JP6483024B2 - 組成物 - Google Patents

Description

本発明は、運動誘発性全身性炎症の防止および激しい運動（intense exercise）からの回復促進に使用され得る、果実抽出物または果実抽出物配合物を含有し、他の特定の栄養素を含有していてもよい組成物に関する。

運動療法（exercise regime）の維持には、心理的コミットメントと体力の両方が必要である。

現在の体力の度合いは、大部分は、（持続性損傷がない場合）運動療法によって身体に加えられるストレスに対する該身体のレジリエンス（resilience）によって、すなわち、該ストレスの影響からの回復速度によって決まる。

運動からの回復は、多くの身体的プロセスを必要とする。該身体的プロセスとしては、損傷した筋肉組織の修復；筋グリコーゲン貯蔵量の補充；運動中に筋肉またはその他の組織に蓄積する代謝副産物の除去；ならびに、運動中に起こる炎症に対する反応および該炎症のダウンレギュレーションが挙げられる。

ある程度の運動誘発性炎症は、完全な回復にとって必要である。例えば、運動中に用いられる筋肉群内での局所的な炎症シグナリングは、筋損傷部位への白血球動員を促進し、それにより、治癒過程を促進する。

しかしながら、一部の運動は、治癒を促す誘因として作用するのではなくて、特に反復運動セッションの間持続される場合には身体の回復能を低下させる可能性があり、一部の生物系を不必要で潜在的に危険なストレスの下に置く可能性がある有害な全身炎症負荷として作用する、全身性炎症を誘発することがある。

いずれの運動様式（exercise modality）も、運動強度が十分である場合には、この全身性炎症を誘発することがある。激しい運動とは、本明細書では、ＶＯ₂ｍａｘの約６０％超に相当する強度で行われる運動を意味するが、この激しい運動は、止血系（haemostatic system）の活性化を非常に急速に伴う。該止血系は、血小板および凝固因子を含み、血小板および凝固因子は、共に、ＶＯ₂ｍａｘの６０％超の運動強度によって活性化される。それらの活性化によって、トロンビンの産生、凝固促進性および炎症誘発性循環マイクロパーティクルの放出、循環白血球の活性化、血管内皮の活性化、利用可能な一酸化窒素の減少および関連する血管拡張の低下、ならびにＩＬ−６のような循環炎症マーカーの増加が引き起こされる。

高レベルの循環ＩＬ−６は、より強い運動後筋痛（post-exercise muscle soreness）、および先に行った運動セッションからの回復の遅れに関連している。

これを踏まえて、本発明者は、ＩＬ−６および関連炎症マーカーの運動誘発性産生を減少させることができる薬剤は運動からの回復を促進させるのに潜在的に有用であると考えた。しかしながら、止血系を抑制する全ての薬剤が血小板の運動誘発性活性化、凝固および炎症マーカー産生に影響を及ぼすわけではないことが、立証された。血小板産生および作用という異なる段階で作用する抗血小板凝集剤は多数知られており、例えば、アスピリン（アセチルサリチル酸）は最も広く使用され研究されている。しかしながら、このような抗血小板薬は、止血系の運動誘発性活性化を抑制しない。このことは、長期の抗血小板療法を受けている患者において示されており、別の面では定期的な運動療法から恩恵を受ける可能性のある患者群の間での運動禁止の理由となっている。激しい運動中の主な生物由来血小板活性化物質は、トロンビンおよびエピネフリンであり、最も一般に使用される抗血小板薬は、これらに対して非常に限られた効力しか持たない。力を合わせて働くトロンビンおよびエピネフリンは、不可逆的で非常に即効性がある、血小板活性化のための非常に強力な系である。

したがって、本発明の目的は、対象体の運動誘発性全身性炎症を処置、軽減、最小化または防止し、したがって、対象体の運動からの回復を促進するのに有用である、組成物を同定することである。

本発明の第一の態様によると、対象体の運動誘発性全身性炎症の処置、軽減、最小化または防止に用いるための、血小板凝集阻害活性を有する、ナス科（Solanaceae family）の果実の水溶性抽出物が提供される。

「防止」とは、本明細書では、当該抽出物が、運動誘発性炎症の発生を妨げるか、または、運動誘発性炎症の重症度を軽減するか；運動誘発性炎症の発症を遅らせるか；または運動誘発性炎症に関連する症状を和らげることを意味する。

「軽減」とは、本明細書では、当該抽出物が、当該抽出物を受けていない対照対象体と比べて、運動誘発性炎症の重症度を軽減するか；運動誘発性炎症の発症を遅らせるか；または運動誘発性炎症に関連する症状を和らげることを意味する。

「最小化」とは、本明細書では、運動誘発性炎症が、（消失しない場合であっても）対象体の運動からの回復を遅らせない程度に軽減されることを意味する。

好ましい実施態様において、当該抽出物の使用は、（当該抽出物を受けていない対照対象体と比べて）対象体の運動からの回復を改善または促進する。

回復期間は、神経系、内分泌系および筋骨格系に重要な修復作業を実行する機会を与えるために必要である。筋肉系は、例えば、多大な労力の間に損傷した細胞を修復するのに時間を要する。筋肉は、また、栄養素を代謝し、グリコーゲン貯蔵を補充し、新たな酵素およびエネルギー産生性ミトコンドリアを合成するのに時間を要する。回復の間、神経系は、トレーニング中に用いられた特殊な運動パターンをより良く制御できるように該神経系にかけられたストレスに順応する。内分泌系は、平衡状態に戻らなければならない。炎症負荷の増大は、これらのプロセスを妨げる可能性があり、休憩中のトレーニングからの回復度を低下させ、最高の運動能力に不可欠であるトレーニングと回復のバランスを崩す可能性がある。

本発明の第二の態様によると、対象体の運動からの回復の促進に用いるための、血小板凝集阻害活性を有する、ナス科の果実の水溶性抽出物が提供される。

本発明者は、ほとんどの抗血小板薬（たとえば、アスピリン）が、対象体の運動誘発性全身性炎症の処置もしくは防止、または対象体の運動からの回復の促進に対して効果がないことを見出した。したがって、本発明者は、意外にも、抗血小板活性を有する公知の水溶性トマト抽出物（国際公開第９９／５５３５０号に開示されており、国際公開第２０１０／０４９７０７号に記載の創意に富んだ改良を有する）が、激しい運動をシミュレートする条件下で内皮型ＩＬ−６産生によって定義されるような運動誘発性炎症の軽減に対して効果を示さないということを見出した。

国際公開第２０１０／０４９７０７号には、最適な抗血小板活性を有する水溶性トマト抽出物の製造方法が記載されている。該水溶性抽出物は、人体臨床試験において、アデノシン二リン酸およびコラーゲンに反応して血小板凝集の防止または軽減に有意に効果があることが見出され、欧州では循環器の分野で健康効果を有する栄養補助食品として欧州食品安全機関（European Food Safety Authority）承認の栄養機能表示を付して販売されている。

本発明者が得た新しいデータ（実施例を参照）は、水溶性トマト抽出物（例えば、国際公開第２０１０／０４９７０７号の記載に従って製造）が、特に激しい運動を始める前に摂取されると、運動回復時間を減少させ、激しい運動の後の回復の質を改善することを示している。

運動誘発性全身性炎症の防止によって、対象体における激しい運動からの回復能が向上すると考えられる。

当該果実抽出物は、激しい運動からの回復を促進するために使用されるのが好ましい。「激しい運動（intensive exercise）」とは、本明細書では、ＶＯ₂ｍａｘの約６０％超に相当する強度で行われる運動を意味する。

当該果実抽出物は、哺乳動物対象体に与えられることができ、獣医学的に関心のある動物の処置（例えば、運動後またはレース後のウマの回復の改善）に有用性がある。しかしながら、対象体は、好ましくは、ヒト対象体であり、より好ましくは、上記で定義した激しい運動をまさに受けようとしているかまたは行ったばかりのヒト対象体である。本発明者は、健康な個体、および訓練を受けた運動選手または激しい運動からの最適な回復を望む「一流の」運動選手に投与した場合に、当該抽出物が最も効果的であることを見出した。

当該果実抽出物は、好ましくは、血小板凝集の防止に対する活性を有する実質的に熱安定な無色の分子量１０００未満の水溶性化合物を１種類以上含有するフラクションである、活性な水溶性トマト抽出物（ＷＳＴＣ）である。

当該抽出物は、皮をむいたフルーツおよび／またはフルーツの種の周辺の果汁から得られてもよい。

当該抽出物は、基本的には、果汁を含んでいてよく、その果汁を、さらに、本明細書の記載および国際公開第９９／５５３５０号または国際公開第２０１０／０４９７０７号の記載に従って処理することもできる。

当該抽出物は、トマトから単離され得、好ましくは、
（ａ）無色または淡黄色であること；
（ｂ）水溶性化合物であること；
（ｃ）分子量１０００未満の成分からなること；および
（ｄ）血小板凝集阻害活性を有するヌクレオシドを１種類以上含有すること
によって特徴付けられる、活性フラクションであってよい。

好ましい果実抽出物は、
（ａ）グリコシル化フェノール酸もしくはフェノール酸エステル、またはその誘導体；
（ｂ）グリコシル化フラボノイド；および
（ｃ）ヌクレオシド
を含む。

