JP2009050172A - ドーパミン神経細胞の分離方法 - Google Patents
ドーパミン神経細胞の分離方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009050172A JP2009050172A JP2007217471A JP2007217471A JP2009050172A JP 2009050172 A JP2009050172 A JP 2009050172A JP 2007217471 A JP2007217471 A JP 2007217471A JP 2007217471 A JP2007217471 A JP 2007217471A JP 2009050172 A JP2009050172 A JP 2009050172A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- cell
- dopamine
- promoter activity
- vivo
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 200
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 title claims abstract description 100
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 40
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 50
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 39
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 28
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 14
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 169
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 95
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 18
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 13
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 12
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 9
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 8
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 claims description 6
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 claims description 4
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 abstract 1
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 description 17
- 210000001259 mesencephalon Anatomy 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 8
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 8
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 6
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 6
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 6
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 description 6
- 230000002964 excitative effect Effects 0.000 description 6
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 5
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 4
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 4
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 3
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150076211 TH gene Proteins 0.000 description 3
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 3
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 2
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 2
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 2
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 2
- 230000003291 dopaminomimetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 2
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 description 2
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000535 oligodendrocyte precursor cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 206010018341 Gliosis Diseases 0.000 description 1
- 101000979001 Homo sapiens Methionine aminopeptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000969087 Homo sapiens Microtubule-associated protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 206010026749 Mania Diseases 0.000 description 1
- 102100023174 Methionine aminopeptidase 2 Human genes 0.000 description 1
- 206010061296 Motor dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 101000756628 Mus musculus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102100036691 Proliferating cell nuclear antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004227 basal ganglia Anatomy 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000001222 gaba-ergic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000000848 glutamatergic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004565 granule cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000000956 olfactory bulb Anatomy 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000001176 projection neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 210000000463 red nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 1
- 230000002747 voluntary effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞の有効な分離方法を提供する。
【解決手段】ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞であって、下記の性質：(a)ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、細胞増殖期マーカー遺伝子のプロモーター活性を併せ持つ；(b)ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、DNA合成酵素のプロモーター活性を併せ持つ；(c)ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、細胞分裂周期特異的発現分子のプロモーター活性を併せ持つ、のいずれかで特徴づけられる細胞を分離する。
【選択図】図２
【解決手段】ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞であって、下記の性質：(a)ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、細胞増殖期マーカー遺伝子のプロモーター活性を併せ持つ；(b)ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、DNA合成酵素のプロモーター活性を併せ持つ；(c)ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、細胞分裂周期特異的発現分子のプロモーター活性を併せ持つ、のいずれかで特徴づけられる細胞を分離する。
【選択図】図２
Description
この出願の発明は、ドーパミン神経細胞が減少した病態脳のドーパミン神経細胞の数を正常値に戻すことに用いる、ドーパミン神経細胞のみに分化させられるが生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を生み出す細胞を分離する方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明にある細胞は、増殖能を持つドーパミン神経前駆細胞であり、それ自身（増殖能を持つドーパミン神経前駆細胞）とドーパミン神経細胞を生み出す。増殖能を持つドーパミン神経前駆細胞を、シャーレ内で増殖させることにより、ドーパミン神経細胞が減少した病態脳のドーパミン神経細胞の数を正常値に戻すことに用いる移植細胞を準備できる。中脳大脳基底核領域のドーパミン神経細胞が減少したパーキンソン病の治療を行う治療行為を可能にする移植用細胞を準備する方法に関するものである。
中枢神経系の神経細胞には興奮性の神経細胞と抑制性の神経細胞がある。また同二種類の神経細胞以外に、反応は遅いが両方向性に神経細胞の活動を調節し神経細胞の様々な活動を促進する物質、例えばドーパミンを放出する神経細胞も含まれている。しかしながら時として、ドーパミン神経細胞の活性が落ち、死滅していくことがある。ドーパミン神経細胞が減少すると随意運動機能障害が生じる。その治療法として、初期であるならば、ドーパミンの前駆物質であるL-dopaを経口投与することにより、残存しているドーパミン神経細胞により多くのドーパミンを合成させて、一時的に症状を緩和することができる。しかし、L-dopa投与による効果を維持するためには日々増量しなければならなくなり、ドーパミン神経細胞死が進めば、どの様に多量のL-dopaを投与してもまったく効果が無くなる。このような経過を辿って患者は感染症及び合併症を併発して死に至る。現在のところ完全治癒させる治療法は無く、将来的に、細胞移植により失われたドーパンミン神経細胞を補う治療法に期待が寄せられている。
しかし、これまで脳は再生しないと考え続けられてきたために、移植用に使う細胞を準備するすべが無かった。その様な中、中枢神経系でも生涯神経細胞産生が続いていることが知られるようになり、患者の脳内から神経幹細胞を取り出して増殖させて移植に使おうという考えも出された。また、患者自身の神経幹細胞を刺激して、脱落した神経細胞を再生させよう言う気運も高まっている。しかし患者から十分量の神経幹細胞取り出すことは難しく、内在性の神経幹細胞を刺激して増殖させることは、広範な領域の神経幹細胞の増殖を招き、脳腫瘍の発生頻度を著しく上昇させる可能性がある。また再生医療によく用いられているES細胞から、神経幹細胞や神経細胞を産生して移植に使おうとする試みもあるが、移植細胞へES細胞が混入することによるteratoma（奇形腫）が生じる危険性や、神経幹細胞や星状膠細胞が混入することによるグリア瘢痕の形成が絶えず危惧される。また現在の技術では、神経細胞のみをセルソーターで分離して移植しても、大半の移植神経細胞は、ソート時の損傷により死滅して移植部位に炎症反応を引き起こし、生き残っていた神経細胞も炎症反応で死滅してしまい、有効な結果がなかなか得られていないのが現実である。
なお、ドーパミン作動性ニューロンを分離する方法としては、特許文献１が知られている。この特許文献１は、ドーパミン作動性ニューロンで発現する遺伝子（例えばtyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター／エンハンサーの制御下で蛍光蛋白質を発現させ、蛍光を発する細胞を細胞集団から分離する方法を開示している。
また、この出願の発明に深く関連する他の刊行物を以下に挙げる。
特開2002-51775
国際公開WO2004/058965号パンフレット
国際公開WO2005/095588号パンフレット
特開2002-51775
Wu SX, Goebbels S, Nakamura K, Nakamura K, Kometani K, Minato N, Kaneko T, Nave KA, Tamamaki N, Pyramidal neurons of upper cortical layers generated by NEX-positive progenitor cells in the subventricular zone. PNAS 2005,102(47):17172-17177.
