KR20160008190A

KR20160008190A - 신경 전구 세포를 사용한 세포 치료에 있어서의 이식 보조제

Info

Publication number: KR20160008190A
Application number: KR1020157032821A
Authority: KR
Inventors: 준 다카하시
Original assignee: 다이니뽄 스미토모 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2013-05-16
Filing date: 2013-11-14
Publication date: 2016-01-21
Also published as: CA2912345C; KR102133621B1; JP2018076385A; CA3088270A1; CA2912345A1; WO2014184973A1; CA3088270C; AU2013389474A1; AU2013389474B2; US9884045B2; US20160106719A1; JP6290876B2; KR20200085922A; US20180098971A1; JPWO2014184973A1

Abstract

본 발명은 발프로산 및/또는 조니사미드를 유효 성분으로서 함유하는, 신경 전구 세포의 이식 보조제를 제공한다.

Description

신경 전구 세포를 사용한 세포 치료에 있어서의 이식 보조제{TRANSPLANTATION ADJUVANT IN CELL THERAPY USING NEURAL PROGENITOR CELLS}

본 발명은 신경 전구 세포를 사용한 세포 치료에 있어서의 이식 보조제에 관한 것이다.

파킨슨병은, 진행성의 신경 변성 질환이며, 흑질선조체의 도파민 작동성 신경(도파민 작동성 뉴런)의 상실을 특징으로 한다. 지금까지의 임상 연구로부터, 태생기중 뇌세포의 이식에 의해, 파킨슨병 환자의 운동 증상의 개선이 확인되어 있다. 이러한 사실로부터, 파킨슨병의 치료 방법으로서 세포 보충 요법이 생각된다.

Hsieh, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.(2004) 101, 16659-16664. Abematsu, M. et al., J Clin. Invest., (2010) 120, 3255-3266.

다능성 줄기 세포, 특히 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포)는 도파민 작동성 신경을 대량으로 공급할 수 있을 가능성을 갖고 있다. 그 때문에 다능성 줄기 세포는, 새로운 도너 세포원으로서 생각된다. 그러나, 본 발명자들의 지견에 의하면, iPS 세포 등의 줄기 세포로부터 분화된 신경 전구 세포 및 도파민 작동성 신경 세포는, 뇌내에의 이식 후의 잔존율(이하, 「생존율」이라고 하는 경우가 있다.) 이 극히 낮다.

따라서, 본 발명의 목적은, 이식 후의 신경 전구 세포로부터 유도되는 도파민 작동성 신경 세포의 잔존율의 향상이 가능한, 신경 전구 세포의 이식 보조제를 제공하는 데 있다.

본 발명자들은, 신경 전구 세포의 이식 시에, 항간질약으로서 사용되고 있는 발프로산 또는 조니사미드를 보조제로 하여 대상에 투여함으로써, 이식 후의 도파민 작동성 신경 세포의 잔존율이 향상되는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

종래, 인비트로의 계에서, 발프로산이 해마 유래의 신경 전구 세포를 뉴런으로 분화시키는 것(비특허문헌 1), 및 척수 손상의 모델 마우스에서, 신경 줄기 세포의 이식과 동시에 발프로산을 투여하면, 신경 세포로의 분화가 촉진되는 것(비특허문헌 2)은 보고되어 있었다. 그러나, 발프로산이, 이식 후의 분화 유도형의 도파민 작동성 신경 세포의 잔존율을 향상시키는 것은 알려져 있지 않았다. 항간질약인 조니사미드에 대해서도, 이식 후의 신경 전구 세포 및 도파민 작동성 신경 세포의 잔존율의 향상에 관한 지견은 존재하지 않았다.

즉, 본 발명은 이하에 관한 것이다.

[1] 발프로산 및/또는 조니사미드를 유효 성분으로서 함유하는, 신경 전구 세포의 이식 보조제.

[2] 상기 신경 전구 세포를 이식하기 2일 전 이후에 투여되도록 사용되는, 상기 [1]에 기재된 이식 보조제.

[3] 상기 신경 전구 세포가 iPS 세포 유래인, 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 이식 보조제.

[4] 도파민 작동성 신경의 변성 질환 치료용인, 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 이식 보조제.

[5] 상기 도파민 작동성 신경의 변성 질환이 파킨슨병인 [4]에 기재된 이식 보조제.

[6] 1일당 100 내지 1200mg의 상기 발프로산, 또는 1일당 10 내지 600mg의 상기 조니사미드가 인간에 대하여 투여되도록 사용되는, 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 이식 보조제.

[7] 상기 신경 전구 세포를 이식하기 2일 전 이후에, 인간에 대하여 투여되도록 사용되는, 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 이식 보조제.

또한 본 발명은 이하에 관한 것이다.

[8] 발프로산 및/또는 조니사미드의 유효량을, 신경 전구 세포가 이식된 포유 동물에 투여하는 것을 포함하는, 이식 후의 상기 신경 전구 세포로부터 유도되는 도파민 작동성 신경 세포의 잔존율을 향상시키기 위한 방법.

[9] 상기 포유 동물이 인간인, 상기 [8]에 기재된 방법.

[10] 상기 신경 전구 세포를 이식하기 2일 전 이후에, 발프로산 및/또는 조니사미드의 유효량을 투여하는, 상기 [8] 또는 [9]에 기재된 방법.

[11] 상기 신경 전구 세포가 iPS 세포 유래인, 상기 [8] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[12] 상기 포유 동물이 도파민 작동성 신경의 변성 질환으로 이환하고 있는, 상기 [8] 내지 [11] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[13] 상기 도파민 작동성 신경의 변성 질환이 파킨슨병인, 상기 [12]에 기재된 방법.

[14] 상기 유효량이, 1일당 100 내지 1200mg의 상기 발프로산, 또는 1일당 10 내지 600mg의 상기 조니사미드인, 상기 [8] 내지 [13] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[15] 상기 신경 전구 세포를 이식하기 2일 전 이후에, 인간에 대하여 발프로산 및/또는 조니사미드의 유효량을 투여하는, 상기 [8] 내지 [14] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[16] 포유 동물에 이식 후의 신경 전구 세포로부터 유도되는 도파민 작동성 신경 세포의 잔존율을 향상시키기 위하여 사용되는, 발프로산 및/또는 조니사미드.

[17] 상기 신경 전구 세포를 이식하기 2일 전 이후에 투여되도록 사용되는, 상기 [16]에 기재된 발프로산 및/또는 조니사미드.

[18] 상기 신경 전구 세포가 iPS 세포 유래인, 상기 [16] 또는 [17]에 기재된 발프로산 및/또는 조니사미드.

[19] 상기 포유 동물이 도파민 작동성 신경의 변성 질환으로 이환하고 있는, 상기 [16] 내지 [18] 중 어느 하나에 기재된 발프로산 및/또는 조니사미드.

