KR20150126343A - 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 운동-유도 전신 염증을 예방하고, 감소시키기거나 최소화 및/또는 강한 운동으로부터 회복을 촉진하는데 과일 추출물 및 선택적으로 다른 특정 영양소의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이런 과일 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

조성물{COMPOSITIONS}
본 발명은 운동-유도 전신 염증을 예방하고 강한 운동으로부터 회복을 촉진하는데 사용될 수 있는 과일 추출물 또는 과일 추출물의 조합 및 다른 특정 영양소를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
임의의 운동 요법을 지속하는 것은 심리적 서약 및 육체적 능력 둘 다를 필요로 한다.
진행 중인 신체 능력의 크기는 운동 요법에 의해 몸에 가해진 스트레스에 대한 몸의 탄성력, 즉 이런 스트레스에 작용으로부터의 회복 속도에 의해 (지속적 손상의 부존재하에서) 주로 측정된다.
운동으로부터의 회복은 여러 신체적 과정을 필요로 한다. 여러 신체적 과정은 손상된 근육 조직의 회복; 근육 글리코겐 저장소의 재충전; 운동 동안 근육 또는 다른 조직에 축적되는 신진대사의 부산물 제거; 및 운동 동안 발생하는 염증에 대한 반응 및 염증의 하향 조절을 포함한다.
일부 운동-유도 염증은 완전 회복에 필수적이다. 예를 들어 운동 동안 사용된 근육 그룹 내 국소화된 염증 시그널링은 근육 손상의 부위로 백혈구의 보충을 도와서 치료 과정을 돕는다.
그러나 일부 형태의 운동은 전신 염증을 유도할 수 있고, 이는 치료에 대한 자극이 아니라 특히 반복된 운동 시간 동안 지속되는 경우, 회복하는 신체 능력을 감소시키고 일부 생물학적 시스템을 불필요하고 잠재적으로 위험한 스트레스 하에 놓이게 하는 해로운 전신 염증 부담으로 작용한다.
임의의 운동 양식은 운동의 강도가 충분한 경우 이런 전신 염증을 일으킬 수 있다. 대략 60% VO2max 초과에 해당하는 강도에서 실행된 임의의 운동을 의미하는 강한 운동은 지혈 시스템의 활성화가 매우 빠르게 동반된다. 지혈 시스템은 혈소판과 응고 인자를 포함하며 혈소판과 응고 인자 모두는 60% VO2max 초과의 운동 강도에 의해 활성화된다. 이들의 활성화는 트롬빈의 발생, 응혈성 및 친염증성 순환 미세입자의 방출, 순환성 백혈구의 활성화, 혈관 내피의 활성화, 이용가능한 질소 산화물의 감소 및 관련 혈관확장 및 IL-6와 같은 순환하는 염증성 마커의 증가를 초래한다.
순환하는 IL-6의 높은 수준은 더욱 강한 운동 후 근육 통증 및 이전 운동 시간으로부터 더 느린 회복과 연관이 있다.
이와 관련하여 본 발명자는 IL-6 및 관련 염증성 마커의 운동 유도 발생을 감소시킬 수 있는 물질은 운동으로부터 회복을 촉진하는데 잠재적으로 사용된다는 것을 알았다. 그러나 지혈 시스템을 억제하는 모든 물질이 혈소판, 응고 및 염증 마커 발생의 운동 유도 활성화에 영향을 미치지는 않는다는 것이 확립되어 있다. 혈소판 생산과 작용의 다른 단계에서 작용하는 여러 공지된 항-혈소판-응집제가 있으며, 예를 들어, 아스피린(아세틸살리실산)이 가장 널리 사용되고 연구된다. 그러나, 이런 항혈소판제는 지혈 시스템의 운동-유도 활성화를 억제하지 않는다. 이것은 장기간 항혈소판 치료를 받은 환자에서 입증되었고 규칙적인 운동 요법으로부터 이득을 얻을 수 있는 환자의 그룹 중에서 운동 금지에 대한 이유이다. 강한 운동 동안 혈소판의 주요 생물학적 활성제는 트롬빈과 에피네프린이며, 이에 대항하여 가장 일반적으로 사용된 항혈소판제는 매우 제한된 효과를 가진다. 함께 작용하는 트롬빈과 에피네프린은 혈소판 활성화를 위한 매우 중요한 시스템을 제공하며, 이는 비가역적이며 매우 빠르게 작용한다.
따라서 본 발명의 목적은 피험자에서 운동 유도 전신 염증을 치료, 감소, 최소화 또는 예방하며 따라서 피험자에서 운동으로부터의 회복을 촉진하는데 유용할 조성물을 확인하는 것이다.
본 발명의 제 1 양태에 따라 피험자에서 운동 유도 전신 염증을 치료, 감소, 최소화 또는 예방하는데 사용하기 위해 혈소판 응집을 억제하는 활성을 가진 가지과의 수용성 과일 추출물이 제공된다.
"예방하는"은 추출물이 운동 유도 염증이 발생하는 것을 멈출 것을 의미하며 또는 대안에서 운동 유도 염증의 심각성을 감소시키고; 운동 유도 염증의 개시를 지연하고; 또는 운동 유도 염증과 관련된 증상을 줄일 것을 의미한다.
"감소시키는"은 추출물을 섭취하지 않은 대조군 피험자와 비교할 때, 추출물이 운동 유도 염증의 심각성을 감소시키고; 운동 유도 염증의 개시를 지연하고; 또는 운동 유도 염증과 관련된 증상을 줄일 것을 의미한다.
"최소화하는"은 운동 유도 염증이 피험자에서 운동으로부터 회복을 지연하지 않을 정도로 감소될 것을 의미한다(비록 제거되지 않을 경우에도).
한 바람직한 실시태양에서, 추출물의 사용은 (추출물을 섭취하지 않은 대조군 피험자와 비교할 때) 피험자에서 운동으로부터 회복을 개선하거나 촉진한다.
회복 기간은 신경계, 내분비계 및 근골격계에 중요한 회복 작업을 실행하는 기회를 제공하는데 필수적이다. 근육계는, 예를 들어, 강한 수고 동안 손상된 세포를 회복하는데 시간을 필요로 한다. 근육은 또한 영양소를 신진대사하고, 글리코겐 저장소를 재충전하고 새로운 효소 및 에너지 생산 미토콘드리아를 합성하는데 시간을 필요로 한다. 회복 동안, 신경계는 가해진 스트레스에 적응하여 훈련 동안 사용된 특수 운동 근육 패턴을 더욱 잘 제어할 수 있다. 내분비계는 평형으로 되돌아가야 한다. 증가된 염증 부하는 이런 과정을 간섭할 수 있어서, 휴식 동안 훈련으로부터의 회복 정도를 감소시키며 잠재적으로 최대 운동 성과에 필수적인 훈련과 회복 사이에 균형을 무너뜨린다.
본 발명의 제 2 양태에 따라 피험자에서 운동으로부터 회복을 촉진하는데 사용하기 위해 혈소판 응집을 억제하는 활성을 가진 가지과의 수용성 과일 추출물이 제공된다.
본 발명자는 대부분의 항혈소판제(예를 들어, 아스피린)는 피험자에서 운동 유도 전신 염증을 치료 또는 예방하는데 비효과적이었고 또한 피험자에서 운동으로부터의 회복을 촉진하는데 비효과적이었다는 것을 발견하였다. 따라서 본 발명자는(WO2010/049707에 기술된 본 발명의 미세한 차이를 가진 국제특허출원 WO 99/55350에 개시된) 항혈소판 활성을 가진 공지된 수용성 토마토 추출물이 강한 운동을 자극하는 조건하에서 내피 IL-6 생산에 의해 정의된 대로 운동 유도 염증을 감소시키는데 효과를 나타내었다는 것을 발견하고 놀랐다.
WO2010/049707은 최적 항혈소판 활성을 가진 수용성 토마토 추출물을 생산하는 방법을 개시한다. 이런 수용성 추출물은 인간 실험에서 아데노신 다이포스페이트 및 콜라겐에 반응하여 혈소판 응집을 예방하거나 감소시키는 현저한 효과를 갖는 것이 발견되었고 심혈관 분야에서 건강 이익을 가진 영양 보충제로서, 유럽 식품 안전청이 유럽에서 식품 유용성 표시(health claim)를 승인하여 판매되었다.
본 발명자에 의해 생성된 새로운 데이터(실시예 참조)는 특히 강한 운동을 시작하기 전에 섭취될 때, 수용성 토마토 추출물(예를 들어, WO2010/049707에 개시된 대로 제조)은 또한 강한 운동 이후 운동 회복 시간을 감소시키고 회복 품질을 개선한다는 것을 나타낸다.
운동 유도 전신 염증의 예방은 강한 운동으로부터의 회복하는 피험자의 능력을 개선할 것을 알게 될 것이다.
과일 추출물은 강한 운동으로부터의 회복을 촉진하는데 사용되는 것이 바람직하다. "강한 운동"은 대략 60% VO2max 초과에 해당하는 강도에서 실행된 임의의 운동을 의미한다.
과일 추출물은 임의의 포유류 피험자에게 제공될 수 있고 예를 들어, 운동 또는 경주 후 말의 회복을 개선하기 위해) 수의사 관심의 동물을 치료하는데 용도를 가진다. 그러나 피험자는 인간 피험자인 것이 바람직하며 피험자는 위에서 정의한 대로 강한 운동을 실시하려고 하거나 방금 실시한 인간 피험자인 것이 더욱 바람직하다. 본 발명자는 추출물이 신체적으로 적합한 개인 특히 강한 운동으로부터 최적의 회복을 소망하는 훈련된 운동선수 또는 "엘리트" 운동선수에게 제공될 때 대부분의 효과를 가진다는 것을 발견하였다.
과일 추출물은 바람직하게는 활성 수용성 토마토 추출물(WSTC), 상당한 열 안정성 무색 수용성 화합물 또는 1000 미만의 분자량을 가진 혈소판 응집을 억제하는 활성을 가진 화합물을 함유하는 부분이다.
추출물은 껍질을 벗긴 과일의 과육 및/또는 과일의 근경을 둘러싸는 주스로부터 유래될 수 있다.
추출물은 과일의 주스를 필수적으로 포함할 수 있고 주스는 본 발명 및 WO99/55350 또는 WO2010/049707에서 논의된 대로 추가로 처리될 수 있다.
추출물은 토마토로부터 분리가능한 활성 부분일 수 있고 바람직하게는 다음을 특징으로 한다:
(a) 무색이거나 담황색이다;
(b) 수용성 화합물이다;
(c) 1000 미만의 분자량을 가진 구성요소로 이루어진다; 및
(d) 혈소판 응집 억제 활성을 가진 하나 이상의 뉴클레오시드를 함유한다.
