KR101768963B1 - 사포닌에 대해 생물전환 활성을 갖는 락토바실러스 파라카세이 균주, 발효 인삼 추출물 및 발효 인삼 추출물의 제조방법 - Google Patents

사포닌에 대해 생물전환 활성을 갖는 락토바실러스 파라카세이 균주, 발효 인삼 추출물 및 발효 인삼 추출물의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 균주 및 이의 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 균주는 식품학적으로 안전하고, 인삼에 함유된 메이저 사포닌인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re 또는 Rg1을 마이너 사포닌인 진세노사이드 Rg3, Rh1 또는 Rh2로 생물전환시키는 능력이 뛰어나다. 따라서, 본 발명에 따른 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 균주를 사용하여, Rg3, Rh1 또는 Rh2 함량이 상대적으로 증가한 발효 인삼 추출물을 제조할 수 있다.

Description

사포닌에 대해 생물전환 활성을 갖는 락토바실러스 파라카세이 균주, 발효 인삼 추출물 및 발효 인삼 추출물의 제조방법{Lactobacillus paracasei strain with biological conversion activity of saponin, fermented ginseng extracts and manufacturing method of fermented ginseng extracts}
본 발명은 소정의 사포닌을 다른 형태의 사포닌으로 생물전환 시킬 수 있는 신규 락토바실러스 파라카세이 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
인삼은 식물 분류학상 오가과 인삼속에 속하는 다년생 숙근초로서 지구상에 약 11종이 알려져 있으며, 대표적인 종으로는 고려 인삼(Panax ginseng C. A. Meyer), 미국삼(Panax quinquefolium L.), 전칠삼(Panax notoginseng F. H. Chen), 죽절삼(Panax japonicus C. A. Meyer) 등이 있다. 고려 인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)은 아시아 극동 지역(북위 33 ~ 48도 한국, 북만주, 러시아 일부)에 자생하며, 약효가 매우 우수하다. 미국삼(Panax quinquefolium L.)은 미국, 캐나다에 자생 및 재배되며, 전칠삼(Panax notoginseng F. H. Chen)은 중국 운남성 동남부로부터 광서성 서남부 지역에서 야생 또는 재배된다. 또한 죽절삼(Panax japonicus C. A. Meyer)은 일본, 중국 서남부, 네팔에 이르기까지 분포한다.
인삼의 주요성분 및 약리작용에 관한 연구가 발표됨에 따라, 자연 건강식품으로 각광을 받고 있으며, 그 수요도 점차 신장 되고 있고, 경제성장과 생활수준의 향상으로 더욱 가속화되어 대중적 자연건강식품으로 널리 애용되고 있다. 또한 인삼은 주로 한국 등 아시아 국가에서 생약의 형태로 정신 의학적, 신경계의 질병 및 당뇨병 등 여러 가지 질병에 대해 사용되어 왔으며, 상기 인삼의 주요 성분인 사포닌은 강장, 강정, 진정, 조혈 및 항고혈압 등에 효과를 나타내는 것으로 보고되고 있다. 인삼에 함유된 사포닌은 트리테르페노이드 글리코사이드(triterpenoid glycoside) 형태를 가지며 진세노사이드(ginsenoside)로 불린다. 인삼에 함유된 사포닌 중 흡수가 어려운 메이져(major) 사포닌 (Rg1, Re, Rb1, Rc, Rb2 및 Rd)이 가수 분해되어 생성된 마이너(minor) 사포닌 (Rg3, Rh2, Compound K 등)은, 마우스에서 종양 세포 전이의 저해, 시험관 내 종양 세포 침입 저해, 암세포 세포자살 유발, 암세포 전이 억제, 혈압 강하, 카테콜아민(catecholamine) 분비 억제, 진통제 활성 및 면역력 증강 등 탁월한 약리 활성을 나타내는 것으로 보고되어 있다. 이렇게 마이너(minor) 사포닌의 우수한 약리 활성이 검증됨에 따라 마이너(minor) 사포닌 생성을 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.
일반적으로 인삼은 재배하여 채취한 그대로의 수삼, 수삼을 상온에서 건조시킨 백삼 또는 수삼을 정제수로 세척한 다음 약 98 ~ 100℃에서 수증기로 증삼 처리하여 제조되는 홍삼의 형태로 이용되고 있다. 이 중에서 특히 홍삼은 백삼보다 훨씬 약효가 강한 것으로 알려져 있다. 다만 홍삼의 제조는 노동 집약적이고 장시간이 소요된다. 최근에는 이러한 인삼의 약효성분이 인체 내로 용이하게 흡수되도록 하며, 인삼에 극미량으로 존재하는 성분들을 강화시키는 방법으로서 인삼을 장내 미생물 또는 유산균을 이용하여 발효하거나 및 효소를 처리하는 방법 등이 사용되고 있다. 예를 들어, 대한민국 등록특허 공보 제10-1295444호에는 홍삼에 포함된 Rg1, Re, Rb1, Rc, Rb2 및 Rd 중 하나 이상의 메이져 사포닌을 F2, Rg3, Rh2 및 컴파운드-k(Compound-K) 중 하나 이상의 마이너 사포닌으로 전환시키는 특성을 나타내는 홍삼 발효용 미생물로서, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei; 기탁번호 : KCTC 12108BP) 균주가 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허 제10-1285681호에는 사포닌 생물전환능을 갖는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei NS 808) KCCM 11115P와, 상기 균주를 인삼에 접종하고 배양하여 화합물 K, 진세노사이드 Rg3의 함량이 높은 발효 인삼을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 상기 선행문헌에 개시된 균주의 인삼 사포닌에 대한 생물전환 능력은 여전히 만족스럽지 못하고, 산업적으로 활용하기에는 한계가 있다.
