ES2834773T3 - Método para producir progenitores óticos - Google Patents

Abstract

Un método para generar células progenitoras óticas que comprende las etapas secuenciales de: i) cultivar una célula progenitora en condiciones suficientes para inhibir la señalización de Wnt y activar la señalización de FGF durante un primer período de tiempo suficiente para inducir la sobrerregulación de uno o más marcadores de células óticas seleccionados entre PAX2, PAX8, FOXG1 y SOX2; ii) cultivar la célula progenitora de la etapa i) en condiciones suficientes para activar la señalización de Wnt y reducir la señalización de FGF con respecto a la etapa i) durante un segundo período de tiempo suficiente para mantener la expresión sobrerregulada de dichos uno o más marcadores de células óticas seleccionados de PAX2, PAX8, FOXG1 y SOX2; en el que: las condiciones suficientes para inhibir la señalización de Wnt comprenden cultivar dicha célula progenitora en un medio de cultivo que comprende uno o más inhibidores de Wnt; las condiciones suficientes para activar la señalización de FGF comprenden cultivar dicha célula progenitora en un medio de cultivo que comprende uno o más FGF; las condiciones suficientes para activar la señalización de Wnt comprenden cultivar dicha célula progenitora en un medio de cultivo que comprende uno o más activadores de Wnt; y las condiciones suficientes para reducir la señalización de FGF comprenden cultivar dicha célula progenitora de la etapa ii) en un medio de cultivo que comprende uno o más FGF a una concentración menor que dicho uno o más FGF presentes en dicho medio de cultivo de la etapa i).

Description

DESCRIPCIÓN

Método para producir progenitores óticos

Esta invención se refiere a un método mejorado para generar células progenitoras óticas. La invención también se refiere a usos de dichas células progenitoras óticas, por ejemplo, como un medicamento (por ejemplo, en el tratamiento de la pérdida auditiva, sordera u otro trastorno auditivo asociado con la pérdida de la función del oído interno) y/o en métodos de cribado de fármacos.

Antecedentes

La pérdida de audición, o sordera, es una condición que afecta a millones de personas en todo el mundo con un impacto significativo tanto en el sistema de salud en su conjunto como en la calidad de vida y la integración social del individuo afectado. En la gran mayoría de los casos, el déficit sensorial se debe al daño o pérdida de las células ciliadas sensoriales y sus neuronas ganglionares espirales asociadas (SGN) en el oído interno del individuo afectado. Dado que los mamíferos han perdido la capacidad de regenerar estas células, la sordera es irreversible. De todas las formas de sordera, la neuropatía auditiva es de particular interés. Esta condición, definida principalmente por el daño de las SGN con relativa preservación de las células ciliadas, es responsable de la pérdida auditiva en una proporción sustancial de pacientes. Aunque la pérdida de células ciliadas puede evitarse parcialmente con un implante coclear, no se dispone de un tratamiento de rutina para la pérdida de neuronas sensoriales, ya que una inervación deficiente limita el rendimiento prospectivo de un implante. La medicina regenerativa y el uso de progenitores de células sensoriales producidos in vitro ofrecen esperanzas para el tratamiento de una condición que hasta ahora permanece sin cura.

Se han obtenido fenotipos similares a células ciliadas y neuronas sensoriales, con diferentes grados de maduración funcional, a partir de poblaciones de células madre de ratón (Oshima K, Shin K, Diensthuber M, Peng AW, Ricci AJ, Heller S. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell., 141(4): 704-16 (2010); Martinez-Monedero R, Yi E, Oshima K, Glowatzki E, Edge AS. Differentiation of inner ear stem cells to Functional sensory neurons. Dev Neurobiol. 68(5): 669-84. (2008)). Después del trasplante, algunos tipos de células han mostrado un injerto exitoso, pero ninguno ha mostrado evidencia de recuperación funcional (Corrales CE, Pan L, Li H, Liberman MC, Heller S, Edge AS. Engraftment and differentiation of embryonic stem cell-derived neural progenitor cells in the cochlear nerve trunk: growth of processes into the organ of Corti. J Neurobiol. 66(13): 1489-500. (2006)). Aunque son útiles para fines de investigación, estos productos no son adecuados para una aplicación terapéutica y los tipos de células apropiados de origen humano han sido difíciles de alcanzar hasta ahora. Además, los neuroprogenitores aislados de cócleas humanas maduras muestran un potencial proliferativo y diferenciador limitado, y las células de la cresta neural derivadas de hESC pueden diferenciarse en neuronas sensoriales por exposición a la proteína morfogenética ósea (BMP) pero carecen de características óticas verdaderas (Shi F, Corrales CE, Liberman MC , Edge AS. BMP4 Induction of sensory neurons from human embryonic stem cells and reinnervation of sensory epithelium. Eur J Neurosci. 26 (11): 3016-23. (2007)).

Estudios más prometedores han demostrado que las células madre embrionarias humanas (hESC) se pueden usar para generar progenitores óticos empleando FGF3 y FGF10, moléculas implicadas en la inducción de placoda ótica, y que estos progenitores óticos pueden provocar reparación funcional en jerbos ensordecidos (Chen et al., 2012). Sin embargo, el método de inducción de FGF3/10 utilizado es ineficaz y produce aproximadamente el 20% de los tipos de células requeridos únicamente.

También se ha publicado recientemente un método en el que se manipuló la señalización de Wnt para producir células similares a las células ciliadas del oído interno a partir de hESC (Ronaghi et al., 2014). El método comienza forzando la agregación de hESC en cuerpos embrioides (Eb ) en presencia de IGF-1, mientras inhibe tanto TGFp como Wnt. A continuación, los EB se cultivan en placa sobre poli-L-ornitina y laminina con bFGF, FGF-19, nogina y R-espondina durante 3 días, y en esta etapa se eliminan nogina y R-espondina y se reemplazan con BMP4. El método Ronaghi se realiza en presencia de reemplazo de suero KnockOut. El rendimiento previsto de progenitores óticos de este método es sólo alrededor del 12,5% del número total de células.

Aunque la técnica anterior demuestra que las células progenitoras óticas pueden generarse con éxito a partir de hESC, los métodos utilizados son relativamente ineficaces.

Existe una clara necesidad de un método mejorado y confiable para generar células progenitoras óticas, en el que el método tenga la capacidad de producir al menos uno (e idealmente ambos) de los tipos de células requeridos para el reemplazo sensorial (células similares a las células ciliadas) y/o neuronas auditivas (sensoriales)).

Breve resumen de la divulgación

Los inventores han investigado las condiciones de cultivo necesarias para generar células progenitoras óticas.

La invención se basa en el sorprendente hallazgo de que la manipulación secuencial de la señalización de Wnt (inhibición inicial, seguida de activación) contra un contexto de señalización de FGF atenuada durante el cultivo de una célula progenitora da como resultado una mejora significativa en el rendimiento de células progenitoras óticas (de aproximadamente 20% a cerca del 60%). Por consiguiente, la invención proporciona un método mejorado en el que se induce la diferenciación de células progenitoras de células madre pluripotentes (por ejemplo, hESC) utilizando señalización modificada de la placoda ótica.

Se sabe que la vía de señalización de Wnt juega un papel durante el desarrollo del oído in vivo. Los inventores han manipulado la vía de señalización canónica de Wnt en combinación con FGF con el fin de diferenciar el progenitor ótico. Se ha encontrado necesario un período inicial de señalización de FGF combinado con inhibición de Wnt para promover una identidad ectodérmica en las células madre embrionarias humanas en diferenciación, con un aumento concomitante de la expresión de marcadores óticos. Sorprendentemente, se ha demostrado que una fase posterior de activación de Wnt con una señal de FGF atenuada expande aún más la proporción de progenitores óticos, en la que el rendimiento resultante de progenitores óticos es sustancialmente mayor que el mostrado usando métodos anteriores en los que la señalización de FGF se mantiene en esta segunda fase al mismo nivel que en la primera fase.

Ventajosamente, el rendimiento típico del progenitor ótico del método mejorado descrito en el presente documento es del 50 al 60% (del número total de células).

Ventajosamente, el método da como resultado dos poblaciones de células progenitoras óticas (progenitoras epiteliales óticas y progenitoras neurales óticas respectivamente) que pueden diferenciarse adicionalmente in vitro en células del tipo de células ciliadas y neuronas auditivas.

Es importante destacar que el método se puede llevar a cabo en una monocapa. A diferencia de los métodos que requieren una etapa de agregación inicial, el crecimiento de las células como una monocapa facilita la selección manual y la purificación de colonias del tipo celular deseado.

Ventajosamente, el método se puede realizar en condiciones de cultivo sin suero que eviten el uso de reemplazo de suero knockout (KSR), un reemplazo de suero indefinido. Además, poder realizar la diferenciación en un sistema definido libre de suero facilitará la adaptación del protocolo a las normas GMP (Buenas Prácticas de Manufactura), libre de productos animales y apto para aplicación clínica.

Por el tanto, el método facilita la generación de células progenitoras óticas que pueden usarse en un entorno clínico, por ejemplo, en el tratamiento de la pérdida auditiva, sordera u otro trastorno auditivo asociado con la pérdida de la función del oído interno.

Por lo tanto, algunas de las ventajas notables del método son: (i) simplicidad (menos etapas), (ii) mayor eficiencia en la generación del tipo o tipos de células deseados (iii) uso de un sistema de cultivo monocapa que permite la selección manual de colonias, y (iv) condiciones de cultivo sin suero que evitan el uso de KSR, un reemplazo de suero indefinido.

En un primer aspecto, la invención proporciona un método para generar células progenitoras óticas que comprende las etapas secuenciales de:

i) cultivar una célula progenitora en condiciones suficientes para inhibir la señalización de Wnt y activar la señalización de FGF durante un primer período de tiempo suficiente para inducir la sobrerregulación de uno o más marcadores de células óticas;

ii) cultivar la célula progenitora de la etapa i) en condiciones suficientes para activar la señalización de Wnt y reducir la señalización de FGF en relación con la etapa i) durante un segundo período de tiempo suficiente para mantener la expresión sobrerregulada de dichos uno o más marcadores de células óticas.

En una realización, dicha célula progenitora es una célula madre pluripotente. Preferiblemente, dicha célula madre pluripotente es una célula madre embrionaria o una célula madre pluripotente inducida.

En una realización, dichas células progenitoras óticas comprenden una o más células progenitoras epiteliales óticas y/o una o más células progenitoras neurales óticas.

En una realización, dichos uno o más marcadores de células óticas se seleccionan entre PAX2, PAX8, FOXG1 y SOX2.

En una realización, dicha sobrerregulación de uno o más marcadores de células óticas se determina midiendo la expresión génica, por ejemplo, dicha expresión génica se determina midiendo los niveles de ARNm y/o proteínas.

En una realización, dichas condiciones suficientes para inhibir la señalización de Wnt comprenden cultivar dicha célula progenitora en un medio de cultivo que comprende uno o más inhibidores de Wnt. Preferiblemente, dicho uno o más inhibidores de Wnt es IWR-1-endo.

En una realización, dichas condiciones suficientes para activar la señalización de FGF comprenden cultivar dicha célula progenitora en un medio de cultivo que comprende uno o más FGF. Preferiblemente, dichas condiciones suficientes para reducir la señalización de FGF comprenden cultivar dicha célula progenitora de la etapa ii) en un medio de cultivo que comprende uno o más FGF a una concentración menor que dicho uno o más FGF presentes en dicho medio de cultivo de la etapa i). Opcionalmente, dicho uno o más FGF presentes en el medio de cultivo de la etapa i) son los mismos que dicho uno o más FGF presentes en el medio de cultivo de la etapa ii). Opcionalmente, dicho uno o más FGF se selecciona de FGF3 y FGF10.

En una realización, dicha célula progenitora se cultiva como una monocapa.

En una realización, dicha célula progenitora se cultiva en condiciones libres de suero.

En una realización, la inhibición de la señalización de Wnt se produce antes de la diferenciación de la célula progenitora ótica.

En una realización, dicho primer período de tiempo es de al menos 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240, 264 o 288 horas. Preferiblemente, dicho primer período de tiempo es de al menos 144 horas.

En una realización, dicho segundo período de tiempo es de al menos 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 o 192 horas. Preferiblemente, dicho segundo período de tiempo es de al menos 96 horas.

En una realización, el método comprende además una etapa iii) que comprende diferenciar dichas células progenitoras óticas en células similares a células ciliadas.

En una realización, el método comprende además una etapa iii) que comprende diferenciar dichas células progenitoras óticas en neuronas auditivas o sensoriales.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una célula progenitora ótica obtenida mediante el método de la invención.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una célula progenitora ótica de acuerdo con la invención para su uso como medicamento.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una célula progenitora ótica de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de una pérdida auditiva, sordera u otro trastorno auditivo asociado con la pérdida de la función del oído interno.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una célula progenitora ótica de acuerdo con la reivindicación de la invención para su uso en el cribado de fármacos.

Breve descripción de los dibujos

Las realizaciones de la invención se describen con más detalle a continuación con referencia a los dibujos adjuntos: La Figura 1 muestra la respuesta a la dosis de IWR-1-endo, presente a lo largo del protocolo de 12 días, sobre la expresión génica de PAX2, PAX8 y FOXG1 en la línea celular H14S9 hES, sembrada a razón de 8 x 103 células/cm2. El compuesto se reconstituyó en el vehículo DMSO y también se incluyó un control de solo vehículo. Los gráficos de barras indican la desviación media y estándar de la expresión génica en relación con la de la condición de DFNB control (n = 2 experimentos independientes). La significancia estadística se determinó mediante ANOVA de una vía con la prueba posterior de comparación múltiple de Bonferroni. ns = sin diferencia significativa. * P <0,05, ** P <0,01, **** p <0,0001.