該グリコシル化フェノール酸またはフェノール酸エステルは、グリコシル化桂皮酸またはその誘導体であってよい。該グリコシル化桂皮酸またはその誘導体は、カフェオイル−４−Ｏ−キナ酸、カフェオイル−４−Ｏ−グルコシド、クマロイル−４−Ｏ−グリコシド（ｇｌｕｅ／ｇａｌ）およびクマロイル−４−Ｏ−グリコシド（二糖）からなる群から選択され得る。

該グリコシル化フェノール酸またはフェノール酸エステルは、カフェ酸グルコシド；ｐ−クマル酸ヘキソース／ジヒドロケンフェロールヘキソース；フェルラ酸グリコシド；およびｐ−クマル酸誘導体から選択され得る。

該グリコシル化フラボノイドは、ケルセチン−３−Ｏ−グルコシドまたはルチンであってよい。

該ヌクレオシドは、ＡＭＰ、ウリジン、アデノシン、グアノシンおよびＧＭＰからなる群から選択され得る。

最も好ましい実施態様では、該抽出物は、国際公開第９９／５５３５０号または国際公開第２０１０／０４９７０７号に記載の、血小板凝集予防に対する活性を有する抽出物である。

国際公開第９９／５５３５０号、および特に国際公開第２０１０／０４９７０７号にもまた、本発明に従って使用され得る抽出物の好ましい製造方法が記載されている。

国際公開第２０１０／０４９７０７号には、図２（果実から液体／シロップ抽出物を製造する方法）および図４（糖分を除去した粉末を製造するための抽出物の処理方法）において、抽出物の最も好ましい製造方法、および本発明に従って使用され得る抽出物自体が記載されている。これらの抽出物およびその製造方法は、出典明示により本明細書の一部を構成する。

本発明者は、さらに、水溶性トマト抽出物、および生物組織によって外因性一酸化窒素へ変換可能な硝酸塩（nitrate）を含む新規組成物を製造する研究開発を行った。

本発明者は、意外なことに、本発明の第一の態様または第二の態様に従って、当該果実抽出物と硝酸塩との配合物が有用であることを見出した。本発明者は、如何なる仮説に制約されることを望まないが、この配合物は、トロンビンおよびエピネフリンによる血小板活性化を標的とするだけではなく、血小板および内皮細胞が使用する一酸化窒素の内因性源が欠乏した場合にその外因性源をも提供するので、有効であると考えられる。

硝酸塩を加えた抽出物は、本発明の重要な特徴である。したがって、本発明の第三の態様に従って、
（ａ）血小板凝集阻害活性を有するナス科の果実の水溶性抽出物（ここで、該抽出物は、
（ｉ）分子量１０００未満の成分；および
（ｉｉ）血小板凝集阻害活性を有する、ヌクレオシド；グリコシル化フェノール酸もしくはフェノール酸エステル、またはその誘導体；またはグリコシル化フラボノイドの１種類以上
を含む）；
ならびに
（ｂ）食原性硝酸塩（dietary nitrate）源または内因性一酸化窒素の前駆物質
を含む組成物を提供する。

本発明の第三の態様の組成物中の該抽出物（ａ）は、血小板凝集阻害活性を有するナス科の果実の水溶性抽出物であってよい。好ましくは、該抽出物は、上記で定義されたもの、および特に国際公開第９９／５５３５０号または国際公開第２０１０／０４９７０７号に記載されたものである。

本発明の第三の態様の組成物での使用に好適な食原性硝酸塩源（ｂ）としては、新鮮な果実または野菜組織（vegetable tissue）の水性抽出物が挙げられ、ここで、選択された該果実または植物は、硝酸塩の最終抽出物濃度が７.５ｇ／Ｌを超えるかまたは約７.５ｇ／Ｌとなるように十分に高いレベルの硝酸塩を含有することが知られているものである。このような果実および植物の例としては、葉物野菜、例えば、ほうれん草の葉、ハナダイコン（rocket）の葉、レタスの葉、チャード（chard）の葉またはクレソン（watercress）の葉；アブラナ科の野菜、例えば、キャベツまたはケール；果実、例えば、イチゴ、リンゴまたはダイオウ（rhubarb）が挙げられる。

該食原性硝酸塩源は、新鮮なまたは凍結乾燥した果実または野菜組織から新たに調製されてよいか、または、濃縮果汁および濃縮野菜ジュースのような市販の商品生産物から供給されてよい。該濃縮物は、存在する硝酸塩含有量に応じて使用される用量を滴定することによって、硝酸塩含有量のために標準化され得る。別法として、食原性硝酸塩は、水を添加した後に新鮮な植物組織（plant tissue）を漬け込むこと；遠心分離または濾過によってパルプを除去すること；および、例えば凍結乾燥、低温真空乾燥または低温蒸発により、硝酸塩の分解を回避するために低温で濃縮することによって、調製され得る。このような調製物の硝酸塩含有量もまた標準化され得る。

食原性硝酸塩源は、単独で使用されてよいか、異なる原料からなる配合物（combination）が調製されてもよい。好ましい配合物の例としては、スイスチャード抽出物とダイオウ抽出物の配合物、またはイチゴ抽出物とダイオウ抽出物とレタス抽出物の配合物が挙げられる。

食原性硝酸塩源は、液体形態、または乾燥による水分除去後の粉末形態のいずれかで使用され得る。最終形態の食原性硝酸塩源中に存在する硝酸塩の最終濃度は、液体の場合には７.５ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌの範囲、または粉末の場合には７.５ｇ／ｋｇ〜８０ｇ／ｋｇの範囲であってよい。最終形態中に存在する亜硝酸塩（nitrite）のレベルは、液体の場合には１５０ｍｇ／Ｌを超えてはならず、粉末の場合には１５０ｍｇ／ｋｇを超えてはならない。

本発明の第三の態様による組成物、または意義ある数の他の成分が市販品（下記参照）に含まれる場合の該組成物を含む生成物は、６.５ｇ／Ｌ未満または６.５ｇ／ｋｇ未満の硝酸塩を含有するのが好ましい。好ましくは、該組成物または生成物は、約４００〜４５００ｍｇ／Ｌまたは約４００〜４５００ｍｇ／ｋｇの硝酸塩を含む。一の実施態様では、該組成物または生成物は、約１.６６６ｇ／Ｌまたは１.６６６ｇ／ｋｇの硝酸塩を含む。

本発明に従って、多数の内因性一酸化窒素前駆物質を使用してもよい。このような前駆物質は、体内で変換されて硝酸塩を形成し得る。例としては、シトルリン、グルタミンおよびアルギニンが挙げられる。本発明に従って使用するための最も好ましい前駆物質は、シトルリンである。

本発明の第三の態様による組成物は、また、第三の成分（ｃ）として、内因性一酸化窒素経路におけるコファクターとして作用する葉酸またはその代謝物も含むのが好ましい。葉酸は、内皮細胞による内因性一酸化窒素産生を維持するコファクターである。本発明者は、激しい運動をシミュレートする実験（実施例を参照）において、硝酸塩サプリメントと葉酸との複合効果が、意外にも、血小板活性化と炎症性マイクロパーティクル放出の両方の抑制を改善することを見出した。さらにまた、本発明の第三の態様の組成物は、活性内皮細胞内でのＩＬ−６産生について、水溶性トマト抽出物を単独で使用した場合よりも非常に大幅な減少を引き起こした。

本発明に従って使用され得る葉酸の代謝物の例としては、５−メトキシテトラヒドロ葉酸エステルまたはテトラヒドロ葉酸エステルが挙げられる。

本発明における使用に好適な、内因性一酸化窒素経路でコファクターとして作用する葉酸およびその代謝物の供給源は、典型的には、市販の医薬用調製物、例えばＤＳＭＫによって供給される葉酸ＢＰ／ＥＰ（純度９６％）である。

本発明の第四の態様によると、対象体の運動誘発性全身性炎症の治療または予防に使用するための本発明の第三の態様による組成物が提供される。

本発明の第五の態様によると、対象体の運動からの回復促進に使用するための本発明の第三の態様による組成物が提供される。

本発明の第三の態様による組成物は、本発明の第一の態様および第二の態様に関して記載したように使用され得、また、以下に記載するように使用され得る、好ましい組成物である。

医薬製剤および栄養補助食品
本発明の第一の態様および第二の態様に従って使用される果実抽出物、または本発明の第三の態様の組成物は、さらなる成分を用いずに調製され得るが（例えば、実施例１または２を参照）、好ましい実施態様では、当該抽出物および組成物は、商業上の特性を改善するため（例えば、運搬、保存可能期間、味などの改善）に、下記のように、また、実施例５に記載のように、他の剤を用いて製剤化される。

本発明の果実抽出物および組成物は、経口投与用に製剤化されてよい。例えば、ゲル剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤およびスナックバー、飲料品、インサート剤およびパッチ剤として製剤化され得る。このような製剤は、当業者に周知の方法に従って調製され得る。例えば、該抽出物または組成物は、例えば健康飲料として、経口投与用シロップまたは他の溶液に形成されてよい。該シロップまたは溶液に、糖、ビタミン、矯味矯臭剤、着色剤、保存剤および増粘剤から選択される１種類以上の賦形剤が含まれてよい。特定の浸透力を有する溶液、例えば等張液を提供するために、塩化ナトリウムまたは糖のような浸透圧調整剤を加えることができる。ｐＨを特定の値に調整するために、また、好ましくはその値に維持するために、緩衝剤のような１種類上のｐＨ調整剤を使用することもできる。緩衝剤の例としては、クエン酸ナトリウム／クエン酸緩衝剤およびリン酸塩緩衝剤が挙げられる。