본 발명은 종래의 기술적 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명의 일 목적은 사포닌에 대한 생물전환 활성이 높고 식품학적으로 안전한 신규 균주를 제공하는데에 있다.
또한, 본 발명의 일 목적은 신규 균주의 다양한 용도를 제공하는데에 있다.
본 발명의 발명자들은 발효 우유 커드(fermented cow milk curd)로부터 무수한 유산균을 스크리닝하고, 이 중 특정 락토바실러스속 균주가 식품학적으로 안전하고 동시에 인삼에 함유된 메이저 사포닌을 생리활성이 우수한 마이너 사포닌으로 전환시키는 능력이 뛰어나다는 점을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans)로서, 사포닌에 대해 생물전환 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 균주를 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 인삼을 전술한 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 균주로 발효시킨 산물의 추출물 또는 인삼 추출물을 전술한 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 균주로 발효시킨 산물로서, 상기 발효에 의해 인삼에 함유된 사포닌 중 적어도 일부가 다른 형태의 사포닌으로 전환되는 것을 특징으로 하는 발효 인삼 추출물을 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 인삼에 전술한 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 균주를 접종하고 발효시켜 발효 인삼을 수득하는 단계; 및 상기 발효 인삼을 추출 용매로 추출하여 발효 인삼 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 발효 인삼 추출물의 제조방법을 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 인삼 추출물에 전술한 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 균주를 접종하고 발효시켜 발효 인삼 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 발효 인삼 추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 균주는 식품학적으로 안전하고, 인삼에 함유된 메이저 사포닌인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re 또는 Rg1을 마이너 사포닌인 진세노사이드 Rg3, Rh1 또는 Rh2로 생물전환시키는 능력이 뛰어나다. 따라서, 본 발명에 따른 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 균주를 사용하여, Rg3, Rh1 또는 Rh2 함량이 상대적으로 증가한 발효 인삼 추출물을 제조할 수 있다.
도 1은 균주 MJM60396의 진화관계도(phylogenetic tree)를 나타낸 도면이다.
도 2는 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) 균주 MJM60396의 생체 유래 아민 생성 여부를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) 균주 MJM60396의 뮤신 분해 여부를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) 균주 MJM60396의 용혈 활성 여부를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 발효 인삼 추출물에 함유된 인삼 사포닌을 TLC로 분석한 결과이다.
도 6은 미발효 인삼 추출물의 n-부탄올 분획물을 HPLC로 분석한 결과이고, 도 7은 인삼 추출물을 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans) 균주 MJM60396으로 3일 동안 발효시켜 수득한 발효 인삼 추출물의 n-부탄올 분획물을 HPLC로 분석한 결과이고, 도 8은 인삼 추출물을 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans) 균주 MJM60396으로 5일 동안 발효시켜 수득한 발효 인삼 추출물의 n-부탄올 분획물을 HPLC로 분석한 결과이고, 도 9는 인삼 추출물을 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans) 균주 MJM60396으로 7일 동안 발효시켜 수득한 발효 인삼 추출물의 n-부탄올 분획물을 HPLC로 분석한 결과이고, 도 10은 인삼 추출물을 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans) 균주 MJM60396으로 3일 동안 발효시켜 수득한 발효 인삼 추출물의 n-부탄올 분획물을 HPLC로 분석한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면은 사포닌, 특히 인삼 사포닌인 진세노사이드에 대해 생물전환 활성을 갖는 신규 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 균주에 관한 것이다.
본 발명의 일 예에 따른 신규 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 균주는 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans)로서, 사포닌에 대해 생물전환 활성을 갖는다. 본 발명에서 사용되는 용어인 "생물전환"은 미생물을 사용하여 어떤 화합물을 다른 화합물로 변환시키는 것을 의미한다. 상기 화합물의 변환은 미생물의 대사 또는 미생물에서 분비되는 효소에 의해 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 신규 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 균주에 의해 생물전환되는 사포닌은 아랄로사이드 A(araloside A), 아스트라갈로사이드(astrogaloside), 바코사이드 A(bacoside A), 쿠쿠르비타신(cucurbitacin), 엘레우테로사이드(eleutheroside), 진세노사이드(ginsenoside), 김네마산(gymnemic acid), 지페노사이드(gypenoside), 20-hydroxyecdysone, tangshenoside I, tinosporoside, 비타놀라이드(withanolide) 등과 같은 트리테르페노이드 사포닌(triterpenoid saponin)이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 이중 신규 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 균주의 생물전환 활성을 고려할 때 인삼 사포닌인 진세노사이드(ginsenoside)인 것이 바람직하다. 구체적으로 상기 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans)는 인삼에 포함된 메이저 사포닌인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re 또는 Rg1을 마이너 사포닌인 진세노사이드 Rg3, Rh1 또는 Rh2로 생물전환 시킬 수 있다. 또한, 상기 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans)는 바람직하게는 진세노사이드 Rb1 또는 Rd를 진세노사이드 Rg3로 생물전환 시킬 수 있다. 또한, 상기 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans)는 바람직하게는 진세노사이드 Rd 또는 Rg3를 진세노사이드 Rh2로 생물전환 시킬 수 있다. 또한, 상기 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans)는 바람직하게는 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans) MJM60396(수탁번호 : KACC 92105P)이다. 또한, 상기 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans)는 용혈 활성(hemolytic activity), 바이오아민 생성(bioamine production), 뮤신 분해(mucin degradation)와 같은 해로운 활성을 가지지 않기 때문에 식품학적으로 안전하다. 따라서, 상기 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans)에 의해 발효된 식품 소재는 인간에게 해로운 활성을 가지지 않으며 웰빙 소재로 적합하다. 또한, 상기 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans)는 chloramphenicol, tetracycline, Lincomycin, Amikacin, Erythromycin, Streptomycin, paromomycin, penicillin, Ampicillin, Novobiocin, Rifampicin 및 Neomycin과 같은 항생제에 대해 내성을 보이지 않는다. 따라서, 상기 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans)에 의해 발효된 식품 소재는 항생제 내성 유전자 산물을 포함하지 않는다.
