KR20150139326A

KR20150139326A - 캡시에이트 또는 이의 염을 유효성분으로 하는 알러지성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20150139326A
Application number: KR1020140067769A
Authority: KR
Inventors: 김태윤; 이윤상
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2014-06-03
Filing date: 2014-06-03
Publication date: 2015-12-11
Also published as: KR101823982B1; US9351950B2; US20150342919A1

Abstract

본 발명은 캡시에이트 또는 이의 염을 유효성분으로 하는 알러지성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 화학식 1로 표시되는 캡시에이트 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 하는 알러지성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 알러지성 피부질환 예방 및 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 상기 본 발명의 조성물은 알러지성 질환의 예방 및 치료의 목적으로 사용할 수 있다.

Description

캡시에이트 또는 이의 염을 유효성분으로 하는 알러지성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing and treating allergic disease comprising capsiate or salt thereof as an active ingredient}

본 발명은 캡시에이트 또는 이의 염을 유효성분으로 하는 알러지성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 화학식 1로 표시되는 캡시에이트 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 하는 알러지성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 알러지성 피부질환 예방 및 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

캡시에이트(capsiate)는 캡사이신(capsaicin) 유사체의 일종으로 맵지 않은 고추 품종인 CH19 Sweet에서 주로 발견되는 캡사이시노이드(capsaicinoid)의 일종이다. 캡시에이트도 캡사이신 수용체를 활성화하여, 체지방 축적억제 등 캡사이신과 동등한 효능을 나타내지만, 맵지 않은 특성을 지녀 이의 기작에 대해 여러 가지 연구가 진행되고 있으나, 아직 구체적인 성과는 얻지 못한 상태이다.

한편, 비만세포는 여러 가지 알러지 질환 즉, 알러지성 비염, 알러지성 아토피성 피부염, 알러지성 결막염, 알러지성 천식, 음식 알러지 및 아나필락틱 쇼크(anaphylactic shock)등을 유발하는 체내 세포로 알려져 있다. 이들 세포는 세포표면에 알러지를 유발하는 항체인 immunoglobulin E (IgE)에 대한 수용체 Fc epsilon Receptor 1 (FcεRI)를 가지고 있고, 제1형 알러지 반응을 매개하는 주요한 효과세포로서 이 수용체와 결합한 항체에 항원이 접하게 되면 알러지 반응이 활성화 된다. 알러지를 치료하는 다양한 방법들이 존재하나, 현재 대부분의 알러지 치료는 그 원인을 없애기보다는 증상을 완화하는 방향으로 연구가 진행되고 있다.

대표적으로 알러젠에 의해 비만세포 등에서 분비된 히스타민이나 류코트리엔 등의 수용체에 대한 길항약들이 주를 이루고 이러한 약물들이 거대한 시장을 이루고 있다. 그러나, 이러한 약물은 환자에게 투여 후 단기간 내에 내성을 보이기 때문에 일정기간 지난 후 혹은 반복 투여 시 환자들의 증상을 호전시키지 못하는 경우가 많다. 따라서, 항히스타민제 등의 부작용이 없는 알러지 치료제 개발을 요구하고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 캡시에이트의 생리적 기능에 대해서 연구하던 중 이들이 비만세포(mast cell)의 활성에 의한 알러지 반응을 억제하는 새로운 기능을 한다는 점을 발견하여 캡시에이트를 포함하는 알러지성 피부질환의 예방 및 치료용 조성물을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 캡시에이트 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 하는 알러지성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 캡시에이트(capsiate) 또는 이의 염을 유효성분으로 하는 알러지성 피부질환 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 캡시에이트 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 하는 알러지성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 캡시에이트(capsiate) 또는 이의 염을 유효성분으로 하는 알러지성 피부질환 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 캡시에이트 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 하는 알러지성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 캡시에이트는 화학식 1의 구조를 가지며, 천연으로부터 분리 정제하거나, 상업적으로 구입하여 사용하거나 또는 당 업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있다.

