JP5776101B2

JP5776101B2 - ヒト神経前駆細胞のドーパミン性ニューロンへの分化方法及び分化用培地

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Publication number: JP5776101B2
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Inventors: ムーン，ジスク
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Description

本発明は、ヒト神経前駆細胞のドーパミン性ニューロンへの分化方法に係り、さらに詳細には、フザリン酸を含む培地中でヒト神経前駆細胞を培養することを含むヒト神経前駆細胞のドーパミン性ニューロンへの分化方法に関し、また、ヒト神経前駆細胞のドーパミン性ニューロンへの分化用培地に関する。

パーキンソン病は、中脳黒質（substantia nigra）におけるドーパミン性ニューロンの選択的な退化を特徴とする。胎児中脳組織（fetal midbrain tissue）の移植によってパーキンソン病患者のドーパミン性ニューロンを置き換える治療法が様々な形で研究されている（非特許文献１参照）。移植された胎児中脳組織は、ヒトの脳で長期間生存しつつ、患者の線条体（striatum）へのドーパミン神経支配を回復させ、パーキンソン病による運動症状（motor symptoms）を軽減する（非特許文献２参照）。

移植はパーキンソン病の治療に効果的ではあるが、大量にヒトの堕胎胎児組織（abortion fetal tissues）を得ることは困難であることから、その臨床的な適用は、数例に限られている。このような問題点を克服するために、パーキンソン病の移植治療のための供与細胞として多様な候補細胞が研究されてきた（非特許文献３）。

一方、胎児中脳組織由来のヒト神経前駆細胞（ｈＮＰＣｓ）は、長期にわたって増殖活性を有することから自己再生能にすぐれ、かつドーパミン性ニューロンに分化可能であるため、移植用の卓越した候補細胞源（cell source）である（非特許文献４及び５参照）。従って、ドーパミン性ニューロン置換（すなわち、移植）によるパーキンソン病の治療には、ｈＮＰＣｓを効率的に増殖（proliferation）または拡大（expansion）させる方法、及びｈＮＰＣｓをドーパミン性ニューロンに効果的に分化させる方法を確立することが非常に重要である。

先行文献で公知のｈＮＰＣｓのドーパミン性ニューロンへの分化方法は、アスコルビン酸とジブチリル環状アデノシンモノホスフェート（ｄｂ−ｃＡＭＰ）とを含む培地中で３日間培養して分化させる方法（非特許文献６参照）；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ドーパミン及びフォルスコリンを含む培地中で３週間培養して分化させる方法（非特許文献７参照）；及びソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、線維芽細胞増殖因子−８（ＦＧＦ−８）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及びアスコルビン酸を含む培地中で３週間培養して分化させる方法（非特許文献８参照）などを含む。

しかし、先行文献による分化方法は、満足できる分化効率を示すことができず、しかも分化には長期間を要する。また、ＳＨＨ、ＦＧＦ−８などの高価な添加剤を含む培地の使用により、経済的な困難も生じる。パーキンソン病を患う患者を治療するために必要な細胞を大量に増殖させるための技術は依然として不十分である。従って、これらを臨床的に適用するには多くの限界がある。

Bjorklund, A. et al. Reconstruction of the nigro-striatal dopamine pathway by intra-cerebral nigral transplants. Brain Res. 1979; 177: 555-560 Perlow, M. et al. Brain grafts reduce motor abnormalities produced by destruction of nigrostriatal dopamine system. Science 1979; 204: 643-647 Brain J. Snyder et al. Stem cell treatment for parkinson's disease: an update for 2005. Current Opinion in Neurology 2005; 18: 376-385 Storch A. et al. Midbrain-derives neural stem cells: from basic science to therapeutic approaches. Cell tissue Res. 2004; 318: 15-22 Yang M. et al. Neural stem cells spontaneously express dopaminergic traits after transplantation into the intact or 6-hydrodopamine lesioned rat. Exp Neurol. 2002; 177: 50-60 Sanchez-Pernaute, R. et al. In vitro generation and transplantation of precursor-derived human dopamine neurons. J. Neurosic. Res. 2001; 65(4). 284-288 Riaz, S.S. et al. The differentiation potential of human foetal neuronal progenitor cells in vitro. Brain Res. Dev. Brain Res. 2004; 153(1), 39-51 Jaroslaw Maciaczyk et al. Combined use of BDNF, ascorbic acid, low oxygen, and prolonged differentiation time generates tyrosine hydroxylase-expressing neurons after long-term in vitro expansion of human fetal midbrain precursor cells. Experimental Neurology 2008; 213: 354-362

本発明は、ヒト神経前駆細胞（ｈＮＰＣｓ）を高い分化効率でドーパミン性ニューロンに分化させる方法、及び前記分化に有用な培地を提供する。特に、本発明は、分化誘導剤としてフザリン酸を使用してｈＮＰＣｓをドーパミン性ニューロンに分化させる方法、及び前記分化に有用な培地を提供する。