본 발명의 다른 측면은 전술한 신규 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 균주의 다양한 용도에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명은 진세노사이드 Rg3, Rh1 또는 Rh2가 풍부하게 함유되어 있는 발효 인삼 추출물을 제공할 수 있다. 상기 발효 인삼 추출물은 인삼을 전술한 신규 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 균주로 발효시킨 산물의 추출물 또는 인삼 추출물을 전술한 신규 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 균주로 발효시킨 산물이다. 상기 발효 인삼 추출물에는 발효에 의해 인삼에 함유된 사포닌 중 적어도 일부가 다른 형태의 사포닌으로 전환되어 존재한다. 구체적으로, 상기 발효 인삼 추출물에서는 마이너 사포닌인 진세노사이드 Rg3, Rh1 또는 Rh2의 함량이 상대적으로 높게 나타나고, 바람직하게는 진세노사이드 Rg3 또는 Rh2의 함량이 상대적으로 높게 나타난다. 본 발명에서 발효 인삼 추출물을 제조하기 위해 사용되는 원료인 인삼은 그 종류가 특별히 제한되지 않으며 인삼 그 자체 및 인삼 가공물을 포함한다. 또한, 본 발명에서 인삼의 균등물에는 인삼 사포닌과 유사한 형태의 사포닌을 함유하는 도라지, 더덕 등이 있다. 예를 들어, 본 발명에서 인삼은 수삼, 백삼, 홍삼, 홍미삼, 미삼, 산양삼, 산삼 또는 산삼 배양근에서 선택될 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 인삼의 원산지는 크게 제한되지 아니하며, 예를 들어 고려인삼, 삼칠인삼, 미국인삼, 죽절인삼, 히말라야인삼, 베트남인삼 등을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 인삼의 부위는 크게 제한되지 않으며, 뿌리, 줄기, 열매, 잎 등을 사용할 수 있고, 사포닌의 함량을 고려할 때 뿌리인 것이 바람직하다. 또한, 상기 인삼 추출물의 추출 용매는 바람직하게는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 인삼 추출물의 추출 용매는 메탄올, 에탄올, 함수 메탄올 또는 함수 에탄올 등에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 진세노사이드 Rg3, Rh1 또는 Rh2가 풍부하게 함유되어 있는 발효 인삼 추출물의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 일 예에 따른 발효 인삼 추출물의 제조방법은 인삼에 전술한 신규 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 균주를 접종하고 발효시켜 발효 인삼을 수득하는 단계; 및 상기 발효 인삼을 추출 용매로 추출하여 발효 인삼 추출물을 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 발효 인삼 추출물의 제조방법은 바람직하게는 발효 인삼 추출물로부터 탄소 수가 3 내지 6인 알코올(예를 들어, 부탄올)에 가용성인 성분을 분획하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 분획하는 단계를 통해 발효 인삼 추출물에 함유된 진세노사이드 성분의 함량을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 다른 예에 따른 발효 인삼 추출물의 제조방법은 인삼 추출물에 전술한 신규 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 균주를 접종하고 발효시켜 발효 인삼 추출물을 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 다른 예에 따른 발효 인삼 추출물의 제조방법은 바람직하게는 발효 인삼 추출물로부터 탄소 수가 3 내지 6인 알코올(예를 들어 부탄올)에 가용성인 성분을 분획하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 분획하는 단계를 통해 발효 인삼 추출물에 함유된 진세노사이드 성분의 함량을 증가시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 다른 예에 따른 발효 인삼 추출물의 제조방법에서, 발효 시간은 발효 인삼 추출물에 존재하는 진세노사이드 Rg3, Rh1 또는 Rh2의 함량을 고려할 때 5일 내지 15일인 것이 바람직하고, 5일 내지 10일 인 것이 더 바람직하다. 본 발명의 일 예에 따른 발효 인삼 추출물의 제조방법에서는 인삼 추출물 대신 인삼을 신규 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 균주로 발효시키기 때문에 발효 시간이 본 발명의 다른 예에 따른 발효 인삼 추출물의 제조방법보다 더 필요할 수 있다.
본 발명에 따른 발효 인삼 추출물의 제조방법에서 신규 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) 균주를 통해 인삼 또는 인삼 추출물을 발효시킬 때 발효 온도는 30~40℃인 것이 바람직하고, 인삼 사포닌의 생물전환 속도 내지 생물전환 효율을 고려할 때 35~40℃인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 발효는 혐기적인 조건에서 수행된다.
