KR20160012446A

KR20160012446A - 귤나무 꽃잎 및 차엽으로부터 화차 추출물을 생성시키는 방법, 및 상기 차엽 추출물을 포함하는 화장품 조성물

Info

Publication number: KR20160012446A
Application number: KR1020140093883A
Authority: KR
Inventors: 석보영; 박상용; 현동관
Original assignee: 석보영
Priority date: 2014-07-24
Filing date: 2014-07-24
Publication date: 2016-02-03

Abstract

본 발명은, 귤나무 꽃잎 및 차엽으로부터 화차 추출물을 생성시키는 방법, 및 상기 추출물을 포함하는 화장품 조성물, 특히 피부 상태를 개선시키기 위한 화장품 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따라, 귤나무의 꽃잎 및 차엽으로부터 화차 추출물을 생성시키는 방법으로서, (a) 귤나무의 꽃잎 및 차엽으로부터 화차 건조물을 제조하는 단계; (b) 상기 화차 건조물의 중량에 기초하여, 탄소수 1 내지 3의 무수 또는 함수 알코올 및 물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매를 1 내지 15배로 상기 화차 건조물에 첨가하는 단계; 및 (c) 0 내지 100℃의 온도에서 1 내지 12시간 동안 추출기를 사용함으로써 상기 화차 건조물로부터 화차 추출물을 생성시키는 단계를 포함하는 방법; 상기 방법에 의해 제조된 화차 추출물; 및 상기 화차 추출물을 포함하는 화장품 조성물이 제공된다. 본 발명에 따르면, 저비용으로 귤나무의 꽃잎 및 차엽으로부터 화차 추출물을 생성시킬 수 있고, 상기 화차 추출물을 포함하는 화장품 조성물은 콜라겐 생성 촉진 효과, 피부노화 방지 효과, 항산화 효과, 및 피부미백 효과와 함께 우수한 안전성(safety)을 나타낸다.

Description

귤나무 꽃잎 및 차엽으로부터 화차 추출물을 생성시키는 방법, 및 상기 차엽 추출물을 포함하는 화장품 조성물{METHOD FOR PREPARING SCENTED TEA LEAVE EXTRACT FROM CITRUS FLOWERS AND TEA LEAVES, AND COSMETIC COMPOSITION COMPRISING SAID TEA LEAVE EXTRACT}

본 발명은, 귤나무 꽃잎 및 차엽으로부터 화차 추출물을 생성시키는 방법, 및 상기 차엽 추출물을 포함하는 화장품 조성물, 특히 피부 상태를 개선시키기 위한 화장품 조성물에 관한 것이다.

최근, 현대 사회에 크게 대두되고 있는 '웰빙' 현상은, 단순히 잘 먹고 잘 살자라는 일차적인 의미뿐만 아니라, '신체의 건강이 외모, 즉 피부의 아름다움으로서 표현된다' 라는 부가적인 의미까지 내포하고 있다. 이와 같이, 웰빙 현상은 피부 분야에서 예컨대 미용과 관련되어 가장 많이 나타나고 있으며, 이러한 피부미용은 현재 단편적인 외모적 효능을 벗어나 피부노화 억제 등의 복합적인 신체 기능과 이와 관련된 과학적인 개선을 위한 접근을 필요로 하고 있다.

이러한 피부노화는 크게 2가지 종류로 나눌 수 있다. 그 중 하나는 내인성 노화(intrinsic aging)로서 세월이 흘러감에 따라 피할 수 없는 피부노화 현상을 지칭한다. 나머지 하나는 광노화(photo-aging)로서 오랫동안 햇빛에 노출된 얼굴, 손, 목 등의 피부에서 관찰되는 피부노화 현상을 지칭하는 것이며, 상기 내인성 피부노화 현상과 자외선 등의 외부 빛에 의한 피부노화 현상의 합쳐진 결과로서 발생한다.

이러한 피부노화의 주요 원인은, 콜라겐 섬유, 탄력 섬유(elastic fiber) 등의 손상으로 이어지는 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin) 등의 기질 단백질이 손상되고, 이로 인해 피부 내 콜라겐의 양이 부족해지고 탄력 섬유가 변성됨으로써 나타난다고 알려져 있다. 또한, 피부노화 과정에서, 이러한 콜라겐은 그의 합성이 다양한 신호전달 경로를 거쳐 감소되고, 콜라겐을 비롯한 여러 세포 외 기질 단백질의 분해 효소인 매트릭스 금속단백분해효소(matrix metalloproteinase)(MMP)의 발현이 증가된다고 알려져 있다.

이와 같이, 콜라겐은 피부노화와 관련된 주요 인자로서 인식되어 지며, 이러한 콜라겐의 합성 증진 및 분해 억제는 피부노화 억제 및 피부미용 개선과 관련하여 중요한 지표가 되고 있다.