特許文献１の方法は、ドーパミン作動性ニューロンとして、その前駆細胞（ドーパミン神経細胞にのみ分化する細胞）を単離することも含んでいる。しかしながら、この特許文献１の方法では、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来るドーパミン神経前駆細胞を効率よく分離することは困難である。
この出願は、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞の有効な分離方法を提供することを課題としている。
この出願は、前記の課題を解決するために、この出願では、
ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞であって、下記の性質：
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、細胞増殖期マーカー遺伝子のプロモーター活性を併せ持つ；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、DNA合成酵素のプロモーター活性を併せ持つ；
(c) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、細胞分裂周期特異的発現分子のプロモーター活性を併せ持つ、
のいずれかで特徴づけられる細胞を提供する。
ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞であって、下記の性質：
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、細胞増殖期マーカー遺伝子のプロモーター活性を併せ持つ；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、DNA合成酵素のプロモーター活性を併せ持つ；
(c) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、細胞分裂周期特異的発現分子のプロモーター活性を併せ持つ、
のいずれかで特徴づけられる細胞を提供する。
またこの出願は、前記の細胞を分離する方法であって、以下の工程：
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む細胞集団を調製する工程；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター下流と、細胞増殖マーカーのプロモーター下流に、生体でも検出可能な二種類のシグナルを発する別々のレポーター蛋白のcDNAをつないだDNAを、細胞集団の各細胞に導入する工程；
(c) 二種類のレポーター蛋白質の発するシグナルの有無により、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を単離する工程、
(d) ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を、培養液中で増殖させる工程、
を含むことを特徴とする方法を提供する。
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む細胞集団を調製する工程；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター下流と、細胞増殖マーカーのプロモーター下流に、生体でも検出可能な二種類のシグナルを発する別々のレポーター蛋白のcDNAをつないだDNAを、細胞集団の各細胞に導入する工程；
(c) 二種類のレポーター蛋白質の発するシグナルの有無により、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を単離する工程、
(d) ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を、培養液中で増殖させる工程、
を含むことを特徴とする方法を提供する。
さらに、前記の細胞を分離する方法であって、以下の工程：
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む細胞集団を調製する工程；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター下流に生体でも検出可能なシグナルを発するレポーター蛋白のcDNAをつないだDNAと、細胞増殖マーカーのプロモーター下流に薬剤耐性の性質を付与する蛋白を発現するcDNAをつないだDNAを、細胞集団の各細胞に導入する工程；
(c) レポーター蛋白質の発するシグナルの有無により、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を含む細胞集団を単離する工程、
(d) ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を、薬剤耐性の有無により単離しつつ、培養液中で増殖させる工程、
を含むことを特徴とする方法を提供する。
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む細胞集団を調製する工程；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター下流に生体でも検出可能なシグナルを発するレポーター蛋白のcDNAをつないだDNAと、細胞増殖マーカーのプロモーター下流に薬剤耐性の性質を付与する蛋白を発現するcDNAをつないだDNAを、細胞集団の各細胞に導入する工程；
(c) レポーター蛋白質の発するシグナルの有無により、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を含む細胞集団を単離する工程、
(d) ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を、薬剤耐性の有無により単離しつつ、培養液中で増殖させる工程、
を含むことを特徴とする方法を提供する。
さらにまた、前記の細胞を主に含む細胞集団を分離方法であって、以下の工程：
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む細胞集団を調製する工程；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター下流に生体でも検出可能なシグナルを発するレポーター蛋白のcDNAをつないだDNAと、細胞集団の各細胞に導入する工程；
(c) レポーター蛋白の有無によりドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を単離する工程；
(d) ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞細胞を培養液中で増殖させ、主な含有細胞種とする工程、
