JP2020524501A - 網膜細胞への線維芽細胞の再プログラミング方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる2017年6月15日に出願された米国仮特許出願第62/520,290号に基づく優先権を主張する。
本発明は、National Institutes of Healthによって授与されたEY021171およびEY025667の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明においてある特定の権利をする。
本発明は、一般に、体細胞を再プログラミングするための組成物および方法に関する。具体的には、組成物および方法は、心筋細胞または網膜細胞への体細胞の再プログラミングを含む。
大部分の網膜疾患における視力喪失は、網膜光受容細胞および/または網膜色素上皮細胞(RPE)の喪失による。細胞置換治療は、機能を回復するかまたは保存するため、これらの失われた網膜細胞を置換するためのものである。幹細胞治療は、現在、細胞置換治療の最先端にあり、当技術分野において極めて精力的に研究されており、数件の初期ヒト臨床試験を有するいくつかのバイオテックスタートアップが生まれている。しかしながら、幹細胞アプローチは、政治的問題および倫理的問題、植え込まれた細胞の腫瘍成長に関する懸念、ウイルスの使用に関する懸念、ならびに宿主拒絶に関する懸念のため、限定されている。幹細胞を使用することなく、網膜置換細胞およびその他の細胞型を生成することは、有利であろう。
多くの網膜症が、網膜ニューロン様光受容細胞およびRGC細胞における機能障害によって引き起こされる。これらの網膜ニューロンの喪失は、重度の永久の視力喪失をもたらす、そのような障害の一般的なエンドポイントである。いくつかの動物、例えば、爬虫類は、網膜を再生させる能力を有するが、哺乳動物における再生可能性は制限されている。過去数十年間の研究は、網膜障害の病原に関する理解を大いに高めた(Wright et al.Nature reviews.Genetics 11:273-84,2010;Bramall et al.,Annual review of neuroscience 33:441-72,2010)。しかしながら、処置の機会は、現在、限定されている。再生細胞治療は、これらの網膜ニューロパシーを管理するための有望なツールとして出現した(Schwartz et al.,Lancet 385:509-16,2015)。現在、これらの治療用細胞の二つの主な起源が存在し、一方は、ES(胚性幹)細胞またはiPS(誘導多能性幹)細胞からの分化であり、他方は、体細胞からの直接的または間接的な再プログラミングである(Mellough et al.,Stem cells(Dayton,Ohio)30:673-86,2012;Zhong et al.,Nature communications 5:4047,2014;Vierbuchen et al.,Nature 463:1035-41,2010)。例えば、ニューロンが、定義された転写因子によって線維芽細胞から変換されることが示された(Vierbuchen et al.,Nature 463:1035-41,2010)。しかしながら、異所性トランスジーンの導入は、治療的適用を限定する。
細胞運命の可塑性について増大する証拠によって、実験室で体細胞を再プログラミングする可能性が開かれた。再プログラミングとは、他の体細胞型へのある体細胞型の変換をさし、その過程は、細胞の遺伝子発現プロファイルの再指示を必然的に伴う。再プログラミングされた体細胞は、細胞治療または組織治療のために使用され得るため、患者自身の細胞または組織適合性の細胞が、疾患または損傷の処置のために使用され得る。
体細胞を、培養プレートに播種することができる。体細胞を、0.1%ゼラチンコート上に播種し、第1の再プログラミング物質組成物に曝露することができる。2日後、3日後、4日後、5日後、6日後、7日後、8日後、またはそれ以降に、第1の再プログラミング物質組成物を増強物質と共に導入することができる。本発明のある種の局面は、本明細書中に記載される体細胞の再プログラミングのための培養培地および培養条件を含む。本発明の細胞培養培地は、(i)エピジェネティック修飾物質、(ii)グリコーゲン合成酵素キナーゼ3(GSK-3)阻害物質、(iii)TGFβR/ALK5阻害物質、(iv)cAMP上昇化合物(例えば、アデニルシクラーゼ活性化物質);および(v)増強物質を含んでいてよく、ここで、培養培地は、体細胞を目的の細胞へ再プログラミングするために有効である。
