KR20160013641A - 신규한 락토바실러스 펜토수스 neo 1 균주, 상기 균주를 이용한 인삼 발효 추출물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) NEO 1 균주(수탁번호: KCTC18313P), 상기 균주를 이용한 인삼 발효 추출물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 인삼을 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) NEO 1 균주(수탁번호: KCTC18313P)로 접종하여 발효시킨 인삼 발효 추출물은 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2의 함량을 현저하게 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라 피부 항산화, 미백 및 주름개선 효과를 부여할 수 있는 인삼 발효 추출물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

신규한 락토바실러스 펜토수스 NEO 1 균주, 상기 균주를 이용한 인삼 발효 추출물 및 이의 제조방법 {Novel Lactobacillus pentosus NEO 1 and extracts from ginseng-fermented products using Lactobacillus pentosus NEO 1 and manufacturing method thereof}

본 발명은 신규한 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) NEO 1 균주(수탁번호: KCTC18313P)(이하 'NEO 1'로 약칭함), 상기 균주를 이용한 인삼 발효 추출물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 새롭게 분리 동정된 신규한 NEO 1 균주를 인삼에 접종하고 배양할 경우, 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2의 함량을 현저하게 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라 피부 항산화, 미백, 항염증 및 주름개선 효과를 부여할 수 있는 인삼 발효 추출물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)은 오가피과 인삼 속에 속하는 식물로서 한국, 중국 및 일본 등지에서 2,000여년 전부터 사용되어 온 생약으로 질병을 예방하고 수명을 연장시킬 목적으로 사용되어 왔다. 지금까지 알려진 인삼의 효능 및 효과는 중추신경계에 대한 작용, 항발암 작용, 항암활성, 면역기능 조절작용, 항당뇨 작용, 간기능 항진효능, 심혈관 장해개선, 항동맥경화 작용, 혈압조절 작용, 갱년기 장애 개선, 골다공증에 미치는 효과, 항스트레스 및 항피로 작용, 항산화 활성 및 노화억제 효능 등이 있다.

인삼의 주요 약효성분으로 배당체 성분인 40여종 이상의 진세노사이드(Ginsenoside)를 비롯하여 비(非)사포닌계의 생리활성 물질로 Polyacetylene, Phenolic compounds, Acid polysaccharides, Peptides, Alkaloids 등 인체에 유용한 다양한 성분들이 함유되어 있다.

인삼의 대표적 생리활성 성분인 진세노사이드(Ginsenoside)는 인삼에 함유된 사포닌(Saponin)을 의미하며, 인삼에는 다양한 종류의 진세노사이드 성분이 함유되어 있다. 진세노사이드는 인삼의 지상 및 지하부에 고르게 분포되어 있으며, 특히 인삼 근(뿌리), 인삼엽 및 인삼 열매 등 부위에 따라 진세노사이드 함량뿐만 아니라 조성도 다른 것으로 알려져 있다.

인삼의 진세노사이드는 인삼 건조량의 약 5％를 차지하며, 트리터페노이드(Triterpenoid) 계열의 다마란(Dammarane) 골격에 포도당(Glucose), 아라비노즈(Arabinose), 자일로즈(Xylose), 람노즈(Rhamnose) 등이 결합되어 있는 중성 배당체이다. 비당부분에 붙어있는 -OH의 수에 따라 2개인(3, 12번 위치) 경우 프로토파낙사디올 (Protopanaxadiol; PPD) 계열 사포닌, 3개인(3, 6, 12번 위치) 경우 프로토파낙사트리올 (Protopanaxatriol; PPT) 계열 사포닌이라 한다. PPD과 PPT의 R1, R2, R3 위치의 -OH에 글루코오스(Glucose), 아라비노오스(Arabinose), 자일로오스(Xylose), 람노오스(Rhamnose) 등이 결합된다. 30종 이상의 진세노사이드가 인삼으로부터 분리 보고되었으나 실제 인삼을 추출하여 분석할 때 상당한 양이 검출되는 것은 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rg1의 6종이 전체 사포닌의 90％ 이상을 차지하고 있으며 나머지 사포닌 성분들은 그 함량이 낮다.

상기 진세노사이드는 인체 내에서 그대로 흡수되는 것이 아니라 인체 장내에 존재하는 Bacteriodes, Lactobacillus, Fusobactrium, Eubacterium, Provetella 종 등의 미생물에 의하여 분해되어 그 대사체가 흡수된다. 진세노사이드 Rb1의 경우 장내 미생물에 의해 진세노사이드 Rd, 컴파운드 케이(compound K, 이하 C-K라로 약칭함)와 프로토파낙사디올로 순차적으로 전환된다. PPD계 진세노사이드인 Rb1, Rb2, Rc, Rd는 장내에서 20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol(C-K)로 대사되어 흡수된다. PPT계 진세노사이드 Re, Rf, Rg1은 장내에서 Rh1, F1, Protopanaxatriol로 대사된다. Rb1, Rb2, Rc, Rd 등은 장내 미생물에 의하여 20(R)-/20(S)-ginsenoside Rg3로 전환되며, Rg3는 장내 미생물에 의하여 Rh2로 전환된다.