別法として、当該抽出物または組成物は、乾燥されてよく（例えば、スプレー乾燥または凍結乾燥による）、該乾燥品は、固体または半固体投与剤形で、例えば錠剤、トローチ剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤またはゲル剤として、製剤化される。

本発明の第三の態様の抽出物または組成物を含有する組成物は、固体支持体、例えば、シュークロース、ラクトース、グルコース、フルクトースもしくはマンノースのような糖、またはキシリトール、ソルビトールもしくはマンニトールのような糖アルコール；またはセルロース誘導体からなる支持体の上に吸着させて調製されてよい。特に有用な他の吸着剤としては、穀粉（例えば、小麦粉およびコーンスターチ）のようなデンプン系吸着剤が挙げられる。

錠剤については、当該抽出物または組成物は、典型的には、典型的には、シュークロースおよびラクトースのような糖、およびキシリトール、ソルビトールおよびマンニトールのような糖アルコール；または粉末セルロースまたは微結晶セルロースまたはカルボキシメチルセルロースのような改質セルロースまたはセルロース誘導体などの希釈剤と混合されてよい。当該錠剤は、また、造粒剤、結合剤、滑沢剤および崩壊剤から選択される１種類以上の賦形剤をも含有する。崩壊剤の例としては、デンプンおよびデンプン誘導体、ならびに、他の膨潤性ポリマー、例えば、架橋カルボキシメチルセルロース、架橋ポリビニルピロリドンおよびデンプングリコール酸のような架橋ポリマー崩壊剤が挙げられる。滑沢剤の例としては、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸の塩およびステアリン酸が挙げられる。結合剤および造粒剤の例としては、ポリビニルピロリドンが挙げられる。希釈剤が本来あまり甘くない場合には、甘味料、例えば、グリチルリチン酸アンモニウム、またはアスパルテームもしくはサッカリン酸ナトリウムのような人工甘味料を添加することができる。

当該抽出物または組成物は、また、散剤、顆粒剤、ゲル剤、またはカプセル中に取り込むための半固体剤、として製剤化され得る。散剤の剤形で使用される場合、当該抽出物は、錠剤に関しては上記で定義した賦形剤の１種類以上と一緒に製剤化され得るか、または未希釈形態で提供され得る。ゲルもしくは半固体の剤形での提供については、乾燥した当該抽出物または組成物を、粘稠性液体、またはポリエチレングリコールのような半固体ビヒクル、または液体担体、例えばグリコール、例えばプロピレングリコール、またはグリコールまたは植物油もしくは魚油、例えば、オリーブ油、ヒマワリ油、サフラワー油、月見草油、大豆油、肝油、ニシン油などから選択される油に溶解または懸濁することができる。次いで、これらを、ハードゼラチンまたはソフトゼラチンのいずれかタイプのカプセル中に充填することができるか、または、ハードまたはソフトゲル化等価物から作ることができ、粘稠性液体または半固体充填物については、ソフトゼラチンまたはゼラチン等価カプセルが好ましい。一の好ましい実施態様では、本発明による抽出物または組成物は、所望により、カプセル、例えば、ハードゼラチンカプセル中に取り込むための好ましい固体（例えば、粉末）賦形剤と一緒に、粉末形態で提供される。

本発明の固体または半固体投与剤形は、製剤を約１０００ｍｇまで、例えば、約８００ｍｇまで含有することができる。

本発明の抽出物または本発明の第三の態様による組成物は、所定の濃度の血小板凝集阻害活性を有する化合物を含有する単位投与剤形の形態で提供され得る。このような単位投与剤形は、所望のレベルの生物活性を達成するように選択され得る。例えば、単位投与剤形は、本発明による果実抽出物または組成物を１０００ｍｇ（乾燥重量）まで、より典型的には８００ｍｇまで、例えば５０ｍｇ〜８００ｍｇ、例えば１００ｍｇ〜５００ｍｇ含有することができる。単位投与剤形に含まれ得る当該抽出物または組成物の特定の量は、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７００ｍｇ、７５０ｍｇおよび８００ｍｇから選択されてよい。

投与計画
本発明の第一の態様に従って使用される抽出物の量、または対象体への投与に要する本発明の組成物の量は、多くの要因に依存する。例えば、対象体がヒトである場合、必要量は、行われた運動の種類または行われる予定の運動の種類に依存する；該運動の期間；ヒトの適応能のレベル、ならびに対象体の年齢、性別および体重のような要因に依存する。

方法１.１（下記の実施例１を参照)に従って製造した液体抽出物について、本発明による果実抽出物の推奨される日用量は、０.５ｇ〜２０ｇであり、より好ましくは、２ｇ〜７ｇである。日用量は、約３ｇであってよい。ヒトについての典型的な投与計画は、運動する日ごとに、体重１ｋｇにつき約７０ｍｇ〜２８５ｍｇ、好ましくは約２５ｍｇ〜１００ｍｇであってよい。

方法１.２（下記の実施例１を参照）に従って製造した粉末抽出物について、推奨される日用量は、１０ｍｇ〜５００ｍｇであってよく、より好ましくは、約８５ｍｇ〜約１５０ｍｇである。ヒトについての典型的な投与計画は、運動する日ごとに、体重１ｋｇにつき約１ｍｇ〜２.２５ｍｇであってよい。

本発明の第三の態様による好ましい組成物は、水溶性トマト抽出物（例えば、先に記載した量）、および１用量につき硝酸塩２５ｍｇ〜２５０ｍｇ、好ましくは１用量につき硝酸塩５０ｍｇ〜１５０ｍｇ、最も好ましくは１用量につき硝酸塩約１００ｍｇを提供する食原性硝酸塩源を含む。該硝酸塩が、低い濃度の亜硝酸塩を含有する組成物中に含まれるのが最も好ましい。好ましくは、当該組成物は、１用量につき硝酸塩を４００ｍｇ未満含有する。

本発明の第三の態様による最も好ましい組成物は、水溶性トマト抽出物（例えば、１用量につき液体抽出物約３ｇ）および食原性硝酸塩源（例えば、１用量につき硝酸塩約１００ｍｇ）および葉酸を含む。葉酸は、１用量につき１０〜５００μｇ、好ましくは１用量につき５０〜４００μｇ、より好ましくは１用量につき１０〜３００μｇ；最も好ましくは１用量につき約２００μｇの範囲で含まれてよい。

対象体は、運動前に１用量の抽出物（ならびに所望により硝酸塩および葉酸）の投与を受けるのが好ましい。抽出物（ならびに所望により硝酸塩および葉酸）は、好ましくは、運動前のいつでも経口摂取される。例えば、午後または夕方に運動が行われる場合には、午前中または昼食時に１用量が摂取され得る。好ましくは、運動の０〜５時間前に摂取され、より好ましくは運動の１.５〜３時間前に摂取される。

かくして、本発明のさらなる態様によると、硝酸塩２５ｍｇ〜２５０ｍｇを含む本発明の第三の態様による組成物を含む投与剤形が提供される。

当該投与剤形は、硝酸塩約１００ｍｇを含むのが好ましい。

当該投与剤形は、葉酸を１０μｇ〜５００μｇ、好ましくは１用量につき５０〜４００μｇ、より好ましくは１用量につき１０〜３００μｇ；最も好ましくは１用量につき約２００μｇ含有してよい。

当該投与剤形は、投与計画という見出しで上記したナス科の果実の水溶性抽出物を含んでよい。

ヒトが摂取するのに好ましい組成物
当該抽出物または組成物は、栄養補助食品（food supplement）または食品添加物として提供され得るか、または食品、例えば機能性食品または栄養補給食品（nutraceuticals）に取り込まれ得る。

ゲル製品
栄養補助食品として摂取するための水性ゲル製品は、本発明の好ましい組成物である。このようなゲルは、運動前にパッケージングを破いて開けてゲルを摂取することができるように包装され得る。

当該ゲル製品は、上記のようなナス科の果実の水溶性抽出物を含有する。好ましくは、該ゲルは、上記のような食原性硝酸塩源または内因性一酸化窒素前駆物質を含んでおり、最も好ましくは、葉酸またはその誘導体を含む。ゲル製品は、さらに、電解質、炭水化物、抗酸化物質、保存剤、矯味矯臭剤および甘味料のうち１種類以上を含んでよい。

ゲル剤は、パッケージングから絞り出されて容易に摂取されるように修正されたコンシステンシーを有する可食ゲルを形成する適切な剤を含む。

当業者に知られている数多くの適切なゲル化剤（gel agent）が使用され得る。例えば、ジェランガム（例えば、Ｋｅｌｃｏｇｅｌ−Ｆ）を使用することができる。いくつかの実施態様では、該ゲルは、２種類のゲル化剤を含んでよい。例えば、ジェランガムおよびキサンタンガムを含んでよい。