<화학식 1>

바람직하게, 캡시에이트는 천연으로부터 분리 정제될 수 있다. 더욱 바람직하게는 맵지 않은 고추 품종인 CH19 Sweet로부터 분리 정제될 수 있다. 본 발명에 따른 캡시에이트는 유기용매 추출 및 크로마토그래피 등의 당업계에서 통상적으로 사용되는 공지의 방법에 의해 추출될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 활성화된 HMC-1 cells (Human mast cell line)에서 사이토카인(cytokine) 증가에 대한 캡시에이트(capsiate)의 억제 효과를 살펴보았다. 그 결과, 활성화된 HMC-1 cells에서 증가된 cytokine IL-6 및 TNF-α의 발현이 캡사이신을 처리한 경우 증가하였으나 캡시에이트를 처리하는 경우 감소하였다.

또한, 상기 캡사이신은 알러지 반응을 유도하는 물질로 알려져 있으며, 활성화된 HMC-1 cells에서 cytokine IL-6 및 TNF-α의 발현을 더욱 증가 시키는 것을 본 발명의 일 실시예에서 확인하였다. 이에 캡시에이트가 활성화된 HMC-1 cells에서 항 알러지 효과를 가지고 있음을 알 수 있었다(실시예 1, 도 1 및 도 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는 활성화된 BMMC (Mouse bone marrow derived mast cells)에서 사이토카인(cytokine) 증가에 대한 캡시에이트의 억제 효과를 살펴보았다. 그 결과, 활성화된 BMMC에서 증가된 cytokine IL-6 및 TNF-α의 발현이 캡사이신을 처리한 경우 증가하였으나 캡시에이트를 처리하는 경우 감소하였다.

또한, 상기 캡사이신은 알러지 반응을 유도하는 물질로 알려져 있으며, 활성화된 BMMC에서 cytokine IL-6 및 TNF-α의 발현을 더욱 증가 시키는 것을 본 발명에서 확인하였다. 이에 캡시에이트가 활성화된 BMMC에서 항 알러지 효과를 가지고 있음을 알 수 있었다(실시예 2, 도 3 및 도 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 마우스에서 DNFB로 유도되는 아토피성 피부염에 대한 캡시에이트의 억제 효과를 살펴보았다. 상기 DNFB (2,4-dinitro-1-fluorobenzene)는 Nc/Nga 생쥐에서 아토피성 피부염을 일으키는 물질로 알려져 있어, 아토피성 피부염 유발 물질로 처리하였다. 그 결과, 마우스에서 DNFB로 유도된 아토피성 피부염이 캡시에이트에 의해 억제되는 것을 확인 할 수 있었다(실시예 3, 도 5 및 도 6 참조). DNFB로 유도된 아토피성 피부염 마우스 모델에서 캡시에이트의 혈청 IgE 수준 감소 효과 또한 본 발명의 실시예에서 확인되었다(실시예 4 및 도 7 참조). 상기 혈청 IgE는 혈청 면역단백질로써, 주로 알러지 질환 및 면역 질환에 의해 수치가 높아지며, 비만세포(mast cell)를 자극하여 히스타민을 분비시키는 물질로 알려져 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 마우스 아토피성 피부염 부위에서 캡시에이트의 사이토카인(cytokine) 및 케모카인(chemokine) 억제 효과를 살펴보았다. 그 결과, DNFB에 의해서 유발된 마우스 아토피성 피부염 부위에서 증가된 사이토카인 IL-4 및 TSLP의 발현과 케모카인 CCL11, CCL17 및 CCL22의 발현이 캡시에이트를 처리하는 경우 감소하는 것을 확인하였다(실시예 5, 도 8 및 도 9 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 아토피성 피부염 마우스 모델에서 캡시에이트의 Th2 cell 분화 억제 효과를 살펴보았다. Th2 cell의 분화는 면역과민반응 상태에서 일어나는 것으로, 본 발명에서 DNFB로 유도된 아토피성 피부염 마우스 모델에서 spleen 과 lymph node 내 Th2 cell의 분화가 캡시에이트에 의해 억제되는 것을 알 수 있었다(실시예 6, 도 10 및 도 11 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 캡시에이트의 수동피부과민증(PCA; Passive Cutaneous anaphylaxis) 억제 효과를 살펴보았다. 그 결과, IgE로 유도되는 마우스 귀의 부종이 캡시에이트에 의해 억제되는 것을 확인 할 수 있었다(실시예 7 및 도 12 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 활성화된 BMMC에서 캡시에이트의 염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 발현 억제 효과를 살펴보았다. 그 결과, IgE에 의해 활성화된 BMMC에서 증가된 cytokine IL1-β, IL-6 및 TNF-α의 발현이 캡시에이트에 의해 억제되는 것을 확인 할 수 있었다(실시예 8 및 도 13 참조).