従って、新規の分化誘導剤を含む培地中で、ヒト神経前駆細胞をドーパミン性ニューロンに分化させる方法を提供することが本発明の目的である。

また、ヒト神経前駆細胞をドーパミン性ニューロンに分化させるのに有用な分化用培地を提供することが本発明の他の目的である。

本発明の一態様によって、フザリン酸を含む培地中でヒト神経前駆細胞を培養することを含む、ヒト神経前駆細胞のドーパミン性ニューロンへの分化方法が提供される。

本発明の分化方法において、前記培地は、ジブチリル環状アデノシンモノホスフェート（ｄｂ−ｃＡＭＰ：dibutyryl cyclic adenosine monophosphate）、フォルスコリン、Ｂ２７、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）及び線維芽細胞増殖因子−８（ＦＧＦ８）を含むドーパミン性ニューロン分化用培地に、フザリン酸を加えて調製してもよい。

あるいは、本発明の分化方法において、前記培地は、フザリン酸、ｄｂ−ｃＡＭＰ、フォルスコリン及びＢ２７を含むＮＢ培地であってよく、望ましくは、５０μＭないし４ｍＭのフザリン酸、５０μＭないし４ｍＭのｄｂ−ｃＡＭＰ、５ないし２０μＭのフォルスコリン及び０．５ないし５重量％のＢ２７を含むＮＢ培地であってもよい。さらに望ましくは、前記培地は、１００μＭのフザリン酸、１００μＭのｄｂ−ｃＡＭＰ、１０μＭのフォルスコリン及び２重量％のＢ２７を含むＮＢ培地であってもよい。

本発明の分化方法において、前記培養は、２ないし１０％の酸素分圧を有する低酸素条件で行ってもよい。

本発明の他の態様によって、ヒト神経前駆細胞のドーパミン性ニューロンへの分化用培地として、フザリン酸、ｄｂ−ｃＡＭＰ、フォルスコリン及びＢ２７を含むＮＢ培地である分化用培地が提供される。

前記分化用培地は、５０μＭないし４ｍＭのフザリン酸、５０μＭないし４ｍＭのｄｂ−ｃＡＭＰ、５ないし２０μＭのフォルスコリン及び０．５ないし５重量％のＢ２７を含むＮＢ培地であってよく、望ましくは、１００μＭのフザリン酸、１００μＭのｄｂ−ｃＡＭＰ、１０μＭのフォルスコリン及び２重量％のＢ２７を含むＮＢ培地であってもよい。

フザリン酸存在下でヒト神経前駆細胞を培養することによって、ドーパミン性ニューロンへの分化が著しく増加することが本発明によって発見された。特に、本発明の分化方法は、高価な分化誘導剤として使用が制限されるＳＨＨ及びＦＧＦ８の代わりに、低廉なフザリン酸を使用して、ヒト神経前駆細胞をドーパミン性ニューロンに分化させることができるので、経済的である。また、本発明の分化方法は、従来の分化方法では不十分であった分化効率を著しく改善させることができる。従って、本発明の分化方法は、パーキンソン病を含む神経損傷治療のためのドーパミン性ニューロンの製造に適用される。