바람직한 과일 추출물은 다음을 포함한다:
(a) 글리코실화 페놀산 또는 페놀 에스터 또는 이의 유도체;
(b) 글리코실화 플라보노이드; 및
(c) 뉴클레오시드.
글리코실화 페놀산 또는 페놀 에스터는 글리코실화 시남산 또는 이의 유도체일 수 있다. 이런 글리코실화 시남산 또는 이의 유도체는 카페오일-4-O-퀸산, 카페오일-4-O-글루코시드, 코우마로일-4-O-글리코시드(글루/갈) 및 코우마로일-4-O-글리코시드(다이사카라이드)로부터 선택될 수 있다.
글리코실화 페놀산 또는 페놀 에스터는 카페산 글루코시드; p-코우마르산 헥소스 / 다이하이드로카엠페롤 헥소스; 페룰산 글리코시드; 및 p-코우마르산 유도체로부터 선택될 수 있다.
글리코실화 플라보노이드는 쿠에르세틴-3-O-글루코시드 또는 루틴일 수 있다.
뉴클레오시드는 AMP, 우리딘, 아데노신, 구아노신 또는 GMP를 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
가장 바람직한 실시태양에서, 추출물은 WO99/55350 또는 WO2010/049707에 개시된 혈소판 응집을 억제하는 활성을 가진 임의의 추출물이다.
WO99/55350 및 특히 WO2010/049707은 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있는 추출물을 제조하는 바람직한 방법을 개시한다.
WO2010/049707은 도 2(과일로부터 액체/시럽 추출물을 제조하는 방법) 및 도 4(추출물로부터 제거한 당으로 분말을 제조하기 위해 추출물을 가공하는 방법)에서, 추출물 및 자체로 본 발명에 따라 사용될 수 있는 추출물을 생산하는 가장 바람직한 방법을 개시한다. 이런 추출물 및 이를 제조하는 방법은 참조로 본 발명에 포함된다.
본 발명자는 수용성 토마토 추출물 및 생물학적 조직에 의해 외생 질산 산화물로 전환할 수 있는 질산염을 포함하는 새로운 조성물을 생산하는 추가 개발 연구를 실시하였다.
본 발명자는 질산염과 과일 추출물의 조합이 본 발명의 제 1 또는 제 2 양태에 따라 특히 유용하다는 것을 발견하고 놀랐다. 본 발명자는 어떠한 가정에 한정되기를 원치 않으나 이런 조합은 효과적이라고 생각하는데 이는 트롬빈과 에피네프린에 의한 혈소판 활성화를 목표로 할 뿐만 아니라 내생 원료가 고갈되었을 경우 혈소판과 내피 세포를 위한 질산 산화물의 외생 원료를 제공하기 때문이다.
질산염으로 보충된 추출물은 본 발명의 중요한 특징을 제공한다. 따라서 본 발명의 제 3 양태에 따라 다음을 포함하는 조성물이 제공된다:
(a) 혈소판 응집을 억제하는 활성을 가진 가지과의 수용성 과일 추출물, 추출물은 다음을 포함한다:
(i) 1000 미만의 분자량을 가진 구성요소; 및
(ii) 뉴클레오시드; 글리코실화 페놀산 또는 페놀 에스터 또는 이의 유도체; 또는 혈소판 응집 억제 활성을 가진 글리코실화 플라보노이드의 하나 이상;
및
(b) 식용 질산염의 원료 또는 내생 질산 산화물의 전구체.
본 발명의 제 3 양태의 조성물에서 추출물(a)은 혈소판 응집을 억제하는 활성을 가진 가지과의 임의의 수용성 과일 추출물일 수 있다. 바람직하게는 추출물은 위에서 정의한 것 특히 WO99/55350 또는 WO2010/049707에 개시된 것이다.
본 발명의 이런 양태에 따른 조성물에 사용하기에 적합한 식용 질산염(b)의 원료는 신선한 과일 또는 채소 조직의 수성 추출물을 포함하며, 선택된 과일 또는 채소는 7.5g/l 초과 또는 약 7.5g/l 질산염 최종 추출물 농도를 생성하는데 충분하게 높은 질산염의 수준을 함유하는 것으로 알려져 있다. 이런 과일과 채소의 예들은 잎이 무성한 녹색 채소, 예를 들어, 시금치, 로켓(rocket), 양상추, 근대, 물냉이의 잎; 양배추(cabbage) 또는 케일(kale)와 같은 십자화과 채소; 딸기, 사과와 같은 과일 또는 대황 줄기를 포함한다.
식용 질산염의 원료는 신선한 또는 동결 건조 과일 또는 채소 조직으로부터 새롭게 제조될 수 있거나 과일 및 채소 주스 농축액과 같은 구입가능한 상품으로부터 얻을 수 있다. 이런 농축액은 제공된 질산염 함유량에 따라 사용된 복용량을 적정함으로써 질산염 함유량에 대해 표준화될 수 있다. 선택적으로 식용 질산염은 물의 첨가 후 신선한 식물 조직을 부드럽게 하고; 원심분리 또는 여과에 의해 펄프를 제거하고; 질산염의 분해를 피하도록 예를 들어 동결 건조, 저온 진공 건조 또는 저온 증발에 의해 저온에서 농축시켜 제조될 수 있다. 이런 제제의 질산염 함유량은 또한 표준화될 수 있다는 것을 알 것이다.
식용 질산염의 원료는 단독으로 사용될 수 있거나 다른 원료 재료로부터의 조합이 제조될 수 있다. 바람직한 조합의 예들은 스위스 근대 추출물 및 대황 줄기 추출물 또는 딸기 추출물, 대황 줄기 추출물 및 양상추 추출물이다.
식용 질산염의 원료는 액체 형태 또는 건조에 의한 물 제거 후 분말 형태로 사용될 수 있다. 식용 질산염 원료의 최종 형태로 존재하는 질산염의 최종 농도는 액체의 경우 7.5g/L - 100g/L 범위 또는 분말 형태의 경우 7.5g/kg - 80g/kg 범위일 수 있다. 최종 형태로 존재하는 질산염의 수준은 액체의 경우 150mg/L 또는 분말의 경우 150mg/kg를 초과하지 않아야 한다.
본 발명의 제 3 양태에 따른 조성물; 또는 상당한 수의 다른 성분이 상품에 포함되는 경우(아래 참조), 조성물을 포함하는 제품은 6.5g/l 미만 또는 6.5g/kg의 질산염을 함유하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 조성물 또는 제품은 약 400 내지 4500mg/l 또는 약 400 내지 4500mg/kg의 질산염을 포함한다. 한 실시태양에서, 조성물 또는 제품은 약 1.666g/l 또는 1.666g/kg 질산염을 포함한다.
여러 내생 질산 산화물의 전구체가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 이런 전구체는 신체 내에서 전환되어 질산염을 형성할 수 있다. 예는 시트룰린, 글루타민 및 아르기닌을 포함한다. 본 발명에 따라 사용하기에 가장 바람직한 전구체는 시트룰린이다.
본 발명의 제 3 양태에 따른 조성물은 제 3 구성요소(c)로서, 내생 질산 산화물 경로에서 보조인자로 작용하는 엽산 또는 이의 대사산물을 포함하는 것이 바람직하다. 엽산은 내피 세포에 의한 내생 질산 산화물 생산을 유지하는 보조인자이다. 본 발명자는 강한 운동을 모방하는 한 실험(실시예 참조)에서 질산 보충제 및 엽산의 혼합 효과는 혈소판 활성화 및 염증성 미세입자의 방출 모두의 억제를 현저하게 개선하였다는 것을 발견하였다. 또한 본 발명의 제 3 양태의 조성물은 수용성 토마토 추출물이 단독으로 사용될 때보다 활성화된 내피 세포에서 IL-6 생성의 더욱 큰 감소를 일으켰다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 엽산의 대사산물의 예는 5-메톡시테트라하이드로폴레이트 또는 테트라하이드로폴레이트를 포함한다.
제제에 사용하기에 적합한 내생 질산 산화물 경로에서 보조인자로 작용하는 엽산 또는 이의 대사산물의 원료는 통상적으로, 예를 들어 DSMK에 의해 공급된 엽산 BP/EP, 96% 순도인 약품 등급의 상업용 제제이다.
본 발명의 제 4 양태에 따라 피험자에서 운동 유도 전신 염증을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 본 발명의 제 3 양태에 따른 조성물이 제공된다.
본 발명의 제 5 양태에 따라 피험자에서 운동으로부터의 회복을 촉진하는데 사용하기 위한 본 발명의 제 3 양태에 따른 조성물이 제공된다.
본 발명의 제 3 양태에 따른 조성물은 본 발명의 제 1 및 제 2 양태와 관련하여 논의한 대로 및 아래 논의한 대로 사용될 수 있는 바람직한 조성물을 제공한다.
약학적 및 영양학적 제제
비록 바람직한 실시태양에서 추출물과 조성물은 아래 및 실시예 5에서 논의된 대로 다른 제제로 제제화되어, 이들의 상업적 특성을 개선(예를 들어, 전달, 저장수명, 맛 등을 개선)할 수 있지만 본 발명의 제 1 또는 제 2 양태에 따라 사용된 과일 추출물 또는 본 발명의 제 3 양태의 조성물은 임의의 추가 구성요소 없이 제조될 수 있다(예를 들어, 실시예 1 또는 2 참조).
본 발명의 과일 추출물 및 조성물은 경구 투여를 위해 제제화될 수 있다. 이와 같이, 이들은, 예를 들어, 겔, 용액, 현탁액, 시럽, 정제, 캡슐, 약용박하드롭스 및 스낵바, 음료, 인서트 및 패치로 제제화될 수 있다. 이런 제제는 당업계에 주지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 추출물 또는 조성물은 경구 투여를 위한 시럽 또는 다른 용액, 예를 들어, 건강 드링크로 형성될 수 있다. 당, 비타민, 풍미제, 착색제, 방부제 및 점증제로부터 선택된 하나 이상의 부형제가 이런 시럽 또는 용액에 포함될 수 있다. 염화나트륨 또는 당과 같은 긴장성 조절제가 첨가되어 등장액과 같은 특정 삼투압 강도의 용액을 제공할 수 있다. 완충제와 같은 하나 이상의 pH 조절제는 pH를 특정 값으로 조절하고 바람직하게는 그 값으로 유지하는데 사용될 수 있다. 완충제의 예는 시트르산 나트륨/시트르산 버퍼 및 인산염 버퍼를 포함한다.
선택적으로, 추출물 또는 조성물은 (예를 들어, 분무 건조 또는 동결 건조에 의해) 건조될 수 있고 건조 제품은 정제, 약용박하드롭스, 캡슐, 분말, 과립 또는 겔과 같은 고체 또는 반고체 제형으로 제제화될 수 있다.