최근에는 이러한 인삼의 약효성분이 인체 내로 용이하게 흡수되도록 하며, 인삼에 극미량으로 존재하는 성분들을 강화시키는 방법으로서 인삼을 장내 미생물 또는 유산균을 이용하여 발효하거나 및 효소를 처리하는 방법 등이 사용되고 있다. 대한민국 등록특허공보 제10-1017378호는「발효인삼, 발효홍삼의 제조방법 및 이에 적합한 청국장 유래의 바실러스 서브틸리스 신균주」에 관한 것으로서, 청국장에서 분리된 바실러스(Bacillus) 속 미생물을 이용하여 인삼 및 홍삼을 발효시켜 진세노사이드 Rd의 함량을 증진시키는 것을 특징으로 하는 발효인삼 및 발효홍삼의 제조방법 및 이에 적합한 청국장 유래의 바실러스 서브스틸리스 신균주에 관한 기술이 개시되어 있다.

또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1240192호는「락토바실러스 아시도필러스 Ｋ-59 균주, Ｋ-59 균주를 이용한 인슐린 분비 개선용 인삼 발효 추출물 및 이의 제조방법」에 관한 것으로서, 새롭게 분리 동정된 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus) K-59 (KFCC11467P) 균주를 이용하여 인삼의 생체이용률이 낮은 성분인 진세노사이드 Rg1, Rb1, Rg1 또는 Re을 진세노사이드 Rh1, Rg3, Rh2 또는 C-K로 전환시키는 방법이 개시되어 있다.

이에, 본 발명자들은 새롭게 분리 동정된 신규한 락토바실러스(Lactobacillus) 속 미생물 즉, 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) NEO 1 균주(수탁번호:KCTC18313P)를 인삼에 접종하여 배양할 경우, 인삼에 함유된 생체 이용률이 낮은 진세노사이드(Ginsenoside) Re, Rg1을 생체이용률이 높은 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2로 전환시켜 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2의 함량을 현저하게 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라 피부 항산화, 미백, 항염증 및 주름개선 효과를 부여할 수 있다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 등록특허공보 제10-1017378호 대한민국 등록특허공보 제10-1240192호

본 발명의 목적은 신규한 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) NEO 1 균주(수탁번호:KCTC18313P)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 신규한 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) NEO 1 균주(수탁번호:KCTC18313P)를 이용하여 인삼에 접종하고, 배양함으로써 인삼에 함유된 생체 이용률이 낮은 진세노사이드(Ginsenoside) Re, Rg1을 생체이용률이 높은 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2로 전환시켜 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2의 함량을 현저하게 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라 피부 항산화, 미백, 항염증 및 주름개선 효과를 부여할 수 있는 인삼 발효 추출물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 새롭게 분리 동정된 신규한 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) NEO 1 균주(수탁번호:KCTC18313P)를 제공한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) NEO 1 균주(수탁번호:KCTC18313P)를 인삼에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인삼 발효 추출물의 제조방법을 제공한다.

상기 인삼은 잎, 열매, 뿌리 및 전초를 포함하는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

상기 배지에는 인삼 사포닌을 첨가하여 배양하는 것일 수 있다.

상기 배양하는 단계는 30 내지 37℃에서 3 내지 7일 동안 이루어지는 것일 수 있다.

상기 인삼 발효 추출물은 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2의 함량이 증대된 것일 수 있다.

상기 인삼 발효 추출물은 피부 항산화, 미백, 항염증 또는 주름개선용인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기와 같은 제조방법을 통해 제조된 인삼 발효 추출물을 제공한다.

본 발명은 새롭게 분리 동정된 신규한 락토바실러스 속 미생물 즉, 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) NEO 1 균주(수탁번호:KCTC18313P)를 제공한다.

상기 신규한 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) NEO 1 균주(수탁번호:KCTC18313P)를 인삼에 접종하여 배양할 경우, 인삼에 함유된 생체 이용률이 낮은 진세노사이드(Ginsenoside) Re, Rg1을 생체이용률이 높은 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2로 전환시킴으로써 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2의 함량이 현저하게 증진된 인삼 발효 추출물을 얻을 수 있다.

또한, 상기 인삼 발효 추출물은 피부 항산화, 미백, 항염증 및 주름개선 효과가 우수하기 때문에, 상기 인삼 발효 추출물을 유효 성분으로 화장료 베이스에 적용하였을 때 화장료 조성물로서의 효과가 우수하다.

도 1은 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) NEO 1 균주(수탁번호:KCTC18313P)의 사포닌 전환 양상을 나타낸 TLC 전개 결과이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1로부터 수득된 인삼 발효 추출물의 세포생존율(Cell viability) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1로부터 수득된 인삼 발효 추출물의 DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 소거 활성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1로부터 수득된 인삼 발효 추출물의 티로시나제(Tyrosinase) 효소 저해 활성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 비교예 1로부터 수득된 인삼 발효 추출물의 티로시나제(Tyrosinase) 효소 저해 활성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예 1로부터 수득된 인삼 발효 추출물의 엘라스타아제(Elastase) 억제 활성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실시예 1로부터 수득된 인삼 발효 추출물의 NO(Nitric Oxide) 억제 활성 결과를 나타낸 그래프이다.

이에 본 발명자들은 인삼에 특이적으로 생육하는 새로운 균주를 분리하여, 이를 분자 유전학적 측면에서 동정하는 16S rDNA partial sequencing을 통해 균주의 종, 속명을 확인하였다. 상기와 같이 새롭게 분리 동정된 락토바실러스(Lactobacillus) 속 미생물을 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) NEO 1 균주(수탁번호:KCTC18313P)로 명명하고 이를 한국생명공학연구원에 2014년 07월 23일자로 수탁하고, 수탁번호 KCTC18313P를 부여받았다. 상기 균주를 인삼에 접종하고, 배양하는 단계를 통해서 수득할 수 있는 인삼 발효 추출물은 생체 이용률이 낮은 진세노사이드(Ginsenoside)Re, Rg1을 생체이용률이 높은 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2로 전환시켜 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2의 함량을 현저하게 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라, 우수한 피부 항산화, 미백, 항염증 및 주름개선 효과를 부여할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 인삼을 발효시킬 수 있는 신규한 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) NEO 1 균주(수탁번호:KCTC18313P)(이하 'NEO 1'로 생약칭함)를 제공한다.