[20] 상기 도파민 작동성 신경의 변성 질환이 파킨슨병인 [19]에 기재된 발프로산 및/또는 조니사미드.

[21] 1일당 100 내지 1200mg의 상기 발프로산, 또는 1일당 10 내지 600mg의 상기 조니사미드가 인간에 대하여 투여되도록 사용되는, 상기 [16] 내지 [20] 중 어느 하나에 기재된 발프로산 및/또는 조니사미드.

[22] 상기 신경 전구 세포를 이식하기 2일 전 이후에 인간에 대하여 투여되도록 사용되는, 상기 [16] 내지 [21] 중 어느 하나에 기재된 발프로산 및/또는 조니사미드.

본 발명에 따르면, 이식 후의 신경 전구 세포로부터 유도되는 도파민 작동성 신경 세포의 잔존율의 향상이 가능한, 신경 전구 세포의 이식 보조제를 제공하는 것이 가능해진다.

도 1은 마우스 iPS 세포로부터 신경 전구 세포를 거쳐서 중뇌 도파민 작동성 신경 세포로 분화 유도하기 위한 스케줄을 도시하는 도면이다.
도 2는 마우스 iPS 세포로부터 신경 전구 세포를 거쳐서 중뇌 도파민 작동성 신경 세포로의 분화에 수반되는, 각 마커 유전자의 발현의 경시 변화를 나타내는 RT-PCR의 사진이다.
도 3은 인비트로 실험에서의, 마우스 iPS 세포 유래의 신경 전구 세포의 각 마커 분자의 발현량을 나타내는 그래프이다.
도 4는 인비트로 실험에서의, 마우스 iPS 세포 유래의 중뇌 도파민 작동성 세포의 각 마커 분자의 발현량을 나타내는 그래프이다.
도 5는 인비트로 실험에서의, 마우스 iPS 세포 유래의 중뇌 도파민 작동성 세포의 카스파제3의 발현량을 나타내는 그래프이다.
도 6은 인비보 실험에서의, 마우스 iPS 세포 유래의 이식편 중의 각 마커 분자의 발현량을 나타내는 그래프이다.
도 7은 인비보 실험에서의, 마우스 iPS 세포 유래의 이식편의 체적 및 이식편 중에 존재하는 중뇌 도파민 작동성 세포의 수를 나타내는 그래프이다.
도 8은 인비보 실험에서의, 인간 iPS 세포 유래의 이식편 중에 존재하는 중뇌 도파민 작동성 세포의 수를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명의 적합한 실시 형태에 대하여 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 이하의 실시 형태에 한정되는 것은 아니다.

본 실시 형태에 따른 신경 전구 세포의 이식 보조제(이하, 간단히 「이식 보조제」라고 하는 경우가 있다.)는, 발프로산(화학명: 2-프로필펜탄산나트륨) 및/또는 조니사미드(화학명: 1,2-벤즈이속사졸-3-메탄술폰아미드)를 유효 성분으로서 함유한다(이하, 발프로산, 조니사미드를 각각 「VPA」, 「ZNS」라고 하는 경우가 있다.) .

여기서, 이식 보조제란, 이식 후의 세포의 잔존율을 향상시키는 것, 이식 후의 세포를 원하는 세포종으로 유도하는 것 또는 이식 후의 세포의 종양화를 방지하는 것 등에 의해, 세포 이식에 의한 원하는 효과를 발휘시키기 위해서, 이식을 보조하는 약제인 것을 의미한다. 이식 보조제는, 예를 들어 이식 후의 목적 신경 세포의 생존율 향상제, 생착율 향상제 또는 분화 유도 향상제로서 파악할 수도 있다. 이식 후의 목적 표현형 신경 세포(중뇌 도파민 작동성 세포)의 잔존율이 향상되었는지 여부는, 예를 들어 이식하고 나서 7일 후 내지 4주후의 잔존하는 도파민 산생 세포 또는 뇌내 도파민의 산생량 등의 증가율을 컨트롤과 비교하여, 통계적인 유의성이 있는지 여부로 판별할 수도 있고, 이식편의 사이즈가 계시적으로 불변인 것으로도 판별할 수 있다. 여기서, 이식으로부터 상술한 판별을 행하기 위한 검사까지의 일수가 연장되는 것에 대하여 문제가 없기 때문에, 이식부터 검사까지의 일수는 「7일 후 내지 4주 후」로 한정되지 않고, 특별히 상한은 설정하지 않는다.

이식 보조제는, 유효 성분으로서 발프로산 또는 조니사미드를 단독으로 함유하고 있을 수도 있고, 발프로산 및 조니사미드를 모두 함유하고 있을 수도 있다. 예를 들어, 발프로산은 시그마(Sigma)사로부터 입수 가능하고, 조니사미드는 다이닛본 스미토모 세이야쿠 가부시끼가이샤로부터 입수 가능하다.

이식 보조제는, 유효 성분인 발프로산 및/또는 조니사미드만을 함유하는 것일 수도, 이 유효 성분과 다른 성분을 함유하는 것일 수도 있다. 다른 성분으로서는, 예를 들어 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 결합제, 안정제, 완충제, 용해 보조제, 등장제 등을 들 수 있다. 이 밖에도, 경구적 또는 비경구적인 투여에 맞춰서, 적당한 다른 성분을 적절히 제조할 수 있다.

「유효 성분으로서 함유하는」이란, 발프로산 또는 조니사미드가 산 등의 프리(free)체의 형태 뿐만 아니라, 이들의 약학적으로 허용되는 염의 형태로서, 이식 보조제에 함유하는 경우도 포함한다. 약학적으로 허용되는 염으로서는, 예를 들어 나트륨염 등을 들 수 있다.

환자의 증상, 연령 및 체중 등의 여러가지 조건에 따라 변화할 수 있지만, 경구 투여에 의해 인간에 대하여 투여되는 경우, 이식 보조제는 예를 들어, 1일 용량당 100 내지 1200mg, 또는 400 내지 1200mg의 발프로산을 유효 성분으로서 함유할 수 있다. 이식 보조제는, 경구 투여에 의해 인간에 대하여 투여되는 경우, 예를 들어, 1일 용량당 10 내지 600mg, 또는 25 내지 200mg의 조니사미드를 유효 성분으로서 함유할 수 있다.

이식 보조제의 적용 대상이 되는 신경 전구 세포란, 신경 세포로 분화가 가능한 세포를 의미한다.

신경 전구 세포는, 인간 등의 포유 동물의 뇌 조직으로부터 단리한 세포일 수도 있다. 신경 전구 세포는, 배아 줄기 세포(ES 세포) 및 iPS 세포 등의 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도시켜서 얻어진 세포(각각, ES 세포 유래의 세포, iPS 세포 유래의 세포라고 하는 경우가 있다.)여도 된다. 뇌 조직으로부터 단리한 세포로서는, 예를 들어 문헌 [Nature Neuroscience, 2, 1137(1999)] 또는 [N. Engl. J. Med. ; 344: 710-9(2001)]에 기재된 것과 같은 태아의 중뇌 조직에 함유되는 세포가 예시된다. 신경 전구 세포는, 도파민 산생 전구 세포일 수도 있다.