따라서, 본 발명은 캡시에이트 또는 이를 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 알러지성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 캡시에이트는 그 자체 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기에서 ‘약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말하며, 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산은 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탄산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한, 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명에 따른 화합물이 적용될 수 있는 알러지성 질환은, 이에 제한되지는 않으나, 아토피성 피부염, 담마진, 비만세포증, 알러지성 피부질환, 기관지천식, 알러지성 비염 및 알러지성 점막염 등을 포함한다.

아울러, 상기 알러지성 피부질환은 이에 한정되지는 않으나, 아토피성 피부염, 알러지성 피부염, 알러지성 접촉성 피부염, 습진, 비만세포증, 두드러기, 중독진, 약진, 홍반성 낭창 및 피부 육아종성 질환 등을 포함한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 캡시에이트 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로 부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 ‘경피투여’란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말하다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

본 발명의 캡시에이트의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 경구 투여용 제제의 경우, 본 발명의 캡시에이트의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.000001 ㎍ 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 ㎍ 내지 100 mg일 수 있다. 비경구 투여용 제제의 경우, 본 발명의 캡시에이트의 바람직한 전체 용량은 1일당 0.000001-1000mM의 캡시에이트를 환부에 도포할 수 있다. 그러나 상기 캡시에이트의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 캡시에이트를 알러지성 질환의 예방 또는 치료제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정 할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

또한, 본 발명은 캡시에이트(capsiate) 또는 이의 염을 유효성분으로 하는 알러지성 피부질환 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 본 발명의 화장료 조성물은 캡시에이트(capsiate) 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하며 피부학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 기초 화장품 조성물(화장수, 크림, 에센스, 클렌징폼 및 클렌징 워터와 같은 세안제, 팩, 보디오일), 색조 화장품 조성물(화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스), 두발 제품 조성물(샴푸, 린스, 헤어컨디셔너, 헤어젤) 및 비누 등의 형태로 제조될 수 있다.

상기 부형제로는 이에 한정되지는 않으나 예를 들어, 피부연화제, 피부 침투 증강제, 착색제, 방향제, 유화제, 농화제 및 용매를 포함할 수 있다. 또한, 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제 및 보습제 등을 추가로 포함 할 수 있으며, 물성개선을 목적으로 점증제, 무기염류, 합성 고분자 물질 등을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화장료 조성물로 세안제 및 비누를 제조하는 경우에는 통상의 세안제 및 비누 베이스에 캡시에이트(capsiate) 또는 이의 염을 첨가하여 용이하게 제조할 수 있다. 크림을 제조하는 경우에는 일반적인 수중유적형(O/W)의 크림베이스에 캡시에이트(capsiate) 또는 이의 염을 첨가하여 제조할 수 있다. 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등과 물성개선을 목적으로 한 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 추가로 첨가할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 함유되는 캡시에이트(capsiate) 또는 이의 염의함량은 이에 한정되지 않지만 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 50 중량%인 것이 바람직하고, 0.01 내지 5 중량%인 것이 더욱 바람직하다. 상기 함량이 0.0001 중량% 미만에서는 목적하는 알러지성 피부 트러블 예방 및 개선 효과를 기대할 수 없고, 10 중량% 초과하는 경우 사용량 만큼의 효과가 없다.

따라서 본 발명은 캡시에이트 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 하는 알러지성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 알러지성 피부질환 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 알러지성 질환의 예방 및 치료의 목적으로 사용할 수 있다.