또한, 멜라닌(melanin)은 주로 티로시나제(tyrosinase)의 작용에 의하여 생성되는 것으로 보고되고 있다. 이러한 티로시나제는, 구리와 결합한 효소로서, 동물, 식물, 미생물 및 사람 등에게서 넓게 분포되어 있고, 모노하이드록시- 또는 다이하이드록시-페닐알라닌(dihydroxy-phenylalanine, DOPA) 등의 페놀 화합물에서 호기적 산화를 촉진시키고, 자외선에 심하게 노출된 피부에서 멜라닌토스(melanintorth)를 침착시켜서 피부노화 또는 피부손상을 유발시키는 작용을 한다. 이러한 멜라닌의 생합성 기전은 피부암과 관련하여 최근 집중적으로 연구되고 있고, 이로부터 다양한 멜라닌 생성 저해제 등이 개발되어 의약품 산업에서 피부질환 치료제로서, 화장품 산업에서 기미, 주근깨 등을 예방 및 개선하는 피부 미백제로서, 또는 식품 산업에서 갈변 방지제 등으로서 적용되고 있다.

지금까지, 이러한 멜라닌의 생성 저해제에 대한 연구에서는 주로 티로시나제 저해제를 개발하는 방향으로 집중되어 왔고, 대표적인 티로시나제 저해제로는 티로시나제 활성 부위의 구리 이온에 대한 킬레이트 형성물질, 퀴논류를 페놀류로 환원시키는 아스코르브산 등의 환원제, 및 티로시나제 자체를 변성시키는 바이설파이트(bisulfite) 제제 등을 들 수 있다.

이러한 티로시나제 저해제의 일례로서, 잣나무, 소나무의 껍질과 잎 또는 쑥으로부터 추출한 추출물, 상기 추출물로부터 분리된 페놀산과 루코안토시안, 이들에 함유되어 있는 기존에 알려진 페놀산들과의 피부미백용 조성물, 및 상기 조성물의 화장품, 멜라닌 관련 질환의 치료제 및 식품 첨가물로서의 용도에 관한 기술이 또한 알려져 있다(예컨대, 해태제과 주식회사에 의해 출원된 대한민국 특허 공개공보 10-2001-0017516 참조).

예를 들어, 멜라닌 생성 저해제로서는 하이드로퀴논(hydroquinone), 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 그의 유도체, 코직산(kojic acid), 글루타치온(glutathione), 알부틴(arbutin)과 같은 티로시나아제에 대해 저해 활성을 갖는 물질이 알려져 있다. 그러나, 이들 중에서, 하이드로퀴논은 피부에 대한 자극이 너무 강해서 그의 사용이 제한되고; 아스코르브산은 산화되기 쉬워서 이를 포함하는 제형의 변색, 변취 되는 등의 문제가 발생하고; 코직산은 용액 내에서 불안정하여서 이를 포함하는 제형의 안정성이 낮으며 갑상선암 등과 같은 발암성의 문제가 있고; 알부틴의 경우는 그 활성이 높지 않고; 글루타티온, 시스테인 등의 티올계 화합물은 특유의 불쾌한 냄새를 가질 뿐만 아니라 경피 흡수에도 문제점이 있고 이들이 배당체 및 유도체들도 극성이 높으므로 화장품 원료에 배합하기 어려운 문제가 있다.

따라서, 상기 종래 기술의 문제점들을 해결하면서, 저비용의 천연물질로부터 피부노화, 피부미백, 항산화 등의 피부미용을 개선시키기 위한 화장품 조성물이 여전히 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은, 피부노화 방지와 더불어, 피부미백 활성 및 항산화 활성 등의 복합 기능을 갖는 피부미용을 개선시키기 위한 연구에서, 귤나무의 꽃향을 보유한 차엽(tea leave) 또는 화차(건조물)로부터의 추출물(이후, 본원에서 "차엽 추출물" 또는 "화차 추출물"로도 지칭함)을 사용하는 경우 피부미용에 우수한 활성을 나타낸다는 것을 알게 되어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 일 실시양태에 따라, 피부미용에 우수한 활성을 나타내는 화장품 조성물을 제조하기 위해, 귤나무 꽃잎 및 차엽으로부터 화차 추출물을 생성시키는 방법, 및 상기 화차 추출물을 유효성분으로서 포함하는 피부노화, 피부미용 또는 주름을 개선시키기 위한 화장품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 저비용으로 통상적으로 입수 가능한 귤나무의 꽃잎 및 차엽으로부터 피부미용을 개선시키기 위한 기본적인 추출물을 제조할 수 있으며, 이로 인해 제조된 추출물을 포함하는 화장품 조성물에서는, 인간의 피부 섬유아세포(HDF: human dermal fibroblast)에서의 콜라겐 생성(생합성) 촉진 효과, MMP-1 억제를 통한 주름개선등과 같은 피부노화 방지 효과, DPPH 라디칼(radical) 억제를 통한 항산화 효과, 및 B16F10 멜라노마 세포에 처리했을 때 멜라닌 생성 저해를 통한 피부미백 효과를 탁월하게 발현함과 동시에, 세포 생존율 변화를 유발시키지 않는 우수한 안전성(safety)을 나타낸다.