본 발명에 의해 새롭게 분리 동정된 신규한 NEO 1 균주는 인삼에 함유된 생체 이용률이 낮은 진세노사이드(Ginsenoside) Re, Rg1을 생체이용률이 높은 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2로 전환시킬 수 있다.

상기한 바와 같이 신규한 NEO 1 균주는 인삼의 진세노사이드(Ginsenoside) Re, Rg1을 당을 가수분해시켜 각각 ginsenoside Rg2, Rg1으로 전환시키며 ginsenoside Rg1의 경우 F1으로 추가적으로 전환되어진다. 바람직하게는 진세노사이드(Ginsenoside) Re를 Rg2로 생물전환시켜 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2의 함량을 증진시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 신규한 NEO 1 균주를 인삼에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인삼 발효 추출물의 제조방법을 제공한다. 상기에 기재된 '인삼 발효 추출물'이라 함은 산삼, 산삼 배양근, 산양삼, 수삼, 홍삼, 홍미삼, 백삼, 미삼 등의 인삼에 신규한 NEO 1를 접종하고, 배양하여 얻어진 생성물을 의미한다.

본 발명에 바람직한 양태에 따르면, 상기 인삼 발효 추출물 제조에 사용되는 인삼은 그 종류, 원산지가 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 산삼, 산삼 배양근, 산양삼, 수삼, 홍삼, 홍미삼, 백삼, 미삼 등을 사용할 수 있고, 원산지 또한 고려인삼, 삼칠인삼, 베트남인삼, 미국인삼, 죽절인삼 등을 제한 없이 사용할 수 있다. 또한, 인삼의 형태로는 인삼 추출물, 인삼 분말, 인삼 농축물 등 다양한 형태로 사용될 수 있으며 특별히 한정되지 않는다.

나아가, 상기 인삼 발효 추출물 제조에 사용되는 인삼의 부위로는 잎, 열매, 뿌리 및 전초를 포함하는 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있으나, 보다 바람직하게는 인삼의 열매를 사용하는 것이 다른 부위를 사용하는 것에 비해 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2의 함량을 현저하게 증진시킬 수 있기 때문에 인삼의 열매를 사용하는 것이 더욱 효과적이다.

본 발명에 바람직한 양태에 따르면, 상기 배지에는 인삼 사포닌을 첨가하여 배양하는 것일 수 있다. 상기 NEO 1 균주를 배양시 MRS 배지 총 중량에 대하여 0.1 내지 1중량%의 인삼 사포닌을 첨가하는 것이 NEO 1 균주의 활성을 유도할 수 있기 때문에 생체이용률이 낮은 진세노사이드(Ginsenoside) Re, Rg1을 생체이용률이 높은 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2로의 전환 활성이 더욱 효과적이다. 이때, MRS 배지 총 중량에 대하여 인삼 사포닌의 함량이 0.1중량% 미만일 경우에는 충분한 균주의 활성을 유도할 수 없기 때문에 바람직하지 않고, 1중량%를 초과할 경우에는 그 이상을 함유하지 않아도 충분한 효능을 나타낼 수 있기 때문에 비경제적이다.

본 발명에 바람직한 양태에 따르면, 상기 NEO 1 균주를 인삼에 접종하고 배양하는 단계는 30 내지 37℃에서 3 내지 7일동안 이루어지는 것이 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2의 함량을 더욱 높일 수 있기 때문에 바람직하다. 또한, 배양하여 수득된 인삼 발효 추출물은 원심분리 및 살균 과정을 거쳐, 균주를 제균하여 이용하는 것이 향후 미생물에 번식에 의한 유효성분의 파괴 방지 및 제품의 안정성 측면에서 바람직하다.

상기한 바와 같이, NEO 1 균주를 인삼에 접종하고 배양하는 단계를 포함하여 제조된 인삼 발효 추출물은 인삼에 함유되어 있는 생체이용률이 낮은 진세노사이드(Ginsenoside) Re, Rg1을 생체이용률이 높은 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2로 전환시켜 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2의 함량을 현저하게 증진시킬 수 있다. 또한, 상기 발효 과정을 거쳐 얻어지는 인삼 발효 추출물은 발효 과정을 거치지 않은 인삼 추출물에 비해 우수한 피부 항산화, 미백, 항염증 또는 주름개선의 효과가 있어서 피부 미용에 효과적인 화장료 조성물로서 적용이 가능하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

1. 균주의 분리 및 선별

인삼으로부터 유산균의 분리는 인삼을 오존수에 살균한 후 밀봉하여 3개월동안 자연 숙성하였으며 이때 숙성 균주를 분리하였다. 인삼 발효물을 멸균증류수를 이용하여 10⁰ 내지 10^-5으로 희석한 후 MRS agar 배지에 100 ul씩 도말하여 30℃ Incubator에서 배양하였다. 균주는 모양, 색, 투명도, 크기, 외형구조 등을 육안으로 관찰하여 선발하였으며 선발균주는 MRS agar 배지에 Streaking 하여 4회 계대 배양하여 Single colony를 순수 분리하였다. 순수 분리된 균주는 20% Glycerol stock solution을 만들어 -70℃ 초저온 냉동고에 보관하였다.