도 1은 활성화된 HMC-1 cells (Human mast cell line)에서 사이토카인(cytokine) 증가에 대한 캡시에이트(capsiate)의 억제 효과를 Real time PCR 결과로 나타낸 것이다(A : IL-6; B : TNF-α).
도 2는 활성화된 HMC-1 cells (Human mast cell line)에서 사이토카인(cytokine) 증가에 대한 캡시에이트(capsiate)의 억제 효과를 ELISA 결과로 나타낸 것이다(A : IL-6; B : TNF-α).
도 3은 활성화된 BMMC (Mouse bone marrow derived mast cells)에서 사이토카인(cytokine) 증가에 대한 캡시에이트의 억제 효과를 Real time PCR 결과로 나타낸 것이다(A : IL-6; B : TNF-α).
도 4는 활성화된 BMMC (Mouse bone marrow derived mast cells)에서 사이토카인(cytokine) 증가에 대한 캡시에이트의 억제 효과를 ELISA 결과로 나타낸 것이다(A : IL-6; B : TNF-α).
도 5는 마우스에서 DNFB(2,4-dinitro-1-fluorobenzene)로 유도되는 아토피성 피부염에 대한 캡시에이트의 억제 효과를 나타낸 것이다(A : DNFB 투여방법; B : 마우시 실험 결과 사진).
도 6은 마우스에서 DNFB(2,4-dinitro-1-fluorobenzene)로 유도되는 아토피성 피부염에 대한 캡시에이트의 억제 효과를 나타낸 것이다(A : 조직염색 결과; B : 표피두께).
도 7은 DNFB로 유도되는 아토피성 피부염 마우스 모델에서 캡시에이트의 혈청 IgE 수준 감소 효과를 나타낸 결과이다.
도 8은 마우스 아토피성 피부염 부위에서 캡시에이트의 사이토카인(cytokine) 발현 억제 효과를 Real time PCR 결과로 나타낸 것이다(A : IL-4; B : TSLP).
도 9는 마우스 아토피성 피부염 부위에서 캡시에이트의 케모카인(chemokine) 발현 억제 효과를 Real time PCR 결과로 나타낸 것이다(A : CCL11; B : CCL17; C : CCL22).
도 10은 아토피성 피부염 마우스 모델의 lymph node에서 캡시에이트의 Th2 cell 분화 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 11은 아토피성 피부염 마우스 모델의 spleen에서 캡시에이트의 Th2 cell 분화 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 12는 캡시에이트의 수동피부과민증(PCA; Passive Cutaneous anaphylaxis) 억제 효과를 모세혈관 투과성과 마우스 귀 두께를 측정하여 나타낸 결과이다(A : 실험방법; B: 마우스 귀 사진; C : 모세혈관 투과성; D : 귀 두께).
도 13은 활성화된 BMCC에서 캡시에이트의 전염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 발현 억제 효과를 나타낸 결과이다(A : IL-1β; B : IL-6; C : TNF-α).

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

활성화된 HMC-1 cells (Human mast cell line)에서 사이토카인(cytokine) 증가에 대한 캡시에이트(capsiate)의 억제 효과

<1-1> 세포 배양 및 활성화

본 실험에 사용한 HMC-1 cells (Human mast cell line)은 IMDM 배지에 100 U/ml penicillin, 100 lg/ml streptomycin, and 10% heat-inactivated FBS를 혼합하여 37℃의 온도, 5% CO2 환경의 incubator에서 배양하였다. 세포의 활성화에는 A23187 및 PMA를 사용하였다.

<1-2> Real-time PCR 분석

활성화된 HMC-1 세포의 사이토카인 증가에 대한 캡시에이트의 억제효과를 알아보기 위해, 활성화된 HMC-1 세포에 캡시에이트 및 캡사이신을 50 농도로 37℃에서 4시간 처리하여 사이토카인 IL-6 및 TNF-α의 전사체 발현을 Real-time PCR을 통해 확인 하였다. Total RNA는 RNeasy Mini kit (Quiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 HMC-1 세포로부터 분리하였고, first strand cDNA는 QuantTect Reverse Transcription kit (Quiagen, Germany)를 이용하여 합성하였다. Real-time PCR은 KAPA SYBR fast qPCR kit (KAPA BIosystems, Woburn, MA, USA)를 사용하였으며, 95℃에서 10분, 95℃에서 20초간 50번 반복, 55℃에서 30초, 72℃에서 20초 순서의 조건으로 수행하였다. 유전자 발현 수준은 GAPDH 발현 수준을 표준으로 하였다. 또한 IL-6 및 TNF-α의 primer 세트는 QIAGEN으로부터 구입하였다.

그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이, IL-6 및 TNF-α의 발현이 캡사이신을 처리한 군에서는 증가하지만 캡시에이트를 처리한 군에서는 유의적인 감소효과를 나타냈다.