도 1은 시험예 1에 따라 수행한 실시예 1의 추출물의 인간 섬유아세포 성장에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 2는 시험예 1에 따라 수행한 실시예 1의 추출물에 대한 Type-1 Procollagen 및 MMP-1의 mRNA 발현량을 확인 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 시험예 2에 따라 수행한 실시예 1의 추출물에 대한 멜라닌 함량 및 세포 생존율 실험의 결과를 나타내는 그림이다.
도 4는 시험예 3에 따라 수행한 실시예 1의 추출물에 대한 항산화 결과를 나타내는 그래프이다.

앞서 언급된 바와 같이, 종래 기술에서 피부노화를 억제하고 주름을 개선하며, 항산화 효과 및 미백효과 등을 나타내기 위해서는 콜라겐 생성촉진효과, MMP-1 억제효과, DPPH radical 억제활성 및 멜라닌 생성억제효과를 필요로 한다.

귤나무(Citrus)는, 운향과(Rutaceae)의 속으로서, 구연산 함유량이 높아서 특유의 신 맛과 향을 갖고 즙이 많은 열매를 맺는다. 특히, 열매에는 비타민 C와 플라보노이드가 풍부한 것으로 알려져 있다.

또한, 차는 좁게는 차나무(tea)의 잎(즉, 차엽)을 달이거나 우린 물을 의미하나, 넓게는 다양한 식물의 잎이나 뿌리, 과실 따위를 그대로 또는 가공하여 달이거나 우려서 만든 마실 것을 모두 포함한다. 따라서, 차에는 차나무 잎(차엽)을 이용하여 제조된 녹차, 청차, 홍차, 보이차 뿐만 아니라, 기타 인삼차, 대추차, 칡차, 생강차 등(이를 차엽으로 만든 차를 대신하는 마실거리라는 의미에서 대용차라 함)도 포함된다.

최근에는 국화차, 매화차, 민들레차 등과 같이 다양한 꽃 또는 꽃잎 자체를 이용한 차뿐만 아니라, 이러한 다양한 꽃 또는 꽃잎으로부터의 향 또는 향기가 차나무 잎에 흡착된 "꽃차" 또는 "화차"가 음용되고 있다. 건조한 꽃 또는 꽃잎 자체, 또는 상기 꽃 또는 꽃잎으로부터의 향 또는 향기가 차 또는 차엽에 흡착된 건조한 "꽃차" 또는 "화차"를 우려서 마시는 것으로서 대용차라 할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "화차"는 꽃 또는 꽃잎으로부터의 향 또는 향기가 차 또는 차엽에 흡착되어 있는 차 생성물 또는 건조한 차 생성물(즉, 화차 건조물)을 지칭한다. 또한, 용어 "화차 추출물"은 꽃 또는 꽃잎으로부터의 향 또는 향기가 차 또는 차엽에 흡착되어 있는 건조한 상태의 화차 건조물로부터 특정 용매와 조건을 사용하여 추출된 생성물을 지칭한다(대한민국 공개특허공보 10-2011-0005229).

본 발명에서는 특히 귤나무 꽃향이 차에 흡착된 화차(건조물)로부터의 화차 추출물을 사용하는 화장품 조성물, 구체적으로 피부 상태를 개선시키기 위한 화장품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시양태에 따라, 귤나무의 꽃잎 및 차엽으로부터 화차 추출물을 생성시키는 방법으로서, (a) 귤나무의 꽃잎 및 차엽으로부터 화차 건조물을 제조하는 단계; (b) 상기 화차 건조물의 중량에 기초하여, 탄소수 1 내지 3의 무수 또는 함수 알코올 및 물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매를 1 내지 15배로 상기 화차 건조물에 첨가하는 단계; 및 (c) 0 내지 100℃의 온도에서 1 내지 12시간 동안 추출기를 사용함으로써 상기 화차 건조물로부터 화차 추출물을 생성시키는 단계이 제공된다.