多様な培地を使用してドーパミン性ニューロンへの分化を誘導した後、ＴＨ及びＴｕｊ１をＤＡＰＩ染色を介して測定して得られた結果を示すグラフ及び写真である。ｈＮＰＣｓを増殖させ、フザリン酸１００μＭを含むまたは含まない培地中でニューロンへの分化を誘導した後、ＴＨ及びＴｕｊ１の発現レベルを測定して得られた結果を示す写真である。ｈＮＰＣｓを増殖させ、フザリン酸１００μＭを含むまたは含まない培地中でニューロンへの分化を誘導した後、免疫細胞化学分析及びＲＴ−ＰＣＲ分析を行って得られた結果を示すグラフである。異なる分化誘導剤を含む培地を使用してドーパミン性ニューロンへの分化を誘導した後、細胞でのＴＨ発現レベルを測定して得られた結果を示す写真及びグラフである。低酸素条件（hypoxia）及び正常酸素条件（normoxia）における分化効率を測定して得られた結果を示す写真及びグラフである。ＭＰＰ存在下で分化を誘導した際のフザリン酸の影響を測定して得られた結果を示す写真である。ｈＮＰＣｓを増殖させて継代培養し、初期継代（第７継代）、中間継代（第１１継代）、後期継代（第１７継代）それぞれのｈＮＰＣｓの分化を誘導した後、ＴＨ及びＴｕｊ１の発現レベルを測定して得られた結果を示すグラフである。ｈＮＰＣｓを増殖させて継代培養し、初期継代（第７継代）、中間継代（第１１継代）、後期継代（第１７継代）それぞれのｈＮＰＣｓの分化を誘導した後、それぞれの細胞でのＴＨの発現レベルを免疫細胞化学法で測定して得られた結果を示す写真である。ｈＮＰＣｓを増殖させて継代培養し、初期継代（第７継代）、中間継代（第１１継代）、後期継代（第１７継代）それぞれのｈＮＰＣｓの分化を誘導した後、それぞれの細胞でのネスチン（神経幹細胞マーカー）、Ｋｉ６７（増殖性細胞マーカー）及びＴｕｊ１（神経マーカー）の発現レベルを免疫細胞化学法で測定して得られた結果を示す写真である。初期継代（第７継代）のｈＮＰＣｓに対して、分化誘導前及び１週間の分化誘導後に蛍光活性化細胞選別分析（ＦＡＣＳ analysis）を行って得られた結果を示すグラフである。ｈＮＰＣｓを増殖させて継代培養し、初期継代（第７継代）、中間継代（第１１継代）、後期継代（第１７継代）それぞれのｈＮＰＣｓの分化を誘導した後、得られた細胞に対してＲＴ−ＰＣＲ分析及びウェスタンブロット分析を行って得られた結果を示す図面である。本発明の分化方法によって分化した細胞の特性を、免疫細胞化学法により分析して得られた結果を示す写真及びグラフである。本発明の分化方法によって分化した細胞の特性を、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット分析及び免疫細胞化学法により分析して得られた結果を示す図面である。本発明の分化方法によって分化誘導した際の他のサブタイプ（subtype）のニューロン、すなわち、グルタミン酸、ＧＡＢＡ、ＣｈＡＴ及びセロトニンの発現を免疫細胞化学法で測定して得られた結果を示す写真及びグラフである。

本発明は、フザリン酸を含む培地中でヒト神経前駆細胞を培養することを含む、ヒト神経前駆細胞のドーパミン性ニューロンへの分化方法を提供する。

前記ヒト神経前駆細胞は、以前に報告された方法、例えば、Storch et al．2001；及びMilosevic et al．2006，2007に記述された方法によって得ることができる。本明細書で、「ヒト神経前駆細胞」というのは、ヒトの体内から分離された生体外（ex vivo）細胞、すなわち、ヒトの体内から分離された後、通常の細胞培養によって増殖するヒト神経前駆細胞を意味する。前記ヒト神経前駆細胞は、幹細胞特性を有し、ニューロン、アストロサイト（astrocyte）、希突起神経膠細胞（oligodendrocyte）などに分化する。

本発明による分化方法は、フザリン酸を分化誘導剤として含む培地を使用して遂行される。

前記フザリン酸は、化学名が５−ブチルピコリン酸（５−butylpicolinic acid）であって、下記化学式１の化学構造を有する。フザリン酸は、公知の物質であり、公知の方法によって製造することも商業的に購入することもできる（例えば、Sigma-Aldrichなど）。

本発明の分化方法において、前記培地は、従来のドーパミン性ニューロン分化用培地にフザリン酸を加えて調製してもよい。例えば、前記培地は、ジブチリル環状アデノシンモノホスフェート（ｄｂ−ｃＡＭＰ：dibutyryl cyclic adenosine monophosphate）、フォルスコリン、Ｂ２７、ＳＨＨ（ソニックヘッジホッグ）及びＦＧＦ８（線維芽細胞増殖因子−８）を含む従来のドーパミン性ニューロン分化用培地に、フザリン酸を加えて調製してもよい。このとき、フザリン酸は、５０μＭないし４ｍＭの濃度で加えられてもよい。前記ｄｂ−ｃＡＭＰ、フォルスコリン、Ｂ２７、ＳＨＨ、ＦＧＦ８は、いずれも一般的に使用される物質であり、商業的に購入することができる。例えば、ｄｂ−ｃＡＭＰ及びフォルスコリンは、Sigma社から購入することができ、Ｂ２７は、ＧＩＢＣＯ社から購入することができ（商品名：Ｂ−２７ minus−ＡＯ supplement）、ＳＨＨ及びＦＧＦ８は、それぞれＲ＆Ｄ system社及びPeproTech社から購入することができる。一実施形態において、従来のドーパミン性ニューロン分化用培地にフザリン酸を加えて調製した培地は、５０μＭないし４ｍＭのｄｂ−ｃＡＭＰ、５μＭないし２０μＭのフォルスコリン、０．５％ないし５％のＢ２７、２５ｎｇ／ｍｌないし５００ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ、１０ｎｇ／ｍｌないし２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ８及び５０μＭないし４ｍＭのフザリン酸を含むＮＢ培地（Neurobasal media）であってもよい。この基本培地、すなわち、ＮＢ培地は、Invitrogen社などから購入することができる。