<1-3> ELISA 분석

활성화된 HMC-1 세포의 사이토카인 증가에 대한 캡시에이트의 억제효과를 알아보기 위해, 활성화된 HMC-1 세포에 캡시에이트 및 캡사이신을 50 농도로 37℃에서 16시간 처리하여 사이토카인 IL-6 및 TNF-α의 발현량을 ELISA 분석을 통해 확인 하였다. Plate에 capture antibody를 넣고 4℃에서 overnight 한다. 다음날, capture antibody는 PBS/Tween buffer로 세척하고, blocking buffer를 넣어 실온에서 1시간 반응한다. Blocking buffer를 세척하고 standard 및 sample 배양액을 넣고 4℃에서 overnight 한다. 다음날, 세척하여 detection antibody를 넣고 실온에서 1시간 반응시킨다. 다시 세척하고 Streptavidin-HRP을 넣고 실온에서 30분 반응한다. 다시 세척한뒤, 기질로 TMB를 넣고 stop solution을 넣어준 상태에서 ELISA reader로 흡광도를 측정한다.

그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, 캡사이신을 처리한 군에서는 IL-6 및 TNF-α가 증가하지만, 캡시에이트 처리 군에서는 유의적인 감소효과를 나타냈다.

<실시예 2>

활성화된 BMMC (Mouse bone marrow derived mast cells)에서 사이토카인( cytokine ) 증가에 대한 캡시에이트의 억제 효과

<2-1> 세포 배양 및 활성화

8주 내지 10주의 old C57/BL/6 마우스의 경골 및 대퇴골에서 Bone marrow cell을 얻어, 10% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin이 혼합된 RPMI 1640 배지에 mIL-3 (10 ng/ml) 및 mSCF (50 ng/ml)를 첨가하여 37℃의 온도, 5% CO₂ 환경의 incubator에서 6주간 배양하였다. 배양한 세포는 FACS 분석을 통해 mast cells (CD117 (c-kit) 및 FceRI positive) 97% 이상인 것을 확인하였다. BMMC의 활성화는 anti-mouse DNP-IgE 1 μg/ml 를 처리하여 overnight 하고, 10 ng/ml DNP-HSA를 6시간 내지 24시간 처리하였다.

<2-2> Real time PCR

활성화된 BMMC의 사이토카인 증가에 대한 캡시에이트의 억제효과를 알아보기 위해, 활성화된 BMMC에 캡시에이트 50 농도로 37℃에서 4시간으로 처리하여 사이토카인 IL-6 및 TNF-α의 전사체 발현을 Real-time PCR을 통해 확인 하였다. Total RNA는 RNeasy Mini kit (Quiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 BMMC로부터 분리하였고, first strand cDNA는 QuantTect Reverse Transcription kit (Quiagen, Germany)를 이용하여 합성하였다. Real-time PCR은 KAPA SYBR fast qPCR kit (KAPA BIosystems, Woburn, MA, USA)를 사용하였으며, 95℃에서 10분, 95℃에서 20초간 50번 반복, 55℃에서 30초, 72℃에서 20초 순서의 조건으로 수행하였다. 유전자 발현 수준은 GAPDH 발현 수준을 표준으로 하였다. 또한 IL-6 및 TNF-α의 primer 세트는 QIAGEN으로부터 구입하였다.

그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, IL-6 및 TNF-α의 발현이 캡사이신을 처리한 군에서는 증가하지만 캡시에이트를 처리한 군에서는 유의적인 감소효과를 나타냈다.

<2-3> ELISA

활성화된 BMMC의 사이토카인 증가에 대한 캡시에이트의 억제효과를 알아보기 위해, 활성화된 BMMC에 캡시에이트를 50 농도로 37℃에서 16시간으로 처리하여 사이토카인 IL-6 및 TNF-α의 발현량을 ELISA 분석을 통해 확인 하였다. Plate에 IL-6 혹은 TNF-α의 capture antibody를 넣고 4℃에서 overnight 한다. 다음날, capture antibody는 PBS/Tween buffer로 세척하고, blocking buffer를 넣어 실온에서 1시간 반응한다. Blocking buffer를 세척하고 standard 및 sample 배양액을 넣고 4℃에서 overnight 한다. 다음날, 세척하고 IL-6 혹은 TNF-α의 detection antibody를 넣고 실온에서 1시간 반응시킨다. 다시 세척하고 Streptavidin-HRP을 넣고 실온에서 30분 반응한다. 다시 세척한 뒤, 기질로 TMB를 넣고 stop solution을 넣어준 상태에서 ELISA reader로 흡광도를 측정한다.