La Figura 2 muestra la expresión génica de marcadores asociados con la diferenciación de linajes de ectodermo (A), mesodermo (B) y endodermo (C) siguiendo un protocolo de diferenciación de 12 días con células H14S9 hES, sembradas a razón de 8 x 103 células/cm2. El compuesto estuvo presente en todo el protocolo desde el día inicial de la siembra. La expresión génica se presenta como relativa a la de la línea base de DFNB control. Los gráficos de barras indican la desviación media y estándar de la expresión génica en relación con la de la condición de DFNB control (n = 3 experimentos independientes). La significancia estadística se determinó mediante ANOVA de una vía con la prueba posterior de comparación múltiple de Tukey. ns = sin diferencia significativa. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001.

La Figura 3 muestra la expresión génica de los marcadores óticos PAX2, PAX8 y FOXG1 (A) y marcadores de ectodermo (PAX6, NESTlN), mesodermo (BRACHYURY, MEOX1) y endodermo (AFP, GATA6) (B) siguiendo un protocolo de diferenciación de 12 días con células H14S9 hES, sembradas a 8 x 103 células/cm2. BIO se complementó en medio FGF y se mantuvo en todo momento. La expresión génica se presenta como relativa a la de la línea base de DFNB control. Se llevó a cabo un experimento, por lo que no se puede determinar la significancia estadística.

La Figura 4 muestra la expresión génica de los marcadores óticos PAX2, PAX8y FOXG1 siguiendo un protocolo de diferenciación de 12 días con células H14S9 hES, sembradas a razón de 8 x 103 células/cm2 El inhibidor canónico de Wnt se complementó en el medio el día 4 y se mantuvo hasta el día 12. La expresión génica se presenta en relación con la de la línea base de DFNB control. Los gráficos de barras indican la desviación media y estándar de la expresión génica en relación con la de la condición de DFNB control (n = 3 experimentos independientes). La significancia estadística se determinó mediante ANOVA de una vía con la prueba posterior de comparación múltiple de Tukey. ns = sin diferencia significativa. * P <0,05, ** P <0,01, **** P <0,0001.

La Figura 5 muestra la expresión génica de marcadores asociados con la diferenciación del linaje de ectodermo (A), mesodermo (B) y endodermo (C) después de la diferenciación de 12 días con células H14S9 hES, sembradas a razón de 8 x 103 células/cm2. El inhibidor canónico de Wnt se complementó en el medio desde el día 4 y se mantuvo hasta el día 12. La expresión génica se presenta como relativa a la de la línea base de DFNB control. Los gráficos de barras indican la desviación media y estándar de la expresión génica en relación con la de la condición de DFNB control (n = 3 experimentos independientes). La significancia estadística se determinó mediante ANOVA de una vía con la prueba posterior de comparación múltiple de Tukey. ns = sin diferencia significativa. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001.

La Figura 6 muestra la expresión génica de los marcadores óticos PAX2, PAX8y FOXG1 siguiendo un protocolo de diferenciación de 12 días con células H14S9 hES, sembradas a razón de 8 x 103 células/cm2. IwR-1-endo se complementó el día 0 y se mantuvo hasta el día 4, el día 6, el día 8 o el día 12. La expresión génica se presenta como relativa a la de la línea base de DFNB control. Los gráficos de barras indican la desviación media y estándar de la expresión génica en relación con la de la condición de DFNB control (n = 3 experimentos independientes). La significancia estadística se determinó mediante ANOVA de una vía con la prueba posterior de comparación múltiple de Bonferroni. ns = sin diferencia significativa. * P <0,05, *** P <0,001, **** P <0,0001.

La Figura 7 proporciona una representación esquemática del Protocolo Modificado 1 (A). Expresión génica de los marcadores óticos PAX2, PAX8, FOXG1 y SOX2 siguiendo un protocolo de diferenciación de 12 días con células H14S9 hES, sembradas a razón de 8 x 103 células/cm2 (B). La inhibición canónica de Wnt se realiza mediante 10 pM de IWR-1-endo y la activación mediante BIO 2 pM. Los ligandos FGF 3 y FGF 10 se complementan a razón de 50 ng/ml. La expresión génica se presenta como relativa a la de la línea base de DFNB control. Los gráficos de barras indican la desviación media y estándar de la expresión génica en relación con la de la condición de DFNB control (n = 3 experimentos independientes). La significancia estadística se determinó mediante ANOVA de una vía con la prueba posterior de comparación múltiple de Bonferroni. ns = sin diferencia significativa. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, **** p <0,0001.

La Figura 8 proporciona una representación esquemática del Protocolo Modificado 2 (A). Expresión génica de los marcadores óticos PAX2, PAX8, FOXG1 y SOX2 siguiendo un protocolo de diferenciación de 12 días con células H14S9 hES, sembradas a razón de 8 x 103 células/cm2 (B). La inhibición canónica de Wnt se realiza mediante 10 pM de IWR-1-endo y la activación mediante BIO 2 pM. Los ligandos FGF 3 y FGF 10 se complementan a razón de 50 ng/ml. La expresión génica se presenta como relativa a la de la línea base de DFNB control. Los gráficos de barras indican la desviación media y estándar de la expresión génica en relación con la de la condición de DFNB control (n = 3 experimentos independientes). La significancia estadística se determinó mediante ANOVA de una vía con la prueba posterior de comparación múltiple de Bonferroni. ns = sin diferencia significativa. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, **** p <0,0001.

La Figura 9 proporciona datos para células H14S9 hES diferenciadas durante 12 días en DFNB, FGF o sometidas al Protocolo Modificado 2. Experimento representativo que se muestra a continuación. Diagramas de dispersión para el inmunomarcación con (A) PAX2/PAX8 (verde/rojo), (B) FOXG1/PAX8 (verde/rojo) y (C) SOX2/PAX8 (verde/rojo). La intensidad de fluorescencia de cada anticuerpo se muestra en cada eje. Los diagramas de dispersión se colorean de acuerdo con dos umbrales de intensidad diferentes: puntos del percentil 99 de intensidad fluorescente en el control de solo anticuerpo secundario y puntos del percentil 75 de intensidad fluorescente observados en la marcación de la condición FGF. Gris: intensidad por debajo del percentil 99. Verde: intensidad por encima del percentil 99 para el verde (PAX2, FOXG1, SOX2) pero no canal rojo (PAX8). Rojo: intensidad por encima del percentil 99 en el canal rojo pero no en el canal verde. Púrpura: las células son doblemente positivas, con una intensidad por encima del percentil 99 en ambos canales. Negro: las células son altamente doblemente positivas, la intensidad está por encima del percentil 75 de FGF en ambos canales.

La Figura 10 proporciona datos para las células H14S9 hES diferenciadas durante 12 días en DFNB, FGF o sometidas al Protocolo Modificado 2. Los gráficos de barras muestran el porcentaje de células altamente doblemente positivas (con un umbral de intensidad por encima del percentil 75) en cada condición para las combinaciones de anticuerpos PAX2hi/PAX8hi, FOXG1hi/PAX8hi y SOX2hi/PAX8hi. Los resultados se presentan como la media de tres réplicas experimentales combinadas. Las barras de error indican la desviación media y estándar. La significancia estadística se determinó mediante el uso de Chi-cuadrado con la corrección de continuidad de Yates. *** P <0,001, **** P <0,0001.

La Figura 11 muestra la tinción conjunta de células reporteras H14S9 NOP-SOX2 diferenciadas durante 12 días en condiciones DFNB, FGF o Protocolo Modificado 2. Las células se inmunomarcaron con anticuerpos primarios PAX2, PAX8 o FOXG1, y el porcentaje de células doblemente positivas (anticuerpo primario y GFP NOP-SOX2) se muestra a continuación (n = 3 experimentos independientes). Las barras de error indican la desviación media y estándar. La significancia estadística se determinó mediante el uso de Chi-cuadrado con la corrección de continuidad de Yates. **** P <0,0001.

La Figura 12 proporciona una representación esquemática del Protocolo Modificado 3 (A). Expresión génica de los marcadores óticos PAX2, PAX8, FOXG1 y SOX2 siguiendo un protocolo de diferenciación de 12 días con células H14S9 hES, sembradas a razón de 8 x 103 células/cm2 (B). La inhibición canónica de Wnt se realiza mediante 10 pM de IWR-1-endo y la activación mediante BIO 2 pM. Los ligandos de FGF 3 y FGF 10 se complementan a razón de 50 ng/ml o 25 ng/ml cuando sea apropiado. La expresión génica se presenta como relativa a la de la línea base de DFNB control. Los gráficos de barras indican la desviación media y estándar de la expresión génica en relación con la de la condición de DFNB control (n = 3 experimentos independientes). La significancia estadística se determinó mediante ANOVA de una vía con la prueba posterior de comparación múltiple de Bonferroni. ns = sin diferencia significativa. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001.

La Figura 13 muestra datos para células H14S9 hES diferenciadas durante 12 días en FGF o sometidas al Protocolo Modificado 3. Experimento representativo mostrado a continuación. Diagramas de dispersión para inmunomarcación con SOX2/PAX8 (verde/rojo). La intensidad de fluorescencia de cada anticuerpo se muestra en cada eje. Los diagramas de dispersión se colorean de acuerdo con dos umbrales de intensidad diferentes: puntos del percentil 99 de intensidad fluorescente en el control de solo anticuerpo secundario y puntos del percentil 75 de intensidad fluorescente observados en la marcación de la condición FGF. Gris: intensidad por debajo del percentil 99. Verde: intensidad por encima del percentil 99 para el canal verde (SOX2) pero no para el canal rojo (PAX8). Rojo: intensidad por encima del percentil 99 en el canal rojo pero no en el canal verde. Púrpura: las células son doblemente positivas, con una intensidad por encima del percentil 99 en ambos canales. Negro: las células son altamente doblemente positivas, la intensidad está por encima del percentil 75 de FGF en ambos canales.

La Figura 14 muestra los datos de las células H14S9 hES diferenciadas durante 12 días en FGF o sometidas al Protocolo Modificado 3. Los gráficos de barras muestran el porcentaje de células altamente doblemente positivas (con un umbral de intensidad por encima del percentil 75) en cada condición para la combinación de anticuerpos SOX2hi /PAX8hi. Los resultados se presentan como la media de tres réplicas experimentales combinadas. Las barras de error indican la desviación media y estándar. La significancia estadística se determinó mediante el uso de Chi-cuadrado con la corrección de continuidad de Yates. **** P <0,0001.

La Figura 15 muestra la tinción conjunta de células reporteras H14S9 NOP-SOX2 diferenciadas durante 12 días en condiciones de FGF o Protocolo Modificado 3. Las células se inmunomarcaron con anticuerpos primarios PAX2, PAX8 o FOXG1, y el porcentaje de células doblemente positivas (anticuerpo primario y GFP NOP-SOX2) se muestra a continuación (n = 3 experimentos independientes). Las barras de error indican la desviación media y estándar. La significancia estadística se determinó mediante el uso de Chi-cuadrado con la corrección de continuidad de Yates. **** P <0,0001.

La Figura 16 muestra el potencial de diferenciación en neuronas sensoriales de neuroprogenitores óticos generados por el protocolo de FGF estándar o el Protocolo Modificado 3. La Figura 16A muestra la expresión génica de los marcadores neuronales sensoriales POU4F1, SYPy SLC17A7 siguiendo un protocolo de neuralización de fase 2 de 12 días usando ONP H14S9. La expresión génica se presenta como relativa a la de los ONP de DFNB basales. Los gráficos de barras indican la desviación media y estándar de la expresión génica de n = 3 experimentos independientes. La significancia estadística se determinó mediante ANOVA de una vía con la prueba posterior de comparación múltiple de Bonferroni. ns = sin diferencia significativa. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001. La Figura 16B muestra la inmunomarcación de los ONP (generados a partir del protocolo de FGF o Wnt de fase 1) siguiendo un protocolo de neuralización de fase 2 de 12 días. Las células se marcaron con una combinación de NKAa3 (verde) y POU4F1 (rojo), o p-tubulina III (verde) y NF200 (rojo). Núcleos contrateñidos con DAPI. Campo de visión representativo único. La barra de escala es 200 pM. La Figura 16C muestra la cuantificación de la inmunomarcación de marcadores neuronales. Los gráficos de barras muestran el porcentaje medio de células doblemente positivas marcadas con las combinaciones de anticuerpos NKAa3/POU4F1 y p-tubulina III/NF200 de n = 3 experimentos independientes. Las barras de error indican la desviación media y estándar. La significancia estadística se determinó utilizando Chi-Cuadrado con la corrección de continuidad de Yates. ns = sin diferencia significativa. **** P <0,0001.

Descripción detallada

La invención se basa en el sorprendente hallazgo de que la manipulación secuencial de la señalización de Wnt (inhibición inicial, seguida de activación) contra un contexto de señalización de FGF atenuada durante el cultivo de una célula progenitora da como resultado una mejora significativa en el rendimiento de células progenitoras óticas (de aproximadamente 20% a cerca de 60%). Por consiguiente, la invención proporciona un método mejorado en el que se induce la diferenciación de células progenitoras de células madre pluripotentes (por ejemplo, hESC) utilizando señalización modificada de la placoda ótica.

Ventajosamente, el método da como resultado dos poblaciones de células progenitoras óticas (conocidas en el presente documento como "progenitores epiteliales óticos" (OEP) y "progenitores neurales óticos" (ONP)) que pueden diferenciarse aún más in vitro en células similares a células ciliadas y neuronas auditivas (también llamadas en el presente documento neuronas sensoriales) que muestran propiedades electrofisiológicas esperadas respectivamente.