を含むことを特徴とする方法を提供する。
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む細胞集団を調製する工程；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター下流に生体でも検出可能なシグナルを発するレポーター蛋白のcDNAをつないだDNAと、細胞集団の各細胞に導入する工程；
(c) レポーター蛋白の有無によりドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を単離する工程；
(d) ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞細胞を培養液中で増殖させ、主な含有細胞種とする工程、
を含むことを特徴とする方法を提供する。
またさらに、前記各方法では、工程(a)において、胚性幹細胞または神経幹細胞から誘導したドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む細胞集団を調製することを好ましい態様とする。あるはまた、工程(a)において、ドナーのドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む組織を分散して細胞集団を調製することを別の好ましい態様とする。
そしてさらに、前記の胚性幹細胞または神経幹細胞が哺乳動物由来であり、哺乳動物がヒトであること、前記ドナーが哺乳動物であり、哺乳動物がヒトであることをそれぞれ好ましい態様とする。
さらには、前記各発明においては、ステップ(d)で分離した細胞をレシピエントに移植することを含むことを好ましい態様としている。
この出願はまた、前記の細胞（ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞）を得るために試用する試薬および細胞のキットを提供する。
なお、この発明において、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞は、それ自体を細胞増殖により生み出す細胞である。分裂により生じた娘細胞は、生体内で「ドーパミン神経細胞」へと分化する場合も、「それ自体」に留まる場合もあること意味する。
これまで、胚性幹細胞や神経幹細胞の培養条件を調節することで、ドーパミン神経細胞を始め様々な細胞が誘導されてきた。しかし何れの条件でも、単一種の細胞のみを産生する系はなく、治療に用いる前に再度の分離が必要となり、細胞活性を損なうこととなっていた。この出願の発明によって、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞が純度高く得られる。ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞はTH陽性であり、脳内ではTH陽性細胞はドーパミン神経細胞とノルアドレナリン神経細胞だけであり、ノルアドレナリン神経細胞も移植すると、パーキンソン病症状を軽減することを考えると、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を分離して培養することにより、ドーパミン神経細胞の欠落を補う、ES細胞の混入の無い安全な移植細胞を生み出す系が提供される。
本願発明者らは、生体内での神経細胞産生過程を調べることにより、胎児脳の実質内には神経細胞に運命が決まっているが尚増殖を続け神経細胞を生み出すintermediate neuron progenitorというこれまでにまったく知られていなかった細胞分化の中間状態に有る細胞が存在すること発見した(特許文献２−３、非特許文献１)。 Intermediate neuron progenitorにはGABA神経細胞ばかりを生み出すものや（特許文献２）、興奮性神経細胞ばかりを生み出すものがあり（特許文献２）、それぞれを特徴付ける遺伝子のプロモーター活性を利用して蛍光蛋白を発現させることによりセルソーターを利用して選別することができる。セルソーターで選別すると、上でも述べたように、頻繁に細胞に傷がついてしまうが、Intermediate neuron progenitorの場合は、回復させるために一時的に培養増殖させても、また十分な数を得るために長く培養増殖させても、適切な培養条件を整えることで他の種の細胞が生じることが無いと考えられる。それ故、teratomaを引き起こすES細胞の混入がないことを確認してからIntermediate neuron progenitorを培養することで、乃至は培養してから混入の有無を確認することで、安全な移植用細胞が安定して得られる可能性がある。
Intermediate neuron progenitorは生体内のみで見られるものではなく、ES細胞や神経幹細胞を培養する際に適切な培養条件を設けると、培養細胞中に現れ、神経細胞マーカー（MAP2, Tuj1, GABA, tyrosin hydroxylaseなど）と細胞増殖マーカー、DNA合成酵素、細胞周期マーカー（Ki-67, PCNA, DNApolymerase, cyclinなど）を共発現している細胞として確認することができる。Intermediate neuron progenitorはその種類ごとに異なる神経分化因子により、Intermediate neuron progenitorのみならず神経細胞も産生するようになる。このようなIntermediate neuron progenitorがGABA神経細胞を生み出すものであるならば、癲癇症患者の発作フォーカスに移植することにより、分裂してGABA神経細胞を供給し癲癇発作を抑えることも期待さている（特許文献２）。またこのようなIntermediate neuron progenitorが大脳皮質興奮性神経細胞を生み出すものもあり、外傷性乃至は脳梗塞に拠る機能障害を起こした脳の領域の興奮性神経細胞を補うことが期待されている（特許文献３）。
今回、発明者らの研究により、GABA神経細胞と大脳皮質興奮性神経細胞の脳内での産生過程を観察している際に確認されたIntermediate neuron progenitorと呼ばれる細胞分化状態が、ドーパミン神経細胞の産生過程にも存在することが確認された（下記の実施例）。それ故、GABA神経細胞と大脳皮質興奮性神経細胞のIntermediate neuron progenitorの場合と同様に、安全な移植用のドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を安定して得る方法が準備でき、パーキンソン病の移植治療に貢献できる。