신경 전구 세포를 인간 등의 포유 동물의 뇌 조직으로부터 단리하는 경우, PSA-NCAM, CD24 및 Corin 등의 신경 전구 세포 또는 신경 세포에 특이적으로 발현하는 마커 분자를 지표로 하여, 플로우 사이토메트리법 등의 공지된 방법에 의해 단리할 수 있다.

신경 전구 세포를 ES 세포 및 iPS 세포 등의 줄기 세포로부터 분화 유도시켜서 얻는 경우, 공지된 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, iPS 세포로부터 신경 전구 세포를 분화시키는 방법으로서는, (1) 무혈청 부유 응집 덩어리 배양법(Serum-free Floating culture of Embryoid Bodies-like aggregates, SFEB)(문헌 [Watanabe K., et al. Nat. Neurosci. 8:288-96, 2005]), (2) 스트로마 세포 상에서 다능성 줄기 세포를 배양하여 분화시키는 방법(SDIA법)(문헌 [Kawasaki H., et al. Neuron. 28:31-40, 2000]), (3) 마트리겔 상에 약제를 첨가하여 배양하는 방법(문헌 [Chambers SM., et al. Nat. Biotechnol. 27:275-80, 2009]), (4) 저분자 화합물을 사용하는 방법(문헌 [Morizane A. et al. J. Neurosci. Res. 89:117-126, 2011]) 등을 들 수 있다. 다능성 줄기 세포로부터 분화된 신경 전구 세포를 단리하는 방법으로서는, 상기 신경 전구 세포를 인간 등의 포유 동물의 뇌 조직으로부터 단리하는 경우와 동일한 방법을 사용할 수 있다.

여기서, 다능성 줄기 세포란, 생체에 존재하는 모든 세포로 분화가 가능한 다능성을 갖고, 또한 증식능을 아울러 갖는 줄기 세포를 의미한다. 다능성 줄기 세포에는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 배아 줄기(ES) 세포, 핵이식에 의해 얻어지는 클론 배 유래의 배아 줄기(ntES) 세포, 정자 줄기 세포(GS 세포), 배아 생식 세포(EG 세포), 인공다능성 줄기(iPS) 세포, 배양 섬유아세포 및 골수 줄기 세포 유래의 다능성 줄기 세포(Muse 세포) 등이 포함된다. 다능성 줄기 세포는, ES 세포, ntES 세포, 또는 iPS 세포일 수도 있다. 윤리적인 점을 가미하면 다능성 줄기 세포는, iPS 세포일 수도 있다.

ES 세포는 포유 동물에서 유래되는 수정란으로부터 제작할 수 있다. 포유 동물로서는, 예를 들어 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 염소, 원숭이, 인간 등을 들 수 있다. 포유 동물은 인간일 수도 있다.

구체적으로는, 먼저, 수정란으로부터 발생한 배반포를 피더 세포와 함께 배양하여, 내부 세포 덩어리를 증식시킨다. 그 후, 증식한 상기 내부 세포 덩어리에서 유래되는 세포를 단일 세포로 분리시켜서 피더 세포에 계속 심는 조작을 반복함으로써 ES 세포주를 얻을 수 있다(문헌 [Thomson JA., et al. (1998), Science. 282:1145-1147] 및 [H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932]).

iPS 세포는, 포유 동물에서 유래되는 체세포로부터 제작할 수 있다. 포유 동물로서는, 예를 들어 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 염소, 원숭이, 인간 등을 들 수 있다. 포유 동물은 인간일 수도 있다.

구체적으로는, 예를 들어 피부 세포 등의 체세포에 복수의 소정의 초기화 인자를 도입하여 얻어지는, 다분화능을 획득한 세포를 들 수 있다. 초기화 인자로서, 예를 들어 Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3, Glis1 등이 예시된다. 이들 초기화 인자는, 단독으로 사용할 수도 있고, 조합하여 사용할 수도 있다. 초기화 인자의 조합으로서는, 예를 들어 WO2007/069666, WO2008/118820, WO2009/007852, WO2009/032194, WO2009/058413, WO2009/057831, WO2009/075119, WO2009/079007, WO2009/091659, WO2009/101084, WO2009/101407, WO2009/102983, WO2009/114949, WO2009/117439, WO2009/126250, WO2009/126251, WO2009/126655, WO2009/157593, WO2010/009015, WO2010/033906, WO2010/033920, WO2010/042800, WO2010/050626, WO2010/056831, WO2010/068955, WO2010/098419, WO2010/102267, WO2010/111409, WO2010/111422, WO2010/115050, WO2010/124290, WO2010/147395, WO2010/147612, 문헌 [Huangfu D., et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:795-797, Shi Y., et al. (2008)], [Cell Stem Cell, 2:525-528, Eminli S., et al. (2008)], [Stem Cells. 26:2467-2474, Huangfu D., et al. (2008)], [Nat. Biotechnol. 26:1269-1275, Shi Y., et al. (2008)], [Cell Stem Cell, 3, 568-574, Zhao Y., et al. (2008)], [Cell Stem Cell, 3:475-479, Marson A., (2008)], [Cell Stem Cell, 3, 132-135, Feng B., et al. (2009)], [Nat. Cell Biol. 11:197-203, R.L. Judson et al., (2009)], [Nat. Biotech., 27:459-461, Lyssiotis CA., et al. (2009)], [Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106:8912-8917, Kim JB., et al. (2009)], [Nature. 461:649-643, Ichida JK., et al. (2009)], [Cell Stem Cell. 5:491-503, Heng JC., et al. (2010)], [Cell Stem Cell. 6:167-74, Han J., et al. (2010)], [Nature. 463:1096-100, Mali P., et al. (2010)], [Stem Cells. 28:713-720, Maekawa M., et al. (2011)], [Nature. 474:225-9] 등에 기재된 조합 등이 예시된다. 초기화 인자의 조합은, Oct3/4, Klf4 및 Sox2의 조합일 수도 있다.

또한, iPS 세포는, 소정의 기관(교토대학 등)으로부터 입수 가능하다. 예를 들어, Oct3/4 유전자, Klf4 유전자 및 Sox2 유전자를 도입함으로써 얻어지는 마우스 유래 iPS 세포주인 440A3 세포주를 교토대학으로부터 입수 가능하다. 인간 유래 iPS 세포주로서는, 예를 들어 201B7, 409B2, 1039A1 등을 들 수 있다.

신경 전구 세포는, ES 세포 유래의 세포에서도 동일한 결과가 초래된다.