Por lo tanto, el método facilita la generación de células progenitoras óticas que pueden usarse en un entorno clínico, por ejemplo, en el tratamiento de la pérdida auditiva, sordera u otro trastorno auditivo asociado con la pérdida de la función del oído interno.

Células

El método comprende cultivar una célula progenitora en condiciones específicas que dan como resultado la generación de célula o células progenitoras óticas.

Como se usa en este documento, los términos "célula progenitora" y "célula madre" se usan indistintamente para referirse a una célula biológica que es capaz de autorrenovarse y diferenciarse en una célula más madura. El término "célula progenitora" abarca, pero no se limita a, células madre pluripotentes tales como células madre embrionarias (por ejemplo, hESC) o células madre pluripotentes inducidas.

El método diferencia la célula o células progenitoras en una o más células progenitoras óticas. Como se usa en este documento, una "célula progenitora ótica" se refiere a una célula inmadura que tiene la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en una célula más madura, pero también está comprometida con un cierto linaje celular (por ejemplo, las células progenitoras óticas están comprometidas con el linaje ótico). El término "célula progenitora ótica" abarca, pero no se limita a, células progenitoras epiteliales óticas y/o células progenitoras neurales óticas.

El método puede generar una población mixta de células, que comprende una o más células progenitoras óticas y una o más de otras células (progenitoras no óticas). La una o más células progenitoras óticas también pueden comprender una población mixta de, por ejemplo, una o más células progenitoras epiteliales óticas y/o una o más células progenitoras neurales óticas.

Ventajosamente, el método da como resultado una población mixta de células progenitoras óticas que comprenden dos poblaciones de células progenitoras óticas (conocidas en este documento como "progenitores epiteliales óticos" (OEP) y "progenitores neurales óticos" (ONP)) que pueden además diferenciarse in vitro en células similares a células ciliadas y neuronas auditivas (o neuronas sensoriales) que muestran propiedades electrofisiológicas esperadas respectivamente.

El método utiliza la manipulación secuencial de la señalización de Wnt (inhibición inicial, seguida de activación) contra un contexto de señalización de FGF atenuada durante el cultivo de una célula progenitora para mejorar significativamente el rendimiento de células progenitoras óticas en comparación con los métodos conocidos en la técnica (de aproximadamente 20 % a cerca del 60% del número total de células).

Como se usa en el presente documento, "rendimiento de células progenitoras óticas" se refiere al número de células progenitoras óticas generadas por el método. El rendimiento puede calcularse mediante el número de células progenitoras óticas como porcentaje del número total de células en el cultivo (o muestra representativa de las mismas). El rendimiento del progenitor ótico puede ser de al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, etc. del número total de células.

El método puede estar sesgado hacia la generación de un tipo particular de célula progenitora ótica (por ejemplo, una célula progenitora epitelial ótica o una célula progenitora neural ótica). A modo de ejemplo, el número total de células progenitoras epiteliales óticas puede ser mayor que el número total de células progenitoras neurales óticas (o viceversa). Alternativamente, el número total de células progenitoras epiteliales óticas puede ser el mismo (o aproximadamente el mismo) que el número total de células progenitoras neurales óticas.

Cultivo

La célula o células progenitoras se cultivan en condiciones específicas para generar la célula o células progenitoras óticas.

Como se usa en este documento, "cultivo" y "cultivo celular" se usan indistintamente y se refieren al proceso mediante el cual las células, preferiblemente células progenitoras, se cultivan (por ejemplo, se dividen) en condiciones controladas, preferiblemente in vitro o ex vivo. Preferiblemente, las células se cultivan en medio de cultivo.

Como se usa en este documento, los términos "medio", "medio de cultivo", "medios de cultivo" y "medios" se usan indistintamente. Preferiblemente, las células se cultivan en un medio de cultivo definido que contiene los elementos esenciales mínimos necesarios para mantener el crecimiento de las células progenitoras (de mamífero), en el que los componentes del medio son tanto conocidos como controlados. Dichos medios esenciales mínimos definidos para el cultivo de células progenitoras son conocidos en la técnica.

Como se usa en este documento, "medio de diferenciación de FGF estándar" y "medio FGF estándar" se usan indistintamente para referirse al medio FGF usado en Chen et al., 2012 (es decir, medio que comprende una mezcla 1:1 de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, glucosa alta) y F12, complementado con 1 x N2 y 1 x B27, FGF3 (50 ng ml-1) y FGF10 (50 ng ml-1).

Como se usa en este documento, "protocolo de diferenciación de FGF estándar", "protocolo de FGF estándar" y "condición de FGF estándar" se usan indistintamente para referirse al protocolo de diferenciación de FGF usado en Chen et al., 2012, en el que las células se siembran en placas sobre placas recubiertas con laminina en una mezcla 1:1 de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, alto contenido de glucosa) y F12, complementado con 1 x N2 y 1 x B27, FGF3 (50 ng ml-1) y FGF10 (50 ng ml-1) .

Los medios de cultivo químicamente definidos para el cultivo de células (de mamífero) se han desarrollado y publicado extensamente durante las últimas décadas. Todos los componentes de los medios definidos están bien caracterizados. Los medios definidos normalmente consisten en aproximadamente cincuenta entidades químicas a concentraciones conocidas en agua. Los componentes químicos de los medios se dividen en cuatro amplias categorías: aminoácidos, vitaminas, sales inorgánicas, oligoelementos.

Los oligoelementos consisten en una variedad de sales inorgánicas incluidas en niveles micromolares o inferiores. Los cuatro oligoelementos más comúnmente incluidos presentes en casi todos los medios definidos son hierro, zinc, selenio y cobre. El hierro (sales ferrosas o férricas) y el zinc se añade típicamente en concentraciones micromolares, mientras que los demás suelen estar en concentraciones nanomolares. Los numerosos oligoelementos menos comunes se agregan generalmente en concentraciones nanomolares.

Los medios de cultivo definidos que comprenden elementos esenciales mínimos necesarios para mantener el crecimiento de células de mamíferos son bien conocidos en la técnica e incluyen, a modo de ejemplo, solo Medio Esencial Mínimo Eagle, Medio Esencial Mínimo Dulbecco, ADC-I, LPM (Suero Bovino sin albúmina), FIO (HAM), F12 (HAM), DCCMI, DCCM2, RPMI 1640, medio BGJ (con y sin modificación de Fitton-Jackson), medio basal Eagle (BME, con la adición de la base de sal de Earle), Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM- sin suero), Yamane, IMEM-20, Medio Eagle Modificado de Glasgow (GMEM), Medio Leibovitz L-15, Medio 5a de McCoy, Medio M199 (M199E-con base en una sal de Earle), Medio M 199 (M 199H con base en una sal de Hank), Medio Mínimo Esencial Eagle (MEM-E-con base en una sal de Earle), Medio Esencial Mínimo de Eagle (MEM-H con base en una sal de Hank) y Medio Esencial Mínimo de Eagle (MEM-NAA con aminoácidos no esenciales), entre muchos otros, incluido el medio 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, E de Williams, G de Williams, Neuman & Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411 y MDBC 153.

Los medios de cultivo definidos pueden complementarse con componentes complementarios adicionales al comienzo del proceso de cultivo o en un momento o momentos posteriores al comienzo del proceso de cultivo. En determinadas realizaciones, se pueden añadir componentes complementarios al cultivo celular inicial. En determinadas formas de realización, se pueden añadir componentes complementarios después del comienzo del cultivo celular.

Adicional o alternativamente, los medios de cultivo definidos también pueden complementarse con una o más fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas, vitaminas y/u oligoelementos, o cualquier mezcla y/o combinación de los mismos.

Adicional o alternativamente, los medios de cultivo definidos también pueden complementarse con uno o más factores de crecimiento.

Como se usa en este documento, los términos "factor de crecimiento" o "factores de crecimiento" se refieren a cualquier sustancia capaz de mantener o estimular el crecimiento celular, la proliferación y/o la diferenciación celular, incluyendo citocinas, esteroides y hormonas. Los ejemplos de factores de crecimiento incluyen, pero no se limitan a, IGF, tales como IGF-I e IGF-II, VEGF, PDGF, EGF, factor de crecimiento de fibroblastos, bFGF, osteopontina, trombospondina-1, tenascina-C, PAI-1, plasminógeno, fibrinógeno, fibrina, transferrina, adenina, adrenomedulina, angiopoyetina, factor de motilidad autocrina, proteínas morfogenéticas óseas, factor neurotrófico derivado del cerebro, factor de crecimiento epidérmico, eritropoyetina, factor de crecimiento de fibroblastos, factor neurotrófico derivado de la línea celular glial, factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, factor de diferenciación del crecimiento-9, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento derivado del hepatoma, hidrocortisona, insulina, factor de crecimiento similar a la insulina, L-glutamina, factor estimulante de la migración, miostatina, factor de crecimiento nervioso y otras neurotrofinas, factor de crecimiento derivado de plaquetas, transferrina, trombopoyetina, factor de crecimiento transformante alfa, factor de crecimiento transformante beta, tri-yodotrionina, factor de necrosis tumoral alfa, factor de crecimiento endotelial vascular, vía de señalización de Wnt, factor de crecimiento placentario, somatotropina fetal bovina, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 o cualquier equivalente biológico, derivado o combinación de los mismos.

Adicional o alternativamente, los medios de cultivo definidos también pueden complementarse con uno o más antibióticos. Como se usa en este documento, el término "antibiótico" o "antibióticos" se refiere a cualquier sustancia natural o sintética que inhibe el crecimiento de microorganismos o los destruye. Por ejemplo, el antibiótico puede inhibir la síntesis de la pared celular, la síntesis de proteínas, la síntesis de ácidos nucleicos o alterar la función de la membrana celular. Los ejemplos de antibióticos incluyen amoxicilina, ampicilina, penicilina, ácido clavulánico, aztreonam, imipenem, estreptomicina, gentamicina, vancomicina, clindamicina, efalotina, eritromicina, polimixina, bacitracina, anfotericina, nistatina, rifampicina, teraciclina, coxiciclina, cloranfenicol y zitromicina, o cualquier mezcla o combinación de los mismos. Preferiblemente, el medio se complementa con penicilina y/o estreptomicina. Preferiblemente, el medio de cultivo suplementado con antibiótico comprende de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1,5% (v/v) de antibiótico, más preferiblemente aproximadamente 1% (v/v) de antibiótico.

La célula o células progenitoras se pueden cultivar en condiciones libres de suero. Como se usa en este documento, "condiciones libres de suero" son condiciones en las que se omite el suero (por ejemplo, del medio de cultivo) de manera que, por ejemplo, el medio de cultivo no comprende (es decir, está esencialmente exento o no está complementado con) suero. Opcionalmente, las condiciones de la etapa (i) y/o de la etapa (ii) están libres de suero.

Sólo a modo de ejemplo (y no con fines de limitación), el método de la invención se puede realizar utilizando un medio base como DFNB al que los complementos apropiados (por ejemplo, inhibidores, agonistas y/o FGF) se agregan. En el contexto de DFNB, "D" se refiere a DMEM, "F" se refiere a F12, "N" se refiere a N2 y "B" se refiere a B27, todos los cuales están disponibles comercialmente y son bien conocidos. Un medio base alternativo que también se puede utilizar en DFB (es decir, DFNB sin N2). Se observa que puede usarse cualquier medio base apropiado, varios de los cuales serán fácilmente identificables por un experto en la técnica.

Las células progenitoras se pueden cultivar como una monocapa. Como se usa en el presente documento, una "monocapa" se refiere a una capa de células en la que ninguna célula crece una encima de otra, sino que todas crecen una al lado de la otra y a menudo se tocan entre sí en la misma superficie de crecimiento.

En la etapa (i) del método, la célula progenitora se cultiva en condiciones suficientes para inhibir la señalización de Wnt y activar la señalización de FGF durante un primer período de tiempo suficiente para inducir la sobrerregulación de uno o más marcadores de células óticas.

Como se usa en el presente documento, "condiciones suficientes para inhibir la señalización de Wnt" se refiere a cualquier condición que reduzca parcial o completamente la señalización de Wnt en la célula progenitora de la etapa (i) en comparación con el nivel de señalización de Wnt en una célula progenitora equivalente que no es sometida a tales condiciones ("control"). La inhibición (es decir, la reducción de la señalización de Wnt) puede ser al menos del 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% en comparación con el control . Opcionalmente, las condiciones son tales que no hay señalización de Wnt medible en la célula progenitora de la etapa (i) (por ejemplo, señalización de Wnt completamente inhibida, por ejemplo, hay una reducción del 100% en comparación con el control). Los expertos en la técnica conocen bien métodos para medir la señalización de Wnt.

Las condiciones que son suficientes para inhibir la señalización de Wnt incluyen cultivar la célula progenitora en un medio de cultivo que comprende uno o más inhibidores de Wnt (por ejemplo, IWR-1-endo). Una persona experta en la técnica podrá identificar fácilmente inhibidores de Wnt adecuados y, como tal, puede usarse cualquier inhibidor de Wnt. Un experto en la técnica también podrá identificar fácilmente concentraciones adecuadas de inhibidor de Wnt.

A modo de ejemplo, el cultivo de la etapa (i) puede complementarse con uno o más inhibidores de Wnt, preferiblemente de aproximadamente 1 a 50 pM de IWR-1-endo, lo más preferiblemente de aproximadamente 10 pM de IWR-1-endo.

Preferiblemente, la inhibición de la señalización de Wnt ocurre antes (es decir, antes de) cualquier diferenciación de células progenitoras óticas. A modo de ejemplo, la inhibición de Wnt puede ocurrir el día 0, 1, 2, 3 o 4 de la etapa (i).