추출물을 함유하는 조성물 또는 본 발명의 제 3 양태의 조성물은 고체 지지체; 예를 들어 수크로오스, 락토오스, 글루코오스, 프룩토오스, 만노오스와 같은 당 또는 자일리톨, 소르비톨 또는 만니톨과 같은 당 알코올; 또는 셀룰로오스 유도체 상에 흡착시킴으로써 제조될 수 있다. 다른 특히 유용한 흡착제는 밀가루 및 옥수수가루와 같은 곡물 가루인 전분-기초 흡착제를 포함한다.
정제 형성을 위해, 추출물 또는 조성물은 통상적으로 수크로오스 및 락토오스와 같은 당 및 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨과 같은 당 알코올; 분말 셀룰로오스 또는 미세결정 셀룰로오스 또는 카복시메틸 셀룰로오스와 같은 변형 셀룰로오스 또는 셀룰로오스 유도체와 같은 희석제와 혼합될 수 있다. 정제는 또한 통상적으로 과립화제, 접합제, 윤활제 및 분해제로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 함유할 것이다. 분해제의 예는 전분 및 전분 유도체 및 다른 팽창가능한 폴리머, 예를 들어 가교 카복시메틸셀룰로오스, 가교 폴리바이닐피롤리돈 및 전분 글리콜레이트와 같은 가교 폴리머 분해제를 포함한다. 윤활제의 예는 마그네슘 스테아레이트 및 스테아르산과 같은 스테아레이트를 포함한다. 접합제 및 과립화제의 예는 폴리바이닐피롤리돈을 포함한다. 희석제가 자연적으로 매우 달지 않은 경우, 예를 들어, 암모늄 글리시르히지네이트인 감미료 또는 아스파르탐 또는 소듐 사카리네이트와 같은 인공 감미료가 첨가될 수 있다.
추출물 또는 조성물은 분말, 과립 겔 또는 캡슐 속에 합체하기 위한 반고체로서 제제화될 수 있다. 분말 형태로 사용될 때, 추출물은 정제와 관련하여 위에서 정의한 부형제의 임의의 하나 이상과 함께 제제화될 수 있거나 희석되지 않은 형태로 제공될 수 있다. 겔 또는 반고체 형태로 제공하기 위해서, 건조 추출물 또는 조성물은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 점성 액체 또는 반고체 부형제 또는 예를 들어, 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜 또는 글리세롤과 같은 액체 담체 또는 예를 들어 올리브 오일, 해바라기 오일, 잇꽃 오일, 달맞이꽃 오일, 콩 오일, 대구 간 오일, 청어 오일 등과 같은 식물 오일 또는 생선 오일에 용해 또는 현탁될 수 있다. 그런 후에 이들은 경질 젤라틴 또는 연질 젤라틴 형태의 캡슐 또는 경질 또는 연질 젤라틴 등가물로 제조된 캡슐 속에 채워질 수 있고, 연질 젤라틴 또는 젤라틴-등가물 캡슐은 점성 액체 또는 반고체 충전물에 선호된다. 한 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 추출물 또는 조성물은 선택적으로 캡슐, 예를 들어 경질 젤라틴 캡슐 속에 혼합하기 위해 선호된 고체(예를 들어, 분말) 부형제와 함께 분말 형태로 제공된다.
본 발명의 고체 또는 반고체 제형은 제제의 최대 약 1000mg, 예를 들어 최대 약 800mg을 함유할 수 있다.
본 발명의 추출물 또는 본 발명의 제 3 양태에 따른 조성물은 혈소판 응집을 억제하는 활성을 가진 화합물의 정해진 농도를 함유하는 단위 제형 형태로 제공될 수 있다. 이런 단위 제형은 원하는 수준의 생물학적 활성을 얻도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 단위 제형은 본 발명에 따른 과일 추출물 또는 조성물의 최대 1000mg(건중량), 더욱 통상적으로 최대 800mg, 예를 들어, 50mg 내지 800mg, 예를 들어, 100mg 내지 500mg의 양을 함유할 수 있다. 단위 제형에 포함될 수 있는 추출물 또는 조성물의 구체적인 양은 50mg, 100mg, 150mg, 200mg, 250mg, 300mg, 350mg, 400mg, 450mg, 550mg, 600mg, 650mg, 700mg, 750mg 및 800mg으로부터 선택될 수 있다.
복용 요법
피험자에게 투여될 필요가 있는 본 발명의 제 1 양태에 따라 사용된 추출물 또는 본 발명에 따른 조성물의 양은 여러 인자에 의존할 것이다. 예를 들어 피험자가 인간일 때 필요한 양은 실행한 또는 실행될 운동의 형태; 운동의 지속기간; 사람의 건강상태 수준 및 피험자의 나이, 성별 및 체중과 같은 인자에 의존할 것이다.
방법 1.1(아래 실시예 1 참조)에 따라 제조된 액체 추출물의 경우, 본 발명에 따른 과일 추출물의 권장 일일 복용량은 0.5g 내지 20g 및 더욱 바람직하게는 2g 내지 7g이다. 일일 복용량은 약 3g일 수 있다. 사람에 대한 전통적인 복용 요법은 운동하는 각각의 날의 경우, 체중의 킬로그램당 약 70mg 내지 285mg, 바람직하게는 약 25mg 내지 100mg일 수 있다.
방법 1.2(아래 실시예 1 참조)에 따라 제조된 분말 추출물의 경우, 권장 일일 복용량은 10mg 내지 500mg 및 더욱 바람직하게는 약 85mg 내지 약 150mg이다. 사람에 대한 전통적인 복용 요법은 운동하는 각각의 날의 경우, 체중의 킬로그램당 약 1mg 내지 2.25mg일 수 있다.
본 발명의 제 3 양태에 따른 바람직한 조성물은 수용성 토마토 추출물(예를 들어, 이전 단락에서 논의된 양으로) 및 복용량 당 25mg 내지 250mg 질산염, 바람직하게는 복용량 당 50mg 내지 150mg 질산염 및 가장 바람직하게는 복용량 당 약 100mg 질산염을 제공하는 식용 질산염의 원료를 포함한다. 질산염이 낮은 아질산염 수준을 함유하는 조성물에 포함되는 것이 가장 바람직하다. 바람직하게는 조성물은 복용량 당 400mg 미만의 질산염을 포함한다.
본 발명의 제 3 양태에 따른 가장 바람직한 조성물은 수용성 토마토 추출물(예를 들어, 복용량 당 약 3g 액체 추출물의 양으로) 및 식용 질산염의 원료(예를 들어, 복용량 당 약 100mg 질산염) 및 엽산을 포함한다. 엽산은 복용량 당 10 내지 500㎍, 바람직하게는 복용량 당 50 내지 400㎍, 더욱 바람직하게는 복용량 당 10 내지 300㎍, 및 가장 바람직하게는 복용량 당 약 200㎍로 포함될 수 있다.
피험자는 운동 전에 추출물(및 선택적으로 질산염 및 엽산)의 복용량을 섭취하는 것이 바람직하다. 추출물(및 선택적으로 질산염 및 엽산)은 운동 전 어느 때나 경구로 소비되는 것이 바람직하다. 예를 들어 복용량은 운동이 오후 또는 저녁에 실행되는 경우 아침 또는 저녁 시간에 섭취될 수 있다. 바람직하게는 복용량은 운동 전 0 내지 5시간 및 더욱 바람직하게는 운동 전 1.5 내지 3시간에 섭취된다.
따라서 본 발명의 추가 양태에 따라 25mg 내지 250mg의 질산염을 포함하는 본 발명의 제 3 양태에 따른 조성물을 포함하는 제형이 제공된다.
제형은 약 100mg의 질산염을 포함하는 것이 바람직하다.
제형은 10㎍ 내지 500㎍의 엽산, 바람직하게는 복용량 당 50 내지 400㎍, 더욱 바람직하게는 복용량 당 10 내지 300㎍ 및 가장 바람직하게는 복용량 당 약 200㎍을 포함할 수 있다.
제형은 제목의 복용 요법에서 기술된 것과 같이 가지과의 수용성 과일 추출물을 포함할 수 있다.
사람 소비를 위한 바람직한 조성물
추출물 또는 조성물은 식품 보충제 또는 식품 첨가제로서 제공될 수 있거나 식품, 예를 들어, 기능성 식품 또는 식의약품 속에 혼합될 수 있다.
겔 제품
식품 보충제로서 소비하기 위한 수성 겔 제품은 본 발명에 따른 바람직한 조성물을 제공한다. 이런 겔은 포장되어 포장은 찢어서 개방되고 겔은 운동 전에 소비될 수 있다.
겔 제품은 상기한 대로 가지과의 수용성 과일 추출물을 함유한다. 바람직하게는 겔은 식용 질산염의 원료 또는 상기한 대로 내생 질산 산화물의 전구체를 포함하며 가장 바람직하게는 엽산 또는 이의 유도체를 포함한다. 겔 제품은 전해질, 탄수화물, 항산화제, 방부제, 풍미제 및 감미제 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
겔은 포장으로부터 압착되어 쉽게 소비될 알맞은 굳기를 가진 식용 겔을 형성하는 적절한 물질 또는 물질들을 포함해야 한다.
당업계에 공지된 여러 적절한 겔 물질이 사용될 수 있다. 예를 들어 겔란검(예를 들어, Kelcogel-F)이 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서 겔은 2개의 겔 물질을 포함한다. 예를 들어 겔은 겔란검 및 잔탄검을 포함할 수 있다.
바람직한 겔이 정의되고 WO2007/083117에 개시된 방법에 따라 제조된다(예를 들어, 명세서의 19 - 22 페이지에 기술). 본 발명에 다른 겔은 WO2007/083117에 개시된 대로 등장성일 수 있으나 본 발명에 따라 사용될 필요가 없다는 것을 알 것이다. 예를 들어 아래 및 실시예에서 논의된 바람직한 제품은 등장성이 아니다. 당업자는 제품의 강직성은 필요에 따라 쉽게 적응될 수 있다는 것을 알 것이다.
본 발명에 따라 사용하기에 가장 바람직한 겔 제품은 다음 범위의 성분을 가진다:
성분 양(g/L)
물 650-890
켈코겔-에프 1-3
시트르산 나트륨 0.2-0.8
소르브산 칼륨 0.1-0.5
벤조산 나트륨 0.1-0.5
사티아젠 CX911 1-3
아세설팜 K 0.2-0.5
수크랄로오스 0.05-1.2
시트르산 0.875-1.25
엽산 0.003
스위스 근대 주스 농축물 55-222
1.1에 따라 제조된 액체 추출물 50
풍미제 2-7
사람 운동선수에게 제공하기 위한 전형적인 복용량은 10-200ml의 상기 겔, 바람직하게는 20-150ml의 겔, 더욱 바람직하게는 30-100ml의 겔, 더욱 바람직하게는 40-80ml의 겔 및 가장 바람직하게는 약 60ml의 겔일 것이다.