具体的には、Intermediate neuron progenitorの性質を備えたドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞は、これまでに提案されている方法（特許文献３）で分離された細胞群に混入するが、これまでの方法では、分離された細胞は神経細胞でありそれ以上は分裂しないものと考えて、直ちに脳に移植するのが常であった。しかし（特許文献３）にある方法により分離された細胞群は、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を獲るための原材料となる。
この出願の前記発明において、神経幹細胞は、中枢神経系を構成する全ての種の細胞を供給することのできる細胞であるのに対し、Intermediate progenitorとは、神経幹細胞から生み出され、増殖することができるが、限られた細胞種に分化しうる細胞のことをいう。例えば、希突起膠細胞の前駆細胞として、 oligodendrocyte precursor cell(OPC)が知られているし、GABA作動性神経細胞の前駆細胞としては、嗅球顆粒細胞を供給する前脳胞脳室下帯の細胞がIntermediate neuron progenitorに当たる。しかしこれまでに、中脳の実質内にドーパミン神経細胞を生み出すIntermediate neuron progenitorが存在することは知られていなかった。この出願の発明者による以下の観察結果は、ドーパミン神経細胞を生み出すIntermediate neuron progenitorが中脳実質内に存在する直接および間接証拠である。
1．胎生E14.5のマウスにBrdUを取り込ませ、直ちに還流固定してBrdU、THの二重免疫染色をすると、中脳実質のTH陽性細胞がBrdU免疫染色と重なるものが見つかる（図３）。これは、中脳実質のドーパミン神経前駆細胞が細胞分裂に備えて、DNAを複製していたことを意味する。
2．胎生E14.5のマウス胎児中脳腹側部を取り出し、蛋白分解酵素で細胞を分散させ、ガラススライド表面に塗布した細胞サンプルで、免疫細胞化学的にTH（緑）と細胞増殖マーカーのKi-67（赤）を検出したところ、二つの免疫抗原性が重なることがあることが分かった。これは分散したTH陽性細胞の一部は細胞増殖の何れかの状態にあったことを意味している。
3．胎生E14.5のマウス胎児中脳腹側部を取り出し、蛋白分解酵素で細胞を分散させ、顕微鏡下で単一細胞を吸い上げ、顕微鏡下で吸い上げた単一細胞をmRNA逆転写酵素溶液に射出し、逆転写反応とPCR反応を行って、単一細胞内で発現している遺伝子を調べた。その結果、20個のTH陽性細胞のうち3個（15%）が、細胞増殖マーカーであるKi-67分子を作るためのmRNAを発現していることが分かった。同TH陽性細胞（ドーパミン神経前駆細胞）はまだ増殖細胞サイクルにあることが分かった。
1．胎生E14.5のマウスにBrdUを取り込ませ、直ちに還流固定してBrdU、THの二重免疫染色をすると、中脳実質のTH陽性細胞がBrdU免疫染色と重なるものが見つかる（図３）。これは、中脳実質のドーパミン神経前駆細胞が細胞分裂に備えて、DNAを複製していたことを意味する。
2．胎生E14.5のマウス胎児中脳腹側部を取り出し、蛋白分解酵素で細胞を分散させ、ガラススライド表面に塗布した細胞サンプルで、免疫細胞化学的にTH（緑）と細胞増殖マーカーのKi-67（赤）を検出したところ、二つの免疫抗原性が重なることがあることが分かった。これは分散したTH陽性細胞の一部は細胞増殖の何れかの状態にあったことを意味している。
3．胎生E14.5のマウス胎児中脳腹側部を取り出し、蛋白分解酵素で細胞を分散させ、顕微鏡下で単一細胞を吸い上げ、顕微鏡下で吸い上げた単一細胞をmRNA逆転写酵素溶液に射出し、逆転写反応とPCR反応を行って、単一細胞内で発現している遺伝子を調べた。その結果、20個のTH陽性細胞のうち3個（15%）が、細胞増殖マーカーであるKi-67分子を作るためのmRNAを発現していることが分かった。同TH陽性細胞（ドーパミン神経前駆細胞）はまだ増殖細胞サイクルにあることが分かった。
よって胎生期の中脳脳室帯にある神経幹細胞はTH陰性であるのに対し、中脳実質のドーパミン神経細胞前駆細胞は、THを発現し神経細胞マーカーとしても使われるドーパミンを合成して含むが、同時に分裂能を持つものがあることが明らかになった。これは、Intermediate neuron progenitorの重要な特徴であり、GABA神経細胞、グルタメイト作動性神経細胞でも確認された中間的な細胞分化状態が、ドーパミン神経細胞が産生される際にも存在することを示している。それ故、増殖能を持ったドーパミン神経前駆細胞は、これまでにGABA神経前駆細胞とグルタメイト作動性神経前駆細胞で特許出願された発明（特許文献２、３）と同様の有効な使用法があると容易に類推することができる。
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
実施例１
胎生E14.5の妊娠期にあるマウスにBrdU 50 mg/gの割合で母体の体重分BrdU溶液を腹腔内に注入し、30分後に胎仔を10％ホルマリンで灌流固定し、中脳領域を取り出し、30％ショ糖液に漬けてから凍結切片を作成した。作成した切片を抗THウサギ抗体(Chemicon, USA)に浸漬し、THを緑の蛍光で標識した。その後、ホルマリン処理、アルカリ処理、中和処理を経て、抗BrdUラット抗体に浸漬し、BrdUを赤色の蛍光で標識した。染色後、切片を共焦点顕微鏡で観察したところ、二重に標識される細胞が散在して見られた。図中にある二重標識された細胞は二つが隣り合って存在し、繰り返し分裂を続けるTH陽性のドーパミン神経前駆細胞と考えられる（図３）。
実施例２
胎生E14.5のマウス胎仔を取り出し、中脳領域を切り出して蛋白分解酵素、0.5% trypsin in PBSで処理をして、個々の細胞に分散し、スライドグラスに塗布して乾燥させてから、抗THウサギ抗体(Chemicon, USA)（緑）と、抗Ki-67 (Becton Dickinson, USA)マウス抗体（赤）で染色し、二重に標識される細胞を探すと、其処此処に見つかった（図４）。
実施例３
胎生E14.5のマウス胎仔を取り出し、中脳領域を切り出して蛋白分解酵素、0.5% trypsin in PBSで処理をして、個々の細胞に分散し、顕微鏡下でランダムに単一の細胞をガラス管で吸い上げ、顕微鏡下で単一の細胞をmRNA逆転写反応液の中に射出するのを確認して、single cell RT-PCRを行った。その内20個のTH陽性細胞のうち3個（15%）が、細胞増殖マーカーであるKi-67分子を作るためのmRNAを発現していることが分かった（図５）。同TH陽性細胞（ドーパミン神経前駆細胞）はまだ増殖細胞サイクルにあることが分かった。
実施例１