好ましいゲル剤は、国際公開第２００７／０８３１１７号において定義されており、そこに記載の方法に従って製造される（例えば、該国際公開の明細書の第１９頁〜第２２頁に記載されるように）。当然のことながら、本発明によるゲル剤は、国際公開第２００７／０８３１１７号に記載されるように等張性であってよいが、本発明による使用には必ずしも等張性である必要はない。例えば、下記の、また、実施例に記載の好ましい製品は、等張性ではない。当業者には当然のことであるが、製品の等張性は、必要に応じて容易に適応できる。

本発明に従って使用するための最も好ましいゲル製品は、以下の範囲の成分を有することができる：

アスリートに与えるための典型的な用量は、上記ゲル１０〜２００ｍｌ、好ましくは２０〜１５０ｍｌ、より好ましくは３０〜１００ｍｌ、より好ましくは４０〜８０ｍｌ、最も好ましくは約６０ｍｌである。

当然のことながら、上記成分の多くは、経口摂取のためのゲルを製剤化する技術分野の当業者によって調整または代用が可能である。例えば、エネルギー源としてマルトデキストリンを使用することができ、この場合、水の量は、５０％まで減らすことができる。

矯味矯臭剤は、選ばれた味のゲルを調製するように選択され得る。例えば、好ましいゲルは、バナナ風味およびマンゴー風味である。別法として、クロフサスグリ（blackcurrant）風味、オレンジ風味またはトロピカル風味が使用され得る。

粉末製品
本発明による抽出物および組成物は、また、溶液として再構成するための粉末の形態で提供され得る。例えば、それらは、糖のような可溶性賦形剤、クエン酸塩緩衝剤およびリン酸塩緩衝剤のような緩衝剤を含有することもでき、炭酸塩、例えば、炭酸水素ナトリウムまたは炭酸水素アンモニウムのような炭酸水素塩、ならびに固体酸、例えば、クエン酸およびクエン酸塩から形成される発泡剤を含んでよい。

方法１.２（下記）に従って調製される粉末抽出物は、好ましくは、粉末製品に使用される。

分包（sachet）に充填するために粉末混合物を使用することができる。好ましい分包用混合物は食原性硝酸塩源を含んでおり、最も好ましい分包用混合物は葉酸を含んでいる。典型的な分包用粉末は、以下の成分を含み得る：

分包用混合物で使用するためのフレーバーの例としては、レモンフレーバーおよびベリーフレーバーが挙げられる。

このような分包用粉末は、１０〜１５０ｇ、より好ましくは約２５〜７５ｇの投与単位に分けられてよく、最も好ましくは、５０ｇに分けられ、分包中に密封される。使用時には、当該粉末を水５０〜２５０ｍｌと混合し、運動開始前に摂取することができる。

別法として、粉末は、分散錠（ｆｉｚｚ錠（fizz tab）としても知られている）を形成するように製剤化されてよい（例えば、結合剤を使用してもよい粉末の圧縮による）。典型的な分散錠は、成分を以下の量で含有するように調製され得る：

このような錠剤は、１〜３０ｇであってよく、好ましくは２〜２０ｇであってよく、最も好ましくは１０ｇ錠剤として製剤化される。使用時には、１０ｇ錠剤を水５０〜２５０ｍｌに溶解し、運動開始前に摂取することができる。

フードバー
本発明に従って使用される抽出物または本発明の第三の態様による組成物は、また、スナックフードバー、例えば、フルーツバー、ナッツバーおよびシリアルバーに取り込むために粉末の形態で提供され得る。スナックフードバーの形態で提供するために、当該抽出物または組成物は、日干ししたトマト、レーズンおよびスルタナのような乾燥フルーツ果実、落花生（groundnut）、またはオート麦および小麦のような穀物から選択される１種類以上の成分と混合され得る。

好ましいフードバーは、成分を以下の量で含有するように調製され得る：

フレーバーは、例えば、アップルおよびクロフサスグリ、チョコレートまたはブルーベリーであってよい。

当然のことながら、フードバーは、さまざまなサイズであってよく、このサイズは、多くの要因（バーに含まれる水溶性抽出物、および任意の硝酸塩および葉酸の量を含む）に依存する。典型的には、バーは、１０〜２００ｇ、好ましくは２０〜６０ｇ、最も好ましくは約４０ｇであってよい。フードバーは、最適な効果のためには運動前に摂取されるべきである。

本発明による抽出物を含む最も好ましい製品は、実施例５で定義される。

本発明の抽出物もしくは組成物、またはその製剤は、投与説明書とともに、容器、パックまたはディスペンサーに含まれ得る。

効果の指標
多くの様々なパラメーターを参照して、本発明の抽出物を含む組成物の有益な効果を提供する能力を評価することができる。

下記の実施例は、治療効果を評価するために研究され得る血小板凝集または一次止血の評価に好適なプロトコルの詳細を記載する。実施例に記載のＰＦＡ−１００（登録商標）血小板機能分析器は、一次止血の評価のための比較的新しい装置であるが、十分に確認されている（例えば、“The platelet-function analyzer (PFA-100^R) for evaluating primary hemostasis” by M. Franchini Hematology, Volume 10, Issue 3 June 2005, pages 177-181を参照）。

トロンビン生産能の測定は、血液疾患の評価または抗血栓治療の効力の評価に一般的に使用される標準的なプロトコルであり、自動凝固測定装置（automated coagulometer）によって、または手動で、行うことができる。
循環細胞由来マイクロパーティクルは、凝固促進能力および炎症の指標であり、フローサイトメトリー法によって最も正確に測定され得るが、他の方法も存在する。

ＩＬ−６の測定は、最も一般的には、ＥＬＩＳＡによって、またはＬｕｍｉｎｅｘのような自動システムによって、行われる。ＩＬ−６は、最も広く容認されている炎症のバイオマーカーの１つである。

運動からの回復の評価は、多くの系が関係しているので、複雑である。しかしながら、ウェルビーイング（wellbeing）の簡単な測定は、回復のモニターリングにかなり良好であり、最もよく使用されるものとしては以下のものが挙げられる：ノルエピネフリン血漿中濃度の測定；運動セッション前後の筋力（muscular strength and power）のモニターリング；運動後の筋痛の評価（例えば、ＤＯＭＳ（遅発性筋痛）の程度を測定するための有効なアンケートを使用）；睡眠障害の記録（例えば、睡眠中の四肢の運動を測定する装置を使用）；ストレスおよび疲労の評価（例えば、アスリートへの使用が有効なＰＯＭＳ（気分状態のプロフィール）または修正ＰＯＭＳアンケートの使用）；運動中の主観的作業強度のモニターリング（例えば、有効なアンケートシステムを使用）；活動中の心拍数のモニターリング、および全体的な気分のモニターリング（例えば、修正ＰＯＭＳアンケートを使用）。これらの変数は、有効な回復の信頼性のある指標であることが複数の研究によって立証されている。ＤＯＭＳが循環ＩＬ−６レベルと相関することもまた示されている。

本発明の別の態様
本発明のさらなる態様に従って、激しい運動からの回復を促進する方法であって、処置を必要とする対象体に、血小板凝集阻害活性を有するナス科の果実の水溶性抽出物を投与することを含む方法が提供される。

本発明の別の態様に従って、運動誘発性全身性炎症を防止するかまたはその重症度を軽減する方法であって、処置を必要とする対象体に、血小板凝集阻害活性を有するナス科の果実の水溶性抽出物を投与することを含む方法が提供される。

本発明の別の態様に従って、対象体の運動誘発性全身性炎症を処置または防止するための、血小板凝集阻害活性を有するナス科の果実の水溶性抽出物の使用が提供される。

本発明の別の態様に従って、対象体の運動誘発性全身性炎症の処置用または防止用の医薬の製造における血小板凝集阻害活性を有するナス科の果実の水溶性抽出物の使用が提供される。

本発明の別の態様に従って、激しい運動からの回復を促進するための、血小板凝集阻害活性を有するナス科の果実の水溶性抽出物の使用が提供される。

本発明の別の態様に従って、激しい運動からの回復の促進のための医薬の製造における血小板凝集阻害活性を有するナス科の果実の水溶性抽出物の使用が提供される。

図面の簡単な説明
ここで、下記の実施例によって、また、添付した図面を参照して、本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

