KR20160086933A - 인간 다능성 줄기 세포로부터 기능적 두개 기원판 유도체의 전문화 - Google Patents

Abstract

두개 기원판은 감각 및 내분비 기관 발달을 위해 필수적인 배아 구조이다. 신경 유도의 이중-SMAD 저해 전략 성분인 BMP 저해제 Noggin의 적시 제거가 CNS 운명 대신 기원판 유도를 유발하는 인간 다능성 줄기 세포로부터의 두개 기원판의 효율적 유도가 개시된다. 전-기원판 단계에서의 추가 운명 전문화는 생체내 이식이 가능한 기원판-유도된 삼차신경 신경절, 성숙 수정체 섬유 및 이식 시 비제한적으로 생체내 인간 성장 호르몬 및 부신피질 자극호르몬을 포함하는 호르몬을 생성하는 전방 뇌하수체 호르몬-생산 세포의 선택적 생성을 가능케 한다. 대안적으로, 전방 뇌하수체 호르몬-생산 세포가 시험관내 세포 배양 시스템에서 생성된다.

Description

인간 다능성 줄기 세포로부터 기능적 두개 기원판 유도체의 전문화{SPECIFICATION OF FUNCTIONAL CRANIAL PLACODE DERIVATIVES FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS}

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2013년 11월 21일에 출원된 미국 가출원 번호 61/907,302에 대한 우선권을 청구하며, 그 내용은 그 전문이 본원에 참조로 도입된다.

발명 분야

본 발명은 일반적으로 줄기 세포의 세포 생물학 분야, 보다 구체적으로 인간 배아 줄기 세포(hESC), 신체 줄기 세포, 및 신규한 배양 조건을 이용해서 유도된 인간 다능성 줄기 세포(hiPSC)를 포함하는 다능성 또는 다능 줄기 세포의 유도된 분화에 관한 것이다. 특히, 두개 기원판은 전-기원판 단계에서 추가 운명 전문화와 커플링된 신경 유도의 이중-SMAD 저해 전략에 의해 인간 다능성 줄기 세포로부터 유도된다. 본 방법은 기원판-유도된 삼차신경 신경절, 성숙 수정체 섬유 및 전방 뇌하수체 호르몬-생산 세포를 생성한다. 이들 세포의 적용에는 비제한적으로 감각 및 내분비 질병에서의 인간 세포-기반 치료법이 포함된다.

배아 및 신체 줄기 세포의 분화능은 유전적, 악성 및 변성 질병에 있어서 세포 대체 치료법에 대한 가능성을 열어 두었다. 신경변성 장애, 병태, 및 질병, 그리고 세포 기반 치료법에 의한 이들의 치료는 증상의 예방, 감소 또는 제거의 유망한 수단을 나타낸다. 이러한 장애에는 헌팅턴 질병, 알츠하이머, 파킨슨 및 근위축성 측삭 경화증이 포함된다. 이들은 또한 (i) 질병 치료를 위해 유용할 수 있거나, (ii) 신경 조직의 세포 운명을 결정하기 위해, 중추적인 소분자에 대한 스크리닝용 세포원을 제공한다. 또한, 이들 세포는 정상적 또는 병리적 계통에 관련된 중요 유전자, mRNA 전사체 및 단백질을 특성규명하기 위해 연구되었다.

신경 발달은 신경 전구체 정체성을 지시하는 복잡한 신호 세트에 의해 시간 및 공간적으로 지정된다. 동물 모델에서는 상당한 진보가 있었으나, 인간 신경 발달에 대해서는 훨씬 적게 이해되고 있다.

이전 연구에서는 전방/후방(A/P) 및 등/배(D/V) CNS 정체성을 정의하는 패턴화 인자에 반응하여 마우스(Wichterle, et al., 2002; Barberi, et al., 2003; Watanabe, et al., 2005) 및 인간(Perrier, et al., 2004; Li, et al., 2008; Eiraku, et al., 2008) ESC의 특정 뉴론 유형으로의 유도된 분화를 보고하였다. 이들 연구는 주요 CNS 지역을 특정하는 신호전달 시스템의 진화적 보존을 나타낸다. 포유류에서, 소닉 헤지호그(sonic hedgehog, SHH)는 일차 신경 체외이식편(Briscoe and Ericson, 1999) 및 마우스 ES 세포(Mizuseki, et al., 2003)에서 바닥판(FP) 발현 세포를 포함하는 다양한 배 뉴론 유형을 특정하기 위해 용량 의존적 방식으로 작용하는 배 형성 인자이다. hESC-유도된 신경 세포에 대한 SHH의 적용은 다양한 배 신경 유형을 유도하는 것으로 나타났으나, 바닥판(FP) 조직 자체의 유도는 보고되지 않았다. FP는 분화 경로 및 후속 수임 세포 계통을 유도하기 위한 하나의 신호전달 중심이므로, 인간 ES 세포로부터 FP를 생성하는 능력이 초기 인간 신경 발달의 후속 연구를 향한 주요 단계일 것이다. 또한, 조직의 접근 가능성 부재로 인해 인간에서 FP 발달에 대해서는 거의 알려져 있지 않다.

동물에서, FP는 주요한 SHH 생성 부위이며, 어떤 형태의 완전전뇌증 및 소안구증, 다양한 구순열판 증후군을 포함하는 골격 장애, 및 골린 증후군을 포함하는 종양 병태; SHH 수용체 Patched 1에서의 돌연변이에 의해 유도된 희귀한 유전 장애를 포함하는 몇몇 인간 발달 장애는 중간선 SHH 신호전달에서의 변형에 관련된다(Mullor, et al., 2002). 그러나 중간선 SHH 신호전달에서의 유사한 변형이 인간에서 이들 질병을 유도할 것인지는 알려져 있지 않다.

따라서 인간 바닥판 세포원을 제공하기 위해 인간 배아 줄기 세포(hESCs)로부터 인간 바닥판 조직을 유도하는데 있어서 중추적인 필요성이 존재한다. 이들 인간 바닥판 세포는 인간에서의 발달성 질병의 원인 및 치료를 결정하기 위한 의학적 연구에서의 사용을 위해, 그리고 인간 신경 패턴화 및 액손 향도(pathfinding)의 대조 발달 연구를 위해 필요하다.

발명의 요약

본 발명은 일반적으로 줄기 세포의 세포 생물학 분야, 보다 구체적으로 인간 배아 줄기 세포(hESC), 신체 줄기 세포, 및 신규한 배양 조건을 이용해서 유도된 인간 다능성 줄기 세포(hiPSC)를 포함하는 다능성 또는 다능 줄기 세포의 유도된 분화에 관한 것이다. 특히, 두개 기원판은 전-기원판 단계에서 추가 운명 전문화와 커플링된 신경 유도의 이중-SMAD 저해 전략에 의해 인간 다능성 줄기 세포로부터 유도된다. 본 방법은 기원판-유도된 삼차신경 신경절, 성숙 수정체 섬유 및 전방 뇌하수체 호르몬-생산 세포를 생성한다. 이들 세포의 적용에는 비제한적으로 감각 및 내분비 질병에서의 인간 세포-기반 치료법이 포함된다.

한 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 방법을 고려한다: a) N2 세포 배양 배지 중에 복수의 두개 기원판 전구체 세포를 제공하거나 평판접종하는 단계; b) 상기 복수의 기원판 전구체 세포를 뇌-유래 신경영양 인자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계(여기서 복수의 삼차신경 기원판 세포가 생성됨). 한 구현예에서, 본 방법은 삼차신경 뉴론이 생성되도록 하는 조건 하에 삼차신경 기원판 세포를 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 두개 기원판 전구체 세포는 SIX1, PAX6 및 TFAP2A를 발현한다. 한 구현예에서, 삼차신경 기원판 세포는 SIX1 및 PAX3을 발현한다. 한 구현예에서, 삼차신경 기원판 전구체 세포는 감각 뉴론 감염제를 저해하는 약리제를 확인하기 위해 이용될 수 있다. 한 구현예에서, 감각 뉴론 감염제는 바리셀라 조스터 바이러스(예로, 그 감염이 수두를 일으킴)를 포함한다. 한 구현예에서, 감염된 감각 뉴론은 삼차신경 뉴론이다.

한 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 방법을 고려한다: a) 세포 배양 배지 중에 복수의 두개 기원판 전구체 세포를 제공하거나 평판접종하는 단계; 및 b) 상기 복수의 기원판 전구체 세포를 소닉 헤지호그, 푸르모르파민 및 γ-시크리타제 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계(여기서 복수의 뇌하수체 기원판 세포가 생성됨). 한 구현예에서, 본 방법은 비제한적으로 생식샘 자극세포, 코르티코트로피성 세포 및 성장 자극세포를 포함하는, 호르몬을 분비할 수 있는 복수의 뇌하수체 세포가 생성되도록 하는 조건 하에 상기 뇌하수체 기원판 세포를 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 분비되는 호르몬에는 비제한적으로 스테로이드 호르몬, 부신피질 자극호르몬 및/또는 성장 호르몬이 포함된다. 한 구현예에서, 두개 기원판 전구체 세포는 SIX1, PAX6 및 TFAP2A를 발현한다. 한 구현예에서, 뇌하수체 기원판 세포는 SIX1 및 PITX1을 발현한다.

한 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 방법을 고려한다: a) 세포 배양 배지 중에 복수의 두개 기원판 전구체 세포를 제공하거나 평판접종하는 단계; 및 b) 상기 복수의 기원판 전구체 세포를 소닉 헤지호그, 푸르모르파민, γ-시크리타제 저해제 및 FGF-저해제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계(여기서 복수의 수정체 기원판 세포가 생성됨). 한 구현예에서, 본 방법은 수정체 섬유가 생성되도록 하는 조건 하에 수정체 기원판 세포를 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 두개 기원판 전구체 세포는 SIX1, PAX6 및 TFAP2A를 발현한다. 한 구현예에서, 수정체 기원판 세포는 SIX1 및 PITX3을 발현한다.

한 구현예에서, 본 발명은 통증 증후군의 적어도 하나의 증상을 발현하는 대상체로 삼차신경 기원판 세포를 그라프팅하는 단계를 포함하는 방법을 고려하며, 여기서 상기 통증 증후군의 적어도 하나의 증상이 감소된다. 한 구현예에서, 통증 증후군에는 비제한적으로 삼차신경 신경 마비, 삼차신경 신경통 및/또는 편두통 통증이 포함된다. 한 구현예에서, 그라프팅은 교뇌 상에서 수행된다. 한 구현예에서, 삼차신경 기원판 세포는 삼차신경 핵으로 이동한다.

한 구현예에서, 본 발명은 신경내분비 장애의 적어도 하나의 증상을 발현하는 대상체로 뇌하수체 기원판 세포를 그라프팅하는 단계를 포함하는 방법을 고려하며, 여기서 상기 신경내분비 장애의 적어도 하나의 증상은 감소된다. 한 구현예에서, 그라프팅된 뇌하수체 기원판 세포는 성장 호르몬을 분비한다. 한 구현예에서, 그라프팅된 뇌하수체 기원판 세포는 부신피질 자극호르몬을 분비한다. 한 구현예에서, 그라프트화는 다리 근육 상에 있다. 한 구현예에서, 그라프트화는 시상하부-뇌하수체 축 상에 있다. 한 구현예에서, 그라프트화는 시상하부 상에 있다. 한 구현예에서, 그라프트화는 안장 상에 있다. 한 구현예에서, 신경내분비 장애는 당뇨병을 포함한다. 한 구현예에서, 신경내분비 장애는 뇌하수체저하증을 포함한다. 한 구현예에서, 신경내분비 장애는 뇌하수체 종양을 포함한다. 한 구현예에서, 신경내분비 장애는 방사선 치료법을 포함한다.

한 구현예에서, 본 발명은 눈 장애의 적어도 하나의 증상을 발현하는 대상체로 수정체 기원판 세포를 그라프팅하는 단계를 포함하는 방법을 고려하며, 여기서 상기 눈 장애의 적어도 하나의 증상은 감소된다. 한 구현예에서, 눈 장애의 적어도 하나의 증상은 실명을 포함한다. 한 구현예에서, 눈 장애의 적어도 하나의 증상은 황반 변성을 포함한다. 한 구현예에서, 눈 장애의 적어도 하나의 증상은 백내장을 포함한다. 한 구현예에서, 눈 장애의 적어도 하나의 증상은 난시를 포함한다. 한 구현예에서, 눈 장애의 적어도 하나의 증상은 근시를 포함한다. 한 구현예에서, 눈 장애의 적어도 하나의 증상은 원시를 포함한다. 한 구현예에서, 그라프팅된 수정체 기원판 세포는 복수의 수정체 섬유 단백질을 분비한다. 한 구현예에서, 복수의 수정체 섬유 단백질은 αβ-결정형 수정체 섬유 단백질을 포함한다. 한 구현예에서, 복수의 수정체 섬유 단백질은 층화된다.

한 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 방법을 고려한다: a) 배양 배지 중 인간 다능성 줄기 세포를 포함하는 세포 배양을 제공하거나 평판접종하는 단계; b) 상기 세포 배양을 Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD) 단백질 신호전달의 제1 저해제 및 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드(SB431542)와 접촉시키는 단계; c) 두개 기원판 전구체 세포가 형성되도록 하는 조건 하에 상기 제1 SMAD 저해제를 제거하는 단계. 한 구현예에서, 제1 SMAD 저해제는 Noggin, Noggin의 디설파이드-연결된 단독이량체, 도르소몰핀, LDN-193189, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는다. 한 구현예에서, 두개 기원판 전구체 세포는 SIX1, PAX6 및 TFAP2A를 발현한다. 한 구현예에서, 배양 배지는 N2 배지를 포함한다. 한 구현예에서, 배양 배지는 녹아웃 혈청 대체 배지를 포함한다. 한 구현예에서, 제거는 적어도 접촉 48 시간 후 수행된다.

본 발명은 (i) 줄기 세포(hESCs, hiPSCs, 신체 줄기 세포, 암 줄기 세포, 인간 또는 포유류 다능성 또는 다능 세포)를 수득하는 단계; 및 (ii) SMAD 신호전달을 차단하는 조건 하에 인간 줄기 세포를 배양하는 단계에 의한 인간 신경 세포(신경 줄기 세포, 뉴론 하위유형, 성숙 뉴론, 신경 계통 세포)의 생성 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 배양 방법에는 영양세포-비함유 시스템에서의 조건이 포함된다. 바람직한 구현예에서, 줄기 세포는 단층으로 배양된다. 바람직한 구현예는 화합물 Noggin 및/또는 도르소몰핀 및 SB431542로 보충되는 배지의 사용을 고려하였다.

한 구현예에서, 본 발명은 Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD) 단백질 신호전달의 제1 저해제 및 Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD) 단백질 신호전달의 제2 저해제를 포함하는 키트를 제공한다. 한 구현예에서, 상기 제1 저해제는 Noggin(서열번호 50)의 디설파이드-연결된 단독이량체, 도르소몰핀, LDN-193189, 이들의 조합 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는다. 한 구현예에서, 상기 Noggin은 마우스, 인간, 래트, 및 제노푸스개구리로부터 선택된다. 한 구현예에서, 상기 Noggin은 (서열번호 50)이다. 한 구현예에서, 상기 제2 저해제는 역형성 림프종 키나아제 신호전달 경로를 저해한다. 한 구현예에서, 상기 제2 저해제는 Lefty, Activin, 및 TGF베타로 이루어진 군으로부터 선택되는 신호전달 경로를 저해한다. 한 구현예에서, 상기 제2 저해제는 activins 및 nodal 신호전달을 모두 저해한다. 한 구현예에서, 상기 제2 저해제는 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드(SB431542) 및 이들의 유도체이다. 한 구현예에서, 상기 키트는 인간 줄기 세포를 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 키트는 지침을 추가로 포함한다.

한 구현예에서 본 발명은 줄기 세포, Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD) 단백질 신호전달의 제1 저해제 및 Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD) 단백질 신호전달의 제2 저해제를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 구현예에서, 상기 제1 저해제는 Noggin의 디설파이드-연결된 단독이량체, 도르소몰핀, LDN-193189, 이들의 조합 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는다. 한 구현예에서, 상기 Noggin은 마우스, 인간, 래트, 및 제노푸스개구리로부터 선택된다. 한 구현예에서, 상기 Noggin은 (서열번호 50)이다. 한 구현예에서, 상기 제2 저해제는 ALK4, ALK5 및 ALK7 수용체의 인산화를 차단함으로써 Lefty/Activin/TGF베타 경로를 저해한다. 한 구현예에서, 상기 제2 저해제는 activin/nodal 신호전달을 저해한다. 한 구현예에서, 상기 제2 저해제는 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드(SB431542) 및 이들의 유도체이다. 한 구현예에서, 상기 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포(hESC), 신체 줄기 세포, 및 유도된 인간 다능성 줄기 세포(hiPSC)로 이루어진 군으로부터 선택되는다.

한 구현예에서 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 줄기 세포에서 분화의 유도 방법을 제공한다: a) i) 인간 줄기 세포를 포함하는 세포 배양, ii) Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD) 단백질 신호전달의 제1 저해제, iii) Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD) 단백질 신호전달의 제2 저해제를 제공하는 단계, 및 b) 줄기 세포에서 디폴트가 아닌 분화된 세포로의 분화를 유도하기 위한 조건 하에 상기 줄기 세포를 상기 Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD) 단백질 신호전달의 제1 저해제 및 상기 시험 화합물과 접촉시키는 단계. 한 구현예에서, 상기 제1 저해제는 Noggin의 디설파이드-연결된 단독이량체, 도르소몰핀, LDN-193189, 이들의 조합 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는다. 한 구현예에서, 상기 Noggin은 마우스, 인간, 래트, 및 제노푸스개구리로부터 선택된다. 한 구현예에서, 상기 Noggin은 (서열번호 50)이다. 한 구현예에서, 상기 제2 저해제는 ALK4 수용체 저해제이다. 한 구현예에서, 상기 제2 저해제는 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드(SB431542) 및 이들의 유도체이다. 한 구현예에서, 상기 디폴트가 아닌 분화된 세포는 신경 선조 세포이다. 한 구현예에서, 상기 디폴트가 아닌 분화된 세포는 배양된 세포 모집단의 일부이다. 한 구현예에서, 상기 디폴트가 아닌 분화된 세포는 배양된 세포의 상기 모집단의 적어도 10% 내지 최대 100%이다. 한 구현예에서, 배양된 세포 모집단 내의 상기 디폴트가 아닌 분화된 세포는 paired box gene 6 단백질을 발현한다. 한 구현예에서, 상기 paired box gene 6 단백질은 배양된 세포의 상기 모집단의 적어도 10%에서 발현된다. 한 구현예에서, 상기 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포(hESC), 인간 신체 줄기 세포, 및 유도된 인간 다능성 줄기 세포(hiPSC)로 이루어진 군으로부터 선택되는다. 한 구현예에서, 상기 디폴트가 아닌 분화된 세포는 신경 세포이다. 한 구현예에서, 상기 신경 세포는 도파민 양성 뉴론 및 바닥판 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는다.

한 구현예에서 본 발명은 단리된 인간 배아 신경 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 구현예에서, 상기 단리된 인간 배아 신경 세포는 인간 배아 세포로부터 유도되었다. 한 구현예에서, 상기 인간 배아 신경 세포는 시험관내 배양된다. 한 구현예에서, 상기 인간 배아 신경 세포는 부착된 세포이다. 한 구현예에서, 상기 조성물은 제2 세포 유형을 추가로 포함하는 공동-배양물이다.

한 구현예에서 본 발명은 하기 단계를 포함하는 생물학적 제제의 스크리닝 방법을 제공한다: a) i) 인간 배아 줄기 세포(hESCs)를 포함하는 세포 배양, 및 ii) 시험 화합물을 제공하는 단계, 및 b) 신경 바닥판 세포를 유도하기 위한 조건 하에 상기 줄기 세포를 상기 시험 화합물과 접촉시키는 단계. 한 구현예에서, 상기 시험 화합물은 소닉 헤지호그 또는 이들의 단편이다. 한 구현예에서, 상기 인간 배아 줄기 세포는 로제트-단계 신경 세포이다.

한 구현예에서 본 발명은 하기 단계를 포함하는 분화된 세포의 제공 방법을 제공한다: a) i) 인간 배아 줄기 세포(hESCs)의 세포 배양, 및 ii) 분화를 유도하기 위한 화합물을 제공하는 단계, 및 b) 신경 바닥판 세포를 유도하기 위한 조건 하에 상기 줄기 세포를 상기 시험 화합물과 접촉시키는 단계. 한 구현예에서, 상기 화합물은 소닉 헤지호그 단백질 또는 이들의 단편이다. 한 구현예에서, 상기 유도는 상기 시험 화합물 없이 배양된 상기 인간 배아 줄기 세포에서 발현되는 상기 특징에 비해 편평한 세포 형태, 소닉 헤지호그 발현, forkhead box 단백질 A2(FOXA2) 발현, Netrin-1 발현 및 F-Spondin 발현으로 이루어진 군으로부터 선택되는 특징의 증가로 구성된다. 한 구현예에서, 상기 유도는 상기 시험 화합물 없이 배양된 상기 인간 배아 줄기 세포에서의 상기 특징에 비해 로제트 구조, BF1 발현, paired box homeotic gene-6(PAX6) 발현, NK6 homeobox 1(NKX6.1), 호메오박스 단백질 SIX6 발현으로 이루어진 군으로부터 선택되는 특징의 감소로 구성된다. 한 구현예에서, 본 방법은 activin 수용체-유사 키나아제 4(ALK4), activin 수용체-유사 키나아제 5(ALK5) 및 activin 수용체-유사 키나아제 7(ALK7) 수용체로 이루어진 군으로부터 선택되는 수용체의 인산화를 차단하기 위한 제제 및 Noggin 단백질을 추가로 제공하고 포함하며, 상기 화합물 첨가 전에 인간 줄기 세포로 상기 noggin 및 상기 제제를 상기 인간 줄기 세포와 접촉시키는 단계를 추가로 제공하고 포함한다. 한 구현예에서, 본 방법은 항체를 추가로 제공하며, 여기서 상기 항체는 dickkopf homolog 1(DKK-1) 항체이고, DKK-1 단백질 기능을 감소시키기 위해 상기 줄기 세포를 상기 항체와 접촉시키는 단계를 추가로 제공한다. 한 구현예에서, 본 방법은 wingless-type MMTV 통합 부위 패밀리 구성원 1(Wnt-1), 및 레티노산(RA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 꼬리화 인자를 추가로 제공하고 포함한다. 한 구현예에서, 본 방법은 뉴론 유도 화합물 및 선조 뉴론을 유도하기 위해 상기 뉴론 유도 화합물을 첨가하는 단계 c)를 추가로 제공하고 포함한다. 한 구현예에서, 상기 도파민 뉴론은 corin, 세린 펩티다제(CORIN) 및 신장모세포종 과발현 유전자(NOV)로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커를 발현한다. 한 구현예에서, 상기 선조 뉴론은 LIM 호메오박스 전사 인자 1 베타(LMX1B) 및 neurogenin 2(NGN2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커를 발현한다. 한 구현예에서, 본 방법은 줄기 세포, 및 상기 줄기 세포로부터 신경돌기 증식을 일으키기 위해 상기 인간 신경 바닥판 세포를 상기 줄기 세포와 공동-배양하는 단계 d)를 추가로 제공하고 포함한다.

한 구현예에서 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 생성되는 신경 바닥판 세포를 제공한다. 한 구현예에서 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 생성되는 기원판 세포를 제공한다. 한 구현예에서 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 제조되는 수정체 세포를 제공한다.

본 발명은 유도된 신경 세포의 신경 정체성 평가 방법을 고려한다. 상기 방법은 형태적 수단, 기능적 평가, 및 특정 계통과 연관된 단백질의 발현 또는 하향조절의 측정을 통해서일 수 있다. 바람직한 방법에서, 도파민성 활성 또는 운동 뉴론에 대한 기능적 분석이 이용된다.

본 방법은 질병, 장애의 진단, 예방, 치료를 위해 또는 뇌졸중으로부터의 신경 손상을 겪는 환자를 위해 유효량으로 뇌에 제제 또는 신경 세포를 전달하기 위해 채용될 수 있다. 이러한 세포는 신경 운명으로 공동-수임되었다.

한 구현예에서, 본 발명은 단리된 인간 배아 바닥판 세포를 포함하는 조성물을 고려한다. 한 구현예에서, 단리된 인간 배아 바닥판 세포는 인간 배아 세포로부터 유도되었다. 한 구현예에서, 인간 배아 바닥판 세포는 시험관내 배양된다. 한 구현예에서, 인간 배아 바닥판 세포는 부착된 세포이다. 한 구현예에서, 조성물은 제2 세포 유형을 추가로 포함하는 공동-배양물이다.

한 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 생물학적 제제의 스크리닝 방법을 고려한다: a) i) 인간 배아 줄기 세포(hESCs)를 포함하는 세포 배양, 및 ii) 시험 화합물을 제공하는 단계, 및 b) 신경 바닥판 세포를 유도하기 위한 조건 하에 상기 줄기 세포를 상기 시험 화합물과 접촉시키는 단계. 한 구현예에서, 시험 화합물은 소닉 헤지호그 또는 이들의 단편이다. 한 구현예에서, 인간 배아 줄기 세포는 로제트-단계 신경 세포이다.

한 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 분화된 세포의 제공 방법을 고려한다: a) i) 인간 배아 줄기 세포(hESCs)의 세포를 배양하는 단계, 및 ii) 분화를 유도하기 위한 화합물을 제공하는 단계, 및 b) 신경 바닥판 세포를 유도하기 위한 조건 하에 상기 줄기 세포를 상기 시험 화합물과 접촉시키는 단계. 한 구현예에서, 화합물은 소닉 헤지호그 단백질 또는 이들의 단편이다. 한 구현예에서, 유도 단계는 상기 시험 화합물 없이 배양된 상기 인간 배아 줄기 세포에서 발현되는 상기 특징에 비해 편평한 세포 형태, 소닉 헤지호그 발현, forkhead box 단백질 A2(FOXA2) 발현, Netrin-1 발현 및 F-Spondin 발현으로 이루어진 군으로부터 선택되는 특징의 증가로 구성된다. 한 구현예에서, 상기 유도는 상기 시험 화합물 없이 배양된 상기 인간 배아 줄기 세포에서의 상기 특징에 비해 로제트 구조, BF1 발현, paired box homeotic gene-6(PAX6) 발현, NK6 homeobox 1(NKX6.1), 호메오박스 단백질 SIX6 발현으로 이루어진 군으로부터 선택되는 특징의 감소로 구성된다. 한 구현예에서, 본 방법은 activin 수용체-유사 키나아제 4(ALK4), activin 수용체-유사 키나아제 5(ALK5) 및 activin 수용체-유사 키나아제 7(ALK7) 수용체로 이루어진 군으로부터 선택되는 수용체의 인산화를 차단하기 위한 제제 및 Noggin 단백질을 추가로 제공하며, 상기 화합물 첨가 전에 인간 줄기 세포로 상기 noggin 및 상기 제제를 상기 인간 줄기 세포와 접촉시키는 단계를 추가로 제공한다. 한 구현예에서, 본 방법은 항체를 추가로 제공하며, 여기서 상기 항체는 dickkopf homolog 1(DKK-1) 항체이고, DKK-1 단백질 기능을 감소시키기 위해 상기 줄기 세포를 상기 항체와 접촉시키는 단계를 추가로 제공한다. 한 구현예에서, 본 방법은 wingless-유형 MMTV 통합 부위 패밀리 구성원 1(Wnt-1), 및 레티노산(RA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 꼬리화 인자를 추가로 제공한다. 한 구현예에서, 뉴론 유도 화합물 및 선조 뉴론을 유도하기 위해 상기 뉴론 유도 화합물을 첨가하는 단계 c)를 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 도파민 뉴론은 corin, 세린 펩티다제(CORIN) 및 신장모세포종 과발현 유전자(NOV)로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커를 발현한다. 한 구현예에서, 선조 뉴론은 LIM 호메오박스 전사 인자 1 베타(LMX1B) 및 neurogenin 2(NGN2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커를 발현한다. 한 구현예에서, 본 방법은 줄기 세포, 및 상기 줄기 세포로부터 신경돌기 증식을 일으키기 위해 상기 인간 신경 바닥판 세포를 상기 줄기 세포와 공동-배양하는 단계 d)를 제공하는 단계를 추가로 포함한다.