胎生E14.5の妊娠期にあるマウスにBrdU 50 mg/gの割合で母体の体重分BrdU溶液を腹腔内に注入し、30分後に胎仔を10％ホルマリンで灌流固定し、中脳領域を取り出し、30％ショ糖液に漬けてから凍結切片を作成した。作成した切片を抗THウサギ抗体(Chemicon, USA)に浸漬し、THを緑の蛍光で標識した。その後、ホルマリン処理、アルカリ処理、中和処理を経て、抗BrdUラット抗体に浸漬し、BrdUを赤色の蛍光で標識した。染色後、切片を共焦点顕微鏡で観察したところ、二重に標識される細胞が散在して見られた。図中にある二重標識された細胞は二つが隣り合って存在し、繰り返し分裂を続けるTH陽性のドーパミン神経前駆細胞と考えられる（図３）。
実施例２
胎生E14.5のマウス胎仔を取り出し、中脳領域を切り出して蛋白分解酵素、0.5% trypsin in PBSで処理をして、個々の細胞に分散し、スライドグラスに塗布して乾燥させてから、抗THウサギ抗体(Chemicon, USA)（緑）と、抗Ki-67 (Becton Dickinson, USA)マウス抗体（赤）で染色し、二重に標識される細胞を探すと、其処此処に見つかった（図４）。
実施例３
胎生E14.5のマウス胎仔を取り出し、中脳領域を切り出して蛋白分解酵素、0.5% trypsin in PBSで処理をして、個々の細胞に分散し、顕微鏡下でランダムに単一の細胞をガラス管で吸い上げ、顕微鏡下で単一の細胞をmRNA逆転写反応液の中に射出するのを確認して、single cell RT-PCRを行った。その内20個のTH陽性細胞のうち3個（15%）が、細胞増殖マーカーであるKi-67分子を作るためのmRNAを発現していることが分かった（図５）。同TH陽性細胞（ドーパミン神経前駆細胞）はまだ増殖細胞サイクルにあることが分かった。
なお、Single cell RT-PCRは下記のとおりに行った。
1．以下の溶液を単一細胞に加え、65℃で10分間インキュベートした後、少なくとも１分間氷で冷却した。
1．以下の溶液を単一細胞に加え、65℃で10分間インキュベートした後、少なくとも１分間氷で冷却した。
DNase RNase Free water 6.5 ml
10 mM dNTP mixture 1.0 ml
Oligo(dT) primer (0.5 mg/ml) 1.0 ml
2．以下の溶液を加え、50℃で60分間インキュベートした。
10 mM dNTP mixture 1.0 ml
Oligo(dT) primer (0.5 mg/ml) 1.0 ml
2．以下の溶液を加え、50℃で60分間インキュベートした。
5 X First strand buffer 4.0 ml
0.1 M DTT 1.0 ml
RNase inhibitor (40 U/ml, Ambion) 0.5 ml
Superscript III (200 U/ml, invitrogen) 0.5 ml
3．混合溶液を70℃で15分間加熱して反応を停止させた後、冷却した。
4．0.5 ml RNaseH を添加し、37℃で20分間インキュベートした。
5．標的遺伝子断片を、単一のGFPポジティブSVZ細胞のcDNAを鋳型とするnested PCRまたはsemi-nested PCRによって増幅した。
0.1 M DTT 1.0 ml
RNase inhibitor (40 U/ml, Ambion) 0.5 ml
Superscript III (200 U/ml, invitrogen) 0.5 ml
3．混合溶液を70℃で15分間加熱して反応を停止させた後、冷却した。
4．0.5 ml RNaseH を添加し、37℃で20分間インキュベートした。
5．標的遺伝子断片を、単一のGFPポジティブSVZ細胞のcDNAを鋳型とするnested PCRまたはsemi-nested PCRによって増幅した。
第1回目のPCRは、多量の標的遺伝子に基づいたcDNA溶液（1〜3μl）を用いて行った。
・第1回目PCR増幅（Qiagen HotstarTaq PCR kit）
10 x PCR buffer 5 ml
2 mM dNTP (Toyobo) 5 ml
第1回目PCR用のプライマーセット
upper primer (50 mM) 0.4 ml
lower primer (50 mM) 0.4 ml
cDNA 1-3 ml
HotStarTaq (5 U/ ml) 1 ml
DDW to 50 ml
・第1回目PCR条件
95 °C 10分（1サイクル）
95 °C 30秒
57 °C（変動） 30秒
72 °C 1分（40サイクル）
72 °C 10分
・第2回PCR増幅（Toyobo Blend Taq PCR kit）
10 x PCR buffer 5 ml
2 mM dNTP (Toyobo) 4 ml
第2回PCR用プライマーセット
upper primer (50 mM) 0.4 ml
lower primer (50 mM) 0.4 ml
Blend Taq (5 U/ ml) 0.5 ml
First-round PCR product 1-2 ml
DDW to 50 ml
・第2回PCR条件
94 °C 2分（1サイクル）
94 °C 30秒
57 °C（変動） 30 秒
72 °C 30秒（25-30サイクル）
72 °C 7分
6．第2回PCR産物を1.0%アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで可視化した。
・第1回目PCR増幅（Qiagen HotstarTaq PCR kit）
10 x PCR buffer 5 ml
2 mM dNTP (Toyobo) 5 ml
第1回目PCR用のプライマーセット
upper primer (50 mM) 0.4 ml
lower primer (50 mM) 0.4 ml
cDNA 1-3 ml
HotStarTaq (5 U/ ml) 1 ml
DDW to 50 ml
・第1回目PCR条件
95 °C 10分（1サイクル）
95 °C 30秒
57 °C（変動） 30秒
72 °C 1分（40サイクル）
72 °C 10分
・第2回PCR増幅（Toyobo Blend Taq PCR kit）
10 x PCR buffer 5 ml
2 mM dNTP (Toyobo) 4 ml
第2回PCR用プライマーセット
upper primer (50 mM) 0.4 ml
lower primer (50 mM) 0.4 ml
Blend Taq (5 U/ ml) 0.5 ml
First-round PCR product 1-2 ml
DDW to 50 ml
・第2回PCR条件
94 °C 2分（1サイクル）
94 °C 30秒
57 °C（変動） 30 秒
72 °C 30秒（25-30サイクル）
72 °C 7分
6．第2回PCR産物を1.0%アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで可視化した。
