KR20150120740A - 무청 추출물을 포함하는 항염 및 항산화를 위한 동물사료 조성물 - Google Patents

Abstract

무청 추출물의 항산화 및 항염 활성 및 궤양성 대장염 예방 효과를 갖는 무청 추출물을 분말화한 추출분말을 함유하는 사료용 식이조성물에 관한 것으로서, 무청 추출물을 포함하는 추출분말을 유효활성성분으로 포함함을 특징으로 하는 항염 및 항산화를 위한 사료조성물이 개시된다.

Description

무청 추출물을 포함하는 항염 및 항산화를 위한 동물사료 조성물{Composition comprising radish leave extract for anti-inflammatory and anti-oxidant}

본 발명은 무청 추출물을 포함하는 항염 및 항산화를 위한 사료조성물에 관한 것으로 특히, 상기 무청 추출물의 항산화 및 항염 활성 및 궤양성 대장염 예방 효과를 갖는 무청 추출물 또는 상기 무청 추출물을 분말화한 추출분말을 함유하는 사료용 식이조성물에 관한 것이다.

염증성 장질환(Inflammatory bowel disease ; IBD)은 대장암 발생의 대표적인 고위험 질환으로(문헌 Terzic J, Grivennikov S, Karin E, Karin M. 2010. Inflammation and colon cancer. Gastroenterology 138:2101-14 e5 참조), 병변과 염증증상의 차이에 따라 궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC)와 크론병(Crohn's disease, CD)로 나뉜다(문헌 Fiocchi C. 1998. Inflammatory bowel disease ; etiology and pathogenesis. Gastroenterology. 115 : 182-205 참조). 둘 다 완치가 힘들고 호전과 악화를 반복하며, 체중감소, 혈액을 동반한 설사, 발열, 장 운동장애, 결장의 단축 같은 유사한 병리학적 징후를 보인다(문헌 Hendrickson BA, Gokhale R, Cho JH. 2000. Clinical aspects and pathophysiology of inflammatory bowel diesease. Clin Microbiol Rev. 15(1) : 79-94 참조).

특히 UC의 경우, 대규모 역학조사는 시행되지 않았지만, 서울 송파-강동구를 표본으로 한 조사에서 UC의 발병률은 1986-1988년경에 인구 10만명당 0.2명이던 것이(문헌 Chang DK, Kim YH, Byeon JS, Yang SK, Chung YW, Han DS, Kim SG, Kim TI, Kin WH, Jeen YT, Eun CS, Choi H, Choi KY, Song IS. 2005. The current states of ulcerative colitis-associated colorectal cancer in Korea: a KASID study. Korean J Gastroenterol. 46(4) : 276-282 참조), 1995-1997년 사이에 1.23명으로 상승하였으며 2001-2005년에는 인구 10만명당 3.08명으로 증가한 것이 관찰되었다(문헌 Yang SK, Hong WS, Min YI. 2000. Incidence and prevalence of uncerative colitis in the Songpa-Kangdong District, Seoul, Korea. 1986-1997. J Gastroenterol Hepatol 15 : 1037-1042 참조). 유병률 역시 1997년 인구 10만명 당 7.57명에서 2005년에는 30.87명으로 가파르게 상승하였다(문헌 Yang SK, Yun S, Kim JH, Park JY, Kim YH, Chang DK, Kim JS, Song PS, Park JB, Park ER, Kim KJ, Moon G, Yang SH. 2008. Epidemiology of Inflammatory Bowel Disease in the Songpa-Kangdong District, Seoul, Korea, 1986 2005: A KASID Study. Inflammatory bowel diseases 14(4) : 542-549 참조). 북미의 경우 연간 발생률이 인구 10만명 당 6.0-15.6명, 유렵의 경우 1.5-20.3명으로 나타났으며, 유병률은 지역에 따라 21.4-246명으로 보고되어(문헌 Loftus E. 2004. Clinical epidemiology of inflammatory bowel disease : incidence, prevalence and environmental influences. Gastroenterology 126(6) : 1504-1517 참조), 한국의 UC 유병률은 북미, 유럽의 발병률에 비하면 흔치 않은 질병이라 할 수 있지만 지속적으로 증가하고 있는 추세를 볼 때 조만간 비슷해지리라 예상한다(문헌 Yang SK. 2002. Current status and clinical characteristics of inflammatory bowel disease in Korea. Korean J Gastroenterol. 40(1) : 1-4 참조).