細胞の機能障害に起因する多くの疾患が、再プログラミングされた細胞の投与による処置を受け入れ可能であり得る。これらには、心疾患、神経疾患、内分泌疾患、血管疾患、網膜疾患、皮膚疾患、および筋骨格系疾患、ならびにその他の疾患が含まれる。患者自身の細胞を、置換を必要とする所望の細胞型へ形質転換するかまたは変換することができる。従って、再プログラミングは、移植時に免疫拒絶を受けないであろう自己の遺伝学的にマッチした細胞の生成を可能にする。さらに、本明細書中に記載された方法によって作製された再プログラミングされた細胞株は、移植のための細胞の起源となり得る。
再プログラミングされた細胞は、様々な方法を使用して、同定されかつ確認され得る。これらの方法には、細胞およびコロニーの形態学の調査;細胞が目的の細胞型の機能的特徴を示すか否かの判定;細胞が目的の細胞型の特徴的なマーカーを発現するか否かの判定;ならびに遺伝子メチル化の目的の細胞型との比較が含まれる。
本発明は、再プログラミングされた体細胞(例えば、誘導されたRPE、誘導されたPR細胞、および誘導された網膜前駆細胞;誘導されたRPE、誘導されたPR細胞、および誘導された網膜前駆細胞の子孫)と、適切な担体とを含む組成物を提供する。本発明の組成物は、本発明の再プログラミングされた細胞を含むことができ、いくつかの態様において、一つまたは複数の追加の構成要素を含むことができ、それらの構成要素は、一部分、本発明の再プログラミングされた細胞の意図された使用に基づき選択される。適切な構成要素には、塩;緩衝液;安定剤;プロテアーゼ阻害因子;細胞膜および/または細胞壁を保存する化合物、例えば、グリセロール、ジメチルスルホキシドなど;細胞にとって適切な栄養培地などが含まれる。
網膜細胞への線維芽細胞の化学的再プログラミング
A.結果
光受容細胞様細胞(CiPPC)の誘導のための低分子の同定 網膜ニューロンに特異的な運命を担う低分子を同定するため、本発明者らは、線維芽細胞をニューロンへ変換することができる低分子のセットを記載している以前の研究に従った(Hu et al.,Cell stem cell 17:204-12,2015;Zhang et al.,Cell stem cell 17:735-47,2015;Fu et al.,Cell research 25,2015;Cheng et al.,Cell research 25:1269-72,2015)。これらの研究において記載された6種類の低分子のうちの4種類、バルプロ酸(V)、CHIR(C)、Repsox(R)、およびフォルスコリン(F)は、線維芽細胞を混合前駆細胞段階へ変換することができる(Fu et al.,Cell research 25,2015)。本発明者らは、網膜ニューロンに特異的な運命の決定のために重要であり得る追加の低分子を見出すため、この現象を活用した。種々の培地組成および時点と共に、低分子のアレイを、可能性のある候補として試験した。光受容細胞特異的レポーターマウス(Nrl-GFP)由来のマウス胎仔線維芽細胞(MEF)を、再プログラミング研究のための出発細胞として使用する(Akimoto et al.,PNAS 103:3890-95,2006)。光受容細胞へ変換された場合に、これらのMEFは、NrlプロモーターからのGFP発現を有するであろう。多くの低分子および培養培地による数回の失敗の後、本発明者らは、d10〜d11の間にVCRFの存在下でGFP陰性MEFをGFP+陽性の丸形の光受容細胞様細胞へ変換することができるWnt/βカテニン阻害物質(IWR1)を同定した。この変換は、8日目(d8)に導入される3種類の追加の因子、ソニックヘッジホッグ(S)、タウリン(T)、およびレチノイン酸(R)を必要とする(図1Aおよび図1B)。