여러 상기 성분은 경구 소비를 위한 겔을 제제화하는 기술분야의 당업자에 의해 조절되거나 치환될 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들어 말토덱스트린은 에너지 원으로 사용될 수 있고 이 경우에 물의 양은 50%까지 감소될 수 있다.
풍미제는 선택된 맛의 겔을 제조하도록 선택될 수 있다. 예를 들어 바람직한 겔은 바나나 및 망고 맛이다. 선택적으로 검은 건포도, 오렌지 또는 열대 풍미제가 사용될 수 있다.
분말 제품
본 발명에 따른 추출물 및 조성물은 또한 용액으로서 재구성하기 위해 분말로 제공될 수 있다. 이와 같이 이들은 또한 당과 같은 가용성 부형제, 시트르산염 및 인산염 버퍼와 같은 완충제를 함유할 수 있으며 탄산염, 예를 들어, 중탄산 나트륨 또는 암모늄과 같은 중탄산염 및 고체산, 예를 들어, 시트르산 또는 스트르산 염으로부터 형성된 발포제를 포함할 수 있다.
방법 1.2(아래)에 따라 제조된 분말 추출물은 바람직하게는 분말 제품에서 사용된다.
분말 믹스는 향주머니를 채우는데 사용될 수 있다. 바람직한 향주머니 믹스는 식용 질산염의 원료를 포함할 것이며 가장 바람직한 향주머니 믹스는 엽산을 포함할 것이다. 전형적인 향주머니 분말은 다음을 포함할 수 있다:
성분 양(g/kg)
시트르산 5-10
말토덱스트린 650-850
스위스 근대 분말 133-266
프룩토오스 20-30
풍미제 10-20
1.2에 따라 제조된 분말 추출물 3
수크랄로오스 0.5-1
엽산 0.004
이런 향주머니 믹스에 사용하기 위한 예시적 풍미제는 레몬과 베리 풍미제를 포함한다.
이런 향주머니 분말은 10-150g의 복용 단위, 더욱 바람직하게는 약 25-75g, 가장 바람직하게는 50g 질량으로 나뉘며 향주머니 내에 밀봉된다. 사용시에 분말은 50 내지 250ml의 물과 혼합될 수 있고 운동이 개시되기 전에 소비될 수 있다.
선택적으로 분말은 (예를 들어, 접합제의 선택적 사용에 의한 분말의 압축에 의해) 제제화되어 분산가능한 정제(또한 발포 정제로 알려짐)를 형성할 수 있다. 전형적인 분산가능한 정제는 다음 양으로 성분을 함유하도록 제조될 수 있다:
성분 양(g/kg)
전해질 염 0-300
시트르산 200-400
스위스 근대 분말 500-800
1.2에 따라 제조된 분말 추출물 15
엽산 0.017-0.023
수크랄로오스 0.5-1.0
풍미제 10-20
말토덱스트린 0-200
이런 정제는 1-30g, 바람직하게는 2-20g일 수 있으며 가장 바람직하게는 10g 정제로 제제화된다. 사용시에 10g 정제는 50 내지 250ml의 물에 용해될 수 있고 운동이 개시되기 전에 소비될 수 있다.
푸드 바
본 발명에 따라 사용된 추출물 또는 본 발명의 제 3 양태에 따른 조성물은 예를 들어 과일 바, 넛 바 및 시리얼 바와 같은 스낵 푸드 바 속에 혼합하기 위해 분말 형태로 제공될 수 있다. 스낵 푸드 바 형태로 제공하기 위해서, 추출물 또는 조성물은 햇빛 건조 토마토, 건포도 및 씨 없는 건포도, 땅콩 또는 귀리 및 밀과 같은 시리얼과 같은 건조 과일로부터 선택된 임의의 하나 이상의 성분과 미리 혼합될 수 있다.
바람직한 푸드 바는 다음 양으로 성분을 함유하도록 제조될 수 있다:
성분 양(g/kg)
혼합 과일 주스 35-80
스위스 근대 분말 83.3-333
말토덱스트린 100-200
귀리 50-150
락트산 칼슘 2-5
과일 플레이크 / 민스 50-300
쌀 / 콩 크리스피 50-300
1.1에 따라 제조된 액체 추출물 75
풍미제 5-10
수크랄로오스 0.5-1.0
엽산 0.005
풍미제는, 예를 들어, 사과 및 건포도, 초콜릿 또는 블루베리일 수 있다.
푸드 바의 크기는 변할 수 있고 이것은 여러 인자(바에 포함된 수용성 추출물 및 선택적으로 질산염 및 엽산의 양을 포함)에 의존할 것이라는 것을 알 것이다. 통상적으로 바는 10-200g, 바람직하게는 20-60g 및 가장 바람직하게는 약 40g일 수 있다. 푸드 바는 최적 효과를 위해 운동 이전 소비되어야 한다.
본 발명에 따른 추출물을 포함하는 가장 바람직한 제품은 실시예 5에서 정의된다.
본 발명의 추출물 또는 조성물 또는 이의 제제는 투여를 위한 지시와 함께 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
효과의 표시
유익한 효과를 제공하는 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 능력은 여러 다른 변수를 참조하여 평가될 수 있다.
아래 실시예는 혈소판 응집 또는 1차 지혈의 평가를 위해 적절한 프로토콜의 세부내용을 제공하며, 혈소판 응집 또는 1차 지혈의 각각은 치료 효과를 평가하기 위해 조사될 수 있다. 실시예에 기술된 PFA-100® 혈소판 기능 분석기는 1차 지혈의 평가를 위한 비교적 새로운 장치이나, 잘 평가되었다(예를 들어, "The platelet-function analyzer(PFA-100®) for evaluating primary hemostasis" by M. Franchini Hematology, Volume 10, Issue 3 June 2005, pages 177 - 181 참조).
트롬빈 생성 능력의 측정은 지혈 이상 또는 항혈전 치료의 효과의 평가를 위해 일반적으로 사용된 표준 프로토콜이며 자동 응고검사기에 의해 또는 수동으로 실행될 수 있다. 순환하는 세포-유래 미세입자는 응혈 능력 및 염증의 지표이며, 비록 다른 방법이 존재하나, 흐름세포분석 방법에 의해 가장 정확하게 측정될 수 있다.
IL-6의 측정은 ELISA 또는 루미넥스(Luminex)와 같은 자동 시스템에 의해 가장 일반적으로 실행된다. IL-6는 염증의 가장 널리 수용된 바이오마커들 중 하나이다.
운동으로부터의 회복의 평가는 여러 시스템을 필요로 하기 때문에 복잡하다. 그러나 웰빙의 간단한 측정은 회복을 관찰하는데 합리적으로 좋으며, 빈번하게 사용된 대부분의 일부는 혈장 노르에피네프린 수준의 측정; 운동 시간 이전 및 이후 근육 강도 및 세기의 관찰; 운동 이후 근육 통증의 평가(예를 들어 DOMS - 근육 통증의 지연 개시의 정도를 측정하기 위한 평가된 설문을 사용); 수면 방해의 기록(예를 들어 수면 동안 팔 다리 운동을 측정하는 장치를 사용); 스트레스 및 피로의 평가(예를 들어 운동선수에서 사용하기 위해 평가된 POMS - 기분 상태의 프로파일 - 또는 변형 POMS 설문); 운동 동안 인지된 격심한 활동의 등급의 관찰(예를 들어 평가된 설문 시스템을 사용); 활동 동안 심박수의 관찰 및 전체 기분의 관찰(예를 들어 변형 POMS 설문을 사용)을 포함한다. 이런 변수는 효과적인 회복의 신뢰가능한 지표인 것으로 연구에서 증명되었다. DOMS는 또한 순환하는 IL-6 수준과 관련이 있는 것으로 입증되었다.
본 발명의 다른 양태
본 발명의 추가 양태에 따라 혈소판 응집을 억제하는 활성을 가진 가지과의 수용성 과일 추출물을 치료가 필요한 피험자에게 투여하는 것을 포함하여 강한 운동으로부터의 회복을 촉진하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 양태에 따라 혈소판 응집을 억제하는 활성을 가진 가지과의 수용성 과일 추출물을 치료가 필요한 피험자에게 투여하는 것을 포함하여 운동-유도 전신 염증의 심각성을 예방 또는 감소시키는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 양태에 따라 피험자에서 운동-유도 전신 염증을 치료 또는 예방하기 위해 혈소판 응집을 억제하는 활성을 가진 가지과의 수용성 과일 추출물의 용도가 제공된다.
본 발명의 다른 양태에 따라 피험자에서 운동-유도 전신 염증을 치료 또는 예방하기 위해 의약의 제조에서 혈소판 응집을 억제하는 활성을 가진 가지과의 수용성 과일 추출물의 용도가 제공된다.
본 발명의 다른 양태에 따라 강한 운동으로부터의 회복을 촉진하기 위해 혈소판 응집을 억제하는 활성을 가진 가지과의 수용성 과일 추출물의 용도가 제공된다.
본 발명의 다른 양태에 따라 강한 운동으로부터의 회복을 촉진하기 위해 의약의 제조에서 혈소판 응집을 억제하는 활성을 가진 가지과의 수용성 과일 추출물의 용도가 제공된다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
본 발명은 제한되지 않는 다음 실시예 및 첨부된 도면에 예시될 것이다.
도 1: 실시예 3에서 논의한 대로 트롬빈과 에피네프린에 반응하여 혈소판 응집에 대한 수용성 토마토 추출물(WSTC)에 의한 혈소판-풍부 혈장의 배양의 효과를 예시한다.
도 2: 실시예 3에서 논의한 대로 트롬빈과 에피네프린에 노출된 혈소판으로부터의 미세입자 방출에 대한 수용성 토마토 추출물(WSTC)에 의한 치료의 효과를 예시한다.
도 3: 실시예 3에서 논의한 대로 트롬빈과 에피네프린에 의해 활성화된 혈소판과 미세입자에 대한 노출 이후 IL-6의 내피세포 방출에 대한 수용성 토마토 추출물(WSTC)에 의한 치료의 효과를 예시한다. 'Con -'은 활성화된 혈소판-백혈구 현탁액에 의해 치료되지 않은 대조군 HUVEC 세포를 나타낸다. 'Con +'는 혈소판-백혈구 현탁액에 의해 치료되고 치료제로서 식염수를 사용하는 HUVEC 세포를 나타낸다. WSTC는 활성화된 혈소판-백혈구 현탁액에 의해 배양되고 치료제로서 WSTC를 사용하는 HUVEC 세포를 나타낸다.