이식 보조제는, 신경 전구 세포를 대상인 포유 동물에 이식하기 전후의 시기 또는 이식과 동시에, 상기 포유 동물에 투여되도록 사용할 수 있다. 이식 보조제는, 신경 전구 세포를 이식하기 2일 전 이후에 투여되도록 사용될 수도 있다. 신경 전구 세포를 이식하기 2일 전 이후에 이식 보조제를 투여함으로써, 유효 성분이 유효 혈중 농도를 유지한 상태에서, 이식을 행할 수 있다. 여기서, 「신경 전구 세포를 이식하기 2일 전」이란, 대상인 포유 동물에 상기 신경 전구 세포를 이식하는 날을 기준으로 하여 2일 전인 것을 의미한다.

대상이 되는 포유 동물로서는, 예를 들어 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 염소, 원숭이, 인간 등을 들 수 있다. 본 실시 형태에 따른 이식 보조제는, 인간에 대하여 사용할 수도 있다.

이식 보조제는, 투여의 목적, 투여 방법, 투여 대상의 상황(성별, 연령, 체중, 병상 등)에 따라 상이한데, 인간에 대하여 투여되는 경우, 예를 들어 1일당 100 내지 1200mg, 또는 400 내지 1200mg의 상기 발프로산이 투여되도록 사용될 수도 있다. 예를 들어, 1일당 10 내지 600mg, 또는 25 내지 200mg의 상기 조니사미드가 투여되도록 사용될 수도 있다.

이식 보조제는, 상술한 투여량으로 1일 1회 투여할 경우, 적어도 1회 이상, 대상인 포유 동물에 투여되도록 사용될 수도 있다. 이식 보조제는, 상술한 투여량으로 1일 1회 투여할 경우, 60 내지 180회, 또는 90 내지 120회, 대상인 포유 동물에 투여되도록 사용될 수도 있다.

이식 보조제의 투여 경로는, 경구 투여 또는 비경구 투여 중 어느 것일 수도 있고, 경구 투여일 수도 있다. 통상 사용되는 투여 형태로서는, 예를 들어 정제, 캡슐제, 과립제, 세립제, 산제, 설하정, 시럽제, 현탁액 등을 들 수 있다. 액제의 형으로 한 이식 보조제를 주사제로서 비경구적으로 투여할 수도 있다. 상기 투여제형은 허용되는 통상의 담체, 부형제, 결합제, 안정제 등에, 발프로산 및/또는 조니사미드를 유효 성분으로서 배합함으로써 제조할 수 있다. 이식 보조제를 주사제로서 사용하는 경우에는, 허용되는 완충제, 용해 보조제, 등장제 등을 첨가할 수도 있다.

이식 보조제를 대상인 포유 동물에 투여하면, 신경 전구 세포 및 상기 신경 전구 세포로부터 분화된 도파민 작동성 뉴런의 이식 후의 잔존율이 향상된다. 그로 인해, 상기 이식 보조제는, 도파민 작동성 신경의 변성 질환의 치료용 또는 예방용으로서 사용될 수도 있다.

도파민 작동성 신경의 변성 질환이란, 도파민 작동성 신경이 감소하는 것에 기인하는 질환이며, 예를 들어 파킨슨병, 루이소체(Lewy's bodies)형 인지증 등을 들 수 있다.

이상, 본 발명을 실시 형태에 기초하여 구체적으로 설명했지만, 본 발명은 상기 실시 형태에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 체외에서 신경 전구 세포에 본 발명의 이식 보조제를 첨가하고, 도파민 작동성 신경 등의 이식용 세포의 제조를 행한 후에, 얻어진 이식용 세포를 뇌 부위 등에 이식할 수도 있다. 이 경우, 원하는 이식용 세포로 분화시키기 위하여 충분한 양의 이식 보조제를 첨가하고, 예를 들어 48 내지 192시간 유지한 후에, 목적으로 하는 뇌 부위에 이식한다. 이식용 세포를 목적으로 하는 뇌 부위에 이식한 후, 상기 이식을 행한 포유 동물에 본 발명의 이식 보조제를, 추가로 전신 투여할 수도 있다.

실시예

재료 및 방법

도파민 작동성 뉴런의 마우스 iPS 세포로부터의 분화

마우스 iPS 세포주인 440A3 세포는, 10-25 계대의 후에 사용되었다. Oct3/4, Klf4 및 Sox2의 3개의 유전자를 갖는 플라스미드 벡터에 의해 생긴 440A3 세포는, Nanog 인핸서 및 프로모터의 제어 하에 있는, 녹색 형광 단백질(GFP) 및 퓨로마이신 내성 유전자를 갖고 있었다. 상기 GFP 유전자 및 퓨로마이신 내성 유전자는, 440A3 세포가 분화되어 있지 않을 때에만 활성화한다. 440A3 세포에 있어서, 외래성 유전자의 삽입은 보고 되어 있지 않다.

미분화된 440A3 세포는, 마이토마이신C로 처리된 마우스 태아 섬유아세포(MEF)(피더 세포)와 함께, DMEM(둘베코의 변형된 이글 배지; Dulbecco's Modified Eagle Medium, 와코(Wako)사 제조) 중에서 유지 관리되었다. 이렇게 함으로써, 분화되어버린 440A3 세포를 제거하였다. 상기 DMEM은, 1％의 소태아혈청(FBS), 5％의 녹아웃 혈청 대체물(KSR; 인비트로젠사 제조), 0.1mM의 비필수 아미노산, 1mM의 피루브산 나트륨, 0.1mM의 2-머캅토에탄올(2-ME; 인비트로젠사 제조), 2000U/ml의 백혈병 억제 인자(인비트로젠사 제조) 및 1.5μg/ml의 퓨로마이신을 포함하고 있었다. iPS 세포를 신경계 세포로 분화 유도하기 위해서, 무혈청 부유 응집 덩어리 배양법(SFEB법)을 사용하였다. 즉, 440A3 세포의 집합체를 0.25％의 트립신/1mM EDTA(에틸렌디아민4아세트산)로 개개의 세포로 분리하고, 96웰 저점착성 플레이트(상품명: 리피듀어-코트 플레이트(Lipidure-Coat Plate) A-US96, NOF 코포레이션(Corporation) 제조) 상에 3000 세포/웰의 농도(세포 밀도)로 뿌렸다. 그 후, GMEM(글래스고 최소 필수 배지; Glasgow Minimum Essential Medium), 5％의 KSR, 0.1mM의 비필수 아미노산, 1mM의 피루브산 나트륨 및 0.1mM의 2-ME을 함유하는 분화 배지 중에서, 상기 440A3 세포의 재집합을 유발하도록 하고, 이 날을 0일째로 했다(도 1). 이 분화 프로세스 동안, 도 1에 기재되어 있는 바와 같이, 중뇌 도파민 작동성의 표현형을 유발하기 위하여 여러가지 인자가 상기 분화 배지에 가해졌다. 구체적으로는, SFEB법을 개시하고 나서 3일째부터 7일째에 20ng/ml의 마우스 FGF-8b(R&D 시스템즈(systems)사 제조)를 첨가하고, SFEB법을 개시하고 나서 4일째부터 7일째에 10ng/ml의 재조합형 마우스 소닉 헤지호그(mouse sonic hedgehog)(C25II) N 말단(R&D 시스템즈사 제조)을 첨가하고, SFEB법을 개시하고 나서 7일째 이후에 1％의 N-2서플리멘트(깁코(Gibco)사 제조) 및 200nM의 아스코르브산을 첨가하였다. KSR은, SFEB법을 개시하고 나서 7일째에 분화 배지로부터 제거되었다.