望ましくは、本発明の分化方法に使用される培地は、使用が制限される高価なＳＨＨ及びＦＧＦ８を除いた培地である。驚くべきことに、ＳＨＨ及びＦＧＦ８を含まずフザリン酸のみを含む培地によるドーパミン性ニューロンへの分化効率は、ＳＨＨ、ＦＧＦ８及びフザリン酸をすべて含む培地より高いことが本発明によって発見された。

従って、本発明の分化方法において、前記培地は、フザリン酸、ｄｂ−ｃＡＭＰ、フォルスコリン及びＢ２７を含むＮＢ培地であってよく、望ましくは、５０μＭないし４ｍＭのフザリン酸、５０μＭないし４ｍＭのｄｂ−ｃＡＭＰ、５ないし２０μＭのフォルスコリン及び０．５ないし５重量％のＢ２７を含むＮＢ培地であってもよい。さらに望ましくは、前記培地は、５０μＭないし１ｍＭのフザリン酸、５０μＭないし１ｍＭのｄｂ−ｃＡＭＰ、５ないし１５μＭのフォルスコリン及び０．５ないし３重量％のＢ２７を含むＮＢ培地であってもよい。一実施形態において、前記培地は、およそ１００μＭのフザリン酸、およそ１００μＭのｄｂ−ｃＡＭＰ、およそ１０μＭのフォルスコリン及びおよそ２重量％のＢ２７を含むＮＢ培地であってもよい。また、前記培地は、必要によって、ゲンタマイシンなどの抗生物質、またはＬ−グルタミンなどのアミノ酸を追加で含んでもよい。もちろん、前記抗生物質及びアミノ酸は、他の適切な物質で代替してもよい。

本発明の分化方法において、前記培養は、従来の方法で使用される培養条件下で行うことができる。例えば、前記培養は、３７℃で７ないし１４日、望ましくは、およそ７日間行われてもよい。低酸素分圧条件（すなわち、低酸素条件）下で培養することによって有意に高い分化効率を達成できることが本発明によって明らかになった。従って、本発明の分化方法において、前記培養は、２ないし１０％の酸素分圧を有する低酸素条件で行うことが望ましい。

本発明の分化方法によって得られたドーパミン性ニューロンは、通常の方法で回収することができる。例えば、Accutase（ＰＡＡ社）などの酵素を使用して細胞を分離した後、得られた細胞を１，０００ｒｐｍで、およそ５分間遠心分離して上澄み液を取り除くことにより、分化した細胞を回収することができる。

本発明はまた、ヒト神経前駆細胞のドーパミン性ニューロンへの分化用培地として、フザリン酸、ｄｂ−ｃＡＭＰ、フォルスコリン及びＢ２７を含むＮＢ培地である分化用培地を提供する。

前記分化用培地は、上述した通り、従来のドーパミン性ニューロン分化用培地にフザリン酸を加えて調製してもよい。

上述した通り、前記分化用培地は、望ましくは、５０μＭないし４ｍＭのフザリン酸、５０μＭないし４ｍＭのｄｂ−ｃＡＭＰ、５ないし２０μＭのフォルスコリン及び０．５ないし５重量％のＢ２７を含むＮＢ培地であってよく、さらに望ましくは、５０μＭないし１ｍＭのフザリン酸、５０μＭないし１ｍＭのｄｂ−ｃＡＭＰ、５ないし１５μＭのフォルスコリン及び０．５ないし３重量％のＢ２７を含むＮＢ培地であってもよい。最も望ましくは、前記培地は、およそ１００μＭのフザリン酸、およそ１００μＭのｄｂ−ｃＡＭＰ、およそ１０μＭのフォルスコリン及びおよそ２重量％のＢ２７を含むＮＢ培地であってもよい。また、前記培地は、必要によって、ゲンタマイシンなどの抗生物質、またはＬ−グルタミンなどのアミノ酸を追加で含んでもよい。もちろん、前記抗生物質及びアミノ酸は、他の適切な物質で代替してもよい。

以下、本発明について実施例によりさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、説明のためだけに提供されるものであり、よって本発明はそれらによって限定されるものではない。

１．材料及び試験方法
（１）ヒト神経前駆細胞（ｈＮＰＣｓ）の分離
母体の子宮筋無力症（uterine atonies）によって流産したおよそ１４週齢の胎児から、ヒト神経前駆細胞を分離した。前記胎児サンプルは、事前に胎児の親からインフォームド・コンセント（informed consent）を得た上で取得した。サンプルの収集及び研究目的のためのその使用は、チャ（ＣＨＡ）病院の倫理委員会から承認を受けた。