본 발명에 따른 발효 인삼 추출물의 제조방법에서, 원료로 사용되는 인삼은 그 종류가 특별히 제한되지 않으며 인삼 그 자체 및 인삼 가공물을 포함한다. 또한, 본 발명에서 인삼의 균등물에는 인삼 사포닌과 유사한 형태의 사포닌을 함유하는 도라지, 더덕 등이 있다. 예를 들어, 본 발명에서 인삼은 수삼, 백삼, 홍삼, 홍미삼, 미삼, 산양삼, 산삼 또는 산삼 배양근에서 선택될 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 인삼의 원산지는 크게 제한되지 아니하며, 예를 들어 고려인삼, 삼칠인삼, 미국인삼, 죽절인삼, 히말라야인삼, 베트남인삼 등을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 인삼의 부위는 크게 제한되지 않으며, 뿌리, 줄기, 열매, 잎 등을 사용할 수 있고, 사포닌의 함량을 고려할 때 뿌리인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 발효 인삼 추출물의 제조방법에서 인삼 추출물을 준비하거나 발효 인삼으로부터 발효 인삼 추출물을 수득하기 위해서는 추출 과정이 필요한데, 이때 추출 방법으로는 당업계에 공지된 통상의 추출 방법, 예를 들어 용매 추출법을 사용할 수 있다. 용매 추출법을 이용하여 추출물을 제조할 때 사용될 수 있는 추출 용매는 물, 탄소 수가 1 내지 4인 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올) 또는 이들의 혼합물인 함수 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 이중 물, 알코올 또는 이들의 혼합물에서 선택되는 것이 바람직하다. 추출 용매로 물을 사용하는 경우 물은 열수인 것이 바람직하다. 또한, 추출 용매로 알코올을 사용하는 경우 알코올은 탄소 수가 1 내지 4인 저급 알코올인 것이 바람직하고, 저급 알코올은 메탄올 또는 에탄올에서 선택되는 것이 더 바람직하다. 또한, 추출 용매로 함수 알코올을 사용하는 경우 알코올 함량은 50~90%인 것이 바람직하다. 한편, 추출물은 상기 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다. 예를 들어, 이산화탄소를 이용한 초임계 유체 추출법(supercritical fluid extraction)에 의한 추출, 초음파를 이용한 추출법에 의한 추출, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리 또는 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 및 추출방법을 통해 얻어진 활성 분획도 본 발명의 추출물에 포함된다. 일반적으로 초임계 유체는 기체가 고온 고압 조건에서 임계점에 도달하였을 때 갖는 액체 및 기체의 성질을 지니고 있으며, 화학적으로 비극성 용매와 유사한 극성을 지니고 있으며 이러한 특성으로 인해 초임계 유체는 지용성 물질의 추출에 사용되고 있다(J. Chromatogr. A. 1998;479:200-205). 이산화탄소는 초임계 유체기기의 작동으로 압력 및 온도가 임계점까지 이르는 과정을 거치면서 액체 및 기체 성질을 동시에 지닌 초임계 유체가 되고 그 결과 지용성 용질에 대한 용해도가 증가한다. 초임계 이산화탄소가 일정량의 시료를 함유한 추출 용기를 통과하게 되면 시료에 함유된 지용성 물질은 초임계 이산화탄소에 추출되어 나온다. 지용성 물질을 추출한 후 추출 용기에 남아있는 시료에 다시 소량의 공용매가 함유된 초임계 이산화탄소를 흘려 통과시키면 순수한 초임계 이산화탄소만으로는 추출되지 않았던 성분들이 추출되어 나오게 할 수 있다. 본 발명의 초임계 추출법에 사용되는 초임계 유체는 초임계 이산화탄소 또는 이산화탄소에 추가적으로 공용매를 혼합한 혼합유체를 사용함으로써 효과적으로 유효 성분을 추출할 수 있다. 이러한 공용매로 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다. 추출된 시료는 대부분 이산화탄소를 함유하고 있는데 이산화탄소는 실온에서 공기 중으로 휘발되고, 공용매는 감압증발기로 제거할 수 있다. 또한, 상기 초음파 추출법은 초음파 진동에 의해 발생되는 에너지를 이용하는 추출방법으로, 초음파가 수용성 용매 속에서 시료에 포함된 불용성인 용매를 파괴시킬 수 있으며, 이때 발생되는 높은 국부온도로 인하여 주위에 위치하는 반응물 입자들의 운동에너지를 크게 하기 때문에 반응에 필요한 충분한 에너지를 얻게 되고, 초음파 에너지의 충격효과로 높은 압력을 유도하여 시료에 함유된 물질과 용매의 혼합 효과를 높여주어 추출효율을 증가시키게 된다. 초음파 추출법에 사용할 수 있는 추출용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸 에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다. 추출된 시료는 진공 여과하여 여과액을 회수한 후 감압증발기로 제거하고, 동결 건조하는 통상의 추출물 제조방법을 통해 추출물을 얻을 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것일뿐, 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.
1. 유산균의 분리 및 동정
(1) 진세노사이드(ginsenoside)의 전환 활성을 갖는 후보 유산균의 분리
후보 유산균은 발효 우유 커드(fermented cow milk curd)로부터 스크리닝 되었다. 발효 우유 커드(fermented cow milk curd)는 남쪽 인도의 전통 음식으로서 적어도 50년 이상 인간에 의해 안전하게 소비되어온 식품이다. 후보 유산균의 스크리닝은 생물 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 방법과 유산균에 선택적인 3가지 배지를 사용하여 수행하였다. 유산균에 선택적인 배지는 MRS 배지(Difco, USA), GYP(Glucose Yeast Extract Peptone) 배지 및 YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose) 배지를 포함한다. 구체적으로, 발효 우유 커드(fermented cow milk curd)의 희석액을 유산균에 선택적인 3가지 배지에 각각 도말한 후 배양하고, 노란색 콜로니를 형성한 후보 균주들을 분리하였다.
(2) 최종 유산균의 선별 및 동정
프로바이오틱 유산균은 카탈라제 음성(catalase negative), 호모-발효(homo-fermentative), 그람 양성(gram-positive), 낮은 pH에서의 아포 불형성(non-spore forming) 이어야 한다. 상기 기준을 가지고 후보 균주로부터 1차로 유산균을 선별하였다. 또한, 1차로 선별된 유산균으로부터 다음의 기준을 가지고 최종 유산균을 선별한다.
- 발효된 인삼 추출물은 생산 비용을 최소화하기 위해 발효 후 추가적인 정제를 필요로 하지 않아야 하며, 식품 등급의 성분을 포함하여야 한다. 따라서, 용혈 활성(hemolytic activity), 바이오아민 생성(bioamine production), 뮤신 분해(mucin degradation), 항생제 감수성(antibiotic susceptibility)과 같은 인비트로(in vitro) 안전성 평가에서 활성을 보이지 않아야 한다.