なお、PCRプライマーセットは、各標的遺伝子のGenBank配列に基づきデザインした。1対の各プライマーはゲノムDNAの増幅を避けるため、異なるエクソンに位置するようにデザインした。詳細は以下のとおりである。
・マウスβ-actin（GenBank accession number: X03672）
第1回PCR用のプライマーセット（産物長：556 bp）
Upper: 5'-gccaaccgtgaaaagatgac-3'：配列番号1（位置：420-459；エクソン4内）
Lower: 5'-gcactgtgttggcatagagg-3'：配列番号2（位置：956-975；エクソン5内）
アニーリング温度： 57.9 °C
第2回目PCRプライマーセット（産物長：391 bp）
Upper: 5'-ggctgtgctgtccctgtatg-3'：配列番号3（位置：491-510；エクソン4内）
Lower: 5'-caagaaggaaggctggaaaa-3'：配列番号4（位置：862-881；エクソン5内
アニーリング温度：57.0 °C
・マウスβIII-tubμlin（GenBank accession number NM_023279）
第1回PCR用のプライマーセット（産物長：609 bp）
Upper: 5'-agtgcggcaaccagataggg-3'：配列番号5（位置：74 - 93；エクソン1内）
Lower: 5'-tgcggaagcagatgtcgtag-3'：配列番号6（位置：663-682；エクソン4内）
アニーリング温度：58.8 °C
第2回PCR用のプライマーセット（産物長：323 bp）
Upper: 5'-tctggcgcctttggacacct-3'：配列番号7（位置：274-293；エクソン3内）
Lower: 5'-gcgttgtagggtccaccac-3'：配列番号8（位置：577-598；エクソン4内）
アニーリング温度：59.3 °C
・Ki-67（GenBank accession No. X82786）
第1回PCR用のプライマーセット（産物長：675 bp）
Upper: 5'-caacattacaaagcaaaagca-3'：配列番号9（位置：8396-8416；エクソン13内）
Lower: 5'-gcttaggttcactgtccaaa-3'：配列番号10（位置：9051-9070；エクソン14内）
アニーリング温度：53.5 °C
第2回PCR用のプライマーセット（産物長：380 bp）
Upper: 5'-caccaaagcaggaagcaaca-3'：配列番号11（位置：8492-8511；エクソン13内）
Lower: 5'-ttggccccgagatgtagatt-3'：配列番号12（位置：8852-8871；エクソン14内）
アニーリング温度：54.7 °C
・マウスtyrosine hydroxylase（GenBank accession No. M69200）
第1回PCR用のプライマーセット（産物長：571 bp）
Upper: 5’-cccaaggaaagtgtcagagt-3’：配列番号13（位置：506；エクソン4内）
Lower: 5’-cagagatgcaagtccaatgt-3’：配列番号14（位置：1057；エクソン10内）
好適アニーリング温度：56.6 °C
第2回PCR用のプライマーセット（産物長：354 bp）
Upper: 5’-ttgaccctgacctggacctg-3’：配列番号15（位置：556；エクソン4内）
Lower: 5’-ccagaaaatcacgggcagac-3’：配列番号16（位置：890；エクソン8内）
好適アニーリング温度：58.4 °C;
・マウスβ-actin（GenBank accession number: X03672）
第1回PCR用のプライマーセット（産物長：556 bp）
Upper: 5'-gccaaccgtgaaaagatgac-3'：配列番号1（位置：420-459；エクソン4内）
Lower: 5'-gcactgtgttggcatagagg-3'：配列番号2（位置：956-975；エクソン5内）
アニーリング温度： 57.9 °C
第2回目PCRプライマーセット（産物長：391 bp）
Upper: 5'-ggctgtgctgtccctgtatg-3'：配列番号3（位置：491-510；エクソン4内）
Lower: 5'-caagaaggaaggctggaaaa-3'：配列番号4（位置：862-881；エクソン5内
アニーリング温度：57.0 °C
・マウスβIII-tubμlin（GenBank accession number NM_023279）
第1回PCR用のプライマーセット（産物長：609 bp）
Upper: 5'-agtgcggcaaccagataggg-3'：配列番号5（位置：74 - 93；エクソン1内）
Lower: 5'-tgcggaagcagatgtcgtag-3'：配列番号6（位置：663-682；エクソン4内）
アニーリング温度：58.8 °C
第2回PCR用のプライマーセット（産物長：323 bp）
Upper: 5'-tctggcgcctttggacacct-3'：配列番号7（位置：274-293；エクソン3内）
Lower: 5'-gcgttgtagggtccaccac-3'：配列番号8（位置：577-598；エクソン4内）
アニーリング温度：59.3 °C
・Ki-67（GenBank accession No. X82786）
第1回PCR用のプライマーセット（産物長：675 bp）
Upper: 5'-caacattacaaagcaaaagca-3'：配列番号9（位置：8396-8416；エクソン13内）
Lower: 5'-gcttaggttcactgtccaaa-3'：配列番号10（位置：9051-9070；エクソン14内）
アニーリング温度：53.5 °C
第2回PCR用のプライマーセット（産物長：380 bp）
Upper: 5'-caccaaagcaggaagcaaca-3'：配列番号11（位置：8492-8511；エクソン13内）
Lower: 5'-ttggccccgagatgtagatt-3'：配列番号12（位置：8852-8871；エクソン14内）
アニーリング温度：54.7 °C
・マウスtyrosine hydroxylase（GenBank accession No. M69200）
第1回PCR用のプライマーセット（産物長：571 bp）
Upper: 5’-cccaaggaaagtgtcagagt-3’：配列番号13（位置：506；エクソン4内）
Lower: 5’-cagagatgcaagtccaatgt-3’：配列番号14（位置：1057；エクソン10内）
好適アニーリング温度：56.6 °C
第2回PCR用のプライマーセット（産物長：354 bp）
Upper: 5’-ttgaccctgacctggacctg-3’：配列番号15（位置：556；エクソン4内）