ヒト線維芽細胞(HFL1、ATCC CCL153)も、これらの低分子によって光受容細胞様細胞へ変換され得る。本発明者らは、Nrlプロモーターの下流にレンチウイルスによって形質導入されたDsRedレポーターを有するHFL-1細胞株を最初に生成した。薬物によって選択されたHFL1-Nrl-DsRed細胞を、いくつかの改変を含み以前に記載されたマウスに特異的なプロトコールによる再プログラミングのために使用した(図1C)。丸形のニューロン様のNrlプロモーターによって駆動されたDsRed陽性細胞が、d6〜d8に明らかになり始めた(図1D)。IWR1濃度およびその導入の時期を変化させることによる方法の改変が、その細胞を入手するためには必須である。再プログラミング中のBDNF、GDNF、およびNT3の添加は、これらの変換されたヒト光受容細胞様細胞が、健常な形態学を有することを支援する。本発明者らは、出発細胞としてNrl-GFP MEFを使用することによって、再プログラミング過程における各低分子の重要性を試験した。それらの各々は、単独では、GFPレポーターを活性化することができず、このことから、低分子の間の相乗作用がその過程のために重大であることが示された(図1E)。次いで、本発明者らは、カクテルから低分子の各々を差し引き、Repsox、フォルスコリン、CHIR、およびIWR1の除去が再プログラミング過程に対して最悪の効果を有することを見出した。これらの結果は、低分子カクテル(5C)が、線維芽細胞を網膜光受容細胞様細胞へ変換することができることを明確に証明した。図12A〜12Fは、ciRGCがニューロン活性を有することを図示する。
化学的に誘導された網膜ニューロンの生成 全ての低分子を、製造業者の説明書に従って、DMSOで希釈。0日目に、約35000個のMEFを、(0.1%ゼラチンによってO/Nコーティングされた)24穴プレートの各ウェルに播種した。1日目に、培地を、V(0.5mM)、C(4.8μM)、R(2μM)、F(10μM)を含む光受容細胞誘導培地(PIM)に交換した。3日目に、V、C、R、F+IWR1(I、10μM)を含む培地(PIM)に交換した。d5およびd6において、VCRFIを含む培地(PIM)に交換した。8日目に、ソニックヘッジホッグ(S、3nM)、タウリン(T、100μM)、およびレチノイン酸(R、1μM)を添加した。9日目に、全ての低分子および因子を含む培地に交換した。最後に、11日目に、GFP発現を有する細胞を観察した。分化のため、培地を光受容細胞分化培地(PDM)に交換し、d15〜d16までそれを維持する。ヒト包皮線維芽細胞(HFF-1)変換のためのプロトコールは、d3において添加された5μM IWR1、5日目に添加されたS、T、R、BDNF、GDNF、およびNT3を除き、全て同一のままである。細胞は7日目に固定され分析された。
免疫蛍光およびレーザー走査型共焦点顕微鏡法 共焦点顕微鏡法のため、変換されGFPによって選別された細胞を、チャンバー付きカバーガラス(Nunc)に播種し、一晩維持した。翌朝、細胞をMitotracker Red(500nM)によって30分間染色した。次いで、細胞を、4%PFAで20分間固定し、アキシン2 Ab(Santa Cruz 1:100)によって一晩染色した。顕微鏡写真をZeiss LSM 510共焦点顕微鏡において得た。データ分析および3D再構築は、ZEN liteソフトウェアの補助により行われた。免疫蛍光顕微鏡法のため、抗体によって染色された細胞を、Leica蛍光顕微鏡において分析した。必要に応じて、Alexa633、Alexa549、およびAlexa488のタグ付き二次抗体を使用した。一次抗体の一覧については、表2を参照すること。
光受容細胞(hCiPC)へのヒト成人皮膚線維芽細胞(HADF)の化学的再プログラミング
A.結果
ヒト成人皮膚線維芽細胞再プログラミングのための改変されたスキームは、図13Aに例示される。HADFから変換されたCiPCのqPCR分析(変化倍率)は、光受容細胞に特異的な遺伝子の増大した発現を示す。Nrlによって染色されたHADFの顕微鏡写真は、変換されたCiPCを示す。初期変換プロトコールと改変された変換プロトコールとの間の変換効率の比較。(異なる供給元、Coriell Instituteからの)HADFから変換されたCiPCにおける光受容細胞に特異的な遺伝子(Crxおよびリカバリン)の発現。(ATCCからの)HADFから変換されたCiPCにおける光受容細胞に特異的な遺伝子(Nrl、リカバリン、ロドプシン)の発現(図13および図14)。