선별된 최종 유산균의 균주 명을 "MJM60396"으로 정하고, 이의 계통학적 분석(phylogenetic analysis)을 수행하였다. 먼저, 유전체 DNA 분리 키트(genomic DNA isolation kit; GeneALL, Seoul, Republic of Korea)를 이용하여 제조자의 사용설명서에 따라 균주 MJM60396의 유전체 DNA를 분리하였다. 이후, 균주 MJM60396의 16S rDNA을 증폭시키기 위해 순방향 프라이머인 27F((5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 역방향 프라이머인 1492R(5'-GGTTACCT TGTTACGACTT-3')를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이후, 솔젠트사(SolGent sequencing company, Republic of Korea)에 의뢰하여 균주 MJM60396의 전장에 가까운 16S rDNA 염기서열을 분석하였다. 이때, 프라이머로 27F((5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 785F(5'-GGATTAGATACCCTGGTA-3')를 사용하였다. 이후, 균주 MJM60396의 16S rDNA 염기서열을 BLAST 프로그램을 이용하여 GeneBank nucleotide database와 비교하고, MEGA 6 소프트웨어(Tamura et al. 2013)를 이용하여 균주 MJM60396의 진화관계도(phylogenetic tree)를 완성하였다. 도 1은 균주 MJM60396의 진화관계도(phylogenetic tree)를 나타낸 도면이다. 도 1에서 보이는 바와 같이 균주 MJM60396의 16S rDNA 염기서열은 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei)의 16S rDNA와 99% 이상의 상동성을 보였다. 이를 통해 균주 MJM60396의 종을 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans)로 확정하였다.
2. 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스( Lactobacillus paracasei subsp . tolerans ) 균주 MJM60396의 인비트로(in vitro) 안전성 평가
(1) 생체 유래 아민 생성 평가
L-phenlyalanine, L-lysine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-argnine, L-ornithine, L-histidine과 같은 아미노산을 각각 추가한 decarboxylase 배지에서 실험 균주를 배양한 후, Bover-Cid와 Holzapfel의 방법(Bover-Cid S, Hozapfel WH. Improved screening procedure for biogenic amine production by lactic acid bacteria. International Journal of Food Microbiology, 1999)에 따라 생체 유래 아민 생성 여부를 확인하였다. 이때, 비교 균주로 엔테로코커스 패칼리스(enterococcus faecalis)를 사용하였다. Bover-Cid와 Holzapfel의 배지 조성은 아래와 같다.
Compostion of Bover - Cid and Holzapfel medium
Tryptone : 0.5 wt%; yeast extract : 0.5 wt%; beef extract : 0.5 wt%; sodium chloride : 0.25 wt%; glucose : 0.05 wt%; tween 80 : 0.1 wt%, MgSO4 : 0.02 wt%; MnSO4 : 0.005 wt%; FeSO4 : 0.004 wt%; Ammonium citrate : 0.2 wt%; Thiamine : 0.001 wt%; dipotassium phosphate : 0.2 wt%; calcium carbonate : 0.01 wt%; pyridoxal 5-phosphate : 0.005 wt%; Amino acid(one of the amino acid listed above) : 1 wt%; bromocresol purple : 0.006 wt%; agar 2 wt%; pH : 5.3
도 2는 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) 균주 MJM60396의 생체 유래 아민 생성 여부를 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 도 2에서 보이는 control 사진은, 아미노산을 첨가하지 않은 decarboxylase 배지를 사용한 실험 결과를 나타낸 것이다. 또한, 도 2에서 사용되는 용어인 "MJM60396"은 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans) 균주 MJM60396를 나타낸다. 도 2에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans) 균주 MJM60396은 생체 유래 아민을 생성하지 않는 것으로 확인되었다.
(2) 뮤신 분해 평가
실험 균주의 뮤신 분해 여부는 0.3% 뮤신(mucin)이 공급된 아가로스 배지를 사용하여 확인하였다. 상기 배지는 trypton 7.5 g/ℓ; casitone 7.5 g/ℓ; yeast extract 3.0 g/ℓ; meat extract 5.0 g/ℓ; NaCl 5.0 g/ℓ; K2HPO4·3H2O 3.0 g/ℓ; KH2PO4 0.5 g/ℓ; MgSO4·7H2O 0.5 g/ℓ; cysteine HCl 0.5 g/ℓ; resazurin 0.002 g/ℓ; D-(+)-glucose 3 g/ℓ; purified HGM 0.5 g/ℓ 및 agarose 1.5 g/ℓ를 기본 성분으로 포함한다. 배지의 pH는 2N NaOH 수용액을 사용하여 약 7.2로 조정하였다. 실험 균주의 24시간 배양액 10 ㎕를 페트리디쉬 안의 아가로스 배지 위에 접종하고, 37℃에서 혐기적으로 72시간 동안 배양하였다. 이후, 배지를 착색제(0.1% Amido black in 3.5 M acetic acid)로 30분 동안 착색하고 콜로니 주변에 뮤신 분해 영역(mucin lysis zone)이 나타날 때까지 1.2M 아세트산으로 세척하였다. 뮤신 분해 활성은 뮤신 분해 영역의 크기로 정의되었다. 양성 대조 균주로 식품 유래 병원균인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) KACC 11240 및 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) KCCM 11802를 사용하였다.
도 3은 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) 균주 MJM60396의 뮤신 분해 여부를 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 도 3에서 사용되는 용어인 "MJM60396"은 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans) 균주 MJM60396를 나타낸다. 도 3에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans) 균주 MJM60396은 뮤신 분해를 하지 않는 것으로 확인되었다.
(3) 용혈 활성 평가
실험 균주의 용혈 활성은 5% 탈섬유소 양 혈액(defibrinated sheep blood)를 포함하는 Columbia blood agar base(BD)를 사용하여 평가하였다. 혈액 한천 배지 내의 콜로니 주변에 클리어런스 영역(clearance zone)이 나타나면 용혈 활성이 양성인 경우를 의미하고 클리어런스 영역(clearance zone)이 나타나지 않으면 용혈 활성이 음성인 경우를 의미한다. 용혈 활성 평가시 양성 대조 균주로 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) KACC 11240을 사용하였다.