Lower: 5’-ccagaaaatcacgggcagac-3’：配列番号16（位置：890；エクソン8内）
好適アニーリング温度：58.4 °C;
パーキンソン病の治療法として、ドーパミン神経細胞の欠落を補う、ES細胞の混入の無い安全な移植細胞を効率的に生み出す適切な系はこれまでなかったが、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を分離して培養することにより、生物工学的に産生が可能となると考えられる。
Claims (12)
- ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞であって、下記の性質：
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、細胞増殖期マーカー遺伝子のプロモーター活性を併せ持つ；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、DNA合成酵素のプロモーター活性を併せ持つ；
(c) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性と、細胞分裂周期特異的発現分子のプロモーター活性を併せ持つ、
のいずれかで特徴づけられる細胞。 - 請求項１に記載の細胞を分離する方法であって、以下の工程：
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む細胞集団を調製する工程；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター下流と、細胞増殖マーカーのプロモーター下流に、生体でも検出可能な二種類のシグナルを発する別々のレポーター蛋白のcDNAをつないだDNAを、細胞集団の各細胞に導入する工程；
(c) 二種類のレポーター蛋白質の発するシグナルの有無により、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を単離する工程、
(d) ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を、培養液中で増殖させる工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項１に記載の細胞を分離する方法であって、以下の工程：
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む細胞集団を調製する工程；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター下流に生体でも検出可能なシグナルを発するレポーター蛋白のcDNAをつないだDNAと、細胞増殖マーカーのプロモーター下流に薬剤耐性の性質を付与する蛋白を発現するcDNAをつないだDNAを、細胞集団の各細胞に導入する工程；
(c) レポーター蛋白質の発するシグナルの有無により、ドーパミン神経細胞のみに分化させられる細胞であるが、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を含む細胞集団を単離する工程、
(d) ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞を、薬剤耐性の有無により単離しつつ、培養液中で増殖させる工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項１に記載の細胞を主に含む細胞集団を分離方法であって、以下の工程：
(a) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む細胞集団を調製する工程；
(b) ドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター下流に生体でも検出可能なシグナルを発するレポーター蛋白のcDNAをつないだDNAと、細胞集団の各細胞に導入する工程；
(c) レポーター蛋白の有無によりドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を単離する工程；
(d) ドーパミン神経細胞のみに分化するとともに、生体内でも生体外でも分裂増殖を続けることが出来る細胞細胞を培養液中で増殖させ、主な含有細胞種とする工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 工程(a)において、胚性幹細胞または神経幹細胞から誘導したドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む細胞集団を調製する請求項２から４のいずれかの方法。
- 工程(a)において、ドナーのドーパミン合成酵素tyrosin hydroxylase遺伝子のプロモーター活性を持つ細胞を含む組織を分散して細胞集団を調製する請求項１から４のいずれかの方法。
- 胚性幹細胞または神経幹細胞が哺乳動物由来である、請求項５の方法。
- 哺乳動物がヒトである、請求項７の方法。
- ドナーが哺乳動物である、請求項６の方法。
- 哺乳動物がヒトである、請求項９の方法。
- さらに、ステップ(d)で分離した細胞をレシピエントに移植することを含む、請求項２から４のいずれかの方法。
- 請求項１に記載の細胞を得るために試用する試薬および細胞のキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007217471A JP2009050172A (ja) | 2007-08-23 | 2007-08-23 | ドーパミン神経細胞の分離方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007217471A JP2009050172A (ja) | 2007-08-23 | 2007-08-23 | ドーパミン神経細胞の分離方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2009050172A true JP2009050172A (ja) | 2009-03-12 |
Family
ID=40501847
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007217471A Pending JP2009050172A (ja) | 2007-08-23 | 2007-08-23 | ドーパミン神経細胞の分離方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2009050172A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014184973A1 (ja) * | 2013-05-16 | 2014-11-20 | 大日本住友製薬株式会社 | 神経前駆細胞を用いた細胞治療における移植補助剤 |