다음으로, β-glucosidase 활성을 갖는 균주의 선발을 위해 Esculin agar법 (Atlas, 1993)을 이용하여 Esculin이 함유된 Esculin-MRS agar 배지에 접종하여 배지 내에서의 색깔 변화를 관찰하였다. Esculin-MRS agar 배지의 조성은 아래 표 1과 같다.

성분	Amount (g/L)
Pancreatic digest of casein	13.0
Sodium chloride	5
Yeast extract	5.0
Heart muscle, solids from infusion	20.0
Esculin	1.0
Ferric ammonium citrate	0.5
Agar	15.0

Esculin은 β-glucosidase에 의하여 Glucose와 Esculetin으로 분리 되며, Esculetin은 Ferric ammonium citrate와 반응하여 Colony 주위에 Black complex를 형성하게 된다. 따라서, Colony 주위에 Black complex를 형성하는 균주는 β-glucosidase 활성을 가지는 균주로 판단하고 Ginsenoside Re와의 반응을 통해 사포닌 전환능력을 가진 NEO 1 균주를 선택적으로 선별하였다.

2. 16S rRNA 유전자 염기 서열 분석에 의한 분리 균주의 동정

상기 선별된 NEO 1 균주로부터 DNA를 추출한 다음, 16S rRNA gene sequencing은 (주)제노텍에 의뢰하였으며, 계통학적 분석을 위하여 NCBI database를 이용하여 Type strain과의 상동성을 확인하였다. Type strain의 16S rRNA 염기서열을 BioEdit program (Hall, 1999)과 Clustal X program(Thompson et al., 1997)을 이용하여 Alignment 하고, 균주들의 진화과정을 추적하는 작업은 Kimura two-parameter model(Kimura, 1983)을 이용하였으며, MEGA 3 Program(Kumar et al., 2004)의 Neighbor-joining(Saitou and Nei, 1987)방법으로 계통분류학적 위치를 결정하였다.

상기 균주로부터 DNA를 추출하여 16S rRNA를 실시하고 BLAST 프로그램을 사용하여 균주의 상동성을 분석한 결과, 상기 NEO 1 균주가 락토바실러스 펜토서스락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus)와의 16S rRNA gene과 99％ 상동성을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 NEO 1 균주는 락토바실러스 펜토서스락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus)에 속하는 새로운 균주로 판명되어, 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) NEO 1(수탁번호: KCTC18313P)로 명명하고, 이를 한국생명공학연구원에 2014년 07월 23일자로 기탁하여, 기탁번호 KCTC18313P를 부여받았다.

상기 16S rRNA 유전자 염기 서열 분석을 통하여 얻어진 NEO 1 균주 및 기존의 락토바실러스(Lactobacillus) Type strain을 비교한 결과는 다음 표 2 내지 4와 같다.

1: NEO 1 균주

2: Lactobacillus pentosus type stain

3: Lactobacillus brevis type stain

4: Lactobacillus plantarum type stain

5: Lactobacillus parabrevis type stain

Characteristic	1	2	3	4	5
Motility	+	-	-	-	+
Ratio of D- to L-Lactic acid	6.5:3.5	4:06	ND	ND	3:07
Tolerance of 10% red ginseng extract	+	+	+	-	+
Acid production from:
D-glucose	-	-	-	-	+
L-arginine	w	w	w	+	w
esculin ferric citrate	+	+	+	w	+
gelatin(bovine origin)	+	+	+	+	+
4-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside	w	w	w	+	-
D-glucose	-	-	-	-	-
L-arabinose	-	-	-	-	-
D-mannose	+	+	w	+	-
D-mannitol	+	+	-	-	w
D-Ribose	+	+	+	-	W
D-Xylose	+	+	+	W	-
D-Galactose	+	+	+	-	+
D-Mannitol	+	+	-	-	-
N-acetyl-glucosamine	+	-	w	+	-
D-maltose	+	+	+	+	+
potassium gluconate	-	-	-	-	-
capric acid	+	+	+	+	-
adipic acid	+	+	++	++	+
malic acid	+	+	-	-	-
trisodium citrate	-	-	-	-	-
phenylacetic acid	-	-	-	-	-
DNA G+C content(Mol%)	45	43	43.5	43.9	36.4

fatty acid	1	2	3	4	5
saturated
C10:0	-		-	-	-
C12:0	1.14				-
C14:0	6.16	10.32	3.82	1.28
C16:0	42.17	40.57	36.69	27.79	29.96
C17:0	-	-	-	-	0.18
C:18:0	1.27	1.46	3.07	1.77	3.15
C:20:0	-	1.51		-
Unsaturated
18:1 w9c	10.67	11.46	7.98	31.06	29.26
20:1 w7c	-			-	-
19:0 cyclo w8c	8.48	-	14.12	-	-
Branched chain
13:0 iso 3OH	-	-		-	-
15:0 iso	-	-		-
15:1 iso F	-	-		-	-
19:0 iso	-	1.49		-	1.43
Hydroxy
16:0 2OH	-	-
16:0 3OH	-			-	-
Summed feature
12:0 aldehyde	-		-	-	-
15:1 iso H/13:0 3OH	-	-		-	-
16:1 w7c/16:1 w6c	5.02	6.14	2.23	1.85	1.04
17:1 iso I/anteiso B	-	-		-	-
un 18.846/19:1 w6c	9.21	-	17.64	31.57	29.44
18:1 w7c	15.88	12.37	7.52	4.25	2.99