Como se usa en este documento, "condiciones suficientes para activar la señalización de FGF" se refiere a cualquier condición que induzca (por ejemplo, aumente y/o active) la señalización de FGF en la célula progenitora de la etapa (i) en comparación con el nivel de señalización de FGF en una célula progenitora equivalente que no está sujeta a tales condiciones ("control"). La inducción (es decir, aumento y/o activación en la señalización de FGF) puede ser de al menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de aumento en la señalización de FGF en comparación con el control. Los expertos en la técnica conocen bien métodos para medir la señalización de FGF.

Las condiciones que son suficientes para activar la señalización de FGF incluyen cultivar la célula progenitora en un medio de cultivo que comprende uno o más FGF. Los FGF adecuados son fácilmente identificables por un experto en la técnica e incluyen (pero no se limitan a) FGF3 y FGF10. Otros FGF adecuados pueden incluir FGF2 (también conocido como bFGF). Un experto en la técnica también podrá identificar fácilmente las concentraciones de FGF adecuadas.

A modo de ejemplo, el cultivo de la etapa (i) puede complementarse con uno o más FGF, tal como FGF 3 y/o FGF10. Preferiblemente, el cultivo se complementa con FGF3 a una concentración de aproximadamente 1 a 100 ng/ml, lo más preferiblemente de aproximadamente 50 ng/ml de FGF3. Además, o alternativamente, el cultivo de la etapa (i) puede complementarse con FGF 10 a una concentración de aproximadamente 1 a 100 ng/ml, lo más preferiblemente de aproximadamente 50 ng/ml de FGF 10.

Las condiciones de la etapa (i) deben ser suficientes para inhibir la señalización de Wnt y activar la señalización de FGF.

El medio de cultivo (complementado) de la etapa (i) puede renovarse (es decir, eliminarse y reemplazarse con medio de cultivo fresco que comprende los mismos complementos) durante el primer período de tiempo. Adicional o alternativamente, el medio de cultivo (complementado) de la etapa (ii) se puede renovar (es decir, eliminar y reemplazar con medio de cultivo fresco que comprende los mismos complementos) durante el segundo período de tiempo.

La célula progenitora se cultiva en la etapa (i) en las condiciones especificadas durante un primer período de tiempo, en el que el período de tiempo es suficiente para inducir la sobrerregulación de uno o más marcadores de células óticas.

Como se usa en el presente documento, un "período de tiempo suficiente para inducir la sobrerregulación de uno o más marcadores de células óticas" se refiere a cualquier período de tiempo que permite la sobrerregulación de uno o más marcadores de células óticas. Preferiblemente, el primer período de tiempo es de al menos aproximadamente 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 120 horas, 144 horas, 168 horas, 192 horas, 216 horas, 240 horas, 264 horas o 288 horas. Preferiblemente, el primer período de tiempo es de al menos 144 horas. Preferiblemente, el primer período de tiempo es de 144 a 216 horas.

Como se usa en este documento, "sobrerregulación" se refiere a un aumento en uno o más marcadores de células óticas en la célula progenitora que se ha cultivado en las condiciones de la etapa (i) durante un primer período de tiempo en comparación con el uno o más marcadores de células óticas de una célula progenitora equivalente que no se ha cultivado en las condiciones de la etapa (i) durante un primer período de tiempo ("control"). La sobrerregulación de uno o más marcadores de células óticas puede determinarse mediante cualquier medio adecuado conocido en la técnica. Como ejemplo, la sobrerregulación se puede determinar midiendo el nivel de expresión génica del marcador de células óticas usando métodos conocidos tales como medir los niveles de ARNm y/o proteínas del marcador de células óticas, o midiendo la actividad del marcador de células óticas.

Un "aumento" en uno o más marcadores de células óticas puede estar representado por al menos 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60 %, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más aumento en comparación con el control. En consecuencia, un aumento en el nivel de ARNm y/o proteína puede estar representado por al menos 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% , 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más de aumento en el nivel de ARNm y/o proteína en comparación con el control.

Puede usarse cualquier método de detección de ARNm conocido para detectar el nivel de ARNm del marcador de células óticas en una muestra.

Por ejemplo, el nivel de ARNm correspondiente a la molécula de ácido nucleico marcadora de células óticas en una muestra puede determinarse mediante formatos tanto in situ como in vitro. El ARNm del marcador de células óticas puede detectarse usando análisis de transferencia Southern o Northern, reacción en cadena de la polimerasa o matrices de sondas. A modo de ejemplo, una muestra puede ponerse en contacto con una molécula de ácido nucleico (es decir, una sonda, tal como una sonda marcada) que puede hibridar con el ARNm codificado por la molécula de ácido nucleico marcadora de células óticas. La sonda puede corresponder, por ejemplo, a una molécula de ácido nucleico marcadora de células óticas de longitud completa, o una porción de la misma, que hibrida en condiciones rigurosas con una molécula de ácido nucleico marcadora de células óticas.

Las condiciones rigurosas son conocidas por los expertos en la técnica y se pueden encontrar en las referencias disponibles (por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 1989, 6.3.1-6.3.6). Los métodos acuosos y no acuosos se describen en esa referencia y pueden usarse cualquiera. Un ejemplo preferido de condiciones de hibridación rigurosas es la hibridación en cloruro sódico/citrato sódico (SSC) 6X a aproximadamente 45 °C, seguida de uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% (p/v) a 50 °C. Otro ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas son la hibridación en 6 x SSC a aproximadamente 45 °C, seguida de uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% (p/v) a 55 °C. Un ejemplo adicional de condiciones de hibridación rigurosas es la hibridación en 6X SSC a aproximadamente 45 °C, seguida de uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% (p/v) a 60 °C. Preferiblemente, las condiciones de hibridación rigurosas son la hibridación en 6X SSC a aproximadamente 45 °C, seguida de uno o más lavados en 0,2XSSC, SDS al 0,1% (p/v) a 65 °C. Las condiciones de rigurosidad particularmente preferidas (y las condiciones que deben usarse si el médico no está seguro de qué condiciones deben aplicarse para determinar si una molécula está dentro de una limitación de hibridación de la invención) son fosfato de sodio 0,5 molar, SDS al 7% (p/v) a 65 °C, seguido de uno o más lavados a 0,2X SSC, SDS al 1% (p/v) a 65 °C.

El nivel de un ARNm marcador de células óticas en una muestra puede evaluarse con amplificación de ácido nucleico, por ejemplo mediante rtPCR, reacción en cadena de ligasa, replicación de secuencia autosostenida, amplificación transcripcional o cualquier otro método de amplificación de ácido nucleico, seguido de la detección de las moléculas amplificadas usando técnicas conocidas en el arte.

Puede usarse cualquier método conocido de detección de proteínas para detectar el nivel de polipéptido (proteína) marcador de células óticas en una muestra.

Generalmente, los métodos de detección de proteínas comprenden poner en contacto un agente que se une selectivamente a un polipéptido marcador de células óticas, por ejemplo, un anticuerpo marcador anticélulas óticas, con una muestra para determinar el nivel de polipéptido marcador de células óticas en la muestra. Preferiblemente, el agente o anticuerpo está marcado, por ejemplo, con un marcador detectable. Los anticuerpos adecuados pueden ser policlonales o monoclonales. Puede usarse un fragmento de anticuerpo tal como un Fab o F(ab')2.

Como se usa en este documento, el término "marcado" se refiere al marcado directo de la sonda o anticuerpo mediante el acoplamiento (es decir, uniendo físicamente) una sustancia detectable a la sonda o anticuerpo, así como al marcado indirecto de la sonda o anticuerpo por reactividad con una sustancia detectable.

El nivel de polipéptido marcador de células óticas en una muestra se puede determinar mediante técnicas conocidas en el arte, tales como ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), inmunoprecipitación, inmunofluorescencia, inmunoensayo enzimático (EIA), radioinmunoensayo (RIA) y análisis de transferencia Western.

El nivel de polipéptido marcador de células óticas en una muestra también se puede determinar determinando el nivel de actividad del polipéptido marcador de células óticas en una muestra.

El nivel o la actividad del marcador de células óticas en la muestra se puede comparar con el nivel o la actividad del marcador de células óticas en una muestra de control o con un nivel de referencia predeterminado para el marcador de células óticas.

Una muestra de control puede ponerse en contacto con un compuesto o agente capaz de detectar una molécula de ácido nucleico marcadora de células óticas, tal como ARNm o ADN genómico, y comparar el nivel de la molécula de ácido nucleico marcadora de células óticas en la muestra de control con el nivel de molécula de ácido nucleico marcadora de células óticas en la muestra generada por el método de la invención ("muestra de prueba").

Además o alternativamente, la muestra de control puede ponerse en contacto con un compuesto o agente capaz de detectar un polipéptido marcador de células óticas, y el nivel de proteína marcadora de células óticas en la muestra de control puede compararse con la presencia de proteína marcadora de células óticas en la muestra de prueba.

Alternativamente, el nivel de referencia puede estar compuesto por un nivel de expresión de marcador de células óticas de una base de datos de referencia, que puede usarse para generar un valor de corte predeterminado.

El nivel de expresión medido del marcador de células óticas puede normalizarse. Los niveles de expresión se normalizan corrigiendo el nivel de expresión absoluto del marcador de célula ótica en una muestra al comparar su expresión con la expresión de un ácido nucleico de referencia que no es un marcador de célula ótica, por ejemplo, un ARNm, tal como un ARNm que se expresa constitutivamente . Esta normalización permite la comparación del nivel de expresión en una muestra con otra muestra, o entre muestras de diferentes fuentes. Esta expresión normalizada se puede comparar opcionalmente con un nivel de referencia o control. Por ejemplo, cuando se mide el nivel de marcador de células óticas en una muestra, el nivel puede expresarse como una concentración absoluta o, alternativamente, puede normalizarse frente a un marcador celular conocido expresado de forma ubicua, tal como Actina, RPLO o Gapdh.

Como se usa en el presente documento, "uno o más marcadores de células óticas" se refiere a al menos uno, y opcionalmente a dos o más (por ejemplo, tres, cuatro, cinco, etc.) marcadores de células óticas. Los ejemplos de marcadores de células óticas que pueden sobrerregularse en el contexto de la invención incluyen, pero no se limitan a, PAX2, PAX8, FOXG1 y/o SOX2. También pueden usarse otros marcadores de células óticas que son conocidos por los expertos. Otros ejemplos de marcadores de células óticas incluyen nestina, SIX1 y GATA3. Se puede usar cualquier combinación adecuada de marcadores de células óticas (por ejemplo, PAX2 con al menos uno, dos o los tres de PAX8, FOXG1 y SOX2; PAX8 con al menos uno, dos o los tres de PAX2, FOXG1 y SOX2; FOXG1 con al menos uno, dos o los tres de PAX2, PAX8 y SOX2; SOX2 con al menos uno, dos o los tres de PAX2, PAX8 y FOXG1).

El método comprende además sustituir (es decir, eliminar y reemplazar) las condiciones de cultivo (por ejemplo, medio de cultivo) de la etapa (i) por las condiciones de cultivo (por ejemplo, medio de cultivo) de la etapa (ii) y cultivar por un segundo período de tiempo.

La etapa (ii) del método comprende el cultivo de la célula progenitora de la etapa (i) en condiciones suficientes para activar la señalización de Wnt y reducir la señalización de FGF en relación con la etapa (i) durante un segundo período de tiempo, en el que el segundo período de tiempo es suficiente para mantener la expresión sobrerregulada de dichos uno o más marcadores de células óticas.

Como se usa en este documento, un "período de tiempo suficiente para mantener la expresión sobrerregulada de uno o más marcadores de células óticas" se refiere a cualquier período de tiempo en el que la expresión sobrerregulada de uno o más marcadores de células óticas observados en la etapa (i) es sostenida (es decir, el nivel de expresión del marcador o marcadores de células óticas sobrerregulado en la etapa (i) permanece aumentado en comparación con el nivel de expresión del mismo marcador o marcadores de células óticas en una célula progenitora equivalente que no se ha cultivado bajo las condiciones de la etapa (i) durante un primer período de tiempo ("control")). "Aumento" y "sobrerregulación" en el contexto de la expresión de marcadores de células óticas se definieron anteriormente y se aplican igualmente en este documento.

Se observa que para que la "expresión sobrerregulada" de uno o más marcadores de células óticas se mantenga en la etapa (ii), no es necesario que el nivel de expresión del marcador de células óticas en la etapa (ii) esté al mismo nivel como en la etapa (i) (o superior), solo necesita mantenerse a un nivel que se incrementa (es decir, sobrerregulado) en comparación con el nivel de expresión de los mismos marcador o marcadores de células óticas en una célula progenitora equivalente que no se ha cultivado en las condiciones de la etapa (i) durante un primer período de tiempo ("control").

Preferiblemente, el segundo período de tiempo es de al menos aproximadamente 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 120 horas, 144 horas, 168 horas o 192 horas. Preferiblemente, el segundo período de tiempo es de al menos 96 horas.

Como se usa en este documento, "condiciones suficientes para activar la señalización de Wnt" se refiere a cualquier condición que induzca (por ejemplo, aumente y/o active) la señalización de Wnt en la célula progenitora de la etapa (ii) en comparación con el nivel de señalización de Wnt en una célula progenitora equivalente que no está sujeta a tales condiciones ("control"). La inducción (es decir, aumento y/o activación en la señalización de Wnt) puede ser de al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de aumento en la señalización de Wnt en comparación con el control. Los expertos en la técnica conocen bien métodos para medir la señalización de Wnt.