| JP2017511153A (ja) * | 2014-03-21 | 2017-04-20 | セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド | 中脳ドーパミン作動性ニューロンの生産およびその使用方法 |
-
2007
- 2007-08-23 JP JP2007217471A patent/JP2009050172A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014184973A1 (ja) * | 2013-05-16 | 2014-11-20 | 大日本住友製薬株式会社 | 神経前駆細胞を用いた細胞治療における移植補助剤 |
| JPWO2014184973A1 (ja) * | 2013-05-16 | 2017-02-23 | 大日本住友製薬株式会社 | 神経前駆細胞を用いた細胞治療における移植補助剤 |
| US9884045B2 (en) | 2013-05-16 | 2018-02-06 | Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. | Transplantation adjuvant in cell therapy using neural progenitor cells |
| JP2017511153A (ja) * | 2014-03-21 | 2017-04-20 | セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド | 中脳ドーパミン作動性ニューロンの生産およびその使用方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6588500B2 (ja) | 移植用中脳ドーパミン（ｄａ）ニューロン | |
| JP6983128B2 (ja) | 薬物スクリーニング及び筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）の処置における使用のための、ヒト多能性幹細胞からのアストロサイトの指向性分化 | |
| CN103396993B (zh) | 衍生自灵长类胚胎干细胞的用于脊髓损伤的再髓鞘化和治疗的少突胶质细胞 | |
| JP6163104B2 (ja) | ヒト・トロホブラスト幹細胞からの神経幹細胞の生成 | |
| Zhang et al. | Transplantation of bFGF-expressing neural stem cells promotes cell migration and functional recovery in rat brain after transient ischemic stroke | |
| Voloboueva et al. | Distinct effects of miR-210 reduction on neurogenesis: increased neuronal survival of inflammation but reduced proliferation associated with mitochondrial enhancement | |
| AU2016335563B2 (en) | Neural precursor cell populations and uses thereof | |
| JP5776101B2 (ja) | ヒト神経前駆細胞のドーパミン性ニューロンへの分化方法及び分化用培地 | |
| KR20010071601A (ko) | 뇌실막 신경 간세포 및 이의 분리 방법 | |
| JP2009050172A (ja) | ドーパミン神経細胞の分離方法 | |
| WO2023165062A1 (zh) | 一种少突胶质细胞的制备方法及应用 | |
| US20080293056A1 (en) | Method for preparing cancer stem cells | |
| JP7389505B2 (ja) | クローナル幹細胞を含む膵炎治療用薬学的組成物 | |
| US6254865B1 (en) | Method of treating huntington's disease using HNT neurons | |
| EP2515890A1 (en) | Neuronal stimulation | |
| Bianco et al. | Rapid serum-free isolation of oligodendrocyte progenitor cells from adult rat spinal cord | |
| JP2023511003A (ja) | ヒト多能性幹細胞から調製された３ｄオルガノイドを分解することにより大量のオリゴデンドロサイトを確保するための分化方法 | |
| Li et al. | Neural differentiation of adipose-derived stem cells by indirect co-culture with Schwann cells | |
| DK2915879T3 (en) | NEURAL STAMCELLE WITH INCREASED PASSENGER, PROCEDURE FOR PREPARING THE NEURAL STAMCELLE WITH INCREASED PASSENGER AND PROCEDURE FOR CULTIVATING THE NEURAL STAMCELLE TO INCREASE PASSAGE NECAL | |
| KR20060091293A (ko) | 가역적으로 불멸화된 후각 초성 세포 및 신경세포 재생을촉진시키기 위한 그의 용도 | |
| US7736641B2 (en) | Role for SRY in Parkinson's disease | |
| Bédard et al. | Neurogenesis in monkey and human adult brain | |
| Qin | Molecular mechanisms of zebrafish photoreceptor regeneration | |
| VINTILA et al. | TRIAL TO CULTIVATE AND ISOLATE NEURONAL LIKE CELLS FROM 7 DAYS OLD MICE BRAIN | |
| Sun | The Potential Use of Skin-derived Precursors (SKPs) in Stem-cell Based Therapy for Hirschsprung's Disease |