Storch et al．2001及びMilosevic et al．2006，2007などに開示された方法によって、ヒト神経前駆細胞を分離した。１４週齢の胎児の脳組織から中脳腹側部の組織（ventral midbrain tissue）を分離した後、０．１ｍｇ／ｍｌのパパイン及び１００μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅを含む溶液中で、３７℃でおよそ３０分間処理して、単一細胞に分散した懸濁液を得た。前記懸濁液を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、５０μｇ／ｍｌのアンチパイン中で、３７℃で３０分間インキュベーションした。１５μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−オルニチン及び４μｇ／ｍｌのフィブロネクチンでコーティングした培養皿に、得られたヒト神経前駆細胞（ｈＮＰＣｓ）を３０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の密度で単層になるよう播種して培養した。

（２）分化及び分離
ドーパミン性ニューロンへの分化は別段の記載がない限り、以下の方法で行った。ｈＮＰＣｓを、１５μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−オルニチン及び４μｇ／ｍｌのフィブロネクチンでコーティングした培養皿に、３０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の密度で播種し、２日または３日経過したところで、細胞を２％のＢ−２７ minus−ＡＯ supplement（ＧＩＢＣＯ社）、１０μＭのフォルスコリン、１ｍＭのｄｂ−ｃＡＭＰ及び１ｍＭのフザリン酸などの分化誘導剤を含むＮＢ培地中で、３７℃で７日間培養した。

分化した細胞、すなわち、ドーパミン性ニューロンは、次のようにして回収した：培養皿から培地を取り除き、細胞を緩衝液で洗浄した後、Accutase（ＰＡＡ社）で３０分間処理して、細胞を分離した。細胞を再び緩衝液で洗浄した後、１，０００ｒｐｍでおよそ５分間遠心分離した。上澄み液を取り除いて、分化したドーパミン性ニューロンを回収した。

（３）ＲＮＡ抽出、逆転写及び定量的リアルタイムＰＣＲ
全細胞ＲＮＡは、トリゾール及びクロロホルムを使用してｈＮＰＣｓから抽出した。５００ｎｇの全ＲＮＡから、RNA Superscript ＩＩＲＴａｓｅ、Oligo−ｄ（Ｔ）プライマー、ＤＴＴ及びｄＮＴＰｓを使用し、製造元のプロトコールに従ってｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲは、１μｌのｃＤＮＡ及び１μｌの１０ｐＭプライマーを含む最終容積２０μｌ中、ＳＹＢＲ−Green mixtureを使用して遂行した。内部コントロールとしてＲＰＬ２２を使用して、ＴＨ、ＤＡＴ、ＧＦＡＰ、Ｎｕｒｒ１、Ｔｕｊ１及びＬｍｘ１ａの発現を分析した。定量的リアルタイムＰＣＲは、LightCycler Systemを使用して遂行した。蛍光染色剤であるＳＹＢＲ Greenの二本鎖ＤＮＡとの結合量を測定することによって、増幅をモニタリングして分析した。標的ＤＮＡは、９５℃で１０秒、６０℃で１０秒、７２℃で２０秒の条件で、全４０サイクルを遂行して増幅した。最終伸長（extension）は、７２℃で１０分間行った。結果は、比較Ｃｔ法により、遺伝子ＲＰＬ２２に対して相対的に示した。前記ＰＣＲに使用したプライマーは、次の表１の通りである。

（４）免疫細胞化学（immunocytochemistry）
ｈＮＰＣｓをＰＢＳで３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで１０分間処理して固定した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、３％正常ヤギ血清、０．２％トリトンＸ−１００及び１％ＢＳＡを含むＰＢＳと室温で１時間反応させてブロッキングした。細胞を一次抗体、すなわち、抗ＴＨ（rabbit anti−ＴＨ、Pelfreez）、抗Ｔｕｊ１（mouse anti−Ｔｕｊ１ Millipore、ＣＡ、ＵＳＡ）、抗ネスチン（rabbit anti−nestin、ＣＯＶＡＮＣＥ、ＣＡ、ＵＳＡ）、抗GFAP (mouse anti-GFAP Millipore, CA, USA)、抗Ki67 (mouse anti-Ki67, Leica)、抗O4 (mouse anti-O4, Millipore)、抗Sox2 (rabbit anti-Sox2, Abcam)、抗VMAT2 (rabbit anti-VMAT2, Abcam)、抗Pitx3 (rabbit anti-Pitx3, Millipore)、抗DAT (rabbit anti-DAT, Santa Cruz)、抗Nurr1 (rabbit anti-Nurr1, Santa Cruz)、抗NeuN (mouse anti-NeuN, Millipore)、抗GIRK2 (rabbit anti-GIRK2, Alomone lab)、抗Cal28K (mouse anti-Cal28K, Sigma)、抗グルタミン酸 (rabbit anti-Glutamate, Sigma)、抗GABA (rabbit anti-GABA, Sigma)、抗ChAT (mouse anti-ChAT, Millipore)、及び抗５−ＨＴ（rabbit anti−５−ＨＴ、ImmunoStar）と共に、４℃で一晩中インキュベーションした後、ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、細胞を二次抗体、すなわち、抗マウス（Alexa Fluor^ＴＭ４８８）、抗マウス（Alexa Fluor^ＴＭ５９４）、抗ウサギ（Alexa Fluor^ＴＭ４８８）及び抗ウサギ（Alexa Fluor^ＴＭ５９４）と共に、室温で６０分間インキュベーションした後、ＤＡＰＩ（４’，６−diamidino−２−phenylindole）で染色（counterstaining）した。