Las condiciones que son suficientes para activar la señalización de Wnt incluyen cultivar la célula progenitora en un medio de cultivo que comprende uno o más activadores de Wnt (también denominados en el presente documento agonistas de Wnt). Los agonistas de Wnt adecuados son fácilmente identificables por un experto en la técnica e incluyen (pero no se limitan a) BIO (6-bromoindirrubin-3'-oxima, Tocris). Un experto en la materia también podrá identificar fácilmente concentraciones de agonistas de Wnt adecuadas.

A modo de ejemplo, el cultivo de la etapa (ii) puede complementarse con uno o más agonistas de Wnt, tales como BIO (6-bromoindirrubin-3'-oxima, Tocris). Preferiblemente, el cultivo se complementa con BIO (6-bromoindirrubin-3'-oxima, Tocris) a una concentración de aproximadamente 1 a 10 jM , lo más preferiblemente de aproximadamente 2 |jM.

Como se usa en este documento, "condiciones suficientes para reducir la señalización de FGF en relación con la etapa (i)" se refiere a cualquier condición que reduzca parcial o completamente la señalización de FGF en la célula progenitora de la etapa (ii) en comparación con el nivel de señalización de FGF observado en el célula progenitora equivalente de la etapa (i). La reducción en la señalización de FGF puede ser de al menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% en comparación con la señalización de FGF observada en la etapa (i). Preferiblemente, la señalización de FGF de la célula progenitora en la etapa (ii) se reduce con respecto a la etapa (i) pero no se elimina por completo (es decir, la señalización de FGF en la etapa (ii) no se inhibe completamente, por ejemplo, todavía es medible). Los expertos en la técnica conocen bien métodos para medir la señalización de FGF.

Las condiciones que son suficientes para reducir la señalización de FGF con respecto a la etapa (i) incluyen cultivar la célula progenitora en un medio de cultivo que comprende menos FGF que el utilizado en la etapa (i). Los FGF adecuados son fácilmente identificables por un experto en la técnica e incluyen (pero no se limitan a) FGF3 y FGF10. Un experto en la técnica también podrá identificar fácilmente las concentraciones de FGF adecuadas.

A modo de ejemplo, el cultivo de la etapa (ii) puede complementarse con uno o más FGF, tal como FGF 3 y/o FGF10, en el que la concentración de uno o más FGF utilizados es menor o igual a 90 %, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 2% o 1% del utilizado en la etapa (i). Preferiblemente, el cultivo de la etapa (ii) se complementa con FGF3 a una concentración de aproximadamente 5-30 ng/ml, lo más preferiblemente de aproximadamente 25 ng/ml de FGF3. Además, o alternativamente, el cultivo de la etapa (ii) puede complementarse con FGF 10 a una concentración de aproximadamente 5-30 ng/ml, lo más preferiblemente de aproximadamente 25 ng/ml de FGF 10.

El método puede comprender adicionalmente una etapa (iii) en la que las células progenitoras óticas (por ejemplo, progenitoras epiteliales óticas) de la etapa (ii) se diferencian (además) en células similares a células ciliadas. Los expertos en la técnica conocen métodos adecuados para diferenciar dichas células progenitoras óticas en células similares a células ciliadas (véase, por ejemplo, Chen et al., 2012). A modo de ejemplo, las colonias progenitoras deseadas (por ejemplo, progenitores epiteliales óticos) de la etapa (ii) pueden purificarse usando disociación secuencial para producir cultivos moderadamente homogéneos del tipo de colonia celular deseada, seguido de expansión de las células, por ejemplo, en medios completos de células madre óticas (OSCFM) que comprenden una mezcla 1:1 de DMEM con alto contenido de glucosa (4,5 g/l de D-glucosa) más complementos de F12, N2 y B27, 20 ng/ml de bFGF humano recombinante, 50 ng/ml de IGF-1 y EGF humano recombinante y 20 ng/ml humano recombinante. Las condiciones de cultivo de "células ciliadas" se pueden utilizar para producir células similares a células ciliadas diferenciadas, por ejemplo, cultivando en una mezcla 1:1 de DMEM con alto contenido de glucosa (4,5 g/l de D-glucosa) más F12, N2 y B27, complementado con ácido todo trans retinoico 10-6 M (Sigma) y 20 ng/ml de EGF.

Como se usa en este documento, "célula similar a una célula ciliada" se refiere a una célula que expresa simultáneamente ATOH1 y BRN3C, o BRN3C y MYO7A.

Alternativa o adicionalmente, el método puede comprender adicionalmente una etapa (iii) en la que las células progenitoras óticas (por ejemplo, progenitoras neurales óticas) de la etapa (ii) se diferencian (además) en neuronas auditivas o sensoriales. Los expertos en la técnica conocen métodos adecuados para diferenciar tales células progenitoras óticas en neuronas auditivas o sensoriales (véase, por ejemplo, Chen et al., 2012). A modo de ejemplo, las colonias progenitoras deseadas (por ejemplo, progenitores neurales óticos) de la etapa (ii) se pueden purificar usando disociación secuencial para producir cultivos moderadamente homogéneos del tipo de colonia celular deseada, seguido de expansión de las células, por ejemplo en medios completos de células madre óticas (OSCFM) como se describió anteriormente. Las condiciones de cultivo de "células neurales" se pueden utilizar para producir neuronas auditivas o sensoriales diferenciadas, por ejemplo, la diferenciación neuronal se puede activar utilizando un "protocolo de neuralización estándar" disociando las células con tripsina y sembrándolas en placas a una densidad de 3-4.000 células/cm2 A continuación, las células se cultivan en DMEM con alto contenido de glucosa más solución nutritiva F12, N2 y B27, complementada con bFGF humano recombinante (20 ng/ml) más Shh-C24ll (500 ng/ml) durante tres días. Al tercer día, el medio se complementa con 10 ng ml-1 de BDNF y NT3 y se elimina Shh-C24ll al quinto día.

Como se usa en este documento, "neurona auditiva o sensorial" se refiere a una célula que expresa simultáneamente BRN3A y (3-tubulina III, o p-tubulina III y NF200.

Uso como medicamento

Las células progenitoras óticas producidas por los métodos descritos en este documento pueden ser útiles como medicamento (en diversos entornos terapéuticos). A modo de ejemplo, tales células progenitoras óticas pueden ser útiles en el tratamiento de una pérdida auditiva, sordera u otro trastorno auditivo asociado con la pérdida de la función del oído interno.

Como se usa en este documento, la frase "pérdida auditiva" se refiere a cualquier sensibilidad disminuida a los sonidos que normalmente escucha un sujeto no afectado. La gravedad de una pérdida auditiva se clasifica de acuerdo con el aumento de volumen por encima del nivel habitual necesario antes de que el oyente pueda detectarlo. El término "pérdida de audición" se usa en este documento para referirse a todos los grados (severidades) de pérdida de audición (desde un nivel menor de pérdida de audición, por ejemplo, menos del 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%; un nivel moderado de pérdida auditiva, por ejemplo, menos del 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%; o pérdida total de la audición, por ejemplo, 100%).

Como se usa en este documento, "sordera" se define como un grado de deterioro tal que una persona es incapaz de comprender el habla incluso en presencia de amplificación. En la sordera profunda, es posible que no se detecten incluso los sonidos más fuertes producidos por un audiómetro (un instrumento que se utiliza para medir la audición mediante la producción de tonos puros a través de un rango de frecuencias). En la sordera total, no se escucha ningún sonido, independientemente de la amplificación o el método de producción. El término "sordera" se usa en el presente documento para referirse a todos los grados de sordera (incluyendo sordera parcial y total/profunda).

Como se usa en este documento, "otro trastorno auditivo asociado con la pérdida de la función del oído interno" incluye enfermedades y trastornos que afectan la función vestibular.

Las células progenitoras óticas producidas mediante los métodos de la invención pueden trasplantarse al oído de un sujeto que lo necesite. El trasplante de células en el oído interno de un sujeto puede ser útil para restaurar o mejorar la capacidad del sujeto para oír, o para disminuir los síntomas de disfunción vestibular. Las células del oído interno derivadas de células progenitoras de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento no necesitan estar completamente diferenciadas para ser terapéuticamente útiles. Una célula parcialmente diferenciada que mejora cualquier síntoma de pérdida auditiva, sordera u otro trastorno auditivo asociado con la pérdida de la función del oído interno en un sujeto es útil para las composiciones y métodos terapéuticos descritos en este documento.

El sujeto es preferiblemente un mamífero, por ejemplo un primate, preferiblemente un ser humano o alternativamente un roedor.

El sujeto puede ser sordo o tener una pérdida auditiva por cualquier motivo o como resultado de cualquier tipo de evento. Por ejemplo, un ser humano puede ser sordo debido a un defecto genético o congénito; por ejemplo, un ser humano puede haber sido sordo desde su nacimiento, o puede ser sordo o tener problemas de audición como resultado de una pérdida gradual de la audición debido a un defecto genético o congénito. En otro ejemplo, un ser humano puede ser sordo o tener problemas de audición como resultado de un evento traumático, tal como un trauma físico en una estructura del oído, un ruido fuerte repentino o una exposición prolongada a ruidos fuertes. Por ejemplo, las exposiciones prolongadas a salas de conciertos, pistas de aeropuertos y áreas de construcción pueden causar daños en el oído interno y la consiguiente pérdida de audición. Un ser humano puede experimentar ototoxicidad inducida por productos químicos, en la que las ototoxinas incluyen fármacos terapéuticos que incluyen agentes antineoplásicos, salicilatos, quininas y antibióticos aminoglucósidos, contaminantes en alimentos o medicinas y contaminantes ambientales o industriales. Un ser humano puede tener un trastorno auditivo que resulta del envejecimiento, o el ser humano puede tener tinnitus (que se caracteriza por un zumbido en los oídos).

Las células se pueden administrar mediante cualquier método adecuado. Por ejemplo, para restaurar la audición, las células del oído interno generadas por un método descrito en este documento se pueden trasplantar, tal como en forma de suspensión celular o utilizando un dispositivo o estructura adecuada, en el oído mediante inyección, tal como en las luminarias de la cóclea. Véanse, por ejemplo, los métodos descritos en Corrales et al., J. Neurobiol. 66 (13): 1489-500 (2006); Backhouse et al., Experimental Neurology 214 (2008) 193-200 y Hu et al., Experimental Cell Research 302: 40-47 (2005). La inyección puede realizarse, por ejemplo, a través de la ventana redonda de la oreja o a través de la cápsula ósea que rodea la cóclea. Las células se pueden inyectar a través de la ventana redonda en el tronco del nervio auditivo en el meato auditivo interno o en la escala del tímpano. En una realización preferida, las células se administran dentro o cerca del epitelio sensorial del sujeto, por ejemplo, en un espacio lleno de líquido (perilinfa) por encima o por debajo del epitelio sensorial o directamente en el tronco nervioso o el modiolo coclear (tal como en Chen et al., 2012).

Uso en el cribado de fármacos

Los progenitores óticos generados de acuerdo con la invención pueden usarse como plataformas para el cribado de fármacos. Por ejemplo, los progenitores óticos pueden usarse en cribados para identificar compuestos que a) mejorarán la diferenciación, reparación o supervivencia de las células ciliadas; b) mejorar la diferenciación, reparación o supervivencia neuronal; c) prevenir el daño y/o apoptosis de las células ciliadas y neuronas inducido por ruido, envejecimiento o fármacos citotóxicos; y d) inducir la generación de nuevas células ciliadas o neuronas mediante conversión/transdiferenciación fenotípica de las células de soporte.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones de esta memoria descriptiva, las palabras "comprende" y "contiene" y sus variaciones significan "que incluyen pero no se limitan a", y no pretenden (y no excluyen) otras fracciones, aditivos, componentes, números enteros o etapas. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones de esta especificación, el singular abarca el plural a menos que el contexto requiera lo contrario. En particular, cuando se usa el artículo indefinido, debe entenderse que la especificación contempla tanto la pluralidad como la singularidad, a menos que el contexto requiera lo contrario.

Se debe entender que las características, números enteros, rasgos, compuestos, fracciones químicas o grupos descritos junto con un aspecto, realización o ejemplo particular de la invención son aplicables a cualquier otro aspecto, realización o ejemplo descrito en este documento a menos que sea incompatible con el mismo. Todas las características descritas en esta memoria descriptiva (incluidas las reivindicaciones adjuntas, el resumen y los dibujos) y/o todos las etapas de cualquier método o proceso así divulgado, pueden combinarse en cualquier combinación, excepto combinaciones en las que al menos algunas de dichas características y/o etapas se excluyan mutuamente. La invención no se limita a los detalles de ninguna de las realizaciones anteriores. La invención se extiende a cualquier novedad, o cualquier combinación novedosa, de las características descritas en esta memoria descriptiva (incluidas las reivindicaciones, resúmenes y dibujos adjuntos), o a cualquier novedad, o combinación novedosa, de las etapas de cualquier método o proceso así divulgado.

Se dirige la atención del lector a todos los artículos y documentos que se presentan al mismo tiempo o antes de esta memoria descriptiva en relación con esta solicitud y que están abiertos a la inspección pública con esta memoria descriptiva, y se incorpora el contenido de todos esos artículos y documentos en el presente documento como referencia.

Ejemplos de referencia

1. Manipulación de Wnt en diferenciación ótica temprana

1.1 La inhibición canónica de la señalización de Wnt en combinación con FGF 3 y FGF 10 sobrerregula la expresión del gen marcador ótico

Las funciones de la vía de señalización canónica de Wnt en el control de la especificación del linaje (endodermo, mesodermo y ectodermo) durante la embriogénesis se han caracterizado bastante bien in vivo (Blauwkamp et al., 2012, Loh et al., 2014, Sokol, 2011). Los inventores han investigado si esta información pudiera usarse ventajosamente para la generación de progenitores óticos in vitro.