형광-활성화 세포 소팅(Fluorescence-Activated Cell Sorting; FACS)

SFEB법을 개시하고 나서 9일째에, 440A3 세포를 인산 생리 식염수(PBS(-))로 2번 세정하였다. 그 후, 37℃에서 애큐맥스(Accumax)(이노베이트 셀 테크놀로지스(Innovate Cell Technologies)사 제조, 상품명)를 사용한 5분간 배양에 의해 440A3 세포를 단일 세포로 분리하였다. 상기 세포는, FACS 버퍼로 회수되었다. 상기 FACS 버퍼는, 2％의 FBS, 20mM의 D형 글루코오스 및 1％의 페니실린/스트렙토마이신(P/S, 인비트로젠사 제조)을 함유하는 PBS(-)로 구성되어 있었다. 회수된 세포는, 느린 피펫팅 조작으로 단일 세포 부유액으로 기계적으로 분리되었다. 이어서, 상기 세포를 마우스 항PSA-NCAM 항체(희석 배율 1:200, 밀리포어(Millipore)사 제조)와 함께 4℃에서 30분 정도 인큐베이팅하였다. 그 후, 원심 분리기를 사용하여 세정 조작을 2번 행하고, 또한 상기 세포를 2차 항체인 알렉사플루오르(AlexaFluor) 594가 표지된 당나귀 항마우스 IgG(희석 배율 1:400, 인비트로젠사 제조)와 함께 30분간 인큐베이팅하였다. 죽은 세포 및 세포의 파편은, 7-아미노액티노마이신-D(7-AAD, BD 파미젠(Pharmigen)사 제조) 염색제를 사용하여 제거하였다. 남은 생존 세포는 다시, 최종 농도(세포 밀도) 1×10⁷세포/ml로 현탁시켰다. 세포 소팅은, 488nm 아르곤 레이저, 633nm 헬륨-네온 레이저, 100㎛ 노즐 및 FACSDiva 소프트웨어 프로그램을 구비한 FACSAriaII 셀 소터(벡톤 딕킨슨(Becton Dickison)사 제조)를 사용하여 행하여졌다. PSA-NCAM 양성율은, 1차 항체를 사용하고 있지 않은 네거티브 컨트롤을 기준으로 하여 결정되었다.

시험 화합물을 사용한 신경 전구 세포를 도파민 작동성 신경 세포로 분화 유도하기 위한 인비트로 처리

세포 소팅 후, 세포의 재집합을 유발하기 위해서, DMEM/F12 배지(와코사 제조)에 있어서, PSA-NCAM⁺ 세포군을 96웰 플레이트 상에 20000 세포/웰의 농도(세포 밀도)로 파종하였다. 상기 DMEM/F12 배지는, 1％의 N-2서플리멘트, 200nM의 아스코르브산, 2％의 B27서플리멘트(인비트로젠사 제조), 0.5mM의 L-글루타민 및 1％의 P/S를 포함하고 있었다. 아포토시스를 방지하기 위해서, ROCK 저해제 Y-27632(와코사 제조)가 세포 소팅의 과정과 그 후의 밤새 배양에 있어서, 30μM의 농도로 사용되었다. SFEB법을 개시하고 나서 10일째에, 발프로산(VPA)(시그마사 제조), 조니사미드(ZNS)나트륨염(다이닛본 스미토모 세이야꾸 가부시끼가이샤 제조), 17β에스트라디올(E2)(시그마사 제조), 글리아 세포주 유래 신경영양인자(GDNF)(R&D 시스템즈사 제조), 또는 PBS(-) 중 어느 하나가, 4일간 배지에 가해졌다. VPA, ZNS 및 E2는 각각 3가지의 서로 다른 농도로 사용되었다. 즉, VPA의 농도는 0.01mM, 0.1mM 및 1mM이며, ZNS의 농도는 1μM, 10μM 및 100μM이며, E2의 농도는 1nM, 10nM 및 100nM이었다. GDNF는, 20mg/ml 가해서, 포지티브 컨트롤로 하였다. VPA 및 E2의 효과를 중화하기 위해서, 아데닐산시클라아제 저해제인 2,5-디데옥시아데노신(ddA, 100μM; 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)사 제조) 또는 에스트로겐 수용체 길항약인 ICI182780(ICI, 2μM; 와코사 제조)이 SFEB법을 개시하고 나서 10일째에 배지에 가해졌다.

마우스 iPS 세포 유래 도파민 신경 전구 세포의 이식 실험

생후 10주일의 스프라그-다우레이(Sprague-Dawley) 래트(SD 래트, 시미즈 지켕 자이료 가부시끼가이샤 제조)는 교토대학 동물 실험 가이드 라인에 따라서 취급되었다. 상기 SD 래트에 마취를 시키고, 양측의 선조체 중에 도너 세포를 정위 고정적으로 주사함으로써 이식하였다. SFEB법을 개시하고 나서 9일째의 2개의 세포 집합체(평균 3.1×10⁵ 세포)를 1μl의 PBS(-) 중에 모은 상태에서, 도너 세포로서 각 트랙트에의 이식에 사용하였다. 상기 PBS(-)에는, 최종 농도로 30μM의 Y-27632가 가해져 있었다. 그 후, VPA(150mg/kg/일), ZNS 나트륨염(30mg/kg/일), E2(80μM/kg/일), 또는 생리 식염수의 복강내 주사를, 상기 도너 세포를 이식하기 2일 전부터 실시하고, 부검되는 날까지 계속하였다. 면역 제어를 위해서, 모든 SD 래트에 대하여 1일 용량인 10mg/kg의 사이클로스포린A(CsA, 와코사 제조)를 투여하였다. 도너 세포의 이식 후 4주간, 상기 SD 래트는, 깊은 마취 하에서, 4％의 파라포름알데히드를 심장 내에 관류시킴으로써 뇌를 세정 및 고정하였다. 부검날, 최후의 시험 화합물 또는 CsA의 주사로부터 1시간 후에 각 SD 래트로부터 혈액 샘플이 채취되었다. 이들 샘플은 SRL, Inc.(도쿄, 일본)에 보내져, 상술한 투여된 의약(시험 화합물)의 혈중 농도가 측정되었다.