（５）免疫ブロッティング（immunoblotting）
タンパク質は、プロテアーゼインヒビター（ＰＩ）（Roche Molecular Biochemicals）を含むＲＩＰＡ緩衝液［１０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、０．１％ＮＰ−４０］で抽出した。ＢＣＡ法（Pierce）により、タンパク質濃度を測定した。タンパク質を、ＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離した後、ＰＶＤＦ膜に転写した。前記膜を、５％スキムミルク（skim milk）を含むＴＢＳ−Ｔ緩衝液を用いて室温で２時間ブロッキングした後、一次抗体、すなわち、抗ＴＨ（rabbit anti−ＴＨ、Pelfreez、１：１０００）、抗Ｔｕｊ１（rabbit anti−Ｔｕｊ１ＣＯＶＡＮＣＥ、１：５０００）、抗ネスチン（rabbit anti−Nestin、Abcam、１：１０００）、抗Sox2 (rabbit anti-Sox2, Abcam, 1:1000)、抗Bcl2 (mouse anti-Bcl2, Santa Cruz, 1:200)、抗PCNA (mouse anti-PCNA, Santa Cruz, 1:1000)、抗VMAT2 (rabbit anti-VMAT2, Abcam, 1:1000)、抗Pitx3 (rabbit anti-Pitx3, Millipore, 1:2000)、抗DAT (rabbit anti-DAT, Santa Cruz, 1:200)、抗Nurr1 (rabbit anti-Nurr1, Santa Cruz, 1:250)、及び抗アクチン（rabbit anti−Actin、Santa Cruz、１：５０００）と共に、４℃で一晩中インキュベーションした。前記膜は、ＨＲＰ（horse radish peroxidase）が結合（conjugation）した抗マウス及び抗ウサギの二次抗体と共に、１時間室温でインキュベーションした後、化学発光ウェスタンブロット検出試薬（chemiluminescence western blot detection reagents）と反応させた。

２．結果及び考察
（１）分化条件（培地条件）の評価
Neurobasal培地［differentiation medium（ＤＭ） control］にインターロイキン１β、ｄｂ−ｃＡＭＰ及びフザリン酸（Ｆｕｓ）を多様な濃度及び組み合わせで加えて得られた培地中で、ｈＮＰＣｓをドーパミン性ニューロンに分化させた。ドーパミン性ニューロンのマーカーであるＴＨ、及び神経マーカーであるＴｕｊ１を、ＤＡＰＩ染色を介して測定した（図１）。図１の結果から、ｄｂ−ｃＡＭＰ及びフザリン酸を含む培地を使用した場合、ＴＨ及びＴｕｊ１の発現レベルが最も高い、すなわち、分化効率が最も高いことが分かる。また、ｄｂ−ｃＡＭＰ及びフザリン酸をそれぞれ１００μＭの濃度で使用した場合、最も高い分化効率が得られることが分かる。

ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１） Glutamax培地中でｈＮＰＣｓを増殖させた後、２％のＢ−２７ minus−ＡＯ supplement（ＧＩＢＣＯ社）、１０μＭのフォルスコリン及び１ｍＭのｄｂ−ｃＡＭＰを含み、かつフザリン酸１００μＭを含むまたは含まないNeurobasal（ＮＢ）培地中でニューロンに分化させた。分化誘導後、ＴＨ及びＴｕｊ１の発現レベルを測定した（図２）。免疫細胞化学分析及びＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を図３に示す。図２及び図３の結果から、フザリン酸を添加した場合、ドーパミン性ニューロンのマーカーであるＴＨが、著しく高く発現していることが分かる。また、フザリン酸を添加すると、神経マーカーであるＴｕｊ１の発現もまた増加した。

使用が制限される高価な分化誘導剤ＳＨＨ及びＦＧＦ８に対する代替可能性を評価するために、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）Glutamax培地中でｈＮＰＣｓを増殖させた。２％のＢ２７、２００ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ、２５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ８、１０μＭのフォルスコリン、１００μＭのフザリン酸及び１００μＭのｄｂ−ｃＡＭＰを使用して、Neurobasal（ＮＢ）培地（Invitrogen社）中で分化を誘導した後、ＴＨの発現レベルを測定した（図４）。図４の結果から、ＳＨＨ及びＦＧＦ８の代わりにフザリン酸で処理した場合に、細胞は最も効果的にドーパミン性ニューロンに分化することが分かる。また、ＳＨＨ及びＦＧＦ８に追加でフザリン酸を加えた場合にも、ドーパミン性ニューロンへの分化が増加した。