도 1은 7 일 내에 부착성 배양에서 고도로 효율적인 영양세포-비함유 신경 유도를 허용한 예시적인 이중 SMAD 저해를 나타낸다. (a) 신경 유도를 달성하기 위해 이용된 분화 방식은 SB431542, ALK 저해제, 및 Noggin, BMP 저해제의 조합으로 달성되었다. (b) 이중 SMAD 저해는 신경 분화(PAX6 발현, 녹색)를 80% 초과로 크게 개선한다. 단일 인자가 이용되는 경우, 빈번하지 않은 신경 분화(< 10% PAX6⁺ 세포)가 관찰되었다. (c) 초기 배엽층 마커 CDX2, SOX1, SOX17 및 Brachyury에 대한 실시간 PCR. (d) OCT4(빨간색) 및 PAX6(녹색) 발현에 대한 면역형광은 7 일까지는 신속한 중화가 일어남을 시사한다. (e) 이중 SMAD 저해 동안 PAX6, OTX2, FGF5, OCT4에 대한 실시간 PCR은 5 일째에 배반엽상층 줄기 세포 중간체를 드러낸다. (f) 신경외배엽을 향한 이중 SMAD 저해 분화 동안 신경 및 뉴론 마커에 대한 실시간 PCR. (g) BAC 리포터 라인(HES5-GFP)을 이용해서 MS5 간질 세포(Noggin) 또는 이중 SMAD 저해(SB431542 및 Noggin)를 이용한 방법에 대한 신경 유도 백분율을 정량하였다. 오차 막대는 S.E.M.을 나타내며, p-값은 Student T-테스트를 이용해서 결정되었다. 약어: N, Noggin; SB, SB431542; KSR, 녹아웃 혈청 대체 배지; N2, N2 배지. 축적 막대: (b) - 200 ㎛; (d) - 50 ㎛.
도 2는 hESC 세포가 24 시간 동안 Noggin 및 SB43152로 처리되는 경우 감소되는 SMAD4의 예시적인 핵 국소화를 나타낸다. 일정 비율의 SMAD4는 핵 주위 국소화로 재분포되어 덜 한정된 세포질-대-핵 경계를 생성한다.
도 3은 Noggin 및 SB431542의 작용에 기여하는 제안된 기전의 예시적 모델을 나타낸다. 여기에는 비제한적으로 TGF/activin- 및 Nanog-매개된 다능성 네트워크의 탈안정화, 내인성 activin 및 nodal 신호의 억제에 의한 중배엽 운명의 억제, 및/또는 BMP 저해를 통한 원시 외배엽의 신경화 촉진이 포함된다. (a) 고밀도에서는 PAX6+인 CNS 세포가 주로 형성되며, 이는 분화 19 d 이내에 운동뉴론 및 도파민성 뉴론의 패턴화 가능한 뉴론 모집단 및 R-NS 세포를 생성할 수 있다. (b) 더 저밀도에서는 (a)에 기재된 특성을 갖는 CNS 운명 및 신경 능선 운명이 모두 관찰된다. 신경 능선 계통에는 패턴화 및 하위유형 전문화 반응하기 쉬운 멜라닌세포 및 신경 능선 전구체 세포가 포함된다. 세포 밀도에 부가하여, BMP 경로를 포함하는 신호전달 경로의 추가 조작이 CNS 대 신경 능선 운명의 비를 왜곡할 가능성이 있을 것이다. 직선 화살표는 나타낸 세포 운명 가능성을 시사한다; 점선 화살표는 현재 문헌에 근거하여 제안된 세포 운명을 시사한다.
도 4는 예시적인 nanog 실시간 유전자 발현을 나타낸다. KSR 중 녹아웃 혈청(KSR), Noggin(N), SB431542(SB), 또는 Noggin 및 SB431542(N + SM)로 처리된 hESC가 Nanog 발현에 대해 조사되었다. 가장 극적인 하향 조절은 SB431542의 첨가로 관찰되었다. 오차 막대는 S.E.M.을 나타낸다.
도 5는 HES5-GFP BAC 리포터 hESC 라인의 예시적인 GFP 발현을 나타낸다. GFP는 신경 유도를 위해 두 조건(분화 13 일째에 MS5 상 Noggin 또는 SB431542와 Noggin) 하에 모두 관찰되었다.
도 6은 MS5 영양세포 세포 상의 예시적인 endoglin(CD105) 발현을 나타낸다. hESC를 분화시키기 위해 이용된 MS5 세포는 조합된 SMAD 저해를 이용해서 13 일째에 분화된 hESC에 비해 FACS 분석에 기반한 Endoglin(CD105) 발현에 대해 균일하게 양성이다. Endoglin 발현을 이용해서 HES5-BAC hESC로부터 MS5 세포를 구별하고 제거하였다.
도 7은 도파민성 및 운동 뉴론 가능성을 갖는 전-로제트, 신경 줄기 세포를 허용하는 이중 SMAD 저해에 의한 hESC의 예시적인 신경화를 나타낸다. PAX6 양성 신경 조직(녹색)은 로제트 마커(빨간색) (a) + Nestin, (b) PLZF, (c) ZO1을 발현하였다. (d) 로제트는 PAX6⁺ 조직이 분열간기 핵 이동의 증거인 KI67(녹색) 및 루미날 포스포-히스톤 H3(빨간색) 발현에 의해 확인된 로제트를 촉진하는 조건(BSAF)으로 계대되는 경우 형성된다. 지역적 뉴론 특이성을 부여하는 인자의 부재 하에, PAX6⁺ 신경 조직(녹색)은 (e) OTX2, 및 (f) BF1을 발현하여, 조직이 디폴트로 앞뇌 전문화에 대한 것임을 시사하였다. 신경 능선은 (g) AP2, (h) HNK1, (i) PAX7, 및 (j) p75 발현(빨간색)에 기반하여 PAX6 양성 조직(녹색)의 말초 상에서 확인될 수 있었다. 계대 시, 신경 능선 세포는 (k) 색소 세포를 생성하여 (l) HMB45(녹색)를 발현하며 멜라닌소체 합성을 시사하였다. (m) 도파민성 뉴론 패턴화는 5-9 일째에 super sonic의 첨가에 이어 9-12 일째에 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF), 아스코르브산, 소닉 헤지호그, 및 FGF8의 첨가에 의해 개시되었다. 도파민성 세포는 12-19 일째에 BDNF, 아스코르브산, GDNF, TGFb3, 및 cAMP로 성숙되었다. 운동 뉴론 패턴화는 5 일째에 BDNF, 아스코르브산, 소닉 헤지호그, 및 레티노산의 첨가로 개시되었다. 세포는 11 일째에 계대되었다. (n-p) 계대 없이, 티로신 하이드록실라제(TH) 양성 세포가 19 일 경에 관찰될 수 있었다. (p) 12 일째에 일괄 계대된 경우, TH 양성 세포로부터 보다 성숙한 돌기가 관찰되었다. 운동뉴론 유도를 위해, 운동 뉴론 마커 (q) ISL1 및 (r) HB9의 핵 발현이 hESC로부터 총 분화 19 일 내에 관찰되었다. 축적 막대: (a, b, c, e, f, g, h, i, j, o, p, q, 및 r) - 100 ㎛; (c, d) - 50 ㎛; (k, l, n) - 200 ㎛.
도 8은 PNS 대 CNS 세포 생성에 영향을 미치는 예시적인 평판접종 밀도를 나타낸다. 초기 hESC 평판접종 밀도는 분화 11 일째에 존재하는 신경-능선(HNK1, p75; 빨간색) 대 신경 조직(PAX6; 녹색)의 비를 결정하며, 밀도가 더 높을수록 신경 분화를 선호한다.
도 9는 이중 SMAD 저해를 이용해서 신경 조직으로 분화되었고 도파민성 뉴론 및 운동 뉴론으로 패턴화 가능한 예시적인 유도된 다능성 줄기 세포(IPS)를 나타낸다. (a-i, ii) 2 개의 IPS 클론(IPS^C14, IPS^C27)이 생성되었고 OCT4(빨간색)뿐만 아니라 추가적인 다능성 인자(Tra-1-81, Tra-1-60, SSEA-4 및 Nanog)에 대해 스크리닝되었다. (b-i, ii) 2 개의 클론은 이중 SMAD 저해에 의해 신경화되었고(PAX6 발현, 녹색), 신경 능선은 HNK1 염색에 의해 관찰할 수 있었다(c-i, ii). IPS 클론으로부터 신경 조직이 유도되어 KI-67(빨간색) 및 포스포-히스톤 H3(녹색) 발현에 근거하여 로제트-NSC(d-i, ii)를, HB9 발현(녹색)에 근거하여 운동 뉴론(e-i, ii)을, 그리고 TUJ1(녹색) 및 TH(빨간색) 공동-발현에 근거하여 도파민성 뉴론(f-i, ii)을 형성할 수 있었다. 축적 막대: 200 ㎛ -(a); 50 ㎛ -(b, c, d, e, f).
도 10은 신경-유도의 처음 5 일 동안의 예시적인 조합된 SMAD 저해를 나타낸다. 배지 중에 보충된 SB431542 및 Noggin이 5 일째에 제거되었을 때 균일한 PAX6 발현이 관찰되었다.
도 11은 개질된 N-SB 프로토콜을 이용한 Six1+ 기원판 전구체의 예시적인 유도를 나타낸다.
A) 기원판 세포 전문화에서 내인성 BMP 신호전달을 위한 시간적 요건을 결정하기 위한 적시 noggin 제거 패러다임의 도식적 예시.
B) (A)에 기재된 바와 같은 개질된 N-SB 프로토콜을 분화에 걸쳐 유지된 N-SB 처리(SBN 조건)와 비교하는 기원판 마커(Dlx3, Eya1, 및 Six1)의 상대적 유도. 세포가 48 시간 동안 noggin으로 처리되는 경우, Dlx3, Eya1, 및 Six1의 최적 공동-발현이 관찰되었다. 데이터는 11 일째에 qRT-PCR에 의해 측정된 mRNA 발현의 배율 변화를 나타낸다. C) 분화 11 일째에 Six1(기원판 마커) 및 Pax6(전방 신경외배엽 마커) 발현을 나타내는 면역세포화학적 분석. 개질된 N-SB 프로토콜(분화 2 일 후 noggin 제거)로 처리된 세포는 높은 백분율의 Six1+ 세포를 나타낸다. D) 표준(전방 신경외배엽-유도) 11 일의 noggin 처리에 비해 개질된 N-SB 조건(noggin 2 일)을 이용해서 생성된 세포의 대략 70 퍼센트는 Six1+이다.
도 12는 인간 ES 세포 유도된 기원판 전문화 동안의 예시적인 시간적 전반적 유전자 발현 프로필을 나타낸다. A-D) 개질된(기원판-유도) 대 표준(전방 신경외배엽-유도) N-SB 프로토콜을 거친 hESC 자손에서 가장 차별적으로 발현된 유전자의 분화 5 일, 7 일, 9 일 및 11 일째의 페어식 비교. E) 마이크로어레이 데이터의 미감독 클러스터링은 데이터를 복제물, 시간적 샘플링 및 처리 조건에 따라 분리한다. F) 데이터의 주 성분 분석은 인간 ES 세포 분화 동안의 샘플과 후기 분화 단계에서 개질된 대 표준 N-SB 처리된 세포의 분리 증가 간에 밀접한 시간적 연관성을 확인시켜준다.
도 13은 hESC 기원판 유도된 감각 뉴론의 예시적인 유도를 나타낸다. A-C) 분화 20 일째의 면역세포화학적 분석은 기원판 전구체 세포가 처음에 Six1 발현을 보유하는 뉴론을 효율적으로 산출함을 나타낸다. D, E) 감각 뉴론 정체성은 Six1+ 클러스터로부터 유도된 대부분의 뉴론에서 Brn3A 및 Isl1의 발현에 의해 확인된다. F) 40 일째에 분화 뉴론은 성숙 말초 뉴론 운명에 특징적인 감소된 수준의 Tuj1 염색 및 증가된 peripherin 발현을 나타낸다. G) hESC 유도된 기원판 세포로부터 감각 뉴론 전문화 동안 마커 발현의 도식적 예시.
도 14는 hESC 유도된 기원판 전구체의 예시적인 전향적 단리를 나타낸다. A) 분화 11 일째에, hESC 유도된 세포는 상호 배타적인 p75+ 및 Forse1+ 전구체 세포 도메인으로 분리된다. B) p75 및 HNK1 발현에 대한 분화 11 일째의 FACS 분석. C) Six1 mRNA 발현에 대한 qRT-PCR 데이터에 이어 p75 및 HNK1의 발현에 근거한 세포 분리. p75에 대해서는 양성이지만 HNK1(전향적 기원판 전구체)에 대해서는 음성인 세포는 다른 군에 비해 Six1 mRNA 발현에서 극적인 증가를 나타내었다. D) 전구체가 표준(전방 신경외배엽-유도) N-SB 유도 조건에 비해 개질된(기원판-유도) 조건 하에 유도되는 경우 p75에 대해 양성이고 HNK1에 대해 음성인 세포 분획의 증가가 관찰된다.
도 15는 예시적인 고 SHH 수준, 증가된 FOXA2 및 감소된 BF1 발현을 나타낸다. (A) 신경 분화 계대 1, 21 일째에는 15 일에 첨가된 경우 SHH 처리의 효과를 나타내지 않는다. 결과를 오른쪽에 정량하였다, ^*p<0.01 N=3. 축적 막대, 200 um. (B) 신경 분화 21 일째에는 9 일째에 Sonic C25II 처리 후 로제트 유사 구조의 감소를 나타낸다. 로제트 손실을 오른쪽에 정량하였다, ^*p<0.01 N=4. 축적 막대, 100 um. (C) Sonic C25II 처리는 21 일째에 BF1 감소 및 Foxa2 증가를 일으킨다. 오른쪽에 정량하였다, *p<0.05 N=4. 축적 막대, 200 um. (D) 신경 분화 21 일째에는 ZO1/BF1+ 로제트 구조의 감소가 드러난다. 상기 감소가 정량된다, ^*p<0.01 N=4. 축적 막대, 50 um. (E) Sonic C25II 처리 후 21 일째의 PAX6 발현 감소. 상기 감소가 정량된다, ^*p<0.01 N=4. 축적 막대, 200 um. (F) FOXA2 유도에 대한 Sonic 및 Sonic C25II 유효성을 비교하는 용량 반응 곡선. (E) FP 마커(FOXA2 및 Netrin-1)를 또 다른 SHH 반응 유전자 NKX6.1의 유도와 비교하는 Sonic C25II의 용량 반응 곡선.
도 16은 초기의, 짧은 시간적 패턴화 윈도우를 갖는 예시적인 바닥판 유도를 나타낸다. (A) 신경 유도 프로토콜 동안 상이한 시점의 Sonic C25II 첨가를 나타내는 도식. (B-C) 왼쪽의 제목은 Sonic C25II가 첨가된 날을 나타내고, 상부 제목은 분석이 중단되었을 때를 나타낸다. Sonic C25II 첨가가 빠를수록 그리고 세포가 이것에 오래 노출될수록, 매우 높은 백분율의 FOXA2로 이어진다. (C) 상기 결과가 정량된다, ^*p<0.01 N=3. 축적 막대, 200 um, 고배율, 50 um. (D) Sonic C25II(노출 9 일)를 이용한 처리 연장은 FOXA2 유도를 증가시키지 않는다. (E) 연구의 나머지를 위해 이용될 FOXA2 유도를 위한 최적 프로토콜의 도식.
도 17은 기능적인 예시적 hESC 유도된 FP를 나타낸다. (A) 컨디셔닝된 배지가 수집되었을 때를 나타내는 도식. (B) Sonic C25II가 신경 유도를 위해 초기 첨가된 경우 9 일 및 11 일째에 배지 내로 분비된 Netrin-1 수준 증가를 나타내는 ELISA, ^*p<0.01 N=3. (C) NSB 및 NSB + Sonic C25II로부터 컨디셔닝된 배지가 수집되고 NSB 유도된 신경 전구체 세포를 함유하는 배양 상에 배치되었다. 배 유전자(NKX6.1 및 NKX2.1)뿐만 아니라 SHH 반응 유전자(GLI2)의 유도를 나타내는 qRT-PCR. 이들 유도는 SHH 길항제 사이클로파민의 존재 하에 억제된다. (C') NKX6.1의 유도가 GFP 발현 라인을 이용하여 단백질 수준에서 나타난다. ^*p<0.01, NSB CM 대비, ^#p<0.05, FP CM 대비, N=3. 축적 막대, 200 um. (D 및 E) NSB + Sonic C25II 조직과 공동-배양된 E8.5 신경외배엽으로부터 단리된 신경 체외이식편은 전위 FOXA2 염색을 나타낸다. 삽입물은 M6(녹색) 및 FOXA2(빨간색)의 공동-국소화를 나타낸다. (E) 상기 데이터가 정량된다, *p<0.001 N=4 체외이식편. 축적 막대, 50 um.
도 18은 FP 발달에 관여된 신규 유전자를 드러낸 예시적인 전사 분석을 나타낸다. (A-J) 프로토콜의 11 일 길이에 걸쳐 발현의 시간 경과를 나타내는 qRT-PCR 데이터. FP 마커(A-D), SHH 반응 유전자(E-G), 신경 마커(H), AN 마커(I 및 J), 그리고 중배엽 및 내배엽 수임에 관여되는 유전자(K 및 L)를 포함하는 유전자를 나타낸 상이한 모집단에서 관찰하였다. (M-R) 상세한 시간 경과 마이크로어레이 분석 (M-N) 7 일(M) 및 11 일(N) 동안의 GO 기간은 NSB 대조군 대비 증가 또는 감소를 나타냄. FP 조건은 액손 가이드 및 분비된 단백질과 연관된 유전자의 농축을 나타내는 반면, 전방 신경외배엽 발달과 연관된 유전자의 감소를 나타낸다. (O-R) 3 일(O), 5 일(P), 7 일(Q) 및 11 일(R)째에 NSB 대조군 조건 대비 상향 및 하향 조절된 유전자를 나타내는 페어식 비교.
도 19는 FP 유도의 예시적인 DKK-1 억제를 나타낸다. (A) 경시적인 대조군 NSB 조건에서의 DKK-1 발현에 대한 qPCR. (B) 5, 7 및 11 일째에 배지 중 DKK-1 단백질 수준을 측정하는 ELISA는 Sonic C25II 처리 후 Dkk-1 수준 감소를 나타냄, ^*p<0.05 N=3. (C) 경시적인 NSB + Sonic C25II 조건에서 DKK-1 발현에 대한 qPCR. (D 및 E) BF1(D) 및 FOXA2(E)에 대한 qPCR은 DKK-1 첨가 후 BF1 증가 및 FOXA2 감소를, 그리고 DKK-1 항체가 첨가되는 경우 FOXA2 증가를 나타냄. (F) FOXA2에 대한 면역염색은 DKK-1이 첨가되는 경우 FOXA2+ 세포의 감소를 나타냄. 축적 막대, 200 um. (G) BF1 발현에 대한 qPCR은 DKK-1 항체 처리가 더 이른 시점에(3 일-5 일) 감소된 발현으로 이어짐을 나타냄. (H 및 I) DKK-1 항체의 초기 첨가는 FOXA2 발현 증가로 이어지지만, 후기 시점에 첨가되는 경우 효과를 갖지 않음. (I) 면역세포화학 데이터는 분화 5 일째에(또는 그 이후에) 시작되는 Dkk-1 처리가 SHH-매개된 FOXA2 발현을 증강시키지 않음을 나타냄.
(J-K") 대조군 또는 BF1 shRNA로 형질도입된 hESC(J 및 K), GFP는 형질도입 마커이다(A' 및 B'). 신경 조직으로 분화된 경우, 대조군(J" 및 K")에 비해 단백질 수준에서 BF1 감소가 관찰된다. 축적 막대, A 및 B 100 um, J" 및 K" 200 um. (L) 11 일째의 qRT-PCR 분석은 대조군 대비 BF1 shRNA 라인에서 FP 마커(FOXA2, SHH, Netrin-1 및 F-Spondin)의 증가를 나타내었다, p<0.01 N=3. (M) BF1 shRNA는 단백질 수준에서 나타난 FOXA2의 상향조절로 이어진다. 축적 막대, 200 um.
도 20은 예시적인 hESC 유도된 FP가 A/P 축을 따라 이동하였음을 나타낸다. (A) 면역염색은 FGF8, Wnt-1, 및 레티노산에 반응하는 FOXA2의 증가를 드러낸다. 축적 막대, 200 um. (B) qPCR은 꼬리화 제제, 예컨대 FGF8, Wnt-1, 및 레티노산(RA)이 NSB + Sonic C25II 대비 FOXA2 증가 및 SIX6 감소로 이어짐을 나타냄. (C) 중뇌 FP 마커(CORIN 및 NOV) 및 중뇌 DA 선조 마커(LMX1B, NGN2, 및 EN1) 패널에 대한 qPCR. 특히, Wnt-1 처리는 중뇌 FP 마커뿐만 아니라 중뇌 DA 선조 마커 둘 다의 상향조절을 유도한다. (D) FP 세포가 전방 배 축(SBE2) 또는 중뇌 배 축(SBE1)으로의 발현을 유도하는 Shh 인핸서로 전달감염되었다. 디폴트 FP는 SBE2 활성을 나타내어 전방 위치를 시사한다. 이는 Wnt1 및 FGF8 첨가 시 제거되며, 이제 SBE1 활성이 나타나서 전방 정체성으로부터 중뇌로의 이동을 제시한다. 축적 막대, 200 um. (E) hESC 분화 동안 FP 대 AN 전문화의 도식. 신경 분화는 Noggin 및 SB431542의 노출 시 개시된다. 분화 1 일째에 시작하는 SHH 노출은 FP 분화를 유도하고, DKK-1 및 BF1의 저해를 통해 AN 전문화를 억제한다. 생성 FP 세포의 지역 정체성은 디폴트로는 전방이지만, 후방 FP 조직이 꼬리화 인자, 예컨대 Wnt-1, FGFF8 또는 RA의 존재 하에 유도되었다.
도 21은 적절한 마커를 발현하는 예시적인 hESC 유도된 FP를 나타낸다. (A) 11 일째의 qRT-PCR 데이터는 대조군 NSB 조건 대비 바닥판 마커 FOXA2, SHH, Netrin-1, 및 F-Spondin의 증가를 나타냄. (B) 면역 염색 실험 결과를 정량하는 표. (C-F) FOXA2+ 세포의 면역 염색은 소수의 마커, 예컨대 (C) Nestin, (D) SOX2, (E) Nkx2.2, 및 (F) Tuj1과의 공동-표지를 드러낸다. 축적 막대, (D 및 F, 50 um) (E 및 G, 100 um). (G-H) 11 일째의 qRT-PCR 데이터는 NSB + Sonic C25II 처리로 분화된 FOXA2 및 SOX17 세포 및 내배엽 계통으로 분화된 세포의 수준을 나타냄. SOX17은 Sonic C25II 조건에서는 발현되지 않지만 내배엽에서는 고도 발현된다. 이는 면역염색에 의해 단백질 수준에서 나타난다(H). 축적 막대, 200 um.
도 22는 신경돌기 증식을 유도하는 FP 세포 상 소뇌판 체외이식편의 예시적인 공동-배양을 나타낸다. E8.5 마우스로부터의 소뇌 체외이식편을 NSB 신경 세포 또는 NSB + Sonic(FP) 세포 상에 평판접종하였다. 3 일 후 상당한 신경돌기 증식이 대조군에 비해 NSB + Sonic(FP) 조건에서 관찰되었다.
도 23은 마이크로어레이에서 변화하는 유전자를 검증하는 예시적인 qPCR을 나타낸다. (A) FP 유전자에 대한 qPCR은 NSB 대조군 대비 Sonic C25II 조건에서 농축을 나타낸다. (B-D) qPCR은 NSB 대조군 대비 Sonic C25II 조건에서 변화하는 신규 유전자를 검증함.
도 24는 FP 유도를 억제하는 예시적인 BF1 발현을 나타낸다. (A) 신경 분화 동안의 두 시점에서의 qRT-PCR은 대조군 대비 BF shRNA hESC 라인에서 BF1 수준 감소를 나타냄, ^*p<0.01 N=3. (B) 세포 주기 분석은 두 라인의 세포 주기 역학에서 차이를 드러내지 않았다. (C) GFP에 의해 가시화된 BF1을 발현하는 hESC. 축적 막대, 20 um. (D) BF를 과발현하는 세포에는 FOXA2+ 발현이 없다. 축적 막대, 200 um. (E) 11 일째의 qRT-PCR 데이터는 Sonic C25II 처리 후 BF1 발현 hESC에서 FP 유도의 부재를 나타냄.
도 25는 DA 뉴론 분화를 유도할 수 있는 FP 분화에 따른 예시적인 조기 WNT1 첨가를 나타낸다. (A) 조기 WNT 또는 GSK3β-저해제(BIO 100 nM) 첨가는 FOXA2 발현을 증가시킬 수 있다. (B) 후기 단계 신경 로제트 세포로의 WNT1 첨가는 FOXA2 유도에 효과를 갖지 않는다, 축적 막대 200 um. (C) WNT1 처리된 FP 배양은 FOXA2를 발현하는 DA 뉴론을 생성할 수 있다, 축적 막대 50 um.
도 26은 예시적인 Gray 해부 플레이트를 나타낸다. A: 개 배아의 일련의 횡단 섹션, 전방부터 후방까지, I - V. 섹션 I이 최전방이다. V에서, 신경판은 거의 편평하게 확산된다. Henry Gray에 의한 Gray 해부.
도 27은 다양한 인간 ESC 및 iPSC 라인에 걸친 기원판 유도, 특성규명 및 프로토콜 검증의 예시적인 데이터를 제공한다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. (^*) p<0.05; (^**) p<0.01; (^***) p<0.001, 대조군 N-SB 조건 대비(n = 3, 독립적 실험). 축적 막대는 50 ㎛에 해당한다.
A) 인간 신경판 단계 배아의 등쪽 시야의 도식적 예시((O'Rahilly, 1987)에 기반). 모델 개체에서의 운명 연구는 전-기원판 지역(PPR; 여기서 빨간색으로 표시됨)으로 불리는 모든 기원판 전구체를 함유하는 머리 외배엽에서 독특한 말굽-형상 영역을 확인하였다. 신경외배엽은 신경판(밝은 파란색으로 표시됨)을 형성한다. 신경판의 가장 가쪽 측면은 향후 신경 능선 세포를 생성하는 신경 주름(분홍색으로 표시됨)을 형성한다.
B) BMP4 처리는 형태 상 포배기 외배엽-유사 계통을 유도한다.
C) BMP4 처리 또는 SB + BMP4 처리 후 11 일째의 CDX2 발현. 데이터는 N-SB 조건 대비 qRT-PCT에 의한 mRNA 발현의 배율 변화를 나타낸다.
D) 분화 11 일째의 SIX1(빨간색) 및 PAX6(녹색) 발현.
E) N-SB 및 PIP 조건에서 DACH1(빨간색) 발현에 대한 면역세포화학
F) SOX10::GFP hESC 리포터 라인을 이용한 PIP의 11 일째의 SOX10 발현에 대한 유세포 분석.
G, H) 기원판 유도 프로토콜(PIP)은 여러 hESC(H9, I6 및 Hs293) 및 hiPSC 라인(C14, M3X, 및 C27)에 걸쳐 강력하였다. SIX1/PAX6 면역세포화학의 대표적 이미지를 각 라인에 대해 (G)에, 더 고배율로 삽입물에, 그리고 PIP 조건 하에 SIX1+ 세포 백분율 정량과 함께 (H)에 나타낸다.
I) 포유류 시스템에서 EYA1::GFP 인핸서의 특이성을 시험하기 위한 실험 설계 방식. E11.5 마우스 배아로부터 일차 배양 후각(OLF) 영역 및 중뇌(MB) 영역이 단리되고 기원판 특이적 EYA1::GFP 인핸서로 핵감염되었다.
J) 일차 후각 배양(OLF)만 EYA1 인핸서의 활성화를 나타낸 반면, 중뇌 일차 배양은 GFP 발현을 나타내지 않았다.
K) GFP 발현이 PIP 및 N-SB 조건 하에 FACS 분석에 의해 정량된다.
도 28은 개질된 이중-SMAD 저해 프로토콜을 이용하는 Six1+ 기원판 전구체 유도의 예시적인 데이터를 나타낸다. 오차 막대는 SD를 나타낸다. (^*) p<0.05; (^**) p<0.01; (^***) p<0.001, 대조군 N-SB 조건 대비(n = 3, 독립적 실험).
A) 기원판 전문화 동안 내인성 BMP 신호전달을 위한 시간적 요건을 결정하기 위한 적시 Noggin 제거 패러다임의 도식적 예시. 프로토콜은 CNS 유도를 위해 개발된 Noggin + SB431542(NSB) 프로토콜의 개질에 기반한다(Chambers, et al., 2009).
B) 개질된 NSB 프로토콜(다양한 시점의 Noggin 제거)을 분화에 걸쳐 유지된 N-SB 처리(NSB 조건)와 비교하는 기원판 마커의 상대적 유도. 데이터는 11 일째에 qRT-PCR에 의해 측정되는 mRNA 발현의 배율 변화를 나타낸다.
C) 분화 11 일째에 SIX1 및 PAX6 발현의 면역세포화학적 분석. 삽입물은 클러스터 내에서 SIX1 발현을 나타내는 동일초점 섹션을 나타낸다. 축적 막대는 50 ㎛에 해당한다.
D) 개질된 N-SB(SB3 = 기원판 유도(PIP) 프로토콜) 대 N-SB 조건 하에 생성된 Six1+ 세포 백분율의 정량.
E) 기원판 클러스터에서 기원판 마커, EYA1, DACH1, 및 FOXG1의 면역세포화학적 분석. 삽입물은 각각의 마커에 대해 더 고배율 이미지를 나타낸다. 축적 막대는 50 ㎛에 해당한다. F-H) PIP 대 N-SB 프로토콜에서 유전자 발현의 시간적 분석. 값은 분화되지 않은 hESC에서 관찰된 발현에 대해 정상화된다.
F) 다능성(NANOG, OCT4/POU5F1) 및 포배기 외배엽(TE) 마커의 발현 상실;
다능성 마커(NANOG, OCT4), 포배기 외배엽(CDX2), 중배엽(T), 내배엽(SOX17), 및 기원판 마커(DLX3, SIX1, FOXG1)의 시간 경과 발현의 모니터링에 의한 G) 중배엽 마커 T의 발현 부재; H) 비-신경 운명의 부재 및 기원판 운명의 유도.
도 29는 기원판(PIP 조건) 대 CNS(NSB 조건) 운명의 시간적 유전자 발현 분석의 예시적인 데이터를 나타낸다:
A) 데이터의 주 성분 분석은 hESC 분화 동안 샘플과 후기 분화 단계에서 PIP 대 N-SB 처리된 세포의 분리 증가 간 밀접한 시간적 연관성을 확인시켜준다.
B) qRT-PCR에 의한 마이크로어레이 데이터의 확인.
C) PIP 프로토콜 7 일째에 상향조절되는 유전자의 유전자 실체 분석.
D) PIP에서 5, 7 및 9 일째에 상향조절되는 유전자의 비교 벤 다이어그램.
E) PIP에서 7, 9 및 11 일째에 상향조절되는 유전자의 비교 벤 다이어그램.
도 30은 hESC-유도된 기원판 전문화 동안 시간적인 전반적 유전자 발현 프로필의 예시적인 데이터를 나타낸다.
A) PIP 대 N-SB 프로토콜 동안 상이하게 조절된 유전자의 클러스터링. B-E) 5, 7, 9 및 11 일째에 배율 변화에 의해 PIP 대 N-SB 프로토콜에서 상위 20 개의 가장 유의미한 상향조절된(빨간색) 및 하향조절된(파란색) 유전자.
F-G) PIP 조건 하에 단백질 수준에서 ISL1 및 TFAP2A 발현의 확인(11 일).
H) 면역세포화학에 의한 OVOL2 발현의 확인(11 일).
I) PIP, N-SB 및 신경 능선(NC) 프로토콜 동안 OVOL2 유전자 발현의 시간 경과 분석. F, G 및 H에서 축적 막대는 50 ㎛에 해당한다.
도 31은 FGF 신호전달의 조정에 대한 표피 대 기원판 운명의 유도 및 인간 기원판 유도 동안 BMP 및 WNT 신호전달의 역할의 예시적인 데이터를 나타낸다: 오차 막대는 SEM을 나타낸다. (^*) p<0.05; (^**) p<0.01; (^***) p<0.001(n = 3, 독립적 실험).
A) 초기 각질세포 유도를 위해 이용된 분화 조건의 도식적 요약.
B) 42 일째에 각질세포 패치는 E-CADHERIN(녹색) 및 KRT14(빨간색)를 공동-발현한다.
C) 패치 중심은 42 일째에 KI67을 발현하는 반면, KI67 양성 세포는 60 일 경에 사라진다. KRT14 양성 세포는 KI67에 대해 음성이다. 축적 막대는 50 ㎛에 해당한다.
D) PIP 3 일째에 시작하여 WNT 신호전달의 약리적 저해제(XAV939) 및 활성화제(CHIR99021)의 처리 후 11 일째의 SIX1 및 SOX10 발현 분석.
E) PIP 3 일째에 시작하여 BMP 신호전달의 저해제(Noggin) 및 활성화제(BMP4)를 이용한 처리 후 11 일째의 CDX2 및 SIX1 발현 분석.
도 32는 FGF 신호전달이 기원판 대 비-신경 외배엽/표피 운명을 결정하는 예시적인 데이터를 나타낸다. 오차 막대는 SD를 나타낸다. 오차 막대는 SD를 나타낸다. (^*) p<0.05; (^**) p<0.01; (^***) p<0.001, 대조군 PIP 조건 대비(n = 3, 독립적 실험). C 및 G에서의 축적 막대는 50 ㎛에 해당한다.
A-B) PIP 조건 하에 TFAP2A 및 SIX1 유도의 시간 경과.
C) TFAP2A(녹색)는 기원판 및 표면 외배엽에서 발현되는 반면, SIX1(빨간색)은 기원판 세포에서만 발현된다. 내인성 FGF 신호전달의 약리적 저해를 통한 PIP 차단은 SIX1+ 세포의 형성을 차단한다.
D) FGF 저해제 SU5402의 처리 후 SIX1 유전자 발현의 손실 정량.
E) 초기 표피 마커 KRT8의 발현. 데이터는 PIP 조건에 비해 11 일째에 qRT-PCR에 의한 mRNA 발현의 배율 변화를 나타낸다.
F) 각질세포 분화 동안 후기 표피 마커 KRT14의 발현. 데이터는 hESC에 비해 11 일 및 42 일째에 qRT-PCR에 의한 mRNA 발현의 배율 변화를 나타낸다.
G) 장기 SU5402 처리된 배양은 KRT 14 단백질을 발현하여 표피/각질세포 운명을 제시한다.
도 33은 여러 인간 ESC 및 iPSC 계통에 걸친 기원판-유도된 삼차신경 감각 뉴론 계통의 예시적인 특성규명 데이터를 나타낸다: 오차 막대는 SEM을 나타낸다(n = 3, 독립적 실험).
A) 분화 20 일째의 면역세포화학적 분석은 SIX1+ 기원판 클러스터가 처음에는 SIX1 발현을 보유하는 다수의 TUJ1 양성 뉴론을 효율적으로 산출함을 나타낸다.
B) 42 일째에 분화된 뉴론은 Peripherin(녹색)을 발현한다.
C-E) C) RUNX1 D) RET1 E) TRK 수용체의 삼차신경 뉴론 mRNA 발현의 단기(23 일) 및 장기(55 일) 배양, 데이터는 hESC에 대해 정상화된 mRNA 발현의 배율 변화(FC)를 나타낸다.
F) TRKA에 대한 삼차신경 뉴론 염색(생활성 염색)
G) 삼차신경 감각 뉴론에 대한 분화 프로토콜의 도식적 표시. 클러스터는 13-17 일째에 수동 계대된다.
H) 삼차신경-유형 감각 뉴론은 다양한 hESC(16) 및 hiPSC(C27, M3X, J 1-5) 라인으로부터 고효율로 동일한 PIP 조건 하에 수득될 수 있다.
도 34는 hESC-유도된 삼차신경 유형 감각 뉴론의 유도, 특성규명 및 이식의 예시적인 데이터를 나타낸다. 모든 축적 막대는 50 ㎛에 해당한다.
A) 호르몬 생산 세포(뇌하수체 기원판), 구조적 세포, 예컨대 수정체 섬유(수정체 기원판) 및 감각 뉴론(삼차신경 기원판)을 포함하는 전-기원판 세포에 대한 발달 동안 유도된 다양한 기원판의 도식적 표시. 삼차신경 기원판 운명(오렌지색으로 강조됨)은 PIP 조건 하에 디폴트로 나타난다.
B) PAX3, 삼차신경 기원판 마커는 11 일째에 기원판 단계에서 SIX1+ 기원판 클러스터에서 발현된다.
C) 기원판 클러스터는 디폴트로 감각 뉴론 마커, 예컨대 ISL1 및 HNK1을 발현하는 세포를 산출한다.
D) 분화 20 일째의 면역세포화학적 분석은 SIX1+ 기원판 클러스터가 처음에는 SIX1 발현을 보유하는 다수의 TUJ1 양성 뉴론을 산출함을 나타낸다.
E) 감각 뉴론 정체성은 SIX1+ 클러스터로부터 유도된 다수의 뉴론에서 BRN3A의 발현에 의해 추가로 확인된다.
F) 분화 42 일째에, 뉴론은 Peripherin 발현 증가 및 TUJ1 염색 수준 감소를 나타내어 더 많은 성숙 말초 뉴론 운명의 채택을 제시한다.
G) 글루타메이트에 대한 삼차신경 뉴론 염색.
H) RUNX 인자의 발현
I) TRK 수용체
J, K) 고온(TRPV1) 및 저온(TRPM8) 감각 및 염증성 통증(P2X3; n = 3, 독립적 실험)에 관여하는 삼차신경 뉴론에서의 통각수용체-특이적 채널 및 수용체.
L, M) 분화 53 일째에 hESC-유도된 삼차신경-유형 뉴론에서의 단일 세포 패치 클램프 전기생리적 분석의 예.
N) 자극의 세기는 -125 pA에서 시작하여 단일 활동 전위가 관찰될 때까지 25 pA씩 증가되었다. 나타낸 단계는 25 pA 증분에 해당한다.
O) 정량적 전기생리적 파라미터의 요약은 2 극 및 3 극 유형 뉴론 모두에 대해 필적하는 패턴을 나타내었다.
P-S) 닭 배아에서 삼차신경 원기 내로의 이식. P) 이식 2 일 후 GFP 표지된 세포 및 그라프팅 형태.
Q) 저해상 이미지가 GFP+ 섬유 번들을 나타낸다: GFP(녹색) 및 DAPI(파란색). 삽입물, 중뇌 수준에서의 섹션은 삼차신경 원기에 인접한 GFP+ 섬유 번들을 나타낸다.
R) 인간 섬유 번들은 인간 세포질 마커(녹색) 및 감각 뉴론 마커, Peripherin(빨간색)을 발현한다.
S) GFP+/PERIPHERIN+ 세포체는 생체내에서 신경절-유사 클러스터로 배열된다.
도 35는 hESC-유도된 삼차신경 뉴론 전구체의 생체내 특성을 평가하기 위한 패러다임의 예시적인 데이터를 나타낸다:
A) hESC-유도된 삼차신경 뉴론은 흰 원으로 나타낸 바와 같이 분화 동안(30 일) 시험관내 번들을 형성한다.
B) 닭 및 마우스 이식 실험의 도식.
C) 닭 배아 실험의 이식 시간 및 수집 시간
D) 신경판 지역에서 닭 섹션에서의 이식을 위한 음성 염색 대조군.
E-H) 그라프팅된 hESC-유도된 삼차신경 뉴론 액손 가지가 삼차신경 핵에서 표적에 도달하는 능력을 시험하기 위한 성체 마우스 교뇌 내로의 삼차신경 뉴론 전구체 이식. E) 이식 1 개월 후 교뇌 핵(Pn) 내에 그라프팅된 GFP(녹색) 표지된 인간 삼차신경 뉴론의 위치 및 형태. F) 삼차신경 핵 수도관(Aq)으로 이동하는 인간 GFP 뉴론 돌기. G) 그라프팅된 세포에서 BRN3A(빨간색), GFP(녹색) 및 DAPI(파란색)의 공동-발현에 대한 면역조직화학. H) 인간 뉴론 섬유 번들이 hNCAM 및 GFP를 공동-발현한다.
도 36은 추정 전-기원판의 확인 및 인간 수정체 기원판 계통에 대해 유도된 분화의 예시적인 데이터를 나타낸다. (G)에서의 축적 막대는 50 ㎛에 해당한다. 오차 막대는 SD를 나타낸다. (^*) p<0.05; (^**) p<0.01; (^***) p<0.001, 대조군 PIP 조건 대비(n = 3, 독립적 실험).
A) 분화 3 일째에 TFAP2A 및 PAX6에 대한 면역세포화학적 분석. B) PIP 분화의 5, 7, 9 및 11 일째의 시간 경과 분석은 분화 7 및 9 일째에 TFAP2A 및 PAX6의 공동-발현을 나타낸다.
C) N-SB 분화의 5, 7, 9 및 11 일째에 시간 경과 분석은 TFAP2A 발현의 부재를 나타내지만 CNS 신경외배엽 세포에서 PAX6의 발현을 나타낸다. A-C에서의 축적 막대는 25 ㎛에 해당한다.
D) PIP 대 NSB 프로토콜 동안 PAX3 유전자 발현의 시간적 분석.
E) PIP 동안 FGF(FGF8, SU5402) 및 WNT 신호전달(CHIR99021, XAV939) 활성화제 또는 저해제를 이용한 처리(7-11 일) 후 PAX3 발현 수준. F) (E)에서와 동일한 처리를 이용한 PAX6 발현 수준.
F) 4 개의 신호전달 경로 스크리닝 결과(PIP 7-11 일째에 첨가된 BMP, FGF, WNT 및 SHH 신호전달의 조정물질). qRT-PCR에 의한 수정체 기원판 마커 PITX3의 유도가 BMP 신호전달의 활성화제(BMP4) 또는 FGF 신호전달의 저해제(SU5402)를 이용한 처리 시 관찰되었다.
G) 분화 57 일째에 성숙 수정체 섬유 형태를 갖는 결정형+ 세포로 분화하는 개질된 기원판 배양.
도 37은 전-기원판 세포가 BMP를 이용한 처리 시 수정체 기원판으로 추가 분화될 수 있다는 예시적인 데이터를 나타낸다. 축적 막대는 50 ㎛에 해당한다.
A) TFAP2A, PAX6 및 SIX1 공동-발현은 PIP 조건 하의 일시적인 추정 전-기원판 단계를 표시한다. PIP 조건 하에 분화 7 일째에 SIX1(빨간색), TFAP2A(파란색) 및 PAX6(녹색)에 대한 면역세포화학적 분석. 축적 막대는 50 ㎛에 해당한다.
B) 초기 수정체 유도를 위해 이용된 분화 조건의 도식적 표시.
도 38은 호르몬-생성 뇌하수체 기원판 유도체의 전문화 및 기능적 특성규명의 예시적인 데이터를 나타낸다. 축적 막대는 (C, P)에서 100 ㎛, (D, H, I, J, Q, R, S)에서 50 ㎛ 및 (K)에서 10 ㎛이다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. (^*) p<0.05; (^**) p<0.01; (^***) p<0.001, (B)에서 대조군 PIP 조건, (E, F, G; n = 3, 독립적 실험)에서 hESC, (L)에서 세포 비함유 HBSS, 및 (N, O; n=3 및 n=5 동물)에서 매트리겔만 주사된 (모의) 동물로부터의 혈장 샘플 대비.
A) 생체내 정상 뇌하수체 계통 발달의 도식적 예식(Tabar, 2011). 본 발명자들의 개질된 PIP를 이용해서 생성된 호르몬 생산 세포의 예가 진한 글씨체로 기재된다(ACTH, GH, FSH).
B) PIP 분화 7-11 일로부터 SHH를 이용한 처리는 qRT-PCR에 의해 평가된 바와 같이 PITX1 및 SIX6 발현을 유도하였다. PITX1 및 SIX6은 뇌하수체 원기를 표시한다. 저 SHH: 20 ng/ml C25II SHH; 고 SHH: 100 ng/ml C25II SHH + 1μM 푸르모르파민.
C) 면역세포화학적 분석은 SHH 처리의 존재 하에 클러스터 하위세트에서 단백질 수준에서의 SIX6 발현을 나타내었다.
D) 16 일째(SHH 처리 시) LHX3의 발현에 대한 면역세포화학적 분석.
E-G) 정의된 내분비 전구체 계통의 유도: E) TBX19 발현이 20 일 경에 고도로 유도되었다. F) 분화 20 및 32 일째의 PIT1 발현(처리 패러다임에 대해서는 도 S7A 참고). G) 분화 20 및 32 일째의 GATA2 발현.
H-L) 호르몬 생산의 면역세포화학 증거. H) CGA 발현이 SHH-처리된 PIP 배양에서 16 일째에 쉽게 검출되었다. I) FSH가 27 일 경에 발현되었다.
J) ACTH 발현은 분화 30 일까지는 SHH-처리된 PIP 배양에서 가장 풍부하였다.
K) 분화 30 일째의 GH 발현.
L) HBSS에서 10 분 노출 후 시험관내 호르몬 생산의 ELISA 측정.
M) 누드 래트 숙주에서 이식 패러다임의 도식적 예시.
N) 이식 4 및 6 주 후에 그라프팅된 성체 누드 래트 및 모의-그라프팅된 대조군에서의 ACTH 혈장 수준.
O) 인간 특이적 ELISA를 이용한 GH 혈장 수준(이식 6 주 후). P-R) 이식 6 주 후 조직학적 분석: P) hNCAM+ 인간 세포의 강력한 생존. 생체내 Q) ACTH 발현 및 (R) GH 발현 세포.
도 39는 생체내 이식 연구를 위해 전방 뇌하수체 기원판 및 호르몬 생산 세포를 생성하기 위한 프로토콜의 예시적인 데이터를 나타낸다.
A) 초기 뇌하수체 유도를 위해 이용되는 분화 조건의 도식적 표시.
B, C) NOD-SCID 마우스에서 hESC-유도된 GFP+ 초기 뇌하수체 세포의 피하 주사 시 단기 생체내 분석.
D) 마우스 그라프트에서 GSU(CGA) 및 GFP 표지된 세포의 공동 발현.
E) 마우스 그라프트에서 FSU 및 GFP 표지된 세포의 공동-발현.
도 40은 hPSC로부터 인간 기원판의 유도를 위해 제안된 모델의 예시적인 데이터를 나타낸다. 기원판 유도는 dSMADi 프로토콜을 이용한 BMP 신호전달의 탈억제에 의존한다. 연속적 BMP 억제는 CNS 운명을 유도하였고, SU5402에 의한 FGF 신호전달의 저해와 조합된 BMP의 탈억제는 표피 운명을 유발한다. 전-기원판 세포는 분화 7 일째에 FGF, BMP 또는 SHH 신호전달을 조정함으로써 특정한 기원판 운명에 대해 추가로 패턴화되어 기능적 수정체, 삼차신경 뉴론 및 전방 뇌하수체 유도체로 이어질 수 있다.
도 41A-E는 (A-C) SIX1::H2B-GFP 리포터 세포 라인을 생성하기 위해 이용되는 프로토콜을 나타내는 도식; 및 (D-E) SIX1::H2B-GFP 리포터 구축물을 발현하는 기원판 세포를 나타낸다.
도 42A-B는 (A) E8/E6 세포 배양 배지에서 세포를 배양하기 위해 이용되는 PIP 프로토콜을 나타내며, 여기서 배양 배지는 배양일 0-11 일 동안 SMAD 저해제 SB431542, 및 0-2 일 동안 SMAD 저해제 LD193189로 보충된다. (B)는 PIP 프로토콜 및 E8/E6 배지를 이용해서 유도된 세포에서 기원판 전구체 마커 SIX1 및 PAX6의 발현을 나타낸다.
도 43A-C는 (A) 배양 0-3 일 동안 BMP4 및 단일 SMAD 저해제 SB431542로 E8/E6 배지를 보충하는 개질된 PIP-E6 프로토콜에 대한 프로토콜을 나타내며; (B-C)는 0, 1, 5, 10, 15 및 20 ng/ml BMP4를 이용하여 PIP-E6 프로토콜에 따라 배양되는 세포에서의 AP2 발현을 나타낸다.
도 44A-C는 (A) SIX1::H2B-GFP 세포를 배양하기 위해 이용된 PIP-E6 프로토콜; (B) BMP4가 5 ng/ml의 BMP4 농도로 0-3 일 동안 배양 배지 중에 존재한 경우 유도된 세포에서의 AP2 및 SIX1의 발현 및 (C) BMP4가 20 ng/ml의 BMP4 농도로 0-3 일 동안 배양 배지 중에 존재한 경우 유도된 세포에서의 AP2 및 SIX1의 발현을 나타낸다.
도 45A-B는 (A) SIX1::H2B-GFP 세포를 배양하기 위해 이용된 PIP-E6 프로토콜을 (B) 배양의 0-1, 0-2 및 0-3 일의 배양일 동안 5 ng/ml BMP4를 이용하고, SIX1 및 AP2의 생성 발현을 나타낸다. 최고 수준의 SIX1 및 AP2 발현은 0-3 일 프로토콜 후 일어났다.
도 46은 PIP-E6 프로토콜(배양 3 일 후 BMP4 제거)에 따른 SIX::H2B-GFP 세포의 배양 동안 경시적으로 다양한 기원판 마커의 유전자 발현 수준을 나타낸다. 또한 다능성(OCT4) 손실, 근육(MyoD) 또는 일반 중배엽(Brachyury) 유도의 부재, 및 내배엽(SOX17) 또는 신경 능선(SOX10) 유도의 부재를 나타낸다.
도 47은 PIP-E6 프로토콜(배양 3 일 후 BMP4 제거)을 이용하여 E8/E6 배지에서 배양된 세포에서 기원판 정체성을 확인시켜주는 다양한 단백질의 염색을 나타낸다.
도 48은 PIP-E6(E8/E6 배지) 및 PIP(KSR 배지) 프로토콜을 이용해서 생성된 기원판 전구체 세포의 수율 및 변동성을 나타낸다. PIP-E6은 더 적은 기원판 전구체 세포를, 그러나 PIP에 비해 더 작은 변동성으로 산출하였다.
도 49A-B는 (A) 디폴트 기원판로서 삼차신경 기원판을 유도하기 위해 CHIR(Wnt 활성화제)로 보충되는 PIP-E6 프로토콜(배양일 2-4 동안 보충됨); 및 (B) 배양 11 및 12 일 후 개질된 PIP-E6 프로토콜에 따라 배양된 세포에 의해 발현되는 삼차신경 기원판 마커 SIX1 및 PAX3을 나타낸다.
도 50은 PIP-E6 배양 프로토콜을 이용하여 유도될 수 있는 뇌하수체, 수정체 및 삼차신경 기원판을 나타낸다.
도 51은 배양일 2-4 동안 CHIR이 보충된 PIP-E6 프로토콜을 이용해서 유도된 삼차신경 기원판 세포에서 농축되는 세포 표면 마커 GD2를 나타낸다.
도 52는 GD2의 화학적 구조를 나타낸다.
도 53A-B는 배양일 2-4 동안 CHIR로 보충된 PIP-E6 프로토콜을 이용해서 유도되는 삼차신경 기원판 세포에서 GD2 및 기원판 마커 SIX1::GFP의 공동-발현을 나타낸다.
도 54A-B는 CD24 및 SIX1::GFP가 배양일 2-4 동안 CHIR로 보충된 PIP-E6 프로토콜을 이용해서 유도되는 삼차신경 기원판 세포를 포함하는 모든 신경 세포에서 발현되는 양성 대조군 세포를 나타낸다.
도 55는 PIP-E6 프로토콜을 이용해서 유도되는 삼차신경 기원판 세포에서 농축되는 세포 표면 마커 CD57(HNK1)을 나타낸다.
도 56A-B는 배양 2-4 일 동안 CHIR로 보충된 PIP-E6 프로토콜을 이용해서 유도되는 삼차신경 기원판 세포에서 CD57(HNK1) 및 SIX1::GFP의 공동-발현을 나타낸다.
도 57은 디폴트 기원판 운명으로 삼차신경 기원판을 생성하기 위해 이용될 수 있는 PIP-E6 프로토콜을 나타내며, 여기서 기원판은 이들의 GD2 마커 발현에 기반하여 단리되고 정렬된다.
도 58은 GD2 음성 세포에 비해 분화 28 일 후(GD2 정렬 14 일 후) 개질된 PIP-E6 프로토콜(CHIR로 보충됨)을 이용해서 유도되는 GD2 양성 삼차신경 세포의 형태를 나타낸다.
도 59는 분화 48 일 후(GD2 정렬 33 일 후) 개질된 PIP-E6 프로토콜(CHIR로 보충됨)을 이용해서 유도되는 삼차신경 뉴론을 나타낸다.
도 60은 PIP-E6 프로토콜을 이용해서 기원판 유도를 촉진하는 화합물에 대한 고처리량 스크리닝 도식을 나타내며, 여기서 시험 화합물은 PIP-E6 프로토콜 3 일째에 배양 배지로 첨가된다.
도 61은 기원판 유도를 촉진하는 화합물에 대한 고처리량 스크리닝 결과를 나타낸다. 3 개의 후보 화합물이 유도 인핸서로서 스크리닝에서 확인되었다: BRL-54443, 펜안트롤린 1 수화물, 및 파르테놀라이드.
도 62는 후보 기원판 유도 인핸서인 BRL-54443, 펜안트롤린 1 수화물, 및 파르테놀라이드의 구조를 나타낸다.
도 63A-B는 (A) 뇌하수체 기원판 세포를 유도하기 위해 이용된 PIP-E-6 프로토콜을 나타내며, 여기서 뇌하수체 패턴화 인자는 배양 6-15 일째에 PIP-E6 배지로 보충되었고; (B) 뇌하수체 기원판 마커 Pitx1, Pitx2, Lhx3 및 Lhx4의 발현에 의해 입증된 바와 같이 뇌하수체 기원판이 유도되었음을 나타낸다.
도 64는 개질된 PIP-E6 프로토콜을 이용하여 30 일까지의 분화 후, 뇌하수체 기원판 세포가 모든 세 뇌하수체 전구체 계통의 유도체에 해당하는 호르몬 발현 세포로 분화했음을 나타낸다.
도 65는 각각의 세 뇌하수체 전구체 계통의 비율이 Notch 신호전달 저해제(DAPT)로 세포를 처리함으로써 그리고 CHIR(Wnt의 활성화제)에 의해 더 적은 정도로 조정되었음을 나타낸다.
도 66은 배양일 6에 뇌하수체 패턴화 인자의 첨가로 개질된 PIP-E6 프로토콜에 따라 유도된 뇌하수체 호르몬 발현 세포가 외부 자극에 반응하였음을 나타낸다. 소마토크리닌에 반응하여, 세포는 성장 호르몬(GH)을 방출한다. 나파렐린에 반응하여, 세포는 난포 자극 호르몬(FSH)을 방출하였다.
도 67은 BMP2로 보충된 PIP-E6 프로토콜에 따른 세포 배양이 몇몇 뇌하수체 하위유형 특이적 마커의 수율을 증가시킬 수 있었음을 나타낸다.
도 68은 전방 뇌하수체 샘 세포의 유도를 위한 개질된 PIP-E6 프로토콜을 나타내며, 여기서 SIX1::GFP hPSC는 PIP-E6 프로토콜에 따라 배양되었고, 뇌하수체 패턴화 인자, 예컨대 FGF8, FGF10 또는 SHH 등이 6-14 일째로부터 배양 배지 중에 포함되었다.
도 69는 배양일 6-14에 FGF2 또는 FGF8로 보충된 PIP-E6에 따른 SIX1::GFP hPSC 배양이 Ki67 및 Sox2의 발현에 의해 입증된 바와 같이 추정 뇌하수체 줄기 세포의 수를 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
도 70은 병소화되지 않은 성체 래트 뇌(뇌하수체/시상하부에 인접) 내로 그라프팅되는 경우 개질된 PIP-E6(뇌하수체 패턴화 인자로 보충됨) 프로토콜의 이용을 통해 뇌하수체 호르몬 발현 운명으로 유도된 세포가 생존하였고, 대조군에 비해 그라프팅된 동물에서 검출가능한 ACTH 수준을 증가시켰음을 나타낸다.
도 71은 유도된 뇌하수체 호르몬 방출 세포의 혼합물이 뇌하수체 절제된 래트 내로 그라프팅된 경우, ACTH 수준이 3 마리의 그라프팅된 동물 중 2 마리에서 증가하는 것으로 나타났음을 보여준다.

정의

신호전달 표적 또는 신호전달 표적 경로의 저해에 대해 본원에서 이용되는 용어 "저해제"는 처리되지 않은 세포, 또는 처리된 세포 또는 조직을 저해하지 않는 화합물로 처리된 세포와 비교된 경우, 생성 표적 분자 또는 표적 화합물 또는 표적 공정, 예컨대 특정한 분화 결과를 방해하는(즉 감소시키거나 제거하거나 억제하는) (예를 들어, 디폴트 세포 유형 분화를 촉진하는 활성 신호전달 경로를 억제함으로써 디폴트가 아닌 세포 유형으로의 분화를 유도하는) 화합물을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "Small Mothers Against Decapentaplegic" 또는 "SMAD"는 신호전달 분자를 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "신경 세포" 또는 "뉴론 세포"는 생체내에서 신경계의 일부가 될 것이고, 배양 중에서는 본 발명의 방법에 의해 수득되는 세포, 예를 들어, CNS 선조 세포, 운동뉴론 및 도파민성 뉴론의 패턴화 가능한(즉 추가 분화를 거칠 수 있는 세포) 뉴론 모집단, 기원판 전구체 세포, 고효율 운동 뉴론 세포 등을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "고효율 운동 뉴론 세포"는 전류를 전도할 수 있는 뉴론 세포를 나타낸다.

일반적으로 세포, 예컨대 "세포 운명 결정"에 대한 용어 "운명"은 그 자손 세포가 생체내 또는 시험관내 배양 조건에 따라 다양한 세포 유형 또는 소수의 특정한 세포 유형이 될 수 있는 유전적으로 결정된 계통을 갖는 세포를 나타낸다. 다시 말하면, 세포의 미리 결정된 운명은 세포가 또 다른 세포 유형 대신 하나의 세포 유형, 예를 들어 그 "신경 운명"이 근육 세포 또는 피부 세포 대신 신경 세포가 되는 것인 줄기 세포의 자손 세포가 되도록 특정한 분화 경로에 대해 운명지워진 그 환경에 의해 결정된다. 전형적으로, 세포의 "운명"은 고도로 특정한 조건 하를 제외하고는 비가역적이다. 또 다른 예에서, "CNS 운명"은 중추 신경계와 연관되는 세포가 될 수 있는 세포를 나타낸다. 반대로, 신경 세포가 될 운명의 세포는 "신경 선조 세포"로 불릴 수 있다.