본 발명에서 추출 용매는 물, 탄소수 1 내지 3의 무수 또는 함수 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 이들의 혼합용매(예를 들어, 함수 알코올, 함수 글리세린 등 2개의 용매혼합 또는 2개 이상의 용매혼합) 중에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출하여 제조되며, 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 알코올에서 선택된 용매로 추출되는 것이 바람직하다. 여기서, 탄소수 1 내지 3의 알코올은 메탄올, 에탄올, n-프로판올, iso-프로판올 등이 있다. 이들 추출용매 중 함수 에탄올이 바람직하며, 그 중에서도 70% 함수 에탄올이 가장 바람직하다.

본 발명의 다른 실시양태에 따라, 이러한 귤나무의 비제한적인 종의 예로는 감귤(Citrus unshiu), 라임(Citrus aurantifolia), 만다린(Citrus reticulata), 시트론(Citrus medica), 왕귤(Citrus maxima), 유자(Citrus aurantium), 또는 기타 교배종, 예컨대 그레이프프루트(Citrus x paradisi), 레몬(Citrus x limon), 오렌지(Citrus x sinensis) 등이 있다. 이와 같이, 상기 단계(a)의 귤나무는 그의 종류에 크게 제약을 받지 않지만, 바람직하게는 감귤(Citrus unshiu), 만다린(Citrus reticulata), 유자(Citrus aurantium) 또는 오렌지(Citrus x sinensis), 가장 바람직하게는 감귤(Citrus unshiu)이다.

본 발명의 다른 실시양태에 따라, 상기 단계(a)의 꽃잎이, 꽃봉오리가 열리기 시작한 상태 내지 70% 열려진 상태, 씨방이 제거된 것, 또는 찢겨진 상태이거나 분쇄된 상태인 것을 특징으로 한다. 이러한 꽃잎의 성숙 또는 외형 상태는 최종 추출물의 성분에 크게 영향을 미칠 수 있으므로, 그의 선별에 있어서 다소 유의해야 할 필요가 있다. 구체적으로, 귤나무 꽃잎은 개화 직후의 것을 이용하는 것이 바람직하다. 개화 직후라 함은, 꽃봉오리가 막 열리기 시작한 상태의 것으로부터 꽃잎이 70%정도 열린 상태까지가 적당하다. 또한, 귤나무 꽃잎은 채화 후 모양과 개화상태가 양호한 것을 선별하여 불필요한 꽃 받침 부분을 다듬은 후, 손으로 공기 중에 흩날려서 산열과 습기를 함께 제거하는 것이 바람직하다. 귤나무 꽃잎은 생화를 통꽃 상태로 사용할 수도 있고, 꽃잎을 찢거나 분쇄하여 사용할 수도 있다. 꽃잎을 찢거나 분쇄하는 과정은 절차기에 넣어서 수행할 수 있으며, 수작업에 의해 가위로 수행할 수도 있다. 귤나무 꽃잎의 씨방은 제거하지 않고 그대로 사용해도 되지만, 씨방을 제거하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 실시양태에 따라, 상기 단계(a) 내지 (c)의 꽃잎에서 갈색 꽃잎을 제거하는 것을 특징으로 한다. 이러한 꽃잎의 색이 갈색의 경우, 즉 갈변된 꽃잎은 그의 내부에 함유된 성분 중 휘발성 성분이 손실되어 있을 우려가 있으므로, 갈변된 꽃잎은 사용하지 않는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 실시양태에 따라, 상기 추출기가 냉각 콘덴서가 장착된 것을 특징으로 하는 한다.

본 발명의 다른 실시양태에 따라, 상기 단계(a) 후, 용매가 첨가된 꽃잎을 상온에서 1 내지 7일간 침적시켜 추출하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 한다.

본 발명의 다른 실시양태에 따라, 상기 단계(a) 후, 용매가 첨가된 꽃잎을 상온에서 1 내지 7일간 침적시켜 가온 추출하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 한다.

본 발명의 다른 실시양태에 따라, 상기 단계(a) 후, 용매가 첨가된 꽃잎을 70% 알코올로 침적시켜 3 내지 7일 동안 추출하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 한다.

본 발명의 다른 실시양태에 따라, 상기 단계(c) 후, 여과 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 한다.

본 발명의 다른 실시양태에 따라, 상기 단계(c) 후, 감압 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 한다.

본 발명의 다른 실시양태에 따라, 상기 단계(c) 후, 농축 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 한다.

본 발명의 다른 실시양태에 따라, 전술된 방법에 의해 제조된 추출물이 제공된다.

본 발명의 다른 실시양태에 따라, 조성물의 총 중량에 기초하여, 전술된 방법에 의해 제조된 추출물 0.001 내지 50중량%를 포함하는 피부미용을 개선시키기 위한 화장품 조성물이 제공된다.