Se probó un inhibidor canónico de Wnt comercialmente disponible (Inhibidor de la respuesta Wnt-1-endo, IWR-1-endo, Calbiochem). El modo de acción de IWR-1-endo es estabilizar Axina2, un componente del complejo de destrucción de p-catenina que conduce a la proteólisis mediada por proteasomas de p-catenina fosforilada (Chen et al., 2009).

El efecto de los inhibidores de Wnt se exploró inicialmente en el contexto de un protocolo de diferenciación conocido, que incluye la complementación con f Gf 3 y FGF 10 desde el principio. Se llevaron a cabo experimentos para determinar el efecto de la inhibición canónica de Wnt sobre la diferenciación de progenitores óticos en medio FGF (concentración estándar de 50 ng/ml para cada FGF 3 y FGF 10) y obtener una concentración de trabajo óptima. IWR-1-endo estuvo presente desde el día 0 de diferenciación (el día 0 se refiere a la siembra inicial de las células hES en condiciones de diferenciación) y se mantuvo durante todo el protocolo de 12 días. Al final del protocolo de diferenciación, se extrajo el ARN y se cuantificó la expresión de los genes PAX2, PAX8 y FOXG1 mediante PCR en tiempo real (QPCR) utilizando SYBr Green (Sigma Aldrich). Se calcularon los Delta Ct frente al gen de mantenimiento RPLPO de la proteína ribosómica grande, y los valores de Delta Ct se compararon con los niveles expresados por células diferenciadas en el medio de DFNB de control (Livak y Schmittgen, 2001). La Figura 1 compara las respuestas a la dosis de IWR-1-endo y el efecto sobre la expresión génica de PAX2, PAX8 y FOXG1 en la línea celular H14S9 hES. El dimetilsulfóxido (DMSO) fue el vehículo para todos los compuestos de moléculas pequeñas. Se añadió un control de solo vehículo al medio FGF para determinar los efectos del DMSO. Se observó que el DMSO añadido al medio de diferenciación estándar de FGF no afectó significativamente la expresión de ninguno de los marcadores óticos investigados. Esto proporcionó la confianza de que el compuesto inhibidor de Wnt ejercía un efecto sobre la expresión génica y no sobre el vehículo portador. Se eligió 10 pM de IWR-1-endo para experimentos futuros, ya que esta concentración en general condujo a una sobrerregulación más robusta y reproducible de PAX2, PAX8 y FOXGl. La concentración óptima de IWR-1-endo concuerda con los hallazgos publicados en estudios de células madre humanas (Chen et al., 2009, Hudson et al., 2012). También se ensayó 20 pM de IWR-1-endo pero esta concentración provocó niveles muy altos de muerte celular en los cultivos.

1.2 La inhibición canónica de Wnt en combinación con FGF 3 y FGF 10 sobrerregula la expresión génica de marcadores ectodérmicos, pero interrumpe la expresión génica de marcadores endodérmicos y mesodérmicos

El efecto de interrumpir la señalización canónica de Wnt con varios inhibidores de moléculas pequeñas presentes durante los 12 días completos del protocolo de diferenciación ótica que da lugar a una sobrerregulación de los marcadores óticos característicos condujo a la investigación de la expresión de genes asociados con la diferenciación de linaje. Se anticipó que el protocolo de diferenciación estándar de FGF utilizado en este documento conduciría a las células hES que se diferencian hacia un destino ectodérmico (ya que la placoda ótica es de origen ectodérmico). No se ha abordado el efecto sobre la diferenciación del endodermo y mesodermo en la condición de FGF, y tampoco se ha investigado en este documento la consecuencia de combinar el tratamiento con FGF con la manipulación de la señalización canónica de Wnt en la diferenciación de linaje.

Con la línea celular H14S9 hES, se llevaron a cabo experimentos de diferenciación ótica de 12 días en DFNB, FGF o FGF de control con medio complementado con 10 pM de IWR-1-endo . La expresión génica de los tres linajes de la capa germinal en relación con la condición inicial de DFNB se cuantificó mediante QPCR. Se investigaron dos marcadores genéticos para cada capa germinal; PAX6 y NESTIN (ectodermo), BRACHYURYy MEOX1 (mesodermo) y A FP y GATA6 (endodermo) (Figura 2).

En comparación con la condición de línea base de DFNB, el medio FGF estándar usado en este documento condujo a la sobrerregulación de genes asociados con las tres capas germinales. Se anticipó que la adición de FGF 3 y FGF 10 induciría la diferenciación ectodérmica pero no tendría ningún efecto sobre la diferenciación del mesodermo y del endodermo. Sin embargo, este no fue el caso. Se observó una sobrerregulación significativa de los genes del ectodermo PAX6 y NESTIN en la condición FGF como se esperaba, aunque también se observó una sobrerregulación significativa de los marcadores de mesodermo y endodermo en la condición de FGF. Cuando el medio FGF se complementó con el inhibidor canónico de Wnt, se mejoró la diferenciación ectodérmica de IWR-1endo aún más con respecto a la condición de FGF, particularmente PAX6. Sin embargo, la expresión del gen de los marcadores de mesodermo y endodermo se redujo significativamente en comparación con la condición de FGF. Este efecto subregulación se observó con la complementación de los tres inhibidores de Wnt canónicos (especialmente IWR-1-endo) en medio FGF para BRACHYURY, MEOX1 y GATA6. Sin embargo, solo la complementación con IWR-1-endo podría causar una subregulación significativa de AFP.

Después de un paradigma de pérdida de función/ganancia de función, se realizó un experimento para determinar el efecto de activar la señalización canónica de Wnt a lo largo de los 12 días de diferenciación ótica. El compuesto de molécula pequeña BIO (6-bromoindirrubina-3'-oxima, Tocris) es un potente inhibidor de la quinasa GSK-3p, un componente del complejo de degradación de la p-catenina. La inhibición de la actividad de la quinasa GSK-3p interrumpe la degradación proteolítica de la p-catenina y, por lo tanto, se mantiene la actividad de Wnt (Meijer et al., 2003). BIO está bien establecido en la bibliografía y se ha utilizado para investigar la supervivencia y proliferación de células hES y también estudios de diferenciación de linaje (Dravid et al., 2005) (Tseng et al., 2006). BIO se probó a una concentración de 2 pM (como se recomienda en la bibliografía). La Figura 3 muestra el efecto sobre la expresión génica de los marcadores óticos PAX2, PAX8 y FOXG1 (A), y también los marcadores de diferenciación de linaje de ectodermo, mesodermo y endodermo (B). En contraste con la inhibición de la señalización canónica de Wnt a lo largo del protocolo de 12 días, la activación de la señalización canónica Wnt parece subregular la expresión génica de los marcadores óticos y del ectodermo, con sobrerregulación de los marcadores del mesodermo y endodermo.

1.3 El momento de la inhibición canónica de Wnt es fundamental para la sobrerregulación de la expresión del gen marcador ótico

Los experimentos anteriores han implicado complementar el medio FGF con uno de los tres compuestos inhibidores canónicos de Wnt y mantener esta complementación durante todo el protocolo de 12 días, lo que conduce a la sobrerregulación de la expresión génica de los marcadores óticos característicos. Dado que el momento y la secuencia de las señales de desarrollo son fundamentales para impulsar un proceso en particular, era importante determinar si es necesario que la señalización canónica de Wnt se inhiba desde el comienzo mismo de la diferenciación ótica in vitro para que tenga su efecto sobrerregulador. La Figura 4 muestra el efecto de complementar el medio FGF con inhibidores canónicos de Wnt desde el día 4 del protocolo de diferenciación ótica sobre la expresión génica de PAX2, PAX8 y FOXG1, y la Figura 5 muestra el resultado de la expresión del gen marcador de la capa germinal en el ectodermo (A), mesodermo (B) y endodermo (C).

Se observó que la inhibición de la señalización canónica de Wnt con cualquiera de los tres compuestos de molécula pequeña desde el día 4 del protocolo estándar de diferenciación ótica de 12 días no condujo a una sobrerregulación de los marcadores óticos o marcadores de linaje ectodérmico en comparación con la condición de FGF, como se vio cuando la Wnt canónica se inhibió desde el inicio del protocolo de diferenciación. Por el contrario, la expresión génica de los marcadores del mesodermo y del endodermo, que anteriormente se veía que estaba significativamente subregulada tras la inhibición canónica de Wnt desde el inicio de la diferenciación, se sobrerreguló significativamente con la complementación de al menos uno de los compuestos de molécula pequeña a partir del día 4 de diferenciación. Esto sugiere que el inicio de la inhibición de la señalización canónica de Wnt debe tener lugar desde el comienzo de la diferenciación de las células hES para que tenga un efecto positivo sobre la sobrerregulación de la expresión génica de marcadores específicos óticos.

1.4 La inhibición de la señalización canónica de Wnt en combinación con FGF 3 y FGF 10 no es necesaria durante la diferenciación ótica in vitro

Hasta ahora, los inventores han demostrado que la inhibición de la señalización canónica de Wnt debe producirse desde el comienzo mismo del protocolo para promover la expresión génica de marcadores de linaje ectodérmico y la sobrerregulación de los marcadores óticos clave, PAX2, PAX8 y FOXG1. Al mismo tiempo, también se observa una subregulación de la expresión del gen marcador de mesodermo y endodermo cuando la señalización canónica de Wnt está presente durante los 12 días completos del protocolo. Estos efectos se revierten esencialmente cuando la inhibición tiene lugar a partir del día 4.

Investigando más a fondo el momento de la inhibición canónica de Wnt, fue importante abordar si la inhibición era necesaria durante todo el protocolo de diferenciación de 12 días. Se establecieron experimentos para inhibir la señalización canónica de Wnt durante diferentes períodos de tiempo. En combinación con el medio FGF, la inhibición de Wnt tuvo lugar del día 0 al día 4, del día 0 al día 6 o del día 0 al día 8. Las células diferenciadoras se mantuvieron en medio FGF solo después del día 4, 6 u 8, respectivamente hasta el día 12. La inhibición del día 0 al día 12 también se incluyó como se muestra en las figuras anteriores. Al final del día 12, la expresión génica de PAX2, PAX8 y FOXG1 se cuantificó en relación con la condición de línea base de DFNB, y se muestra en la Figura 6. Como los efectos sobre la expresión génica de IWR-1-endo fueron similares en todos los experimentos realizados anteriormente, y con IWR-1-endo bien establecido en la bibliografía, todos los experimentos futuros se llevaron a cabo utilizando lWR-1-endo como el inhibidor de elección canónica de Wnt. La inhibición de la señalización canónica de Wnt con IWR-1-endo desde el día 0 al día 4 o del día 0 al día 6 no alteró significativamente la expresión génica de PAX2, PAX8 o FOXG1 de la del medio FGF solo. Sólo se encontró una sobrerregulación significativa de los marcadores óticos entre el medio FGF estándar y FGF con inhibición canónica de Wnt desde el día 0 al 8 o el día 0 al 12. Además, no hubo diferencias significativas en la expresión del gen marcador ótico entre la inhibición de la señalización de Wnt desde el día 0 hasta el día 8 o durante todo el protocolo de diferenciación de 12 días (para PAX2 y PAX8 sin embargo la expresión del gen FOXG1 fue significativamente mayor con 12 días de inhibición canónica de Wnt en contraste con ocho días). Por lo tanto, se requiere la inhibición canónica de Wnt desde el inicio de la diferenciación de hES, y debe mantenerse durante más de 6 días (preferiblemente al menos ocho días) para provocar una respuesta sobrerreguladora de la expresión del gen marcador ótico clave.

2. Manipulación de Wnt durante la diferenciación ótica tardía

2.1 La activación de la señalización canónica de Wnt tardía en la diferenciación ótica en presencia de la señalización de FGF conduce a la pérdida de la expresión del gen marcador ótico

Los resultados descritos anteriormente demostraron que la inhibición de la señalización canónica de Wnt potencia la inducción del destino ectodérmico y la expresión posterior de genes óticos cuando la inhibición se lleva a cabo desde el inicio del protocolo de diferenciación ótica. Además, la señalización canónica de Wnt debe inhibirse durante más de 6 días (preferiblemente al menos ocho días) para tener este efecto sobrerregulador sobre la expresión del gen marcador ectodérmico y ótico. La inhibición de la señalización canónica de Wnt desde el cuarto día del protocolo mostró una subregulación o pérdida de la expresión génica ectodérmica y ótica, con la diferenciación favoreciendo un destino más mesodérmico y endodérmico.

Teniendo en cuenta estos datos, se planteó la hipótesis de que el aumento de la diferenciación ectodérmica con la inhibición canónica de Wnt era permisivo para que los ligandos de FGF 3 y FGF 10 complementados indujeran el destino ótico. El papel de la señalización de Wnt en el desarrollo de placoda ótica está menos bien caracterizado que el papel de la señalización de FGF (Freyer y Morrow, 2010, Jacques et al., 2012, Vendrell et al., 2013), pero se cree que la activación de la vía canónica participa en la expansión del tamaño de la placoda ótica una vez que se ha inducido (Ohyama et al., 2006). Por lo tanto, fue de mayor interés determinar si la expresión del gen marcador ótico podría mejorarse aún más incorporando un período de activación canónica de Wnt en el protocolo de diferenciación.

Se establecieron experimentos de diferenciación ótica que comprendían una fase de inhibición canónica de Wnt durante ocho días con 10 pM de IWR-1-endo , luego un cambio a activación con BIO 2 pM durante los cuatro días restantes del protocolo. Se complementaron FGF 3 y FGF 10 durante los 12 días completos de diferenciación. A partir de este momento, este protocolo modificado se denominará Protocolo Modificado 1. También se incluyeron las condiciones estándar de DFNB (Control) y FGF. Al final del período de diferenciación, el análisis de expresión génica se llevó a cabo mediante QPCR. La condición de línea de base de DFNB se utilizó como calibrador de referencia. Para facilitar la comprensión, la Figura 7 muestra una representación esquemática del Protocolo Modificado 1 (A) y la expresión génica relativa de los marcadores óticos PAX2, PAX8, FOXG1 y SOX2 (B).