도 4는 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) 균주 MJM60396의 용혈 활성 여부를 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 도 4에서 사용되는 용어인 "MJM60396"은 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans) 균주 MJM60396를 나타낸다. 도 4에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans) 균주 MJM60396은 용혈 활성을 보이지 않는 것으로 확인되었다.
(4) 항생제 감수성 평가
실험 균주인 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans) 균주 MJM60396의 항생제 감수성은 특정 항생제에 대한 최소저해농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)로 평가하였다. MIC가 유럽식품안전국(European Food Safety Authority, EFSA)의 cut-off 값보다 크면 실험 균주가 항생제에 내성을 갖는 것으로 평가되고 MIC가 유럽식품안전국(European Food Safety Authority, EFSA)의 cut-off 값보다 작으면 실험 균주가 항생제에 감수성을 갖는 것으로 평가된다. 실험 균주에 대한 항생제의 최소저해농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)는 2-fold broth microdilution method in MRS broth[Wiegand, I., Hilpert, K., and Hancock, R.E.W. 2008. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols 3(2): 163-175. doi: 10.1038/nprot.2007.521.]을 사용하여 측정하였고, 측정된 실험 균주의 최소저해농도를 하기 표 1의 유럽식품안전국(European Food Safety Authority, EFSA)에 의해 추천되는 항생제의 cut-off 값(㎎/ℓ)과 비교하였다. 그 결과, 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans) 균주 MJM60396은 chloramphenicol, tetracycline, Lincomycin, Amikacin, Erythromycin, Streptomycin, paromomycin, penicillin, Ampicillin, Novobiocin, Rifampicin 및 Neomycin과 같은 대부분의 항생제에 대해 내성을 보이지 않는 것으로 나타났다.
[표 1]
Figure 112015119111666-pat00001
3. 인삼 추출물 및 발효 인삼 추출물의 제조
(1) 인삼 추출물의 제조
인삼(Panax ginseng) 뿌리 100g을 수돗물로 세척하고 음건하여 수분을 제거하였다. 음건된 인삼 뿌리를 잘게 썰고 분쇄하여 미세한 인삼 뿌리 분말을 수득하였다. 이후, 인삼 뿌리 분말에 이의 30배 부피에 해당하는 80 wt% 농도의 에탄올을 첨가하고 80℃에서 1시간 동안 추출하였다. 이후, 추출액을 3㎜ 여과지(Whatman filter paper)로 여과하여 여과액을 수득하였다. 또한, 여과 케이크에 이의 20배 부피에 해당하는 80 wt% 농도의 에탄올을 첨가하고 동일한 조건에서 추가로 추출하였다. 추가 추출액을 동일한 방법으로 여과하여 여과액을 수득하였다. 수득한 여과액을 모두 합한 후, 감압하에서 증발시켜 에탄올을 제거하고, 남은 인삼 추출물을 이의 10배 부피의 물에 용해시켜 인삼 추출물 용액을 수득하였다.
(2) 발효 인삼 추출물의 제조
1) 종균 배양(seed culture)
MRS 한천 배지 상에서 배양된 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans) 균주 MJM60396의 단일 콜로니(colony)를 5㎖의 MRS 액체 배지에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) 균주 MJM60396의 배양액 5㎖를 100㎖의 MRS 액체 배지에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양하여, 종균 배양액을 준비하였다. 이후, 종균 배양액을 8000 gf에서 10분 동안 원심분리하여 균체를 수거하고, 수거한 균체를 멸균 PBS(phosphate buffered saline) 용액으로 2번 세척하였다.
2) 인삼 추출물의 발효
위에서 수득한 인삼 추출물 용액 100㎖에 위에서 수거한 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans) 균주 MJM60396의 균체를 첨가하고, 37℃에서 혐기적으로 배양하여 인삼 추출물을 발효시켰다. 발효 후 소정의 시간이 경과하였을 때마다 발효액을 샘플링하였다. 샘플링한 발효액을 여과지로 여과하여 발효 인삼 추출액을 수득하였다.
3) 발효 인삼 추출물의 n-부탄올 분획물 제조
인삼 추출물을 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans) 균주 MJM60396으로 발효시켜 수득한 발효 인삼 추출액에 같은 부피의 n-부탄올을 첨가하고 1시간 동안 교반한 후, 상온에서 12시간 동안 정치(定置)하였다. 이후, 발효 인삼 추출액의 n-부탄올 분획층을 수거하고 감압 조건에서 증발시켜 발효 인삼 추출물의 n-부탄올 분획물을 수득하였다. 발효 인삼 추출물의 n-부탄올 분획물에는 주로 인삼 사포닌인 진세노사이드(ginsenoside)가 함유되어 있다. 수득한 발효 인삼 추출물의 n-부탄올 분획물을 메탄올에 녹인 후, 후술하는 TLC(thin-layer chromatography) 분석 및 HPLC(high performance liquid chromatography) 분석을 위한 시료로 사용하였다.
4. 발효 인삼 추출물에 함유된 인삼 사포닌의 분석
(1) TLC 분석
시료를 TLC 플레이트(silica gel plate; 60 F254; Merck, Darmstadt, Germany) 상에 스폿팅(spotting) 하고 전개 용매(developing solvent)로 클로로포름(chloroform):메탄올(methanol):물(water)의 부피비가 65:35:10인 혼합 용매를 사용하여 전개시켰다. 이후, TLC 플레이트 상에 발색제인 10% 황산 용액을 분무하고 110℃에서 10분 동안 가열하여 발색시켰다.