인간 iPS 세포 유래 도파민 신경 전구 세포의 이식 실험

생후 12주일의 SCID 래트(교토대학 의학부 동물 실험 시설에서 제작)는 교토대학 동물 실험 가이드 라인을 따라서 취급되었다. 상기 SCID 래트에 마취를 시키고, 양측의 선조체 중에 도너 세포를 정위 고정적으로 주사함으로써 이식하였다. 인간 iPS 세포주인 1039A1 세포로부터 제조한 도파민 신경 전구 세포(평균 2.7×10⁵ 세포)를 2μl의 PBS(-) 중에 모은 상태에서, 도너 세포로서 각 트랙트에의 이식에 사용하였다. 상기 PBS(-)에는, 최종 농도로 30μM의 Y-28632가 가해져 있었다. 그 후, VPA (150mg/kg/일 또는 600mg/kg/일, 각각 고용량, 저용량이라고 하는 경우가 있다), ZNS 나트륨염(30mg/kg/일 또는 60mg/kg/일, 각각 고용량, 저용량이라고 하는 경우가 있다), 또는 생리 식염수의 복강내 주사를, 상기 도너 세포를 이식하기 2일 전부터 실시하고, 부검되는 날까지 계속하였다. 도너 세포의 이식 후 4주간, 상기 SCID 래트는, 깊은 마취 하에서, 4％의 파라포름알데히드를 심장 내에 관류시킴으로써 뇌를 세정 및 고정하였다. 부검날, 최후의 시험 화합물의 주사로부터 1시간 후에 각 SCID 래트로부터 혈액 샘플이 채취된 의약(시험 화합물)의 혈중 농도가 측정되었다.

역전사 폴리메라아제 연쇄 반응법(RT-PCR)

토탈 RNA는 알엔이지 플러스 미니(RNeasy Plus Mini) 키트(퀴아젠(Qiagen)사 제조)를 사용하여 추출되었다. 추출된 토탈 RNA는, 슈퍼 스크립트 III 퍼스트-스트랜드 신더시스 시스템(Super Script III First-Strand Synthesis System)(인비트로젠사 제조)을 사용하여 역전사되었다. 각 PCR은, 핫 스타태크(Hot StarTaq) DNA 폴리메라아제(퀴아젠사 제조)를 사용하여 행하여졌다. 역전사 효소를 가하지 않음으로써, 각 프라이머에 대한 컨트롤 증폭 반응이 행하여졌다. MEF가 기타의 네거티브 컨트롤로서 사용되었다. RT-PCR의 검출 대상으로 된 유전자의 배열은 모두 공지이며, 그 유전자의 배열에 기초하여, 프라이머의 설계 및 증폭 산물의 분자량의 견적이 행하여졌다.

면역 형광법

인비트로 실험에서는, SFEB법을 개시하고 나서 14일째에 상술한 시험 화합물로 처리된 세포 집합체를, 4％의 파라포름알데히드로 고정하였다. 그 후, 고정한 세포 집합체를 냉동하고, 면역 세포 화학용의 마이크로톰을 사용하여 10μM 두께의 박편으로 절단하였다. 한편, 인비보 실험(이식 실험)에서는, 이식 실험 후 SD 래트 또는 SCID 래트의 뇌를 취출하고, 4％의 파라포름알데히드로 다시 2일간 고정하였다. 그 후, 고정한 SD 래트 또는 SCID 래트의 뇌를 30％의 수크로오스 중에서 3일간 저온 보존하고, 냉동하고, 면역 조직 화학을 위하여 40μM 두께의 박편으로 절단하였다. 스피어(구상의 세포 덩어리) 및 뇌의 동결 절편에 투과 처리를 실시하고, PBS(-) 중에 실온에서 한시간 블로킹함으로써, 샘플로 하였다. 상기 PBS(-)에는, 0.3％의 트라이톤-X 및 2％의 당나귀 혈청이 포함되어 있었다. 그 후, 상기 절편을 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션을 행하였다. 본 실시예에서 사용한 1차 항체는, 토끼 항티로신하이드록실라아제 항체(희석 배율 1:400, TH; 밀리포어사 제조), 마우스 항TH 항체(희석 배율 1:200, 밀리포어사 제조), 양 항TH 항체(희석 배율 1:400, 밀리포어사 제조), 마우스 항Tubβ3 항체(희석 배율 1:1000, Tujl; 코반스(Covance)사 제조), 래트 항NURR1 항체(희석 배율 1:1000, 캔 겐큐쇼, 고베, 일본), 토끼 항Ki67 항체(희석 배율 1:1000, 노보카스트라(Novocastra)사제: NCL-Ki67p), 토끼 항카스파제3 항체(희석 배율 1:500, 산타 크루즈 바이오테크놀로지사 제조), 래트 항M2M6 항체(희석 배율 1:50, 디벨롭멘탈 스터디 하이브리도마 뱅크(Developmental Study Hybridoma Bank)사 제조), 마우스 항Nestin 항체(희석 배율 1:50; 밀리포어사 제조), 토끼 항Pitx3 항체(희석 배율 1:500; 케미콘(Chemicon)사 제조), 염소 항HNF-3β 항체(희석 배율 1:500, Foxa2; 산타 크루즈 바이오테크놀로지사 제조), 마우스 항인간Nuclei 항체(희석 배율 1:1000; 밀리포어사 제조) 및 마우스 항NeuN 항체(희석 배율 1:500, 케미콘사 제조)이다. PBS (0.05％의 Tween-20) 중에서 3번 세정한 후, 샘플을 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 결합 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 인큐베이팅하였다. 3번 더 세정한 후, 상기 샘플을 핵 염색을 위해 DAPI와 함께 인큐베이팅하고, 파마플로우(다코(Dako))를 사용하여 표본으로 하였다. 면역 반응성 세포는, 공초점 레이저 현미경(플루오뷰(Fluoview) FV1000D; 올림푸스(Olympus)사 제조)으로 가시화하였다. 각 마커의 양성 세포의 비율을 결정하기 위해서, 표지 세포를, 적어도 3번의 독립한 실험에서 수동으로 헤아렸다. Ki67⁺/Nestin⁺ 세포의 이식편의 체적 및 수는, BZ-II 해석 소프트웨어 프로그램(키엔스(Keyence))을 사용하여 결정하였다. 각 이식편에 있어서의 면역 반응성 세포의 수를 예측하기 위해서, 6편마다 세포수를 수동으로 헤아리고, 아베크롬비 코렉션(Abercrombie Correction)을 적용했다(아베크롬비(Abercrombie), 1946).

통계 분석

통계 분석은 그래프패드프리즘 소프트웨어 프로그램 5.0b 버전(GraphPad Software)을 사용하여 행하였다. 모든 양적 데이터는 평균값±SD(표준 편차)로서 나타나고, One-way ANOVA 및 Newman-Keuls 사후 해석 테스트가 사용되었다. 차는 P <0.05로 통계적으로 유의하다고 판정하였다.