Characteristic	1	2	3	4	5
Ginsenoside Rg2 생성	+	-	-	-	-
인삼 농축액 10% 환경	+	-	+	-	-
Re분해 활성	+	-	-	+	-

그 결과, 표 2 내지 4에 나타난 바와 같이 NEO 1 균주는 균주가 이용하는 기질물질과 균주의 G+C 함량이 상이하고, 균주가 생성하는 물질이 서로 상이한 것으로 보아 기존의 균주와 다름을 확인할 수 있었고, 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2를 생성할 수 없었던 기존의 락토바실러스(Lactobacillus ) Type strain과는 달리 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2를 생성할 수 있었으며, 이는 NEO 1 균주가 진세노사이드 Re를 분해 할 수 있는 활성에 의하여 진행되었다는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 1 내지 4> 인삼 발효 추출물 제조

실시예 1

NEO 1 균주를 배양하여 인삼에 접종한 후 발효를 진행하였다. 균주의 발효를 보다 효율적으로 하기 위하여 종균 배양을 통해 균주를 37℃에서 3일동안 교반하면서 배양하였다. 종균 배양시에는 균주 활성의 유도를 위하여 MRS 배지 총 중량 대비 인삼 뿌리로부터 분리한 인삼 사포닌을 0.01중량% 첨가하여 배지를 제조하였으며 이 배지에 균을 접종하여 종균으로 활용하였다. 생장된 종균은 인삼에 직접 접종하여 발효 추출물을 생산하고자 하였다.

다음으로, 인삼(Panax ginseng C.A. Meyer) 열매 분말 5g에 물 100ml을 가하고 85℃에서 60분간 살균 한 후 NEO 1 균주를 접종하였다. 이때 균주의 생장을 보다 원활하게 하고, 효소 활성도를 증가시키기 위하여 Yeast 추출물 10g 및 Lactose 10g를 첨가하였다. 7일 동안 배양을 통해 만들어진 발효 배양물은 8000rpm, 20분 동안 원심분리하여 균체를 제거한 다음, Filter 및 살균을 거쳐 인삼 발효 추출물을 제조하였다.

실시예 2

인삼(Panax ginseng C.A. Meyer) 열매 대신 인삼 잎을 사용하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 인삼 발효 추출물을 제조하였다.

실시예 3

인삼(Panax ginseng C.A. Meyer) 열매 대신 인삼 뿌리를 사용하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 인삼 발효 추출물을 제조하였다.

실시예 4

인삼(Panax ginseng C.A. Meyer) 열매 대신 인삼의 뿌리+잎, 열매(1:1)를 사용하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 인삼 발효 추출물을 제조하였다.

<비교예 1 내지 3> 인삼 추출물 제조

비교예 1

인삼(Panax ginseng C.A. Meyer) 열매 분말 5g에 물 100ml을 가하고 85℃에서 3시간동안 추출하여 인삼 추출물을 제조하였다.

비교예 2

인삼(Panax ginseng C.A. Meyer) 열매 대신 인삼 잎을 사용하여, 비교예 1과 동일한 방법으로 인삼 발효 추출물을 제조하였다.

비교예 3

인삼(Panax ginseng C.A. Meyer) 열매 대신 인삼 뿌리를 사용하여, 비교예 1과 동일한 방법으로 인삼 발효 추출물을 제조하였다.

<시험예 1> 진세노사이드 함량 분석 (HPLC; High Performance Liquid Chromatography)

상기 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 3로부터 제조된 인삼 발효 추출물 1g에 수포화 부탄올을 5g 첨가하여 혼합한 다음, 부탄올 혼합액의 상등액을 취하여 감압농축을 하였다. 수득된 농축물을 Methanol (HPLC grade)에 용해 한 후 0.2 ㎛Membrane filter에 여과하여 HPLC 분석용 시료로 이용하였다. HPLC 분석에는 C18 Column(3.0x50 m㎜, ID 5㎛)을 사용하여 UV 203㎚에서 검출하였다. 이동상은 Acetonitrile (solvent A)과 Water (solvent B)를 이용하여 Gradient를 주었으며 1.6 ㎖/min 유속으로 분리하였으며, 이동상의 Gradient 조건은 표 5와 같다.

시간(min)	이동상
	acetonitrile(solvent A)	water (solvent B)
0.00	17	83
6.00	17	83
9.00	23	77
16.5	23.5	76.5
19.00	31	69
29.00	45	55
31.00	47	53
33.00	90	10
34.00	90	10
35.00	17	83
37.00	17	83

상기 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 3의 진세노사이드(Ginsenoside) 성분변화에 대한 결과는 표 6과 같다.

	인삼 부위	Re(mg)	Rg1(mg)	Rg2(mg)
실시예 1(인삼 발효 추출물)	열매	11.01	1.62	9.31
실시예 2(인삼 발효 추출물)	잎	2.54	1.08	4.16
실시예 3(인삼 발효 추출물)	뿌리	0.38	0.11	0.99
실시예 4(인삼 발효 추출물)	뿌리+잎,열매(1:1)	5.77	0.87	7.28
비교예 1(인삼 추출물)	열매	32.45	3.34	1.08
비교예 2(인삼 추출물)	잎	12.11	15.23	0.78
비교예 3(인삼 추출물)	뿌리	2.21	1.34	0.1

그 결과, 상기 표 6에 나타난 바와 같이 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 3의 진세노사이드(Ginsenoside) 성분 변화를 인삼 부위별로 분석한 결과, 실시예 1 내지 4의 인삼 발효 추출물이 비교예 1 내지 3의 인삼 추출물보다 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2의 함량이 현저하게 높은 것을 확인할 수 있었다. 이는 인삼을 신규한 NEO 1 균주를 이용하여 인삼을 발효하였을 때, 진세노사이드(Ginsenoside) Re, Rg1의 함량이 줄어들고 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2의 함량이 증가된 것을 알 수 있으며, 이는 신규한 NEO 1 균주로 인하여 진세노사이드(Ginsenoside) Re, Rg1가 노사이드(Ginsenoside) Rg2로 전환되는 것을 보여주는 것이다.