図１は、実施例３に記載される、血小板リッチ血漿を水溶性トマト抽出物（ＷＳＴＣ）と一緒にインキュベートすることの、トロンビンおよびエピネフリンに応答する血小板凝集に対する効果を示す。 図２は、実施例３に記載される、水溶性トマト抽出物（ＷＳＴＣ）による処置の、トロンビンおよびエピネフリンに曝露した血小板からのマイクロパーティクル放出に対する効果を示す。 図３は、実施例３に記載される、水溶性トマト抽出物（ＷＳＴＣ）による処置の、トロンビンおよびエピネフリンによって活性化された血小板およびマイクロパーティクルへの曝露後のＩＬ−６の内皮細胞放出に対する効果を示す。「ｃｏｎ−」は、活性化血小板−白血球懸濁液で処理されていない対照ＨＵＶＥＣ細胞を表す。「ｃｏｎ＋」は、血小板−白血球懸濁液で処理され、処理として生理食塩水を使用した、ＨＵＶＥＣ細胞を表す。ＷＳＴＣは、活性化血小板−白血球懸濁液と一緒にインキュベートされ、処理としてＷＳＴＣを使用した、ＨＵＶＥＣ細胞を表す。 図４は、実施例４に記載される、血小板リッチ血漿を、水溶性トマト抽出物（ＷＳＴＣ）＋食原性硝酸塩（ＮＯ３）、および水溶性トマト抽出物（ＷＳＴＣ）＋食原性硝酸塩＋葉酸と一緒にインキュベートすることの、トロンビンおよびエピネフリンに応答する血小板凝集に対する効果を示す。 図５は、実施例４に記載される、水溶性トマト抽出物（ＷＳＴＣ）＋食原性硝酸塩（ＮＯ３）、および水溶性トマト抽出物＋食原性硝酸塩＋葉酸による処理の、トロンビンおよびエピネフリンに曝露した血小板からのマイクロパーティクル放出に対する効果を示す。 図６は、実施例４に記載される、水溶性トマト抽出物（ＷＳＴＣ）＋食原性硝酸塩（ＮＯ３）、および水溶性トマト抽出物＋食原性硝酸塩＋葉酸による処理の、トロンビンおよびエピネフリンによって活性化された血小板およびマイクロパーティクルへの曝露後のＩＬ−６の内皮細胞放出に対する効果を示す。「ｃｏｎ−」は、活性化血小板−白血球懸濁液で処理されていない対照ＨＵＶＥＣ細胞を表す。「ｃｏｎ＋」は、血小板−白血球懸濁液で処理され、処理として生理食塩水を使用した、ＨＵＶＥＣ細胞を表す。ＷＳＴＣ＋ＮＯ３、およびＷＳＴＣ＋ＮＯ３＋葉酸は、活性化血小板−白血球懸濁液と一緒にインキュベートされ、処理として、それぞれ、ＷＳＴＣ＋ＮＯ３、またはＷＳＴＣ＋ＮＯ３＋葉酸を使用した、ＨＵＶＥＣ細胞を表す。 図７は、健康な対象体（ｎ＝３）のベースライン（補給前）、運動前（補給後）および運動後の血小板由来マイクロパーティクルのカウントを示す。Ｐ＝プラセボ補給。ＦＦ＝実施例６に記載される、ＷＳＴＣ、食原性硝酸塩および葉酸の好ましい配合物。 図８は、健康な対象体（ｎ＝３）のベースライン（補給前）、運動前（補給後）および運動後の血漿トロンビン生産能（ｎＭ）を示す。Ｐ＝プラセボ補給。ＦＦ＝実施例６に記載される、ＷＳＴＣ、食原性硝酸塩および葉酸の好ましい配合物。 図９は、健康な対象体（ｎ＝３）のベースライン（補給前）、運動前（補給後）および運動後の循環血漿ＩＬ−６濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。Ｐ＝プラセボ補給。ＦＦ＝実施例６に記載される、ＷＳＴＣ、食原性硝酸塩および葉酸の好ましい配合物。

実施例１
血小板凝集阻害活性を有するトマト水溶性抽出物を以下のプロトコルに従って調製した：

１.１ 本発明に従って使用されてよい液体（シロップ）抽出物を国際公開第２０１０／０４９７０７号の実施例２および図２のプロトコルに従って調製した。

１.２ 本発明に従って使用されてよい粉末抽出物（糖含量が低い）を国際公開第２０１０／０４９７０７号の実施例３および図４のプロトコルに従って調製した。

実施例２
実施例２は、水溶性トマト抽出物、食原性硝酸塩源および葉酸源の配合物を含む、本発明の第三の態様による好ましい組成物の調製方法を提供する。

２.１ 該水溶性トマト抽出物は、実施例１に概略記載されたように供給され、調製されたものである。実施例１.１に記載された抽出物を希釈するか、または、実施例１.２に記載された粉末抽出物を脱イオン水に溶解することによって、この抽出物の４３０μｇ／ｍｌの濃度の溶液を調製した。得られた４３０μｇ／ｍｌの溶液を、実験プロトコルで用いるためにｐＨ７.４に緩衝化し、さらに１０倍希釈して最終作用濃度を４３μｇ／ｍｌとした。この濃度は、最も好ましい単位投与量（液体抽出物（１.１）３ｇ、粉末抽出物（１.２）１５０ｍｇ）の経口摂取の約３時間後の、該抽出物内にある抗血小板化合物の計算上の最大循環血漿濃度を表す。

２.２ Diana Naturals（France）から食原性硝酸塩リッチ抽出物を入手した。これは、約２０ｇ／Ｌの濃度の無機硝酸塩および１５０ｍｇ／Ｌ未満の濃度の無機亜硝酸塩を含有する約６０ Ｂｒｉｘの水溶性スイスチャード抽出物を含んでいた。該原抽出物を脱イオン水で希釈することによって、１８６ｍｇ／ｍｌ硝酸塩濃度のこの抽出物の溶液を生成した。得られた溶液を、実験プロトコルで用いるためにｐＨ７.４に緩衝化し、さらに１０倍希釈して最終作用濃度を１８.６ｍｇ／ｍｌとした。スイスチャード抽出物のこの濃度は、３７２nｇ／ｍｌ硝酸塩の最終作用濃度に相当する。食原性硝酸塩が野菜抽出物の形態で消費された場合の公開データに基づくと、血漿中の３７２nｇ／ｍｌ硝酸塩のこの濃度は、１００ｍｇ用量の食原性硝酸塩を消費してから３時間後に得ることができた（Cermak N et al, Int J Sport Nutr Exerc Metab 2012, 22, 64-71）。

２.３ 葉酸源は、供給元ＤＭＳＫから入手した葉酸ＥＰ／ＢＰであった。この物質は水不溶性であり、希酸に溶解することによって、５０nｇ／ｍｌの濃度のこの物質の溶液を生成した。得られた溶液を調製したらすぐに、物質を沈殿させずにｐＨ７.４に緩衝化し、実験プロトコルで使用し、さらに１０倍希釈して、最終作用濃度を５nｇ／ｍｌとした。これは、ＵＫ ＲＤＡの葉酸２００μｇを供給するマルチビタミン／ミネラルサプリメント（Navarro M et al, JACN, 2003, 22, 124-132）による補給の３時間後の典型的な血漿中葉酸エステル濃度に相当する。

２.４ 上記のように供給され調製された成分を使用し、２.１に記載の調製された抽出物溶液および２.２に記載の調製された食原性硝酸塩溶液を等量で混合することによって混合物を調製した。この混合物を実験プロトコルで１０倍希釈すると、抽出物の最終濃度が４３ｍｇ／ｍｌとなり、食原性硝酸塩の最終濃度が３７２nｇ／ｍｌとなる。これらの量は、シロップ抽出物（１.１）３ｇ、およびスイスチャード抽出物５ｇからの食原性硝酸塩１００ｍｇを経口摂取して３時間後に血漿中を循環すると予測される各成分のおよその濃度である。

２.５ 上記のように供給され調製された成分を使用し、２.１に記載の調製された抽出物溶液、２.２に記載の調製された食原性硝酸塩溶液および２.３に記載の調製された葉酸溶液を等量で混合することによって混合物を調製した。この混合物を実験プロトコルで１０倍希釈すると、抽出物の最終濃度が４３ｍｇ／ｍｌとなり、食原性硝酸塩の最終濃度が３７２nｇ／ｍｌとなり、葉酸の最終濃度が５nｇ／ｍｌとなる。これらの量は、ＷＳＴＣシロップ濃縮物３ｇ、スイスチャード抽出物５ｇからの食原性硝酸塩１００ｍｇ、および葉酸２００μｇを経口摂取して３時間後に血漿中に循環すると予測される各成分のおよその濃度である。この活性成分混合物は、本発明の第三の態様による好ましい組成物である。該混合物にゲル化剤および他の成分を添加して、６０ｍｌの体積の最終ゲル生成物を調製してよい。

実施例３
本発明は、水溶性トマト抽出物が、激しい運動の影響を受け、かつ、激しい運動によって生じた炎症性応答の異なる態様を表す、３種類の生物学的系をモジュレートすることを意外にも確立した研究に基づいている。これら３種類の生物学的系は、以下のものである：トロンビンおよびエピネフリンの血流中への運動誘発性放出ならびに循環一酸化窒素の欠乏に起因して激しい運動によって強く活性化されることが知られている止血系の一部である血小板；血小板および白血球活性化の指標ならびに炎症の指標である循環形質細胞由来マイクロパーティクル；ならびに内皮細胞サイトカイン放出、特に最良の有効な炎症マーカーの１つであるサイトカインＩＬ−６。激しい運動は、血小板活性化および血小板−白血球マイクロパーティクル放出から始まり、活性化血球細胞および生成されたマイクロパーティクルへの曝露の結果としての内皮細胞サイトカイン放出へと続く、全身性炎症を引き起こす連鎖反応を誘発すると考えられる。この全身性炎症は、運動からの回復を遅延させることがあり、パフォーマンス向上に必要な高負荷の運動セッションの持続を困難にする。
本発明者は、トロンビンおよびエピネフリン誘発性血小板凝集、血小板および白血球からの凝固促進性および炎症誘発性マイクロパーティクル放出、ならびに内皮細胞サイトカイン放出の防止における種々の量の水溶性トマト抽出物成分の効果を試験した。使用したトロンビンおよびエピネフリンのレベルは、高負荷運動中の血液で測定されたレベルと一致していた。