従って、前記図１ないし図４の結果から、フザリン酸を含む培地中でｈＮＰＣｓの分化を誘導することにより、ドーパミン性ニューロンへの有意に高い分化効率を達成することが可能であることが分かる。

（２）分化条件（培養条件）の評価
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）Glutamax培地中でｈＮＰＣｓを増殖させた後、２％のＢ２７、１０μＭのフォルスコリン、１００μＭのフザリン酸及び１００μＭのｄｂ−ｃＡＭＰを含むNeurobasal（ＮＢ）培地（Invitrogen社）中、低酸素条件（３％の酸素分圧）下または正常酸素条件（２１％の酸素分圧）下で分化させた。分化誘導後、ＴＨの発現レベルを測定した（図５）。図５の結果から、細胞は、低酸素条件において、正常酸素条件より効率的にドーパミン性ニューロンに分化することが分かる。

（３）フザリン酸の神経保護効果の分析
１−メチル−４−フェニルピリジウム（ＭＰＰ：１−methyl−４−phenylpyridium）は、ドーパミン性ニューロンに対して細胞毒性を示すことが知られている。従って、ＭＰＰ存在下における分化誘導により、分化過程でのフザリン酸の機能を評価した（図６）。

図６の結果から、フザリン酸を含む培地で分化を誘導した方が、ＭＰＰ処理下でも、ＴＨを発現する細胞が多く生存していることが分かる。また、神経マーカーであるＴｕｊ１も相対的に多く発現していた。これらの結果から、フザリン酸は神経保護活性を有し、その結果、ＴＨを発現する細胞の生存に影響を及ぼし、相対的により多くのドーパミン性ニューロンを生存させるということが示唆される。

（４）分化／増殖の評価
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）Glutamax培地中でｈＮＰＣｓを増殖させた後、２日に１回培地を替えつつ、３％の酸素分圧の条件下で連続的に継代培養した。初期継代（第７継代）、中間継代（第１１継代）、後期継代（第１７継代）で得られたｈＮＰＣｓを、２％のＢ２７、１０μＭのフォルスコリン、１００μＭのフザリン酸及び１００μＭのｄｂ−ｃＡＭＰを含むＮＢ培地（Invitrogen社）中、３％の酸素分圧の条件下で７日間培養して分化させた。

初期継代（第７継代）、中間継代（第１１継代）、後期継代（第１７継代）で得られたそれぞれの細胞（増殖細胞及び分化細胞）におけるＴＨ及びＴｕｊ１の発現レベルを測定した（図７）。免疫細胞化学法により、細胞でのＴＨ発現レベルを測定した（図８）。また、免疫細胞化学法により、ネスチン（神経幹細胞マーカー）、Ｋｉ６７（増殖性細胞マーカー）及びＴｕｊ１（神経マーカー）の発現レベルを測定した（図９）。本発明によって分化した細胞中のＴＨ陽性細胞数は、非分化誘導細胞（すなわち、増殖細胞）中のそれに比べて２０％以上増加した。分化効率は、継代回数の増加と共に、およそ３０％まで上昇した（図７のＡ参照）。また、分化後のＴｕｊ１陽性細胞数も、分化前のおよそ１０％から、４０ないし４５％まで増加し、これは、後期継代でも変わらなかった（図７のＢ参照）。前記結果は、ＴＨ陽性細胞に対する免疫細胞化学分析の結果とも一致しており、分化効率は、継代が後期になるにつれて上昇した（図８参照）。分化後のネスチン及びｋｉ６７の発現は減少したが、一方でＴｕｊ１発現は増加した（図９参照）。このような結果は、分化が進行するにつれて、増殖する細胞が幹細胞特性を徐々に失い、成熟したニューロンに分化することを示している。

また、初期継代（第７継代）のｈＮＰＣに対して行った蛍光活性化細胞選別分析（ＦＡＣＳanalysis）の結果、神経幹細胞の表面マーカー、すなわち、ＣＤ１５，１８４及び１３３は分化後、分化前より有意に減少した（図１０参照）。このような結果は、細胞が幹細胞の特性を失い、分化細胞に変化していることを示す。また、ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果、継代回数の増加と共に、ドーパミン性ニューロンのマーカーであるＴＨの発現は正常に維持されたが、神経マーカーであるＴｕｊ１の発現は増加し、神経幹細胞マーカーであるネスチン、ｓｏｘ２、musashi１の発現は減少した（図１１のＡ参照）。ウェスタンブロット分析の結果、継代回数の増加と共に、ＴＨの発現は正常に維持されたが、Ｔｕｊ１の発現は増加し、ネスチン、ｓｏｘ２の発現は減少した（図１１のＢ参照）。これは、ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果と同様であった。また、Ｂｃｌ２（抗アポトーシスマーカー）及びＰＣＮＡ（増殖マーカー）も減少した（図１１のＢ参照）。