또한, 인삼을 부위별로 발효시킨 실시예 1 내지 4를 비교한 결과, 인삼의 부위 중에서 열매를 사용할 경우 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2의 함량이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.

<시험예 2> 진세노사이드 Rg2 생성능 분석

상기 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 3의 진세노사이드 분석 결과, Rg2의 함량이 현저하게 개선된 실시예 1의 방법으로 얻어진 인삼 발효 추출물 1g에 수포화 부탄올을 5g 첨가하여 혼합한 혼합액을 Silica gel 60 F254 TLC Plate(Merck, Germany)에 점적한 후 Chloroform/methanol/water (65:35:10 v/v/v, lower phase)의 혼합 용매를 사용하여 전개하였다. 전개한 TLC plate는 10% H₂SO₄을 분사시킨 후 열을 가해 발색시켜 사포닌 전환 양상을 확인하였다.

그 결과, 도 1에서 확인할 수 있듯이 시간이 경과할수록 진세노사이드(Ginsenoside) Re의 함량이 줄어들고 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2의 함량이 증가된 것을 알 수 있으며, 이는 진세노사이드(Ginsenoside) Re가 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2로 전환되는 것을 보여주는 것이다. (S: standard, C: control)

<시험예 3> 세포 독성 시험

상기 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 3의 진세노사이드(Ginsenoside) 분석 결과, 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2의 함량이 현저하게 증진된 실시예 1의 방법으로 얻어진 인삼 열매 발효 추출물의 세포 독성을 측정하였다.

본 발명에 따른 상기 추출물에 대한 세포독성을 알아보기 위하여, 구체적으로, 인간 각질형성 세포 HaCat(ACTT, CLS 300493, USA)을 헤마사이토미터(Hemacytometer)를 이용하여 96well plate에 1.5 x 10⁴ cell/well 씩 동일하게 계수하여 분주한 후, 37℃, 5%의 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양한 후 얻은 세포 배양액을 제거하고, 상기 실시예 1에서 수득된 인삼 열매 발효 추출물을 0, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4%로 농도로 조제하였다. 농도별로 4㎕를 취하여 DMEM 배지와 혼합한 뒤, 각 well　농도별로 처리하였다. 이를 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 well당 10% WST(high sensitive Water Soluble Tetrazolium salt)를 100㎕씩 첨가하고 동일한 조건에서 2시간 동안 더 배양하였다. 2시간 뒤, ELISA reader(Thermo, Multiskan EX)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 대조군으로는 시료 대신 증류수(Distilled water)를 사용하여 흡광도를 측정하였다.

세포 활성 정도는 아래 수학식 1에 의해 나타낼 수 있고, 그 결과를 하기 표 7과 도 2에 나타내었다.

[수학식 1]

세포 활성도(%) = (실험군의 흡광도 / 대조군의 흡광도) X 100

시료	실시예 1(인삼 열매 발효 추출물)
농도(%)	0	0.125	0.25	0.5	1	2	4
Cell viability(%)	100	105.29	101.36	104.97	97.76	102.62	100.02

그 결과, 상기 표 7 및 도 2에 나타난 바와 같이 인삼 열매 발효 추출물의 사용 농도가 최고 농도인 4%에서도 세포독성이 없는 것으로 나타난 것으로 보아, 독성이 없는 안전한 원료로 사용이 가능함을 확인하였다.

<시험예 4> 항산화 효능 검증 시험: DPPH radical 소거 활성

상기 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 3의 진세노사이드(Ginsenoside) 분석 결과, Rg2의 함량이 현저하게 증진된 실시예 1의 방법으로 얻어진 인삼 열매 발효 추출물의 DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 소거 활성을 측정하였다.

자유라디칼은 일반적으로 외부자극에 대한 활성산소가 과잉 생산되어 피부 보습층을 파괴하여 피부를 건조하게 하고, 외부 자극에 민감한 면역 반응을 보이는 병리적 인자로 작용하게 된다. 본 발명에 따른 인삼 열매 발효 추출물의 항산화능은 DPPH 실험을 통해 자유라디컬 소거능 확인이 가능하다.

본 발명에 따른 상기 추출물에 대한 항산화 효과를 알아보기 위하여, 구체적으로 상기 실시예 1에서 얻어진 인삼 발효 추출물을 다양한 농도로 희석하여 시료를 준비한 후, 이들 시료와 100μM DPPH(1,1-diphenyl -2-picrylhydrazyl) 용액을 혼합하고 4℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 96well plate에 담아 DPPH 양을 520nm에서 측정하였다. 그리고 시료를 넣지 않은 경우를 대조군으로 하여 아래의 수학식 2에 의해 시료의 자유라디칼 소거량(Free radical scavenging activity, %)을 계산하였다. DPPH 자유 라디칼 소거능 측정법에 의한 항산화 정도는 수학식 2로 나타내었으며 항산화 효능 결과는 표 8 및 도 3 에 나타내었다.