상기 화장품 조성물은 상기 화차 추출물을 사용하여 통상적인 화장품의 제조방법에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 화장품 조성물은 상기 화차 추출물을 함유하는 향장 제품, 샴푸, 헤어로션, 헤어크림, 헤어 젤 등의 형태로 제조될 수 있으며, 이는 통상의 클렌징액, 수렴액 및 보습액으로 희석하여 사용될 수 있다. 또한, 상기 화장품 조성물은 화장품 조성물 분야에서 통상적으로 사용되는 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예, 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예, 시험예 및 제조예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 귤나무 꽃잎 및 차엽으로부터 화차 추출물의 제조

귤나무(Citrus unshiu)의 꽃잎 및 차엽을 정제수로 세척한 후, 이들을 건조시켜 화차 건조물을 제조한다(대한민국 공개특허공보 10-2011-0005229). 상기 화차 건조물 50 g에 증류수 1 ㎏을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 약 80 내지 약 100 ℃로 대략 2시간 끓여서 추출한다. 그 다음, 300메쉬(mesh) 필터로 여과하고, 약 1주일간 실온에서 방치한 후, 침전된 여과물을 에드벤텍 5 여과지와 Whatman GF/C 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그 다음, 감압 농축기를 이용하여 약 40 내지 약 50℃의 온도에서 농축한 후, 농축된 여과물에 대하여, 180 ℃의 입구 온도, 100%(35 ㎤/시)의 Aspirator 효율, 25 %(7.5 ㎖/분)의 펌프 효율, Nozzle Cleaner 4 및 30㎜(357 L/시)의 Rotameter를 갖는 Mini Spray Dryer B-290(BUCHI)를 다음 조건으로 건조시켜서 화차 추출물 10g을 분말로서 수득하였다.

또한, 추출 용매로서 에탄올을 여러 농도로서 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1의 방법과 동일한 방법으로 추출물을 수득하였다.

시험예 1. 피부 노화 억제 및 주름 개선 실험

(1) 세포 배양

유아 포경에서 절제된 피부 진피층에서 분리 및 배양하여 수득한 인간 정상 피부 섬유아세포(Human normal dermal fibroblast)(MCTT : Mordern Cell & Tissue Technologies, Seoul, Korea, Cataloge No. MC1213)를 6웰 플레이트(6-well plate)의 각 웰(well)에 1 x 10⁵ 개수의 세포가 되도록 접종한 후, 소 태아 혈청(fetal bovine serum)이 10 % 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 24시간 동안 배양하였다.

(2) 인간 정상 피부 섬유아세포(Human normal dermal fibroblast) 성장에 미치는 영향 평가

화차 추출물이 인간 정상 피부 섬유아세포의 성장 효과에 미치는 영향을, 시험예 1의 (1)에서와 같이 배양한 섬유아세포를 이용하여 평가하였다. 배지는 10% FBS(fetal bovine serum, Cambrex)가 포함된 DMEM 배지를 사용하였으며, 화차 추출물 처리 72시간 후에, MTT 분석으로부터 얻어진 결과는 도 1와 같다. 도 1의 결과로부터, 화차 추출물이 높은 섬유아세포 성장 촉진 활성을 가짐을 알 수 있다. 특히, 화차 추출물에서는 섬유아세포 증식 효능이 이미 주름 개선 효능에 대해 알려져 있는 EGCG보다 높게 나타난다.

(3) 자외선 조사 및 화차 추출물의 처리

상기 (1)에서 배양된 세포에 인산 완충액(Phosphate buffered saline, PBS)을 이용하여 세포를 3회 세척한 후, 다음과 같이 자외선 A 또는 자외선 B를 조사하여 피부노화를 유발하였다. 자외선 B: 자외선 B 램프(Sankyo Denki G9T5E lamp, Sankyo Denki Co., Japan)를 이용하여 총 144 mJ/cm²를 조사하였다. 자외선 조사 직후, 세포를 다시 인산 완충액으로 세척하고 소 태아 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지에 화차 추출물(실시예 1의 화차 추출물)을 0.8 내지 10 ug/ml의 농도로 첨가하여 48 시간 동안 추가로 배양하였다. 시험군은 다음과 같이 나누었다:

* 무처리군 - 자외선 및 화차 추출물 모두 처리하지 않음

* 자외선 단독 처리군 - 오직 자외선만 처리

* 실험군 - 자외선 및 화차 추출물(0.8 내지 10 ug/ml) 모두 처리함

(4) RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction)

전체 RNA(Total RNA) 분리는 통상적인 TRIZOL 방법을 이용하였고, RNA 퀼리티(quality)와 퓨리티(purity)는 A260/280 비를 구하여 계산하였다. 또한, 1.5% 아가로스 겔 영동을 이용해 RNA의 안정성을 확인하였다. RT-PCR은 One-step RT-PCR PreMix Kit(Cat No. 25101, 인트론 바이오테크놀로지, 한국)을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다.