본원에서 이용되는 용어 "신경 선조 세포"는 신경계의 일부를 형성할 수 있는 세포, 예컨대 신경 세포, 신경아교 세포 등을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "뉴론 하위유형"은 뉴론계의 임의 세포, 예컨대 도파민 발현 뉴론, peripherin+ 뉴론, 운동 뉴론 세포 등을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "신경 계통의 세포"는 신경 전구체 경로를 따라 분화된 세포를 나타낸다.

세포에 대해 본원에서 이용되는 용어 "기원판"은 감각 신경계와 연관된 세포가 될 수 있는 세포를 나타낸다. 한 구현예에서, 기원판 세포는 Six1+에 대해 양성, p75에 대해 양성인 반면 HNK1에 대해 음성이다. 한 구현예에서, 본 발명의 방법을 이용해서 수득되는 기원판 세포는 수정체 세포를 형성할 수 있다.

세포에 대해 본원에서 이용되는 용어 "샘하수체 전구체"는 그 생체내 자손 세포가 뇌하수체 샘일 것이거나 그 일부가 될 세포를 나타낸다. 본 발명의 샘하수체 전구체 세포는 Lhx3 및 CGA를 발현할 수 있는 세포를 나타낸다.

유전자 또는 단백질에 대해 본원에서 이용되는 용어 "발현하는"은 분석, 예컨대 마이크로어레이 분석, 항체 염색 분석 등을 이용해서 관찰될 수 있는 mRNA 또는 단백질의 제조를 나타낸다.

신호전달 분자 또는 신호전달 분자의 경로 저해에 대해 본원에서 이용되는 용어 "SMAD 저해제", 예컨대 SMAD 신호전달의 저해제는 분자 또는 경로의 신호전달 기능을 방해하는(즉 감소시키거나 제거하거나 억제하는) 화합물을 나타낸다. 한 구현예에서, 본 발명의 저해제는 디폴트로부터 디폴트가 아닌 세포 유형으로의 분화를 유도하거나(변화시키거나) 변형한다, 예를 들어 SMAD 신호전달의 두 저해제를 포함하는 본 발명의 방법 중 하나는 디폴트가 아닌 신경 선조 세포를 생성한다.

본원에서 이용되는 용어 "Small Mothers Against Decapentaplegic" 또는 "SMAD"는 신호전달 분자를 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "세포 분화"는 덜 특화된 세포(즉 줄기 세포)가 보다 구별되는 형태 및 기능(즉 신경판)을 보유하도록 발달하거나 성숙하는 경로를 나타낸다.

분화하는 세포계에서의 세포에 대해 이용되는 본원에서 이용되는 용어 "분화"는 세포가 하나의 세포 유형(예로, 다능, 만능성 또는 다능성 분화 가능한 세포)에서 또 다른 세포 유형, 예컨대 표적 분화된 세포로 분화하는 공정을 나타낸다.

경로에 대해 본원에서 이용되는 용어 "세포 분화"는 덜 특화된 세포(즉 줄기 세포)가 보다 구별되는 형태 및/또는 기능을 보유하여 보다 특화된 세포 또는 분화된 세포(즉 신경 세포, 신경판 세포, 뇌하수체 세포, 부신 세포 등)로 발달하거나 성숙하거나 분화하는 공정을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "신경 줄기 세포" 또는 "NSC"는 생체내에서 신경, 성상교세포, 희소돌기아교세포, 신경아교 세포 등이, 그리고 배양 중에서 뉴론 세포 자손 및 신경아교 자손이 될 수 있지만 여러 지역-특이적 뉴론 유형에 대한 이들의 시험관내 분화능이 낮은 세포를 나타낸다.

세포 분화 경로에 대해 본원에서 이용되는 용어 "디폴트" 또는 "수동"은 특정 화합물로 처리하지 않은 경우, 즉 정상 세포 배양 조건에서 덜 특화된 세포가 배양 중 특정한 분화된 세포 유형이 되는 경로를 나타낸다. 다시 말하면, 디폴트 세포는 세포가 분화된 세포 유형을 변화시킬 수 있는 분자(즉, 형태원)에 의해 접촉되지 않는 경우 생성된다. 대조적으로, 세포에 대해 "디폴트가 아닌"은 디폴트 세포와 상이하게 나타나는 분화된 세포 유형을 나타낸다, 즉 디폴트가 아닌 세포는 디폴트가 아닌 조건으로부터 생성된 분화된 세포 유형, 예컨대 도파민 양성 신경 세포, 바닥판 세포, 후방 FP 조직 등을 포함하는 본 발명의 세포이다. 디폴트 세포는 또한 세포가 후속 형태원 화합물 없이 디폴트가 아닌 세포가 되는 형태원과 접촉한 후의 디폴트 세포, 예컨대 후속으로 본 발명의 디폴트가 아닌 세포의 디폴트 후방 FP 세포가 되는 디폴트가 아닌 바닥판 세포일 수 있다.

SMAD 분자에 대해 본원에서 이용되는 용어 "단독이량체"는, 예컨대 디설파이드 연결에 의해 함께 연결된 적어도 2 개 분자의 SMAD를 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "Noggin"은 신호전달 단백질의 전환 성장 인자-베타(TGF-β) 수퍼패밀리의 구성원, 예컨대 뼈 형태형성 단백질-4(BMP4)에 결합하고 이를 비활성화하는 분비된 단독이량체성 당단백질을 나타낸다. Noggin은 전형적으로 당화된, 디설파이드-연결된 이량체로 인간 세포에서 발현되는 65 kDa 단백질이다(Groppe, et al., (2002). Nature 420, 636-642; Xu, et al., (2005) Nat Methods 2, 185-190; Wang, et al., (2005) Biochem Biophys Res Commun 330, 934-942). Noggin 아미노산 서열의 한 예는 접근 # U79163 단일 아미노산 마우스 Noggin(서열번호 50)이다:

본원에서 이용되는 용어 "SB431542"는 CAS 번호 301836-41-9, 분자식 C₂₂H₁₈N₄O₃, 및 명칭 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아미드를 갖는 분자를 나타내며, 예를 들어 아래 구조를 참고하라:

본원에서 이용되는 용어 "도르소몰핀"은 CAS 번호 866405-64-3, 분자식 C₂₄H₂₅N₅O 및 명칭 6-[4-[2-(1-피페리디닐)에톡시]페닐]-3-(4-피리디닐)-피라졸로[1,5-a]피리미딘 디하이드로클로라이드를 갖는 분자를 나타내며, 예를 들어 하기 구조를 참고하라.

본원에서 이용되는 용어 "Lefty"는 비제한적으로 "EBAF" 또는 "자궁내막 출혈 연관 인자" 또는 "좌우 결정 인자 A" 전환 성장 인자 베타 수퍼패밀리))로도 알려진, LEFTY 1, LEFTY2, LEFTYA 등을 포함하는 TGF-베타를 저해하는 전환 성장 인자 베타 수퍼패밀리의 신규 구성원을 나타낸다. Lefty 단백질은 포유류에서 기관계의 좌-우 비대칭 결정을 위해 필요하다.

본원에서 이용되는 용어 "Activin"은 전환 성장 인자-베타(TGF-β) 수퍼패밀리의 구성원, 예컨대 Activin A, Activin B 등을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "전환 성장 인자 베타" 또는 "TGF-β"는 다양한 유형의 세포의 성장 및 분화를 조절하는 사이토카인을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "nodal"은 신호전달 분자의 TGF-β 패밀리 구성원을 나타낸다. Nodal 신호전달은 신경외배엽 디폴트 경로에 따른 인간 배아 줄기 세포의 분화를 저해한다(Vallier, et al., Dev. Biol. 275, 403-421.

본원에서 이용되는 용어 "ALK" 또는 "역형성 림프종 키나아제" 또는 "역형성 림프종 수용체 티로신 키나아제" 또는 "Ki-1"은 막 연관 티로신 키나아제 수용체를 나타낸다.

유형 I 세린/트레오닌 키나아제 수용체에 대해 본원에서 이용되는 용어 "ALK4"는 activin에 결합하여 activin 수용체로서 기능하는 역형성 림프종 수용체 티로신 키나아제 4 수용체를 나타낸다.

유형 I 세린/트레오닌 키나아제 수용체에 대해 본원에서 이용되는 용어 "ALK5"는 TGF-β1에 결합하여 TGF-β1 수용체로서 기능하는 역형성 림프종 수용체 티로신 키나아제 5 수용체를 나타낸다.

유형 I 세린/트레오닌 키나아제 수용체에 대해 본원에서 이용되는 용어 "ALK7"은 Nodal 및 Nodal-관련 단백질에 결합하여 Nodal 및 Nodal-관련 단백질로 기능하는 역형성 림프종 수용체 티로신 키나아제 7 수용체를 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "paired box 유전자 6" 또는 "PAX6"은 디폴트가 아닌 신경 선조 세포의 마커를 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "키트"는 물질을 전달하기 위한 임의의 전달계를 나타낸다. 세포 분화의 맥락에서, 키트는 줄기 세포를 접촉시키기 위한 물질 조합을 나타낼 수 있고, 이러한 전달계에는 하나의 위치에서 또 다른 위치로 적절한 용기(예로 튜브 등) 내의 반응 시약(예로, 화합물, 단백질, 검출 제제(예컨대 PAX6 항체) 등 및/또는 지지 물질(예로 완충액, 세포 분화 수행용 서면 지침 등)의 보관, 수송 또는 전달을 허용하는 시스템이 포함된다. 예를 들어, 키트에는 관련 반응 시약(예컨대 Noggin(또는 Noggin 치환물) 및 SB431542(또는 SB431542 대체제) 등) 및/또는 지지 물질을 함유하는 하나 이상의 인클로저(예로, 상자, 또는 가방 등)가 포함된다.

세포에 대해 본원에서 이용되는 용어 "분화 유도"는 디폴트 세포 유형(유전형 및/또는 표현형)에서 디폴트가 아닌 세포 유형(유전형 및/또는 표현형)으로의 변화를 나타낸다. 따라서 "줄기 세포에서의 분화 유도"는 줄기 세포와 상이한 특징, 예컨대 유전형(즉 유전적 분석, 예컨대 마이크로어레이에 의해 결정되는 유전자 발현의 변화) 및/또는 표현형(즉 단백질, 예컨대 PAX6 또는 단백질 세트의 발현 변화, 예컨대 HMB45 양성(+)이지만 SOX10에 대해 음성(-)을 갖는 자손 세포로 분열하도록 하는 세포를 유도하는 것을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어인 본 발명의 화합물과 세포를 "접촉시키는"은 "접촉된" 세포를 생성하기 위해 세포를 터치할 수 있도록 할 위치에 화합물을 배치하는 것을 나타낸다. 접촉은 임의의 적합한 방법을 이용해서 달성될 수 있다. 예를 들어, 한 구현예에서, 접촉은 화합물을 세포 튜브에 첨가하여 수행된다. 접촉은 또한 화합물을 세포 배양으로 첨가하여 달성될 수 있다.

본원에서 이용되는 용어 "줄기 세포"는 만능성 또는 다능성 또는 다능이고, 하나 이상의 상이한 세포 유형, 예컨대 배아 줄기 세포, 기관으로부터 단리된 줄기 세포, 예를 들어 피부 줄기 세포로 분화할 수 있는 세포를 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "배아 줄기 세포"는 줄기 세포 라인, 예컨대 WA-09의 세포, 또는 배아 또는 태반 또는 탯줄에서 단리된 세포를 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "성체 줄기 세포"는 출생 후 개체로부터 유도된 줄기 세포를 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "신경 줄기 세포" 또는 "NSC"는 생체내에서 뉴론, 성상교세포, 희소돌기아교세포, 및 신경아교 세포, 그리고 배양 중에 뉴론 세포 자손 및 신경아교 자손이 될 수 있지만 여러 지역-특이적 뉴론 유형으로의 이들의 시험관내 분화능은 낮은 세포를 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "중배엽 세포 라인"은 중배엽 세포와 연관된 특징을 나타내는 세포 라인을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "내배엽 세포 라인"은 보통 내배엽 세포와 연관된 특징을 나타내는 세포 라인을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "신경 세포 라인"은 보통 신경 세포와 연관된 특징을 나타내는 세포 라인을 나타낸다. 이러한 특징의 예에는 비제한적으로 FOXA2, SHH, Netrin-1, F-Spondin 등의 발현이 포함된다.

본원에서 이용되는 용어 "만능성"은 분화된 개체에서 임의 유형의 세포뿐만 아니라 체외 배아 물질, 예컨대 태반 등의 세포로 분화하는 세포의 능력을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "다능성"은 임의의 분화된 세포 유형으로 분화할 수 있는 세포 라인을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "다능"은 적어도 2 개의 분화된 세포 유형으로 분화할 수 있는 세포 라인을 나타낸다.

분화하는 세포계에서의 세포에 대해 이용되는 본원에서 이용되는 용어 "분화"는 세포가 하나의 세포 유형(예로, 다능, 만능성 또는 다능성 분화 가능한 세포)에서 또 다른 세포 유형, 예컨대 표적 분화된 세포로 분화하는 공정을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "세포 배양"은 세포의 임의의 시험관내 배양을 나타낸다. 상기 용어 내에는 연속적 세포 라인(예로, 불멸 표현형을 갖는 것), 일차 세포 배양, 유한 세포 라인(예로, 형질전환되지 않은 세포), 및 난모세포 및 배아를 포함하는 시험관내 유지된 임의의 다른 세포 모집단이 포함된다.

본원에서 이용되는 용어 "시험관내"는 인공적 환경 및 인공적 환경 내에서 일어나는 공정 또는 반응을 나타낸다. 시험관내 환경은 비제한적으로 시험관 및 세포 배양으로 구성될 수 있다. 용어 "생체내"는 천연 환경(예로, 동물 또는 세포) 및 천연 환경 내에서 일어나는 공정 또는 반응을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "신경판" 또는 "수판"은 발달 중인 배아의 중앙부 지역에서 외배엽의 비후화된 밴드(신경관의 페어링되지 않은 배의 세로 구역)를 나타내며, 이는 신경관 및 신경 능선으로 발달한다(분화한다); 도 12를 참고하라. 배아 발달 동안, 신경판 세포는 일련의 발달 단계를 거친 후 중추 신경계의 뇌, 척추, 및 다른 조직을 형성하는 세포로 발달한다.

본원에서 이용되는 용어 "바닥판" 또는 "FP" 또는 "배 플레이트" 또는 "기저판" 또는 "신경 바닥판"은 신경판의 중간선에서 발달하는 세포 영역을 나타내며, 신경관의 배 중간선에 위치한다, 도 12를 참고하라.

세포에 대해 본원에서 이용되는 용어 "신경 바닥판 세포" 또는 "FP 세포" 또는 "바닥판 세포"는 신경 바닥판에서 발달 중인 배아에서 확인되는 "특화된 신경상피 세포"로도 불리는 세포군을 나타낸다. 시험관내 FP 세포는 다른 세포에서 확인되지 않는 생체내 FP 세포에서 또한 확인되는 특정한 세포 마커를 발현하는 세포이다.

본원에서 이용되는 용어 "지붕판" 또는 "날개판" 또는 "등 지붕판"은 신경관의 페어링되지 않은 등의 세로 구역의 신경관 영역을 형성하고 형성되는 등 지역에 배치된 세포군을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "신경관"은 신경외배엽 세포가 뇌 세포 및 척추 세포로 분화할 수 있도록 신경 홈의 폐쇄에 의해 초기 배아의 신경외배엽 세포로부터 형성되는 신경상피 세포의 중공 실린더형 구조를 나타낸다.

세포 또는 세포 영역에 대해 본원에서 이용되는 용어 "추정" 또는 "선조"는 적절한 조건 하에, 즉 적절한 성장 인자, 화합물, 세포외 신호, 세포내 신호 등과 접촉된 경우 발달할(분화할) 세포 유형 또는 세포 영역을 나타낸다. 예를 들어, "선조 뉴론"은 뉴론으로의 발달능을 갖는 세포를 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "도파민 뉴론" 또는 "도파민성 뉴론"은 일반적으로 도파민을 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. "중뇌 도파민 뉴론" 또는 "mDA"는 앞뇌 구조에서 추정 도파민 발현 세포 및 앞뇌 구조에서 도파민 발현 세포를 나타낸다.

세포 분화 경로에 대해 본원에서 이용되는 용어 "디폴트"는 분화된 세포 유형을 변화시키는 분자와 접촉되지 않은 경우 덜 특화된 세포가 특정한 분화된 세포 유형이 되는 경로를 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "세포 분화"는 덜 특화된 세포(즉 줄기 세포)가 보다 구별되는 형태 및 기능(즉 신경판)을 보유하도록 발달하거나 성숙되는 경로를 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "신경돌기 증식은 세포로부터 세포질의 연장된, 막-폐쇄된 돌기부의 관찰을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "부착된 세포"는 시험관내 성장하는 세포를 나타내며, 여기서 세포는 배양 디쉬의 바닥 또는 측면과 접촉하며, 부착된 세포는 세포외 기질 분자 등을 통해 디쉬와 접촉할 수 있다. 현탁 배양에서의 세포와 배치된다.

본원에서 이용되는 용어 "마커" 또는 "세포 마커"는 특정한 세포 또는 세포 유형을 확인시키는 유전자 또는 단백질을 나타낸다. 세포에 대한 마커는 하나의 마커에 제한되지 않을 수 있고, 마커는 지정된 마커군이 또 다른 세포 또는 세포 유형에서 하나의 세포 또는 세포 유형을 확인할 수 있도록 하는 마커 "패턴"을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 FP 세포는 비-FP 세포, 즉 FOXA2 음성 및 BF1 양성으로부터 FP 세포, 즉 FOXA2 양성 및 BF1 음성을 구별하는 하나 이상의 마커를 발현한다.

본원에서 이용되는 용어 "시험 화합물"은 본 발명의 세포를 제공하기 위해 이용된 임의의 화학적 대상체, 약제, 약물 등을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "로제트-단계 신경 세포" 또는 "R-NSC"는 중추 신경계(CNS) 및 말초 신경계(PNS) 세포(운명)를 형성할 수 있고 생체내 그라프트화가 가능한 넓은 분화능을 갖는 시험관내 신경 줄기 세포 유형을 나타낸다. 다시 말하면, 로제트-단계 신경 세포는 로제트 구조를 형성할 수 있고, 로제트-단계 신경 세포 모집단은 신경 분화의 특징을 갖는다.

세포에 대해 본원에서 이용되는 용어 "로제트 구조" 또는 "로제트"는 세포의 무리 또는 바퀴살 배열을 나타낸다.

특징에 대해 본원에서 이용되는 용어 "증가하는"은 대조군에서의 상기 특징과 비교된 경우, 예컨대 시험 화합물을 포함하고 및 포함하지 않고 배양된 인간 배야 줄기 세포에서의 마커의 양과 비교하는 경우, 더 큰 양의 특징을 나타낸다.

특징에 대해 본원에서 이용되는 용어 "감소하는"은 대조군에서의 상기 특징과 비교된 경우, 예컨대 시험 화합물을 포함하고 및 포함하지 않고 배양된 인간 배야 줄기 세포에서의 마커의 양과 비교하는 경우, 더 작은 양의 특징을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "단백질 기능 감소" 또는 "기능 손실"은 그 기능을 낮추기 위해, 예를 들어 차단 항체에 의해 DKK-1의 기능을 낮추기 위해 기능을 방해하거나 차단하는 것을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "뉴론 유도 화합물"은 세포 경로를 따라 분화를 유도하여 뉴론 세포로 이어지는 물질을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "수용체의 인산화를 차단하기 위한 제제"는 수용체 기능을 감소시키기 위한, 즉 인산화를 감소시키는 물질을 나타낸다.

분석에 대해 이용된 경우 본원에서 이용되는 용어 "반응"은 검출가능한 신호의 생성(예로, 리포터 단백질의 축적, 이온 농도의 증가, 검출가능한 화학적 산물의 축적)을 나타낸다.

용어 "샘플"은 그 가장 광의의 개념으로 이용된다. 하나의 개념에서, 이는 세포 또는 조직을 나타낼 수 있다. 또 다른 개념에서, 이는 임의의 원천으로부터 수득된 표본 또는 배양을 포함하려는 것이며, 유체, 고체 및 조직을 포괄한다. 환경적 샘플에는 환경적 물질, 예컨대 표면 물질, 토양, 물 및 산업용 샘플이 포함된다. 이들 예는 본 발명에 적용 가능한 샘플 유형을 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.

본원에서 이용되는 용어 "정제된", "정제하기 위해", "정제", "단리된", "단리하기 위해", "단리" 및 이들의 문법적 균등물은 샘플로부터 적어도 하나의 오염물질의 양 감소를 나타낸다. 예를 들어, 세포 유형은 바람직하지 못한 세포 유형, 예컨대 비FP 세포로부터의 단리된 분화된 FP 세포, 예컨대 혼합된 세포 배양물에 존재하는 세포의 양이 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 및 가장 바람직하게는 적어도 90% 감소되어 정제된다. 따라서 세포 유형의 정제는 "농축", 즉 샘플에서 뉴클레오타이드 서열의 양 증가를 일으킨다.

물체(예컨대 세포, 조직 등) 및/또는 화학물질(예컨대 단백질, 아미노산 서열, 핵산 서열, 코돈 등)에 적용된 경우, 본원에서 이용되는 용어 "천연 생성"은 물체 및/또는 화합물이 자연에서 확인됨을/확인되었음을 의미한다. 예를 들어, 천연 생성 세포는 자연에서의 원천으로부터 단리될 수 있는 개체에 존재하는 세포, 예컨대 배아 세포를 나타내며, 여기서 세포는 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 개질되지 않았다.

본원에서 이용되는 용어 "시험관내"는 인공적 환경 및 인공적 환경 내에서 일어나는 공정 또는 반응을 나타낸다. 시험관내 환경은 비제한적으로 시험관 및 세포 배양을 예시한다.

본원에서 이용되는 용어 "생체내"는 천연 환경(예로, 동물 또는 세포) 및 천연 환경 내에서 일어나는 공정 또는 반응, 예컨대 배아 발달, 세포 분화, 신경관 형성 등을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "증식"은 세포수의 증가를 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "리간드"는 제2 분자에 결합하는 분자를 나타낸다. 특정한 분자는 리간드 및 제2 분자 중 어느 하나 또는 둘 다에 나타낼 수 있다. 제2 분자의 예에는 리간드의 수용체, 및 리간드에 결합하는 항체가 포함된다.

본원에 개시된 임의의 세포에 대해 언급되는 경우 용어 "에서 유도된" 또는 "에서 구축된" 또는 "에서 분화된"은 임의의 조작, 예컨대 비제한적으로 단일 세포 단리, 생체내 배양, 처리 및/또는 예를 들어 단백질, 화학물질, 방사선, 바이러스를 이용한 감염, DNA 서열, 예컨대 형태원을 이용한 전달감염 등을 이용한 돌연변이화, 배양된 모체 세포에 함유되는 임의 세포의 선택을 이용해서(예컨대 일련의 배양에 의해) 세포 라인, 조직(예컨대 해리된 배아, 또는 유체 중 모체 세포로부터 수득된(예로, 단리된, 정제된 등) 세포를 나타낸다. 유도된 세포는 성장 인자, 사이토카인, 사이토카인 처리의 선택된 진행, 접착성, 접착성 부재, 정렬 절차 등으로의 반응에 의해 혼합된 모집단으로부터 선택될 수 있다.

본원에서 이용되는 용어 "생물학적으로 활성인"은 구조화된, 조절성, 및/또는 생화학적 기능을 갖는 분자(예로 펩타이드, 핵산 서열, 탄수화물 분자, 유기 또는 무기 분자 등)를 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "일차 세포"는 배양의 부재 하에 동물의 조직(예로 혈액) 또는 기관으로부터 직접 수득되는 세포이다. 전형적으로, 반드시는 아니지만, 일차 세포는 노쇠 및/또는 증식의 정지 전에 시험관내에서 10 회 이하의 계대를 거칠 수 있다. 대조적으로, "배양된 세포"는 10 회 이상의 계대를 위해 시험관내 유지되고/되거나 증식된 세포이다.

본원에서 이용되는 용어 "배양된 세포"는 동일한 원천으로부터의 일차 세포와 비교된 경우, 증식의 정지 및/또는 노쇠 전에 시험관내에서 더 많은 수의 계대를 거칠 수 있는 세포를 나타낸다. 배양된 세포에는 "세포 라인" 및 "일차 배양된 세포"가 포함된다.

본원에서 이용되는 용어 "세포 배양"은 세포의 임의의 시험관내 배양을 나타낸다. 상기 용어 내에는 연속적 세포 라인(예로 불멸 표현형을 갖는 것), 일차 세포 배양, 유한 세포 라인(예로, 형질전환되지 않은 세포), 및 배아 및 배아 세포를 포함하는 시험관내 유지된 임의의 다른 세포 모집단이 포함된다.

본원에서 이용되는 용어 "세포 라인"은 일차 세포 라인, 유한 세포 라인, 연속적 세포 라인, 및 형질전환된 세포 라인을 포함하는 시험관내 배양되는 세포를 나타내지만, 세포가 배양 중 무한한 수의 계대를 거칠 수 있을 필요는 없다. 세포 라인은 자연적으로 또는 형질전환에 의해 생성될 수 있다.

본원에서 이용되는 용어 "일차 세포 배양" 및 "일차 배양"은 생체내 세포로부터, 예컨대 동물 조직으로부터 직접 수득된 세포 배양을 나타낸다. 이들 배양은 성체뿐만 아니라 태아 조직으로부터 유도될 수 있다.

본원에서 이용되는 용어 "단층", "단층 배양" 및 "단층 세포 배양"은 기재에 부착하였고 하나의 세포 두께인 층으로 성장하는 세포, 다시 말하면 "부착된 세포"를 나타낸다. 단층은 비제한적으로 플라스크, 튜브, 커버슬립(예로 셸 바이알), 롤러 병 등을 포함하는 임의의 포맷으로 성장할 수 있다.

본원에서 이용되는 용어 "영양세포 세포층" 또는 "영양세포 세포 모집단"은 인접한 세포를 위한 부착성 분자 및/또는 성장 인자를 제공하기 위해 이용되는, 예를 들어 다능성 줄기 세포를 유지하기 위해 공동-배양에서 이용되는 세포 단층을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "현탁" 및 "현탁 배양"은 기재에 부착되지 않고 생존하고 증식하는 세포를 나타낸다. 현탁 배양은 전형적으로 조혈 세포, 형질전환된 세포 라인 및 악성 종양으로부터의 세포를 이용해서 생성된다.

본원에서 이용되는 용어 "배양 배지" 및 "세포 배양 배지"는 시험관내 세포(즉, 세포 배양, 세포 라인 등)의 성장을 지지하기 적합한 배지를 나타낸다. 본 용어가 임의의 특정한 배양 배지에 제한되려는 것은 아니다. 예를 들어, 본 정의는 증식뿐만 아니라 유지 배지를 포괄하려는 것이다. 실제로, 본 용어는 관심 세포 배양 및 세포의 성장에 적합한 임의의 배양 배지를 포괄하려는 것이다.

용어 "세포 생물학" 또는 "세포성 생물학"은 생활성 세포, 예컨대 세포의 해부구조 및 기능, 예를 들어 세포의 생리적 특성, 구조, 소기관, 이들의 환경과의 상호작용, 이들의 생활 주기, 분열 및 사멸의 연구를 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "세포"는 단일 세포뿐만 아니라 (하나를 초과하는) 세포의 모집단을 나타낸다. 모집단은 하나의 세포 유형을 포함하는 순수한 모집단, 예컨대 뉴론 세포의 모집단 또는 분화되지 않은 배아 세포의 모집단일 수 있다. 대안적으로, 모집단은 하나를 초과하는 세포 유형을 포함할 수 있다, 예를 들어 혼합된 세포 모집단일 수 있다. 모집단에서 세포의 수를 제한하려는 것은 아니다, 예를 들어 혼합된 세포 모집단은 적어도 하나의 분화된 세포를 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 혼합된 모집단은 적어도 하나의 분화된 세포를 포함할 수 있다. 본 발명에서, 세포 모집단이 포함할 수 있는 세포 유형의 수에 제한은 없다.

염색에 대해 본원에서 이용되는 용어 "양성 세포"는 마커를 발현하고 이에 따라 대조군 또는 비교 세포를 초과하는 검출가능한 정량적 및/또는 정성적 양으로 그 마커에 대해 "염색되는" 세포를 나타낸다. 양성 세포는 또한 분자, 예컨대 FOXA2에 대해 염색되는 세포 등을 나타낼 수 있다.

본원에서 이용되는 용어 "음성 세포"는 마커에 대해 검출가능한 신호가 없는 세포, 예컨대 FOXA2 항체 검출 방법 등과의 접촉 후 염색되지 않는 세포를 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "꼬리화"는 배아 발달 동안 등화된 외배엽에서 신경 발달의 후방 경로의 개시를 나타낸다, 예를 들어 등화된 외배엽은 꼬리화 정도에 따라 다양한 수준의 후방 신경 조직으로 발달한다.

본원에서 이용되는 용어 "꼬리화 제제" 또는 "꼬리화 인자"는 꼬리화를 유도하는 화합물, 예컨대 Wnt-1 및 레티노산(RA)을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "리포터 유전자" 또는 "리포터 구축물"은 쉽게 검출가능하거나 쉽게 분석 가능한 단백질, 예컨대 유색 단백질, 형광 단백질 또는 효소, 예컨대 베타-갈락토시다제(lacZ 유전자)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전적 구축물을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "유전자 표적화"는 그 발현이 적합하게 조절될 수 있는 부위에서 세포 게놈 내로의 외인성 DNA의 통합을 나타낸다. 상기 통합은 상동성 재조합의 결과로 일어난다.

본원에서 이용되는 "녹-인" 접근은 상동성 재조합을 통해 숙주 세포에서 특정 유전자위 내로 원하는 핵산 서열, 예컨대 리포터 유전자를 인코딩하는 서열을 삽입하는 절차를 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "게놈"은 개체의 유전 물질(예로, 염색체)을 나타낸다.

용어 "관심 뉴클레오타이드 서열"은 임의의 뉴클레오타이드 서열(예로, RNA 또는 DNA)을 나타내며, 본 기술분야의 통상의 기술자에 의한 그 조작은 임의의 사유(예로, 질병 치료, 개선된 품질 부여, 숙주 세포에서 관심 단백질의 발현, 리보자임의 발현 등)에 대해 바람직한 것으로 간주될 수 있다. 이러한 뉴클레오타이드 서열에는 비제한적으로 구조 유전자(예로, 리포터 유전자, 선택 마커 유전자, 종양유전자, 약물 내성 유전자, 성장 인자 등)의 코딩 서열, 및 mRNA 또는 단백질 산물을 인코딩하지 않는 비-코딩 조절 서열(예로, 프로모터 서열, 폴리아데닐화 서열, 중지 서열, 인핸서 서열 등)이 포함된다.

본원에서 이용되는 용어 "관심 단백질"은 관심 핵산에 의해 인코딩된 단백질을 나타낸다.

본원에서 이용되는 용어 "외인성 유전자"는 숙주 개체 또는 세포에 천연 존재하지 않거나 숙주 개체 또는 세포 내로 인공적으로 도입되는 유전자를 나타낸다.

용어 "유전자"는 폴리펩타이드 또는 전구체(예로, 프로인슐린)의 생산을 위해 필요한 코딩 서열을 포함하는 핵산(예로, DNA 또는 RNA) 서열을 나타낸다. 폴리펩타이드는 전장 또는 단편의 원하는 활성 또는 기능적 특성(예로, 효소 활성, 리간드 결합, 신호 전달 등)이 보유되는 한, 전장 코딩 서열 또는 코딩 서열의 임의의 부분에 의해 인코딩될 수 있다. 본 용어는 또한 구조 유전자의 코딩 지역을 포괄하며, 유전자가 전장 mRNA 길이에 대응하도록 어느 한 말단에서 약 1 kb 이상의 거리에 대해 5' 및 3' 말단 둘 다에서의 코딩 지역에 인접하여 배치된 서열이 포함된다. 코딩 지역의 5'에 배치되고 mRNA 상에 존재하는 서열은 5' 미번역 서열로 불린다. 코딩 지역의 3' 또는 하류에 배치되고 mRNA 상에 존재하는 서열은 3' 미번역 서열로 불린다. 용어 "유전자"는 유전자의 cDNA 및 게놈 형태를 둘 다 포함한다. 유전자의 게놈 형태 또는 클론은 "인트론" 또는 "개입 지역" 또는 "개입 서열"로 명명된 비-코딩 서열로 단속되는 코딩 지역을 함유한다. 인트론은 핵 RNA(hnRNA)로 전사되는 유전자 분절이다; 인트론은 조절 요소, 예컨대 인핸서를 함유할 수 있다. 인트론은 핵 또는 일차 전사체로부터 제거되거나 "스플라이스 아웃"된다; 따라서 인트론은 메신저 RNA(mRNA) 전사체에 존재하지 않는다. mRNA는 번역 동안 신생 폴리펩타이드에서 아미노산의 서열 또는 순서를 특정하는 기능을 한다.

본원에서 이용되는 용어 "유전자 발현"은 유전자의 "전사"를 통해(즉, RNA 폴리머라제의 효소 작용을 통해) 유전자에서 인코딩된 유전 정보를 RNA(예로, mRNA, rRNA, tRNA, 또는 snRNA)로 그리고 단백질을 인코딩하는 유전자에 있어서는 mRNA의 "번역"을 통해 단백질로 전환하는 공정을 나타낸다. 유전자 발현은 공정 내 여러 단계에서 조절될 수 있다. "상향-조절" 또는 "활성화"는 유전자 발현 산물(즉, RNA 또는 단백질)의 생산을 증가시키는 조절을 나타내는 반면, "하향-조절" 또는 "억제"는 생산을 감소시키는 조절을 나타낸다. 상향-조절 또는 하향-조절에 관여되는 분자(예로, 전사 인자)는 종종 "활성화제" 및 "억제물질"로 각각 불린다.

본원에서 이용되는 용어 "인코딩하는 핵산 분자", "인코딩하는 DNA 서열", "인코딩하는 DNA", "인코딩하는 RNA 서열" 및 "인코딩하는 RNA"는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산 가닥을 따른 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드의 순서 또는 서열을 나타낸다. 이들 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드의 순서는 폴리펩타이드(단백질) 사슬을 따라 아미노산의 순서를 결정한다. 따라서 DNA 또는 RNA 서열은 아미노산 서열을 코딩한다. 본원에서 이용되는 용어 "갖는 것으로 추정되는"은 감별 진단을 제공하기 불충분한, 환자가 나타내는 의학적 병태 또는 의학적 병태 세트(예로, 예비 증상)를 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 나타난 병태(들)는 진단이 기반하는 추가 정보를 수득하기 위한 추가 시험(예로, 자가항체 시험)을 정당화할 것이다.

본원에서 이용되는 용어 "에 대한 위험에 처한"은 환자를 특정한 질병 또는 병에 걸리기 쉽게 할 수 있는 환자가 나타내는 의학적 병태 또는 의학적 병태 세트를 나타낸다. 예를 들어, 이들 병태는 비제한적으로 행동적, 감정적, 화학적, 생화학적 또는 환경적 영향을 포함하는 영향으로부터 생성될 수 있다.

본원에서 이용되는 용어 "유효량"은 임상적으로 유익한 결과(즉, 증상 감소)를 달성하는 치료제를 포함하는 약학 조성물의 특정한 양을 나타낸다. 이러한 조성물의 독성 및 치료적 유효성은, 예로 LD50(모집단의 50%에 대한 치사 용량) 및 ED50(모집단의 50%에서 치료적으로 유효한 용량)을 결정하기 위해, 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 간 용량 비가 치료 지수이며, 비 LD50/ED50으로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 이들 세포 배양 분석 및 추가적인 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간 사용을 위한 투여량 범위의 제형화에서 이용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED50이 포함되는 순환 농도 범위 내에 있다. 투여형은 채용되는 투여형 형태, 환자의 감수성 및 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 변한다.

본원에서 이용되는 용어 "증상"은 환자에 의해 관찰되는 질병 또는 신체적 교란의 임의의 주관적 또는 객관적 증거를 나타낸다. 예를 들어, 주관적 증거는 보통 환자 자가-보고에 근거하며, 비제한적으로 통증, 두통, 시각적 교란, 오심 및/또는 구토가 포함될 수 있다. 대안적으로, 객관적 증거는 보통 비제한적으로 체온, 전체 혈구수, 지질 패널, 갑상샘 패널, 혈압, 심박, 심전도, 조직 및/또는 신체 조영 스캔을 포함하는 의학적 시험의 결과이다.

본원에서 이용되는 용어 "질병" 또는 "의학적 병태"는 생명 기능의 수행을 방해하거나 개질하는 살아있는 동물 또는 식물 본체 또는 그 부분 중 하나의 정상 상태의 임의의 장애를 나타낸다. 전형적으로 구별되는 징후 및 증상에 의해 발현되며, 보통 하기에 반응한다: i) 환경적 요인(예컨대 영양실조, 산업적 유해물질 또는 기후); ii) 특정 감염제(예컨대 곤충, 박테리아, 또는 바이러스); iii) 개체의 내재적 결함(예컨대 유전적 이상); 및/또는 iv) 이들 요인의 조합.

치료받은 대상체에 비해 치료받지 않은 대상체에서 임의 증상의 발현에 대한 경우, 용어 "감소한다", "저해한다", "제거한다", "억제한다", "감소시킨다", "예방한다" 및 문법적 균등물("더 낮은", "더 적은" 등을 포함)은 치료받은 대상체에서 증상의 양 및/또는 크기가 치료받지 않은 대상체에서보다 임의의 의학적으로 훈련받은 개인에 의해 임상적으로 관련된 것으로 인지되는 임의의 양만큼 더 낮음을 의미한다. 한 구현예에서, 치료받은 대상체에서 증상의 양 및/또는 크기는 치료받지 않은 대상체에서 증상의 양 및/또는 크기에 비해 적어도 10% 미만, 적어도 25% 미만, 적어도 50% 미만, 적어도 75% 미만, 및/또는 적어도 90% 미만이다.

본원에서 이용되는 용어 "환자" 또는 "대상체"는 인간 또는 동물이며 입원할 필요는 없다. 예를 들어, 외래-환자, 가정 간호 개인도 "환자"이다. 환자는 임의 연령의 인간 또는 비-인간 동물을 포함할 수 있고, 이에 따라 성체 및 미성년체(즉, 어린이)가 포함된다. 용어 "환자"는 의학적 치료에 대한 필요성을 암시하려는 것이 아니며, 이에 따라 환자는 임상인지 또는 기초 과학 연구의 지지에서인지 여부와 무관하게 자연적으로 또는 비자연적으로 실험의 일부일 수 있다.

용어 "그라프팅하다", "그라프트화하다", "그라프트화", 또는 "이식"은 수신체 생체 조직 상에 공여체 생체 조직을 배치하는 임의의 방법을 나타낸다. 예를 들어, 복수의 생체 기원판 세포는 공여체 세포가 생활성으로 부착되고 정상 발달하도록 하는 조건 하에 수신체 생체 조직 상에 배치될 수 있다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 일반적으로 줄기 세포의 세포 생물학 분야, 보다 구체적으로 인간 배아 줄기 세포(hESC), 신체 줄기 세포, 및 신규한 배양 조건을 이용하여 유도된 인간 다능성 줄기 세포(hiPSC)를 포함하는 다능성 또는 다능 줄기 세포의 유도된 분화에 관한 것이다. 특히, 두개 기원판은 전-기원판 단계에서 추가 운명 전문화와 커플링된 신경 유도의 이중-SMAD 저해 전략에 의해 인간 다능성 줄기 세포로부터 유도된다. 본 방법은 기원판-유도된 삼차신경 신경절, 성숙 수정체 섬유 및 전방 뇌하수체 호르몬-생산 세포를 생성한다. 이들 세포의 적용에는 비제한적으로 감각 및 내분비 질병에서 인간 세포-기반 치료법이 포함된다.

I. 신경 분화 경로

비제한적으로 뼈 형태형성 단백질(BMPs), Nodal, 및 activin을 포함하는 전환 성장 인자(TGF-베타) 및 이들의 패밀리 구성원은 다양한 기관의 발달 및 유지에 관여될 수 있고, 여기서 줄기 세포는 유용한 역할을 담당한다. 배아의 외배엽 배엽층은 신경외배엽(중추 및 말초 신경계, 신경 능선 세포, 및 유도체)을 생성하는 것으로 여겨진다. 몇몇 라인의 증거는 신경 유도 동안 Smad 신호전달에 대한 역할을 제시한다. 일반적으로, Smad 단백질은 TGF-베타 수퍼패밀리 리간드의 하류이며, 이들의 특이적 수용체가 활성화되는 경우, 이들은 수용체-조절된 Smad(R-Smad: Smad1, Smad2, Smad3, Smad5 및 Smad 8로, Smad 2 및 3은 activin/nodal 및 TGF-베타 유형 I 수용체에 의해 특이적으로 활성화되며 Smad 1, 5, 및 8은 BMP 유형 I 수용체에 의해 활성화됨)의 인산화를 자극한다. 2 개의 구별되는 경로가 Smad 4 상에서 역 관계에 있다.

개구리에서의 연구는 Spearman 형성체에서 중추적 신경 유도 인자로서 chordin(Sasai, et al., Cell 79(5):779(1994)), follistatin(Hemmati-Brivanlou, et al., Cell 77(2):283(1994)), 및 noggin(Smith, et al., Cell 70(5):829(1992))을 포함하는 뼈 형태형성 단백질(BMP) 저해제를 확인하였다. 포유류 noggin(Valenzuela, et al., J Neurosci 15(9):6077(1995))은 필적하는 신경 유도 특성을 가지며, 재조합 Noggin을 이용한 처리가 몇몇 hESC 신경 유도 프로토콜에서 이용되었다(Lee, et al., Stem Cells 25(8): 1931(2007); Elkabetz, et al., Genes Dev 22(2): 152(2008)). 보다 최근에는, 약물 SB431542가 배아체(EB) 기반 hESC 신경 유도 프로토콜에서 신경 유도를 증강시키는 것으로 나타났다(Smith, et al., Dev Biol 313(1): 107(2008)). SB431542는 ALK4, ALK5, ALK7 수용체의 인산화를 차단함으로써 Lefty/Activin/TGFβ 경로를 저해한다. Noggin 또는 SB431542 처리는 신경 유도의 효율을 개선하는 반면, 어느 하나의 처리만으로는 정의된 또는 부착성 조건 하에 hESC를 신경 전환하기 위해 충분하지 않다.