[수학식 2]

자유라디칼소거능(%)=100-(시료를 처리한 군의 흡광도/시료를 처리하지 않은 군의 흡광도 X 100)]

시료	실시예 1(인삼 열매 발효 추출물)
농도(%)	0	0.0625	0.125	0.25	0.5	1	2	4
free radical scavenging(%)	0	2.95	8.39	12.70	36.28	58.05	85.03	95.92

그 결과, 상기 표 8 및 도 3에 나타난 바와 같이 인삼 열매 발효 추출물인 실시예 1을 농도별로 처리하였을때 유의성있는 DPPH 소거능을 나타내어 높은 항산화 활성을 나타내었다.

<시험예 5> 미백 효능 검증 시험: 티로시나아제(Tyrosinase) 저해 활성

상기 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 3의 진세노사이드(Ginsenoside) 분석 결과, Rg2의 함량이 현저하게 증진된 실시예 1의 방법으로 얻어진 인삼 열매 발효 추출물을 비교예 1의 방법으로 얻어진 인삼 추출물과 비교하여 티로시나아제(Tyrosinase) 억제 효과를 측정하였다.

티로시나아제 저해 활성 측정은 티로시나아제의 작용결과 생성되는 DOPA chrome을 비색법 (Pomerantz et al. 1966)에 의해 측정한다. 0.1M sodium phosphate buffer (pH 7.0) 140 μl를 분주한 후 시료 20 μl를 넣는다. 그 후 1,500 U/ml의 Tyrosinase from Mushroom 20 μl를 넣고 혼합한 후, 37oC에서 6분간 반응을 시켰다. 0.06 mM L-DOPA 20 μl를 넣은 후 5분간 37oC 서 반응을 시키고, 얼음 위에서 방치하여 반응을 정지시킨 후 475 nm에서 흡광도를 측정 활성을 확인하였다. 또한, 시험결과의 비교를 위해 양성대조군으로 미백 성분인 10uM 농도의 알부민(arbumin)을 사용하였다.

티로시나아제 저해 활성 측정에 대한 결과는 하기 표 9, 10 및 도 4, 5와 같다.

시료	Arbumin	control	실시예 1(인삼 열매 발효 추출물)
농도(%)	10uM	100	0.1	0.2	0.5	1
Tyrosinase 활성(%)	31	100	90	81	72	60

시료	Arbumin	control	비교예 1(인삼 열매 추출물)
농도(%)	10uM	100	0.1	0.2	0.5	1
Tyrosinase 활성(%)	32	100	92	91	81	79

그 결과, 상기 표 9, 10 및 도 4 , 5에 나타난 바와 같이 인삼 열매 발효 추출물인 실시예 1과 발효를 하지 않은 인삼 열매 추출물인 비교예 1은 모두 농도 의존적으로 티로시나아제(Tyrosinase) 활성을 억제함으로써 효과를 나타냄을 알 수 있었으며, 그 효능 또한 유의성 있는 결과를 나타냄을 알 수 있었다.

하지만, 실시예 1로부터 제조된 인삼 열매 발효 추출물은 비교예 1로부터 제조된 인삼 열매 추출물과 비교시 티로시나아제(Tyrosinase) 억제율이 더 높아 미백 효과가 우수함을 알 수 있었다.

<시험예 6> 주름개선 효능 검증 시험 : 엘라스타아제(Elastase) 억제 활성

상기 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 3의 진세노사이드(Ginsenoside) 분석 결과, Rg2의 함량이 현저하게 증진된 실시예 1의 방법으로 얻어진 인삼 열매 발효 추출물의 엘라스타아제(Elastase) 억제 활성을 측정하였다.

엘라스아타제(Elastase)는 진피 내 피부탄력을 유지시키는 데 중요한 기질인 엘라스틴을 분해하는 효소이다. 또한 elastase는 다른 중요한 기질단백질인 collagen을 분해할 수 있는 비특이적 가수분해 효소이다. 따라서 elastase 저해제는 피부 주름을 개선하는 작용을 나타내며, ursolic acid 등이 elastase 저해제로서 이용되고 있다. Elastase는 동물 결합조직의 불용성 탄성 섬유 단백질인 elastin을 분해시켜 피부의 진피조기의 그물망 구조 결합을 끊어줌으로서 주름생성의 주원인인 효소로 알려져 있다. 피부의 진피 조직 속에는 collagen과 피부의 탄력성에 관련된 elastin이 그물망 구조를 형성하고 있는데, 이러한 그물망 구조가 깨어지면서 즉 elastin이 elastase에 의해 분해되어 피부가 처지고 주름이 생기므로 내인성 피부노화가 발생한다. 그러므로 피부노화의 주원인 중의 하나인 elastin 분해효소인 elastase의 활성을 저하시킴으로서 피부노화를 억제할 수 있다(Tsuji N, Moriwaki S, Suzuki Y, Takema Y, Imokawa G. 2001. The role of elastases secred by fibroblasts in wrinkle formation : implication through selective inhibition of elastase activity. Photochem. Photobiol 74(2), 283-290).

실시예 1에서 얻어진 인삼 열매 발효 추출물을 다양한 농도로 희석하여 시료를 40㎕를 E-tube에 취하고, 10mM Tris-HCl buffer(pH8.0)에 녹인 N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide (S4760, Sigma) 1.6 mM 농도의 기질 200㎕를 가한 후, 10mM Tris-HCl buffer(pH8.0)에 녹인 Elastase from porcine pancreas Type Ⅳ (E0258, Sigma) 0.4U/mL의 효소를 40㎕ 첨가하여 25℃에서 5분 동안 반응한 후 분광분석기 410 nm에서 흡광도를 측정하였다. 엘라스타아제 저해활성은 시료를 넣지 않은 경우를 대조군으로 하여 아래의 수학식 3을 이용하여 계산하였다.