그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이, 캡사이신을 처리한 군에서는 IL-6 및 TNF-α가 증가하지만, 캡시에이트 처리 군에서는 유의적인 감소효과를 나타냈다.

< 실시예 3>

마우스에서 DNFB (2,4- dinitro -1- fluorobenzene )로 유도되는 아토피성 피부염에 대한 캡시에이트의 억제 효과

<3-1> DNFB 및 캡시에이트의 처리방법

DNFB를 아세톤과 올리브 기름이 3:1로 혼합된 vehicle에 0.15%로 희석하여 감작하고, 0.2% DNFB용액을 2번 처리하여 아토피 피부염을 유발하였다. 켑시에이트 처리군은 DNFB 처리 1시간 전에 아세톤에 녹인 1mM 켑시에이트를 도포하였다(도 5 참조).

<3-2> 조직염색 및 표피두께 측정

아토피 피부염이 유도된 피부 조직을 절취한 후 4% formaldehyde에 24시간동안 고정시키고, 수세, 탈수한 다음 파라핀 블록을 만들어 조직을 0.5μm의 두께로 절편을 만들었다. 절편된 조직은 xylene으로 파라핀을 제거한 후 알코올로 침수하고 hematoxyline 과 eosin으로 염색하였다. 염색 후 조직은 위상차 현미경을 이용하여 관찰하였다. 표피의 두께는 조직 사진 상에서 5군데의 표피두께를 재어 평균과 표준편차를 구한 후 그래프로 나타냈다.

그 결과, 도 6에서 보는 바와 같이, DNFB에 의해 증가된 표피 두께가 캡시에이트에 의해 감소되는 것을 확인할 수 있다.

< 실시예 4>

DNFB 로 유도되는 아토피성 피부염 마우스 모델에서 캡시에이트의 혈청 IgE 수준 감소 효과

Plate에 IgE capture antibody를 넣고 4℃에서 overnight 하였다. 다음날, capture antibody는 PBS/Tween buffer로 세척하고, blocking buffer를 넣어 실온에서 1시간 반응하였다. Blocking buffer를 세척하고 IgE standard 및 마우스 혈청을 넣고 4℃에서 overnight 하였다. 다음날, 세척하여 IgE detection antibody를 넣고 실온에서 1시간 반응시켰다. 다시 세척하고 Streptavidin-HRP을 넣고 실온에서 30분 반응하였다. 다시 세척한 뒤, 기질로 TMB를 넣고 stop solution을 넣어준 상태에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 7에서 보는 바와 같이, DNFB에 의해 증가된 IgE가 캡시에이트에 의해 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 5>

마우스 아토피성 피부염 부위에서 캡시에이트의 사이토카인( cytokine ) 및 케모카인( chemokine ) 억제 효과

<5-1> 사이토카인 억제 효과

마우스의 아토피성 피부염 부위에서 캡시에이트의 사이토카인 억제효과를 확인하였다. DNFB와 캡시에이트의 투여 농도는 상기 실시예 <3-1>에서와 동일한 방법으로 시행하였으며, 사이토카인 IL-4 및 TSLP의 전사체 발현을 Real-time PCR을 통해 확인 하였다. Real-time PCR의 반응 조건은 상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 시행하였고, primer 세트는 QIAGEN으로부터 구입하였다.

그 결과, 도 8에서 보는 바와 같이, DNFB에 의해 증가된 사이토카인 발현이 캡시에이트에 의해 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

<5-2> 케모카인 억제 효과

마우스의 아토피성 피부염 부위에서 캡시에이트의 케모카인 억제효과를 확인하였다. DNFB와 캡시에이트의 투여 농도는 상기 실시예 <3-1>에서와 동일한 방법으로 시행하였으며, 케모카인 CCL11, CCL17 및 CCL22의 전사체 발현을 Real-time PCR을 통해 확인 하였다. Real-time PCR의 반응 조건은 상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 시행하였고, primer 세트는 QIAGEN으로부터 구입하였다.