Inesperadamente, la combinación de ligandos de FGF y la activación canónica de Wnt durante los últimos cuatro días del protocolo de diferenciación ótica manipulada (Protocolo Modificado 1) provocó una subregulación estadísticamente muy significativa de todos los marcadores óticos investigados, en comparación con el protocolo de inhibición de Wnt de ocho días anteriores. (Figura 6). Además, en el caso de PAX2 y FOXG1 no hubo una diferencia significativa en la expresión génica entre el protocolo de FGF estándar utilizado en el presente documento y el Protocolo Modificado 1. A la luz de los datos publicados sobre el papel de la señalización canónica de Wnt en la expansión de placoda ótica in vivo, estos resultados fueron sorprendentes. Sin embargo, el trabajo de Freter et al. (Freter et al., 2008) ha propuesto un papel inhibidor de la señalización continua de FGF durante la maduración y expansión de la placoda ótica cuando la señalización canónica de Wnt está activa. En este estudio en el pollito se demostró que se requiere una atenuación de la señalización de Fgf 3 y Fgf 19 para el compromiso ótico.

2.2 La activación canónica de Wnt con eliminación de ligandos de FGF complementados en la diferenciación ótica tardía conduce a una sobrerregulación de PAX2, PAX8 y FOXG1, con una pérdida de expresión de SOX2

A la luz de los datos mostrados por Freter et al. (Freter et al., 2008) se probó otra alteración del protocolo de manipulación de Wnt. Este protocolo involucró el período inicial de ocho días de complementación con ligando de FGF 3 y FGF 10 con inhibición de la señalización canónica de Wnt con IWR-1-endo. Durante los cuatro días restantes, la activación canónica de Wnt se llevó a cabo con BIO en el medio basal de DFNB. FGF 3 y FGF 10 no se complementaron en el medio durante estos últimos cuatro días del protocolo (incluido en el Protocolo Modificado 1). Este protocolo alternativo se denominará en adelante Protocolo Modificado 2 y se representa esquemáticamente en la Figura 8A.

El efecto del Protocolo Modificado 2 (Figura 8B) sobre la expresión génica de PAX2, PAX8 y FOXG1 fue positivo, lo que condujo a una sobrerregulación significativa de estos marcadores óticos en comparación con el FGF y el protocolo de inhibición inicial de ocho días de Wnt. Por lo tanto, en este caso, la eliminación de la complementación con ligando FGF 3 y FGF 10 durante la fase de activación canónica de Wnt fue beneficiosa para la diferenciación y expresión génica de estos marcadores. Sin embargo, una característica sorprendente de este protocolo modificado fue la subregulación altamente significativa de la expresión génica de SOX2. En el experimento del Protocolo Modificado 1 (Figura 7B) con activación canónica de Wnt y complementación con ligando de Fg f 3 y FGF 10, la expresión del gen SOX2 se subreguló junto con los otros marcadores óticos investigados. La expresión del gen SOX2 también se subreguló durante los últimos cuatro días del Protocolo Modificado 2 (Figura 8B), cuando la activación canónica de Wnt tiene lugar sin complementación concomitante del ligando de FGF. Estos experimentos, realizados uno al lado del otro, sugirieron que la señalización de FGF durante los últimos cuatro días de los protocolos modificados se requiere a un nivel particular para que la diferenciación ótica progrese. El mantenimiento de FGF 3 y FGF 10 en la concentración estándar de 50 ng/ml durante la fase de activación canónica de Wnt con BIO parece inhibir la expresión génica de PAX2, PAX8, FOXG1 y SOX2 (Figura 7B). Sin embargo, retirar FGF 3 y FGF 10 de los medios de diferenciación durante la activación canónica de Wnt (Figura 8B) sobrerregula la expresión génica de PAX2, PAX8 y FOXG1, pero sigue siendo perjudicial para la expresión de SOX2. En consecuencia, podría plantearse la hipótesis de que se está produciendo un efecto "Ricitos de oro" de la señalización de FGF en la diferenciación ótica en presencia de activación de Wnt; demasiado FGF parece inhibir la expresión de PAX2, PAX8 y FOXG1, mientras que algo de FGF puede ser necesario para la expresión de SOX2, un regulador clave del desarrollo posterior de las estructuras del oído interno.

Como el Protocolo Modificado 2 parece ser el protocolo más eficaz en la sobrerregulación de la mayoría de la expresión del gen marcador ótico, este protocolo se examinó con mayor detalle. Para determinar si la pérdida de expresión del gen SOX2 (y también la sobrerregulación de los otros marcadores óticos) es solo al nivel del ARN, es importante investigar también la expresión de proteínas. El análisis de la expresión de la proteína se realizó utilizando la plataforma In Cell Analyzer 1000. Se llevaron a cabo experimentos de diferenciación con células H14S9 hES sometidas a DFNB, FGF y las condiciones del Protocolo Modificado 2. Después del período de diferenciación de 12 días, las células se inmunomarcaron con las siguientes combinaciones de anticuerpos primarios (se muestra un experimento representativo en la Figura 9): PAX2/PAX8 (A), FOXG1/PAX8 (B) y SOX2/PAX8 (C). Los resultados de tres experimentos repetidos independientes se muestran en la Figura 10. La plataforma In Cell Analyzer se utilizó para determinar el porcentaje de células de alta coexpresión que se cree que representan la verdadera población progenitora ótica con los cultivos de diferenciación. Se consideró que las células eran altamente coexpresivas de las combinaciones de anticuerpos marcadores óticos si su umbral de intensidad fluorescente estaba por encima del percentil 75 establecido dentro de la condición de FGF.

Los resultados de los tres experimentos independientes presentados en la Figura 10 muestran, como se esperaba, una sobrerregulación estadísticamente significativa de la expresión de la proteína marcadora ótica entre las condiciones de DFNB control basales y las condiciones tratadas con FGF. El porcentaje de células altamente doblemente positivas para las condiciones de DFNB, FGF y el Protocolo Modificado 2 respectivamente para cada par de anticuerpos utilizados fue el siguiente: PAX2/PAX8: 12,08% ± 2,02%, 21,20% ± 3,78% y 38,17% ± 2,21% ; FOXG1/ PAX8: 12,21% ± 4,27%, 21,31% ± 0,97% y 54,75% ± 4,03%; SOX2/PAX8: 10,41% ± 1,1%, 20,76% ± 2,53% y 4,30% ± 1,25%. Al observar estos resultados, es evidente que la diferencia en los niveles de expresión génica entre las condiciones de DFNB, FGF y Protocolo Modificado 2, como se muestra mediante QPCR (Figura 8), también se demuestra en el porcentaje de células altamente doblemente positivas para cada combinación de anticuerpos marcadores óticos. En comparación con el protocolo de diferenciación estándar de FGF utilizado en el presente documento, el Protocolo Modificado 2 parece generar una proporción significativamente mayor de progenitores óticos diferenciados que expresan altamente los marcadores óticos característicos PAX2, PAX8 y FOXG1, tanto a nivel de ARN como de proteína. Sin embargo, la expresión de ARN y proteínas de SOX2 está significativamente subregulada con el Protocolo Modificado 2.

Posteriormente, para una confirmación adicional del efecto del Protocolo Modificado 2 sobre la expresión de SOX2, se establecieron experimentos de diferenciación utilizando una línea hESC que informa sobre la expresión ótica de SOX-2, la línea reportera H14S9 NOP-SOX2. Las células de la línea indicadora se diferenciaron durante 12 días en condiciones de DFNB, FGF o Protocolo Modificado 2, seguido de inmunomarcación con anticuerpos PAX2, PAX8 o FOXG1. En la Figura 11 se muestra el porcentaje de células diferenciadas que coexpresan los marcadores óticos con GFP impulsada por el potenciador NOP-SOX2 de las tres condiciones probadas. Después del período de diferenciación de 12 días, el porcentaje de células que coexpresan un marcador ótico junto con GFP impulsada por el potenciador NOP-SOX2 de cada una de las condiciones probadas (DFNB, FGF y Protocolo Modificado 2 respectivamente) se observó de la siguiente manera: NOP-SOX2/PAX2 : 10,55% ± 1,22%, 21,88% ± 2,02% y 3,83% ± 1,14%; NOP-SOX2/PAX8: 11,58% ± 1,56%, 21,25% ± 2,51% y 4,62% ± 1,78%; NOP-SOX2/FOXG1: 13,18% ± 1,70%, 25,46% ± 3,53% y 3,52% ± 1,51%. Al igual que con la inmunomarcación de anticuerpos en la Figura 9A y 10, la coexpresión de cualquiera de los marcadores óticos con la GFP NOP-SOX2 fue significativamente menor cuando las células reporteras hES se diferenciaron en el Protocolo Modificado 2, en comparación con la línea base de DFNB y la condición estándar de FGF. Se puede concluir que los bajos porcentajes observados en la Figura 11 son el resultado de la disminución de la actividad reportera potenciadora de NOP-SOX2 y, por lo tanto, de la expresión de SOX2. La expresión de PAX2, PAX8 y FOXG1, como se ve en las Figuras 9A y 10, aumentó durante la diferenciación en la condición del Protocolo Modificado 2 y, por lo tanto, esto también agrega peso a la sugerencia de que, de hecho, es únicamente la expresión de SOX2 la que está siendo afectada negativamente en el Protocolo Modificado 2.

2.3 La complementación con ligando de FGF a una dosis reducida durante la activación canónica de Wnt en la diferenciación ótica tardía mantiene la sobrerregulación de PAX2, PAX8 y FOXG 1, y rescata la expresión de SOX2

Se ha demostrado previamente en esta sección que en un protocolo de diferenciación de 12 días, el mantenimiento de la complementación con ligando de FGF 3 y FGF 10 durante el período de inhibición de Wnt (ocho días) y la posterior activación de Wnt (cuatro días) (Protocolo Modificado 1) conduce a una pérdida o subregulación de la expresión génica de PAX2, PAX8, FOXG1 y SOX2 (Figuras 7A y 7B). Se probó una versión alternativa del protocolo en la que los ligandos de FGF 3 y FGF 10 no se complementaron en el medio durante el período de cuatro días de activación canónica de Wnt (Protocolo Modificado 2). A partir de este protocolo alternativo, se observó que la expresión génica de PAX2, PAX8 y FOXG1 se sobrerreguló significativamente en comparación con el FGF estándar o cualquier otra modificación del protocolo probado, sin embargo, la expresión del gen SOX2 se subreguló significativamente (Figuras 8A y 8B). Al hacer coincidir la expresión de ARN, también se observó un resultado similar del Protocolo Modificado 2 en la expresión de la proteína marcadora ótica (Figuras 9A y 10), y también al diferenciar las células reporteras H14S9 NOP-SOX2 (Figura 11). En resumen, el mantenimiento de la complementación con FGF durante la fase de activación canónica de Wnt del protocolo tiene un impacto negativo en la diferenciación ótica, mientras que la eliminación de los ligandos de FGF es beneficiosa para toda la expresión de marcadores óticos excepto para SOX2, lo que sugiere que puede ser necesario un nivel intermedio de señalización de FGF.

Para abordar la posibilidad de un nivel intermedio de requisito de señalización de FGF para mejorar la diferenciación ótica, se establecieron experimentos de diferenciación como sigue. Al igual que con las encamaciones anteriores del protocolo, se complementaron FGF 3 y FGF 10 en el medio de DFNB basal a una concentración de 50 ng/ml con inhibición canónica concomitante de Wnt con 10 pM de IWR-1-endo, con las células hES diferenciadas en esta condición durante ocho días. Durante los últimos cuatro días del protocolo, las células se mantuvieron en medio DFNB complementado con el agonista canónico de Wnt BIO a una concentración de 2 pM, y complementado con FGF 3 y FGF 10 a razón de 25 ng/ml (la mitad de la concentración utilizada en el protocolo estándar de diferenciación ótica y modificaciones previas). Esta versión del protocolo se denominará Protocolo Modificado 3 de aquí en adelante. En la Figura 12A se muestra un esquema del protocolo. Los experimentos de diferenciación con el Protocolo Modificado 3 se llevaron a cabo junto con las células H14S9 hES diferenciadas en condiciones de DFNB, FGF o Protocolo Modificado 2. Se llevó a cabo el análisis QPCR de la expresión del gen marcador ótico y los resultados se muestran en la Figura 12B. Se observó que el Protocolo Modificado 3 conduce de forma reproducible a la diferenciación de progenitores óticos con una sobrerregulación significativa de la expresión génica de los marcadores óticos PAX2, PAX8, FOXG1 y SOX2. Para PAX2, PAX8 y FOXG1, la diferencia en la expresión génica entre los Protocolos Modificados 2 y 3 no es estadísticamente significativa, lo que sugiere que la expresión de estos genes se ha vuelto independiente de FGF en esta etapa y puede mantenerse con la activación de Wnt. Además, la expresión génica de SOX2 en el Protocolo Modificado 3 se rescata y aumenta significativamente con respecto a la expresión observada en el Protocolo Modificado 2. Para SOX2, este resultado sugiere que debe tener lugar un nivel intermedio de señalización de FGF durante la activación canónica de Wnt para sobrerregular y mantener su expresión.