도 4: 실시예 4에서 논의한 대로 트롬빈과 에피네프린에 반응하여 혈소판 응집에 대한 수용성 토마토 추출물(WSTC) + 식용 질산염(NO3); 및 수용성 토마토 추출물(WSTC) + 식용 질산염 + 엽산에 의한 혈소판-풍부 혈장의 배양의 효과를 예시한다.
도 5: 실시예 4에서 논의한 대로 트롬빈과 에피네프린에 노출된 혈소판으로부터 미세입자 배출에 대한 수용성 토마토 추출물(WSTC) + 식용 질산염(NO3); 및 수용성 토마토 추출물 + 식용 질산염 + 엽산에 의한 치료의 효과를 예시한다.
도 6: 실시예 4에서 논의한 대로 트롬빈과 에피네프린에 의해 활성화된 혈소판과 미세입자에 대한 노출 이후 IL-6의 내피세포 방출에 대한 수용성 토마토 추출물(WSTC) + 식용 질산염(NO3); 및 수용성 토마토 추출물 + 식용 질산염 + 엽산에 의한 치료의 효과를 예시한다. 'Con -'은 활성화된 혈소판-백혈구 현탁액에 의해 치료되지 않은 대조군 HUVEC 세포를 나타낸다. 'Con +'는 혈소판-백혈구 현탁액에 의해 치료되고 치료제로서 식염수를 사용하는 HUVEC 세포를 나타낸다. WSTC+NO3 및 WSTC+NO3+엽산은 활성화된 혈소판-백혈구 현탁액에 의해 배양되고 치료제로서 각각 WSTC+NO3 또는 WSTC+NO3+엽산을 사용하는 HUVEC 세포를 나타낸다.
도 7: 건강한 피험자에서 기준(보충 이전), 운동 이전(보충 이후) 및 운동 이후 혈소판 유래 미세입자 개수(n = 3). P = 위약 보충. FF = 실시예 6에서 논의된 대로 WSTC, 식용 질산염 및 엽산의 바람직한 조합.
도 8: 건강한 피험자에서 기준(보충 이전), 운동 이전(보충 이후) 및 운동 이후 혈장 트롬빈 생성 능력(nM)(n = 3). P = 위약 보충. FF = 실시예 6에서 논의된 대로 WSTC, 식용 질산염 및 엽산의 바람직한 조합.
도 9: 건강한 피험자에서 기준(보충 이전), 운동 이전(보충 이후) 및 운동 이후 순환하는 혈장 IL-6 농도(pg/ml)(n = 3). P = 위약 보충. FF = 실시예 6에서 논의된 대로 WSTC, 식용 질산염 및 엽산의 바람직한 조합.
실시예 1
혈소판 응집을 억제하는 활성을 가진 수용성 추출물을 다음 프로토콜에 의해 제조하였다:
1.1 본 발명에 따라 사용될 수 있는 액체(시럽) 추출물을 WO2010/049707의 실시예 2 및 도 2의 프로토콜에 따라 제조하였다.
1.2 본 발명에 따라 사용될 수 있는 분말 추출물(낮은 당 함량을 가짐)을 WO2010/049707의 실시예 3 및 도 4의 프로토콜에 따라 제조하였다.
실시예 2
실시예 2는 수용성 토마토 추출물, 식용 질산염의 원료 및 엽산의 원료의 조합을 포함하는 본 발명의 제 3 양태에 따른 바람직한 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
2.1 수용성 토마토 추출물은 실시예 1에 요약된 대로 원료를 얻고 제조되어야 한다. 430㎍/ml의 농도로 이런 추출물의 용액을 실시예 1.1에 기술된 추출물을 희석하거나 탈이온수에 실시예 1.2에 기술된 분말 추출물의 용해에 의해 제조하였다. 430㎍/ml의 최종 용액을 실험 프로토콜에서 사용하기 위해 pH 7.4로 완충시켰고 이 실험 프로토콜에서 최종 용액은 10배 더 희석되어 43㎍/ml의 최종 작업 농도를 제공하였다. 이 농도는 가장 바람직한 단위 복용량(3g 액체 추출물(1.1), 150mg 분말 추출물(1.2))의 주입 대략 3시간 후 추출물 내에서 항혈소판 화합물의 최대 계산된 순환하는 혈장 농도를 나타낸다.
2.2 식용 질산염이 풍부한 추출물을 프랑스, 다이아나 네추럴로부터 원료를 얻었다. 이것은 대략 20g/L의 수준에서 무기 질산염 및 150mg/L 미만의 수준에서 무기 아질산염을 함유하는 대략 60 브릭스의 수용성 스위스 근대 추출물로 구성되었다. 186mg/ml 질산염의 농도에서 이 추출물의 용액을 탈이온수에서 원래 추출물의 용해에 의해 생산하였다. 최종 용액을 실험 프로토콜에서 사용하기 위해 pH 7.4로 완충시켰고 이 실험 프로토콜에서 최종 용액은 10배 더 희석되어 18.6㎍/ml의 최종 작업 농도를 제공하였다. 스위스 근대 추출물의 이런 농도는 372ng/ml 질산염의 최종 작업 농도에 해당한다. 식용 질산염이 식물 추출물의 형태로 소비된 공표된 데이터를 기초로, 혈장에서 372ng/ml 질산염의 이런 농도는 100mg 복용량의 식용 질산염을 소비한 지 3시간 후에 얻을 수 있다(Cermak N et al, Int J Sport Nutr Exerc Metab 2012, 22, 64-71).
2.3 엽산의 원료는 공급업체 DMSK로부터의 엽산 EP/BP이었다. 이 재료는 수-불용성이며 따라서 50ng/ml의 농도에서 이런 재료의 용액은 묽은 산에서 용해에 의해 생산되었다. 일단 제조되면, 최종 용액을 재료의 침전 없이 연속적으로 pH 7.4로 완충시키고, 실험 프로토콜에서 사용하였고 실험 프로토콜에서 최종 용액은 10배 더 희석되어 5ng/ml의 최종 작업 농도를 제공하였다. 이것은 200㎍ 엽산의 UK RDA를 제공하는 멀티비타민 / 미네랄 보충제에 의한 보충 3시간 후 전형적인 혈장 엽산 농도에 해당한다(Navarro M et al, JACN, 2003, 22, 124-132).
2.4 상기한 대로 원료를 얻고 제조한 구성요소를 사용하여, 혼합물을 2.1에 기술된 제조된 추출물 용액과 2.2에 기술된 제조된 식용 질산염 용액을 동일한 양으로 혼합하여 제조하였다. 이 혼합물은, 실험 프로토콜에서 10배 희석될 때, 43mg/ml의 추출물 및 372ng/ml의 식용 질산염의 최종 농도를 제공한다. 이런 양은 3g 시럽 추출물(1.1) 및 5g 스위스 근대 추출물로부터의 100mg 식용 질산염의 섭취 3시간 후 혈장에서 순환할 것으로 예측된 각 구성요소의 대략적 농도를 나타낸다.
2.5 상기한 대로 원료를 얻고 제조한 구성요소를 사용하여, 혼합물을 2.1에 기술된 제조된 추출물 용액, 2.2에 기술된 제조된 식용 질산염 용액 및 2.3에 기술된 제조된 엽산 용액을 동일한 양으로 혼합하여 제조하였다. 이 혼합물은, 실험 프로토콜에서 10배 희석될 때, 43mg/ml의 추출물; 372ng/ml의 식용 질산염 및 5ng/ml의 엽산의 최종 농도를 제공한다. 이런 양은 3g WSTC 시럽 농축물, 5g 스위스 근대 추출물로부터의 100mg 식용 질산염 및 200㎍ 엽산의 섭취 3시간 후 혈장에서 순환할 것으로 예측된 각 구성요소의 대략적 농도를 나타낸다. 이런 활성 성분 혼합물은 본 발명의 제 3 양태에 따른 바람직한 조성물을 나타낸다. 이 혼합물은 겔 물질 및 다른 부형제에 첨가되어 최종 겔 생성물을 60ml의 부피로 만들 수 있다.
실시예 3
본 발명은 수용성 토마토 추출물이 강한 운동에 의해 영향을 받으며, 강한 운동에 의해 발생된 염증 반응의 다른 양태를 나타내는 3개의 생물학적 시스템을 조절한다는 연구를 기초로 한다. 이런 3개의 생물학적 시스템은 혈류 속에 트롬빈과 에피네프린의 운동-유도 배출 및 순환하는 질산 산화물의 감소에 의한, 강한 운동에 의해 강하게 활성화되는 것으로 알려진 혈전 시스템의 일부인 혈소판; 혈소판 및 백혈구 활성화 및 염증의 지표, 순환하는 혈장 세포 유래 미세입자; 및 염증의 최고의 입증된 마커 중 하나, 특히 사이토카인 IL-6인 내피 세포 사이토카인 배출이다. 강한 운동은 혈소판 활성화 및 혈소판-백혈구 배출과 함께 시작하여, 활성화된 혈액 세포 및 생산된 미세입자에 대한 노출의 결과로서 내피세포 사이토카인 배출이 이어지는 전신 염증을 일으키는 연쇄 반응을 유도한다고 생각될 수 있다. 이런 전신 염증은 운동으로부터의 회복에 지연 및 성과 개선을 위해 필요한 고강도 운동 기간을 지속하는데 어려움을 일으킬 수 있다.
본 발명자는 트롬빈 및 에피네프린 유도 혈소판 응집, 혈소판과 백혈구로부터 친응집성 및 친염증성 미세입자 배출 및 내피세포 사이토카인 배출을 예방하는데 다른 양의 수용성 토마토 추출물 구성요소의 효과를 검사하였다. 사용된 트롬빈 및 에피네프린의 수준은 고강도 운동 동안 혈액에서 측정된 수준과 일치하였다.
3.1. 방법
3.1.1 치료 용액으로서 사용하기 위한 토마토 추출물 및 대조군 용액의 제조
생물학적 활성을 검사하는 실험에서 사용하기에 적합한 토마토 추출물의 용액을 제조하기 위해서, 실시예 1에 기술한 대로 제조한 62 브릭스의 액체 토마토 추출물을 실시예 2.1에 기술한 대로 430㎍/ml의 농도로 희석하였다. 인산염-버퍼 식염수(PBS, Sigma-Aldrich, UK)를 대조군 용액으로 제조하였다.
3.1.2 혈소판 응집을 억제하는 활성을 평가하는 방법
아래 기술된 실험 프로토콜을 연구하여 트롬빈 유사체 TRAP(트롬빈 수용체 활성화 펩타이드) 및 혈소판의 배양 후 얻은 에피네프린(강한 운동 부하와 관련)의 조합에 의해 유발된 혈소판 응집의 억제 정보를 제조된 추출물 또는 대조군과 비교하였다.