II. 줄기 세포 배양 기법

강력하고 고도로 재현 가능한 조건 하에 줄기 세포를 배양하고 교차 오염 기회를 최소화하려는 시도는 완전히 성공적이지는 못했다. 잘 정의된 배지 및 방법을 구축하기 위한 시도는 치료제로서 줄기 세포의 사용을 위한 재현 가능성 및 정확성을 허용할 수 있고, 비-인간 첨가제 및 정의되지 않은 인자가 없는 배지 및 배양 조건을 구축하기 위한 움직임이 있어 왔다. 세포 배양 시스템의 개질은 여러 최근 특허의 초점이 되어 왔다. 본원에 참조로 도입된 미국 특허 번호 7,005,252는 섬유아세포 성장 인자(FGF) 및 영양세포 세포층의 존재 하에 그러나 임의의 동물 혈청의 부재 하에서의 영장류 배아 줄기 세포의 성장을 논의한다. 본원에 참조로 도입된 미국 특허 번호 7,297,539는 섬유아세포 성장 인자 함유 배지 중에, 그러나 영양세포층 없이 세포외 기질을 함유하는 시스템을 이용하는 다능성 줄기 세포의 성장을 논의한다. 본원에 참조로 도입된 미국 특허 번호 7,211,434는 다능성을 유지하기 위해 이용된 또 다른 사이토카인인 백혈병 저해 인자를 함유하는 혈청 비함유, 영양세포층 비함유 배지 중 포유류 배아 줄기 세포의 배양 방법을 기재한다. 배아 줄기 세포의 운명을 조절하기 위한 배지에 대한 첨가제로서의 특정한 그리고 정의된 화합물의 확인은 각각 본원에 참조로 도입된 미국 특허 번호 7,332,336, 7,294,510 및 7,252,995를 포함하는 여러 이용된 특허의 초점이다.

인간 줄기 세포는 세포-대체 치료법에서의 사용을 위해 제안되었고, 유도된 다능성 줄기 세포(hiPSCs)로의 체세포 재프로그래밍에서의 최근 진전은 재생 의약 및 질병 모델링에 대한 환자-특이적 세포 생성에 대한 문을 열어주었다(Takahasi et al, 2007; Kim, et al., Cell, 136(3):411-419(2009)). 그러나, 이들 접근법의 전체 잠재력을 구현하기 위해서는 정의되지 않은 인자, 예컨대 신경-유도 구멍(PAX6 또는 MS5 세포(Kawasaki, et al., 2000; Lee et al 2007))의 이용, 신경 자손의 선택적 생존에 기반한 프로토콜의 불량한 수율의 EB 분화의 불균질한 성질을 제거하는 개선된 분화 프로토콜이 필요하다. hESC에서 신경 시사를 위해 필요하고 충분한 신호전달 경로의 이해 및 선택적 유발이 상기 시도에서의 목표이다.

줄기 세포로부터 유도된 바와 같은 신경 줄기 세포 선조 및 신경 하위유형은 여러 과학 문헌 및 특허 출원의 초점이 되어 왔으나, 이들 개시에는 다수의 세포로 시작하고, 고도로 균질한 원하는 세포 운명을 달성하고, 부착성 조건 하에 영양세포-비함유 프로토콜을 이용하는 능력을 포함하는 줄기 세포 운명을 조절하기 위해 가장 바람직한 조건이 빠져 있다. [Shang, et al., and Reubinoff, et al., Nature Biotechnology 19, 1134 - 1140(2001)]에서는 신경 세포 유형의 수동 발달은 허용하지만 신경 분화는 조절할 수 없다.

III. 줄기 세포 분화

본원에 참조로 도입된 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0035285는 EB 및 로제트 형성에 기반하는 신경 세포의 생성 방법을 교시한다. 본원에 참조로 도입된 미국 특허 번호 6,833,269는 영양세포 세포 및 EB 형성의 이용에 기반하는 세포 분화를 제공한다. 본원에 참조로 도입된 미국 특허 번호 7,011,828, 및 본원에 참조로 도입된 출원 공개 번호 2005026747, 및 본원에 참조로 도입된 20060078543은 hESC의 농축 모집단의 증식을 교시하며, 이는 신경 선조 세포, 뉴론, 또는 신경아교 세포로 분화된다. 본원에 참조로 도입된 미국 특허 번호 6,887,706은 FGF2를 이용하여 heESC의 신경 선조 세포로의 분화 방법을 교시하며, 여기서 시험관내 분화는 FGF2의 제거 및 오르니틴 및 라미닌 기재 상의 평판접종에 의해 유도되었다. 미국 특허 번호 7,368,115는 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제-활성화 폴리펩타이드를 이용한 신경 줄기 세포 또는 신경 줄기 세포 자손의 분화를 교시한다.

본원에 참조로 도입된 [Erceg, et al., Stem Cells. January; 27(1): 78-87(2009)]의 리뷰에서, 저자는 신경 계통으로의 줄기 세포 분화의 최근 공개된 프로토콜의 가장 중요한 우려사항이 (i) 비-신경 세포 오염의 위험성; (ii) EB 형성에 기반하는 절차를 포함하는 줄기 세포 라인, 매트리겔 또는 컨디셔닝된 배지의 이용이 병원체 교차-전달의 위험성을 보유한다는 것임에 주목하였다. 상기 특허 또는 특허 출원 중 어느 것도 본 발명에 존재하는 조건 하에 줄기 세포로부터 신경 세포 계통의 균질한 모집단의 유도를 교시하지 않는다.

본 발명은 추가로, 특히 신경판 조직을 수득하기 위해, 인간 배아 줄기 세포(hESCs)로부터 유도된 신경 선조 세포의 모집단 수득 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 일부 방법은 도파민(DA) 신경 세포를 수득하기 위해 hESC에서 신경판 바닥의 발달을 유도한다. 추가로 본 발명의 일부 방법을 이용해서 수득된 신경판 바닥 조직이 분화 경로의 전환, 즉 패턴화를 위한 유도제로서 다른 조직과의 공동-배양에서 이용하기 위해 고려된다.

인간 ES 세포(hESs)에서 현재의 신경 유도 프로토콜은 배아체 형성, 간질 영양세포 공동-배양, 또는 선택적 생존 조건에 기반한다; 각각의 전략은 상당한 단점, 예컨대 잘 정의되지 않은 배양 조건, 오래 걸리는 분화 및 낮은 수율을 나타낸다.

한 구현예에서, 본 발명은 SMAD 신호전달의 두 저해제의 상승 작용을 포함하는 방법을 고려한다. 예를 들어, Noggin 및 SB431542는 부착성 배양 조건(이중 SMAD 저해 프로토콜) 하에 hESC의 신속하고 완전한 신경 전환을 유도하기 충분한 것으로 발견되었다. 시간적 운명 분석은 일시적인 FGF5+ 배아덩이 위판-유사 단계에 이어 로제트를 형성할 수 있는 PAX6+ 신경 세포를 드러낸다. 초기 세포 밀도가 CNS 대 신경 능선 자손의 비를 결정한다. hiPSC의 중뇌 도파민 및 척추 운동 뉴론으로의 유도된 분화는 신규한 유도 프로토콜의 강력함과 일반적 적용 가능성을 확인시켜준다. Noggin/SB4315242 기반 신경 유도는 재생 의약 및 질병 모델링에서 hESC 및 hiPSC의 이용을 크게 촉진하고, 간질 영양세포 또는 EB-기반 프로토콜에 대한 필요성을 제거한다. 또한, 상기 방법은 신경 세포가 유도되는 용이성, 수율 효율, 속도를 증강시킬 수 있는 배양 시스템으로 채택되었다. 이는 제한으로 간주되어서는 안 되며, 추가적인 분자 또는 성장 인자를 이용한 배양 또는 당분야의 다른 방법의 도입이 고려되었다.

몇몇 라인의 증거는 신경 유도 동안 SMAD 신호전달에 대한 역할을 나타낸다. Noggin 또는 SB431542 공동-처리는 신경 유도의 효율을 개선하지만, 어느 하나의 처리만으로는 정의된 또는 부착성 조건 하에 hESC를 신경 전환하기 충분하지 못하다. 본원에 나타낸 데이터는 Noggin 및 SB431542를 이용한 SMAD 신호전달의 조합된 차단이 완전한 신경 전환을 달성하고, EB- 또는 간질-영양세포 기반 프로토콜에 대한 필요성을 제거하기 충분한지 여부를 시험한다.

한 구현예에서, 본 발명은 hESC의 균질한 신경 분화를 유도하기 위해 균일한 세포 분포를 구축하는 방법을 고려한다. 상기 목적을 위해, 분화되지 않은 hESC는 단일 세포로 해리되고 ROCK 저해제, Y-27632가 보충된 컨디셔닝된 배지 중 매트리겔 코팅된 디쉬 상에 재-평판접종되었다(Wananabe, et al., 2007). 72 시간 후, 세포가 hESC 조건으로부터 Noggin, SB4315242 중 어느 하나, 또는 두 인자를 모두 함유하는 녹아웃 혈청 대체 배지(KSR)로 전환되었고, 총 11 일 동안 분화하도록 두었다(도 1a). 필수 공동-Smad, Smad 4의 핵 국소화 감소는 Noggin 및 SB431542가 둘 다 존재한 경우 24 시간 후에 관찰되었다(도 2). 신경 유도는 신경외배엽 분화의 초기 마커, PAX6의 발현에 의해 모니터링되었다(Callaerts, et al.,. Annu Rev Neurosci 20:483(1997).

Noggin 및 SB431542를 이용한 조합 처리는 Noggin 또는 SB431542가 단독 사용되었을 경우의 10% 미만의 PAX6⁺ 세포에 비해, 총 세포의 80%를 초과하도록 신경 유도 효율을 극적으로 증가시켰다(도 1b). 상승 작용은 예상치 못한 것이며, noggin 및 SB431542의 상승 작용에 기여할 수 있는 몇몇 잠재 기전이 존재한다. 이들에는 비제한적으로 activin- 및 Nanog-매개된 다능성 네트워크의 탈안정화(Xu, et al., Cell Stem Cell 3(2): 196(2008)), 영양막 계통으로의 BMP 유도된 분화의 억제(Xu, et al., Nat Biotechnol 20(12): 1261(2002)), 내인성 activin 및 BMP 신호의 저해에 의한 중배엽/내배엽 운명의 억제(D'Amou, et al., Nat Biotechnol 23(12):1534(2005)) 및 BMP 저해에 의한 원시 외배엽의 신경화 촉진(Laflamme, et al., Nat Biotechnol 25(9): 1015(2007))이 포함된다.

유전자 발현의 시간적 분석은 SB431542를 이용한 처리가 Nanog 발현의 신속한 손실(도 4) 및 CDX2 발현에서의 극적인 증가(도 1c)를 유도하였음을 드러내었다. 이들 데이터는 SB431542-매개된 다능성의 손실이 영양막 계통으로의 분화와 연관됨을 제시하였다. Noggin 또는 Noggin/SB431542의 존재 하에서 CDX2의 억제는 Noggin의 하나의 역할이 분화 시 영양막 운명을 유도하는 내인성 BMP 신호의 억제임을 나타낸다. Noggin/SB431542 처리된 배양에서의 SOX1의 현저한 유도는 이중 SMAD 저해 프로토콜에서 신경외배엽 계통을 향한 강력한 편향을 확인시켜주었다. 또한 대안적인 배아 배엽층의 억제, 예컨대 SOX17의 Noggin-매개된 억제(내배엽 계통) 및 Brachyury의 SB431542-매개된 억제(중배엽 계통)에 대한 증거가 존재한다(도 1c). 함께 취하면, 이들 결과는 SB431542 및 Noggin이 hESC의 효율적인 신경 전환을 달성하기 위해 여러 분화 단계에서 상승적으로 작용함을 시사한다.

두 저해제의 첨가 후 hESC 자손의 계통 진행이 특성규명되었다. 면역세포화학적 분석은 5 일 경에 OCT4 발현의 손실 및 7 일 경에 PAX 6의 강력한 발현을 나타내었다(도 1d). 이들 데이터는 OCT4 및 PAX6 둘 다에 대해 음성이었던 분화 5 일째에 중간체 세포 유형의 존재를 지적하였다. 유전자 발현 분석은 분화 5 일째에 그 발현이 신경 운명 수임 동안 유지되는 또 다른 배아덩이 위판 마커, Otx2의 고발현과 동시에 배아덩이 위판 마커 FGF5의 피크 발현을 드러내었다(도 1e). 발현되는 최초기 신경 마커는 SOX1(도 1f)로, 다른 신경상피 마커, 예컨대 ZIC1 또는 PAX6의 유도에 선행하며, 전방 CNS(FOXG1) 및 신경 능선(p75) 마커의 발현에 선행하였다. SOX1의 초기 유도는 SOX1 유도에 선행하는 PAX6 발현을 제시한 이전 연구와 구별된다(Munoz-Sanjuan, et al., Nat Rev Neurosci 3(4):271(2002)). 상기 불일치를 설명하기 위한 하나의 가능성은 SMAD 신호전달에 의한 SOX1 전사의 직접적 조정일 수 있다. 최근에, 세포 유형 특이적 프로모터의 조절 하에 GFP를 발현하도록 조작된 박테리아 인공 염색체(BAC)를 수반하는 안정한 마우스(Munoz-Sanjuan, et al., Nat Rev Neurosci 3(4):271(2002)) 및 hESC(Placantonakis, et al., Stem Cells 27(3):521-532(2009)) 트랜스제닉 리포터 라인을 구축하기 위한 방법들이 기재되었다. 본원에 제시된 데이터는 HES5 :: eGFP BAC 트랜스제닉 hESC 리포터 라인을 이용하여, 신경 유도의 효율을 측정하기 위한 신경 줄기 및 전구체 세포 자손을 표시한다(Tesar, Nature 448: 196-199(2007);(Placantonakis, et al., Stem Cells 27(3):521-532(2009)).

이중 SMAD 저해 프로토콜은 Noggin의 존재 하에 표준 MS5 프로토콜과 비교되었다(Perrier, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101(34): 12543(2004)). 상기 목적을 위해, HES5 :: eGFP 세포가 MS5 영양세포 또는 SB431542의 존재 하에 Noggin으로 보충된 배지 중에 평판접종되었고, GFP⁺ 세포가 두 조건 하에 쉽게 관찰되었을 때의 단계인 13 일 동안 분화하도록 두었다(도 4). GFP 발현이 유세포 측정에 의해 정량되었다. 개질되지 않은 H9 세포가 음성 대조군으로 이용되었다. MS5 세포는 세포 표면 분자 CD105에 대한 음성적 선택에 기반한 분석에서 배제되었다(도 5). 이중 SMAD 저해는 MS5/Noggin 프로토콜에 비해 13 일째에 3 배를 초과하는 증가인 82% GFP⁺ 세포를 산출하였다(도 1f).

hESC 콜로니의 저밀도 평판접종을 필요로 하는 MS5 프로토콜과는 대조적으로(Li, et al., Nat Biotechnol 23(2):215(2005)), Noggin/SB431542 조건은 고밀도 평판접종을 허용하였다. 따라서 더 높은 백분율에 부가하여, 이중 SMAD 저해 프로토콜은 또한 각각의 배양 플레이트 당 더 많은 절대 갯수의 Hes5 :: eGFP ⁺ 세포를 생성하였다.

hESC로부터 신경 능선 줄기 세포의 발달(Lee, et al, Stem Cells 25(8), 1931(2007))(NCSCs)에 부가하여 로제트 신경 줄기 세포의 단리가 보고되었다(Elkabetz, et al., Genes Dev. 22, 152-165(2008))(R-NSCs). 최근 개시된 데이터는 이전에 기재된 바와 같이 R-NSC 및 NCSC 모집단에 대한 이중 SMAD 저해 프로토콜에서 관찰된 초기 PAX6⁺ 신경외배엽 세포의 계통 상관성을 결정한다. 면역세포화학적 분석은 R-NSC와 유사하게, PAX6⁺ 신경외배엽 세포가 일반적 NSC 마커, 예컨대 Nestin 및 PLZF를 포함하는 R-NSC 마커를 발현하는 것(도 7 a 및 b; 분화 11 일째)을 나타내었다. 그러나 세포구조 및 ZO1 발현은 신경상피 세포가 이들 조건 하에서 극화되지 않고 ESC-유사 세포구조를 나타내었음을 시사하였다. 이들 극화되지 않은 영역은 극화된 원주 상피 세포로 이루어진 R-NSC 유사 영역과 함께 분산되어 있었다(도 7c). 이들 두 세포 모집단의 발달 위계가 후속 계대 시 추가 조사되었다. 이들 조건 하에, 초기 신경상피 세포는 첨단 ZO1 발현 및 분열간기 핵 이동의 증거와 더불어 로제트 구조로 자연적으로 전환되었다(도 7c, 7d). 이들 데이터는 Noggin/SB431542 프로토콜이 로제트를 형성할 수 있는 초기 PAX6⁺ 신경상피 모집단을 산출함을 제시하였다. 따라서 초기 PAX6⁺ 세포는 현재까지 단리된 가장 원시의 hESC 유도된 신경 전구체 단계를 나타낼 수 있다. R-NSC는 디폴트로 전방 CNS 마커를 획득하는 것으로 나타났다(Elkabetz, et al., Genes Dev. 22: 152-165(2008)). 이중 SMAD 저해 프로토콜을 통해 생성된 PAX6⁺ 신경상피 세포는 R-NSC와 유사하게 Otx2 및 FoxG1B의 발현에 의해 입증되는 전방 CNS 특징을 나타내었다(도 7 e, f) (Elkabetz, et al., Genes Dev. 22: 152-165(2008)). 이들 조건 하에서 PAX6 음성 세포는 AP2, HNK1, PAX7, 및 p75(NGFR)를 포함하는 신경 능선 마커를 공동-발현하였다(도 2g-j). 처음 hESC 평판접종 밀도의 조작은 PAX6⁺ CNS 대 PAX6^- 신경 능선-유사 세포의 비를 왜곡시켰다. 높은 평판접종 밀도는 PAX6⁺ 세포로의 편향된 분화를 일으킨 반면, 낮은 밀도는 신경 능선-유사 분화를 촉진하였다(도 8). 로제트 형성 전 다수의 신경 능선-유사 세포의 존재는 이중 SMAD 저해가 R-NSC 유도된 NCSC와 구별되는 초기 신경 능선 모집단을 산출하였음을 제시하였다(Lee, et al., Stem Cells 25(8): 1931(2007)). 구별되는 계통 잠재성 세포를 갖는 초기 신경 능선 모집단이라는 개념의 뒷받침은 멜라닌소체 마커, HMB45를 공동-발현하는 색소 세포에 대해 쉽게 강화될 수 있었다(도 7 k 및 l, 상세 내용은 실시예 참고). 대조적으로, R-NSC 유도된 NCSC는 전형적으로 필적하는 조건 하에서 색소 세포를 산출하지 않는다(Lee, et al., Stem Cells 25(8): 1931(2007)). 그러나 일부 HMB45⁺ 세포는 신경 능선 마커 SOX10을 공동 발현하지 않아서, PAX6⁺ 망막 색소 상피 세포를 포함하는 다른 색소 세포 모집단의 존재를 제시하였다.

전방-후방(AP) 및 등-배(DV) 정체성 및 신경 하위유형 잠재성은 형태원성 인자, 예컨대 레티노산, FGF8, 및 SHH의 초기 노출에 의존한다. 이중 SMAD 저해 프로토콜을 통해 생성되는 세포의 패턴화 잠재성도 평가되었다. 예를 들어, Oct4 발현은 3 일 내지 5 일에 침묵화되고 신경 마커 PAX6이 5 일 내지 7 일에 대부분의 세포에서 활성화되므로, 분화 5 일에 신경 패턴화에 대해 적절한 발달 윈도우가 존재할 수 있다(도 1d, e). 도파민 뉴론 마커를 발현하는 세포의 유도는 SHH 및 FGF8로의 노출 후(Tomishima, et al., Stem Cells 25(1), 39(2007)) 각각 분화 5 일 및 9 일째에 시작해서 관찰되었다(도 2m). SHH 노출 1 주 후, FGF8 및 SHH가 둘 다 제거되고 BDNF, 아스코르브산, GDNF, TGF-β3, 및 사이클릭-AMP를 함유하는 배지(BAGTC) 중에 추가 분화되었다(Tomishima, et al., Stem Cells 25(1), 39(2007)), 도 7m 참고). 뉴론 분화 19 일째에, Tuj1⁺ 뉴론의 큰 비율이 도파민 합성에서의 속도 결정 효소인 티로신 하이드록실라제(TH)를 공동 발현하였다(도 7n, o). TH⁺ 뉴론은 이러한 조건 하에 세포 계대의 부재시에도 자연적으로 출현하였다. 그러나, 긴 신경 돌기를 갖는 보다 성숙한 TH⁺ 세포의 유도는 분화 12 일째에 기계적 단리 및 일괄 계대 후 촉진되었다.

운동 뉴론 마커 ISL1 및 HB9의 핵 발현이 BDNF, 아스코르브산, SHH, 및 레티노산으로의 노출 2 주(BASR; 분화 19 일)째에 관찰되어 신체 유형 운동 뉴론의 유도를 확인하였다(도 7q, r). 운동 뉴론 유도는 분화 약 11 일째에 계대된 배양으로 제한되어 hESC 유도된 R-NSC에 대해 관찰된 바와 같이 매우 높은 세포 밀도에서 감소된 패턴화 반응을 제시하였다(Elkabetz, et al., Genes Dev 22(2), 152(2008)). 이들 데이터는 간질 영양세포 매개된 유도 프로토콜을 이용한 경우의 30 - 50 일에 비해(Lee, et al., Stem Cells 25(8), 1931(2007); Tomishima, et al., Stem Cells 25(1), 39(2007)) 짧은 분화 기간(대략 19 일) 후 Noggin/SB431542 처리된 신경 자손에서 강력한 패턴화 반응 및 관련 뉴론 하위유형의 유도를 나타낸다.

본원에서 이용된 특이적 Smad 저해제의 대안으로서, 대안적 저해제 또는 기전을 이용하는 구별되는 Smad 경로를 모두 차단할 수 있다. 도르소몰핀은 동일한 경로를 표적화하는 Noggin에 대한 소분자 대안물이다. 10 uM 내지 30 nM 범위 농도의 각각의 개별 양이 10 uM의 SB431542에 첨가되었다. 효율은 PAX6+ 세포 백분율에 기반하여 Noggin/SB431542와 함께 이용되는 만큼 높지는 않았지만, 도르소몰핀과 SB431542의 조합은 동등한 효율 및 세포 생활성을 수득하기 위해 필요한 Noggin의 농도를 15 배 감소시킬 수 있도록 하였다. 다른 분자도 이용할 수 있고, 현재 전체 범위의 표적을 차단하는 SB431542에 대한 공지된 대안적 소분자는 존재하지 않지만, 상기 예는 전체 Smad가 두 공지된 경로에 걸쳐 있고 고도로 균질한 신경 세포 모집단을 산출하는 강력하고 상승적인 효과를 일으킬 수 있음을 나타낸다. 이들 대안적 방법에는 또한 비제한적으로 간섭 DNA(안티센스, siRNA, shRNA, 및 당분야에 공지된 표준 방법 포함), 또는 Smad 4 기능을 차단하거나 이와 경쟁하거나 달리 나타낼 수 있는 단백질의 과발현(예컨대 Smad7의 과발현)을 포함하는 기전을 통한 Smad 차단이 포함된다.

특정한 세포 운명이 포유류에서 원하는 대로 생존하고, 이동하고, 기능하는 이들의 능력에 대해 시험되었다. Noggin 및 SB431542 프로토콜에 이어 도파민 뉴론 유도 프로토콜을 이용하여 분화되는 hiPSC로부터의 신경발생 조직의 이식이 수신체 마우스(구체적으로, Nod/SCID)의 뇌 내로 수행될 수 있고 세포의 그라프트화 잠재성의 평가가 평가된다.

또한, 세포가 Noggin 및 SB431542 프로토콜로부터 보다 성숙한 뉴론(운동 뉴론 및 도파민 뉴론 둘 다)으로 추가 분화되는 경우 색소 세포를 관찰할 수 있다. 상기 데이터는 멜라닌세포 및 망막-색소 상피가 모두 생성되고 있음을 제시한다. 추가적으로, PAX6+ 중추 신경계 선조 세포 및 PAX6-HNK1+ 말초 신경계 선조 세포가 관찰되었다. 최근 문헌에서는 인간 체세포의 유도된 다능성 줄기 세포(hiPSCs)로의 재프로그래밍을 보고하였다(Takahashi, et al., Cell 131(5), 861(2007); Suter, et al., Stem Cells 27, 49-58(2008)).

다음으로, 이중 SMAD 저해가 hiPSC 유도된 신경 세포 유형의 광범위한 레퍼토리를 재현성 있게 생성하기 위해 이용될 수 있는지가 결정되었다. hiPSC 클론 중에서 예상되는 내재적 변동성에 따라, 재현 가능한 분화 결과는 본 발명에서 개시된 분화 프로토콜의 강력함을 확인시켜줄 것이다. 예를 들어, 2 개의 hiPS 클론(IPS^C14, IPS^C17; 도 9a-i 및 a-ii)이 cMYC, KLF4, OCT4, 및 SOX2를 갖는 인간 태아 폐 섬유아세포의 렌티바이러스 형질도입을 이용하여 생성되었다. 두 클론은 모두 미분화된 상태에서 Nanog, Tra-1-60, 및 SSEA-3을 포함하는 다능성 마커를 발현하며, 3 배엽층의 유도체로 분화할 수 있다. noggin/SB431542 프로토콜을 통한 신경 유도 시, 두 클론은 모두 분화 11 일 경에 PAX6+ 세포의 거의 균질한 모집단을 산출하였다(도 9 b-i, b-ii). 상기 조작, 세포 밀도, 계대 및 패턴화 인자에 대해 기재된 전략을 이용해서, 두 hiPSC 클론은 모두 HNK1+ 추정 신경 능선 자손(도 9c-i, c-ii), hiPSC 유도된 R-NSC(도 9d-i, d-ii), 및 신체 운동 뉴론(도 9e-i, e-ii) 및 도파민 뉴론(도 9f-i, f-ii)을 포함하는 특정한 hiPSC 유도된 뉴론 하위유형의 생성에 대해 쉽게 편향될 수 있었다. 이들 데이터는 hESC 분화를 넘어선 이중 SMAD 저해 전략의 강력함과 조정력을 나타낸다. 한 구현예에서, 본원에서 개시된 방법은 hiPSC 유도된 신경 세포 유형의 신속한 생성을 위한 효율적이고 정의된 강력한 플랫폼을 제공한다.

따라서 신규한 신경 분화 방법이 적어도 2 개의 신호전달 저해제, 즉 SB431542 및 Noggin을 조합하여 발견되었다. 본원에 제시된 대부분의 연구가 11 일의 처리 기간을 이용하였음에도 불구하고, 후속 연구는 처리가 분화의 처음 5 일로 단축되는 경우 필적하는 수준의 신경 유도가 달성되었음을 나타내었다(도 10). 상기 감소된 처리 시간은 특히 재조합 Noggin의 경우, 복잡성 및 비용을 추가 감소시킨다. 일부 구현예에서, SMAD 신호전달의 저해제는 뼈 형태형성 단백질(BMP 신호전달) 경로의 저해제에 의해 대체된다. 잠재적으로 noggin 기능에 대해 대체할 수 있고 비용을 추가 감소시킬 수 있는 BMP 경로의 소분자 저해제도 이용 가능하다. 따라서 일부 구현예에서, noggin은 도르소몰핀에 의해 대체된다. 다른 구현예에서, noggin은 LDN-193189에 의해 대체되며, 예시적인 구조에 대해서는 하기를 참고하라:

(또 다른 예로, 'Stemolecule™ BMP 저해제 LDN-193189' StemGent, Cambridge, Massachusetts).

두개 기원판은 수정체, 비강 상피, 귀 구조, 샘하수체의 세포, 및 삼차신경 신경절을 포함하는 여러 두개 신경의 형성을 위해 중추적인 일시적 발달 구조이다. 검증된 마커의 부재 및 발달 동안 조직의 접근 불가능으로 인해 인간 기원판 생물학에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 이 분야는 다른 종, 예컨대 제노푸스개구리, 제브라다니오, 닭으로부터의 외삽, 그리고 더 적은 정도로 마우스 발달에 제한된다.

한 구현예에서, 본 발명은 인간 배아 줄기 세포(hESCs)로부터 두개 기원판 및 기원판 유도된 감각 뉴론의 유도를 고려한다. SIX1+ hESC 유도된 기원판 전구체는 개질된 이중 SMAD 저해제 프로토콜을 이용해서 분화 11 일 이내에 고수율로(총 세포의 71%) 수득된다. SIX1+ 세포는 다른 추정 기원판 마커, 예컨대 eyes absent homolog 1(초파리)(Eya1), Dachshund homolog 1(Dach1), eyes absent homolog 4(초파리)(Eya4), 및 SIX homeobox 3(Six3; sine oculis homeobox homolog 3(초파리))을 공동-발현하며, 시간적 전사체 분석은 추가적인 기원판 및 기원판-하부 특이적 마커를 확인시켜준다. 전향 총-기원판 전구체 세포는 HNK1 발현의 부재 하에 p75의 발현에 기반하여 단리되었다. 특정한 인핸서 GFP 구축물은 추정 특이성을 갖는 기원판 세포를 기원판 지역의 하위세트로 표시할 수 있도록 한다. 인간 ESC 유도된 기원판 세포는 인슐린 유전자 인핸서 단백질 ISL-1(Isl1), 뇌- 특이적 호메오박스/POU 도메인 단백질 3A(Brn3a), β-III 튜불린(Tuj1) 및 peripherin을 발현하는 순수한 감각 뉴론 모집단으로 효율적으로 전환되었다. hESC-유도된 기원판의 단리는 인간 기원판 발달을 연구하고 제한되지 않는 수의 이전에 접근 불가능했던 감각 뉴론 모집단의 감각 기능 및 통증 연구를 위한 유도를 가능케 하는 신규한 모델 시스템을 나타낸다.

두개 기원판은 말초 후각 시스템, 수정체, 전방 뇌하수체, 귀 구조, 및 삼차신경 뉴론을 포함하는 감각 신경절을 생성하는 일시적 발달 구조이다. 기원판 발달에서의 결함은 실명, 난청 및 후각 손실을 포함하는 다양한 인간의 선천성 기형에 관여된다(Baker, et al., Dev Biol, 232(1): 1-61(2001); Bailey, et al., Curr Top Dev Biol, 72: 167-204(2001), 본원에 참조로 도입됨). 두개 기원판 발달은 제노푸스개구리, 닭 및 제브라다니오를 포함하는 다양한 모델 개체에서 잘 특성규명되었다(Baker, et al., Dev Biol, 232(1): 1-61(2001); Bailey, et al., Curr Top Dev Biol, 72: 167-204(2006); Bhattacharyya, et al., Curr Opin Genet Dev. 14(5): 520-6(2004); 및 Baker, et al., Development, 2000. 127(14): p. 3045-56, 모두 본원에 참조로 도입됨). 그러나 발달 및 질병에서 기원판 생물학의 중요성에도 불구하고, 인간 기원판 발달은 조사되지 않은 채 남아 있다. 이는 대부분 초기 인간 기원판 조직의 접근 불가능 그리고 연관된 적절한 마커 및 기법의 부재에 기인한다.

배아 줄기 세포는 성체 개체를 이루는 모든 다양한 세포 유형으로 분화하는 능력을 보유하면서 거의 제한되지 않는 방식으로 자가 재생하는 독특한 능력을 갖는다. 인간 발달 동안, 인간 ES 세포가 유도되는 내세포괴(ICM) 및 배아덩이 위판의 다능성 세포는 3 개의 배엽층 및 기원판 세포를 포함하는 모든 후속 유도체를 생성한다. 하나의 질문은 인간 ICM의 생체내 분화 잠재성이 시험관내 인간 ES 세포-기반 배양 시스템을 이용해서 활용되었는지이다.

지난 몇 년 동안, 인간 ES 세포의 다양한 조직 특이적 세포 유형, 예컨대 중뇌 도파민 뉴론[Perrier, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101(34): 12543-8(2004), 본원에 참조로 도입됨], 척추 운동뉴론[Li, et al., Nat Biotechnol, 23(2): 215-21(2005), 본원에 참조로 도입됨], 다능 중간엽 전구체[Barberi, et al., PLoS Med, 2(6):el61(2005); Barberi, et al., Nat Med, 2007. 13(5):642-8, 본원에 참조로 도입됨], 심장 세포[Laflamme, et al., Nat Biotechnol, 25(9): 1015-24(2007), 본원에 참조로 도입됨], 및 간세포-유사 세포[Agarwal, et al., Stem Cells, 26(5): 1117-27(2008), 본원에 참조로 도입됨]로의 유도된 분화를 위해 여러 프로토콜이 개발되었다. 말초 뉴론 정체성 세포로의 유도된 분화는 신경 능선 전구체 중간체를 통해 달성되었다. 인간 ES 세포-유도된 신경 능선 세포를 생성하는 초기 프로토콜[Lee, et al., Nat Biotechnol, 25(12): 1468-75(2007), 본원에 참조로 도입됨]은 신경 유도를 촉진하는 MS5 공동-배양 시스템에 기반하였다[Perrier, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101(34): 12543-8(2004); Barberi, et al., Nat Biotechnol, 21(10): 1200-7(2003), 본원에 참조로 도입됨]. MS5 배양 시스템은 인간 ES 세포 및 인간 IPS 세포로부터 다양한 신경 능선 운명을 유도하고 단리하기 위해, 그리고 신경 능선-유도된 뉴론에 영향을 미치는 희귀한 인간 유전 장애인 선천성 자율신경기능장애(FD)를 모델링하기 위해 성공적으로 이용되었다[Lee, et al., Nature, 461(7262):402-6(Epub 2009 Aug 19) 본원에 참조로 도입됨].

최근에, BMP 및 TGFb/Activin/Nodal 신호전달 경로의 동시적 저해에 기반하는 정의된 신경 유도 전략이 보고되었다[Chambers, et al., Nat Biotechnol, 27(3):275-80(2009), 본원에 참조로 도입됨]. Noggin(N) 및 SB431542(SB)에 대한 노출은 부착성 배양 조건 하에 인간 ES 세포 또는 IPS 세포의 신경 운명으로의 동기화되고 신속한 분화로 이어져서 유도 공정 동안 공동-배양 및 배아체 형성 둘 다에 대한 필요성을 제거한다. N-SB 프로토콜을 이용한 보다 신속하고 동기화된 분화 반응은 시험관내 발달 운명의 편향에서 특정 형태원의 정확한 상관성 시험을 가능케 한다.

일부 구현예에서, 개질된 N-SB 프로토콜은 고도로 농축된 기원판 전구체 모집단의 효율적인 유도를 허용한다. 기원판 운명은 N-SB 유도 48 시간 후 noggin 처리의 제거 시 신경외배엽 세포 대신 유도된다. 이들 데이터는 비-CNS 유도체의 생성을 최적화하기 위한 N-SB 유도 시스템의 이용이 hESC 분화 동안 내인성 BMP 신호전달의 중요성을 나타내며, 제한되지 않는 수의 기원판 유도체, 예컨대 감각 기능 및 통증 연구를 위한 두개 감각 뉴론의 유도를 가능케 함을 예시하였다.

본 발명의 일부 방법에서 사용하기 위해 뒤따르는 본원에 기재된 연구로부터의 몇몇 관찰이 제공된다.

A. HESC 분화 동안 기원판 운명의 BMP 의존적 전문화

BMP는 생체내 초기 배아 운명 전문화에 대해 광범위한 효과를 발휘하며, 다양한 배아-외 구조의 전문화, 완성 중배엽 세포의 결정, 비-신경 외배엽, 기원판 및 신경 능선 조직의 전문화에 관여된다. N-SB 배양 시스템의 이용은 인간 ES 세포의 고도로 동기화되고 효율적인 분화를 가능케 한다. 본원에서 N-SB 시스템의 연구 데이터는 BMP 용량 및 적용 시점이 모두 기원판 운명의 전문화를 조정할 수 있음을 드러낸다. 시스템이 비-신경 외배엽 운명으로의 분화 및 원시 피부 전구체 세포의 생성을 최적화하기 위해 유사하게 이용되었는지 여부에 대한 중요한 질문이 남아 있다. 데이터는 개질된 N-SB 배양 조건 하에서 Six1 음성 세포의 하위세트가 발달 동안 초기 표피 전구체의 공지된 마커인 p63을 발현함을 시사하였다.

B. 인간 배아 줄기(ES) 세포 분화 동안 추정 총-기원판 운명의 출현

인간 ES 세포 분화 동안 Six1+ 운명으로의 고도로 효율적인 분화 및 ISL LIM 호메오박스 1(Isl1)+ 세포로도 알려져 있는 인슐린 유전자 인핸서 단백질 ISL-1의 신속한 출현은 hESC 유도된 세포가 처음에 전-기원판 전구체 운명을 채택할 수 있음을 제시한다. 전-기원판 지역의 출혈은 제노푸스개구리 및 제브라다니오 발달 동안 전방 신경외배엽 세포 주위를 둘러싼 배아의 최전방 지역에서 말굽 형상 영역을 표시하는 것으로 설명되었다. 본원에 나타낸 데이터는 Six1+ 기원판 지역으로부터 감각 뉴론 전구체의 생성에 대해 보고한다. 그러나 향후 연구는 대안적 분화 방식으로의 노출 시 이들 기원판 세포의 유연성을 설명할 수 있다. 특히 관심의 대상이 되는 것은 다양한 호르몬 생산 세포 유형의 전문화를 연구하기 위한 샘하수체 세포의 유도일 수 있다. 이러한 세포는 발달 연구를 위해 그리고 호르몬 방출의 약리적 조절을 정의하기 위한 목표의 연구를 위해 관심의 대상이 된다. 대략, Six1+ 단계에서 세포의 15%가 샘하수체 전구체 세포의 마커인 Lhx3을 발현한다. 샘하수체 호르몬의 생산에 있어서 전구체 단백질 CGA의 발현이 분화 11 일째에 개질된 N-SB 프로토콜에서 인간 ES 세포 분화 동안 관찰되었다(도 12D). Lhx3+ 추정 샘하수체 전구체 세포의 존재 및 CGA의 발현은 샘하수체 계통 세포가 개질된 N-SB 프로토콜을 이용해서 쉽게 유도되었음을 나타내었다.

C. Six1+ 기원판 전구체로부터의 감각 뉴론 전문화

본원에 개시된 발견은 개질된 N-SB 프로토콜에서 생성된 감각 뉴론 모집단의 기원판 기원을 시사한다. 이는 후속 감각 뉴론 생성을 위해 단리된 전구체 클러스터에서 Six1의 발현 및 초기 단계 감각 뉴론에서 Six-1의 공동-발현에 기반한다. 기원판 유도된 감각 뉴론은 신경 능선 계통으로부터 유도된 감각 뉴론과 다양한 마커, 예컨대 Brn3A, Isl1 및 Peripherin을 공유한다. 그러나 개질된 N-SB 프로토콜은 FoxG1B 및 기원판 전구체에서 발현되고 초기 신경 능선 계통에서는 발현되지 않는 다른 전방 마커의 고도로 효율적인 유도를 나타낸다. 초기 세포 밀도(Chambers, et al., Nature Biotechnology 27(3) 275-280, 2009, Corrigendum: in Nature Biotechnology 27(4):1) 및 Wnt 신호전달의 조정(참고문헌)은 기원판 대 신경 능선 유도된 감각 뉴론 모집단의 전문화를 가능케 할 수 있다. 고도로 정제된 두개 감각 뉴론 모집단에 대한 접근은 고처리량 약물 탐색 분석의 향후 개발을 위한 신규한 도구를 나타낸다. 예를 들어, 기원판 유도된 삼차신경 뉴론을 조정하는 화합물은 삼차신경 신경 기능장애와 연관된 널리 공지된 임상적 증후군에 있어서 특히 관심의 대상이 될 수 있다.

E. 인간 배아 줄기 세포로부터 기능적 바닥판 조직의 전문화가 전방 신경외배엽 대신 일어남

바닥판(FP)은 배아의 배 중간선에 따라 배치되는 신경 발달 동안의 중추적 신호전달 센터이다. 조직의 접근 가능성의 부재로 인해, 인간에서 FP 발달에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 본 개시는 인간 배아 줄기 세포(hESC-)의 유도 및 Netrin-1 및 SHH를 분비하고 일차 및 hESC 유도된 조직의 패턴화에 영향을 미칠 수 있는 후속적으로 유도된 FP 조직을 기재한다. hESC에서 FP의 유도는 초기 SHH 노출에 의존하며, 전방 신경외배엽(AN) 대신 일어난다. 전반적 유전자 발현 및 기능적 연구는 AN 억제에서 중요 인자로 DKK-1의 SHH-매개된 저해를 확인시켜준다. hESC 유도된 FP 조직은 전방 SIX6+ 특징을 갖지만 꼬리화 인자에 반응하여 SIX6 발현을 억제하고 지역-특이적 SHH 인핸서의 발현에서 전환을 유도하는 것으로 나타난다. 이들 데이터는 실험 모델 시스템으로서 hESC 유도된 FP를 구축하였고 FP 대 AN 전문화를 조정하는 초기 신호전달 이벤트를 정의한다.

신경 발달은 신경 전구체 정체성을 지시하는 복잡한 신호 세트에 의해 시간 및 공간에서 지시된다. 동물 모델에서 상당한 진보가 있었지만, 인간 신경 발달은 아직도 많이 이해되지 않고 남아 있다. 인간 배아 줄기 세포(hESCs)는 인간 발달의 초기 단계를 모델링하기 위해 이용 가능하고 조작 가능한 세포 플랫폼을 제공한다.

이전 연구는 전방/후방(A/P) 및 등-/배(D/V) CNS 정체성을 정의하는 패턴화 인자에 반응하여 마우스(Wichterle, et al., 2002; Barberi, et al., 2003; Watanabe, et al., 2005) 및 인간(Perrier, et al., 2004; Li, et al., 2008; Eiraku, et al., 2008) ESC의 특정한 뉴론 유형으로의 유도된 분화를 보고하였다. 이들 연구는 CNS 지역을 특정하는 신호전달 시스템의 진화적 보존을 나타낸다. 포유류에서, 소닉 헤지호그(SHH)는 일차 신경 체외이식편(Briscoe and Ericson, 1999) 및 마우스 ES 세포(Mizuseki, et al., 2003)에서 바닥판(FP)을 발현하는 세포를 포함하는 다양한 배 세포 유형을 특정하기 위해 용량 의존적 방식으로 작용하는 배 형성 인자이다. hESC-유도된 신경 세포로의 SHH 적용은 다양한 배 뉴론 유형을 유도하는 것으로 나타났으나, 바닥판(FP) 조직 자체의 유도는 아직 보고되지 않았다. FP가 하나의 신호전달 센터이므로, 인간 ES 세포로부터 FP를 생성하는 능력은 초기 인간 신경 발달의 이해를 심화시키는 전진 단계가 될 것이다.

FP는 척추로부터 가장 꼬리까지 중뇌를 통해 간뇌까지 연장되는 배 신경관의 가장 중앙 측면을 따라 나타나며, 그 전방 한계는 시상속 한계 영역 바로 밑까지이다(Jessell, et al., 1989). 전방 신경외배엽(AN)이 시작되는 곳인 가장 전방 측면에서 FP가 중단되며, 연구는 AN 수임이 세포를 FP 유도 신호에 반응할 수 없도록 함을 나타내었다(Placzek, et al., 2003). 전통적 연구는 SHH, FOXA2, F-Spondin, 및 Netrin-1을 포함하는 FP 특이적 마커를 발현하고 독특하고 편평한 형태를 나타내는 FP 세포를 나타내었다(Placzek, 1995). 마우스 및 닭 배아에서의 연구는 FP에 대해 2 개의 주요 형성체 기능: 배 신경관을 패턴화하는 형태원 SHH의 분비(Placzek and Briscoe, 2005), 및 중간선에 걸쳐 맞교차 액손을 가이드하는 Netrin-1의 발현(Charron, et al., 2003)을 확인하였다. FP는 일반적으로 비-신경발생 지역으로 간주된다. 그러나 마우스에서의 유전적 계통 맵핑 연구는 최근에 중뇌 FP가 선택적으로 신경발생 잠재성을 나타내며, 배 중뇌 도파민 뉴론의 원천임을 보고하였다(Kittappa et al, 2007; Ono, et al., 2007; Joksimovic, et al., 2009).