프라이머 올리고뉴클레오티드 서열은 인간 유래 Type-1 Procollagen 및 MMP-1 (Matrix metalloproteinase type I)에 작용하는 것으로 보고된 서열을 상동성(homology) 확인을 거쳐 이용하였다. 즉, 정방향 Type-1 Procollagen 프라이머는 3'-ATTCTACTGATATCGGGGCTTTGA-5'이고, 역방향 Type-1 Procollagen 프라이머는 5'-ATGTCCTTGGGGTATCCGTGTAG-3'이다. 이는 약 409bp의 DNA 프래그먼트를 증폭시키는 것으로 나타났다. 또한, 정방향 MMP-1 프라이머는 3'-ATTCTACTGATATCGGGGCTTTGA-5'이고, 역방향 MMP-1 프라이머는 5'-ATGTCCTTGGGGTATCCGTGTAG-3'이다. 이는 약 409bp의 DNA 프래그먼트를 증폭시키는 것으로 나타났다. 휴먼 베타-액틴 유전자(human beta-actin gene)에 대한 GAPDH의 프라이머(정방향: 5'-TGGAAATCCCATCACCATTT-3', 역방향: 5'-GGAGGCATTGCTGATGATCT-3')는 Bioneer(Daegu, Korea)로부터 구입하였다. 이는 약 240bp의 DNA 프래그먼트를 증폭시키는 것으로 나타났다. 또한 측정 시료 각각의 mRNA 양을 확인하기 위하여 사용하였다. PCR 산물은 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동을 실시한 후, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide, EtBr) 염색을 실시하였다.

(5) 시험 결과

인간 정상 피부 섬유아세포에 자외선을 조사한 경우(자외선 단독 처리군) MMP-1의 발현은 증가하였으나, 본 발명에 따라 얻어진 화차 추출물 처리에 의하여 MMP-1의 발현은 농도 의존적으로 감소하였다(도 2). 또한, 인간 정상 피부 섬유아세포에 자외선을 조사한 경우(자외선 단독 처리군) Type-1 Procollagen의 발현은 감소하였으나, 본 발명에 따라 얻어진 화차 추출물 처리에 의하여 Type-1 Procollagen의 발현은 농도 의존적으로 증가하였다(도 2). 이와 같이, 본 발명의 열수 추출물에서는 Type-1 Procollagen 생성 및 MMP-1 억제 효능을 나타내는 것으로 확인되었다.

따라서, 본 발명에 따라 얻어진 추출물은 콜라겐의 생성에 관여하는 Type-1 Procollagen의 유전자 발현은 증가시키고, 콜라겐의 분해에 관여하는 콜라게나제(MMP-1)의 유전자 발현을 억제함으로써 우수한 주름개선 활성을 가짐을 알 수 있다.

시험예 2. B16F10 멜라노마(melanoma)에 대한 효능 실험

(1) 멜라닌 함량 측정

B16F10 생쥐 유래 멜라노마 세포주(B16F10 murine melanoma cell line)(ATCC CRL-9475)를 24-웰 플레이트에 1 X 10⁴ 세포/웰로 접종하여 24시간 동안 배양하였다. 흑색종화(melanogenesis)를 촉진하는 것으로 알려진 alpha-MSH(alpha-melanin stimulating hormone)를 배지에 첨가하였다. 웰당 990 ㎕의 배양액을 매일 갈아주고, 농도에 맞춘 10 ㎕의 시료(실시예 1의 화차 추출물)를 3일간 처리한 후, 1일간 더 배양하였다.

그 후, 배양한 세포에서 배지를 제거한 후, 세포를 회수하고 원심분리하여 세포 펠렛(cell pellet)을 얻었다. 10% DMSO(dimethyl sulfoxide)가 포함된 1N 수산화나트륨 용액을 첨가한 후, 60 ℃에서 2시간 동안 배양하여 멜라닌을 용해시킨 후, 400 내지 405 nm에서 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하여, 멜라닌 함량을 측정하였다.

(2) 세포 생존율 측정

상기 (1)에서 배양한 세포에서 배지를 제거하고, 세포를 10 mM 인산완충액(PBS, pH 7.4)으로 세척한 후, 크리스탈 바이올렛 염색제(Crystal violet 0.1%, 10% 에탄올, 나머지 PBS)를 200 ㎕를 첨가하여 5분간 상온에서 배양한 후, 물로 2회 세척하였다. 에탄올 1 ㎖을 첨가하여 상온에서 20분간 진탕한 후, 590 nm에서 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하여, 세포 생존율을 측정하였다.