改変プロトコール:D0:ヒト皮膚線維芽細胞をIMR-90培地において0.1%ゼラチンによって(O/N)コーティングされた6穴プレートに播種する(細胞106個/ウェル)。D1:培地をバルプロ酸(V、0.5mM)、CHIR(C、3μM)、Repsox(R、1μM)、フォルスコリン(F、10μM)、IWR1(I、10μM)を有する光受容細胞誘導培地(PIM)に交換する。D3:VCRFIを含む培地に交換する。D5:VCRFIを含む培地に交換する。D7:VCRFIを含む培地に交換する。D9:VCRFIを含む培地に交換する。遺伝子発現について細胞を分析する。D10:細胞を採集する。
網膜ニューロンへのマウスミュラーグリア細胞の化学的再プログラミング
図15は、網膜神経節細胞へのマウス初代ミュラー細胞の変換を示す。図15Aは、変換前のミュラー細胞を示す。図15Bは、3日目における化学物質カクテルによる変換後のCiRGC細胞を示す。図15Cは、Brn3a、Brn3b、Isl1、Nefl、およびNeNのようなRGCに特異的な遺伝子の発現を示すリアルタイムqPCR分析を示す。
網膜ニューロンへのヒトミュラーグリア細胞の化学的再プログラミング
図16は、網膜神経節細胞(hCiRGC)へのヒト初代ミュラー細胞の変換を例示する。図16Aは、変換前のヒトミュラー細胞を示す。図16Bは、3日目における化学物質カクテルによる変換後のhCiRGC細胞を示す。図16Cは、Brn3a、Brn3b、Isl1、Nefl、およびNeNのようなRGCに特異的な遺伝子の発現を示すリアルタイムqPCR分析を示す。
網膜ニューロンへの胚性幹(ES)細胞の化学的再プログラミング
図17は、化学物質によるニューロン様細胞へのES細胞の変換を示す。(A)化学的処理前の1日目のマウスES細胞。(B)d6におけるES細胞由来の化学的に変換されたニューロン様細胞。(C)d7におけるES細胞由来の化学的に変換されたニューロン様細胞。
Claims (52)
- (a)体細胞を目的の細胞へ変換する再プログラミング物質の存在下で該体細胞を培養する工程であって、(i)エピジェネティック修飾物質、(ii)グリコーゲン合成酵素キナーゼ3(GSK-3)阻害物質、(iii)TGFβR/ALK5阻害物質、(iv)cAMP上昇化合物を含む、第1の再プログラミング組成物と、増強物質を含む第2の再プログラミング組成物とを該再プログラミング物質が含み、該培養によって、再プログラミングされた細胞培養物が形成される、工程;および
(b)該再プログラミングされた細胞培養物中の該目的の細胞を同定する工程
を含む、該体細胞を目的の細胞へ化学的に変換する方法。 - 前記エピジェネティック修飾物質がシトクロムP450 2C9(CYP2C9)阻害物質である、請求項1に記載の方法。
- 前記シトクロムP450 2C9(CYP2C9)阻害物質がバルプロ酸である、請求項2に記載の方法。
- 前記グリコーゲン合成酵素キナーゼ3(GSK-3)阻害物質がCHIR99021である、請求項1に記載の方法。
- 前記TGFβR/ALK5阻害物質がRepsoxである、請求項1に記載の方法。
- 前記アデニルシクラーゼ活性化物質がフォルスコリンである、請求項1に記載の方法。
- 前記体細胞が、線維芽細胞、単球、上皮細胞、血液から単離された細胞、皮膚線維芽細胞、ケラチノサイト、または尿由来上皮細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記体細胞が、ミュラー細胞、または網膜に存在する細胞である、請求項7に記載の方法。
- 前記網膜に存在する細胞が、グリア細胞、アストロサイト、または免疫細胞である、請求項8に記載の方法。
- 前記増強物質が、WNT阻害物質、PKC阻害物質、p160ROCK阻害物質、神経原性物質、TGFβR阻害物質、MEK1/2阻害物質、ヒストン脱アセチル化酵素阻害物質、TGFβR/ALK5阻害物質、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害物質、および/またはGSK-3阻害物質などの増強物質である、請求項1に記載の方法。