현재까지 조직에 대한 접근 가능성 부재로 인해 인간에서 FP 발달에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 동물에서, FP는 SHH의 주요 생산 부위이며, 특정 형태의 완전전뇌증 및 소안구증을 포함하는 몇몇 인간 발달 장애, 다양한 구순열판 증후군을 포함하는 골격 장애, 및 종양 병태, 예컨대 골린 증후군; SHH 수용체 Patched 1에서의 돌연변이에 의해 유도되는 희귀한 유전 장애가 중간선 SHH 신호전달에서의 변형에 관련된다(Mullor, et al., 2002). 따라서 인간 FP가 어떻게 생성되는지에 대한 이해는 인간 신경 패턴화 및 액손 향도의 비교 발달 연구를 도울 것이고, 생성 세포는 잠재적으로 FP 기원을 갖는 특정한 뉴론 유형의 원천으로 작용할 수 있다.

본원에 제공된 데이터는 시험관내 인간 발달 형성체 구조를 생성하는 첫 번째 예로서, hESC의 FP 조직으로의 예시적인 유도된 분화를 나타낸다. 예를 들어, 인간 FP 전문화는 AN의 DKK1-매개된 전문화를 억제하는 초기 고용량 SHH 신호전달에 의존할 수 있다. FP의 기능성은 Netrin-1 및 SHH의 분비 그리고 일차 마우스 및 래트 체외이식편에서 전위 FP 조직 및 신경돌기 증식을 유도하는 능력에 의해 나타난다.

인간 ESC-유도된 FP는 디폴트로 전방 정체성을 채택하지만, 지역-특이적 FP 조직에 대한 접근을 제공하는 꼬리화 신호에 반응하여 후방 운명으로 특화되었다. 본원에 나타낸 실험 시스템 및 SMAD 신호전달의 이중 저해에 의한 인간 ES 및 iPS 세포의 고도로 효율적인 신경 전환에 대해 기재된 조성물 및 방법이 조합되어[Nat. Biotechnol. 26, 275-280(2009); 2009 년 3 월 1 일 온라인 공개; 2009 년 3 월 16 일 인쇄 후 수정, Corrigendum: Chambers 등] 초기 인간 신경 발달 동안 중의 추적인 FP-매개된 신호전달 이벤트에 대한 연구를 촉진할 것이다.

IV. 줄기 세포 라인

본 발명은 임의의 특정한 유형의 인간 줄기 세포의 사용으로 제한되지 않는다. 실제로, 다양한 유형의 인간 줄기 세포의 사용이 고려된다. 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 소 및 양으로부터 만능성 또는 다능성 세포를 수득하는 방법은 이전에 기재되었다. 예로, U.S. 특허 번호 5,453,357; 5,523,226; 5,589,376; 5,340,740; 및 5,166,065(모두 구체적으로 본원에 참조로 도입됨)뿐만 아니라 [Evans, et al., Theriogenology 33(1): 125-128, 1990; Evans, et al., Theriogenology 33(1): 125-128, 1990; Notarianni, et al., J. Reprod. Fertil. 41(Suppl.):51-56, 1990; Giles, et al., Mol. Reprod. Dev. 36: 130-138, 1993; Graves, et al., Mol. Reprod. Dev. 36:424-433, 1993; Sukoyan, et al., Mol. Reprod. Dev. 33:418-431, 1992; Sukoyan, et al., Mol. Reprod. Dev. 36: 148-158, 1993; Iannaccone, et al., Dev. Biol. 163:288-292, 1994; Evans & Kaufman, Nature 292: 154-156, 1981; Martin, Proc Natl Acad Sci USA 78:7634-7638, 1981; Doetschman, et al., Dev Biol 127:224-227, 1988); Giles, et al., Mol Reprod Dev 36: 130-138, 1993; Graves & Moreadith, Mol Reprod Dev 36:424-433, 1993 및 Bradley, et al., Nature 309:255-256, 1984]를 참고하라.

일부 구현예에서, 분화되지 않은 인간 배아 세포 라인, 예를 들어 세포 라인 WA09 등이 사용을 위해 고려된다.

V. 이중 SMAD 분화

본원에 기재된 연구의 하나의 발견은 배아 세포 유도된 FP 조직의 "디폴트" 성질 및 전방 편향이다. 본원에 제시된 NSB(Chambers, et al., 2009; 도 18) 및 FP(도 18) 유도 프로토콜 둘 다에서 임의의 명백한 중배엽 중간체의 부재는 신경외배엽 및 FP 조직의 시험관내 유도가 임의의 추가적인 중배엽 유도된 신호에 의존하지 않음을 제시한다. FP 유도는 nodal이 FP 유도를 위해 필수적인 것으로 여겨지는 제브라다니오에서의 데이터와는 대조적으로(Placzek and Briscoe, 2005에서 리뷰됨) TGFb/Activin/Nodal 신호전달의 저해제인 SB431542의 존재 하에서도 쉽게 일어난다. 본원에서 보고되는 FP 조직의 전방 디폴트는 hESC 유도된 신경외배엽 세포에서 관찰되는 전방 디폴트를 연상시킨다. 닭 발달에서의 연구는 전방 대 후방 FP의 두 구별되는 기원, 즉 배아덩이 위판 및 축방향 중배엽에서의 선조를 제안하였다(Placzek, et al., 2003). 상기 데이터는 신경외배엽 세포와 유사하게 인간 FP 전구체 세포가 FGF8 및 Wnt-1을 포함하는 꼬리화 인자에 반응하여 후방 FP 정체성으로 재특화될 수 있음을 시사하였다.

현재까지, AN 마커의 발현이 세포가 특정 계통을 산출하는 능력을 저해하는지 여부는 명확히 나타나지 않았다. hESC 유도된 신경 로제트 세포에서, BF1의 발현은 HB9+ 신체 운동뉴론을 포함하는 후방 CNS 운명으로의 패턴화를 배제하지 않는다.

그러나 꼬리 뉴론 운명의 생성 효율은 BF1-음성 로제트에 비해 유의미하게 감소된다(Elkabetz, et al., 2008). 일차 마우스 체외이식편에서의 이전 연구는 AN 세포가 SHH 단독에 대해 반응하여 FP 세포로 분화하기 적격이 아님을 나타내었다(Placzek, et al., 1993). 본 발명의 개발 동안 본원에 기재된 방법 및 결과는 FP로 전문화할 수 없는 AN 수임을 나타내었다.

본원에 기재된 추가적인 중요 발견은 NSB-매개된 신경 분화 동안 DKK-1의 극적인(강력한) 유도이다. 마우스의 신경 분화 동안 외인성 DKK-1에 노출된 ESC는 혈청-비함유 배아체(SFEB) 조건 하에서 AN 유도를 증강시켰다(Watanabe, et al., 2005). 따라서 본 발명의 일부 구현예는 신경 분화 동안 내인성 DKK-1의 초기 유도가 적어도 부분적으로 hESC에서 관찰되는 AN 디폴트 표현형에 관여한다고 고려한다. 기능적 연구는 본원에서 차단 항체를 이용한 DKK-1의 저해가 FP 수율을 유의미하게 개선하였음을 나타내었다. 또한 5 일 또는 이후 시점에서 SHH와 함께 DKK-1 항체의 첨가는 FP 적격성의 시간적 윈도우를 연장하기에 충분하지 못했다(도 19H 및 19I). 유사하게, 신경 로제트 단계 세포에 대한 WNT(Wnt-1, Wnt3A 또는 GSK 저해제(BIO))의 첨가는 유도된 FP 적격성에 대해 충분하지 못했다(도 25). 이들 데이터는 매우 초기의 DKK1 매개된 AN 편향이 hESC 유도된 전구체의 FP 잠재성을 억제함을 나타내었다.

BF1 녹다운 hESC 라인에서의 추가적인 데이터는 후방 CNS 세포 유형, 예컨대 HB9+ 운동뉴론의 개선된 수율과 더불어 증강된 FP 수율을 나타내었다. 따라서 본원에 제공된 모델 시스템은 WNT 저해 기능을 갖는 다른 분자, 예컨대 Cerberus(Bouwmeester, et al., 1996)의 AN 전문화 및 FP 운명의 억제에 대한 기여를 평가하기 적합한 것으로 고려된다. 마지막으로, 본원에 기재된 시스템 및 방법은 hESC에서 AN 디폴트를 조절하는 DKK-1 발현의 잠재적인 상류 조절물질의 확인을 허용하기 위해 고려된다.

SHH는 전통적인 배 형성 인자이며, 신경 발달 동안 AP 전문화에 대해 영향을 발휘하는 것으로 알려져 있지 않으므로, 높은 수준의 외인성 SHH에 대한 초기 노출을 통한 DKK-1 및 후속적으로 AN 운명의 억제는 놀라운 결과였다. 본 발명자들의 연구는 SHH에 의한 DKK-1의 조절이 직접적인지 또는 DKK-1 발현이 없는 대안적 전구체 모집단의 유도에 의해 야기되는지 여부는 해결하지 못했다. DKK-1은 FP 유도를 저해했지만, WNT1에 대한 노출은 hESC로부터 FP 조직의 유도를 증강시켰다. 이들 데이터는 FP 수율에서 유사한 증가를 유도하는 RA가 WNT 신호전달에 영향을 미칠 것인지 또는 후방 운명의 유도가 Wnt 신호전달과 무관하게 FP 수율을 증강시키는지에 대한 질문을 불러일으켰다.

정의된 지역적 정체성을 갖는 제한되지 않는 수의 FP 세포의 이용 가능성은 인간 신경 발달의 연구를 위해 귀중한 도구를 제공한다. 마우스에서의 최근 연구는 FP의 일부 지역이 신경 패턴화 및 액손 향도에서의 역할에 더하여 중뇌 도파민 뉴론을 포함하는 특정한 뉴론 유형의 원천으로 작용할 수 있음을 제시한다. hESC 유도된 FP의 지역적 정체성의 재-전문화가 중뇌 특이적 마커의 발현 및 중뇌 특이적 SHH 인핸서 요소의 활성화에 기반하여 중뇌 특징에 대해 나타났다. hESC 유도된 FP 조직이 TH+/FOXA2+ 추정 중뇌 DA 뉴론을 산출할 수 있다는 증거가 확인되었다(도 25). 본원에 나타낸 결과는 인간 FP 대 AN 운명의 유도 및 지역적 전문화에 대한 식견을 제공하였고, hESC를 인간 발달 동안 보다 복잡한 상호작용의 모델링을 위해 적합한 기능적 형성체 조직을 생성하는 강력한 모델 시스템으로 구축하였다.

결론적으로, 본원에 나타낸 예시적인 데이터는 신경 분화 hESC 디폴트가 DKK-1 및 후속적으로 BF1의 상향조절에 의해 AN 운명을 향하는 반면 AN 수임은 hESC 자손에서 FP 적격성을 능동적으로 억제하였음을 나타내었다.

그러나 초기 고수준의 SHH는 DKK-1 수준을 감소시켜서 AN 대신 FP 유도를 가능케 한 반면, DKK-1 또는 BF1의 기능 손실은 FP 생성을 증가시켰다. 따라서 인간 ESC 유도된 FP는 디폴트로는 전방이지만, 꼬리화 인자에 반응하여 후방화되었다. 이것이 도 6E에 요약된다.

따라서 본 발명의 여러 구현예가 하기 표에 요약된다.

본 발명의 신경 세포를 수득하기 위한 화합물 예시적인 양 범위

	Noggin 농도	도르소몰핀 농도	SB431542 농도	Sonic C25H(SHH) 농도
Noggin과 SB431542	125-500 ng/ml	NA	0.001 내지 1000 마이크로M	NA
Noggin과 SB431542 및 SHH	500 ng/ml	NA	0.001 내지 1000 마이크로M	200-2000 ng/ml
도르소몰핀과 SB431542	NA	100-5000 nM, 600 nM에서 최적 결과	0.001 내지 1000 마이크로M	NA
Noggin과 도르소몰핀과 SB431542	25-500 ng/ml, 30 ng/ml까지 고효율	100-5000 nM, 600 nM에서 최적 결과	0.001 내지 1000 마이크로M	NA

본 발명의 신경 세포 유형을 생성하기 위한 본 발명의 화합물의 예시적인 첨가 시간

시작 세포 유형 및 조건	iPS 및 hESC 포함 줄기 세포. 저밀도 세포: KSR 배지 또는 컨디셔닝된 배지	iPS 및 hESC 포함 줄기 세포. 고밀도 세포: KSR 배지 또는 컨디셔닝된 배지	iPS 및 hESC 포함 줄기 세포. 저밀도 또는 고밀도 세포: KSR 배지 또는 컨디셔닝된 배지	개질된 N-SB 처리된 hESC 또는 iPS: KSR 배지 또는 컨디셔닝된 배지	비부착성 배아체 중 N-SB 처리된 hESC 또는 iPS
N-SB: Noggin 및/또는 도르소몰핀과 SB431542	배양물의 배양 0 일에 첨가하고 또한 세포에 영양 공급 시 신선한 분취량 첨가를 계속함	배양 0 일에 첨가하고 또한 세포에 영양 공급 시 신선한 분취량 첨가를 계속함	배양 0 일에 첨가하고 또한 세포에 영양 공급 시 신선한 분취량 첨가를 계속함	NA	배양 0 일에 첨가하고 또한 세포에 영양 공급 시 신선한 분취량 첨가를 계속함: 7 일 즈음에 SB 제거
개질된 N-SB: N-SB 유도 2(1-3)일 후 Noggin/도르소몰핀 제거 SB431542	NA	NA	NA	배양 0 일에 첨가하고 1 일(0 일 후 6 시간부터 4 일 범위)에 Noggin 및/또는 도르소몰핀 없이 세포 배지로 대체함	NA
SHH 또는 C25II	NA	NA	N-SB 첨가 후 1 일(0-5 일 범위)에 첨가함 KSR 배지를 5 일 내지 11 일에 N2 배지로 점차 대체함	NA	NA
생성 세포	CNS 선조 세포(PAX6+) 및 PNS 선조 세포(p75+, HNK-1+)	CNS 선조 세포(PAX6+)(분화 개시 19 d 내에 R-NS 세포 및 운동뉴런 및 도파민성 뉴런의 패턴화 가능한 뉴런 모집단)	FOXA2+(BF1 감소됨) SOX17- 신경 세포, 즉 디폴트 유형으로 FP 전방 세포를 갖는 FP 분화, 그러나 후방 FP 조직이 꼬리화 인자, 예컨대 Wnt-1, FGFF8 또는 RA의 존재 하에 유도될 수 있음	Six1+ 기원판 전구체가 Brn3a+ 선조 세포로 이어지고, 미성숙 뉴론 세포로 이어지고, Tuj1+, peripherin+ 및 성숙 뉴론으로 이어짐.	고효율 운동 뉴런 세포

VI. 두개 기원판 세포의 전문화

한 구현예에서, 본 발명은 삼차신경, 수정체 및 전방 뇌하수체 기원판 계통의 전문화를 포함하는 방법을 고려한다. 한 구현예에서, 본 방법은 개질된 PIP 조건을 이용한 전구체 기원판 세포의 전문화를 추가로 포함한다. 본 발명의 기전을 이해할 필요는 없지만, 다른 기원판 운명도 개질된 PIP 조건을 이용해서 또한 접근 가능한 것으로 여겨진다. 예를 들어, FGF8에 대한 전-기원판 세포의 노출은 후각 기원판 운명과 양립 가능한 ASCL1 발현에 있어서 농축된다(Balmer and LaMantia, 2005). 꼬리화 신호, 예컨대 WNT3A에 대한 노출은 귀 기원판 운명과 양립 가능한 SIX1 및 SOX10을 공동 발현하는 세포 모집단의 유도로 이어진다. 이들 조건은 추가 최적화를 필요로 하지만, PIP가 두개 기원판 운명 전문화를 위한 보편적 플랫폼을 나타낸다는 관점을 지지한다.

두개 기원판은 감각 및 내분비 기관 발달을 위해 필수적인 배아 구조이다. 인간 기원판 발달은 기원판-유도된 조직의 기능이상에 의해 야기되는 심각한 의학적 병태에도 불구하고 대부분 접근 불가능하게 남아 있다. 일부 구현예에서, 인간 다능성 줄기 세포로부터 두개 기원판의 효율적인 유도가 개시된다. 예를 들어, 신경 유도의 이중-SMAD 저해 전략 성분인 BMP 저해제 Noggin의 적시 제거는 다른 CNS 운명 대신 기원판 유도를 유발한다. 대안적으로, FGF 신호전달의 동시적 저해는 기원판 유도를 손상시키고 표면 외배엽을 유도할 수 있다. 전-기원판 단계에서의 추가적인 운명 전문화는 비제한적으로 생체내 그라프트화가 가능한 기원판-유도된 삼차신경 신경절, 성숙 수정체 섬유 및 이식 시 생체내에서 인간 GH 및 ACTH를 생산하는 전방 뇌하수체 호르몬-생산 세포를 포함하는 두개 기원판 세포의 선택적 생성을 가능케 한다. 본원에 개시된 데이터는 인간 두개 기원판 발달을 연구하고 감각 및 내분비 질병에서 인간 세포-기반 치료법의 개발을 위한 단계를 설정하기 위해 강력한 실험적 플랫폼을 구축한다.

인간 두개 기원판 발달의 이해는 추적 가능한 실험 시스템의 부재, 초기 인간 발달 동안 상기 일시적 구조에 대한 접근 불가능성 및 검증된 인간 기원판 마커의 부재로 인해 난제가 되어 왔다. 본원에서 개시된 데이터는 이러한 주요 난제를 해결하며, 인간 기원판 및 외배엽 발달의 연구를 위한 다목적 플랫폼을 구축한다(도 40). 이전 연구에서 특정한 기원판 유도체, 예컨대 수정체(Ooto, et al., 2003; Zhang, et al., 2010) 또는 귀 기원판 유도된 세포(Chen, et al., 2012; Oshima, et al., 2010)의 출현을 관찰하였지만, 특정한 기원판 유도의 기전은 해결되지 않았고 기원판 전문화의 일반적 모델도 이들 연구에서는 제시되지 않았다.

매우 최근의 연구는 다능성 줄기 세포를 기원판 운명으로 유도하는 능력을 보고하였다(Leung, et al., 2013; Mengarelli and Barberi, 2013; Shi, et al., 2007). 그러나 이들 조건 하에서는 기능적 인간 기원판 유도체가 생성되지 않았다. 대조적으로, 마우스 ESC에서의 연구는 기능적 귀(Koehler, et al., 2013) 및 뇌하수체(Suga, et al., 2011) 기원판 유도체를 성공적으로 유도하였다.

특정한 관심의 대상이 되는 발달 상의 의문점은 기원판 세포의 기원이다. 당분야에서 우세한 가설은 기원판 조직이 주변 신경 조직으로부터의 유도성 신호에 대한 반응 시 비-신경 외배엽으로부터 기원한다는 것이다(Schlosser, 2006). 본원에 개시된 데이터는 TFAP2A 발현이 SIX1의 유도에 선행하는 반면 TFAP2A가 N-SB 유도 동안 억제된다는 결과에 근거하여 인간 기원판 발달이 유사하게 비-신경 외배엽으로부터 기원한다는 것을 시사한다. TFAP2A 및 GATA3의 BMP-기반 유도는 기원판 유도에 적격인 비-신경 외배엽 계통의 구축에서 유용할 수 있다(Kwon, et al., 2010).

FGF 신호전달의 저해에 의해 비-신경 외배엽 대신 기원판 유도를 차단하는 능력은 비-신경 외배엽 기원을 추가로 뒷받침하며 내인성 FGF 신호가 PIP에서 기원판 디폴트에 관여하는 신경 신호일 수 있음을 제시한다. 한 구현예에서, 방법은 분화의 7 일째의 세포(전-기원판) 처리가 다양한 기원판 운명 간 스위치를 유도했지만 기원판 세포 대 비-신경 외배엽 운명의 비에는 영향을 미치지 않았다는 점에서, 기원판 운명으로의 발달 수임 시점을 7 일 경으로 서술한다.

이전 연구는 hPSC 분화 동안 전방 신경외배엽 및 신경 로제트 단계 세포의 마커로서 FOXG1 및 DACH1을 기재하였다(Chambers, et al., 2009; Elkabetz, et al., 2008). 본원에 제시된 데이터는 작은 백분율의 SIX1+ 세포가 NSB 조건 하에 자연적으로 출현함을 나타낸다. 따라서, CNS 계통의 생성을 목표로 하는 분화 연구는 오염성 기원판 조직이 hPSC 유도된 신경 배양에 존재하는지 여부를 해결해야 한다.

본 발명의 기전을 이해할 필요는 없지만, 이들 자연적으로 출현하는 기원판 세포는 과거 신경 분화 연구에서 관찰된 렌즈체 및 다른 기원판 유도체의 원천일 수 있다고 여겨진다. 본원에 제시된 유전자 발현 데이터는 광범위한 기원판 마커 세트를 정의한다. 예를 들어, OVOL2는 이전에 마우스 배아덩이 위판 및 표면 외배엽에서 발현되는 것으로 보고되었고, OVOL2의 손실은 초기 배아 치사로 이어진다(Mackay, et al., 2006).

한 구현예에서, 본 발명은 OVOL2를 인간 전-기원판 마커로서 고려한다. 다른 구현예에서, FOXC1 및 ISL1이 전-기원판 단계에서 특이적으로 발현되는 추가적인 전사 인자이다. 본원에 개시된 데이터는 두개 기원판 정체성을 초기 CNS, 신경 능선 및 표면 외배엽 정체성과 구별하는 전사 네트워크를 정의하기 위한 체계를 제공한다.

한 구현예에서, 본 발명은 다양한 특정 기원판 정체성을 채택하기 위해 적격인 일시적인 전-기원판 모집단을 포함하는 방법을 고려한다. 전-기원판 지역의 출현이 제노푸스개구리 및 제브라다니오 발달 동안 기재되었다(Bailey, et al., 2006; Martin and Groves, 2006; Schlosser, 2006). 본원에 기재된 데이터는 PIP가 처음에는 아마도 내인성 FGF 및 WNT 신호의 꼬리화 효과에 기인할 수 있는, 추가 분화 시 자연적으로 더 후방의 PAX3+ 안구 삼차신경 운명을 채택하는 PAX6+/SIX1+ 전방 전-기원판 모집단을 산출함을 나타낸다.

다른 구현예에서, 분화 7 일째에 SHH에 대한 노출 또는 FGF 신호전달의 억제는 추정 전-기원판 전구체를 전방 뇌하수체 및 수정체 기원판 운명으로 유도한다. 수정체 기원판은 닭 기원판 발달 동안 디폴트 상태로서 제시되었고, FGF8이 후각 기원판 운명을 특정하기 위해 필요하고 충분하다(Bailey, et al., 2006). 마우스 ESC에서의 다른 연구(Koehler, et al., 2013; Suga, et al., 2011)는 복잡한 3D 배양 시스템을 이용하는 호르몬-생산 뇌하수체 세포 및 귀 감각 뉴론 각각의 생성 가능성을 나타내었다.

본원에 개시된 데이터는 개질된 PIP 조건이 복잡한 3D 배양 조건에 대한 필요성 없이 인간 뇌하수체 전구체를 효율적으로 산출함을 나타낸다. ACTH 생산 세포를 포함하는 TBX19-관련 뇌하수체 계통을 우선적으로 생성하는 편향이 관찰되었지만, 모든 3 개 주요 전구체 계통(GATA-2, TBX19, 및 PIT1 계통, 도 38A)이 유도될 수 있다. 따라서 프로토콜의 추가 최적화는 개별적인 뇌하수체 호르몬 계통에 대한 선택적 접근을 제공할 수 있을 것이다.

한 구현예에서, 본 발명은 생체내 두개 기원판 세포의 그라프트화를 포함하는 방법을 고려한다. 한 구현예에서, 두개 기원판 세포는 전방 뇌하수체 세포를 포함한다. 한 구현예에서, 그라프트화는 다리 근육 상에 있다. 한 구현예에서, 그라프트화는 시상하부-뇌하수체 축 상에 있다. 한 구현예에서, 그라프트화는 시상하부 상에 있다. 한 구현예에서, 그라프트화는 안장 상에 있다. 한 구현예에서, 그라프트화된 뇌하수체 기원판 세포는 뇌하수체 호르몬을 생산하고 분비한다.

한 구현예에서, 본 발명은 삼차신경 감각 뉴론을 유도할 수 있는 PIP-기반 분화를 포함하는 방법을 고려한다. 삼차신경 뉴론은 몇몇 통증 증후군, 예컨대 삼차신경 신경 마비, 삼차신경 신경통 및 편두통 통증에 관여되는 것으로 보고되었다(Love and Coakham, 2001). 따라서, 다수의 삼차신경 뉴론을 생성하는 능력은 인간 통증인지의 모델링을 위해 그리고 통증 연구에서 세포-기반 약물 스크리닝의 개발을 위해 특히 유용할 것이다. 또 다른 중요한 적용은 인간 iPSC를 이용한 단순 헤르페스 뇌염의 모델링일 것이다(Lafaille, et al., 2012). HSV-1은 특히 삼차신경 신경절 내에서 잠복 형태로 지속되는 바이러스이다(Barnett, et al., 1994).

환자-특이적 iPSC로부터 삼차신경 뉴론을 유도하는 능력은 바이러스 잠재성의 조절에서의 결함이 단순 헤르페스 뇌염을 기여하는지를 해결하게 된다. 삼차신경 기원판 전구체의 강력한 생체내 생존은 기계적, 방사선 또는 화학치료법-유도된 손상 후 신경 보수 목표를 갖는 향후 재생 접근법의 개발 가능성을 불러일으킨다.

본 발명의 기전을 이해할 필요는 없지만, 재생 의약에 대한 잠재적으로 큰 영향이 기능적 호르몬 생산 세포의 유도에서 올 수 있는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 뇌하수체저하증은 선천성 결함, 머리 부상 또는 뇌하수체 종양 환자 또는 방사선 치료법을 수여받고 있는 환자에서 치료적 개입의 공통적 결과이다(Tabar, 2011). 환자에서 안정 혈청 수준을 정상화하기 위해 대체 호르몬이 주어질 수 있지만, 이러한 일생 동안의 치료를 위한 재정적, 물류적 및 의학적 비용이 상당하다. 또한, 호르몬 대체 치료법은 순환 리듬에 반응하는 동적 방출이나 환경 또는 스트레스적 어려움에서의 생리적 변화에 대한 신속한 조정을 허용하지 않는다. 따라서, 다수의 기능적 ACTH 및 GH 생산 세포를 생성하는 능력은 내분비 기능을 복원하기 위해 소아 및 성인 환자에서 장기적인 치료적 세포 대체 전략의 가능성을 일으킨다.

A. 두개 기원판 발달

두개 기원판은 비제한적으로 눈 수정체, 비강 상피, 귀 구조, 샘하수체, 및 두개 신경의 하위세트, 예컨대 삼차신경 신경절을 포함하는 감각 기관의 세포를 생성하는 것으로 여겨진다.

발달 동안, 감각 기원판은 향후 중추 신경계(CNS)의 전방 부분을 둘러싸는 비-신경 외배엽 및 신경판의 계면에서 형성된다(도 27A).

기원판 발달에서의 결함은 실명 및 난청부터 호르몬 불균형 또는 후각 손실까지의 범위의 광범위한 스펙트럼의 인간의 선천성 기형을 일으킬 수 있다(Abdelhak, et al., 1997; Baker and Bronner-Fraser, 2001; Ruf, et al., 2004). 현재까지, 두개 기원판 발달은 개구리, 제브라다니오, 닭 및 더 적은 범위로 마우스를 포함하는 모델 개체에서 특성규명되었다(Baker and Bronner-Fraser, 2001; Bhattacharyya and Bronner-Fraser, 2004; Schlosser, 2006). 그러나, 인간 기원판 발달은 초기 인간 조직에 대한 접근 및 특이적 기원판 마커의 부재로 인해 대부분 조사되지 않고 남아 있다.

인간 배아(hESCs) 및 인간 유도된 다능성 줄기 세포(hiPSCs)를 포함하는 인간 다능성 줄기 세포(hPSCs)는 매우 넓은 분화 잠재성을 보유하면서 자가 재생하는 잠재성을 갖는다. 지난 수 년에 걸쳐, hESC의 운명을 특정 세포 계통으로 유도하기 위한 프로토콜이 개발되었다. 예를 들어, CNS 세포의 유도는 당분야에서 개발된 첫 번째 hESC 분화 프로토콜에 속했다(Reubinoff, et al., 2001; Zhang, et al., 2001). hESC의 말초 신경계 세포로의 분화도 달성되었다(Lee, et al., 2007; Menendez, et al., 2011).

정의된 CNS 및 NC 유도된 세포 유형의 성공적인 유도 및 적용과는 대조적으로, hPSC에서는 두개 기원판 발달의 모델링에 있어서 제한된 성공만이 있었다. 최근에, 뼈 형태형성 단백질(BMP) 및 TGFβ/Activin/Nodal 신호전달 경로의 동시적 저해(이중-SMAD 저해(dSMADi))에 기반한 신경 유도 전략이 보고되었다(Chambers, et al., 2009). 상기 전략은 hPSC를 Noggin(N) 및 SB431542(SB)로 노출시켜 hPSC의 다양한 CNS 세포 운명으로의 동기화되고 신속하며 효율적인 분화로 이어진다.

한 구현예에서, 본 발명은 인간 두개 기원판의 선택적 유도를 위해 충분한 dSMADi 유도된 분화 동안 내인성 BMP 신호전달의 탈억제를 포함하는 방법을 고려한다. 한 구현예에서, 신규한 기원판 유도 프로토콜(PIP)은 모든 세포의 70% 초과가 분화 11 일 경에 SIX1+ 두개 기원판 전구체 운명을 채택하도록 유도한다.

한 구현예에서, 본 발명은 삼차신경 감각 뉴론, 성숙 수정체 섬유 및/또는 호르몬-생산 전방 뇌하수체 세포를 포함하는 선택적 기원판 운명으로 분화하기 위해 적격인 전-기원판 계통을 확인하는 방법을 고려한다. 한 구현예에서, 삼차신경 감각 뉴론은 비제한적으로 마커 발현, 전기 생리 및 발달 중인 닭 배아 및/또는 성체 마우스 CNS로의 이식을 포함하는 기법에 의해 특성규명된다. 다른 구현예에서, 본 방법은 시험관내 및/또는 생체내에서 성장 호르몬(GH) 및/또는 부신피질 자극호르몬(ACTH)을 생산하는 인간 뇌하수체 세포를 유도할 수 있다.

B. 내인성 BMP 신호전달의 탈억제가 신경외배엽 대신 기원판을 유도함

이전에 보고된 dSMADi 프로토콜(상기 참고)이 기원판 세포의 유도를 위해 적합한지를 해결하기 위해, 적절한 기원판 마커 세트가 정의되었다. 모델 개체에서의 연구에 기반하여, 전사 인자 SIX, EYA, 및 DLX 패밀리의 구성원이 인간 기원판 운명을 표시하는 것으로 보고되었다(Baker and Bronner-Fraser, 2001; Schlosser, 2006). 외배엽 계통 내에서, SIX1은 기원판-특이적으로, 초기 전-기원판 지역 및 다양한 특정 기원판을 모두 표시한다(Schlosser, 2006). 닭 배아에서의 연구에 기반하여, 기원판 유도는 생체내에서 초기 외배엽 패턴화 동안 FGF, BMP 및 WNT 신호의 복잡한 상호작용에 의존한다(Litsiou, et al., 2005). 외배엽 내에서 BMP 활성이 또한 운명을 할당하는데 있어서 특히 유용한 것으로 여겨진다. 예를 들어, 높은 수준의 신호전달이 표피 운명을 촉진하고, 온건한 정도의 수준이 기원판을 유도하고, 중간 수준이 NC를 특정하고, BMP 활성의 완전한 부재가 신경판 형성을 위해 필요한 모델이 처음에 제안되었다(Wilson, et al., 1997). 후속 단계가 BMP 활성화보다 BMP-저해를 필요로 하는 것으로 나타났으나(Ahrens and Schlosser, 2005; Kwon, et al., 2010; Litsiou, et al., 2005) 보다 최근 연구는 기원판 적격성의 구축에서 BMP 신호전달에 대한 초기 역할을 확인함으로써 상기 모델을 수정하였다(Kwon, et al., 2010).

초기 BMP 노출이 SIX1+ 기원판 세포의 유도를 촉진하는지를 시험하기 위해, SB(TGFβ 저해제) 처리된 hESC가 다양한 농도의 BMP4에 노출되었다. 그러나 SB의 존재 하에서 BMP4의 첨가는 이전에 보고된 포배기 외배엽-유사 계통의 BMP-매개된 유도(Xu, et al., 2002)와 유사하게, 극적인 형태적 변화를 야기하고 CDX2의 유도를 유발하였다(도 27B, 27C).

기원판 운명이 내인성 BMP 신호전달의 탈억제를 통해 유도될 수 있는지를 결정하기 위해 N-SB 분화 동안 BMP 저해제 Noggin의 적시 제거가 또한 시험되었다. Noggin이 N-SB 프로토콜의 상이한 시점에서 제거되는 동안 시간 경과 분석이 수행되었다(도 28A). 11 일째의 유전자 발현 분석은 분화 2 또는 3 일째의 Noggin의 제거 시 DLX3, SIX1 및 EYA1의 강력한 유도를 드러내었다(도 28B). 대조적으로, 분화 1 일째의 Noggin 제거는 SIX1 발현의 부재 하에 EYA1의 유도로 이어졌고 형태적 변화뿐만 아니라 CDX2 발현을 유발하여, 포배기 외배엽 분화를 제시하였다(그러나 CDX2 및 EYA1은 또한 hESC-유도된 중배엽 계통에서 발현될 수 있음(Bernardo, et al., 2011)).

이들 데이터는 EYA1이 포배기 외배엽 및 기원판 계통에서 모두 발현되고, SIX1과의 공동-발현이 기원판 계통을 정의할 수 있음을 시사한다. 분화 11 일째에 hESC 자손의 면역세포화학적 분석은 3 일째의 Noggin 제거(PIP 조건)가 N-SB 조건 하에서의 82% PAX6+ 신경외배엽 세포로부터 PIP 하에서의 71% SIX1+ 추정 기원판 전구체 세포로의 전환을 유도하였음을 나타내었다(도 28C, 28D, 27D). SIX1+ 클러스터는 다른 기원판 마커, 예컨대 EYA1, DACH1 및 FOXG1(BF1)을 발현하였다(도 28E).

DACH1은 또한 전방 신경외배엽 세포에서 발현되어(Elkabetz, et al., 2008) 신경 로제트를 표시하는 반면 PIP 처리된 배양에서 DACH1은 기원판 클러스터를 표시한다(도 27E). PIP 조건 하의 유전자 발현의 시간적 분석은 다능성 마커(OCT4, NANOG)뿐만 아니라 포배기 외배엽(CDX2)(도 28F), 중배엽(T) 및 내배엽(SOX17) 마커(도 28G)의 신속한 하향조절을 드러내었다. 기원판에서의 SIX1 발현은 인간 일차 조직에서 확인되었다(Carnegie 단계 15, ~ 5.5 주 p.c.; 데이터는 나타내지 않음). SIX1은 또한 골격근, 흉선 및 신장 세포의 전구체에서 발현된다.

그러나, 골격근(MYOD), 내배엽(SOX17), 또는 중배엽(Brachyury(T)) 마커의 발현은 PIP 동안 검출되지 않아서 hESC-유도된 SIX1+ 세포가 기원판 정체성을 가짐을 확인시켜주었다. 매우 적은(< 1%) NC 계통 세포가 면역세포화학 및 SOX10::GFP(Chambers, et al., 2012; Mica, et al., 2013) 리포터 라인 발현에 의한 SOX10 발현에 기반하여 PIP 조건 하에 관찰되었다(도 27F).

두개 기원판 마커의 유도는 SIX1 및 DLX3의 발현에 선행하는 FOXG1로 5 일 경에 관찰되었다(도 28H). PIP 프로토콜은 여러 hESC 및 hiPSC 라인에서 검증되었다(도 27G, 27H). 보존된 Eya1 인핸서 요소(Ishihara, et al., 2008)가 hESC-유도된 기원판 전구체의 정체성을 추가로 검증하기 위해 이용되었다. GFP 발현은 후각 기원판에서 인핸서의 핵감염 후 관찰되었으나 연령 매칭된 중뇌 배양에서는 관찰되지 않아서(도 27I-J) 특이성을 확인시켜주었다. hESC-유도된 기원판에서, PIP 대 N-SB에서 인핸서 활성을 갖는 세포 백분율에 있어서 8 배 증가가 관찰되었다(도 27K).

C. 마이크로어레이 분석이 신규한 인간 기원판 선조 유전자 발현을 드러냄

시험관내 기원판 유도 공정의 편향되지 않는 분자적 평가를 구축하기 위해 시간적 전사체 분석이 수행되었다. RNA가 대조군 N-SB 대 PIP 처리된 배양에서 3 개씩 5 개 시점(1, 3, 5, 7, 및 11 일)에 수집되었다(도 30A-E; 모든 미가공 데이터는 GEO: (ncbi.nlm.nih.gov/geo/: 접근 #는 미정)에서 이용 가능함). 마이크로어레이 분석 전에, 각 샘플의 품질이 기원판 마커(SIX1, DLX3, EYA1) 패널의 발현 및 다른 계통 마커(FOXA2, (내배엽), SOX17(내배엽), MYOD(골격근), CDX2(영양막), 및 T(중배엽)의 부재에 대해 확인되었다.

클러스터 및 주 성분 분석은 분화 7 일 경에 PIP 대 N-SB 처리된 세포에서 전사체 데이터의 시간적 분리를 나타내었다(도 30A, 29A). 전사체 데이터는 또한 기원판 운명을 신경외배엽 운명과 구별하는 유전자 세트를 정의하였다(표 S1, 2). 기원판 유도 동안 차별적으로 발현되는 특이적 유전자에 대한 식견을 얻기 위해, 각각의 분화 시점에 대해 페어식 비교가 수행되었다(도 30B-E). PIP 조건 하에서 가장 크게 농축된 전사체 중에는 공지된 기원판 마커, 예컨대 GATA3, DLX5, DLX3, TFAP2A, 및 TFAP2C가 있었다. SIX1은 분화 9 일 경에 마이크로어레이 분석에서 유의미하게 상향 조절되었으나, 이는 가장 차별적으로 조절되는 유전자 중에 없었다. 이들 및 추가적인 유전자에 대한 차별적 발현이 qRT-PCR에 의해 확인되었다(도 29B).

유의미한 전사 변화가 WNT 및 BMP 경로 성분에서, 예컨대 WNT 경로 저해제 DKK-1 및 BMP 길항제, 예컨대 BMP 신호전달의 공지된 전사 표적인 GREMLIN-1 및 BAMBI(도 30B-D)에서 증가가 관찰되었다(Grotewold, et al., 2001). 흥미롭게도, 감각 뉴론, 운동뉴론, 심장 선조 및 췌장 샘 세포에 대해 보고된 마커인 ISL1이 또한 유도되었다(Hunter and Rhodes, 2005). ISL1 발현의 초기 개시 및 중배엽 운명의 부재에 기반하여, PIP 조건 하에서는 ISL1이 초기 인간 기원판 마커를 나타내는 것으로 추측되었다. ISL1은 PIP 분화 동안 유도되는 첫 번째 마커들 중 하나였다. TFAP2A 및 SIX1과 유사하게(도 30F), ISL1 단백질은 부분적으로 SIX1과 공동-국소화하며 분화 11 일 경에 대다수 세포에서 발현된 채 유지되었다(도 30G).

본원에 개시된 마이크로어레이 발현 데이터에서 확인된 또 다른 신규한 기원판 마커는 아연-핑거 전사 인자의 Ovo 패밀리 구성원인 OVOL2이다. OVOL2는 분화 5 일 경에 PIP 동안 농축되었고 기원판 클러스터는 OVOL2에 대해 강력한 면역반응성을 나타내었다(도 30H). 대조적으로, OVOL2는 CNS(N-SB) 또는 신경 능선(N-SB/CHIR(Chambers, et al., 2012; Mica, et al., 2013)운명을 촉진하는 조건 하에는 하향조절되었다)(도 30I).

또한 FOXC1 및 HAPNL1(또한 CRTL1로 알려짐)을 포함하는 전방 기원판 전문화 동안 추가적인 차별적으로 발현되는 유전자가 확인되었다. FOXC1은 닭 발달 동안 수정체 기원판을 표시하지만(Bailey, et al., 2006) 또한 전-기원판 단계에 발현될 수 있다(Sasaki and Hogan, 1993). HAPNL1은 PIP에서 가장 차별적으로 발현되는 유전자 중 하나이며, 이전에 표면 외배엽 및 닭 신경판 경계에서 발현되는 것으로 나타났다(Colas and Schoenwolf, 2003). DAVID(david.abcc.ncifcrf.gov/; (Dennis, et al., 2003))를 이용한 유전자 실체(GO) 분석은 감각 기관, 외배엽 및 표피 발달과 연관되는 BMP 및 WNT 경로 전사체가 분화 7 일 및 9 일째에 PIP 대 N-SB 조건에서 고도로 농축됨을 시사하였다(도 29C). 차별적으로 발현되는 유전자의 총 수는 기원판 수임을 위해 제시된 시간 틀과 매치되는 분화 7 일 경에 증가하였다(도 29D, 29E). 요약하면, 본원에서 수행된 분자적 분석은 인간 기원판 발달을 위한 예비 로드맵 및 향후 기능적 연구를 위해 중요한 자원을 제공한다.

D. FGF -저해제를 이용한 초기 처리가 기원판을 억제하고 표면 외배엽 운명을 유도함

몇몇 척추동물 종에서의 계통 연구는 두개 기원판 전구체가 신경 기원인 것보다는 표면 외배엽으로부터 기원하며 주변 신경외배엽에서 출현하는 신호에 의해 유도됨을 시사한다(Pieper, et al., 2012). 그러나 이러한 데이터는 인간 발달에 대해 이용할 수 없다.

인간 기원판 유도의 추정 시점(~ 20 일 p.c.)(O'Rahilly, 1987))은 상기 단계를 실험적 조작을 위해 대부분 접근 불가능하게 만든다. PIP 동안 유전자 발현 데이터는 TFAP2A가 최초기 상향 조절되고 차별적으로 발현되는 유전자 중 하나임을 시사한다(도 30B-E). 마우스 발달 오르쏘로그 유전자, Tcfap2a의 초기 발현(E7.5)은 향후 표면 외배엽으로 제한된다(Arkell and Beddington, 1997).

본원에 제시된 데이터는 PIP 5 일째에 TFAP2A 유도의 최초 검출을 그러나 N-SB 프로토콜에서의 부재를 나타낸다(도 32A). 상기 관찰은 PIP의 3 일 내지 5 일 기간이 표면 외배엽 발달에 대한 수임에 대응함을 제시한다. SIX1은 TFAP2A보다 2 일 더 후에 유도되어(도 32A, 32B) 표면 외배엽 중간체를 추가로 나타낸다.

생체내 유전 연구는 FGF 신호전달의 부재 하에 고수준의 BMP가 표피 운명을 촉진하는 반면 FGF의 활성화 시 감소된 수준의 BMP로 기원판 세포가 구축됨을 시사한다(Kudoh, et al., 2004; Litsiou, et al., 2005). 본 발명의 기전을 이해할 필요는 없지만, PIP 조건 하에서 내인성 FGF 신호전달의 차단은 기원판 유도를 손상시키고 표피 운명을 유발할 수 있는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 본 발명의 데이터는 분화 3-11 일째부터 FGF 신호전달을 저해하는 소분자인 SU5402가 SIX1+ 클러스터의 출현을 억제한 반면(도 32A) TFAP2A 발현은 유지함을(도 32C) 나타낸다.