사혈 및 혈액 샘플
인비트로 연구를 위한 혈액을 정상적인 혈소판 기능을 가진 18-60세의 남성 및 여성인 약물을 투여받지 않은 건강한 사람 지원자로부터 수집하였다. 피험자는 혈액 샘플을 제공하기 전 최소 10일 동안 혈소판 기능에 영향을 미치는 것으로 알려진 약물 또는 보충제를 소비하지 않았다고 밝혔다. 혈액을 실리콘처리 바늘을 통해 플라스틱 시트르산염 첨가 혈액 수집 튜브(사르스테디트 모노베테스, 최종 농도 시트르산 나트륨, 13mmol/L)를 통해 전주정맥에 대한 1회 채혈 후에 수집하였다. 모든 혈액을 혈액 채취시로부터 37℃로 유지하였다.
혈소판-풍부 혈장의 제조
혈소판-풍부 혈장(PRP)을 200 x g에서 15분 동안 시트르산염 첨가 혈액의 원심분리에 의해 얻었고 사용 전에 혈소판-부족 혈장으로 320 ± 20 x 109 /L의 표준 혈소판 숫자로 조절하였다. PRP를 2시간 이내에 혈소판 기능 측정을 위해 사용하였다.
혈소판 효현제
다음 효현제를 혈소판 기능 측정에 사용하였다. TRAP, 최종 2 nmol/L; 에피네프린, 최종 농도 0.15μmol/L(모두 Sigma-Aldrich, Poole, UK). 효현제를 따뜻한 생리학적 식염수(0.9% NaCl) 속에 희석시킴으로써 사용 직전 원료 용액으로부터 제조하였고 혼합하여 혼합된 TRAP/에피네프린 효현제를 생성하였다. 이런 농도에서, 효현제는 혈소판 응집 반응을 개별적으로 유도할 수 없었다. 그러나 조합하여, TRAP에 대한 에피네프린의 유효성을 높이는 효과는 강한 혈소판 반응을 초래할 수 있다.
PRP 에 의한 치료 용액(3.1.1)의 배양
180μL PRP를 짧은 잔류시간의 에핀도르프에서 10분 동안 37℃에서 20μL 제조된 치료제 또는 대조군 용액으로 배양하였다.
혈소판 응집의 측정 및 응집의 억제
혈소판 억제제에 의한 배양 이후, PRP 샘플을 유리 큐벳에 옮기고 혼합된 TRAP/에피네프린 효현제에 의해 유도된 응집의 정도를 혈소판 응집기 상에서 10분 동안 관찰하였다(Aggram, Helena Biosciences, Sunderland, UK). 생성된 응집 곡선으로부터, 곡선 아래의 면적을 각각의 PRP 샘플에 대해 계산하였고 치료 용액에 의해 성취된 응집의 억제를 이런 PRP 샘플에 대한 곡선 아래의 면적을 대조군 샘플의 면적과 비교함으로써 계산하였다. 결과는 도 1에 도시된다.
3.1.3 세포-유래 미세입자의 배출을 분석하는 방법
아래 기술된 실험 프로토콜을 연구하여 제조된 추출물 또는 대조군의 존재하에서 트롬빈과 에피네프린(강한 운동 부하 관련)의 조합에 대한 노출 이후 온전한 혈소판으로부터 배출된 혈소판 유래 미세입자의 숫자를 비교하였다.
사혈 및 혈액 샘플
인비트로 연구를 위한 혈액을 상기 3.1.2에 기술된 대로 정상적인 혈소판 기능을 가진 18-60세의 남성 및 여성인 약물을 투여받지 않은 건강한 사람 지원자로부터 수집하였다.
혈소판-부족 혈장의 제조
10분의 수집 내에, 시트르산염 전혈을 실온에서 20분 동안 2000g에서 원심분리하여 혈소판-부족 혈장(PPP)을 분리하였다.
효현제의 제조
강한 운동을 자극하도록 설계된 방식으로 혈소판의 활성을 자극하도록 사용된 효현제는 다시 트롬빈과 에피네프린의 조합이었고 이들을 상기 3.1.2에 기술된 대로 제조하였다.
추출물 및 대조군 용액의 제조
제조된 PPP의 배양을 위한 치료제 및 대조군 용액을 상기 3.1.2에 기술된 대로 제조하였다.
PPP에 의한 치료 용액의 배양
180μL PPP를 짧은 잔류시간의 에핀도르프에서 10분 동안 37℃에서 20μL 제조된 치료제 또는 대조군 용액으로 배양하였다.
트롬빈 - 에피네프린에 의한 처리 이전 및 이후 미세입자의 측정
혈소판-유래 미세입자를 세포흐름법으로 탐지하였고, 이는 용액/현탁액에서 표지화된 입자의 정량화를 허용한다. 치료제 또는 대조군 용액으로 전처리한 PPP 샘플을 TRAP/에피네프린 혼합 효현제 또는 PBS의 첨가에 의해 활성화하였고 10분 동안 방치하였다. 그런 후에 활성화된 샘플을 다른 형광-표지화 항체로 배양하였다. 항-CD61-PerCP 단클론 항체(BD Bioscience, San Jose, CA, USA)를 사용하여 혈소판-유래 미세입자를 탐지하였다. 항-CD45-PE(BD Pharmingen, BD Bioscience) 단클론 항체를 사용하여 LMP를 표지화하였다. PE 및 PerCP 접합 아이소토프 대조군(IgG1, BD Bioscience)을 사용하여 배경 노이즈를 정했다. 25μL 활성화 PPP를 실온에서 20분 동안 어둠 속에서 5μL 각각의 항체로 배양한 후, 470μL 차가운(4℃) FACSFlow(FACSFlow Sheath Fluid, BD Bioscience)를 첨가하였다.
이런 샘플을 FACSCalibur 흐름세포분석기를 통해 흘렸고 미세입자 게이트(<1μ에서, 1μ 비드에 의해 측정) 내에서 항체-표지화 입자를 계수하였다. 빠른 유속에서 100초 동안 계수 후 CellQuest 소프트웨어(버전 2: BD Biosciences)로 데이터를 얻고 분석하였다. 각 샘플에서 미세입자 농도를 기록 시간에 샘플 유속을 곱함으로써 추정한 기록 부피로 계산하였다. 결과는 ㎕ PPP 당 미세입자의 숫자로 표현되며 도 1에 도시된다.
3.1.4. 토마토 추출물 치료제 및 대조군 용액으로 배양된 내피세포로부터 IL-6의 배출을 측정하는 방법
치료제 추출물 및 대조군 추출물의 제조
세포 현탁액에 의한 배양을 위한 치료제 및 대조군 용액을 상기 3.1.2에 기술된 대로 제조하였다.
치료제 및 대조군 추출물의 존재하에서, 활성화 혈소판-백혈구 현탁액 및 비활성화 대조군 현탁액의 제조
450㎕ 시트르산 첨가 전혈을 2개의 12ml 낮은 잔류시간 튜브 속에 나눴다. 원료 용액으로부터 10배 희석된 4.5ml 희석된 용해 시약(해몰리스, Sigma-Aldrich UK)을 뚜껑을 덮은 튜브에 각각 첨가하고 잘 혼합하여 10분 동안 실온에 방치하였다. 그런 후에 용혈된 샘플을 10분 동안 400g에서 원심분리하였다. 4.5ml의 상청액을 제거하고 버렸다. 250㎕ Hepes-Mg 버퍼를 펠렛에 첨가하고, 혼합하고 에펜도르프에 옮겼다. 튜브를 추가 250㎕ Hepes-Mg 버퍼로 세척하고 세척액을 옮겨서 대략 1ml의 부피를 만들었다. 현탁액을 혼합한 후 이전과 같이 원심분리하였다. 900㎕의 상청액을 제거하고 버렸다. 각 튜브에 있는 잔존하는 100㎕에, 250㎕ Hepes-Mg 버퍼를 첨가하고 현탁액을 완전히 혼합하였다. 현탁액에서 있는 세포를 시스멕스 혈액학 분석기(Sysmex UK)를 사용하여 계수하고 최종 현탁액 부피를 조절하여 3.3 - 3.4 x 10^3/㎕의 백혈구 세포 개수를 만들었다.
한 현탁액에, TRAP/에피네프린 효현제를 일정량 첨가하여 원료의 10배 희석을 얻었고, 활성화된 세포 현탁액을 얻었다. 제 2 현탁액에, PBS 및 10㎕ 프로스타글란딘 및 E2 용액을 첨가하여 세포를 비활성화된 상태로 유지하였다.
내피 세포 배양액의 제조
사람 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC)(Lonza Switzerland)를 EBM-2 배지(Lonza Switzerland) 속에서 T75cm 플라스크에서 이 배지에 특이적인 성장 인자 및 항생제로 이루어진 EGM-2 블릿-키트(bullet-kit) 보충제의 첨가에 함께 배양하였다. 세포를 5% CO2의 존재하에서 37℃에서 유지하였다. 이런 배지를 2일마다 바꾸고 세포를 항상 합류 이전에 2차 배양하였다.
대략 75%에서 합류 세포를 6-웰 플레이트 속에 2차 배양하였다. 먼저 T75 플라스크의 배지를 버리고 잔존하는 세포 단층을 ~2ml의 d-PBS(Lonza Switzerland)로 3회 세척하였다. 직후에, 2ml의 트립신(Lonza Switzerland)을 첨가하여 플라스크 벽으로부터 세포층을 분리하였다. 그런 후에 플라스크(T75)를 현미경 아래서 검사하여 플라스크의 바닥으로부터 세포의 전부의 제거를 확인하였다. 2분 후, ~2ml의 태아 소 혈청(FBS)을 첨가하여 트립신에 의한 세포의 분해를 억제하였다. 그 후, 잔존하는 부피를 측정하고 6-웰 플레이트(각 웰 2ml)를 채우는데 필요한 배지의 나머지를 첨가하였다. 플레이트를 추가 처리 진행 이전 1-2일 동안 세포를 100% 합류할 때까지 37℃로 유지하였다.
내피 세포의 치료
합류 HUVECs를 상기한 대로 제조한 치료제 또는 대조군 용액으로 24h 동안 EMB-2에서 배양하였다. 배양 이전 치료제 및 대조군 용액을 세포 배지에서 희석하고 제조된 원료 용액의 10배 희석을 얻기에 충분한 양으로 첨가하였다.
24h의 처리 후, 배지를 웰당 3개의 동일한 분취량으로 수집하고, 액체 질소에서 급랭하고 -80℃로 저장하였다. 추가 처리를 위해 새로운 배지를 세포에 첨가하였다. 세포를 상기한 3ng/ml TNF-α 또는 1ml의 활성화 혈소판-백혈구 현탁액으로 추가로 24h 동안 배양하였고, 웰 중 하나를 자극제가 없게 유지하여 대조군을 만들었다.