- 前記増強物質がWNT阻害物質である、請求項1に記載の方法。
- 前記WNT阻害物質がIWR-1またはXAV939である、請求項11に記載の方法。
- 前記増強物質が、CHIR990211などのWNTアゴニストである、請求項1に記載の方法。
- 前記増強物質がWNTアゴニストおよびWNTアンタゴニストである、請求項12に記載の方法。
- 前記WNT阻害物質がIWR-1またはXAV939であり、かつ前記WNTアゴニストがCHIR99021である、請求項14に記載の方法。
- アキシン2が、薬理学的に安定化されて、網膜細胞型につながるミトコンドリア活性酸素種生成およびエピジェネティック修飾をもたらす、請求項1に記載の方法。
- 前記目的の細胞が肝細胞、心筋細胞、感覚有毛細胞、または網膜細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記体細胞がマトリックス上で培養される、請求項1に記載の方法。
- 前記マトリックスがマトリゲルまたはフィブロネクチンである、請求項18に記載の方法。
- 前記培養する工程によって三次元オルガノイドが形成される、請求項1に記載の方法。
- 前記網膜細胞が、網膜光受容細胞、網膜神経節細胞、または網膜色素上皮細胞である、請求項17に記載の方法。
- 前記体細胞を培養する工程が、
該体細胞を播種すること;
(i)エピジェネティック修飾物質、(ii)グリコーゲン合成酵素キナーゼ3(GSK-3)阻害物質、(iii)TGFβR/ALK5阻害物質、(iv)cAMP上昇化合物を含む、第1の再プログラミング組成物に、誘導された細胞集団を形成する第1の誘導期の間、播種された該体細胞を曝露して、
増強物質を含む第2の再プログラミング組成物に、網膜細胞集団を形成する第2の誘導期の間、該誘導された細胞集団を曝露すること
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記増強物質がWNT阻害物質である、請求項22に記載の方法。
- 前記WNT阻害物質がIWR-1である、請求項23に記載の方法。
- 変換前に前記体細胞を操作する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 操作が、欠陥のある遺伝性遺伝子を置換するための遺伝子編集を含む、請求項25に記載の方法。
- 請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法によって作製された、肝細胞、心筋細胞、または網膜細胞。
- 光受容細胞、RGC細胞、またはRPE様細胞である、請求項27に記載の網膜細胞。
- (a)体細胞を目的の細胞へ変換する再プログラミング物質の存在下で該体細胞を培養する工程であって、(i)エピジェネティック修飾物質、(ii)グリコーゲン合成酵素キナーゼ3(GSK-3)阻害物質、(iii)TGFβR/ALK5阻害物質、(iv)cAMP上昇化合物を含む、第1の再プログラミング組成物と、増強物質を含む第2の再プログラミング組成物とを該再プログラミング物質が含み、該培養によって、再プログラミングされた細胞培養物が形成される、工程;および
(b)該再プログラミングされた細胞培養物中の該目的の細胞を同定する工程
を含む、網膜色素上皮細胞を生成する方法。 - 変換前に前記体細胞を操作する工程をさらに含む、請求項29に記載の方法。
- 操作が、欠陥のある遺伝性遺伝子を置換するための遺伝子編集を含む、請求項30に記載の方法。
- (a)体細胞を目的の細胞へ変換する再プログラミング物質の存在下で該体細胞を培養する工程であって、(i)エピジェネティック修飾物質、(ii)グリコーゲン合成酵素キナーゼ3(GSK-3)阻害物質、(iii)TGFβR/ALK5阻害物質、(iv)cAMP上昇化合物を含む、第1の再プログラミング組成物と、増強物質を含む第2の再プログラミング組成物とを該再プログラミング物質が含み、該培養によって、再プログラミングされた細胞培養物が形成される、工程;および