11 일째에 SIX1 및 TFAP2A 유전자 발현의 정량은 TFAP2A 발현이 유지된 반면 기원판 마커 발현의 완전 손실을 확인시켜주었다(도 32D). TFAP2A+ 세포의 외배엽 전구체 정체성은 PIP + SU5402 처리된 배양에서 표피 전구체 마커 KRT8의 발현에 의해 뒷받침되었다(도 32E). 또한, 장기 배양(42-60 일)은 성숙 각질세포 마커 KRT14의 강력한 유도를 나타내었고(도 32F) 말초에서 KRT14-면역반응성 세포를 갖는 E-CADHERIN 양성 패치를 형성하였다(도 31B). 표피 전구체의 증식능 분석은 E-CADHERIN+/KRT 14- 세포에서 주로 KI67 발현을 나타내었다. 세포 증식은 KRT14를 발현하는 세포의 백분율 증가와 동시에 60 일 경에 감소되었다(도 32G, 31C). 내인성 FGF 신호전달에 대한 요구에 부가하여, 낮은 WNT 및 BMP 수준이 표면 외배엽(3 일)으로부터 초기 기원판 운명으로의 전이를 위해 다른 유용한 파라미터로서 관찰되었다. 고농도의 CHIR 또는 BMP4에 대한 노출은 각각 NC 또는 추정 포배기 외배엽 대신 기원판을 억제하였다(도 31D, 31E).

E. 기원판 전구체가 삼차신경-유형 감각 뉴론으로 효율적으로 분화함

두개 기원판은 비제한적으로 전방 뇌하수체 샘의 호르몬 생산 세포, 구조 세포, 예컨대 눈에서의 수정체 섬유 및 비제한적으로 삼차신경 뉴론을 포함하는 감각 뉴론을 포함하는 광범위한 특화된 세포 유형을 생성하는 것으로 여겨진다(도 34A). 기원판은 특정한 PAX 유전자의 발현을 특징으로 할 수 있다(McCauley and Bronner-Fraser, 2002). 본원에 나타낸 데이터는 표준 PIP 조건 하에서 대부분의 SIX1+ 클러스터가 PAX3을 공동-발현하였음을 나타내어(도 34B) 안구 삼차신경 기원판 정체성을 제시하였다(McCabe, et al., 2004; Stark, et al., 1997). 뉴론 형태를 가지는 HNK1+(Metcalfe, et al., 1990) 세포의 자연적 생성 및 ISL1의 공동-발현은 말초 감각 뉴론 정체성을 확인시켜주었다(도 34C). PIP 조건 하에 감각 뉴론의 기원판 기원을 추가로 확인하기 위해, SIX1과 뉴론 마커의 공동-발현을 평가하였다(도 34D, 33A). PIP-기반 감각 뉴론 분화 동안 SOX10 발현의 부재는 신경 능선 기원을 배제하였다. 분화 20 일 경에(재평판접종 7 일 후), 세포는 긴 방사형 돌기로 연장되는 뉴론을 갖고 감각 뉴론 마커 BRN3A의 핵 발현을 갖는 신경절-유사 구조를 형성하였다(도 34D, 34E). 대부분의 뉴론은 분화 42 일 경에 ISL1 발현을 보유하였고, 말초 뉴론 마커 peripherin의 발현을 획득하였다(도 34F, 33B). 신경전달물질 표현형에 대한 면역세포화학적 분석은 글루타메이트의 발현을 드러내었으나(도 34G) TH 및 GABA의 발현은 없었다(데이터는 나타내지 않음). 이들 데이터는 글루타메이트성 삼차신경 감각 뉴론의 생성과 양립 가능하다. 유전자 발현 분석은 RUNX1(도 34H, 33C) 및 RET(도 33D)의 유도를 나타내어 감각/통증인지 계통을 시사하였다. NTRK1 및 NTRK2를 포함하는 TRK 수용체(도 34I, 33E)의 발현은 통증인지 및 비-통증인지 감각 뉴론 둘 다의 존재를 지적한다(도 33E-G).

통증인지 뉴론 정체성의 진단 마커에는 특정한 나트륨 채널(SCN9A, SCN10A, SCN11A; 도 34J)뿐만 아니라 전통적 통증 수용체, 예컨대 캡사이신 수용체(TRPV1), 저온 감각에 대한 수용체(TRPM8) 및 ATP에 의해 매개되는 염증성 통증의 감각을 위해 중추적인 P2X3 수용체(도 34K)의 발현이 포함된다. 장기적 삼차신경 뉴론 배양(55 일)에서의 유전자 발현 분석은 RET1 및 RUNX1의 지속된 발현을 나타내었다(도 33C, 33D).

기원판-유도된 감각 뉴론의 기능적 분석은 전체 세포 패치-클램프 기록에 의해 수행되었다(도 33G). 뉴론은 2 극 또는 3 극 형태를 나타내는 기록 피펫으로부터 Lucifer yellow로 충전되었다(도 34L, 34M). 일련의 과분극 및 탈분극 펄스에 대해 반응이 측정되었다(도 34N). hESC-유도된 뉴론은 일차 배아 삼차신경 뉴론에 대해 기록된 기능적 특성과 매치되는 역치 탈분극에서 단일 활동 전위를 생성하였다(Grigaliunas, et al., 2002). 평균 휴지 막 전위(RMP)는 -65.6 ± 6.7이었다(도 34L, 34M). 수동 막 및 활동 전위 특성은 (도 34O)에 요약된 바와 같이 2 극 및 3 극 감각 뉴론 간에 필적하여 두 형태적으로 구별되는 모집단이 기능적으로 구별되는 하위그룹을 반영하지 않음을 제시하였다. 삼차신경 감각 뉴론 유도 프로토콜의 강력함은 필적하는 백분율의 ISL1 및 BRN3A 발현 뉴론이 관찰되는 여러 hESC 및 hiPSC 라인에 걸쳐 추가로 평가되었다(도 33H).

F. 발달 중인 닭 배아 및 성체 마우스 CNS에서 hESC -유도된 삼차신경 뉴론의 생체내 분석

hESC-유도된 삼차신경 기원판 전구체의 생체내 특성을 평가하기 위해, 항상적으로 GFP를 발현하는 hESC 라인으로부터 유도된 PIP-유도된 뉴론 클러스터(도 35A, 35B)를 H&H 단계 10-12에서 초기 삼차신경 원기를 표적화하여 발달 중인 닭 배아 내로 주사하였다(도 35C). 인간 세포를 GFP 발현 및 세포질 항원(hCA)에 대한 인간 특이적 항체의 이용에 기반하여 확인하였다. 난소 이식 2 일 후, 생존하는 GFP+ 세포는 내인성 닭 삼차신경 신경절 영역에서 분산되어 나타났다(도 34P). hCA 및 peripherin을 공동 발현하는 광범위한 GFP+ 인간 섬유 번들이 관찰되었다(도 34Q, 34R). 대조적으로, 배아 신경관에서는 hCA 또는 peripherin 발현이 검출되지 않았다(도 35D). 이식 2 일 후 생체내 섬유 증식은 재평판접종된 삼차신경 뉴론 클러스터의 광범위한 시험관내 섬유 증식을 연상시켰다(도 35A). 생체내 Peripherin 발현(도 34S)은 그라프팅된 세포의 말초 신경 정체성을 확인시켜주었다.

hESC-유도된 삼차신경 뉴론은 이들이 성체 마우스 CNS에서 그라프트화되고 생리적 표적을 향해 돌출될 수 있는지에 대해 평가되었다. 뇌간 내 삼차신경 핵은 반대쪽 시상으로 전달되는 삼차신경 감각 신경절로부터 들어오는 신경분포를 수신한다. 교뇌는 수술적으로 접근이 가능하고 삼차신경 신경절로부터 들어오는 입력부를 수신하는 삼차신경 뇌간 핵 근처에 위치하므로, 이식을 위한 부위로 선택되었다. 그러므로, GFP+ 인간 삼차신경 뉴론 클러스터가 정위 수술을 통해 성체 NOD/SCID 마우스 내로 주사되었다. 이식 4 주 후의 조직학적 분석은 배 교뇌에서 GFP+ 인간 세포 그라프트의 생존을 나타내었다(도 35E). GFP+ 세포체는 주사 부위에서 단단히 클러스터링되어 유지되었지만, GFP+ 섬유는 내인성 삼차신경 핵을 포함하는 숙주 뇌(N=6) 내로 광범위한 돌출을 나타내었다(도 35F). BRN3A의 발현은 세포의 감각 뉴론 정체성을 확인시켜주었다(도 35G). 그라프트 코어로부터 나오는 그라프트-유도된 인간 섬유 번들(hNCAM+ 및 GFP+)이 관찰되었다(도 35H).

이들 데이터는 삼차신경 기원판 유도체의 생체내 생존, 감각 뉴론 계통에 따른 분화 및 배아 닭 및 성체 마우스 뇌에서 관련 내인성 표적을 향한 액손 돌기의 구축을 나타낸다.

데이터는 삼차신경 감각 뉴론이 통증 증후군 및 편두통에 대한 약물 스크리닝을 위해 유용할 수 있음을 제시한다. 예를 들어, 삼차신경 기원판 세포로부터 생성된 삼차신경 뉴론 상에서 시험관내 전기생리학에 의한 판독이 수행될 수 있다. 본원에 나타낸 데이터는 기원판-삼차신경 감각 뉴론이 일차 삼차신경 감각 뉴론에 대해 기록되는 기능적 특성과 매치되는 단일 활동 전위를 가짐을 나타낸다. 그러나, 이들 세포는 특정한 나트륨 채널의 발현을 포함하는 통증인지 뉴론 정체성의 진단 마커를 발현한다.

G. 추정 전-기원판 단계의 확인

본원에 나타낸 데이터는 PIP 조건이 안구 삼차신경 기원판 운명을 효율적으로 유도함을 시사한다. 다른 기원판 운명이 개질된 PIP 조건을 이용해서 생성될 수 있는지를 조사하기 위해, 배양 시스템에서 추정 전-기원판 세포의 존재가 해결되었다.

척추동물 발달 동안, 전-기원판은 기원판 정체성을 결정하기 위한 신호에 반응하기 적격인 전구체 세포를 함유하는 발달 원기를 특징으로 한다(Martin and Groves, 2006). 다양한 모델 개체에서의 전-기원판 세포는 Six1을 발현하고 외배엽 및 신경 운명 둘 다의 마커를 공동 발현하는 것으로 나타났다. 그러나, 인간 전-기원판의 발달은 조사되지 않고 남아있다.

TFAP2A(초기 외배엽 마커) 및 PAX6(초기 신경외배엽 마커(Zhang, et al., 2010))에 대해 시간 경과 공동-발현 분석이 수행되었다. 첫 번째 분화 3 일 동안, 공동-발현의 증거 없이 소수의 희박한 PAX6 또는 TFAP2A 발현 세포 패치만 관찰되었다(도 36A). 5 일째에, Noggin 제거 2 일 후(PIP), PIP 조건 하에서 TFAP2A+ 세포 수의 증가(도 36B) 및 N-SB에서 TFAP2A+ 세포의 동시적 손실(도 36C)이 존재했다. 7 일째에, N-SB 조건은 TFAP2A 발현이 없는 PAX6+ 세포를 산출하였으나(도 36C) PIP 처리된 배양은 TFAP2A 및 PAX6의 광범위한 공동-발현을 나타내어, 전-기원판 정체성을 시사하였다(도 36B). TFAP2A/PAX6 이중 양성 세포의 출현은 분화 7 일 경 SIX1+ 클러스터의 출현 및 SIX1 유전자 발현의 개시와 일치하였다(도 32B, 37A). 11 일 경에, 기원판 클러스터는 PAX6에 대해 음성이었지만 TFAP2A의 발현을 보유하여(도 36B) 초기 전방 PAX6+ 전-기원판 세포가 PAX3+에 대해 농축된 PAX6-음성 후방 기원판 모집단을 생성함을 제시하였다. 상기 분화 모델은 PIP의 7-11 일째로부터 강력한 PAX3의 증가를 나타내는 유전자 발현 데이터에 의해 추가로 뒷받침되었다(도 36D). PIP의 7-11 일째로부터 FGF 신호전달 또는 WNT 저해제를 이용한 처리는 PAX3 유도를 억제한 반면(도 36E) PAX6은 유지하였다(도 36F).

이들 결과는 내인성 신호가 전방 PAX6+ 전-기원판으로부터 후방 PAX3+ 기원판 계통으로의 전이에 기여함을 시사한다. 11 일 N-SB 배양에서 소수의 TFAP2A 세포(도 36C)는 PAX6 발현이 없는 신경 능선 전구체를 나타낼 수 있다(Chambers, et al., 2009). PIP 조건 하에서, 11 일째에 오염시키는 SOX10+ NC 세포의 백분율은 1% 미만이었다(도 27F).

H. 전- 기원판 단계에 FGF -저해제 SU5402를 이용한 처리가 수정체 운명을 유도함

추정 전-기원판 세포는 삼차신경 뉴론이 아닌 특정한 기원판 운명으로 분화될 수 있는지에 대해 시험되었다. 영장류 및 hESC로부터 수정체 전구체(렌즈체)의 자연적 출현은 이미 보고되었지만(Ooto, et al., 2003; Zhang, et al., 2010), 계통 기원 및 유도 신호는 이들 연구에서 조사되지 않고 남아 있었다.

수정체 기원판 전문화에 대한 4 개의 발달 신호전달 경로의 영향이 BMP, FGF, WNT, 및 Hedgehog 신호전달의 활성화제 및 저해제를 이용해서 시험되었다. 수정체 기원판 운명의 유도를 정량하기 위해, 수정체 전구체 마커 PITX3 발현이 분화 16 일째에 모니터링되었다(도 37B). PITX3 발현은 재조합 BMP4의 존재 하에 또는 FGF-저해성 분자, SU5402에 대한 노출 시 유의미하게 유도되었다(도 36F). BMP 및 FGF에 대한 역할은 닭에서의 발달 연구에서 이전에 제안되었다(Sjoedal, et al., 2007). 추가 분화는 57 일째에 성숙 수정체 섬유 구조의 형성 및 αβ-결정형의 강력한 유도를 드러내었다(도 36G, 왼쪽 패널). 수정체 섬유의 특징적 층화(도 36G, 오른쪽 패널)는 생체내 발달 중인 수정체의 구조적 특성을 모방하였다.

I. 전-기원판 단계에서 SHH를 이용한 처리는 전방 뇌하수체 세포를 유도함

본원에 나타낸 데이터는 전-기원판 세포가 전방 뇌하수체 기원판으로 분화되고 다양한 뇌하수체 전구체 및 호르몬 생산 세포 유형을 재생성할 수 있음을 나타낸다(도 38A). 전-기원판 단계(7-11 일)에서 SHH 신호전달에 대한 작동제를 이용한 추가 처리(도 39A)는 경구 외배엽 마커 SIX6 및 PITX1(도 38B), 뇌하수체 샘 발달의 주요 조절물질의 발현을 유도하였다(Tremblay, et al., 1998). 전사체 및 단백질 수준에서 PITX1 및 SIX6의 유도는 SHH 용량에 의존하였다(도 38B, 38C). 또한, SHH 처리는 완성 뇌하수체 전구체 마커 LHX3의 발현을 유발하였다(도 38D).

전방 뇌하수체 샘의 내분비 세포는 3 개의 주요 전구체 계통으로부터 유도된다(Scully and Rosenfeld, 2002). PIP + SHH 처리 후, TBX19의 강력한 유도가 관찰되었고(도 38E), 이는 ACTH 및 MSH 생산 세포를 생성하는 전구체에 대해 특이적이었다. PIT1 및 GATA2 전구체 계통의 유도는 덜 효율적이었지만 γ-시크리타제 저해제 DAPT를 이용한 처리 후 증가되었다(도 38F, 38G).

뇌하수체 호르몬에 대한 면역세포화학은 16 일째에 CGA 발현을 나타내었으나 FSH, ACTH 및 GH의 단백질 발현은 분화 25-30 일에 처음으로 관찰되었다(도 38H-K). ACTH+ 세포의 유도는 특히 효율적이었고(도 38J) ACTH 호르몬의 시험관내 방출은 ELISA에 의해 쉽게 검출될 수 있었다(도 38L).

또한, 이들 hESC-유도된 뇌하수체 세포는 마우스 및 래트 이종이식편 모델에서 생체내 생존 및 기능이 가능하다(도 38M, 39B, 39C). 성체 수컷 NOD/SCID 마우스 내로의 GFP-표시된, hESC-유도된 뇌하수체 전구체의 피하 주사(분화 16 일째)는 생체내 GSU 및 FSH 세포의 생존을 나타내었다(도 39D, 39E).

누드 수컷 래트(n=8; 그라프팅 후 4-6 주)에서의 장기 생존 연구는 이른 오전 시간 동안 측정된 바와 같이(주간 주기 동안 저 지점의 내인성 ACTH 발현) 혈청 ACTH 수준에서 유의미한 증가를 나타내었다(도 38N). 인간 GH 수준은 마우스 GH가 아니라 인간 GH를 선택적으로 검출하는 ELISA 분석을 이용해서 생체내 측정되었다(도 38O).

래트 숙주 내로의 이식은 반복된 채혈을 허용하였고 모의 주사(매트리겔만) 동물에 비해 그라프팅된 동물에서 ACTH 및 GH 수준의 일관된 증가를 나타내었다. 마지막으로, 조직학적 분석은 이식 6 주 후 평균 0.46 ± 0.015 백만 개의 생존 hNCAM+ 세포를 나타내었다(도 38P). 약 10%의 생존 인간 세포는 ACTH를 발현하였고(도 38Q), 6%의 세포는 GH에 대해 면역반응성이었다(도 38R).

개질된 PIP 조건을 통해 hESC로부터 기능적 호르몬 생산 뇌하수체 세포를 유도하는 능력은 뇌하수체 계통을 유도하기 위해 복잡한 공동-배양 시스템에 대한 필요성을 제시하는 마우스 ESC에서 주어진 이전 작업에 있어서 특히 흥미로운 것이다(Suga, et al., 2011). 그라프트-유도된 ACTH 및 GH의 생체내 생존 및 생산은 유전적, 수술적 또는 방사선 유도된 뇌하수체저하증을 겪는 환자에 대한 반영 가능성을 제시한다(Tabar, 2011).

뇌하수체 기원판 세포로부터 유도된 ACTH를 생산하는 시험관내 뇌하수체 세포는 시험관내에서 ACTH를 생성하기 위해 이용될 수 있다. ACTH는 영아 연축을 치료하기 위해 매우 중요하다. 또한, 상업적으로 이용 가능한 하나의 조성물(Acthar Gel)이 영아 연축을 치료하기 위해 이용되는 장기 지속 동물 제품이다. Acthar Gel은 현재 극히 고가의 약학 제품이라는 점에서 단점을 갖는다. 바이알 당 가격이 $36,000만큼 높았다. 성장 호르몬이 또한 대사성 장애, 예컨대 성장 호르몬 부전에 대해 이용될 수 있다.

VII. 비-기원판 세포로부터 기원판 세포의 유도

특정 구현예에서, 본 발명은 비-기원판 세포, 예컨대 인간 배아 줄기 세포(hESCs)를 포함하는 배아 줄기 세포(ESCs), 또는 인간 iPSC를 포함하는 유도된 다능성 줄기 세포(iPSCs)로부터 기원판 전구체 세포를 유도하기 위한 조성물, 키트 및 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 기원판 전구체 세포는 본원에 기재된 바와 같이 비-기원판 세포를 SMAD의 저해제와 배양함으로써 유도된다. 특정 구현예에서, SMAD 저해제는 ALK 저해제이다. 특정 구현예에서, ALK 저해제는 ALK4, ALK5 및/또는 ALK7 수용체의 인산화를 차단함으로써 Lefty/Activin/TGF베타 경로를 저해한다. 특정 구현예에서, SMAD 저해제는 SB431542이다. 특정 구현예에서, 조성물, 키트 및 방법에는 BMP 활성 제제, 예를 들어 BMP4가 추가로 포함된다. 특정 구현예에서, 비-기원판 세포는 SMAD 저해제 및 BMP 활성 제제를 포함하는 배지 중에 배양되며, 여기서 BMP 활성 제제는 배양 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10 일 후 배지로부터 제거된다. 특정 구현예에서, BMP 활성 제제는 배양 3 일 후 배지로부터 제거된다. 특정 구현예에서, BMP 활성 제제는 배양 배지 중에 약 0.5 내지 약 20 ng/mL, 또는 약 1 내지 약 15 ng/mL, 또는 약 2 내지 약 10 ng/mL, 또는 약 3 내지 약 5 ng/mL의 농도로 존재한다. 특정 구현예에서, BMP 활성 제제는 배양 배지 중에 약 5 ng/mL의 농도로 존재한다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따른 비-기원판 세포의 배양은 검출가능한 수준의 SIX1 및 PAX6을 발현하는 세포의 분화를 유도한다. 특정 구현예에서, 세포는 또한 검출가능한 수준의 TFAP2A를 발현한다. 특정 구현예에서, 검출가능한 수준의 SIX1 및 PAX6을 발현하는 세포는 기원판 전구체 세포이다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따른 비-기원판 세포의 배양은 검출가능한 수준의 SIX1 및 PAX3을 발현하는 세포를 유도한다. 특정 구현예에서, 검출가능한 수준의 SIX1 및 PAX3을 발현하는 세포는 삼차신경 기원판 세포이다. 특정 구현예에서, 검출가능한 수준의 SIX1 및 PAX3을 발현하는 세포는 검출가능한 수준의 SIX1 및 PAX6을 발현하는 세포(예를 들어, 기원판 전구체 세포)를 삼차신경 기원판 유도제, 예컨대 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF) 및/또는 Wnt와 배양함으로써 유도된다. 특정 구현예에서, BDNF 및 Wnt는 인간 BDNF 및 Wnt이다. 특정 구현예에서, 삼차신경 기원판 유도제는 본원에 기재된 기원판 유도 세포 배양 프로토콜의 3 일, 또는 4 일, 또는 5 일, 또는 6 일, 또는 7 일, 또는 8 일, 또는 9 일, 또는 10 일째에 배양 배지에 첨가된다.

특정 구현예에서, SIX1 및 PAX3을 발현하는 유도된 세포는 또한 검출가능한 수준의 GD2를 발현한다. 특정 구현예에서, SIX1, PAX3 및 GD2를 발현하는 세포는 삼차신경 기원판 세포이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 검출가능한 수준의 GD2를 발현하지 않는 세포 혼합물로부터 검출가능한 수준의 GD2를 발현하는 세포를 단리하거나 정렬하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 방법에는 FACS 정렬 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 세포 정렬 방법이 포함된다.

특정 구현예에서, SIX1 및 PAX3을 발현하는 유도된 세포는 또한 검출가능한 수준의 CD57(HNK1)을 발현한다. 특정 구현예에서, SIX1, PAX3 및 CD57(HNK1)을 발현하는 세포는 삼차신경 기원판 세포이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 검출가능한 수준의 CD57(HNK1)을 발현하지 않는 세포 혼합물로부터 검출가능한 수준의 CD57(HNK1)를 발현하는 세포를 단리하거나 정렬하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 방법에는 FACS 정렬 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 세포 정렬 방법이 포함된다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따른 비-기원판 세포의 배양은 검출가능한 수준의 SIX1 및 PITX3을 발현하는 세포를 유도한다. 특정 구현예에서, 검출가능한 수준의 SIX1 및 PITX3을 발현하는 세포는 수정체 기원판 세포이다. 특정 구현예에서, 검출가능한 수준의 SIX1 및 PITX3을 발현하는 세포는 검출가능한 수준의 SIX1 및 PAX6을 발현하는 세포(예를 들어, 기원판 전구체 세포)를 수정체 기원판 유도제, 예컨대 소닉 헤지호그(SHH), 푸르모르파민, γ-시크리타제 저해제 및/또는 FGF 저해제와 배양함으로써 유도된다. 특정 구현예에서, SHH는 인간 SHH이다. 특정 구현예에서, 수정체 기원판 유도제는 본원에 기재된 기원판 유도 세포 배양 프로토콜의 3 일, 또는 4 일, 또는 5 일, 또는 6 일, 또는 7 일, 또는 8 일, 또는 9 일, 또는 10 일째에 배양 배지에 첨가된다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따른 비-기원판 세포의 배양은 검출가능한 수준의 SIX1 및 PITX1을 발현하는 세포를 유도한다. 특정 구현예에서, 검출가능한 수준의 SIX1 및 PITX1을 발현하는 세포는 뇌하수체 기원판 세포이다. 특정 구현예에서, 검출가능한 수준의 SIX1 및 PITX1을 발현하는 세포는 검출가능한 수준의 SIX1 및 PAX6을 발현하는 세포(예를 들어, 기원판 전구체 세포)를 뇌하수체 패턴화 인자, 예를 들어 소닉 헤지호그(SHH), 푸르모르파민, γ-시크리타제 저해제, FGF8, FGF10, BMP2, 및/또는 시상하부 CM과 배양함으로써 유도된다. 특정 구현예에서, SHH, FGF8, FGF10, BMP2 및 시상하부 CM은 인간 SHH, FGF8, FGF10, BMP2, 및 시상하부 CM이다. 특정 구현예에서, 뇌하수체 패턴화 인자는 본원에 기재된 기원판 유도 배양 프로토콜의 3 일, 또는 4 일, 또는 5 일, 또는 6 일, 또는 7 일, 또는 8 일, 또는 9 일, 또는 10 일째에 배양 배지에 첨가된다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 조건 하에 배양되는 뇌하수체 기원판은 뇌하수체 호르몬 발현 세포로 추가 분화된다.

특정 구현예에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들어 뇌하수체저하증으로 진단받거나 이에 대한 위험에 처한 대상체 내로의 본원에 기재된 방법에 따라 유도된 뇌하수체 기원판 세포 및/또는 뇌하수체 호르몬 발현 세포의 그라프팅 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 세포는 대상체의 뇌 또는 뇌하수체 샘 내로 그라프팅된다.

특정 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 따라 제조되는 세포를 제공한다.

특정 구현예에서, "검출가능한" 수준의 단백질은 단백질이 당분야에 공지된 면역세포화학적 기법에 의해 검출가능함을 의미한다.

특정 구현예에서, "유도된 다능성 줄기 세포"는 비-다능성 세포, 예컨대 성체 세포, 예를 들어 성체 체세포로부터, 또는 임의의 다른 분화된 또는 성숙 세포로부터 생성되는 다능성 줄기 세포를 나타낸다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 제조되고 본원에 기재된 바와 같이 치료 목적을 위해 수신체 대상체에 투여되거나 그라프팅되는 세포는 세포 수신체에 대해 이종성, 자가성, 동종이계, 이종이계 또는 동계이다.

VIII. 기원판 유도제에 대한 스크리닝

특정 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 따라 배양된 비-기원판 세포로부터 유도되는 기원판 및 기원판 전구체 세포의 유도를 증강시키는 화합물에 대한 스크리닝 방법을 제공한다.

특정 구현예에서, 스크리닝 방법은 본원에 기재된 방법에 따른 비-기원판 세포의 배양 단계를 포함하며, 여기서 시험 화합물은 배양 배지로 1 일, 또는 2 일, 또는 3 일, 또는 4 일, 또는 5 일, 또는 6 일째, 또는 7 일째에 첨가된다. 특정 구현예에서, 시험 화합물은 3 일째에 배양 배지에 첨가된다. 특정 구현예에서, 스크리닝 방법은 시험 화합물과 배양된 세포에서 기원판 전구체 마커, 예컨대 SIX1 및/또는 PAX6 및/또는 TFAP2A의 검출가능한 발현 수준을 결정하는 단계 및 상기 수준을 시험 화합물 없이 배지 중에 배양된 세포에서 동일한 마커의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 시험 화합물과 배양된 세포에서의 마커 발현 수준의 증가는 시험 화합물이 기원판 전구체 유도를 증강시킴을 시사한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이 기원판 전구체 유도를 증강시키는 화합물을 제공한다. 특정 구현예에서, 화합물은 BRL-54443, 또는 이들의 염, 예컨대 BRL-54443 말레에이트이다.

특정 구현예에서, 화합물은 파르테놀라이드이다.

특정 구현예에서, 화합물은 펜안트롤린이다.

특정 구현예에서, 본 발명은 기원판 전구체 세포의 유도를 증강시키는 방법을 제공하며, 여기서 비-기원판 세포는 본원에 기재된 방법에 따라 배양되고, 세포 배양 배지는 약 0.001 내지 약 20 mM, 또는 약 0.01 내지 약 15 mm, 또는 약 0.1 내지 약 10 mM, 또는 약 1 내지 약 10 mM, 또는 약 2 내지 약 5 mM의 농도에서 기원판 전구체 유도를 증강시키는 화합물로 보충된다.

참고문헌

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O'Rahilly, R. M., F.(1987). Developmental stages in human embryos, Vol 637, (Washington, D.C.: Carnegie Institution of Washington).

실험

하기 실시예는 본 발명의 특정 구현예 및 측면을 예시하는 작용을 하며, 이들의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 후술되는 실험 개시에서, 하기 약어가 적용된다: N(노르말 농도); M(몰 농도); mM(밀리몰 농도); μM(마이크로몰 농도); mol(몰); mmol(밀리몰); ㎛ol(마이크로몰); nmol(나노몰); pmol(피코몰); g(그램); mg(밀리그램); ㎍(마이크로그램); ng(나노그램); pg(피코그램); L(리터) 및; ml(밀리리터); ㎕(마이크로리터); cm(센티미터); mm(밀리미터); ㎛(마이크로미터); nm(나노미터); U(단위); min(분); s 및 sec(초); deg(도); 및 ℃(섭씨 도/섭씨).

하기는 일반 세포 배양 제형이다:

유지용 hESC 배지(1 리터):

800 mL의 DMEM/F12, 200 mL의 녹아웃 혈청 대체제, 5 mL의 200 mM L-글루타민, 5 mL의 Pen/Strep, 10 mL의 10 mM MEM 최소 비-필수 아미노산 용액, 1000 ㎕의 β-메르캅토에탄올, bFGF(최종 농도는 4 ng/mL임)

hESC 분화용 KSR 배지(1 리터):

820 mL의 녹아웃 DMEM, 150 mL의 녹아웃 혈청 대체제, 10 mL의 200 mM L-글루타민, 10 mL의 Pen/Strep, 10 mL의 10 mM MEM, 1 mL의 β-메르캅토에탄올

hESC 분화용 N2 배지(1 리터):

DMEM/F12 분말 함유 985 ml 증류수, 1.55 g 글루코스, 2.00 g NaHCO₃, 25 mg 인슐린, 0.1 g 아포트랜스페린, 30 nM 나트륨 셀레나이트, 100 μM 푸트레신, 20 nM 프로게스테론

PMEF 제조용 10% FBS 함유 DMEM(1 리터):

885 mL의 DMEM, 100 mL의 FBS, 10 mL의 Pen/Strep, 5 mL의 L-글루타민

MS-5 영양세포 제조용 10% FBS 함유 알파 MEM(1 리터):

890 mL의 알파 MEM, 100 mL의 FBS, 10 mL의 Pen/Strep

젤라틴 용액(500 ml):

0.5 g의 젤라틴을 500 mL의 따뜻한(50-60℃) Milli-Q 수중에 용해시킨다. 실온으로 냉각한다.

Noggin은 R&D system에서 카탈로그 번호: 719-NG, 재조합 마우스 Noggin Fc 키메라로 구매하였다.

실시예 I.

뼈 형태형성 단백질(BMP) 수준이 기원판 운명 정체성을 결정함:

감각 기원판은 초기 신경외배엽 및 비-신경 외배엽 조직의 계면에서 형성되는 발달 구조이다. N-SB 배양 시스템이 기원판 세포의 유도에 적합한지를 해결하기 위해, 인간 배아 줄기 세포(hESCs)-유도된 배양에서 기원판 정체성을 확인하기 위한 마커 세트를 구축하였다. 다른 모델 개체에서의 연구로부터, hESC 분화 동안 인간 기원판 전구체를 확인하기 위한 여러 후보 마커에는 비제한적으로 전사 인자의 Six, Eya, 및 Dlx 패밀리 구성원이 포함된다. Six1은 모델 개체에서 전-기원판 지역 및 기원판 세포를 표시하지만 골격근 전구체에서도 발현된다. 면역세포화학적 분석은 N-SB 분화의 11 일째에 6% ± 4%의 Six1+ 세포를 드러내었다. Six1+ 세포에서 골격근 마커의 발현 부재는 기원판 전구체 세포 정체성을 제시하였다.

다수의 발달 연구가 생체내 초기 외배엽 패턴화 동안 BMP 신호전달에 대한 역할을 나타내었다. 하나의 모델은 외배엽 내에서 BMP 활성 구배가 상이한 세포 운명을 할당하여, 높은 수준의 신호전달이 표피를 촉진하고, 온건한 수준이 기원판을 유도하고, 중간 수준이 신경 능선을 특정하며, BMP 활성의 완벽한 부재가 생체내 신경판 형성을 위해 필요함을 제시한다[Streit, et al., Dev Biol, 2004. 276(1): p. 1-15, 본원에 참조로 도입됨]. 외인성 BMP의 첨가가 Six1+ 세포의 유도를 증강시키는지 여부를 시험하기 위해, SB431542(1 μM)가 처리된 hESC를 다양한 농도의 BMP4에 노출시켰다. 그러나, BMP4의 초기 첨가는 세포의 극적인 형태적 변화 및 cdx2의 유도를 야기하여 영양외배엽 운명으로의 분화를 제시하였다. SB431542의 부재는 BMP에 대한 초기 노출이 hESC 분화 동안 영양외배엽 운명을 유도할 수 있음을 나타내었다[Chambers, et al., Nat Biotechnol, 2009. 27(3): p. 275-80; Xu, et al., Nat Biotechnol, 2002. 20(12): p. 1261-4, 본원에 참조로 도입됨].

N-SB 분화 동안 BMP 저해제 noggin의 제거는 내인성 BMP 신호전달의 탈-억제에 의해 기원판 운명의 출현을 증강시킬 수 있다. 상기 목적을 위해, 분화 11 일째에 qRT-PCR 분석에 의해 영양외배엽, 신경외배엽 기원판 마커(도 11B)의 유도를 모니터링하면서 NSB 프로토콜의 상이한 시점에 noggin을 제거하여 시간 경과 연구를 수행하였다(도 11A). 분화 2 또는 3 일째의 noggin 제거는 Six1의 효율적인 유도를 일으킨 반면, 분화 1 일째의 noggin 제거는 Six1 발현 부재 하에 Eya1의 유도로 이어진다. 1 일째 noggin 제거를 거친 배양에서의 형태적 변화 및 Cdx2의 발현 유도는 영양외배엽 운명으로의 분화를 시사하였고 Eya1이 기원판 세포에 부가하여 영양외배엽 전구체에서 발현됨을 제시하였다. 면역세포화학적 분석은 분화 3 일째의 noggin 제거가 표준 N-SB 조건 하에 수득된 주로 Pax6+ 신경외배엽 세포로부터 71% Six1+ 추정 기원판 전구체 세포로 이루어진 모집단으로의 전환을 유도하였음을 나타내었다(도 11C, D). 공동-표지 연구는 Six1+ 세포에서 다른 기원판 마커, 예컨대 골격근 운명 마커의 부재 하에 Eya1의 공동-발현을 나타내었다.

마이크로어레이 분석은 신규한 인간 기원판 선조 유전자 발현을 드러내었다: 기원판 전구체 세포 정체성의 기원판 유도의 편향되지 않은 측정을 수득하기 위해, 본 발명자들은 Illumina 비드 어레이 플랫폼을 이용해서 전반적 유전자 발현의 시간 경과 분석을 수행하였다. RNA를 대조군 N-SB 배양(전방 신경판 세포 산출; 1-11 일 동안 noggin/SB431542 처리)에서; 그리고 기원판 운명을 촉진하는 조건 하에(전방 기원판 세포; 11 일 동안 SB431542 처리; 1-3 일 Noggin 처리) 분화 동안 5 개 시점(1, 3, 5, 7, 및 11 일)에 수집하였다. 마이크로어레이 분석 전에 각 샘플의 품질을 기원판 마커 패널(Six1, Dlx3, Eya1)의 발현에 대해 그리고 다른 계통, 예컨대 Foxa2(내배엽), Sox17(내배엽), MyoD(골격근), cdx2(영양막), 및 T(Brachyury)(중배엽)의 부재에 대해 확인하였다. 각 시점 그리고 배양 조건에 대해 3 개의 독립적 샘플에서 전반적 유전자 발현 연구를 수행하였다. 데이터를 log2 비로 전환하여 분화 동안 기원판 대 N-SB 프로토콜에서 유전자 발현 수준을 비교하였다(도 12A-D).

시간 경과 데이터는 기원판 전사 프로필의 편향되지 않은 평가로서 DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/; Dennis, et al., Genome Biology 2003 4:P3, 2003. 4(5): p. P3, 본원에 참조로 도입됨)를 이용해서 유전자 실체(GO) 농축 분석을 거쳤다. 분화 5 일 및 7 일째에 기원판 조건 대 NSB 대조군 배양에서 고도로 농축된 전사체 중에는 감각 기관 발달, BMP 및 Wnt 경로, 내이 발달 및 신경 패턴화와 연관된 유전자가 있었다. 감각 기관 발달 및 신경 패턴화 인자의 농축은 개질된 N-SB 프로토콜을 이용해서 유도된 배양의 전방 기원판 정체성을 추가로 확인시켜준다. 신경판 마커 및 신경 마커는 또한 개질된 N-SB(분화 2 일 후 noggin 제거) 대 NSB(즉 적어도 2 개의 SMAD 또는 BMP 신호전달 화합물을 이용한 세포 처리) 프로토콜에서 하향 조절되었다.

기원판 전문화 동안 차별적으로 발현되는 특정 유전자에 대한 식견을 얻기 위해, 본 발명자들은 각각의 분화 단계에 대해 페어식 비교를 수행하였다. 분화 5 일 및 7 일째에(1 일 대비) 유의미하게 조절되는 대다수의 유전자가 NSB 및 개질된 N-SB 프로토콜에서 공유되었으나, 전사체의 하위세트는 차별적으로 조절되었다. 특히, 감각 뉴론 발달에 대해 매우 널리 공지된 마커인 Islet-1의 증가가 개질된 N-SB 프로토콜에서 관찰되었다. Isl1은 또한 다른 계통, 예컨대 운동뉴론, 심장 선조 및 췌장 섬 세포에서 발현된다. hESC 분화 동안 발현의 초기 발현 개시는 Islet-1이 전방 전-기원판 지역에서 형상화된 말굽을 표시하는 제브라다니오 발달 동안의 그 발현과 유사하게 초기 기원판 전구체 세포를 표시함을 제시한다. 따라서, Islet-1은 인간 다능성 줄기 세포의 분화 동안 발현되는 첫 번째 기원판 마커 중 하나이다. 개질된 N-SB 프로토콜은 NSB 조건과 비교되는 경우, 5 일, 7 일, 9 일 및 11 일째에 Islet-1에 대해 고도로 농축된 발현을 유도하였다. 마이크로어레이 데이터에서, 기원판 유전자, GATA3, Dlx5, TFAP2a, 및 TFAP2c가 농축된다. Wnt 경로 및 BMP 경로 성분에서의 유의미한 변화도 관찰되었다. 예를 들어, 5 일째만큼 빠른 시기에 Wnt 경로 저해제 DKK-1의 유의미한 증가가 있었으며, 상기 증가는 프로토콜 과정에 걸쳐 지속되었다. 몇몇 Wnt 수용체의 유의미한 하향-조절이 Noggin 제거에 반응하여 관찰되었다. BMP 길항제, 예컨대 BMP 신호전달에 반응하여 활성화되는 gremlin-1 및 BAMBI의 유도는 noggin 제거가 하류 유전자의 대응하는 증가와 더불어 hESC 분화 동안 내인성 BMP 신호전달에서 변화를 유도함을 확인시켜준다.

또한, Shisa2, Ovol2 및 Foxc1을 포함하는 전방 기원판 전문화 동안 차별적으로 발현된 여러 추가적인 유전자가 확인되었다. 이들 및 추가적인 유전자의 차별적인 발현은 qRT-PCR에 의해 확인되었다. Ovol2는 다양한 모델 개체에서 표면 외배엽 및 기원판 운명의 공지된 마커이다. 마우스에서, Ovol2 녹아웃은 치명적이며, Ovol2-/- 마우스 배아에서는 기원판-유도된 조직, 예컨대 눈 술잔, 및 귀 소포가 발달하지 않는다.

유전자 클러스터 분석은 유전자가 가장 많이 발현되었을 때; 최대 시간(TOM) 및 가장 적게 발현되었을 때; 최소 발현 시간(TIM)을 나타내었다. GO 실체 항이 상기 분석 내로 맵핑되었고, 기원판 전구체 세포 전문화 동안 정확한 발달 윈도우를 확인할 수 있었다. 이들 데이터는 추가적으로 hESC 유도된 기원판 조직의 정체성을 확인시켜주었고, 기원판 대 전방 신경판(AN) 전문화에 관여되는 마커 및 경로를 드러내었다.

차별적으로 발현된 전사체의 클러스터링(도 12E)은 모든 복제 샘플의 정확한 매칭을 드러내었다. 이들 데이터는 또한 신경외배엽을 기원판 전구체와 구분하는 유전자 하위세트에 대해 지적해내면서 처리와 무관한 샘플의 가까운 시간적 매칭을 드러내었다(도 12E에서 상자화된 영역). 주 성분 분석은 더 후기 분화 단계에서 신경외배엽 및 기원판 전구체 세포 간에 개산이 증가하며 샘플의 높은 시간적 연관성을 확인시켜주었다(도 12F).

기원판 선조는 감각 뉴론을 생성하는 것으로 여겨진다. Six1+ 기원판 전구체의 단리에 이어 혈청 비함유 조건 하에서의 배양은 Six1 발현을 보유하는 뉴론으로의 효율적인 분화를 드러내었다(도 13A-C). 이들 세포의 감각 뉴론 정체성은 분화 20 일째에 측정된 Brn3A, Isl-1의 발현에 의해 확인되었다(도 13D, E). 장기 분화 연구(40 일)는 말초 뉴론 마커 Peripherin의 강력한 발현(도 13F)을 갖는 세포를 생성하였으며 감각 뉴론 자손의 시험관내 성숙과 양립 가능한 Tuj1의 발현을 감소시켰다. 기원판 전구체 정체성으로부터 성숙 감각 뉴론 운명으로의 시험관내 발달 진행이 도 13G에 도식적으로 예시된다.