La plataforma In Cell Analyzer 1000 se utilizó a continuación para determinar si el rescate de la expresión del gen SOX2 a nivel de ARN se reflejaba en el nivel de proteína mediante inmunomarcación de anticuerpos. La condición estándar de FGF se usó como línea base en estos experimentos y se usó PAX8 como marcador de coexpresión. La Figura 13 muestra un ejemplo representativo de los resultados con In Cell Analyzer, con tres repeticiones experimentales independientes que se muestran en la Figura 14. A lo largo de los experimentos repetidos, se observó que las células diferenciadoras en la condición de FGF tenían un porcentaje típico de células altamente doblemente positivas para la combinación de marcadores óticos de SOX2 y PAX8 como se vio en experimentos previos (media de 19,6% ± 2,90%). Sin embargo, se encontró que el porcentaje de células altamente doblemente positivas para esta combinación de marcadores de la condición del Protocolo Modificado 3 era una media de 53,98% ± 4,47%. Este es un rescate considerable y un aumento de la expresión de la proteína SOX2 en comparación con el Protocolo Modificado 2 (Figura 10), y es coherente con la sobrerregulación de la expresión del gen SOX2 observada en la Figura 12 mediante el análisis por QPCR.

Además, las células reporteras hES H14S9 NOP-SOX2 también se diferenciaron en las condiciones de FGF y del Protocolo Modificado 3 y se investigó el etiquetado conjunto de la expresión de marcadores óticos de PAX2, PAX8 y FOXG1 con la GFP impulsada por el potenciador de NOP-SOX2. Se llevaron a cabo tres experimentos y se muestran en la Figura 15. De acuerdo con la inmunomarcación de anticuerpos en la Figura 12, el etiquetado conjunto de GFP impulsado por el potenciador de NOP-SOX2 con PAX2, PAX8 y FOXG1 aumentó significativamente cuando las células se diferenciaron en el Protocolo Modificado 3 en comparación con el protocolo estándar de FGF (Figura 15), y está en contraste con el resultado del Protocolo Modificado 2 sobre la actividad potenciadora de NOP-SOX2 (Figura 11). El porcentaje medio de células positivas para GFP NOP-SOX2 con inmunomarcación de anticuerpo marcador ótico altamente positivo para FGF y Protocolo Modificado 3 respectivamente se observó como sigue: NOP-SOX2/PAX2: 19,59% ± 3,31% y 55,79% ± 7,90%; NOP-SOX2/PAX8: 16,94% ± 1,82% y 52,31% ± 5,07%; NOP-SOX2/FOXG1: 22,04% ± 2,14% y 59,83% ± 6,73%.

Ejemplo de protocolo detallado para la generación de progenitores óticos a partir de hES (Protocolo Modificado 3).

Fase 1 (12 días)

Día anterior: recubrir las placas con 2 pg/cm2 de laminina: 22 pl de laminina/2 ml de PBS helado/placa de 35 mm (8,8 cm2); Matraces T12,5 con 2,5 pg/cm2 (31,25 pl de laminina/2 ml de PBS helado. La laminina patrón es de Cultrex de 1 mg/ml de laminina I de ratón (la concentración de trabajo es de 0,05-10 pg/cm2). Descongelar la laminina durante varias horas en el refrigerador. Dejar polimerizar en incubadora (37 °C) durante 4 horas/durante la noche o más (la noche parece mejor, especialmente para placas con fondo de vidrio).

Disociar las células madre embrionarias humanas:

1. El cultivo inicial de hESC debe ser de buena calidad, con colonias bien definidas e indiferenciadas.

• Aspirar el medio de un matraz T25 y lavar las células con 3 ml de solución equilibrada de Hanks caliente (Sigma H9394).

• Agregar 2 ml de tripsina-EDTA al 0,025% caliente (Sigma T4174). La solución patrón está al 0,5%, diluida 1:20 en Hanks (500 pl de T/E 9,5 ml de Hanks). Se debe preparar una nueva solución de trabajo fresca ese día.

2. Inclinar la placa para cubrir toda la superficie e incubar durante 2-5 min a temperatura ambiente. No más de 5 min. Recoger la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml que contenga 4 ml de inhibidor de tripsina de soja 0,5 mg/ml filtrado en caliente (Invitrogen, 17075-029) en DMEM (el patrón es de 2 mg/ml). Enjuagar el matraz con 2 ml de Hanks y agregar al tubo.

3. Centrifugar a 167 x g (1000 rpm en una Harrier 18/80) durante 5 min.

4. Aspirar el sobrenadante del sedimento de células hES y volver a suspender muy suavemente las células en 1 ml de medio de DFNB (DMEM/alto contenido de glucosa: F12 mezclado 1: 1, con complementos de N2 y B27).

5. Pasar la suspensión celular a través de un filtro de células 100 pM (BD Falcon). Este procedimiento debería producir células completamente disociadas o agregados de células muy pequeñas.

6. Recoger el filtrado y contar las células con el contador de células automatizado Bio-Rad TC20 (primero diluya 1: 2 con azul de tripán).

7. Sembrar 5 x 103/cm2 para la generación de ONP o 9 x 103/cm2 para la generación de OEP, en medios de DFNB que contienen 50 ng/ml de FGF 3, 50 ng/ml de FGF 10 y 10 pM de IWR-1-endo (Calbiochem, 681669, la solución patrón es 10 mM en DMSO). Mantener las células en este medio hasta el final del día 8, reemplazar completamente el medio cada 2 días.

8. La purificación manual de los tipos de células de interés puede ocurrir normalmente desde el día 4-6 del protocolo para los ONP. A veces, la morfología de OEP aparece más tarde en el protocolo (aproximadamente los días 7-9). 9. El día 9, retirar el medio y lavar suavemente las células dos veces con 2 ml de DMEM caliente. Reemplazar con DFNB que contenga 25 ng/ml de FGF 3, 25 ng/ml de FGF 10 y BIO 2 pM (Sigma, B1686, el patrón es 2 mM en DMSO). Mantener las células en este medio hasta el final del día 12, reemplazar completamente el medio cada 2 días.

3. Potencial de diferenciación en neuronas sensoriales de neuroprogenitores óticos generados por el protocolo estándar de FGF o el Protocolo Modificado 3

Los inventores han comparado la capacidad de los progenitores neurales óticos (ONP) producidos a partir de células hES utilizando el protocolo de FGF (también denominado "protocolo estándar de FGF" en este documento) o el protocolo de Wnt (también denominado "Protocolo Modificado 3 "en el presente documento) para diferenciación en neuronas sensoriales/auditivas.

Los protocolos utilizados para generar progenitores óticos a partir de células madre embrionarias humanas (hES) fueron los descritos anteriormente en el presente documento:

• Medios basales DFNB complementados con FGF3 y FGF10 (50 ng/ml cada uno) durante 12 días ("protocolo estándar de FGF" o "protocolo de FGF")

• Medio basal DFNB complementado con FGF3 y FGF10 (50 ng/ml cada uno) e IWR-1 10 pM (Inhibidor de la respuesta Wnt-1) durante 8 días, seguido por FGF3 y FGF10 (25 ng/ml cada uno) y BIO 2 pM (6-bromoindirrubina-3'-oxima; inhibidor de GSK-3a/p) hasta el día 12 ("Protocolo Modificado 3", también denominado "protocolo de Wnt").

Se dice que los progenitores óticos inducidos durante 12 días con cualquiera de los métodos han completado la "Fase 1" del protocolo (la "fase 1" corresponde a un método de generación de células progenitoras óticas que comprende la etapa (i) y (ii) como se define en otra parte en este documento). La diferenciación neuronal posterior se denomina "Fase 2" (en la que la "fase 2" corresponde a la etapa (iii) del método como se define en otra parte del presente documento).

Se ensayó la capacidad de los ONP producidos a partir de cada protocolo para diferenciarse en fenotipos neuronales más maduros, utilizando un protocolo de neuralización estándar, como se describe en otra parte del presente documento. Brevemente, la diferenciación neuronal se desencadena disociando las células con tripsina y sembrándolas en placas a una densidad de 3-4.000 células/cm2. A continuación, las células se cultivan en DMEM con alto contenido de glucosa más solución nutritiva F12, N2 y B27, complementada con bFGF humano recombinante (20 ng/ml) más Shh-C24ll (500 ng/ml) durante tres días. Al tercer día, el medio se complementa con 10 ng ml-1 de BDNF y NT3 y se elimina Shh-C24ll al quinto día. La neuralización se evaluó después de 12 días mediante inmunomarcación de marcadores neuronales característicos y la expresión génica mediante análisis por QPCR.

3.1 Resultados

Se diferenciaron células H14S9 hES mediante el protocolo de FGF o de Wnt durante 12 días. Las células se sembraron originalmente a razón de 4 x 103/cm2 para el protocolo de FGF o 6 x 103/cm2 para el protocolo de Wnt. Los cultivos de diferenciación se limpiaron manualmente durante los 12 días para enriquecer las colonias de ONP. Al final de la inducción ótica, las colonias de ONP producidas a partir de ambos protocolos se sometieron a nuestro protocolo de neuralización estándar de fase 2 (etapa iii) y se diferenciaron durante 12-14 días. El análisis por QPCR para marcadores neuronales sensoriales se llevó a cabo para POU4F1/Brn3a, SYP/sinaptofisina y SLC17A7/VGLUT1 (Figura 16A), con inmunomarcación para NKAa3/POu4F1 y p-tubulina III/NF200 (Figura 16B y 16C).

3.2 Discusión

La expresión génica de los tres marcadores neuronales sensoriales investigados (POU4F1, SYP, SLC17A7) se sobrerreguló significativamente en las células generadas a partir del protocolo de Wnt de Fase 1 en comparación con el protocolo estándar de FGF. También hubo una sobrerregulación significativa de los tres marcadores entre los progenitores del protocolo de Wnt antes y después de la neuralización. Por el contrario, utilizando el protocolo de FGF, solo POU4F1 se sobrerreguló significativamente después de la diferenciación neural en comparación con el nivel de expresión en el estado progenitor ótico.

En términos de inmunomarcación, no pareció haber diferencia significativa en el porcentaje de células NKAa3/POU4F1 doblemente positivas entre los progenitores de FGF y Wnt, aunque la intensidad de fluorescencia pareció mayor en los progenitores de Wnt diferenciados. Sin embargo, hubo un aumento significativo en el porcentaje de células dobles positivas y la intensidad de la fluorescencia para la marcación de p-tubulina III/NF200 en los progenitores de Wnt en comparación con FGF.

Estos resultados sugieren que los progenitores óticos producidos usando el protocolo de Wnt tienen una mayor eficiencia para diferenciarse más en los fenotipos neuronales más maduros en comparación con los progenitores óticos producidos a partir de nuestro protocolo estándar de FGF.

Referencias

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Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un método para generar células progenitoras óticas que comprende las etapas secuenciales de:

i) cultivar una célula progenitora en condiciones suficientes para inhibir la señalización de Wnt y activar la señalización de FGF durante un primer período de tiempo suficiente para inducir la sobrerregulación de uno o más marcadores de células óticas seleccionados entre PAX2, Pa X8, FOXg 1 y SOX2;

ii) cultivar la célula progenitora de la etapa i) en condiciones suficientes para activar la señalización de Wnt y reducir la señalización de FGF con respecto a la etapa i) durante un segundo período de tiempo suficiente para mantener la expresión sobrerregulada de dichos uno o más marcadores de células óticas seleccionados de PAX2, PAX8, FOXG1 y SOX2;

en el que:

las condiciones suficientes para inhibir la señalización de Wnt comprenden cultivar dicha célula progenitora en un medio de cultivo que comprende uno o más inhibidores de Wnt;

las condiciones suficientes para activar la señalización de FGF comprenden cultivar dicha célula progenitora en un medio de cultivo que comprende uno o más FGF;

las condiciones suficientes para activar la señalización de Wnt comprenden cultivar dicha célula progenitora en un medio de cultivo que comprende uno o más activadores de Wnt; y

las condiciones suficientes para reducir la señalización de FGF comprenden cultivar dicha célula progenitora de la etapa ii) en un medio de cultivo que comprende uno o más FGF a una concentración menor que dicho uno o más FGF presentes en dicho medio de cultivo de la etapa i).

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha célula progenitora es una célula madre pluripotente, en el que opcionalmente dicha célula madre pluripotente es una célula madre embrionaria o una célula madre pluripotente inducida.

3. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que dichas células progenitoras óticas comprenden una o más células progenitoras epiteliales óticas y/o una o más células progenitoras neurales óticas.

4. El método de acuerdo con cualquiera reivindicación anterior, en el que dicha sobrerregulación de uno o más marcadores de células óticas se determina midiendo la expresión génica, opcionalmente en el que dicha expresión génica se determina midiendo los niveles de ARNm y/o proteína.

5. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que dicho uno o más inhibidores de Wnt es IWR-1-endo.

6. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que dichos uno o más FGF presentes en el medio de cultivo de la etapa i) son los mismos que dicho uno o más FGF presentes en el medio de cultivo de la etapa ii).

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho uno o más FGF se selecciona de FGF 3 y FGF 10.

8. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que dicha célula progenitora se:

a) cultiva como una monocapa; y/o

b) cultiva en condiciones libres de suero.

9. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la inhibición de la señalización de Wnt se produce antes de la diferenciación de las células progenitoras óticas.

10. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que:

a) dicho primer período de tiempo es de al menos 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240, 264 o 288 horas, en el que opcionalmente dicho primer período de tiempo es de al menos 144 horas; y/o

b) dicho segundo período de tiempo es de al menos 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 o 192 horas, en el que opcionalmente dicho segundo período de tiempo es de al menos 96 horas.

11. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que el método comprende además una etapa iii) que comprende:

a) diferenciar dichas células progenitoras óticas en células similares a células ciliadas; y/o

b) diferenciar dichas células progenitoras óticas en neuronas auditivas o sensoriales.