도 5는 발효 인삼 추출물에 함유된 인삼 사포닌을 TLC로 분석한 결과이다. 도 5에서 "Std"는 순수 진세노사이드들인 Rb1, Rb3, Rc, Re, Rd, Rf, Rg1, Rg2, Rg3, Rh1, Rh2 및 Ck(Compound K)의 표준 혼합물을 나타낸다. 표준물질로 사용한 순수 진세노사이드들은 Chromadex Inc. 및 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다. 또한, "UC"는 미발효된 인삼 추출물의 n-부탄올 분획물을 나타낸다. 또한, "MJM60396"은 인삼 추출물을 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans) 균주 MJM60396으로 5일 동안 발효시켜 수득한 발효 인삼 추출물의 n-부탄올 분획물을 나타낸다. 또한, "DI2"는 인삼 추출물을 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium) 균주 DI2로 5일 동안 발효시켜 수득한 발효 인삼 추출물의 n-부탄올 분획물을 나타낸다. 또한, "NI7"은 인삼 추출물을 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium) 균주 NI7로 5일 동안 발효시켜 수득한 발효 인삼 추출물의 n-부탄올 분획물을 나타낸다. 또한, "AD1"은 인삼 추출물을 락토바실러스 균주 AD1로 5일 동안 발효시켜 수득한 발효 인삼 추출물의 n-부탄올 분획물을 나타낸다. 또한, "LAB2"는 인삼 추출물을 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium) 균주 LAB2로 5일 동안 발효시켜 수득한 발효 인삼 추출물의 n-부탄올 분획물을 나타낸다. 또한, "AD5"는 인삼 추출물을 락토바실러스 균주 AD5로 5일 동안 발효시켜 수득한 발효 인삼 추출물의 n-부탄올 분획물을 나타낸다. 도 5에서 보이는 바와 같이 인삼 추출물을 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans) 균주 MJM60396으로 발효시키는 경우 발효 전 인삼 추출물에 비해 진세노사이드 Rg3, Rh2 및 Rh1의 양이 크게 증가하였고, 진세노사이드 Rg3, Rh2 및 Rh1의 증가량은 다른 균주들로 인삼 추출물을 발효시키는 경우에 비해 현저하게 높은 것으로 나타났다.
(2) HPLC 분석
위에서 수득한 인삼 추출물 용액에 같은 부피의 n-부탄올을 첨가하고 1시간 동안 교반한 후, 상온에서 12시간 동안 정치(定置)하였다. 이후, 인삼 추출물 용액의 n-부탄올 분획층을 수거하고 감압 조건에서 증발시켜 미발효 인삼 추출물의 n-부탄올 분획물을 수득하였다. 또한, 인삼 추출물을 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans) 균주 MJM60396으로 3일, 5일, 7일 및 10일 동안 발효시켜 수득한 발효 인삼 추출액으로부터 동일한 방법을 사용하여 발효 인삼 추출물의 n-부탄올 분획물을 제조하였다. 발효 여부 및 발효 시간에 따라 발효 인삼 추출물의 n-부탄올 분획물에 함유된 진세노사이드의 종류 및 함량이 변화되는 양상을 HPLC로 분석하였다. HPLC 분석 조건은 다음과 같다.
* 칼럼 : Sunfire C18 column(4.5㎜×25㎝)
* 이동상 : 아세토나이트릴(A) 및 물(B)
* 이동상 유속 : 1㎖/min
* 이동상 농도 구배 : 0-8 min, 20-30% A; 8-12 min, 30-40% A; 12-15 min, 40-65% A; 15-20 min, 65-100% A, 20-30 min, 100% A; 30-35 min, 100-30% A; 35-40 min, 30-20% A
* 시료 주입량 : 20㎕
* 용출 진세노사이드 검출 파장 : 203 ㎚
도 6은 미발효 인삼 추출물의 n-부탄올 분획물을 HPLC로 분석한 결과이고, 도 7은 인삼 추출물을 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans) 균주 MJM60396으로 3일 동안 발효시켜 수득한 발효 인삼 추출물의 n-부탄올 분획물을 HPLC로 분석한 결과이고, 도 8은 인삼 추출물을 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans) 균주 MJM60396으로 5일 동안 발효시켜 수득한 발효 인삼 추출물의 n-부탄올 분획물을 HPLC로 분석한 결과이고, 도 9는 인삼 추출물을 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans) 균주 MJM60396으로 7일 동안 발효시켜 수득한 발효 인삼 추출물의 n-부탄올 분획물을 HPLC로 분석한 결과이고, 도 10은 인삼 추출물을 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans) 균주 MJM60396으로 3일 동안 발효시켜 수득한 발효 인삼 추출물의 n-부탄올 분획물을 HPLC로 분석한 결과이다. 도 6 내지 도 10에서 보이는 바와 같이 인삼 추출물을 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans) 균주 MJM60396으로 발효시키는 경우 진세노사이드 Rb1 또는 Rd가 진세노사이드 Rg3로 전환되고, 진세노사이드 Rd, Rg3의 일부는 다시 진세노사이드 Rh2로 전환되었다. 인삼 추출물을 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans) 균주 MJM60396으로 5일 동안 발효시켰을 때 진세노사이드 Rd가 가장 풍부하게 존재하였고, 7일 동안 발효시켰을 때 진세노사이드 Rg3가 가장 풍부하게 존재하였고, 10일 동안 발효시켰을 때 진세노사이드 Rd의 대부분 및 Rg3의 일부는 진세노사이드 Rh2로 전환되었다.
5. 유산균의 수탁 정보
본 발명의 발명자들은 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp . tolerans) 균주 MJM60396을 2015년 11월 10일에 공인기탁기관인 한국농업미생물자원센터에 특허기탁 하여 수탁번호 KACC 92105P를 부여받았다.