엘라스타아제 저해활성을 통한 주름개선 효능 결과는 표 11 및 도 6에 나타내었다.

[수학식 3]

엘라스타아제 저해활성(%)=100-(시료를 처리한 군의 흡광도/시료를 처리하지 않은 군의 흡광도 X 100)

시료	실시예 1(인삼 열매 발효 추출물)
농도(%)	0	0.0625	0.125	0.25	0.5	1	2	4
Elastase inhibition(%)	0	1.00	3.78	8.14	17.76	25.02	33.45	50.21

그 결과, 상기 표 11 및 도 6에 나타난 바와 같이 인삼 열매 발효 추출물인 실시예 1을 농도별로 처리하였을때 유의성있는 엘라스타아제(Elastase) 억제율을 나타내어 피부 주름개선 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다.

<시험예 7> 항염증 효능 검증 시험 : Nitric oxide(NO) 억제 활성

상기 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 3의 진세노사이드(Ginsenoside) 분석 결과, Rg2의 함량이 현저하게 개선된 실시예 1의 방법으로 얻어진 인삼 열매 발효 추출물의 Nitric oxide(NO) 억제 활성을 측정하였다.

Nitric oxide(NO)체내에서 L-아르기닌이 시트룰린을 생성할 때 생성되는 것으로, 과잉 생성 시 우리 몸의 산화를 촉진시키는 자유 라디칼(free radial)로 알려져 있다. 염증 유발 인자인 LPS(Lipopolysaccharide)를 RAW 264.7 cell에 처리하여 NO의 생성량을 활성화 시킨 후, Griess 분석 방법을 통해 Nitric oxide 발현양을 측정한다. LPS는 그람음성균 표층의 펩타이드글리칸을 둘러싸는 외막의 중요한 구성성분으로,'염증 유발 인자'라고 알려져 있다. 이 LPS가 macrophage의 표면에 있는 receptor를 통해 macrophage에 activating signal을 주고, iNOs의 발현에 영향을 주어 NO를 많이 합성할 수 있게 한다고 알려져 있다. 이 반응을 통해 monocyte 형태인 RAW 264.7 cell이 macrophge 형태로 변하게 된다.

본 발명에 따른 상기 추출물에 대한 항염증 효과를 알아보기 위하여, RAW 264.7 cell을 헤마사이토미터(Hemacytometer)를 이용하여 24well plate에 2.0 x 10⁴ cell/well 씩 동일하게 계수하여 분주한 후, 37℃, 5%의 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양한 후 얻은 세포 배양액을 제거하고, 상기 실시예 1에서 수득된 인삼 열매 발효 추출물을 0, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4%로 농도로 조제한 시료를 농도별로 40㎕를 취하여 DMEM 배지와 혼합한 뒤, 각 well　농도별로 처리하였다. 이를 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이때, NO를 발현시키기 위해, LPS를 1㎍/㎖도 같이 처리하였다. 그 후 배양액 중 100㎖ 를 96 well plate에 취하고 Griess reagent A 50㎕와 Griess reagent B 50㎕를 각각 넣어준 뒤 각각 10min간 반응시킨 뒤, ELISA plate reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, Sodium nitrite를 standard로 하여 측정하였으며, LPS를 처리하지 않은 군을 대조군으로 하여, LPS와 실시예 1의 인삼 발효 추출물을 각각 농도별로 처리한 실험군의 NO₂ ^-의 생성 농도를 비교하여 그 결과를 표 12 및 도 7에 나타내었다.

시료	실시예 1(인삼 열매 발효 추출물)
농도(%)	0	0.125	0.25	0.5	1
Nitric Oxide inhibition(%)	0	54.4	91.2	111.6	106.4

그 결과, 상기 표 12 및 도 7에 나타난 바와 같이 실시예 1의 방법으로부터 수득된 인삼 발효 추출물을 농도별로 처리하였을때 유의성있는 NO(Nitric Oxide) 억제율을 나타내어 항염 효과가 굉장히 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원 미생물자원센터 KCTC18313P 20140723

Claims (8)

1. 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) NEO 1 균주(수탁번호: KCTC18313P).
   
2. 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) NEO 1 균주(수탁번호: KCTC18313P)를 인삼에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인삼 발효 추출물의 제조방법.
   
3. 제 2항에 있어서,
   상기 인삼은 잎, 열매, 뿌리 및 전초를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인삼 발효 추출물의 제조방법.
   
4. 제 2항에 있어서,
   상기 배지에는 인삼 사포닌을 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는 인삼 발효 추출물의 제조방법.
   
5. 제 2항에 있어서,
   상기 배양하는 단계는 30 내지 37℃에서 3 내지 7일 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 인삼 발효 추출물의 제조방법.
   
6. 제 2항에 있어서,
   상기 인삼 발효 추출물은 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2의 함량이 증대된 것을 특징으로 하는 인삼 발효 추출물의 제조방법.
   
7. 제 2항에 있어서,
   상기 인삼 발효 추출물은 피부 항산화, 미백, 항염증 및 주름개선용인 것을 특징으로 하는 인삼 발효 추출물의 제조방법.
   
8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항의 제조방법을 통해 제조된 인삼 발효 추출물.

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