그 결과, 도 9에서 보는 바와 같이, DNFB에 의해 증가된 케모카인 발현이 캡시에이트에 의해 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 6>

아토피성 피부염 마우스 모델에서 캡시에이트의 Th2 cell 분화 억제 효과

<6-1> Lymph node

림프구를 마우스에서 떼어낸 후 single cell suspension을 만든 후 anti-CD3 항체가 붙어있는 plate에 anti-CD28 항체를 3μg/ml 넣은 후 3일간 배양한다. 3일째 되는 날 PMA(20ng/ml) 와 ionomycin(1μM)를 첨가하고 5시간 배양한 후 세포들을 모아서 Cytofix/Cytoperm kit (BD bioscience)와 anti-CD4 antibody, anti-IL-4 antibody, 그리고 anti-IL-5 antibody (BD bioscience)를 이용하여 intracelluar staining을 하였다. DNFB와 캡시에이트의 투여 농도는 상기 실시예 <3-1>에서와 동일한 방법으로 시행하였다.

그 결과, 도 10에서 보는 바와 같이, Lymph node에서 DNFB에 의해 증가된 Th2 cell의 분화가 캡시에이트에 의해 억제되는 것을 확인 할 수 있었다.

<6-2> Spleen

비장을 마우스에서 떼어낸 후 single cell suspension을 만든 후 anti-CD3 항체가 붙어있는 plate에 anti-CD28 항체를 3μg/ml 넣은 후 3일간 배양한다. 3일째 되는 날 PMA(20ng/ml) 와 ionomycin(1μM)를 첨가하고 5시간 배양한 후 세포들을 모아서 Cytofix/Cytoperm kit (BD bioscience)와 anti-CD4 antibody, anti-IL-4 antibody, 그리고 anti-IL-5 antibody (BD bioscience)를 이용하여 intracelluar staining을 하였다. DNFB와 캡시에이트의 투여 농도는 상기 실시예 <3-1>에서와 동일한 방법으로 시행하였다.

그 결과, 도 11에서 보는 바와 같이, 비장에서 DNFB에 의해 증가된 Th2 cell의 분화가 캡시에이트에 의해 억제되는 것을 확인 할 수 있었다.

< 실시예 7>

캡시에이트의 수동피부과민증 ( PCA ; Passive Cutaneous anaphylaxis ) 억제 효과

캡시에이트의 수동피부과민증 억제 효과를 모세혈관 투과성과 마우스 귀 두께를 측정하여 확인하였다. 모세혈관 투과성은 파란색 염색약인 Evan's blue를 항원과 같이 섞어 정맥주사 하여, 귀의 모세혈관으로부터 피부조직으로 나온 염색약을 정량화하여 확인하였다. 정량화는 귀 조직을 잘라서 formamide에 넣고 65℃에서 16시간 incubation 하여 귀 조직에 있는 Evan's blue를 추출하여 흡광도를 측정하는 방법으로 시행하였다. 마우스의 귀 두께는 D15에 ear thickness guage로 귀의 두께를 측정하였다.

그 결과, 도 12에서 보는 바와 같이, DNP IgE에 의해 증가되는 모세혈관 투과성 및 귀의 부종이 캡시에이트에 의해 억제되는 것을 확인 할 수 있었다.

< 실시예 8>

활성화된 BMCC 에서 캡시에이트의 염증성( pro - inflammatory ) 사이토카인 발현 억제 효과

캡시에이트의 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 IgE 항원으로 유도된 BMCC에서 확인하였다. 사이토카인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 전사체 발현은 Real-time PCR을 통해 확인 하였다. Real-time PCR의 반응 조건은 상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 시행하였고, primer 세트는 QIAGEN으로부터 구입하였다.

그 결과, 도 13에서 보는 바와 같이, IgE 항원에 의해 증가된 케모카인 발현이 캡시에이트에 의해 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 캡시에이트 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 하는 알러지성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 알러지성 피부질환 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 알러지성 질환의 예방 및 치료의 목적으로 사용할 수 있다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 캡시에이트(capsiate) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 하는 알러지성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.

<화학식 1>
제1항에 있어서, 상기 알러지성 질환은 비만세포(mast cell)의 활성에 의한 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 알러지성 질환은 아토피성 피부염, 담마진, 비만세포증, 알러지성 피부질환, 기관지천식, 알러지성 비염 및 알러지성 점막염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서, 상기 알러지성 피부질환은 아토피성 피부염, 알러지성 피부염, 알러지성 접촉성 피부염, 습진, 비만세포증, 두드러기, 중독진, 약진, 홍반성 낭창 및 피부 육아종성 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 캡시에이트(capsiate) 또는 이의 염을 유효성분으로 하는 알러지성 피부질환 예방 및 개선용 화장료 조성물.

<화학식 1>