이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
한국농업미생물자원센터 KACC92105P 20151110
<110> Myongji University Industry and Academia Cooperation Foundation <120> Lactobacillus paracasei strain with biological conversion activity of saponin, fermented ginseng extracts and manufacturing method of fermented ginseng extracts <130> DP-15-970 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1473 <212> DNA <213> 16S rDNA of Lactobacillus paracasei subsp. tolerans MJM60396 <400> 1 gcagtcgacg agttctcgtt gatgatcggt gcttgcaccg agattcaaca tggaacgagt 60 ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcccttaag tgggggataa catttggaaa 120 cagatgctaa taccgcatag atccaagaac cgcatggttc ttggctgaaa gatggcgtaa 180 gctatcgctt ttggatggac ccgcggcgta ttagctagtt ggtgaggtaa tggctcacca 240 aggcgatgat acgtagccga actgagaggt tgatcggcca cattgggact gagacacggc 300 ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgcaa gtctgatgga 360 gcaacgccgc gtgagtgaag aaggctttcg ggtcgtaaaa ctctgttgtt ggagaagaat 420 ggtcggcaga gtaactgttg tcggcgtgac ggtatccaac cagaaagcca cggctaacta 480 cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta tccggattta ttgggcgtaa 540 agcgagcgca ggcggttttt taagtctgat gtgaaagccc tcggcttaac cgaggaagcg 600 catcggaaac tgggaaactt gagtgcagaa gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg 660 aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctgtctggt ctgtaactga 720 cgctgaggct cgaaagcatg ggtagcgaac aggattagat accctggtag tccatgccgt 780 aaacgatgaa tgctaggtgt tggagggttt ccgcccttca gtgccgcagc taacgcatta 840 agcattccgc ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc 900 gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt 960 gacatctttt gatcacctga gagatcaggt ttccccttcg ggggcaaaat gacaggtggt 1020 gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1080 ccttatgact agttgccagc atttagttgg gcactctagt aagactgccg gtgacaaacc 1140 ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg 1200 ctacaatgga tggtacaacg agttgcgaga ccgcgaggtc aagctaatct cttaaagcca 1260 ttctcagttc ggactgtagg ctgcaactcg cctacacgaa gtcggaatcg ctagtaatcg 1320 cggatcagca cgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca 1380 tgagagtttg taacacccga agccggtggc gtaacccttt tagggagcga gccgtctaag 1440 gtgggacaaa tgattagggt gaagtcgtaa caa 1473

Claims (18)

16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하고,
인삼에 포함된 메이저 사포닌인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re 또는 Rg1을 마이너 사포닌인 진세노사이드 Rg3, Rh1 또는 Rh2로 생물전환 시키는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) MJM60396(수탁번호 : KACC 92105P) 균주.
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 진세노사이드 Rb1 또는 Rd를 진세노사이드 Rg3로 생물전환 시키는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) MJM60396(수탁번호 : KACC 92105P) 균주.
제 1항에 있어서, 진세노사이드 Rd 또는 Rg3를 진세노사이드 Rh2로 생물전환 시키는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) MJM60396(수탁번호 : KACC 92105P) 균주.
삭제
인삼을 제 1항, 제 4항 또는 제 5항 중 어느 한 항의 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) MJM60396(수탁번호 : KACC 92105P) 균주로 발효시킨 산물의 추출물이거나 인삼 추출물을 제 1항, 제 4항 또는 제 5항 중 어느 한 항의 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) MJM60396(수탁번호 : KACC 92105P) 균주로 발효시킨 산물인 것을 특징으로 하는 발효 인삼 추출물.
제 7항에 있어서, 상기 인삼은 수삼, 백삼, 홍삼, 산양삼, 산삼 또는 산삼 배양근에서 선택되는 것을 특징으로 하는 발효 인삼 추출물.
제 7항에 있어서, 상기 인삼 추출물의 추출 용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 발효 인삼 추출물.
인삼에 제 1항, 제 4항 또는 제 5항 중 어느 한 항의 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) MJM60396(수탁번호 : KACC 92105P) 균주를 접종하고 발효시켜 발효 인삼을 수득하는 단계; 및 상기 발효 인삼을 추출 용매로 추출하여 발효 인삼 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 발효 인삼 추출물의 제조방법.
제 10항에 있어서, 상기 인삼은 수삼, 백삼, 홍삼, 산양삼, 산삼 또는 산삼 배양근에서 선택되는 것을 특징으로 하는 발효 인삼 추출물의 제조방법.
제 10항에 있어서, 상기 발효 인삼의 추출 용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 발효 인삼 추출물의 제조방법.
제 10항에 있어서, 발효 인삼 추출물로부터 탄소 수가 3 내지 6인 알코올에 가용성인 성분을 분획하는 단계를 더 포함하는 발효 인삼 추출물의 제조방법.
인삼 추출물에 제 1항, 제 4항 또는 제 5항 중 어느 한 항의 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스(Lactobacillus paracasei subsp. tolerans) MJM60396(수탁번호 : KACC 92105P) 균주를 접종하고 발효시켜 발효 인삼 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 발효 인삼 추출물의 제조방법.
제 14항에 있어서, 상기 인삼은 수삼, 백삼, 홍삼, 산양삼, 산삼 또는 산삼 배양근에서 선택되는 것을 특징으로 하는 발효 인삼 추출물의 제조방법.
제 14항에 있어서, 상기 인삼 추출물의 추출 용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 발효 인삼 추출물의 제조방법.
제 14항에 있어서, 발효 인삼 추출물로부터 탄소 수가 3 내지 6인 알코올에 가용성인 성분을 분획하는 단계를 더 포함하는 발효 인삼 추출물의 제조방법.
제 14항에 있어서, 발효 시간은 5일 내지 15일인 것을 특징으로 하는 발효 인삼 추출물의 제조방법.
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