(b)該再プログラミングされた細胞培養物中の該目的の細胞を同定する工程
を含む、光受容細胞を生成する方法。 - 変換前に前記体細胞を操作する工程をさらに含む、請求項32に記載の方法。
- 操作が、欠陥のある遺伝性遺伝子を置換するための遺伝子編集を含む、請求項33に記載の方法。
- (a)体細胞を目的の細胞へ変換する再プログラミング物質の存在下で該体細胞を培養する工程であって、(i)エピジェネティック修飾物質、(ii)グリコーゲン合成酵素キナーゼ3(GSK-3)阻害物質、(iii)TGFβR/ALK5阻害物質、(iv)cAMP上昇化合物を含む、第1の再プログラミング組成物と、増強物質を含む第2の再プログラミング組成物とを該再プログラミング物質が含み、該培養によって、再プログラミングされた細胞培養物が形成される、工程;および
(b)該再プログラミングされた細胞培養物中の該目的の細胞を同定する工程
を含む、網膜前駆細胞を生成する方法。 - 変換前に前記体細胞を操作する工程をさらに含む、請求項35に記載の方法。
- 操作が、欠陥のある遺伝性遺伝子を置換するための遺伝子編集を含む、請求項36に記載の方法。
- それを必要とする対象の眼へ、請求項1〜35のいずれか一項によって作製された細胞の有効量を送達する工程を含む、該対象において眼の障害を処置する方法。
- 前記障害が、網膜委縮、視神経損傷、視神経萎縮、加齢黄斑変性、遺伝性網膜変性、糖尿病性網膜症、鎌状赤血球網膜症、緑内障、嚢胞様黄斑浮腫、網膜剥離、血管閉塞、光受容細胞変性、感染症、視力喪失、およびそれらの任意の組み合わせである、請求項38に記載の方法。
- 前記障害が緑内障である、請求項38に記載の方法。
- それを必要とする対象の耳または頭皮へ、再プログラミング組成物または請求項1〜35のいずれか一項によって作製された細胞の有効量を送達する工程を含む、該対象において耳内の有毛細胞の再生もしくは幼若化によって聴覚喪失を処置するかまたは毛包内の幹細胞の再生、再活性化、もしくは幼若化によって脱毛症を処置する方法。
- それを必要とする対象の眼へ、(i)エピジェネティック修飾物質と(ii)グリコーゲン合成酵素キナーゼ3(GSK-3)阻害物質と(iii)TGFβR/ALK5阻害物質と(iv)cAMP上昇化合物と(v)増強物質との組み合わせの有効量を送達する工程を含む、該対象において眼の障害を処置する方法。
- 低分子の組み合わせが眼内注射によって投与される、請求項42に記載の方法。
- 幹細胞または前駆細胞を分化させるため、低分子(VCRFIおよび/またはSTR)の全てまたは組み合わせを使用する方法。
- 前記幹細胞または前駆細胞が、3Dマトリックス中でまたはオルガノイドとして培養される、請求項44に記載の方法。
- 前記幹細胞または前駆細胞が網膜系統へ変換される、請求項44に記載の方法。
- 老化した細胞を幼若化するため、低分子(VCRFIおよび/またはSTR)の全てまたは組み合わせを使用する方法。
- 損傷した細胞、疾患を有する細胞、および/または老化した細胞の機能を回復するため、低分子(VCRFIおよび/またはSTR)の全てまたは組み合わせを使用する方法。
- (a)体細胞を目的の細胞へ変換する再プログラミング物質の存在下で該体細胞を培養する工程であって、(i)エピジェネティック修飾物質、(ii)グリコーゲン合成酵素キナーゼ3(GSK-3)阻害物質、(iii)TGFβR/ALK5阻害物質、(iv)cAMP上昇化合物を含む、第1の再プログラミング組成物と、増強物質を含む第2の再プログラミング組成物とを該再プログラミング物質が含み、該培養によって、再プログラミングされた細胞培養物が形成される、工程;および
(b)該再プログラミングされた細胞培養物中の該目的の細胞を同定する工程
を含む、網膜神経節細胞を生成する方法。 - 変換前に前記体細胞を操作する工程をさらに含む、請求項49に記載の方法。
- 操作が、欠陥のある遺伝性遺伝子を置換するための遺伝子編集を含む、請求項50に記載の方法。
- 試験作用物質の有効性を判定するため、変換された細胞を該試験作用物質と接触させる工程を含む、診断またはスクリーニングの方法。
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