결과는 N-SB 프로토콜에서의 단순한 개질이 신경외배엽으로부터 기원판 전구체로 분화에서의 전환을 유도함을 나타내었다. 적시-noggin 제거를 이용하여, 본 발명자들은 Six1을 발현하는 71%의 총 세포 수율을 수득하였다. 순수한 기원판 전구체의 단리는 기원판 운명을 전향적으로 확인하는 마커를 필요로 한다. 전향 마커의 확인은 또한 기원판 세포를 다른 대안적 계통, 예컨대 CNS 전구체, 신경 능선 계통 및 비-신경 외배엽과 신뢰성 있게 구분하기 위해 유용하다. 특히 관심사는 기원판 유도된 신경 모집단으로부터 신경 능선을 신뢰성 있게 분리하기 위해 신경 능선 유도된 전구체로부터 유도된 기원판의 분리이다. 이전에, 신경 초기 신경 분화 동안 p75+/HNK1+ 세포의 단리는 신경 능선 정체성으로 운명지워진 세포 모집단을 표시하는 것으로 나타났다(Lee, et al., Nature Biotechnology, 25(12): 1468-75(2007), 본원에 참조로 도입됨). 여기서, 기원판 계통 내에서 이들 마커의 상관성이 시험되었다. NGFR은 이전에 전방 신경외배엽 운명과 연관된 마커(Elkabetz, G&D, 2008, 본원에 참조로 도입됨)인 Forse1을 발현하는 전구체 모집단에 의해 분리되는 개질된 N-SB 프로토콜에서의 기원판 배양물을 효율적으로 표시하는 것으로 관찰되었다(도 14A). p75 및 인간 천연 킬러-1(HNK1) 에피토프(CD57로도 알려져 있음) 발현에 대한 이중 정렬은 HNK1에 대해 음성인 p75-단일 양성 세포가 qRT-PCR 분석에 기반한 Six1 발현에 있어서 극적으로 농축된다는 것을 드러내었다(도 14B, C). 세포의 기원판 정체성은 신경외배엽을 유도하는 전통적 N-SB 프로토콜에 비해 기원판을 유도하는 개질된 N-SB 프로토콜에서 p75+/HNK1- 세포의 수 증가에 의해 추가로 뒷받침된다(도 14D).

실시예 II.

IPS 세포 생성:

hOct4, hSox2, hKlf4 및 c-myc을 인코딩하는 cDNA(Open Biosystems로부터 구매함)를 인간 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터에 의해 유도된 자가-비활성화 렌티바이러스 벡터 내로 서브클로닝하였다. 벡터, pCMVAR8.91 및 pUCMD.G를 인코딩하는 플라스미드 DNA의 293T 세포 내로의 삼중 공동-전달감염에 의해 렌티바이러스 벡터 상청액을 생성하였다. ATCC(CCL-171)로부터 구매한 인간 태아 폐 섬유아세포(MRC-5)를 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Eagle's Minimum Essential 배지 중에 1.5x10⁴ 세포/cm²로 접종하였다. 다음 날, 섬유아세포를 ~16 시간 동안 4 ug/ml 폴리브렌의 존재 하에 동량의 4 개 렌티 바이러스 벡터 상청액으로 형질도입하였다. 형질도입 6 일 후, 섬유아세포를 트립신 처리에 의해 수확하고, 미토마이신 C-처리된 마우스 배아 섬유아세포(CF-1)의 영양세포층 상에 60 mm 디쉬 당 2x10⁴ 세포로 평판접종하였다. 다음 날, 배지를 hESC 배지로 전환하였다. hiPS 라인은 면역형광 및 유세포 측정에 의해 Tra-1-81, Tra-1-60, SSEA-4 및 Nanog에 대해 양성으로 확인되었다. 두 hips 클론에서, 4 개의 벡터-인코딩된 삽입유전자가 침묵화된 것으로 나타났다.

물질 및 방법:

세포 및 배양 조건(이중 SMAD 및 바닥판). hESC(WA-09; 35-45 회 계대)를 12-15,000 세포/cm2(MEFs, Global Stem)으로 평판접종된 마우스 배아 섬유아세포 상에서 배양하였다. DMEM/F12, 20% 녹아웃 혈청 대체제(GIBCO), 0.1 mM b-메르캅토에탄올, 6 ng/mL FGF-2 배지를 매일 교환하였다. 세포를 hESC 배지 중 6 U/mL의 디스파제를 이용해서 계대하고, 세척하고, 1:5 내지 1:10의 희석도로 재평판접종하였다.

신경 유도(이중 SMAD).

hESC 배양물을 20 분 동안 아큐타제로 분리시키고, hESC 배지를 이용해서 세척하고, ROCK 저해제의 존재 하에 37℃에서 1 시간 동안 젤라틴 상에 사전-평판접종하여 MEF를 제거하였다. 비부착성 hESC를 세척하고, 10 ng/mL의 FGF-2 및 ROCK-저해제가 스파이크 첨가된 MEF 컨디셔닝된 hESC 배지(CM) 중 매트리겔(BD) 코팅된 디쉬 상에 10,000-25,000 세포/cm²의 밀도로 매트리겔 상에 평판접종하였다. 이상적인 세포 밀도는 18,000 세포/cm²로 나타났다. ROCK 저해제를 제거하고, hESC는 3 일 동안 또는 이들이 거의 융합성이 될 때까지 CM 중에 증식하도록 두었다. 초기 분화 배지 조건에는 10 nM TGF-베타 저해제(SB431542, Tocris) 및 500 ng/mL의 Noggin(R&D)을 함유하는 녹아웃 혈청 대체(KSR) 배지가 포함되었다. 분화 5 일째에 TGF-b 저해제를 제거하고 500 ng/mL의 Noggin을 유지하면서 증가하는 양의 N2 배지(25%, 50%, 75%)를 2 일마다 KSR 배지에 첨가하였다. MS5 유도를 위해, 이전에 보고된 구축된 방법을 이용하였다¹⁸.

실시간 정량(이중 SMAD).

총 RNA를 RNeasy 키트(Qiagen)를 이용해서 추출하였다. 각각의 샘플에 있어서, 1 ug의 총 RNA를 DNA 오염에 대해 처리하고 Quantitect RT 키트(Qiagen)를 이용해서 역전사하였다. 증폭된 물질을 Mastercycler RealPlex2(Eppendorf) 상에서 Quantitect SYBR 녹색 탐침 및 PCR 키트(Qiagen)를 이용해서 검출하였다.

결과를 HPRT 대조군에 대해 정상화하였고, 각각의 데이터 지점에서 2-3 개의 독립적인 생물학 샘플의 4-6 회 기술적 복제물로부터 얻는다.

신경 패턴화 및 분화(이중 SMAD).

전술된 바와 같이¹⁸, N2 배지 중 BDNF, 아스코르브산, 소닉 헤지호그, 및 FGF8을 이용해서 도파민성 패턴화를 개시하였고, BDNF, 아스코르브산, GDNF, TGFb-1, 및 사이클릭-AMP의 존재 하에 성숙을 수행하였다. 전술된 바와 같이¹⁶, N2 배지 중 BDNF, 아스코르브산, 소닉 헤지호그, 및 레티노산을 이용해서 운동 뉴론 패턴화를 수행하였다.

현미경 관찰, 항체, 및 유세포 측정(이중 SMAD).

조직을 20 분 동안 4% 파라포름알데하이드를 이용해서 고정하고, PBS로 세척하고, PBS 중 .5% Triton X를 이용해서 투과화하고, PBS 중 1% BSA를 이용해서 차단하였다. 현미경 관찰을 위해 이용된 일차 항체에는 PAX6(Covance), Oct4(Biovision), AP2(Novus Biologicals), GBX2(Sigma), HNK1(Sigma), HOXB4(Developmental Studies Hybridoma Bank(DSHB)), Nestin(R&D), NKX6.1(DSHB), OTX2(gift), p75(Advanced Target Systems.), PAX7(DSHB), PLZF(Calbiochem), TUJ1(Covance), ZO1(Zymed), BF1(FOXG1, gift Esseng Lai), TH(Sigma), HB9(DSHB), ISL1(DSHB)이 포함되었다. CD105-PE(eBioscience)를 FACScan(BD) 상에서 유세포 측정을 위해 MS5 간질 세포를 배제하기 위해 이용하였다.

바닥판: 신경 유도.

MS5 유도를 위해, 이전에 보고된 구축된 방법을 이용하였다(Perrier, et al., 2004). 영양세포 비함유 신경 유도를 전술된 바와 같이 수행하였다(Chambers, et al., 2009). 간략하게, 20 분 동안 아큐타제를 이용해서 hESC 배양물을 분리시키고, hESC 배지를 이용해서 세척하고, ROCK 저해제의 존재 하에 37℃에서 1 시간 동안 젤라틴 상에서 사전-평판접종하여 MEF를 제거하였다. 비부착성 hESC를 세척하고 10 ng/mL의 FGF-2 및 ROCK-저해제가 스파이크 첨가된 MEF 컨디셔닝된 hESC 배지(CM) 중 매트리겔(BD) 코팅된 디쉬 상에 20,000 세포/cm²의 밀도로 매트리겔 상에 평판접종하였다. ROCK 저해제를 제거하고, hESC를 3 일 동안 또는 이들이 거의 융합성이 될 때까지 CM 중에 증식하도록 두었다. 초기 분화 배지 조건에는 10 nM TGF-b 저해제(SB431542, Tocris) 및 500 ng/mL의 Noggin(R&D)을 함유하는 녹아웃 혈청 대체(KSR) 배지가 포함되었다. 분화 5 일째에 500 ng/mL의 Noggin 및 TGF-b 저해제를 유지하면서 증가하는 양의 N2 배지(25%, 50%, 75%)를 2 일마다 KSR 배지에 첨가하였다. FP 유도를 위해, Sonic C25II을 200 ng/ml로 첨가하였다. 일부 실험에서, DKK-1(R&D 100 ng/ml) FGF8(R&D 50 ng/ml), Wnt-1(Peprotech 50 ng/ml) 및 레티노산(R&D 1 uM)을 첨가하였다.

실시간 정량적 PCR.

총 RNA를 RNeasy 키트(Qiagen)를 이용해서 추출하였다. 각각의 샘플에 있어서, 1 ug의 총 RNA를 DNA 오염에 대해 처리하고 Superscript III(Invitrogen)을 이용해서 역전사하였다. 증폭된 물질을 Mastercycler RealPlex2(Eppendorf) 상에서 Taqman 탐침 및 PCR 믹스(ABI)를 이용해서 검출하였다. 모든 결과를 HPRT 대조군에 대해 정상화하였고, 각각의 데이터 지점에서 3 개의 독립적인 생물학적 샘플의 3 회 기술적 복제물로부터 얻는다.

마이크로어레이 분석.

Trizol(Invitrogen)을 이용해서 대조군(NSB) 및 FP(NSB+Shh C25II) 둘 다로부터 분화 2, 3, 5, 7, 및 11 일째에 총 RNA를 단리하였다. 시점 별로 3 개의 생물학적 복제물을 이용하였다. 모든 샘플을 MSKCC Genomics Core Facility에서 처리하였고, Illumina 인간 6 올리고뉴클레오타이드 어레이 상에 혼성화하였다. 정상화 및 모델-기반 발현 측정은 통계적 프로그래밍 언어 R(http://cran.r-project.org/)을 포함하는 오픈-소스 Bioconductor 프로젝트(www.bioconductor.org)를 통해 이용 가능한 Illumina 분석 패키지(LUMI)를 이용해서 수행하였다. NSB 및 NSB + Sonic 간 페어식 비교를 Bioconductor를 통해 이용 가능한 마이크로어레이 데이터 패키지(LIMMA)에 대한 선형 모델을 이용해서 수행하였다. 조정된 p-값 < .05 및 2를 초과하는 배율 변화를 갖는 것으로 나타난 유전자가 유의미한 것으로 간주하였다. 발현차는 배율 변화의 log2로 보고한다. 유전자 실체 농축을 주석, 시각화 및 통합 발견을 위한 데이터베이스(DAVID; http://www.david.niaid.nih.gov) 내에 유전자 목록을 입력해서 결정하였다(Huang, et al., 2009 및 Dennis, et al., 2003). 최대 및 최소 발현 시점은 이전에 보고된 바와 같이 계산하였다(Venezia, et al., 2004).

간략하게, NSB + Sonic C25II 및 NSB 조건 모두에 대해 회귀 라인을 피팅하였다. 이들 경향성 라인으로부터, 유전자를 그 최대 및 최소 발현이 발생하는 시점에 기반하여 분류하였다.

현미경 관찰, 항체, 및 유세포 측정.

조직을 15 분 동안 4% 파라포름알데하이드 및 피크르산을 이용해서 고정하고, PBS로 세척하고, PBS 중 0.3% Triton X를 이용해서 투과화하고, 10% 당나귀 혈청을 이용해서 차단하였다. 현미경 관찰을 위해 이용된 일차 항체에는 PAX6(Covance), TUJ1(Covance), ZO1(Zymed), BF1(FOXG1, gift E.Lai), TH(Pelfreez), NKX6.1(DSHB) 및 FOXA2(SantaCruz)가 포함되었다.

벡터 설계 및 렌티바이러스 생산.

3 세대 렌티바이러스 벡터(Lois, et al., 2002)를 기재된 바와 같이 Ub-C 프로모터로부터의 BF1 ORF(Fasano, et al., 2009) 및 H1 프로모터로부터의 BF1 shRNA(Fasano, et al., 2007; Ivanova, et al., 2006)를 발현하도록 개질하였다. Foxg1 shRNA 구축물을 전술된 바와 같이 이용하였다(Shen, et al., 2006). shRNA를 발현하는 렌티바이러스 플라스미드를 플라스미드 pVSV-G 및 pCMVd8.9와 함께 293FT 세포 내로 공동-전달감염시켰다. 바이러스 함유 배지를 수집하고, 여과하고, 초원심분리에 의해 농축하였다. 바이러스 역가를 NIH 3T3 세포의 연속 희석에 이어 72 시간 후 유세포 측정 분석에 의해 측정하였다.

BF1 shRNA의 생성 및 과발현 인간 ES 라인.

hESC(WA-09; 35 회 계대)를 해리시키고, ROCK 저해제를 함유하는 매트리겔 상에 단일 세포로서 평판접종하였다. 평판접종 24 hr 후, ES 세포에 대조군(빈 벡터), BF1 shRNA 또는 BF-1 OFR 함유 벡터를 형질도입하였다. 1 주 후, GFP 발현 콜로니를 손으로 골라내어 MEF 상에 평판접종하였다. 이어서 세포를 증식시키고, 마이코플라즈마 및 정상 핵형에 대해 시험하였다.

일차 체외이식편의 절개.

E8.5, TP Taconic Swiss Webster 암컷을 절개하고, 배아를 꺼내었다. 신경외배엽 조직을 절개하고, FP 세포 상부에 평판접종된 덩어리로서 놔두었다. 신경돌기 성장 분석을 위해, E12.5 Sprague-Dawley 래트 소뇌판 조직을 절개하여 hESC 유도된 FP 세포 또는 대조군 신경외배엽 세포 상부 상에 평판접종하였다(NSB 프로토콜). 래트 체외이식편 조직으로부터의 증식을 공동-배양 3 일째에 분석하였다.

컨디셔닝된 배지 및 ELISA.

hESC를 신경 또는 FP 세포로 분화시키고, Shh를 6 일째에 제거하고, 배지를 배양 9 일 및 11 일째에 모두 수확하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 인간 Netrin-1 ELISA 키트(Axxora)를 이용하여, Netrin-1 단백질 수준을 검출하였다. 공동-배양 실험을 위해, 배지를 여과하고, 배양물에 바로 또는 신선 배지 중 1:2 희석물로 첨가하였다.

통계 분석.

나타낸 결과는 평균 + s.e.m.이다. 별표 및 파운드 기호는 적용 가능한 경우 다중 비교를 위한 Bonferroni 보정(p-값, 0.05)을 포함하는 t-테스트, 원 웨이 ANOVA 또는 투 웨이 ANOVA에 의해 대조군과 유의미하게 상이했던 실험군을 나타낸다.

실시예 III.

조기 고용량 SHH 노출이 FOXA2를 유도하고 BF1을 억제함.

로제트 단계에서 hESC 유도된 신경 세포는 CNS 및 PNS 자손 둘 다로 분화하였으며 A/P 및 D/V 축을 따라 여러 세포 운명으로 패턴화되었다(Elkabetz, et al., 2008). 이들 결과는 로제트 단계 세포가 매우 유연하고 SHH를 포함하는 패턴화 신호에 반응하였음을 나타내었다. 마우스 발달 동안 선조 세포의 FP 조직 및 세포로의 전문화는 초기 신경 계통 내에서 SHH 신호전달에 의존하는 것으로 생각되었다. 본 발명자들은 로제트-단계 신경 세포가 SHH에 반응하여 FP 전문화를 거치기에 적격이었는지 여부를 시험하였다. 마우스 발달 동안 FP를 유도하기 위해 고농도의 SHH가 필요하였다(Roelink, et al., 1994; Ericson, et al., 1996). 재조합 N-말단 SHH는 전체 SHH 작용을 위해 필요한 번역 후 개질의 부재로 인해 제한된 활성 범위를 갖는다. 최근에, SHH가 2 개의 이소류신에 속박된 개질된 버전의 재조합 SHH가 이용 가능해졌으며(Sonic C25II, R&D Systems), 포유류 SHH 단백질의 효능을 보다 가깝게 모방하였다. 대부분의 기능적 분석에서 C25II는 개질되지 않은 N-말단 SHH 보다 ~10 배 더 강력하였다.

그러나 구축된 로제트-단계 신경 세포 상에서 통상적인 SHH 및 SHH-C25II를 둘 다 이용하는 본 발명의 개발 동안 수행된 용량-반응 연구는 시험된 임의의 조건 하에서 FP 마커, 예컨대 FOXA2(FP 마커)를 발현하는 세포를 산출하지 않았다. 대부분의 세포는 로제트 세포구조, 및 전술된 바와 같이 AN 마커 BF1에 대한 염색을 보유하였다(도 1A)(Elkabetz, et al., 2008). 이들 결과는 놀라운 것이었다, 즉 고 SHH에 대한 노출은 구축된 로제트-단계 세포를 FP로 전환하기 위해 충분하지 않았다.

마우스에서의 FP 전문화가 초기 발달 단계에서, 신경 유도 시 또는 그 전에 일어난다는 가설에 기반하여, 본 발명자들은 전통적인 간질-영양세포 매개된 신경 유도 프로토콜을 이용하여 로제트 전문화 시점인 9 일째에 SHH 유도 연구를 반복하였다(Elkabetz, et al., 2008). 상기 패러다임 하에, 본 발명자들은 SHH-C25II로 처리된 세포에 제한된 세포 형태에서의 극적 변화를 주지하였다(도 1B). 세포는 로제트 구조가 없는 편평한 형태를 나타내었다. 또한 본 발명자들은 FOXA2+ 의 강력한 상향조절 및 BF1+ 세포에 있어서의 동시적 감소(도 1C) 그리고 ZO1+ 로제트의 총 수 감소를 관찰하였다(도 1D). BF1의 감소된 발현에 부가하여, 본 발명자들은 또한 AN에서 발현되는 또 다른 마커인 PAX6의 감소된 발현을 관찰하였다(도 1E). 용량-반응 연구는 FOXA2+ 세포의 유도 및 BF1 및 PAX6 발현의 동시적 감소가 125 - 500 ng/ml 농도의 SHH C25II에서 달성되었음을 나타내었다(도 1F 및 나타내지 않음). FOXA2+ 세포의 효율적인 유도는 개질되지 않은 N-말단 SHH를 이용해서 시험된 어느 농도에서도 관찰되지 않았다. 본 발명자들은 더 낮은 농도의 SHH에 반응하는 것으로 알려져 있는 유전자인 NKX6.1 발현에 대비하여 FP 마커가 어떻게 유도되는지를 이해하기 위해 용량 반응 연구를 수행하였다. 저농도의 Sonic C25II에서는 FP 마커 FOXA2 및 Netrin-1의 발현은 없지만 NKX6.1 발현이 강력히 증가하였다. 더 높은 농도에서, FP 마커는 신속히 상승하는데 비해, NKX6.1 발현은 점점 줄어든다(도 1G). 이들 데이터는 높은 수준의 SHH에 대한 초기 노출이 전방 AN 마커를 감소시키고 FP 마커 FOXA2를 유도한다는 것을 나타내었다.

실시예 IV.

FP 유도에 대한 적격성이 좁은 분화 윈도우로 제한됨.

초기 절차를 이용해서 FOXA2의 강력한(강하게 관찰되는 신호, 예컨대 염색의) 상향조절이 유도되었으나, 전통적인 간질-영양세포 매개된 신경 유도를 이용한 배양의 약 21 후에는 단지 약 30%의 세포가 양성이었다. 따라서, 본 발명자들은 FOXA2를 발현하는 배양된 세포의 총 수를 증가시키기 위한 몇몇 유형의 배양 조성물 및 방법을 시험하였다.

최근에 본 발명자들은 noggin 및 SB431542에 대한 노출을 통한 SMAD 신호전달의 저해에 기반하여 유의미하게 더 많은 수의 신경 세포를 산출하는 신속하고 정의된 신경 유도 패러다임을 개발하고 기재하였다(NSB 프로토콜; (Chambers, et al., 2009)). 본 발명의 조성물 및 방법과의 조합으로 상기 프로토콜을 이용하여, 본 발명자들은 신경 유도 동안 상이한 시점에서 Sonic C25II를 첨가하고 FOXA2 발현에 대해 분석하여 FP 분화를 최적화하는 것을 목표로 하였다. 분화는 NSB 노출 시 개시되었고, Sonic C25II를 1 일, 3 일, 5 일 또는 7 일째에 첨가하였다(도 2A). 가장 효율적인 FOXA2 유도는 FOXA2+ 세포를 이용한 분화 1 일째에 시작하여 SHH로 처리된 배양에서 관찰되어 총 세포의 약 65%를 나타내었다(도 2B 및 2C). 분화 11 일째를 넘어서 연장된 SHH 처리는 FOXA2 수율을 증가시키지 않았다(도 2D). 이들 데이터는 FP 정체성을 구축하기 위해 초기에 고 SHH 신호가 필요함을 나타내었고, FP 전문화에 대한 적격정의 중추적 윈도우를 제시한다. 또한, 분화 조건은 시험관내 인간 FOXA2+ 세포의 유도를 위한 강력한 플랫폼을 구축한다.

FOXA2는 FP 발달의 중요 마커이다. 그러나, FOXA2는 또한 내배엽에서 고도로 발현된다. hESC 유도된 추정 FP 조직을 추가로 특성규명하기 위해, 본 발명자들은 11 일째에 후보 마커에 대한 qRT-PCR 분석을 수행하였다. 대조군으로서 NSB 프로토콜을 이용해서, 본 발명자들은 FOXA2 및 SHH, F-Spondin, 및 Netrin-1을 포함하는 다른 FP 마커의 발현에서 극적인 증가를 확인하였다(도 7). 본 발명자들은 신경 전구체, 신경아교, 뉴론 및 비-신경 마커의 패널을 이용해서 FOXA2+ 추정 FP 세포의 성질을 추가로 특성규명하였다(도 7). FOXA2+ 세포는 Nestin(86%) 및 SOX2(17%)를 포함하여 이들 마커의 제한된 하위세트와만 공동-표지되었다. hESC 유도된 FP 대 내배엽 조직에서 FOXA2 발현을 구분하기 위해, 본 발명자들은 hESC를 내배엽으로 분화시켰다(D'Amour, et al., 2005). 예상된 바와 같이, FP 및 내배엽 분화 조건 둘 다에서 모두 본 발명자들은 NSB 처리된 대조군 세포에 비해 FOXA2 발현에서 증가를 관찰하였다. 그러나 내배엽 마커 SOX17의 유도는 내배엽 조건으로 제한되었으며, hESC 유도된 FP 세포에서는 SOX17이 존재하지 않았다(도 7). 본 발명자들은 또한 hESC 유도된 FP 세포에서 다른 내배엽 마커, 예컨대 AFP 및 Albumin 발현을 관찰하지 못했다. 이들 데이터는 NSB+SHH 프로토콜에서 hESC 유도된 FOXA2+ 세포가 FP 및 초기 신경 전구체 마커를 발현하며 내배엽 마커의 발현은 없음을 나타내었다.

실시예 V.

hESCs 유도된 FP 세포가 기능적임.

FP는 신경 패턴화 및 액손 향도에서 발달 동안 중요한 기능적 역할을 갖는다(Jessell, 2000). hESC 유도된 FP의 기능적 특성을 평가하기 위해, 컨디셔닝된 배지를 9 및 11 일째에 단리하였고 ELISA를 이용해서 배지 중 Netrin-1의 발현에 대해 시험하였다(도 3A). 정상 NSB 조건 하에서, Netrin-1은 9 일째에 검출가능하고 11 일째에 감소하는 반면 NSB+SHH 조건에서는 11 일째에 증가하여 Netrin-1 수준의 3.5 배 증가가 존재한다(도 3B). SHH는 FP 세포에 의해 분비되고 용량 의존적 방식으로 배 세포 유형을 특정하는 중추적인 패턴화 인자이다. hESC 유도된 FP가 배 전구체 도메인을 특정할 수 있는 인자를 분비하는지를 시험하기 위해, 컨디셔닝된 배지(CM)를 분화 9 및 11 일째에 단리하였다. 6 일째에 외인성 SHH를 제거하고, 배양물을 세척하여 배지로부터 임의의 외인성으로 첨가된 SHH를 제거하였다. 미처리(naive) 신경 선조 세포를 대조군(NSB) 프로토콜의 11 일째에 단리하였고, NSB CM 또는 FP CM과 배양하였다. CM의 존재 하에 배양 5 일 후, 본 발명자들은 배 전구체 마커의 발현 및 SHH 반응성 유전자 GLI2의 발현에 대해 추적하였다. 본 발명자들은 NSB 대조군 배양으로부터 수득된 CM에 비해, hESC 유도된 FP 조직으로부터의 CM이 NKX2.1 및 NKX6.1을 포함하는 배 유전자의 발현을 효율적으로 유도하였음을 확인하였다(도 3C). 배 마커의 발현 증가는 단백질 수준에서 확인되었다(도 3C).

상기 결과가 SHH-매개된 것인지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 hESC 유도된 FP로부터의 CM에 대한 노출 시 GLI2의 증가된 발현을 나타내었다. 상기 실험을 SHH 길항제 사이클로파민의 존재 하에 반복한 경우, 모든 3 개 유전자 NKX2.1, NKX6.1, 및 GLI2가 유의미하게 감소되어(도 3C) SHH 신호전달에 대한 패턴화 반응의 의존성을 나타내었다.

전통적인 연구는 FP 체외이식편이 초기 신경외배엽 조직에서 전위 FP를 유도할 수 있음을 나타내었다(Placzek, et al., 1993). hESC 유도된 FP가 일차 마우스 체외이식편에서 FP 마커를 유도할 수 있는지를 시험하기 위해, 신경외배엽 조직을 E8.5 마우스 배아로부터 단리하였고, 이를 hESC 유도된 FP 세포와 직접 접촉하도록 두었다. 공동-배양 3 일 후, 체외이식편을 마우스 특이적 M6 마커의 발현에 기반하여 확인하고, 헹구고, FOXA2에 대해 염색할 슬라이드 상에 실장하였다. 대조군 조건으로서, 마우스 체외이식편을 NSB 프로토콜을 이용해서 hESC 유도된 신경 조직과 함께 공동-배양하였다. 대조군 hESC 유도된 신경 조직과의 공동-배양은 FOXA2+ 세포를 산출하지 않았지만, hESC 유도된 FP 세포와 공동-배양된 체외이식편은 특히 체외이식편의 말초에서 FOXA2+ 세포의 강력한 유도를 나타내었다(도 4D 및 4E). hESC 유도된 FP 세포의 신경돌기 성장 촉진 효과는 일차 설치류 FP 조직의 액손 성장 촉진 효과를 나타내기 위해 이전에 이용된 분석(Shirasaki, et al., 1995)인 일차 래트 E12.5 래트 소뇌판 체외이식편에서 관찰하였다(도 8). 이들 실험은 hESC 유도된 FP가 미처리 hESC 유도된 및 일차 마우스 신경 전구체 세포의 배를 형성할 수 있는 Netrin-1 및 SHH를 분비함으로써 형성체로서 일차 FP 조직의 기능적 특성을 모방할 수 있음을 나타내었다.

실시예 VI.

시간적 트랜스크립톰 분석이 AN 대신 FP 전문화가 일어남을 드러냄.

인간 FP 전문화를 위해 중추적인 인자에 대한 추가 식견을 얻기 위해, 후보 마커의 고해상 시간적 유전자 발현 프로필을 11 일의 프로토콜 동안 6 개 시점에서 수행하였다. FOXA2 발현은 면역염색 데이터(도 4A)와 일관되게, 분화 3 일째부터 시작해서 전사체 수준의 일정한 증가로서 관찰되었다(NSB 대비). 흥미롭게도, 다른 FP 마커; SHH, Netrin-1, 및 F-Spondin은 상이한 발현 패턴을 따랐다(도 4B-4D). 모든 3 개 마커가 분화 7 일째에 발현에서 극적 증가를 갖는(NSB 조건 대비) 보다 지연된 유도를 나타내었다.

PTCH1 발현은 SHH 활성의 전사 판독으로서 일반적으로 이용된다. PTCH1 발현의 극적인 증가가 분화 3 일째만큼 조기에 관찰되었고, 다음 2 일에 걸쳐 인수 3 만큼 수준이 추가 증가하였다(도 4E). SHH 하류 효과기 GLI2는 FP 유도를 위해서 필수적이지만 FP 발달 후기 단계에는 감소되며(Matise, et al., 1998) GLI2가 FOXA2 발현을 직접 활성화할 수 있는 것으로(Jeong and Epstein, 2003) 이전에 나타났다. GLI2 및 FOXA2 발현 둘 다에서의 초기 증가(도 4A 및 4F)는 FP 유도 동안 GLI2의 역할과 일관되게 11 일째에 GLI2의 감소가 뒤따르며 관찰되었다. 유사한 경향성이 그러나 훨씬 더 낮은 유도 수준이 GLI1에 대해 관찰된다(도 4G).

SOX1은 초기 신경 마커이며 안쪽 FP에서는 발현되지 않는다(Charrier, et al., 2002). 신속한 신경 유도와 일관되게, SOX1은 NSB 조건에서 신속하게 상향 조절되었으며, 경시적으로 계속 증가하였다. SHH의 첨가 시, 대조군 NSB 조건에 비해 SOX1 수준의 훨씬 더 적은 증가가 3 일째에 관찰된다(도 4H). NSB 조건은 신경 세포를 산출하며, AN 편향이 BF1을 고수준으로 발현한다(Chambers, et al., 2009). 그러나 SHH가 배양으로 첨가되는 경우, 7 일째에 PAX6 및 BF1의 극적인 감소가 존재한다(도 4I 및 4J). 내배엽 마커 SOX17 및 중배엽 마커 Brachury의 유도는 관찰되지 않아서(도 4K 및 4L) NSB 프로토콜을 이용하는 AN 유도와 유사하게 FP 유도가 명확한 중배엽 또는 내배엽 중간체의 기여 없이 일어남을 제시하였다. 이들 데이터는 GLI2 및 FOXA2 발현에 의해 개시되고 기능적 FP 마커, 예컨대 Netrin-1, SHH, 및 F-Spondin의 발현이 뒤따르는 hESC 유도된 FP에서 적절한 마커 발현을 나타내었다. FP 전문화 시점에서의 PAX6 및 BF1 발현의 감소는 FP 유도가 AN 대신 일어남을 제시한다.

실시예 VII.

hESC 유도된 FP 전문화 동안의 전반적 트랜스크립톰 분석.

분화 동안 5 개 시점에서 전반적 유전자 발현의 시간적 프로필을 대조군 NSB 배양(AN 산출)에서 그리고 Sonic C25II 처리된 배양(FP 산출; 도 2E 참고)에서 본 발명의 개발 동안 구축하였다(1, 3, 5, 7 및 11일). 마이크로어레이 분석 전에, 각 샘플의 품질을 FP 마커 패널의 발현에 대해 확인하였다(도 9). 전반적 유전자 발현 연구를 각각의 시점 및 배양 조건에 대해 3 개의 독립적 샘플에서 수행하였다. 데이터를 log2 비로 전환하여 분화 동안 FP 대 NSB 프로토콜에서의 유전자 발현 수준을 비교하였다(도 4l-4Q). 미가공 데이터는 GEO 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)에서 접근 번호: GSEXXX(번호는 공개 시 이용 가능함)로 이용 가능하다.

시간 경과 데이터는 FP 전사 프로필의 편향되지 않은 평가로서 DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/; Dennis, et al., 2003)를 이용한 유전자 실체(GO) 농축 분석을 거쳤다. 분화 7 일 및 11 일째에 SHH 처리군 대 NSB 대조군 배양에서 고도로 농축된 전사체 중에는 Wnt 및 hedgehog 경로, 액손 가이드, 및 분비된 단백질과 연관된 유전자가 있었다(도 4L 및 4M). 패턴화 및 액손 가이드 인자에 대한 농축은 SHH 처리된 배양의 FP 정체성을 추가로 확인시켜준다. 또한, AN의 SHH-매개된 억제는 앞뇌 발달에 관여된 유전자를 포함하는 전사체가 NSB 프로토콜로 배양된 세포에 비해 바닥판 세포를 생성하기 위한 FP 배양 방법에서 더 많은 양의 하향조절을 나타내었음을 보여주었다(도 4L, M).

FP 전문화 동안 차별적으로 발현되는 특정 유전자에 대한 식견을 얻기 위해, 각각의 분화 단계에 대해 페어식 비교를 수행하였다. 분화 3 일 및 5 일째에 유의미하게 조절되는 대다수의 유전자(1 일 대비)는 NSB 및 FP 프로토콜에서 공유되었으나, 전사체의 하위세트는 차별적으로 조절되었다(도 4N-4Q). 특히, SHH 신호전달의 성분이며 공지된 전사 하류 표적인 Patched-1(PTCH1)의 증가가 주지되었다. 상기 프로토콜에서, PTCH1는 이것이 감소하기 시작하는 D11을 제외하고 모든 시점에서 고도로 농축된다(도 4N-4Q).

본 발명자들은 Wnt 경로 성분에서 유의미한 변화를 관찰하였다. 5 일째만큼 조기에, Wnt 경로 저해제 DKK-1의 유의미한 감소가 존재했으며, 상기 감소는 프로토콜 과정에 걸쳐 지속되었다(도 4N-4Q 및 도 7). 이전에 중간선에서 마우스 발달 동안 중간선 액손 가이드에 관여된 것으로 나타난 몇몇 Frizzled 유전자(Lyuksyutova, et al., 2003)의 유의미한 상향조절(도 4P 및 4Q)이 또한 관찰되었다. 추가적으로, SIX6, CAPN6, IGFBP3 및 FIBLN1을 포함하여 FP 전문화 동안 차별적으로 발현된 여러 추가적인 유전자가 확인되었다(도 4N-4Q). 이들 및 추가적인 유전자에 대한 차별적 발현을 qRT-PCR에 의해 확인하였다(도 9). 문헌 및 MGI(마우스 유전자 발현 데이터베이스)에 기반하여 추정 인간 FP 마커를 검증하기 위해서는 마우스 및 인간 배아 조직에서의 체계적인 원 위치 혼성화 스크리닝이 필요할 것이지만, 확인된 여러 유전자는 전방 중간선 및 바닥판 조직에서 양립 가능한 발현 패턴, 예컨대 HESX1(Zoltewicz, et al., 1999) 또는 RBP1(CRBP1 - Hunter, et al., 1991)을 갖는 것을 각각 확인하였다.

실시예 VIII.

유전자가 가장 많이 발현되었을 때; 최대 시간(TOM) 및 가장 적게 발현되었을 때; 최소 발현 시간(TIM)을 나타낸 유전자 클러스터 분석을 또한 수행하였다. GO 실체 항을 상기 분석 내에 맵핑하였고, FP 전문화 공정 동안 정확한 발달 윈도우를 확인할 수 있었다. 이들 데이터는 hESC 유도된 FP 조직의 정체성을 추가로 확인시켜주었고, FP 대 신경외배엽 운명 전문화 동안 차별적으로 발현된 유전자에 대한 식견을 제공한다.

실시예 IX.

DKK-1의 억제가 AN 수임을 차단하고 FP 생성을 증강시킴.

FP 수임이 AN 대신 일어난다는 본 발명자들의 관찰은 Wnt 신호전달 저해제 DKK-1의 신속한 하향조절을 드러낸 본원에서 수득된 전반적 유전자 발현 프로필에 의해 강화되었다. DKK-1은 머리 발달을 유도하기 위해 필요하고 충분한 제노푸스개구리 머리 형성체에서 발현되는 인자로서 최초 확인되었다(Glinka, et al., 1998). 마우스 발달 동안 Wnt 신호전달의 DKK-1-매개된 저해는 전방 뇌 발달을 위해 필수적이며(Mukhopadhyay, et al., 2001), FOXA2 녹아웃 배아는 E7.5에 외배엽에서 DKK-1의 증가된 발현을 나타낸다(Kimura-Yoshida, et al., 2006). NSB 유도 동안, DKK-1 전사체 수준이 5 일째에 200 배에서 5000 배까지 급속히 상승한 뒤 AN 유도제로서의 DKK-1의 역할과 일관되게 다시 감소되는 것이 관찰되었다. 배지에서 DKK-1 단백질 수준을 측정하기 위해 ELISA 분석을 수행하였고, 12 ng/ml만큼 높은 수준을 확인하였다(도 5A, B). mRNA 및 단백질 수준 둘 다에서의 DKK-1의 극적인 감소가 Sonic C25II 처리 2 일 후만큼 조기에 관찰되었다(도 5B, C). DKK-1 발현의 감소는 지속되었으며, PAX6, BF1, OTX1, OTX2, 및 EMX1을 포함하는 AN 마커의 감소가 수반되었다(도 4).

DKK-1이 FP 전문화에서 hESC 분화 동안 기능적으로 관여되는지 여부를 시험하기 위해, 본 발명자들은 Sonic C25II와의 조합으로 재조합 DKK-1을 첨가하였고 FP 마커 발현을 평가하였다. Sonic C25II 만의 처리는 AN 마커 BF1의 감소 및 FOXA2의 상향조절을 일으켰지만(도 5D-F), DKK-1의 첨가는 FOXA2 메시지 및 단백질에서의 감소 그리고 BF1 전사체에서의 보다 신속한 상승을 야기하였다(도 5D-F). 반대로, NSB 프로토콜에서 세포에 대한 DKK-1 항체의 첨가는 BF1 발현 수준의 유의미한 지연 및 감소를 야기하였다. 이들 데이터는 내인성 DKK-1 수준이 AN 전문화를 위해 중추적임을 시사하였다. 다음으로, hESC를 Sonic C25II 및 DKK-1 중화 항체 둘 다의 존재 하에 분화시켰다. 이들 조건 하에서, 5 일째에 BF1 전사체의 초기의 일시적인 유도가 억제되며 FOXA2 수준의 증가가 수반되었다(도 5E 및 5G).

본 발명의 개발 동안 수득되는 데이터는 신경 유도 동안 FP 전문화를 위한 중추적인 윈도우를 드러내었다. DKK-1 발현이 FOXA2 발현을 저해할 수 있다는 관찰로, DKK-1 차단 항체의 첨가가 SHH 매개된 FP 유도에 대한 적격성 윈도우를 확장시키는지 여부를 나타내기 위해 하기 시험을 설계하였다. DKKK-1 항체를 분화 1 일, 5 일 및 9 일째에 첨가하였다. SHH에 대한 노출을 동일한 시점에 개시하였고, FOXA2의 발현을 SHH 노출 9 일 후 분석하였다. Dkk-1을 1 일째에 SHH와 함께 첨가한 경우, FOXA2+ 세포의 증가가 관찰되었다. 그러나 DKKK-1 항체를 5 일 또는 9 일째에 첨가한 경우, FOXA2+ 세포는 관찰되지 않았다(도 5H 및 5I). 이들 데이터는 NSB 프로토콜에서 DKK-1의 높은 초기의 내인성 수준이 AN 수임을 개시하였고 FP 적격성을 억제하였음을 시사한다. SHH를 이용한 초기 처리는 DKK-1 매개된 AN 전문화를 억제하였고 FP 계통으로의 분화를 가능하게 하였다. 그러나, 후기 단계의 5 일째의 DKK-1의 저해는 FP 유도에 대한 시간적 윈도우를 확장시키지 않았다.

실시예 X.

Bf1 발현이 Fp 수임을 억제함.

본 발명자들은 줄기 세포 배양에 대한 SHH 첨가가 적어도 부분적으로 DKK-1의 저해를 통해 매개되는, AN 대신 FP 분화를 야기하였음을 발견하였다. DKK-1은 BF1+ 신경외배엽 BF1을 특정하는 것으로 나타났으며(Mukhopadhyay, et al., 2001), BF1은 NSB 유도 시 대부분의 신경 세포에서 발현된다(도 4 및 5). forkhead 인자 BF1의 발현이 신경 유도 동안 FP 적격성을 직접 억제하는지 여부를 시험하기 위해, hESC를 BF1 shRNA 구축물을 이용해서 형질도입하였고(Fasano, et al., 2009; Shen, et al., 2006) 클론성 라인을 유도하였다. BF1은 hESC에서 고도 발현되지 않으며, 세포 형태 또는 콜로니 크기에는 차이가 없었다(도 10)).

그러나 hESC의 신경 분화 시, BF1 단백질 발현의 감소(도 5J" 및 5K") 그리고 BF1 전사체의 80% 감소(도 10)가 존재하였다. BF1의 기능 손실은 신경 전구체 단계에서 증식 및 세포 주기 진행의 결함과 연관되었지만, hESC 단계에서의 BF1 녹다운 라인은 대조군 벡터가 형질도입된 라인에 필적하는 세포 주기 역학을 나타내었다(도 10). 이어서 BF1 녹다운 및 대조군 hESC를 FP로 분화시켰고, FP 마커 패널에 대한 qRT-PCR 분석을 거쳤다. 분화 11 일째에, BF1 shRNA 조건에서 모든 FP 마커의 발현에서 유의미한 증가가 있었다(도 5L). 또한, 면역세포화학적 분석은 FOXA2+ 세포 수의 유의미한 증가를 드러내어, BF1 녹다운 hESC 라인에서 총 세포의 90% 초과를 나타내었다(도 5M).

hESC 라인을 전술된 벡터를 이용해서 BF1을 과발현하여 생성하였다(Fasano, et al., 2009). 이어서 이들 트랜스제닉 세포를 FP 계통으로의 분화를 유도하는 조건 하에 배양하였다. 11 일째에, 대조군 GFP 발현 클론에 비해, FOXA2+ 세포의 감소 및 FP 마커 발현의 감소가 존재하였다(도 10). 이들 데이터는 BF1 발현이 hESC 유도된 FP의 유도를 저해하였음을 나타내었다.

실시예 XI.

FP의 A/P 축이 꼬리화 제제에 의해 변형됨.

모든 FP 세포 간에는 특정한 특징, 예컨대 FOXA2 및 Netrin-1 발현이 공유되지만, A/P 축을 따라 바닥판의 상이한 지역 간에 차이가 보고되었다(Placzek and Briscoe, 2005). 특히, 최근 연구는 중뇌 FP가 마커 예컨대 CORIN(Ono, et al., 2007) 및 NOV(Placzek and Briscoe, 2005)를 발현함을 나타내었다.

추가적으로, 중뇌 FP는 중뇌 DA 뉴론을 생성하고 DA 선조 마커, 예컨대 LMX1B 및 NGN2를 발현하는 신경발생성인 것으로 나타났다(Joksimovic, et al., 2009). 대조적으로, 마름뇌 및 척추 FP는 모두 비-신경발생성으로 나타난다. hESC로부터 생성된 FP 세포의 A/P 정체성을 더 잘 이해하기 위해, 중뇌 FP 마커 CORIN 및 NOV에 대한 qRT-PCR 분석뿐만 아니라 DA 선조 마커 LMX1B 및 EN1의 분석을 수행하였다. 그러나 이들 마커의 발현은 검출되지 않았다. 다음으로 유전자 발현 데이터 세트를 이용해서 FP 세포의 위치 정체성에 대한 식견을 제공할 수 있는 차별적으로 조절된 전사체 마커를 확인하였다.