(3) 시험 결과

상기와 같이 멜라닌 함량 및 세포 생존율을 측정한 결과는 도 3과 같다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 추출물에서의 멜라닌 생합성 억제 효능이 미백 효능을 갖는 것으로 알려져 있는 Kojic acid 및 EGCG보다 높게 나타난다.

따라서, 본 발명에 따라 얻어진 화차 추출물은 농도 의존적으로 멜라닌 생성을 억제시킬 뿐만 아니라, 세포독성 또한 낮아서 우수한 피부미백용 조성물로 사용할 수 있음을 확인할 수 있다.

시험예 3. 항산화 활성 측정

DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, Sigma, USA)의 환원력을 이용하는 상 등의 문헌(Sang S et al., J. Agric. Food Chem. 50(8), p2459-2463, 2002)에 기재된 방법에 따라, 본 발명에 따른 화차 추출물의 항산화 활성을 측정하였다.

메탄올에 녹인 0.2mM DPPH 용액 180 ul와 증류수 20ul에 녹인 시료(실시예 1에서 제조한 화차 추출물)(1, 10, 100 ug/ml)를 96-웰 마이크로플레이트에 넣고 37℃에서 30 분간 배양한 후, 환원된 DPPH의 양을 분광광도계(Precision microplate reader; Molecular Devices, VersaMax)를 이용하여 520nm에서 흡광도를 측정하여 시료를 가하지 않는 무첨가 대조군과 활성을 비교하였다.

상기 시험은 3회 반복하였으며, 그 결과는 도 4와 같다. 도 4와 같이, 본 발명의 열수 추출물 및 EtOH 추출물에서의 DPPH 라디칼 소거 활성능이 항산화 효능을 갖는 것으로 알려져 있는 알부틴보다 높게 나타난다.

따라서, 본 발명에 따라 제조된 화차 추출물은 용량-의존적으로 우수한 항산화 활성을 나타내며, 미백 및 주름개선 활성을 가질 것으로 기대된다.

실험예 4. 버섯 유래 티로시나제에 대한 저해활성 측정

이시하마(Ishihara Y) 등의 문헌(J. Antibiot(Tokyo). 44(1), p25-32, 1991)에 기재된 활성 실험법을 변형하여, 멜라닌 생합성에 관여하는 버섯 유래 티로시나제 저해활성을 측정하였다.

0.3 %의 티로신 용액 50 ul(0.1M 인산 완충액 pH6.8에 용해시킴임)와 증류수 50 ul에 녹인 시료(실시예 1에서 제조한 화차 추출물)(1, 10, 100 ug/ml)를 96-웰 마이크로플리에트에 넣고 버섯 추출 티로시나제(200U/ml, 0.1M 인산 완충액 pH6.8에 용해시킴) 50 ul를 첨가하였다. 37℃에서 10분간 배양한 후, 생성된 도파 크롬의 양을 분광광도계(Precision microplate reader; Molecular Devices, VersaMax)를 이용하여 475nm에서 흡광도를 측정하였다. 티로시나제 저해활성은 마쯔다(Matsuda H) 등의 문헌(Biol. Pharm. Bull. 19(1), p153-156, 1996)에 따라 다음 식에 따라 계산하였으며, 시료를 가하지 않는 대조군을 기준으로 하였다. 상기 시험은 3회 반복하였으며, 그 결과는 도 5와 같다.

* 티로시나제 억제활성(%) = {(대조군 OD₄₇₅ - 시료 OD₄₇₅) / 대조군 OD₄₇₅} X 100

도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 추출물에서의 티로시나제 저해 효능이 미백 효능을 갖는 것으로 알려져 있는 알부틴보다 높게 나타난다.

따라서, 본 발명에 따라 제조된 화차 추출물은 용량-의존적으로 우수한 티로시나제에 대한 저해 활성을 가지므로, 우수한 미백 활성을 가진다.

제조예 1: 화장품 조성물을 이용한 제품의 제조

1-1 목욕액

얻어지는 목욕액 총 중량을 기준으로, DL-락트산나트륨 21 중량%, 피루브산 나트륨 8 중량%, 실시예 1에서 제조한 화차 추출물 5 중량%, 에탄올 40 중량%, 색소 및 향료 1 중량% 미만을 나머지 잔량의 정제수(전체 100%)와 혼합하여 목욕액을 제조하였다. 얻어진 목욕액은 사용 시 목욕물 중에 약 100-10,000 배로 희석하여 사용할 수 있다. 또한, 얻어진 목욕액은 목욕물 대신 클렌징액, 수렴액 및 보습액으로 희석하여 사용할 수도 있다.