３.１．方法
３.１.１ 処理溶液として使用するためのトマト抽出物、および対照溶液の調製
生物学的活性を試験するための実験における使用に好適なトマト抽出物の溶液を調製するために、実施例１の記載に従って調製した６２°Ｂｒｉｘの液体トマト抽出物を、実施例２.１の記載に従って４３０μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。対照溶液として、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Sigma-Aldrich UK）を調製した。

３.１.２ 血小板凝集阻害活性のアッセイ方法
調製された抽出物または対照と一緒に血小板をインキュベートした後に達成された、トロンビンアナログＴＲＡＰ（トロンビン受容体活性化ペプチド）およびエピネフリン（激しい運動負荷に関係する）の複合物によって引き起こされる血小板凝集の阻害の程度を比較するために、下記の実験プロトコルが考案された。

静脈切開および血液サンプル
血小板機能が正常な１８歳〜６０歳の男性および女性であって薬物フリーの健康なヒトボランティアからインビトロ研究のための血液を採取した。対象体は、血液サンプル提供前の少なくとも１０日間は血小板機能に影響を及ぼすことが知られている薬物またはサプリメントを摂取しなかったと宣言した。シリコーン処理した針で前腕前部を１回静脈穿刺して、プラスチック製のクエン酸入り採血管（Ｓａｒｓｔｅｄｔ Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ、クエン酸ナトリウム最終濃度１３ｍｍｏｌ／Ｌ）中に血液を採取した。採血時から全血液を３７℃で維持した。

血小板リッチ血漿の調製
クエン酸処理した血液を２００×ｇで１５分間遠心分離して、血小板リッチ血漿（ＰＲＰ）を得、使用前に、血小板が乏しい血漿を用いて、標準血小板数３２０±２０×１０⁹／Ｌに調整した。２時間以内に血小板機能測定のためにＰＲＰを使用した。

血小板アゴニスト
血小板機能測定のために以下のアゴニストを使用した。ＴＲＡＰ、最終濃度２ｎｍｏｌ／Ｌ；エピネフリン、最終濃度０.１５μｍｏｌ／Ｌ（どちらも、Sigma-Aldrich（Poole、UK）から入手）。使用直前に、温めた生理食塩水（０.９％ＮａＣｌ）で貯蔵液を希釈してアゴニストを調製し、混合して、ＴＲＡＰ／エピネフリン複合アゴニストを得た。これらの濃度では、どちらのアゴニストも、個別には、血小板凝集反応を誘発することはできなかった。しかしながら、合わせると、エピネフリンのＴＲＡＰに対する増強効果によって強い血小板反応が生じた。

ＰＲＰとともに処理溶液（３.１.１）のインキュベーション
ローリテンションエッペンドルフ中にて、ＰＲＰ １８０μＬを、調製した処理溶液または対照溶液２０μＬと一緒に３７℃で１０分間インキュベートした。

血小板凝集の測定および凝集の阻害
血小板阻害剤と一緒にインキュベートした後、ＰＲＰサンプルをガラスキュベットに移し、ＴＲＡＰ／エピネフリン複合アゴニストによって誘発された凝集の程度を、血小板凝集測定装置（Ａｇｇｒａｍ、Helena Biosciences、Sunderland、UK）で１０分間にわたってモニターした。作成された凝集曲線から、各ＰＲＰサンプルについて曲線下面積を算出し、これらＰＲＰサンプルについての曲線下面積を対照サンプルのものと比較することによって、処理溶液によって達成された凝集阻害を算出した。結果を図１に示す。

３.１.３ 細胞由来マイクロパーティクルの放出のアッセイ方法
調製した抽出物または対照の存在下での、トロンビンおよびエピネフリン（激しい運動負荷に関係する）の複合物への曝露の後にインタクト血小板から放出された血小板由来マイクロパーティクルの数を比較するために、下記の実験プロトコルが考案された。

静脈切開および血液サンプル
上記３.１.２の記載に従って、血小板機能が正常な１８歳〜６０歳の男性および女性であって薬物フリーの健康なヒトボランティアからインビトロ研究のための血液を採取した。

血小板が乏しい血漿の調製
採取から１０分以内に、クエン酸処理した全血を室温にて２０００ｇで２０分間遠心分離して、血小板が乏しい血漿（ＰＰＰ）を単離した。

アゴニストの調製
激しい運動を刺激するように設計された方法で血小板の活性化を刺激するために使用したアゴニストは、再度、トロンビンおよびエピネフリンの複合物であった。これらを、上記３.１.２の記載に従って、調製した。

抽出物および対照溶液の調製
上記３.１.２の記載に従って、調製したＰＰＰと一緒にインキュベートするための処理溶液および対照溶液を調製した。

ＰＰＰとともに処理溶液のインキュベーション
ローリテンションエッペンドルフ中にて、ＰＰＰ １８０μＬを、調製した処理溶液または対照溶液２０μＬと一緒に３７℃で１０分間インキュベートした。

トロンビン−エピネフリンによる処理の前および後のマイクロパーティクルの測定
血小板由来マイクロパーティクルを、溶液／懸濁液中での標識粒子の定量を行うフローサイトメトリーで検出した。処理溶液または対照溶液で予め処理しておいた該ＰＰＰサンプルを、ＴＲＡＰ／エピネフリン複合アゴニスト、またはＰＢＳのいずれかの添加によって活性化し、１０分間放置した。次に、該活性化サンプルを異なる蛍光標識抗体と一緒にインキュベートした。血小板由来マイクロパーティクルを検出するために、抗ＣＤ６１−ＰｅｒＣＰモノクローナル抗体（BD Bioscience、San Jose、CA、USA）を使用した。ＬＭＰを標識するために、抗ＣＤ４５−ＰＥ（BD Pharmingen、BD Bioscience）モノクローナル抗体を使用した。バックグラウンドノイズを規定するためにＰＥ−およびＰｅｒＣＰ複合アイソタイプ対照（ＩｇＧ１、BD Bioscience）を使用した。活性化ＰＰＰ ２５μＬを各抗体５μＬと一緒に、暗所にて室温で２０分間インキュベートし、次に、冷（４℃）ＦＡＣＳＦｌｏｗ（ＦＡＣＳＦｌｏｗ Ｓｈｅａｔｈ Ｆｌｕｉｄ、BD Bioscience）４７０μＬを添加した。

これらのサンプルをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターに通し、マイクロパーティクルゲート（＜１μ、１μビーズによって決定）内にある抗体標識粒子をカウントした。高流速で１００秒間カウントした後、データを得、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（version 2: BD Biosciences）で分析した。読み取り時間にサンプル流速を乗じて推定した読み取った体積によって各サンプル中のマイクロパーティクル濃度を算出した。結果をＰＰＰ １μＬ当たりのマイクロパーティクルの数で表し、図１に示した。

３.１.４ トマト抽出物処理溶液および対照溶液と一緒にインキュベートした内皮細胞からのＩＬ−６の放出を測定する方法
処理抽出物および対照抽出物の調製
上記３.１.２の記載に従って、細胞懸濁液と一緒にインキュベートするための処理溶液および対照溶液を調製した。

処理抽出物および対照抽出物の存在下での活性化血小板−白血球懸濁液および不活化対照懸濁液の調製
クエン酸処理した全血４５０μｌを２本の１２ｍｌローリテンション管に等分した。各々に、原貯蔵液から１０倍希釈した希溶解剤（Ｈａｅｍｏｌｙｓｅ、Sigma−Aldrich UK）４.５ｍｌを加え、各管に蓋をし、よく混合し、室温で１０分間放置した。次に、該溶血サンプルを４００ｇで１０分間遠心分離した。上清４.５ｍｌを取り出して廃棄した。該ペレットにＨｅｐｅｓ−Ｍｇ緩衝液２５０μｌを加え、混合し、エッペンドルフに移した。上記の管をさらなるＨｅｐｅｓ−Ｍｇ緩衝液２５０μｌで洗浄し、該洗液を移して約１ｍｌの体積にした。該懸濁液を混合し、次に、上記と同様に遠心分離した。上清９００μｌを取り出して廃棄した。各管に残っている１００μｌに、Ｈｅｐｅｓ−Ｍｇ緩衝液２５０μｌを加え、懸濁液を完全に混合した。Ｓｙｓｍｅｘ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｓｅｒ（Sysmex UK）を使用して懸濁液中の細胞をカウントし、白血球カウントが３.３〜３.４×１０³／μｌとなるように懸濁液の最終体積を調整した。

１つの懸濁液に、ＴＲＡＰ／エピネフリンアゴニストを、貯蔵液の１０倍希釈が達成されるような量で加え、活性化細胞懸濁液を得た。別の懸濁液には、ＰＢＳおよびプロスタグランジンＥ２溶液１０μｌを加えて、該細胞を不活化状態に保持した。

内皮細胞培養液の調製
Ｔ７５ｃｍフラスコ中、培地にとって特異的な成長因子および抗生物質からなるＥＧＭ−２ブレット（bullet）キットサプリメントを加えたＥＢＭ−２培地（Lonza、Switzerland）中にて、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（Lonza Switzerland）を培養した、該細胞を５％ＣＯ₂の存在下にて３７℃で維持した。この培地を２日ごとに交換し、コンフルエンス前まで細胞を継代培養し続けた。