마우스에서의 뛰어난 연구는 특정한 인핸서 요소가 FP의 A/P 축을 따라 상이한 지역에서 Shh 발현을 지시함을 나타내었다(Jeong, et al., 2005). SIX6은 NSB 대조군 조건에 비해 FP 유도 동안 극적으로 증가하였다(분화 5 일째에 mRNA 수준에서 약 50,000-배 증가; 도 9). SIX6은 배 뇌의 최전방 측면으로 SHH 발현을 지시하는 SBE2로 알려져 있는 인핸서 지역에서 SHH 유전자에 결합하는 것으로 나타났다(Jeong, et al., 2008). 본 발명자들은 전방 FP 정체성의 추정 마커로서 SIX6의 이용을 고려하였다. 따라서 hESC 유도된 FP의 SIX6 상태를 이용해서 공지된 꼬리화 제제, 예컨대 FGF8, Wnt-1, 및 레티노산에 반응하여 재전문화를 표시하였다. 이들 꼬리화 인자를 각각 SHH와의 조합으로 첨가하였으며, 생성 조직을 FP 마커 FOXA2 및 NETRIN-1, AN 마커 BF1, 및 추정 전방 FP 마커 SIX6의 발현에 대해 평가하였다. FP 생성은 꼬리화 인자의 존재 하에 손상되지 않는 것으로 나타났다. 사실 상, Wnt-1 또는 RA의 첨가는 FOXA2 및 Netrin-1 발현에 기반하여 FP 생산을 유의미하게 증강시켰다(도 6A 및 6B). RA 및 Wnt-1 군에서 FP 마커의 증강된 발현은 BF1 발현의 극적인 감소와 연관되어 AN 수임이 FP 유도에 반대로 작용된다는 개념을 추가로 뒷받침하였다(도 6B). 놀랍게도 모든 조건에서, SIX6 발현의 유의미한 감소가 존재하였고, Wnt-1 및 RA 조건이 전방 FP 정체성을 억제하는데 있어서 가장 효과적이었다.

실시예 XII.

상기 실시예는 본원에서 이용된 임의의 방법(조건)이 중뇌 FP 및 DA 선조 마커의 상향조절로 이어질 것인지를 결정하기 위해 설계된 예시적인 실험을 나타낸다. 본 발명자들은 상이한 인자가 마커 발현 상에 다양한 효과를 가졌음을 발견하였다(도 6B). 특히, Wnt-1에 대한 노출은 중뇌 FP 마커 CORIN 및 NOV의 유의미한 증가뿐만 아니라 DA 선조 마커 LMX1B, EN1, 및 NGN2의 증가를 일으켰다. 이전 연구는 Wnt 신호전달이 중뇌 FP의 신경발생성 반응에서 중추적이었음을 나타내었다(Joksimovic, et al., 2008).

상기 언급된 바와 같이, 연구는 배 축을 따라 상이한 A/P 지역으로 SHH 발현을 지시한 상이한 인핸서를 확인하였다(Jeong, et al., 2008). 꼬리화 인자의 첨가가 생성 FP 조직의 A/P 정체성을 재특정함을 추가로 나타내기 위해, hESC 유도된 FP를 Wnt-1 또는 FGF8의 존재 또는 부재 하에 생성하였고, FP의 상이한 A/P 도메인에서 LacZ 발현을 유도하는 2 개의 SHH 인핸서 구축물로 생성 조직을 전달감염시켰다. SBE1 구축물은 바닥판의 중뇌 지역으로 SHH 발현을 지시하는 반면 SBE2 인핸서는 Six6이 결합하는 것으로 나타난 FP의 최전방 지역으로 SHH 발현을 지시한다. 꼬리화 인자(SHH C25II 단독)의 부재 하에, LacZ 발현은 본원에서 SBE1 인핸서가 아닌 SBE2를 이용한 전달감염 후 관찰되었으며 hESC 유도된 FP가 디폴트로 전방이라는 가설을 뒷받침하였다(도 6C). 대조적으로 SBE2 활성은 Wnt1 또는 FGF8을 이용한 처리 시 폐지된 반면 SBE1 활성은 이들 조건 하에 유도되었다. 이들 데이터는 FGF8 또는 Wnt1 처리가 FP 정체성에서 보다 꼬리쪽의 중뇌-유사 정체성으로의 전환을 유도함을 시사하였다(도 6C).

결론적으로, 본 발명자들의 데이터는 신경 분화 시 hESC가 디폴트로 DKK-1 및 후속적으로 BF1의 상향조절에 의해 AN 운명으로 향하며, AN 수임이 hESC 자손에서 FP 적격성을 활발하게 억제함을 나타내었다. 그러나 초기 고수준의 SHH는 DKK-1 수준을 감소시켜 AN 대신 FP 유도를 가능케 하는 반면 DKK-1 또는 BF1의 기능-손실은 FP 생성을 증가시킨다. 인간 ESC 유도된 FP는 디폴트로 전방이지만 꼬리화 인자에 반응하여 후방화되었다. 이를 도 6E에 요약한다.

실시예 XIII

세포 배양: hESC(WA-09; 35-45 회 계대), hiPSC 라인(iPS-14, iPS-27; 20-30 회 계대), 및 I6을 분화되지 않은 상태로 유지하였고, 전술된 이중-SMAD 저해 프로토콜을 이용해서 CNS 계통으로 분화시켰다. 기원판 유도 프로토콜(PIP)에 있어서, Noggin을 분화 3 일째에 제거하였다. 일부 실험에서, BMP-4, Noggin, DKK-1, FGF8, SU5402, Wnt-3a, DAPT, CHIR99021, 사이클로파민, 소닉 헤지호그(SHH) 및 푸르모르파민을 첨가하였다. 삼차신경 감각 운명으로의 분화를 위해 기원판 클러스터를 아스코르브산 및 BDNF가 보충된 N2 배지 중에 유지하였다. PIP 7-11 일째부터 SHH 및 푸르모르파민으로의 노출에 이어 DAPT를 이용한 처리로 PIT1+ 운명을 촉진함으로써 뇌하수체 운명을 유도하였다.

실시예 IVX.

세포 특징: qRT-PCR 데이터를 HPRT에 대해 정상화하였고, 적어도 3 회의 독립적 실험으로부터 4-6 개의 기술적 복제물에 기반한다. 전반적 유전자 발현 분석을 제조업체의 사양(Illumina 인간-6 올리고뉴클레오타이드 어레이)에 따라 MSKCC genomics core에서 수행하였다. 면역세포화학 및 유세포 분석을 위한 일차 항체의 이용 및 전기생리적 분석에 대한 상세한 정보는 연장된 보충 방법에서 제시된다.

실시예 XV.

동물 연구: 동물 연구는 본 발명자들의 기관 동물 관리 및 이용 위원회에 의해 승인받은 프로토콜에 따라 그리고 NIH 가이드라인을 따라 수행하였다. 호르몬 생산 세포를 성체 수컷 NOD-SCID IL2Rgc 마우스 및 8 마리의 성체 수컷 누드 래트 내로 피하 주사하였다. 이식 4-6 주 후 혈액을 수집한 뒤 호르몬 수준을 결정하기 위해 ELISA 분석을 수행하였다. 닭 이식 연구를 HH 단계 9-10에 수행하였고 배아를 HH 단계 20에 수확하였다. 성체 NOD-SCJD IL2Rgc 마우스의 교뇌 내로의 주사를 정위 수술에 의해 수행하였다.

실시예 XVI.

통계 분석: 통계 분석을 GraphPad Prism version 5.0b(GraphPad Software)를 이용해서 수행하였다. 모든 데이터를 적어도 3 회의 독립적 실험에서 유도하였다. 별표는 투-테일 Student t-테스트에 의해, 또는 대조군을 여러 독립적 처리군에 대해 비교하기 위해 ANOVA에 이어 Dunnett 테스트에 의해 대조군과 유의미하게 상이했던 실험군을 표시한다. 달리 나타내지 않는 한, 데이터는 평균 ± SEM으로 나타낸다.

실시예 XVII

세포 및 배양 조건: hESC(WA-09; XX, 35-45 회 계대), hiPSC 라인(iPS-14, iPS-27; 20-30 회 계대)(Chambers, et al., 2009), 및 I6(Amit and Itskovitz-Eldor, 2002)을 12-15,000 세포/cm²로 평판 배양된 마우스 배아 섬유아세포(MEFs, Global Stem) 상에서 배양하였고 매일 교체되는 DMEM/F12, 20% 녹아웃 혈청 대체제(GIBCO), 0.1 mM b-메르캅토에탄올, 6 ng/mL FGF-2로 구성된 배지 또는 mTeSR™1(StemCell Technologies, Inc., Vancouver, Canada) 중에 hESC-적격 Matrigel™(BD Biosciences, San Jose, CA) 코팅된 플레이트 상에 유지하였다. 세포를 hESC 배지 중 6 U/mL의 디스파제를 이용해서 계대하고, 세척하고, 1:10 내지 1:15의 희석도로 재평판접종하였다.

실시예 XVIII

신경 유도 및 기원판 유도: 영양세포-비함유 신경 유도를 전술된 바와 같이 수행하였다(Chambers, et al., 2009). 간략하게, hESC 배양물을 20 분 동안 아큐타제를 이용해서 해리시키고, hESC 배지를 이용해서 세척하고, ROCK 저해제의 존재 하에 37℃에서 1 시간 동안 젤라틴 상에서 사전-평판접종하여 MEF를 제거하였다. 비-부착성 hESC를 세척하고, 10 ng/mL의 FGF-2 및 ROCK-저해제가 스파이크 첨가된 MEF 컨디셔닝된 hESC 배지(CM) 중 매트리겔(BD) 코팅된 디쉬 상에서 60,000 세포/cm²의 밀도로 매트리겔 상에 평판접종하였다. ROCK 저해제를 24 시간 후 제거하고, hESC를 2 일 동안 또는 이들이 95% 융합성이 될 때까지 CM 중에 증식하도록 두었다. 초기 분화 배지 조건에는 10 μM TGF-β 저해제(SB431542, Tocris) 및 250 ng/mL의 Noggin(R&D)을 함유하는 녹아웃 혈청 대체(KSR) 배지가 포함되었다. 분화 5 일째에 500 ng/mL의 Noggin 및 TGF-β 저해제를 유지하면서 증가하는 양의 N2 배지(25%, 50%, 및 75%)를 2 일마다 KSR 배지에 첨가하였다. KSR-비함유 조건(E6 배지(Chen, et al., 2011))에 이어 BMP 신호전달에서의 조정; 데이터는 나타내지 않음)을 이용하는 경우 유사한 결과를 수득할 수 있었다. 기원판 유도를 위해, Noggin을 분화 3 일째에 제거하였다. 일부 실험에서, BMP-4(R&D 50 ng/ml), Noggin(R&D 250 ng/ml), DKK-1(R&D 100 ng/ml), FGF8(R&D 50 ng/ml), SU5402(Tocris 10 μM), Wnt-3a(R&D 50 ng/ml), DAPT(Tocris, 10 μM), CHIR99021(Stemgent, 3 μM), 사이클로파민(Tocris, 10 μM), 소닉 헤지호그(C25II-R&D 100 ng/ml), 및 푸르모르파민(Stemgent, 1μM)을 첨가하였다.

실시예 IXX

삼차신경 감각 뉴론의 말단 분화: 기원판 클러스터를 13-17 일째에 수동으로 단리하였다. 클러스터를 15 ㎍/mL의 폴리오르니틴, 1 ㎍/mL의 라미닌(Po/Lam)으로 사전-코팅된 배양 디쉬 상에 재평판접종하고, 아스코르브산(AA, 0.2 mM), 및 BDNF(20 ng/mL)가 보충된 N2 배지 중에 유지하였다. 전기생리학적 실험을 위해, NGF 및 ROCK 저해제를 ACSF에서 이용하였고, 이는 챔버 내에서 세포의 생존을 증가시킨다.

실시예 XX

호르몬 생산 세포의 분화: 기원판 유도 프로토콜 동안, 소닉 헤지호그(C25II-R&D 100 ng/ml) 및 푸르모르파민(Stemgent, 1μM)을 PIP의 7-11 일 사이에 첨가하여 뇌하수체 기원판 원기로의 분화를 촉진하였다. 세포를 N2 배지에서 계대하지 않고 유지하였고, 분화 13 일 내지 17 일째에 추가 인자, 예컨대 DAPT(Tocris, 10 μM)로 처리하여 PIT1+ 및 GATA2+ 전구체 세포를 유도하였다(도 39A 참고).

실시예 XXI

정량적인 실시간 PCR: 총 RNA를 RNeasy 키트(Qiagen) 또는 Trizol을 이용해서 추출하였다. 각각의 샘플에 대해, 1 ㎍의 총 RNA를 DNAase로 처리하고 Quantitect RT 키트(Qiagen)를 이용해서 역전사하였다. 증폭된 물질을 Mastercycler RealPlex2(Eppendorf) 상에서 Taqman 탐침 및 PCR 믹스(ABI)를 이용해서 검출하였다. 모든 결과를 HPRT 하우스키핑 유전자 대조군에 대해 정상화하였고, 적어도 3 회의 독립적 실험 각각으로부터의 4-6 개의 기술적 복제물에 기반한다.

실시예 XXII

마이크로어레이 분석: 총 RNA를 Trizol(Invitrogen)을 이용해서 대조군(NSB) 및 PIP 둘 다로부터의 분화 1, 3, 5, 7, 9 및 11 일째에 단리하였다. 시점 별로 3 개의 생물학적 복제물을 이용하였다. 모든 샘플을 MSKCC Genomics Core Facility에서 처리하였고 Illumina 인간-6 올리고뉴클레오타이드 어레이 상에서 혼성화하였다. 사분위수 정상화 및 모델-기반 발현 측정은 Partek Genomic Suite(Partek GS)(Downey, 2006)를 이용해서 수행하였다. NSB 및 PIP 간 페어식 비교를 수행하였다. 조정된 p-값이 < .001이고 배율 변화가 2 초과인 것으로 확인된 유전자를 유의미한 것으로 간주하였다. 발현 차이는 배율 변화의 log2로 보고한다. 유전자 실체 농축은 주석, 시각화 및 통합 발견을 위한 데이터베이스(DAVID; david.niaid.nih.gov) 내로 유전자 목록을 입력하여 결정하였다(Dennis, et al., 2003; Huang, et al., 2009).

실시예 XXIII

현미경 관찰, 항체, 및 유세포 측정: 세포를 15 분 동안 4% 파라포름알데하이드를 이용해서 고정하고, PBS로 세척하고, PBS 중 0.3% Triton X를 이용해서 투과화하고, 1% BSA를 이용해서 차단하였다. 현미경 관찰을 위해 이용된 일차 항체에는 PAX6(Covance, DSHB), TUJ1(Covance), BRN3A(Chemicon), AP2a(DSHB), HNK1(Sigma), PAX3(DSHB), SIX1(ABR, Atlas), ISL1(DSHB), PERIPHERIN(Santa Cruz), GSU(gift A. McNeilly), CRYAB(Chemicon), DACH1(Proteintech), EYA1(gift Kawakami), E-CADHERIN(Abeam), FSH(gift A. McNeilly), GATA2(Abeam), 닭 GFP(Abeam), hNCAM(Santa Cruz), GLUTAMATE(Sigma), KRT14(Labvision), SIX6(Atlas), LHX3(Abeam), OVOL2(Aviva), TFAP2A(DSHB), FOXG1(gift E. Lai), hCA(Stem Cells), 및 Ki67(Sigma)이 포함되었다. 적절한 Alexa 488, Alexa 568, Alexa 647 2 차 항체(Molecular Probes) 및/또는 DAPI 카운터염색을 시각화를 위해 이용하였다. 유세포 측정을 위해, 세포를 25℃에서 20 분 동안 아큐타제에 대한 노출 후 기계적으로 해리시켰다. FACS 분석에서 죽은 세포 모집단을 제거하기 위해, 제조업체의 권장사항에 따라 DAPI 또는 7-AAD를 이용하였다. 세포를 FACScan(Becton Dickinson) 및 FlowJo 소프트웨어(Tree Star, Inc.)를 이용해서 분석하였다.

실시예 IVXX

전기생리학: 클러스터를 유리 슬라이드 상에 접종하였다. 슬라이드를 기록 전 최소 1 h 동안 실온에서 5% CO2/95% O2로 버블링된 하기를 함유하는 인공 CSF(ACSF) 중에서 회수한다: 119 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 26.2 mM NaHCO3, 2.5 mM CaC12, 1.3 mM MgCl2, 1 mM NaH2PO4, 및 20 mM 글루코스(pH 7.4, 삽투압 300 mOsm). 슬라이스를 기록 동안 ACSF로 연속 관류하였다. 전체-세포 기록을 클러스터로부터 이동하는 뉴론에서 수행하였고, 이는 클러스터 중심의 세포보다 더 성숙한 경향이 있었다. 패치 전극(5-8 M)을 하기를 함유하는 세포내 용액으로 충전하였다: 130 mM K-글루코네이트, 16 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 0.2 mM EGTA, 4 mM Na2-ATP, 및 0.4 mM Na3-GTP(pH 7.25, 삼투압 290 mOsm). 각 세포의 막 전위를 패치 파열 직후에 그리고 세포 건강의 유의미한 열화가 없도록 하기 위해 실험 과정 동안 주기적으로 확인하였다. 자연적 미세 시냅스 전류를 -60 mV에서 유지되는 전압-클램프 모드에서 기록하였다. 탈분극 및 과분극 전류 단계(0.2 Hz; 500 ms 기간)를 세포에 적용하여 이들의 전기생리적 프로필을 특성규명하는 것을 도왔다. 모든 파라미터를 각각의 세포에 대해 최소 3 회 시험에 대해 측정하였고, 평균 값을 계산하였다.

실시예 XXV

생체내 이식: 모든 동물 실험은 본 발명자들의 기관 동물 관리 및 이용 위원회에 의해 승인받은 프로토콜에 따라 그리고 동물 복지에 대한 NIH 가이드라인을 따라 수행하였다. 호르몬 생산 세포의 쥐과 피하 주사: 피하 이식을 위해, 0.5 mL의 매트리겔 중 1x106 hESC-유도된 뇌하수체 세포(분화 16 일 및 32 일째에) 또는 매트리겔 단독(대조군으로서)을 성체 8 주령 수컷 NOD-SCID IL2Rgc 널 계통 마우스 및 성체 8 주령 수컷 누드 래트(Taconic) 내로 주사하였다. PARC 가이드라인에 따라 전혈 수집 또는 안와후 혈액 수집을 혈장으로부터의 호르몬 측정을 위해 이식 1 주, 4 주 및 6 주 후에 수행하였다. 동물을 이식 2 일, 1 주 및 6 주 후 희생시키고 조직학을 위해 처리하였다. 성체 마우스로부터의 매트리겔 마개를 4% 파라포름알데하이드 중에 고정하고 면역조직화학적 분석을 위해 동결섹션화하였다.

실시예 XXVI

닭 삼차신경 신경절 원기 내로의 이식: 난자 내 이식을 위해, 수정란(Charles River)을 가습화된 인큐베이터 내 37℃에서 인큐베이션하였다. GFP hESC-기원판 유도된 뉴론을 HH 단계 9-10 닭 배아의 전향적 삼차신경 신경절 내로 이식하였다. 수정란을 HH 단계 20이 될 때까지 인큐베이션한다. 닭 배아를 중뇌 신경관 수준에서 횡으로 섹션화하여 삼차신경 신경절을 가시화하였다.

실시예 XXVII

마우스 교뇌 지역 내로의 이식: 분화 22 일째에 GFP를 발현하는 hESC 유도된 삼차신경 뉴론/선조 세포를 정위 수술을 이용해서 9 마리의 NOD-SCID IL2Rgc 널 계통 마우스의 오른쪽 교뇌 내로 이식하였다; 좌표는 람다: -0.77, 브레그마: -4.16, D/V: 4.65 및 M/L: +0.5(Right)였다. 각각의 동물에 대해, 200,000 개의 세포를 100 Κ/㎕ 밀도로 이식하였다. 닭 배아 및 성체 마우스로부터의 조직을 4% 파라포름알데하이드 중에 고정하고 면역조직화학적 분석을 위해 동결섹션화하였다.

실시예 XXVIII

ACTH 및 GH 방출의 시험관내 및 생체내 분석: 호르몬을 생산하는 hESC-유도된 세포를 분화 36 일째에 분석하였다. 세포를 HBSS로 헹군 뒤 신선한 HBSS(10 분 동안 37℃에서 500 ㎕)에 노출시켰다. 이어서 상청액을 수집하고 ACTH LumELISA 키트(Calbiotech)를 이용해서 ELISA를 거쳤다. ACTH는 또한 ELISA를 거친 컨디셔닝된 배지로부터 쉽게 검출되었다. 생체내 연구를 위해, hESC 유도된 전방 뇌하수체 세포 및 매트리겔-단독 대조군이 그라프트화된 마우스 및 래트로부터의 혈액 샘플을 스트레스를 최소화하는 조건 하에 8 a.m.에 K2 EDTA-처리된 BD Microtainer MAP(BD) 내로 수집하였다. 냉장되는 원심분리기를 이용해서 2,000 g에서 20 분 동안 원심분리에 의해 혈장을 단리하였다. 상청액을 ELISA를 위해 수집하여 호르몬 수준을 측정하였다. 인간 성장 호르몬 ELISA 키트(Calbiotech)를 이용해서 이식 후 시험관내 및 생체내에서 모두 유사하게 GH 수준을 측정하였다.

실시예 XXIX

E8/E6 세포 배양 배지를 이용한 PIP 프로토콜: E8/E6 세포 배양 배지(Essential8™/Essential6™, Nat Methods. 2011 May;8(5):424-9)는 성분 DMEM/F12, 아스코르브산, 셀레눔, 인슐린, NaHCO₃, 트랜스페린, FGF2 및 TGFβ를 포함한다. 배지는 E8/E6에 활성 BMP 또는 Wnt 성분이 포함되지 않는다는 점에서 본원에 기재된 KSR 배지와 다르다. 본 실시예는 BMP 결핍 E8/E6 배지를 이용하는 개질된 PIP 프로토콜을 기재한다.

세포가 언제 기원판 운명으로 변환되었는지를 모니터링하기 위해 GFP 리포터 세포 라인에서 SIX1 녹(SIX1::H2B-GFP)을 개발하였다(도 41A-E). 세포를 SMAD 저해제 SB431542 및 LDN193189를 포함하는 배지 중에 배양하고 LDN193189를 배양 2 일 후 제거하는 본원에 기재된 KSR PIP 프로토콜에 따른 E8/E6 배지에서의 리포터 세포의 배양은 배양 11 일 후 낮은 수준의 기원판 세포를 산출하였다(도 42A-B). E8/E6 배지에 존재하지 않는 BMP4는 마커 AP2의 발현에 의해 입증되는 바와 같이 세포가 비-신경 외배엽 및 기원판으로 분화하기 위해 필요하다(도 43A-C). SB431542 및 BMP4를 포함하는 E8/E6에서 SIX1::H2B-GFP 리포터 세포의 배양(여기서 BMP4를 배양 3 일 후 제거함)은 BMP4가 5 ng/ml의 농도로 배지 중에 존재한 경우 기원판 발달을 일으켰다. 그러나 20 ng/ml의 농도에서는, 또는 5 일을 초과하는 동안 5 ng/ml의 BMP4를 이용한 배양은 기원판 전구체 대신 비-신경 외배엽(피부 전구체)의 유도를 야기하였다(도 44A-C). SB431542 및 5 ng/ml의 BMP4를 함유하는 E8/E6 중 SIX1::H2B-GFP 세포의 배양(여기서 BMP4를 배양 3 일 후 제거함)은(배양 1 또는 2 일 후 제거 대비) E8/E6 배지 중 총 6 일의 배양 후 최고 수율의 기원판 전구체를 생성하였다(도 45A-B). 개질된 PIP 프로토콜(PIP-E6, 여기서 BMP4는 5 ng/ml의 농도로 존재하며 3 일 후 제거함)에 따른 세포 배양은 배양 11 일 후 다양한 기원판 마커의 유도를 일으켰다. 이는 또한 다능성(OCT4) 손실, 근육(MyoD)의 부재 또는 일반적 중배엽(Brachyury)의 유도, 및 내배엽(SOX17)의 부재 또는 신경 능선(SOX10)의 유도를 일으켰다(도 46 및 47). PIP-E6 프로토콜을 이용해서 유도된 기원판 세포의 수율은 낮았지만, 유도는 KSR PIP 프로토콜에 비해 고도로 일관되었다(도 48).

실시예 XXX

디폴트로 삼차신경 기원판을 유도하기 위해 개질된 PIP-E6: KSR과는 다르게, E8/E6에는 임의의 Wnt 활성 화합물이 포함되지 않는다. PIP-E6 프로토콜을 이용하여 배양하는 경우 디폴트 운명으로서 삼차신경 기원판 운명을 제조하기 위해, CHIR(Wnt 활성화제)을 배양 프로토콜로 첨가함으로써 PIP-E6을 개질하였다. PIP-E6 프로토콜의 2-4 일 동안 배지 중에 CHIR을 함유시키는 것은 디폴트 기원판으로서 삼차신경 기원판의 유도를 야기하였다(도 49A-B). 도 50은 PIP-E6 배양 프로토콜을 이용하여 유도될 수 있는 뇌하수체, 수정체 및 삼차신경 기원판을 도시한다.

실시예 XXXI

삼차신경 기원판 마커 GD2 및 CD57(HNK1)의 확인: Six1::GFP 마커 세포를 도 49에 의해 기재되는 바와 같이 PIP-E6 프로토콜에 따라 배양하였다. 배양 11 일 후, 하기 단계를 수행하였다:

·세포를 50,000 세포/96 웰의 농도로 재-평판접종하였음

·세포를 4 h의 부착기 동안 플레이트에 부착하도록 두었음

·살아있는 세포의 염색을 BD Lyoplate를 이용해서 수행하였음

·242 인간 세포 표면 항원을 검출하였음(대부분 CD 단백질)

·세포를 2 차 항체 염색 후 고정하였음

·세포를 다음 날에 Operetta를 이용해서 영상화하였음

·Six1::GFP+/마커+(Alexa647+) % 및 마커+(Alexa647+)의 %를 정량하였음

삼차신경 기원판에 대해 농축되는 표면 마커를 도 51에 나타낸다. 마커 GD2가 삼차신경 기원판에 대한 마커로 확인되었고, 이후 본원에 기재된 조건 하에 배양된 인간 ESC/ipSC 세포로부터 삼차신경 기원판의 단리를 위해 이용되었다. GD2는 신경외배엽 기원의 종양, 예컨대 신경모세포종을 포함하는 신경 조직 상에 발현되는 디시알로갱글리오사이드이다. GD2의 구조를 도 52에 나타낸다. 도 53A-B는 삼차신경 기원판 세포에서 GD2 및 기원판 마커 SIX1::GFP의 공동-발현을 나타낸다. 도 54A-B는 CD24 및 SIX1::GFP가 삼차신경 기원판을 포함하여 모든 신경 세포에서 발현되는 양성 대조군 세포를 나타낸다.

CD57(HNK1)이 또한 삼차신경 기원판을 확인하고 단리하기 위해 유용할 수 있는 마커로서 확인되었다(도 55). 기원판 세포에서 CD57(HNK1) 및 SIX1::GFP의 공동-발현을 도 56A-B에 나타낸다.

도 57은 디폴트 기원판 운명으로서 삼차신경 기원판을 생성하기 위해 이용될 수 있는 PIP-E6 프로토콜을 기재하며, 여기서 기원판은 이들의 GD2 마커의 발현에 기반하여 단리되고 정렬된다. 이들 배양 조건 하에, 세포를 SB431542, BMP4 및 CHIR99021(Wnt)이 보충된 E8/E6 배지 중에 배양하고, 여기서 BMP를 배양 3 일 후 제거하고 CHIR99021(Wnt)을 1.5-3.5 일 경에 배지에 포함시킨다. 정렬 후, 세포를 배지 중에 배양하여 삼차신경 분화를 뒷받침하였다(BDNF, GDNF, NGF, 및 DAPT(Notch 저해제)가 보충된 NBM/B27 배지 중). 도 58은 GD2 음성 세포에 비해 분화 28 일 후(GD2 정렬 14 일 후) GD2 양성 삼차신경 세포의 형태를 나타낸다. 도 59는 분화 48 일 후(GD2 정렬 33 일 후) 삼차신경 뉴론을 나타낸다.

실시예 XXXII

기원판 유도를 촉진하는 화합물에 대한 고처리량 스크리닝: SIX1::GFP 세포를 PIP-E6 프로토콜에 따라 배양하였다. 1280 개의 시험 화합물을 기원판 유도를 증강시키는 이들의 능력에 대해 스크리닝하였다. 각각의 시험 화합물을 3 일째에 세포 배양 배지에 첨가하였고, 세포를 6 일째에 기원판 유도 수준을 결정하기 위해 영상화하였다(도 60). 도 61은 스크리닝 결과를 나타낸다. 3 개의 후보 화합물: BRL-54443, 펜안트롤린 1 수화물, 및 파르테놀라이드가 기원판 유도를 촉진하는 것으로 확인되었다(도 61 및 도 62).

실시예 XXXIII

전방 뇌하수체 샘 세포의 유도: 뇌하수체 기원판 세포를 PIP-E6 프로토콜에 따라 SIX1::GFP 세포를 배양하여 유도하였고, 여기서 뇌하수체 인자 SHH, FGF8, FGF10 및/또는 시상하부 CM을 6-15 일로부터 배양 배지 중에 보충하였다(도 63A). 도 63B에 나타낸 바와 같이, 뇌하수체 기원판을 마커 Pitx1, Pitx2, Lhx3 및 Lhx4의 발현에 의해 입증되는 바와 같이 유도하였다. 뇌하수체 마커는 보충이 없는 PIP-E6 프로토콜만을 이용해서 유도되는 기원판에 비해 10 내지 100 배 더 많이 발현되었다. 개질된 PIP-E6 프로토콜을 이용하여 30 일까지의 분화 후, 뇌하수체 기원판 세포는 모든 3 개의 뇌하수체 전구체 계통의 유도체에 해당하는 호르몬 발현 세포로 분화하였다(도 64 및 도 65). 3 개의 전구체 계통 각각의 비는 세포를 Notch 신호전달의 저해제(DAPT)로 처리하여 그리고 CHIR(Wnt의 활성화제)에 의한 것보다 더 적은 정도로 조정되었다(도 65).

호르몬 발현 세포는 외부 자극에 반응하였다. 특히, 소마토크리닌을 이용한 자극에 반응하여 세포는 성장 호르몬(GH)을 방출하였고, 나파렐린에 반응하여 세포는 난포 자극 호르몬(FSH)을 방출하였다(도 66). 개질된 PIP-E6 프로토콜에 따라 유도된 뇌하수체 세포를 BMP2 및/또는 FGF8과 함께 배양하여 이러한 제제가 하위유형 특이적 마커 Tbx19, Pit1, GATA2, POMC1, GH1, FDHM, 및 LHB를 발현하는 뇌하수체 세포의 수율을 조작할 수 있는지를 결정하였다. BMP2는 몇몇 하위유형 특이적 마커의 수율을 증가시킬 수 있었다(도 67).

실시예 XXXIV

전방 뇌하수체 샘 세포의 유도: SIX1::GFP hPSC를 개질된 PIP-E6 프로토콜에 따라 배양하였고, 여기서 뇌하수체 인자, 예컨대 FGF8, FGF10 또는 SHH 등을 6-14 일부터 배양 배지에 포함시켰다. 세포를 SIX1::GFP의 발현에 기반하여 정렬하였고, PO/L/F 상에서 10,000 세포/cm²의 농도로 재평판접종하였고, 2 주 동안 소분자/성장 인자와 함께 인큐베이션하였다(도 68). 도 69에 나타낸 바와 같이, FGF2 및 FGF8은 Ki67 및 Sox2의 발현에 의해 입증된 바와 같이, 추정 뇌하수체 줄기 세포의 수를 증가시킬 수 있다(도 69).

실시예 XXXV

뇌하수체 호르몬 방출 세포의 시험관내 분화된 혼합물의 래트 내로의 그라프팅: 앞의 두 실시예에 기재된 개질된 PIP-E6 프로토콜을 이용해서 인간 PSC로부터 시험관내 유도된 뇌하수체 호르몬 방출 세포의 혼합물을 뇌하수체/시상하부 부위에 인접한 병소를 포함하지 않는 성체 래트의 뇌 내로 그라프팅하였다. 그라프팅된 세포는 생존하였고, 대조군에 비해 그라프팅된 동물에서 검출가능한 ACTH의 수준을 증가시켰다(도 70). 유도된 뇌하수체 호르몬 방출 세포의 혼합물을 뇌하수체 절제된 래트 내로 그라프팅했을 때, ACTH 수준은 3 마리의 그라프팅된 동물 중 2 마리에서 증가하는 것으로 나타났다(도 71).

상기 명세서에서 언급된 모든 문헌 및 특허가 본원에 참조로 도입된다. 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 개질 및 변형은 본 발명의 범위 및 정수에서 벗어나지 않고 당분야 숙련가에게 자명할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 구현예와 함께 기재되었지만, 청구되는 바와 같은 발명이 이러한 특정한 구현예에 과도하게 제한되지 않아야 함이 이해되어야 한다. 실제로, 세포 생물학, 신경생물학, 암 세포 생물학, 분자 생물학, 생화학, 화학, 유기 합성 또는 관련 분야에서의 숙련가에게 자명한 본 발명을 수행하기 위한 기재된 방식의 다양한 개질은 하기 청구범위의 범위 내인 것으로 의도된다.

<110> MEMORIAL SLOAN-KETTERING CANCER CENTER <120> SPECIFICATION OF FUNCTIONAL CRANIAL PLACODE DERIVATIVES FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS <130> 2016-FPA-7588 <150> 61/907,302 <151> 2013-11-21 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 240 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Glu Arg Cys Pro Ser Leu Gly Val Thr Leu Tyr Ala Leu Val Val 1 5 10 15 Val Leu Gly Leu Arg Ala Ala Pro Ala Gly Gly Gln His Tyr Leu His 20 25 30 Ile Arg Pro Ala Pro Ser Asp Asn Leu Pro Leu Val Asp Phe Thr Leu 35 40 45 Ile Glu His Pro Asp Pro Ile Phe Asp Pro Lys Glu Lys Asp Leu Asn 50 55 60 Glu Thr Leu Leu Arg Ser Leu Leu Gly Gly His Tyr Asp Pro Gly Phe 65 70 75 80 Met Ala Thr Ser Pro Pro Glu Asp Arg Pro Gly Gly Gly Gly Gly Pro 85 90 95 Ala Gly Gly Ala Glu Asp Leu Ala Glu Leu Phe Thr Asp Gln Leu Leu 100 105 110 Arg Gln Arg Pro Ser Gly Ala Met Pro Ser Glu Ile Lys Gly Leu Glu 115 120 125 Phe Ser Glu Gly Leu Ala Gln Gly Lys Lys Gln Arg Leu Ser Lys Lys 130 135 140 Leu Arg Arg Lys Leu Gln Met Trp Leu Trp Ser Gln Thr Phe Cys Pro 145 150 155 160 Val Leu Tyr Ala Trp Asn Asp Phe Thr Leu Gly Ser Arg Phe Trp Pro 165 170 175 Arg Tyr Val Lys Val Gly Ser Cys Phe Ser Lys Arg Ser Cys Ser Val 180 185 190 Pro Glu Gly Met Val Cys Lys Pro Ser Lys Ser Val His Leu Thr Val 195 200 205 Leu Arg Trp Arg Cys Gln Arg Arg Gly Gly Gln Arg Cys Gly Trp Ile 210 215 220 Pro Ile Gln Tyr Phe Thr Pro Ile Ile Ser Glu Cys Lys Cys Ser Cys 225 230 235 240 <210> 2 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 ctctctgctc ggccccctca cctccagtct ggtggacttg gggtcctaag tggggagg 58

Claims (41)

1. a) 세포 배양 배지에서 검출가능한 수준의 SIX1 및 PAX6을 발현하는 복수의 세포를 제공하는 단계; 및
   b) 상기 복수의 세포를, 복수의 세포에서 검출가능한 수준의 SIX1 및 PAX3의 발현을 유도하기 위한 유효량으로 뇌-유래 신경영양 인자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 배양 방법.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 방법은 세포가 삼차신경 뉴론으로 분화하도록 유도하기에 충분한 조건 하에 SIX1 및 PAX3 발현 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 SIX1 및 PAX6 발현 세포는 검출가능한 수준의 TFAP2A를 추가로 발현하는 방법.
4. 청구항 1에 있어서,
   SIX1 및 PAX3 발현 세포는 삼차신경 기원판 세포인 방법.
5. a) 세포 배양 배지에서 검출가능한 수준의 SIX1 및 PAX6을 발현하는 복수의 세포를 제공하는 단계; 및
   b) 상기 복수의 세포를, 복수의 세포에서 검출가능한 수준의 SIX1 및 PATX1의 발현을 유도하기 위한 유효량으로 소닉 헤지호그, 푸르모르파민 및 γ-시크리타제 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 배양 방법.
6. 청구항 5에 있어서,
   상기 방법은 세포가 생식샘 자극세포, 코르티코트로피성 세포 및 성장 자극세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 뇌하수체 세포로 분화하도록 유도하기에 충분한 조건 하에 SIX1 및 PITX1 발현 세포를 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
7. 청구항 5에 있어서,
   상기 SIX1 및 PAX6 발현 세포는 검출가능한 수준의 TFAP2A를 추가로 발현하는 방법.
8. 청구항 5에 있어서,
   SIX1 및 PITX1 발현 세포는 뇌하수체 기원판 세포인 방법.
9. a) 세포 배양 배지에서 검출가능한 수준의 SIX1 및 PAX6을 발현하는 복수의 세포를 제공하는 단계; 및
   b) 상기 복수의 세포를, 복수의 세포에서 검출가능한 수준의 SIX1 및 PITX3의 발현을 유도하기 위한 유효량으로 소닉 헤지호그, 푸르모르파민, γ-시크리타제 저해제 및 FGF-저해제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 배양 방법.
10. 청구항 9에 있어서,
    상기 방법은 세포가 수정체 섬유로 분화하도록 유도하기에 충분한 조건 하에 SIX1 및 PAX3 발현 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
11. 청구항 9에 있어서,
    상기 SIX1 및 PAX6 발현 세포는 검출가능한 수준의 TFAP2A를 추가로 발현하는 방법.
12. 청구항 5에 있어서,
    SIX1 및 PITX3 발현 세포는 수정체 기원판 세포인 방법.
13. 통증 증후군의 적어도 하나의 증상을 발현하는 대상체 내로 검출가능한 수준의 SIX1 및 PAX3을 발현하는 세포를 그라프팅하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 치료 방법으로서, 상기 세포의 그라프팅은 상기 통증 증후군의 적어도 하나의 증상을 감소시키는 방법.
14. 청구항 13에 있어서,
    상기 통증 증후군은 삼차신경 신경 마비, 삼차신경 신경통 및 편두통 통증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
15. 청구항 13에 있어서,
    상기 세포는 대상체의 교뇌 조직 내로 그라프팅되는 방법.
16. 청구항 13에 있어서,
    상기 세포는 삼차신경 핵으로 이동하는 방법.
17. 신경내분비 장애의 적어도 하나의 증상을 발현하는 대상체 내로 검출가능한 수준의 SIX1 및 PITX1을 발현하는 세포를 그라프팅하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 치료 방법으로서, 상기 세포의 그라프팅은 상기 신경내분비 장애의 적어도 하나의 증상을 감소시키는 방법.
18. 청구항 17에 있어서,
    상기 세포는 성장 호르몬을 발현하는 방법.
19. 청구항 17에 있어서,
    상기 세포는 부신피질 자극호르몬을 발현하는 방법.
20. 청구항 17에 있어서,
    상기 세포는 대상체의 다리 근육으로 그라프팅되는 방법.
21. 청구항 17에 있어서,
    상기 세포는 대상체의 시상하부-뇌하수체 축의 조직으로 그라프팅되는 방법.
22. 청구항 17에 있어서,
    상기 세포는 대상체의 시상하부로 그라프팅되는 방법.
23. 청구항 17에 있어서,
    상기 세포는 대상체의 터키 안장으로 그라프팅되는 방법.
24. 청구항 17에 있어서,
    상기 신경내분비 장애는 당뇨병, 뇌하수체저하증, 뇌하수체 종양 및 방사선 치료 부작용으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
25. 눈 장애의 적어도 하나의 증상을 발현하는 대상체 내로 검출가능한 수준의 SIX1 및 PITX3을 발현하는 세포를 그라프팅하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 치료 방법으로서, 상기 세포의 그라프팅은 상기 눈 장애의 적어도 하나의 증상을 감소시키는 방법.
26. 청구항 25에 있어서,
    상기 눈 장애의 적어도 하나의 증상은 실명, 황반 변성, 백내장, 난시, 근시 및 원시로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
27. 청구항 25에 있어서,
    상기 세포는 복수의 수정체 섬유 단백질을 발현하는 방법.
28. 청구항 27에 있어서,
    상기 복수의 수정체 섬유 단백질은 αβ-결정형 수정체 섬유 단백질을 포함하는 방법.
29. 청구항 27에 있어서,
    상기 복수의 수정체 섬유 단백질은 층화되는 방법.
30. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조되는 세포.
31. a) 복수의 세포를 제공하는 단계;
    b) 상기 복수의 세포를 Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD) 단백질 신호전달의 저해제와 접촉시키는 단계; 및
    c) 상기 복수의 세포를 뼈 형태형성 단백질(BMP) 활성 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포의 분화 유도 방법으로서,
    상기 복수의 세포를, 복수의 세포에서 SIX1 및 PAX6의 검출가능한 발현을 유도하기 위한 유효량으로 상기 SMAD의 저해제 및 BMP 활성 제제와 접촉시키는 방법.
32. 청구항 31의 방법에 따라 제조되는 검출가능한 수준의 SIX1 및 PAX6을 발현하는 세포.
33. a) 복수의 세포를 제공하는 단계;
    b) 상기 복수의 세포를 Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD) 단백질 신호전달의 저해제와 접촉시키는 단계; 및
    c) 상기 복수의 세포를 SMAD의 제2 저해제와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 검출가능한 수준의 SIX1 및 PAX6을 발현하는 세포로서,
    상기 복수의 세포를, 복수의 세포에서 SIX1 및 PAX6의 검출가능한 발현을 유도하기 위한 유효량으로 상기 SMAD의 제1 저해제 및 SMAD의 제2 저해제와 접촉시키는 방법.
34. 이를 필요로 하는 대상체의 치료에서 사용하기 위한, 검출가능한 수준의 SIX1 및 PAX3을 발현하는 세포.
35. 청구항 34에 있어서,
    상기 대상체는 통증 증후군의 적어도 하나의 증상을 발현하는 세포.
36. 이를 필요로 하는 대상체의 치료에서 사용하기 위한, 검출가능한 수준의 SIX1 및 PITX1을 발현하는 세포.
37. 청구항 36에 있어서,
    상기 대상체는 신경내분비 장애의 적어도 하나의 증상을 발현하는 세포.
38. 이를 필요로 하는 대상체의 치료에서 사용하기 위한, 검출가능한 수준의 SIX1 및 PITX3을 발현하는 세포.
39. 청구항 38에 있어서,
    상기 대상체는 눈 장애의 적어도 하나의 증상을 발현하는 세포.
40. 청구항 30 및 청구항 32 내지 청구항 39 중 어느 한 항의 세포를 포함하는 키트.
41. 청구항 1 내지 청구항 29 및 청구항 31 중 어느 한 항의 방법을 실시하기 위한 키트.

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