1-2 미백 스킨로션

얻어지는 미백 스킨로션 총 중량을 기준으로, 실시예 1에서 제조한 화차 추출물 1 중량%, 글리세린 5 중량%, 부틸렌글리콜 3 중량%, 프로필렌 글리콜 2 중량%, 폴리옥시에칠렌(60) 경화 피마자유 1 중량%, 에탄올 10 중량%, 트리에탄올 아민 0.1 중량%, 방부제, 향료 및 색소 1 중량% 미만을 정제수(전체 100 %)에 혼합하여 미백 스킨로션을 제조하였다.

1-3 미백 밀크로션 (영양로션)

얻어지는 미백 밀크로션 총 중량을 기준으로, 실시예 1에서 제조한 화차 추출물 1 중량%, 시토스테롤 1.7 중량%, 폴리글리세릴 2-올레이트 1.5 중량% , 세라마이드 0.7 중량%, 세테아레스-4 1.2 중량%, 콜레스테롤 1.5 중량%, 디세틸 포스페이트 0.4 중량%, 농글리세린 5.0 중량%, 선플라우어 오일 10 중량%, 카르복시비닐폴리머 0.2 중량%, 산탄검 0.3 중량%, 향료 및 색소 1 중량% 미만을 정제수(전체 100 %)에 혼합하여 미백 밀크로션을 제조하였다.

1-4 미백크림

얻어지는 미백크림 총 중량을 기준으로, 실시예 1에서 제조한 화차 추출물 3 중량%, 시토스테롤 4 중량%, 폴리글리세릴 2-올레이트 3 중량%, 세라마이드 0.7 중량%, 세테아레스-4 2 중량%, 콜레스테롤 3 중량%, 디세틸포스페이트 0.4 중량%, 농글리세린 5.0 중량%, 선플라우어 오일 22 중량%, 카르복시비닐폴리머 0.5 중량%, 방부제, 향료 및 색소 1 중량% 미만을 정제수(전체 100 %)에 혼합하여 미백크림을 제조하였다.

1-5 미백에센스

얻어지는 미백에센스 총 중량을 기준으로, 실시예 1에서 제조한 화차 추출물 5 중량%, 시토스테롤 1.7 중량%, 폴리글리세릴 2-올레이트 1.5 중량%, 세라마이드 0.7 중량%, 세테아레스-4 1.2 중량%, 콜레스테롤 1.5 중량%, 디세틸포스페이트 0.4 중량%, 농글리세린 5.0 중량%, 선플라우어 오일 15 중량%, 카르복시비닐폴리머 0.2 중량%, 산탄검 0.2 중량%, 방부제, 향료 및 색소 1 중량% 미만을 정제수(전체 100 %)에 혼합하여 미백에센스를 제조하였다.

Claims

귤나무의 꽃잎 및 차엽으로부터 화차 추출물을 생성시키는 방법으로서,
(a) 귤나무의 꽃잎 및 차엽으로부터 화차 건조물을 제조하는 단계;
(b) 상기 화차 건조물의 중량에 기초하여, 탄소수 1 내지 3의 무수 또는 함수 알코올 및 물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매를 1 내지 15배로 상기 화차 건조물에 첨가하는 단계; 및
(c) 0 내지 100℃의 온도에서 1 내지 12시간 동안 추출기를 사용함으로써 상기 화차 건조물로부터 화차 추출물을 생성시키는 단계
를 포함하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계(a)의 귤나무가 귤(Citrus unshiu), 라임(Citrus aurantifolia), 만다린(Citrus reticulata), 시트론(Citrus medica), 왕귤(Citrus maxima), 유자(Citrus aurantium), 그레이프프루트(Citrus x paradisi), 레몬(Citrus x limon) 및 오렌지(Citrus x sinensis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계(a)의 꽃잎이, 꽃봉오리가 열리기 시작한 상태 내지 70% 열려진 상태인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계(a)의 꽃잎이, 씨방이 제거된 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계(a)의 꽃잎이, 찢겨진 상태이거나 분쇄된 상태인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계(a) 내지 (c)의 꽃잎에서 갈색 꽃잎을 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 추출기가 냉각 콘덴서가 장착된 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계(a) 후, 용매가 첨가된 꽃잎을 상온에서 1 내지 7일간 침적시켜 추출하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계(a) 후, 용매가 첨가된 꽃잎을 상온에서 1 내지 7일간 침적시켜 가온 추출하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계(a) 후, 용매가 첨가된 꽃잎을 70% 알코올로 침적시켜 3 내지 7일 동안 추출하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계(c) 후, 여과 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계(c) 후, 감압 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계(c) 후, 농축 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 화차 추출물.
조성물의 총 중량에 기초하여, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 화차 추출물을 포함하는, 피부미용을 개선시키기 위한 화장품 조성물.
조성물의 총 중량에 기초하여, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 화차 추출물 0.001 내지 50중량%를 포함하는, 피부미용을 개선시키기 위한 화장품 조성물.