결과

도파민 작동성 뉴런의 마우스 iPS 세포로부터의 분화

SFEB법을 사용하여 마우스 iPS 세포주인 440A3 세포로부터 도파민 작동성 뉴런을 분화 유도하였다. 상기 440A3 세포는, SFEB법을 개시하고 나서 14일째까지 계속하여 증식하고 있었다. 분화 유도에 수반하여, Nanog-GFP의 발현이 서서히 감소하고, SFEB법을 개시하고 나서 9일째에는, 거의 발현이 확인되지 않았다. 각 유전자 마커의 경시적인 발현 변화를 나타낸 RT-PCR의 사진을 도 2에 도시한다. 다능성을 나타내는 세포 집단(Oct3/4⁺, Nanog⁺)이 SFEB법을 개시하고 나서 6 내지 9일째에 미숙 신경 전구 세포(NPC)(Nestin⁺)로 분화되고, 그 후 Tuj1⁺ 신경 세포로 분화된 것이 확인되었다(도 2). 이 Tuj1⁺ 신경 세포는, 도파민 작동성 뉴런의 특이적 마커인 Lmx1a, Nurr1 및 TH도 발현하고 있었다.

얻어진 세포 집단에는, 미분화된 세포 및 비신경 세포도 포함되어 있었다. 따라서, 균일성이 높은 NPC의 집단을 얻기 위해서, FACS를 사용하여, PSA-NCAM⁺의 세포를 소팅하였다. PSA-NCAM은, 신경 세포의 표면에 특이적으로 발현하고 있는 세포 접착 분자이다. SFEB법을 개시하고 나서 9일째에는, 얻어진 세포 집단의 약 60％가 PSA-NCAM 양성(PSA-NCAM⁺)이었다. FACS에 의해 소팅된 PSA-NCAM⁺의 세포는, 재집합한 후, 추가로 5일 후에 성숙하였다. 성숙한 세포는, 면역 세포 화학법에 사용하였다. 상기 성숙한 세포의 집합체의 절편을 면역 형광 염색한 바, 대부분이 Tuj1⁺ 신경 세포이며, 그 안에, 중뇌의 도파민 작동성 뉴런이 존재하고 있었다. 상기 도파민 작동성 뉴런은, TH, NURR1, FOXA2 및 PITX3을 동시에 발현하고 있었다.

인비트로에 있어서의, VPA 및 E2의 도파민 작동성 뉴런에의 분화에 대한 영향

VPA, ZNS 및 E2가 인비트로에 있어서, 도파민 작동성 뉴런에의 분화 유도에 영향이 있을지 조사하였다. SFEB법을 개시하고 나서 10일째 내지 14일째의 동안, 재집합한 PSA-NCAM⁺ 세포를, VPA, ZNS 또는 E2의 존재 하에서 배양하였다. SFEB법을 개시하고 나서 14일째에 면역 세포 화학법을 행한 바, 어느 시험 화합물에 있어서도 90％ 이상의 세포가 신경 세포 마커인 Tuj1을 발현하고 있었다(도 3의 (A)). 컨트롤의 세포에서는, 5.2±1.1％가 TH⁺였다. 이에 비해, VPA(0.01mM, 0.1mM) 또는 E2(10nM)의 존재 하에서 배양한 세포는, TH⁺ 세포의 비율이, 컨트롤에 대하여 약 2배까지 증가하고 있었다(각각, 12.1±1.5％, 11.7±0.4％ 및 12.2±2.3％)(도 3의 (B)). VPA 및 E2의 이러한 효과가 환상 AMP 경로 또는 에스트로겐 수용체를 통하여 행해지고 있는지 여부를 조사하기 위해서, 아데닐산시크라아제 저해제인 ddA 또는 에스트로겐 수용체 길항제인 ICI를 각각 사용하였다. 100μM의 ddA 또는 2μM의 ICI를 각각 0.1mM의 VPA 또는 10nM의 E2와 함께 세포에 가하여 배양한 바, TH⁺ 세포의 증가 비율이 현저하게 감소했다(도 3의 (C)). 한편, ddA 또는 ICI를 단독으로 세포에 가해도 컨트롤과 비교하여, TH⁺ 세포의 비율에 변화는 보이지 않았다.

이어서, FOXA2, NURR1, PITX3 및 TH 등의 중뇌 도파민 작동성 뉴런의 마커 분자를 대상으로, 이중 표지에 의한 면역 세포 화학법을 행하였다. 0.1mM의 VPA를 첨가하여 배양한 세포에 있어서, TH⁺FOXA2⁺ 세포 및 TH⁺NURR1⁺ 세포의 비율이, 컨트롤 때와 비교하여 현저하게 증가하고 있었다(각각, 1.00±0.58％ 대 0.25±0.22％, 및 1.00±0.70％ 대 0.37±0.32％, 도 4). 분화 유도의 기간이 너무 짧았던 것 및 GDNF와 같은 사이토카인을 가하고, 세포를 배양하지 않았던 것으로부터, PITX3⁺ 세포는 거의 관찰되지 않았다. 이 결과로부터, VPA와 함께 세포를 배양함으로써, 도파민 작동성 뉴런에의 분화 및 중뇌형 도파민 작동성 뉴런 표현형의 획득이 촉진되는 것이 시사되었다.

이어서, 아포토시스 세포의 마커인 카스파제3의 발현을 지표로 하여, 상술한 시험 화합물이 TH⁺ 신경 세포의 인비트로에 있어서의 생존율에 끼치는 영향을 평가하였다. 컨트롤의 스피어에 있어서, TH⁺ 신경 세포의 18.0±5.9％가 카스파제3을 발현하고 있었다. 이 결과로부터, 5분의 1의 도파민 작동성 뉴런이 아포토시스를 향하고 있는 것이 시사되었다(도 5). 한편, VPA 또는 E2의 존재 하에서 배양한 세포는, 아포토시스를 향하고 있는 도파민 작동성 뉴런의 비율이 낮았다. 그러나, 4개의 그룹 간에, 유의차는 보이지 않았다.

이식한 NPC의 신경 세포로의 분화에 대한 VPA의 영향

이어서, VPA, ZNS 또는 E2의 전신 투여가, 이식편 중의 도파민 작동성 뉴런의 생존율 및 분화에 영향을 미치는지 여부를 조사하였다. 이 이식 실험에서는, SFEB법을 개시하고 나서 9일째에, FACS에 의한 소팅을 행하고 있지 않은 세포 집단(2개의 세포 집합체 중에 3.1×10⁵ 세포, PBS 중)을 SD 래트의 선조체에 이식하였다. 이식에 사용한 SD 래트는, 이식을 행하는 날의 2일 전부터 살처분되는 날까지(이식 후 4주일) 매일, 상술한 약제 중 1가지 및 면역 제어제인 CsA가 복강내 투여되었다. 살처분의 날, CsA의 혈중 농도는 평균으로 3700±898ng/ml였다. VPA, ZNS 및 E2의 혈중 농도는, 각각 158.5±3.9μg/ml, 2.43±0.13μg/ml 및 1141±926pg/ml였다.