約７５％コンフルエンスの細胞を６ウェルプレート中に継代培養した。最初に、Ｔ７５フラスコ中の培地を廃棄し、残った細胞単層をｄ−ＰＢＳ（Lonza、Switzerland）約２ｍｌで３回洗浄した。直後に、トリプシン（Lonza、Switzerland）２ｍｌを加えて、フラスコの壁面から細胞層を分離した。次に、該フラスコ（Ｔ７５）を顕微鏡下で検査して、該フラスコの底面から細胞のすべてを確実に取り出した。２分後、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）約２ｍｌを加えて、細胞のトリプシンによる消化を阻害した。その後、残りの体積を測定し、６ウェルプレート（各ウェル２ｍｌ）を満たすのに必要な培地の残分を加えた。細胞が１００％コンフルエントになるまで、さらなる処理を施す前に１〜２日間、該プレートを３７℃に維持した。

内皮細胞の処理
コンフルエントＨＵＶＥＣを、上記に従って調製した処理溶液または対照溶液を加えたＥＭＢ−２中にて２４時間培養した。処理溶液および対照溶液は、インキュベーション前に細胞培養培地で希釈され、調製した貯蔵液の１０倍希釈を達成するのに十分な量で加えられた。

処理から２４時間後、該培地を１ウェルごとに３つのアリコートに等分して回収し、液体窒素で即座に凍結させ、−８０℃で貯蔵した。さらなる処理のために新鮮な培地を該細胞に加えた。３nｇ／ｍｌのＴＮＦ−α、または上記活性化血小板−白血球懸濁液１ｍｌとともに、該細胞をさらに２４時間インキュベートし、ウェルの１つを、刺激物質を含まないように維持して、対照とした。

放出されたＩＬ−６をアッセイする方法
製造者の説明書（Biosource、UK）の記載に従って、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−６を検出した。簡潔には、１：２に希釈した細胞培養上清（１００μｌ）を１時間インキュベートし、次に、ウェルを洗浄緩衝液で４〜５回洗浄し、抗ＩＬ−６コンジュゲート１００μｌおよび溶液Ａ ５０μｌを充填した。室温で１時間インキュベートした後、ウェルを再度洗浄し、各ウェルにクロモゲン２００μｌを充填し、１５分間インキュベートした。停止液１００μｌを添加して該反応を終了させた。吸光度を４５０ｎｍで測定した。キットで与えられた異なるＩＬ−６標準（１６〜１６９０ｐｇ／ｍｌの濃度）をアッセイすることによって標準曲線を得た。

実験３.１.４の結果を図３に示す。

３.２ 結果
上記の実験の結果は、図１、図２および図３にてグラフで示されている。

３.３ 結論
実施した実験は、ナス科の果実の水溶性抽出物が、トロンビンおよびエピネフリン媒介活性化の増大によって特徴付けられる、既知の抗血小板薬によっておおむね影響を受けない、激しい運動に付随する血小板活性化を抑制する能力を有することを示している。さらに、該抽出物のこの主たる作用によって、血小板活性化の結果である血小板マイクロパーティクル放出が抑制される。血小板マイクロパーティクルは、循環細胞マイクロパーティクル数の約７０％までを占め、全身を操作する重要な炎症性情報伝達系として認められている。それらは、また、高い凝固促進性を有しており、トロンビン放出を悪化させる能力、ならびに運動セッション後長時間にわたって凝固促進性および炎症誘発性状態を維持する能力を有している。トロンビンおよびエピネフリンによって生じる血小板および白血球マイクロパーティクルの内皮細胞に対する効果が内皮細胞からのＩＬ−６放出の増大であることが立証された。本発明の抽出物の溶液の生理学的に関連性のある量による内皮細胞の前処理がこのＩＬ−６放出を抑制し、結果として内皮の炎症性状態の低下をもたらすことが示された。別の研究では、循環ＩＬ−６の抑制が回復時間および遅発性筋痛に影響を及ぼすことが示された。したがって、激しい運動の前にナス科の果実の水溶性抽出物によって前処理することによって、運動後の回復の促進が助けられる。

実施例４
本発明者は、また、実施例３で試験した生物学的系の活性化の防止における実施例２に記載した本発明の第三の態様の好ましい組成物の効力を試験した。

４.１．方法
４.１.１ 処理溶液として使用するための水溶性トマト抽出物と食原性硝酸塩源および葉酸との配合物、ならびに対照溶液の調製
食原性硝酸塩および葉酸と合わせたナス科の果実の水溶性抽出物の生物学的活性を試験する実験において使用するために、実施例２.４および２.５に記載の好ましい調製物を使用した。対照溶液としてＰＢＳを調製した。

４.１.２ 血小板凝集阻害活性をアッセイする方法
４.１に記載の処理溶液を使用したこと以外は、３.１.２に記載の実験プロトコルの詳細に正確に従った。結果を図４に示す。

４.１.３ 細胞由来マイクロパーティクルの放出をアッセイする方法
４.１に記載の処理溶液を使用したこと以外は、３.１.３に記載の実験プロトコルの詳細に正確に従った。結果を図５に示す。

４.１.４ トマト抽出物処理溶液および対照溶液と一緒にインキュベートした内皮細胞からのＩＬ−６の放出を測定する方法
４.１に記載の処理溶液を使用したこと以外は、３.１.３に記載の実験プロトコルの詳細に正確に従った。結果を図６に示す。

４.２ 結果
記載した実験の結果は、図４、図５および図６にてグラフで示されている。

４.３ 結論
実施例４で実施した実験を介して、本発明者は、葉酸の添加の有無にかかわらずナス科の果実の水溶性抽出物と食原性硝酸塩抽出物との配合物について生物活性の有意な改良を示すことができた。該抽出物と食原性硝酸塩および葉酸の両方との配合物は、活性化血小板、白血球および増加したレベルの関連マイクロパーティクルへの曝露後の血小板凝集、血小板マイクロパーティクル産生、および内皮細胞ＩＬ−６放出に対する効果に関して、最も効果的に試験された。運動誘発性血小板凝集およびマイクロパーティクル放出の阻害について、この好ましい配合物は、ＷＳＴＣを単独で使用した場合の２倍よりも高い効力を有していた；一方、活性化血小板および白血球への曝露後の内皮細胞からのＩＬ−６産生の阻害については、ほぼ３倍の効力を有していた。

これらの結果は、ナス科の果実の水溶性抽出物は、単独では、運動によって誘発された全身性炎症に対して意外にも有益に影響を及ぼすが、その効果は、食原性硝酸塩および葉酸と組み合わせることによって、実質的にかつ発明的に増大することができることを示している。

実施例５
最良の全体的有効性を示した水溶性トマト抽出物および一酸化窒素源の配合物に関して得られた知見を考慮して、本発明者は、激しい運動の前およびその間にこれらの配合物を適切に送達するために使用され得る組成物の開発を行った。

５.１ゲル剤
ゲル剤（下記を参照）が等張性であるように設計されなかったこと以外は、国際公開第２００７／０８３１１７号に記載の方法に従って（その明細書の第１９頁〜第２２頁の記載に従って）、ゲル剤を製造した。

本発明に従って使用するための最も好ましいゲル剤は以下の成分を含むことができる：

^＊ フレーバーは、バナナとマンゴーであってよい。他に、クロフサスグリ（blackcurrant）風味、オレンジ風味またはトロピカル風味を使用してもよい。

ゲル剤は、例えばUniversal Pack製のようなゲル包装機を使用して、保存期間を確実にするために、積層ホイル製分包（sachet）に包装され得る。典型的なゲルサイズは、約４０ｍｌ〜約１００ｍｌの範囲である（例えば、６０ｍｌであってよい）。

５.２ 分包用散剤（Sachet Powder）
粉末混合物は、各成分を以下の量で含有するように調製され得る：

該粉末混合物は、粉塵および湿度を制御する好適な工場条件下で、例えばリボンブレンダーまたは類似のものを使用して、慣用の乾燥ブレンド技術によって調製され得る。得られた粉末の流動性を確実にするために、アンチケーキング剤のような薬剤を添加してもよい。タブ（tub）または分包のような適切な容器へのパッケージングは、厳密な粉塵制御および湿度制御の条件下で行われるべきである。

該粉末を５０ｇ投与単位に分け、分包中に密封してよい。使用に際して、運動を始める前に、該粉末を水５０ｍｌ〜２５０ｍｌと混合し、摂取する。

５.３ Ｆｉｚｚ錠
分散錠（fix tabとしても知られている）は、各成分を以下の量で含有するように調製され得る：

Ｆｉｚｚ錠もまた、工程全体が１０未満の相対湿度を有する制御された大気条件下で行われる場合には、例えばリボンブレンダーまたは類似のものを使用して、慣用の乾燥ブレンド技術によって調製され得る。乾燥成分ブレンド物からの打錠は、所望の錠剤サイズに応じて、およそ５〜１０トンの圧力を加えることができるさまざまな打錠機によって行われてよい。個々の分包またはマルチチューブへの包装は、制御された湿度の条件下で行われなければならず、保存期間および錠剤安定性を確実するために、個々のパケットに十分な乾燥剤を容れておくべきである。
このような錠剤は、１０ｇ錠剤として作成される。使用に際して、運動を始める前に、運動を始める前に、該錠剤を水５０ｍｌ〜２５０ｍｌに溶解し、摂取する。