배출된 IL-6를 분석하는 방법
제조사 지시(Biosource, UK)에 의해 기술된 대로, IL-6를 ELISA로 탐지하였다. 간략하게, 1:2 희석 세포 배양액 상청액(100㎕)을 1h 동안 배양하였고, 그런 후에 웰을 세척 버퍼로 4-5회 세척하고 100㎕의 항-IL-6 컨쥬게이트 및 50㎕의 용액으로 채웠다. 실온에서 1시간 배양 후, 웰을 다시 세척하고 200㎕의 색원체를 각 웰에 채웠고 15분 동안 배양하였다. 100㎕의 정지 용액을 첨가하여 반응을 종료시켰다. 흡광도 값을 450nm로 읽었다. 키트에 제공된 (16 내지 1690pg/ml의 농도를 가진) 다른 IL-6 표준을 분석함으로써 표준 곡선을 얻었다.
실험 3.1.4의 결과는 도 3에 도시된다.
3.2 결과
기술된 실험의 결과는 도 1, 2 및 3에 그래프 형식으로 도시된다.
3.3 결론
실시한 실험은 가지과의 수용성 과일 추출물은 트롬빈 및 에피네프린-매개 활성화의 증가를 특징으로 하며 공지된 항혈소판 약물에 의해 크게 영향을 받지 않는 강한 운동에 부수하는 혈소판 활성화를 억제할 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, 추출물의 이런 주요 작용은 혈소판 활성화의 결과인 혈소판 미세입자 배출의 억제를 초래한다. 혈소판 미세입자는 순환하는 세포 미세입자 집단의 대략 70%를 차지하며 신체 전체에서 작동하는 뚜렷한 염증 시그널링 시스템으로 알려져 있다. 이들은 또한 매우 응혈성이며, 트롬빈 배출을 완화하고 운동의 중단 이후 수시간 동안 응혈 및 친염증 상태를 유지할 수 있다. 트롬빈 및 에피네프린에 의해 발생된, 내피 세포에 대한 혈소판 및 백혈구 미세입자의 효과는 내피 세포로부터의 IL-6 배출의 증가인 것으로 입증되었다. 생리학적으로 관련된 양으로 본 발명에 따른 추출물의 용액에 의한 내피 세포의 전처리는 이런 IL-6 배출을 억제하는 것으로 나타났고, 내피의 낮아진 염증 상태를 초래하였다. 순환하는 IL-6의 억제는 다른 연구에서 회복 시간과 근육 통증의 지연된 개시에 영향을 주는 것으로 나타났다. 따라서 격렬한 운동 이전 가지과 수용성 추출물에 의한 전처리는 운동 후 회복을 촉진하는 것으로 돕는다.
실시예 4
본 발명자는 또한 실시예 3에서 검사한 생물학적 시스템의 활성화를 예방하는데 실시예 2에 기술된, 본 발명의 제 3 양태에 따른 바람직한 조성물의 효과를 검사하였다.
4.1 방법
4.1.1 치료제 용액으로 사용하기 위한 식용 질산염과 엽산의 원료 및 대조군 용액과 수용성 토마토 추출물의 조합의 제조
식용 질산염과 엽산과 혼합된 가지과의 수용성 과일 추출물의 생물학적 활성을 검사하는 실험에서 사용하기 위해, 실시예 2.4 및 2.5에 기술된 바람직한 제제를 사용하였다. PBS를 대조군 용액으로 제조하였다.
4.1.2 혈소판 응집을 억제하는 활성을 분석하는 방법
3.1.2에 기술된 실험 프로토콜은 4.1에 기술된 치료제 용액이 사용된 것을 제외하고 정확한 세부내용을 따른다. 결과는 도 4에 도시된다.
4.1.3 세포 유래 미세입자의 배출을 분석하는 방법
3.1.3에 기술된 실험 프로토콜은 4.1에 기술된 치료제 용액이 사용된 것을 제외하고 정확한 세부내용을 따른다. 결과는 도 5에 도시된다.
4.1.4 토마토 추출물 치료제 및 대조군 용액으로 배양한 내피 세포로부터의 IL-6의 배출을 측정하는 방법
3.1.3에 기술된 실험 프로토콜은 4.1에 기술된 치료제 용액이 사용된 것을 제외하고 정확한 세부내용을 따른다. 결과는 도 6에 도시된다.
4.2 결과
기술된 실험의 결과는 도 4, 5 및 6에서 그래프 형식으로 도시된다.
4.3 결론
실시예 4에서 실시된 실험을 통해, 엽산의 첨가와 함께 및 첨가 없이, 본 발명자는 식용 질산염 추출물과 가지과의 수용성 과일 추출물의 조합에 대한 생체활성에 현저한 개선을 나타낼 수 있다. 식용 질산염과 엽산 모두와 추출물의 조합은 혈소판 응집, 혈소판 미세입자 생성 및 활성화된 혈소판, 백혈구에 대한 노출 이후 내피 세포 IL-6 배출 및 관련 미세입자의 증가된 수준에 대한 효과의 면에서, 검사된 가장 효과적인 것이었다. 운동 유도 혈소판 응집 및 미세입자 배출의 억제의 경우, 이런 바람직한 조합은 단독으로 사용된 WSTC보다 2배 이상 더 효과적인 반면 활성화된 혈소판 및 백혈구에 대한 노출 후 내피 세포로부터 IL-6 생성의 억제의 경우, 거의 3배 효과적이었다.
이런 결과는, 가지과 수용성 과일 추출물 단독은 운동에 의해 유도된 전신 염증에 놀랍고도 유익하게 영향을 미치는 반면, 이의 효과는 식용 질산염 및 엽산과 혼합됨으로써 상당히 창의적으로 추가로 증가될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 5
최고의 전체 효과를 나타낸 수용성 토마토 추출물 및 질산 산화물의 원료의 조합에 대해 얻은 지식의 관점에서, 본 발명자는 강한 운동 이전 및 동안 이런 조합을 적절하게 전달하는데 사용될 수 있는 조성물을 개발하도록 진행하였다.
5.1 겔
겔 제품(아래 참조)이 등장액인 것으로 설계되지 않은 것을 제외하고 WO2007/083117에 개시된 방법(명세서의 페이지 19-22에 기술)에 따라 제조하였다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 가장 바람직한 겔 제품은 다음을 포함할 수 있다:
성분 양(g/L)
물 848
켈코겔-에프 2.4
시트르산 나트륨 0.4
소르브산 칼륨 0.2
벤조산 나트륨 0.2
사티아젠 CX911 2.4
아세설팜 K 0.3
수크랄로오스 0.08
시트르산 1
엽산 0.003
스위스 근대 주스 농축물 90
1.1에 따라 제조된 액체 추출물 50
풍미제* 5.5
* 풍미제는 바나나 및 망고일 수 있다. 선택적으로 검은 건포도, 오렌지 또는 열대 풍미제가 사용될 수 있다.
겔은, 예를 들어, 유니버셜 팩에 의해 제조된 것과 같은 겔 포장 재료를 사용하여, 박층 호일 향주머니 속에 포함될 수 있다. 전형적인 겔 크기는 약 40ml 내지 약 100ml 범위이다(예를 들어, 이들은 60ml일 수 있다).
5.2 향주머니 분말
분말 믹스를 다음 양으로 성분을 함유하도록 제조할 수 있다:
성분 양(g/kg)
시트르산 7
말토덱스트린 755
스위스 근대 분말 200
프룩토오스 22
레몬 풍미제 12
1.2에 따라 제조된 분말 추출물 3
수크랄로오스 0.6
엽산 0.004
이런 분말 믹스를, 예를 들어, 먼지와 습도를 조절하는 적절한 공장 조건하에서, 리본 블렌더 또는 유사물을 사용하여 통상적인 건조-혼합 기술로 제조할 수 있다. 고결방지제와 같은 물질이 첨가되어 최종 분말의 자유로운 흐름을 보장할 수 있다. 튜브 또는 향주머니와 같은 적절한 용기 속에 포장은 엄격한 먼지 제어 및 제어된 수분의 조건하에서 실행되어야 한다.
분말을 50g 복용량 단위로 나누고 향주머니 내에 밀봉할 수 있다. 사용시에 분말을 50 내지 250ml의 물과 혼합하고 운동 개시 이전 소비한다.
5.3 발포 정제
(픽스 정제로도 알려진) 분산성 정제는 다음 양으로 성분을 함유하도록 제조될 수 있다:
성분 양(g/kg)
전해질 염 2.5
시트르산 300
스위스 근대 분말 670
1.2에 따라 제조된 분말 추출물 15
엽산 0.02
수크랄로오스 0.8
풍미제 10
말토덱스트린 2.5
발포 정제 정제를, 예를 들어, 먼지와 습도를 조절하는 적절한 공장 조건하에서, 리본 블렌더 또는 유사물을 사용하여 통상적인 건조-혼합 기술로 제조할 수 있으며, 전체 공정은 10 미만의 상대 습도를 가진 제어된 대기 조건하에서 실행된다. 혼합 건조 성분으로부터의 정제의 압축은 원하는 정제 크기에 따라, 약 5 - 10 톤의 압력을 발휘할 수 있는 정제 압축기에 의해 실행될 수 있다. 개별 향주머니 또는 여러 튜브 속에 포장은 제어된 습도의 조건하에서 실행되어야 하며 개별 패킷은 사용 수명 및 정제 안정성을 보장하도록 충분한 건조 재료를 함유해야 한다. 이런 정제는 10g 정제로 제조된다. 사용시에 정제는 50 내지 250ml의 물에 용해되고 운동 개시 전에 소비된다.
5.4 푸드 바
푸드 바는 다음 양으로 성분을 함유하도록 제조될 수 있다:
성분 양(g/kg)
혼합 과일 주스 50
스위스 근대 분말 125
말토덱스트린 140
귀리 60
락트산 칼슘 3
과일 플레이크 / 민스 290
쌀 / 콩 크리스피 250
1.1에 따라 제조된 액체 추출물 75
풍미제* 7
수크랄로오스 0.8
엽산 0.005
*풍미제는, 예를 들어, 사과 및 건포도, 초콜릿 또는 블루베리일 수 있다.