Nestin(NPC의 마커) 및 Ki67(증식하고 있는 세포의 마커)을 대상으로 하여 이중 표지를 사용한 면역 조직 화학법을 행한 바, 이식한 세포의 15 내지 20％가 Nestin⁺ 세포였지만, 4개의 그룹 간에 유의차는 보이지 않았다(도 6의 (A)). Nestin⁺ 세포 중의 Ki67⁺ 세포의 비율은, 모든 이식편에 있어서 매우 낮았다(<0.1％). Nestin⁺ 세포는, 이 시점에 있어서, 정지기 또는 유사 분열후 세포가 되어 있는 것이 시사되었다. 한편, 성숙 신경 세포의 마커인 NeuN을 대상으로 하여 면역 조직 화학법을 행한 바, VPA를 투여한 SD 래트에서는, 이식편의 전체 세포수에 대한 NeuN⁺ 세포의 비율이, 컨트롤의 SD 래트와 비교하여 유의미하게 증가하고 있었다(77.9±5.1％ 대 57.7±9.4％, 도 6의 (B)). 이 결과에 의해, VPA는 이식한 NPC의 신경 세포로의 분화를 촉진하는 것이 시사되었다. 이식된 세포는, 면역 형광 염색을 사용하여 M2M6을 마커로서 동정하였다. M2M6은, 이식된 세포(마우스의 세포)에만 발현되고, 숙주인 SD 래트의 세포에는 발현되지 않는다. 이식하여 4주일 후, 모든 그룹에 있어서, 이식편은 양호하게 생존하고, 암화의 사인도 관찰되지 않았다. 이식편의 체적에 대해서는, VPA를 투여한 SD 래트가 가장 작고(4.33±2.14㎣), 컨트롤의 SD 래트가 가장 컸다(9.76±3.19㎣). 그러나, 유의차는 보이지 않았다(도 7의 (A)).

VPA 또는 ZNS의 투여에 의한, 마우스 iPS 세포 유래 신경 전구 세포를 포함하는 이식편 중의 중뇌 도파민 작동성 뉴런의 잔존율의 향상

이식 후 4주일째의 이식편 중에 있어서의 TH⁺ 세포의 수를, 4개의 그룹간에 비교하였다. 이중 표지를 사용한 면역 조직 화학법을 행한 바, VPA를 투여한 SD 래트의 이식편에서는, 컨트롤의 SD 래트의 이식편과 비교하여, TH⁺ 세포의 수가 현저하게 많았다(각각, 1396±864 세포, 393±311 세포, 도 7의 (B)). 컨트롤의 SD 래트의 이식편에 있어서, TH⁺ 세포의 지극히 일부가 중뇌 마커인 FOXA2를 공발현하고 있었다(24.7±9.3％). 이에 비해, VPA 또는 ZNS를 투여한 SD 래트의 이식편에서는, 대부분의 TH⁺ 세포가, FOXA2⁺였다(각각, 81.8±33.6％ 및 80.4±21.1％). 통계학적인 분석에 의해, VPA 또는 ZNS를 투여한 SD 래트의 이식편 중에 있어서의 중뇌 도파민 작동성 뉴런(TH⁺FOXA2⁺)의 수는, 컨트롤의 SD 래트의 이식편과 비교하여, 유의미하게 증가하고 있는 것이 나타났다(각각, 984±770 세포, 835±540 세포 및 97±76 세포, 도 7의 (C)). 이 결과로부터, VPA 또는 ZNS의 전신 투여에 의해, 이식한 신경 전구 세포로부터 분화된 도파민 작동성 뉴런의 잔존율이 향상되는 것이 시사되었다. ZNS를 투여한 경우, 이식한 NPC의 신경 세포로의 분화의 비율이, 컨트롤과 동일 정도인 것(도 6의 (B))으로부터, 이식 후의 잔존율과, NPC의 신경 세포로의 분화의 효율은 서로 독립적인 관계에 있는 것이 시사되었다.

VPA 또는 ZNS의 투여에 의한, 인간 iPS 세포 유래 신경 전구 세포를 포함하는 이식편 중의 중뇌 도파민 작동성 뉴런의 생존율

이식 후 4주일째의 이식편 중에 있어서의 TH⁺ 세포의 수를, 5개의 그룹 간에 비교하였다. 이중 표지를 사용한 면역 조직 화학법을 행한 바, 고용량의 ZNS를 투여한 SCID 래트의 이식편에서는, 컨트롤의 SCID 래트의 이식편과 비교하여, TH⁺ 세포의 수가 현저하게 많았다. (각각, 6480±2145 세포, 3026±1349 세포, 도 8의 (A). 도면 중의 「*」은, p <0.05인 것을 나타낸다.) . 컨트롤의 SCID 래트의 이식편에 있어서는, TH⁺ 세포 중 중뇌 마커인 FOXA2를 공발현하고 있었던 세포가 76.3±9.7％이었던 것에 비해, 고용량의 ZNS를 투여한 SCID 래트의 이식편에서는, TH⁺ 세포 중 91.8±6.2％가 FOXA2⁺였다. 통계학적인 분석에 의해, 고용량의 ZNS를 투여한 SCID 래트의 이식편 중에 있어서의 중뇌 도파민 작동성 뉴런(TH⁺FOXA2⁺)의 수는, 컨트롤의 SCID 래트의 이식편과 비교하여, 유의미하게 증가하고 있는 것이 나타났다(각각, 5889±1821 세포, 2297±1116 세포, 도 8의 (B). 도면 중의 「*」 및 「**」은, 각각 p <0.05 및 p <0.01인 것을 나타낸다.). 이들 결과로부터, ZNS의 전신 투여에 의해, 이식한 신경 전구 세포로부터 분화된 도파민 작동성 뉴런의 잔존율이 향상되는 것이 시사되었다.

본 발명의 이식 보조제는, 신경 전구 세포, 특히 iPS 세포 유래의 신경 전구 세포의 이식에 있어서, 레시피언트 뇌이식 부위에서의 도파민 작동성 뉴런의 잔존율을 향상시키는 것에 유용하다. 또한, 상기 이식 보조제가 발프로산을 포함하는 경우, 상기 이식 보조제는, 신경 전구 세포의 도파민 작동성 신경에의 분화를 촉진시키는 것에도 유용하다.

Claims

발프로산 및/또는 조니사미드를 유효 성분으로서 함유하는, 신경 전구 세포의 이식 보조제.
제1항에 있어서, 상기 신경 전구 세포를 이식하기 2일 전 이후에 투여되도록 사용되는 이식 보조제.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 신경 전구 세포가 iPS 세포 유래인 이식 보조제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 도파민 작동성 신경의 변성 질환 치료용인 이식 보조제.
제4항에 있어서, 상기 도파민 작동성 신경의 변성 질환이 파킨슨병인 이식 보조제.