５.４ フードバー
フードバーは、各成分を以下の量で含有するように調製され得る：

^＊ フレーバーは、例えば、リンゴおよびクロフサスグリ、チョコレートまたはブルーベリーであってよい。

フードバーの適切な製造方法は、フルーツジュースを約１００℃に加熱して湿気をある程度除去した後に乾燥成分に混合し、低温殺菌することを含む。次に、ミキサーの内容物をトレーまたはコンベヤー上に出し、産業用ローラーを使用して、適切な高さ（典型的には、１０〜１５ｍｍ）に伸ばしてよい。この工程の間、ファンを用いて該混合物を冷却してよく、その後、機械的裁断機を使用して、該バーを必要なサイズに切断してよい。新鮮さを保持するために、バーをアルミホイル中にフローラップ（flowrap）して個別包装してよい。

４０ｇバーが適切な投与単位であり、運動前に摂取されるべきである。

実施例６
本発明者は、また、血小板および凝固系活性化ならびにＶＯ₂ｍａｘの７０％で行った一定期間の運動に関連する血漿ＩＬ−６レベルの増加の防止における実施例５の記載に従ってゲルの形態で製造された本発明の好ましい組成物の効力を試験した。

６.１．方法
６.１.１ 対象体
ＶＯ₂ｍａｘを事前に測定しておいた１８歳〜５５歳の３人の健康な男性対象体を採用した。

６.１.２ サプリメント
実施例５の記載に従って、２つの試験ゲル剤を調製した。ゲル剤を６０ｍｌ容量のホイルパック中に包装した。処理ゲル（ＦＦ）は、水溶性トマト抽出物（ＷＳＴＣ）３ｇ、食原性硝酸塩約１００ｍｇに相当するスイスチャード濃縮ジュース５.４ｇ、および葉酸約２００μｇを含有していた。プラセボゲルは、この混合物の代わりにグルコースシロップ３ｇを含有していた。

６.１.３ 運動プロトコル
２種類の運動プロトコルを受けた全対象体を少なくとも７２時間までに分けた。対照他を研究施設にて絶食条件下におき、抗凝固剤としてクエン酸三ナトリウムを使用して、ベースライン血液サンプルを採取した。対象体は、一定の朝食を取り、その時、処理（ＦＦ）またはプラセボ（Ｐ）であるようにランダムに設計した単一の試験ゲルを摂取した。９０分後、予備検査血液サンプルを採取した。次に、対象体は、ＶＯ₂ｍａｘの７０％で２０分間のトレッドミル走を行った。該トレッドミル走の完了後、対象体は、随意疲労（volitional exhaustion）になるまで、ＶＯ₂ｍａｘの９０％で走り続けた。運動後の血液サンプルを採取し、その後、対象体は軽い昼食を取り、自由に外出した。７２時間後、対象体は施設に戻り、試験日を繰り返し、残りの試験ゲルを取り込んだ。

６.１.５ サンプル分析
採取から２０分以内に、クエン酸処理した全血を室温にて２０００ｇで２０分間遠心分離して、血小板が乏しい血漿を単離した。蛍光ベースのアッセイ（Thrombin Generation Assay、Technoclone、UK）を使用して測定される凝固系の活性の指標であるトロンビン生産能の測定のため、および血漿ＩＬ６の測定（３.１.４に記載されるように、Biosource（UK）からのＥＬＩＳＡによる）のために、アリコートを凍結させた。残りの血小板が乏しい血漿は、循環血小板の活性の指標である循環マイクロパーティクルの測定（３.１.３に記載されるように）のために、すぐに使用した。

６.２ 結果
記載した実験の結果は、図７、図８および図９にてグラフで示されている。

６.３ 結論
実施例６で行われた実験によって、本発明者は、中程度〜激しい運動の２０分後の血小板および凝固系の活性化をプラセボと比べて低下させることにおけるＷＳＴＣ、食原性硝酸塩および葉酸の配合物の効力を示すことができた。この止血活性化の低下は、プラセボと比べたＦＦ処理についての循環血漿ＩＬ６の減少を付随した。

この実験において、血小板活性化の指標として、血小板マイクロパーティクルカウントを使用した。ベースラインマイクロパーティクルカウントは、ＦＦ試験グループまたはＰ試験グループのどちらにおいても試験ゲルの消費後に有意に変わらなかった。しかしながら、運動後、循環血小板マイクロパーティクルの数は、ＦＦグループにおける１.２倍と比べて、プラセボグループにおいて１.９倍増加した。すなわち、ＦＦ処理は、プラセボと比べて、血小板マイクロパーティクルの運動誘発性放出を約７０％減少させると考えられる。

トロンビン産生能は、Ｐゲルの消費後にはベースラインから変わらなかったが、ＦＦゲルの消費後には１９％低下した（運動前）。これは、血小板機能の急激な阻害に起因する可能性が高い。運動後、トロンビン産生能は、Ｐ試験グループにおいて２.２倍増大した。ＦＦ試験グループにおいては、運動後のトロンビン産生能は、運動前のレベルと比べて１.４倍増大した；これは、ベースライントロンビン生産能からの１.１倍の増大を意味する。かくして、プラセボ処理を受けながらの運動は、ベースライントロンビン生産能からの１２０％を超える増大を付随したが、一方、ＦＦ処理は、この増大をベースラインから１３％に有効に制限した。

ベースラインＩＬ６レベルは、いずれのゲルの消費によっても影響を受けなかった（運動前）。循環ＩＬ６のレベルは、運動後のプラセボグループにおいて４.５倍増加したが、ＦＦグループにおいては、当該レベルは２.６倍増加した。かくして、ＦＦ処理後の運動によって生じたのは、プラセボ処理後の運動後に観察された血漿ＩＬ６の増加の４２％にすぎなかった。

要約すれば、ＦＦ処理の消費は、血小板マイクロパーティクルの運動関連放出、血漿トロンビン生産能の関連増加、および運動によって誘発される全身性ＩＬ６のレベルを有意に減少させた。これらの結果は、ＷＳＴＣ、食原性硝酸塩および葉酸の好ましい配合物が運動によって誘発される全身性炎症に有益に影響を及ぼし得ることを示しており、したがって、本発明の組成物が運動からの回復を促進することを示している。

Claims (11)

1. 対象体における運動誘発性全身性炎症の処置、軽減、最小化または防止のための組成物であって、
   （ａ）水溶性トマト抽出物（ここで、該抽出物は、
   （１）無色または淡黄色であり；
   （２）分子量１０００未満の成分からなり；
   （３）（ｉ）グリコシル化フェノール酸またはフェノール酸エステル；
   （ｉｉ）グリコシル化フラボノイド；および
   （ｉｉｉ）ヌクレオシド
   を含有する）；
   （ｂ）食原性硝酸塩（dietary nitrate）の外因性源、または内因性一酸化窒素の前駆物質、ここで、該外因性源が、新鮮な果実または野菜組織（vegetable tissue）の水性抽出物を含み、該果実または野菜が、硝酸塩の最終抽出物濃度が７.５ｇ／Ｌ以上となるように十分に高いレベルの硝酸塩を含有し、該前駆物質が、シトルリン、グルタミンまたはアルギニンより選択される；および
   （ｃ）葉酸、または５−メトキシテトラヒドロ葉酸エステルもしくはテトラヒドロ葉酸エステルである葉酸の代謝物
   を含む、組成物。
2. スイスチャード、ハナダイコン、ほうれん草、ダイオウ、イチゴおよびレタスからの水溶性抽出物から選択される食原性硝酸塩源を含む、請求項１記載の組成物。
3. グリコシル化フェノール酸またはフェノール酸エステルが、カフェオイル−４−Ｏ−キナ酸、カフェオイル−４−Ｏ−グルコシド、クマロイル−４−Ｏ−グリコシド（ｇｌｕｅ／ｇａｌ）およびクマロイル−４−Ｏ−グリコシド（二糖）からなる群から選択されるグリコシル化桂皮酸である、請求項１または２記載の組成物。
4. グリコシル化フェノール酸またはフェノール酸エステルが、カフェ酸グルコシド；ｐ−クマル酸ヘキソース／ジヒドロケンフェロールヘキソース；フェルラ酸グリコシド；およびｐ−クマル酸誘導体から選択される、請求項１または２記載の組成物。
5. グリコシル化フラボノイドが、ケルセチン−３−Ｏ−グルコシドおよびルチンから選択される、請求項１〜４いずれか１項記載の組成物。
6. ヌクレオシドが、ＡＭＰ、ウリジン、アデノシン、グアノシンまたはＧＭＰからなる群から選択される、請求項１〜５いずれか１項記載の組成物。
7. 栄養補給食品、飲料、食品または栄養補助食品の形態の、請求項１〜６いずれか１項記載の組成物。
8. ゲル剤、散剤、フードバーまたは分散錠の形態の、請求項７記載の組成物。
9. 対象体がＶＯ₂ｍａｘの約６０％超に相当する強度で運動する、請求項１〜８いずれか１項記載の組成物。
10. 硝酸塩２５ｍｇ〜２５０ｍｇを含む、請求項１〜９いずれか１項記載の組成物を含む製剤。
11. 葉酸１０μｇ〜５００μｇを含む、請求項１０記載の製剤。

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