푸드 바를 제조하기 위한 적절한 방법은 과일 주스를 가열하여 대략 100℃로 가열하여 일부 수분을 제거하고, 마른 성분을 혼합하고 살균하는 것을 필요로 한다. 그런 후에 혼합기 내용물을 트레이 또는 컨베이어에 비우고, 산업용 롤러를 사용하여 통상적으로 10-15mm인 적절한 높이로 밀어서 펼 수 있다. 이 과정 동안 혼합물을 냉각하도록 팬을 사용할 수 있고, 그 후 바를 기계적 절단기를 사용하여 원하는 크기로 절단할 수 있다. 바를 알루미늄 호일에 개별적으로 플로우랩으로 포장하여 신선도를 유지할 수 있다.
40g 바가 적절한 복용량 단위이며 운동 전에 소비되어야 한다.
실시예 6
본 발명자는 또한 70% VO2 max에서 실행된 혈소판 및 응집 시스템 활성화 및 운동의 지정 기간과 관련된 혈장 IL-6 수준에 증가의 예방에서, 실시예 5에 기술된 대로 겔 형태로 제조된 본 발명에 따른 한 바람직한 조성물의 효과를 검사하였다.
6.1. 방법
6.1.1 피험자
18-55세이고, VO2max를 사전에 측정한 3명의 건강한 남성 피험자를 모집하였다.
6.1.2 보충제
실시예 5에 기술된 대로, 2개의 테스트 겔을 제조하였다. 겔을 60ml 부피의 호일 팩에 포장하였다. 치료제 겔(FF)은 3g의 수용성 토마토 추출물(WSTC), 대략 100mg 식용 질산염과 동일한 5.4g 스위스 근대 주스 농축물 및 대략 200㎍ 엽산을 함유하였다. 위약 겔은 이 혼합물 대신에 3g 글루코오스 시럽을 함유하였다.
6.1.3 운동 프로토콜
모든 피험자는 적어도 72시간 분리된 2개의 운동 프로토콜을 실시하였다. 피험자는 금식 상태로 연구 시설에 보내졌고 기준 혈액 샘플을 항응고제로서 시트르산 삼나트륨을 사용하여 채취하였다. 피험자에게 세트 아침을 제공하였고, 이때 무작위로 치료제(FF) 또는 위약(P)으로 배정된, 단일 테스트 겔을 소비하였다. 90분 후, 사전-테스트 혈액 샘플을 채취하였다. 그런 후에 피험자는 70% VO2max에서 20분 트레드밀 달리기를 실시하였다. 트레드밀 달리기를 종료하자마자, 피험자는 최고 수준(volitional exhaustion)까지 90% VO2max로 달렸다. 운동 후 혈액 샘플을 채취하고, 그 후 피험자에게 스낵 점심을 제공하고 자유롭게 출발시켰다. 피험자는 72시간 후 시설에 되돌아 왔고, 잔존하는 테스트 겔을 포함하는 테스트 일을 반복하였다.
6.1.5 샘플 분석
수집 20분 내에, 시트르산 첨가 전혈을 실온에서 20분 동안 2000g에서 원심분리하여 혈소판-부족 혈장을 분리하였다. 형광-기반 분석법(Thrombin Generation Assay, Technoclone, UK)을 사용하여 측정한 응고 시스템의 활성 지표인 트롬빈 생성 능력의 측정 및 혈장 IL6(3.1.4에서 기술된 Biosource, UK로부터의 ELISA)의 측정을 위해 분취량을 동결하였다. (3.1.3에 기술된 대로) 순환하는 혈소판의 활성 지표인 순환하는 미세입자의 측정을 위해 잔존하는 혈소판-부족 혈장을 즉시 사용하였다.
6.2 결과
기술된 실험의 결과는 도 7, 8 및 9에 그래프 형식으로 도시된다.
6.3 결론
실시예 6에서 실시한 실험을 통해서, 본 발명자는 위약과 비교하여, 중간부터 강한 운동의 20분 후 혈소판 및 응고 시스템의 활성화를 감소시키는데 WSTC, 식용 질산염 및 엽산의 조합의 효과를 입증할 수 있었다. 혈전 활성의 이런 감소는 위약과 비교하여, FF 치료제에 의한 순환하는 혈장 IL6의 감소를 동반하였다.
혈소판 미세입자 개수를 혈소판 활성화의 지표로서 실험에서 사용하였다. 기준 미세입자 개수는 FF 또는 P 테스트 그룹에서 테스트 겔의 소비 후 현저하게 변하지 않았다. 그러나 운동 후, 순환하는 혈소판 미세입자의 숫자는 FF 그룹에서 1.2배와 비교하여, 위약에서 1.9배 증가하였다. 즉, FF 치료제는 위약과 비교하여, 약 70%정도 혈소판 미세입자의 운동-유도 배출을 감소시키는 것으로 나타났다.
트롬빈 생성 능력은 P 겔의 소비 이후 기준선으로부터 변하지 않았고, FF 겔의 소비 후 19% 감소하였다(운동-이전). 이것은 혈소판 기능의 급격한 억제 때문일 수 있다. 운동-이후, 트롬빈 생성 능력은 P 테스트 그룹에서 2.2-배 증가하였다. FF 테스트 그룹에서, 운동 이후 트롬빈 생성 능력은 운동 이전 수준과 비교하여 1.4-배 증가하였다; 이것은 1.1-배의 기준선 트롬빈 생성 능력으로부터의 증가를 나타낸다. 따라서, 위약 치료제를 섭취하면서 운동하면 기준선 트롬빈 생성 능력으로부터 120% 이상의 증가가 동반되었지만, FF 치료제는 이런 증가를 기준선으로부터 13%로 효과적으로 제한하였다.
기준선 IL6 수준은 겔의 소비에 의해 영향을 받지 않았다(운동-이전). 순환하는 IL6의 수준은 운동-이후 위약 그룹에서 4.5-배 증가되는 반면, FF 그룹에서, 수준은 2.6-배 증가하였다. 따라서 FF 치료제 후 운동은 위약 치료제 후 운동 이후 관찰된 혈장 IL6의 증가의 단지 42%를 초래하였다.
요약하면, FF 치료제를 섭취하는 것은 혈소판 미세입자의 운동-관련 배출 및 혈장 트롬빈 생성 능력에서 관련 증가뿐만 아니라 운동에 의해 유도된 전신 IL6의 수준을 현저하게 감소시켰다. 이런 결과는 WSTC, 식용 질산염 및 엽산의 바람직한 조합이 운동에 의해 유도된 전신 염증에 유익하게 여양을 미칠 수 있는 것을 나타내며 따라서 본 발명에 따른 조성물은 운동으로부터의 회복을 촉진할 것을 입증한다.

Claims (22)

  1. 피험자에서 운동 유도 전신 염증을 치료, 감소, 최소화 또는 예방하는데 사용하기 위해 혈소판 응집을 억제하는 활성을 가진 가지과의 수용성 과일 추출물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    운동으로부터의 회복이 피험자에서 개선되는 것인 수용성 과일 추출물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    토마토 추출물의 활성 부분을 포함하며, 활성 부분은 혈소판 응집을 억제하는 활성을 가진 실질적으로 열 안정성의 무색 수용성 화합물 또는 화합물들을 함유하며 1000 달톤 미만의 분자량을 갖는 것인 수용성 과일 추출물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 실질적으로 열 안정성이며;
    (b) 무색 또는 담황색이며;
    (c) 수용성이며;
    (d) 1000 미만의 분자량을 가진 구성요소로 이루어지며;
    (e) (i) 글리코실화 페놀산 또는 페놀 에스터 또는 이의 유도체;
    (ii) 글리코실화 플라보노이드; 및
    (iii) 뉴클레오시드로부터 선택된 혈소판 응집을 억제하는 하나 이상의 화합물을 함유하는 것인 수용성 토마토 추출물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    글리코실화 페놀산 또는 페놀 에스터 또는 이의 유도체; 글리코실화 플라보노이드; 및 뉴클레오시드를 포함하는 것인 수용성 과일 추출물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    글리코실화 시남산 또는 이의 유도체인 글리코실화 페놀산 또는 페놀산 에스터를 포함하는 수용성 과일 추출물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    글리코실화 시남산 또는 이의 유도체는 카페오일-4-O-퀸산, 카페오일-4-O-글루코시드, 코우마로일-4-O-글리코시드(글루/갈) 및 코우마로일-4-O-글리코시드(다이사카라이드)를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인 수용성 과일 추출물.
  8. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    카페산 글루코시드; p-코우마르산 헥소스 / 다이하이드로카엠페롤 헥소스; 페룰산 글리코시드; 및 p-코우마르산 유도체로부터 선택된 하나 이상의 글리코실화 페놀산 또는 페놀 에스터를 포함하는 수용성 과일 추출물.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    쿠에르세틴-3-O-글루코시드 및/또는 루틴으로부터 선택된 글리코실화 플라보노이드를 포함하는 것인 수용성 과일 추출물.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AMP, 우리딘, 아데노신, 구아노신 또는 GMP를 포함하는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오시드를 포함하는 것인 수용성 과일 추출물.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    대략 60% VO2max 초과에 해당하는 강도에서 실행된 운동으로부터 회복을 촉진하기 위한 것인 수용성 과일 추출물.
  12. 제 3 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서
    피험자에서 운동으로부터의 회복을 촉진하는데 사용하기 위한 것인 가지과 수용성 과일 추출물.
  13. (a) 혈소판 응집을 억제하는 활성을 가진 가지과의 수용성 과일 추출물, 추출물은 다음을 포함한다:
    (i) 1000 미만의 분자량을 가진 구성요소; 및
    (ii) 뉴클레오시드; 글리코실화 페놀산 또는 페놀 에스터 또는 이의 유도체; 또는 혈소판 응집 억제 활성을 가진 글리코실화 플라보노이드의 하나 이상; 및
    (b) 식용 질산염의 원료 또는 내생 질산 산화물의 전구체를 포함하는 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서,
    추출물(a)은 제 3 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 정의된 조성물.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,
    식용 질산염(b)의 원료는 스위스 근대, 로켓, 시금치, 대황, 딸기 및 양상추로부터의 수용성 추출물로 선택되는 것인 조성물.
  16. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,
    내생 질산 산화물의 전구체는 시트룰린, 글루타민 또는 아르기닌인 조성물.
  17. 제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    엽산 또는 이의 대사산물을 포함하는 것인 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서,
    5-메톡시테트라하이드로폴레이트 또는 테트라하이드로폴레이트로부터 선택된 엽산의 대사산물을 포함하는 조성물.
  19. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 수용성 추출물 또는 식의약품, 드링크, 식품 물질 또는 식품 보충제 형태의 제 13 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
  20. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 수용성 추출물 또는 겔, 분말, 푸드 바 또는 분산가능한 정제로서 제제화된 제 13 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
  21. 25mg 내지 250mg의 질산염을 포함하는 제 13 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 정의된 조성물 또는 추출물을 포함하는 제형.
  22. 제 21 항에 있어서,
    10㎍ 내지 500㎍의 엽산을 포함하는 제형.
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