従って、前記図７ないし図１１の結果から、後期継代まで細胞を培養した後、前記分化培地で分化させた場合、初期継代の細胞と同様の分化効率で分化が誘導されることが分かる。

（５）分化したドーパミン性ニューロンの特性分析
ｈＮＰＣｓを、２％のＢ２７、１０μＭのフォルスコリン、１００μＭのフザリン酸及び１００μＭのｄｂ−ｃＡＭＰを含むＮＢ培地（Invitrogen社）中、３％の酸素分圧の条件で１４日間培養して分化させた。

得られた細胞におけるＴＨの発現及び成熟したドーパミン性ニューロンのマーカー（ＮｅｕＮ、ＶＭＡＴ２、Ｎｕｒｒ１及びＰｉｔｘ３）の発現を、免疫細胞化学法で測定した（図１２のＡ）。ＴＨ発現細胞のタイプ（Ａ９タイプまたはＡ１０タイプ）を確認するために、Ｇｉｒｋ２及びｃａｌ２８Ｋの発現を、免疫細胞化学法で測定した（図１２のＢ）。Ｇｉｒｋ２及びＴＨが同時に発現している場合、細胞はＡ９タイプと見なされる。ｃａｌ２８Ｋ及びＴＨが同時に発現している場合、細胞はＡ１０タイプと見なされる。図１２の結果から、本発明の分化方法によって得られたドーパミン性ニューロンは、Ａ９タイプの成熟したドーパミン性ニューロンであることが分かる。

また、ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果、ＴＨと共に、ＶＭＡＴ２、Ｐｉｔｘ３、ＤＡＴ、Ｎｕｒｒ１などの成熟ドーパミン性ニューロンのマーカーは分化後（＋）、分化前（−）より著しく増加した（図１３のＡ）。ウェスタンブロット分析において、ＴＨと共に、ＶＭＡＴ２、Ｐｉｔｘ３、ＤＡＴ、Ｎｕｒｒ１などの成熟ドーパミン性ニューロンのマーカーは分化後（＋）、分化前（−）より著しく増加した（図１３のＢ）。このような結果は、免疫細胞化学分析の結果とも一致した（図１３のＣ）。成熟ドーパミン性ニューロンのマーカーは、分化誘導後７日から１４日の間に顕著に増加することを免疫細胞化学法により確認した。

また、他のサブタイプ（subtype）のニューロンへの分化を確認するために、グルタミン酸、ＧＡＢＡ、ＣｈＡＴ及びセロトニンの発現を、免疫細胞化学法で測定した（図１４）。図１４の結果から、他のサブタイプのニューロンは、ドーパミン性ニューロンより発現が有意に少ないことが分かる。

Claims

フザリン酸を含む培地中でヒト神経前駆細胞を培養することを含むヒト神経前駆細胞のドーパミン性ニューロンへの分化方法。
前記培地が、ジブチリル環状アデノシンモノホスフェート（ｄｂ−ｃＡＭＰ）、フォルスコリン、Ｂ２７、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）及び線維芽細胞増殖因子−８（ＦＧＦ８）を含むドーパミン性ニューロン分化用培地に、フザリン酸を加えて調製されることを特徴とする請求項１に記載の分化方法。
前記培地が、フザリン酸、ｄｂ−ｃＡＭＰ、フォルスコリン及びＢ２７を含むＮＢ培地であることを特徴とする請求項１に記載の分化方法。
前記培地が、５０μＭないし４ｍＭのフザリン酸、５０μＭないし４ｍＭのｄｂ−ｃＡＭＰ、５ないし２０μＭのフォルスコリン及び０．５ないし５重量％のＢ２７を含むＮＢ培地であることを特徴とする請求項３に記載の分化方法。
前記培地が、１００μＭのフザリン酸、１００μＭのｄｂ−ｃＡＭＰ、１０μＭのフォルスコリン及び２重量％のＢ２７を含むＮＢ培地であることを特徴とする請求項３に記載の分化方法。
前記培養が２ないし１０％の酸素分圧を有する低酸素条件で行われることを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１項に記載の分化方法。
フザリン酸、ｄｂ−ｃＡＭＰ、フォルスコリン及びＢ２７を含むＮＢ培地である、ヒト神経前駆細胞のドーパミン性ニューロンへの分化用培地。
５０μＭないし４ｍＭのフザリン酸、５０μＭないし４ｍＭのｄｂ−ｃＡＭＰ、５ないし２０μＭのフォルスコリン及び０．５ないし５重量％のＢ２７を含むＮＢ培地であることを特徴とする請求項７に記載の分化用培地。
１００μＭのフザリン酸、１００μＭのｄｂ−ｃＡＭＰ、１０μＭのフォルスコリン及び２重量％のＢ２７を含むＮＢ培地であることを特徴とする請求項８に記載の分化用培地。