이에 따라 많은 치료제가 사용되고 있으며, 이 중 궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC)의 치료제로 글루코코르티코이드(glucocorticoid)(문헌 Boumpas DT, Chrousos GP, Wilder RL. 1993. Glucocorticoid therapy for immune-mediated diseases:basic and clinical correlates. AnnIntern Med 119 : 1198-1208 참조)와 설파살라진(sulfasalazine)(문헌 Msiewicz JJ, Lennard-hones JE, Connell AM. 1965. Controlled trial of sulfasalazine in maintenance therapy for ulcerative colitis. Lancet:185-188 참조) 등이 사용되고 있으나, 장내 유용한 세균총들을 죽이고 구역질, 구토, 소화불량, 식욕부진 및 두드러기, 발열, 간염, 용혈성 빈혈, 골수 억제 등의 부작용을 일으키며(문헌 Das KM, Eastwood MA, McManus JP, Sircus W. 1973. Adverse reactions during salicylazosulphapyridine therapy and the relation with drug metabolism and acetylator phenotype. M Engl J Med 289 : 491-495; Dignass A, Layer P. 1995. Inflammatory bowel Diseases : New Developments and Standards, Dordrecht : Kluwer Acadenic Publishers. 183-192 참조), 궤양성 대장염은 이환된 지 30년 이내에 18%의 환자에서 대장암이 발생한다(문헌 Canavan C, Abrams KR, Mayberry J. 2006. Meta-analysis: colorectal and small bowel cancer risk in patients with Crohn's disease. Aliment Pharmacol Ther 23:1097-104 참조)는 연구결과가 보고되면서(문헌 Eaden JA, Abrams KR, Mayberry JF. The risk of colorectal cancer in ulcerative colitis: a meta-analysis. Gut 2001;48:526-35 참조), 이를 예방할 수 있는 대안책을 필요로 한다(문헌 Ullman T, Croog V, Harpaz N, Sachar D, Itzkowitz S. 2003. Progression of flat low-grade dysplasia to advanced neoplasia in patients with ulcerative colitis. Gastroenterology 125 : 1311-1319 참조).

궤양성 대장염은 여러 가지 환경적 요인과 유전적 요인이 복합적으로 작용하여 발생한다고 하지만, 주된 발병요인은 아직 명확하게 밝혀지지 않은 상태이다. 그러나, 일본의 경우, 육류와 유제품 등의 동물성 단백질의 소비가 증가하기 시작한 1960년대부터 궤양성 대장염의 발생이 증가하였으며(문헌 Yosida Y, Murata Y. 1990. Inflammatory bowel disease in Japan : studies of epidemiology and etiopathogenesis. Med Clin North Am 74 : 67-90 참조), 우리나라 역시 1인당 1일 동물성 단백질의 섭취량이 증가한 1980년대부터 1990년대 중반까지 궤양성 대장염의 발생이 증가(문헌 Ministry of Health & Welfare. 1990. Report on 1998 national health and nutrition survey(dietary intake survey). 38-140 참조)한 점이나, 저개발 국가보다는 미국이나 유럽과 같이 산업화된 국가에서 더 많이 발생하고, 저개발 국가도 경제가 성장함에 따라 발병률이 증가하는 것으로 볼 때, 필요이상의 열량과 동물성 식품의 섭취 그리고 채소와 과일을 포함한 식물성 식품의 적은 섭취로 변화된 식습관이 궤양성 대장염과 밀접하게 관련이 있다고 본다(문헌 Doll R, Peto R. 1981. The causes of cancer. Quantitative estimates of avoidable risks of cancer in the Unitede States today. J Natl Cancer Inst 66 : 1191-1308 참조).

리프(Rief) 등은 지방의 섭취가 궤양성대장염 발병 증가와 관련이 있으며, 과일, 채소와 식이섬유의 섭취가 이를 감소시킨다고 보고하였고(문헌 Rief S, Klein I, Lubin F, Farbstein M, Hallak A, Gilat T. 1997. Pre-illness dietary factors in inflammatory bowel disease. Gut 40(6) : 754-760 참조), 또 다른 연구에서는 환자군-대조군 비교연구를 통해 UC의 발병을 증가시키는 요인으로 과도한 당류섭취를 꼽았다(문헌 Sakamoto N, Kono S, Wak ai K, Fukuda Y, Satomi M, Shimoyama T, Inada Y, Miyake Y, Sasaki S, Okamoto K, Kobashi G, Washio M, Yokoyama T, Date C, Tanaka H. 2005. Dietary risk factors for inflammatory bowel disease : a multicenter case-control study in Japan. Inflamm Bowel Dis 11(2) : 154-163 참조).

궤양성 대장염의 염증반응은 체내에서 발생한 산화스트레스에 의해 촉진된다(문헌 최수연. 2004. 일반식이와 고지방식이에서 quercetin 또는 -carotene 보충이 화학적으로 유도된 대장암의 발생과 대장점막 염증반응에 미치는 효과에 관한 연구. 박사학위논문, 숙명여자대학교 대학원. 참조). 산화스트레스는 활성산소종(ROS ; reactive oxygen species)를 만드는데, ROS는 세포 내 DNA, 단백질, 지질, 탄수화물 등의 거대분자들과 반응하여 DNA분절, 단백질의 불활성화, 불포화 지방산의 과산화 등의 문제를 낳아 생체기능을 저하 시킨다(문헌 Volko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin MT, Mazur M, Telser J, 2007. Free radicals and antioxidants in normal physiological functons and human disease. nt J. Biochem Cell Biol 39 : 44-84 참조). ROS가 과잉 축적되면 DNA와 세포내 여러 분자에 손상을 가져오므로 이를 개선하기 위해 체내에는 항산화 시스템이 존재한다(문헌 Andersen HR, Nielsen JB, Nielsen F, Grandjean P. 1997. Antioxidative enzyme activities in human erythrocytes. Clin. Chem. 43 : 562-568 참조). 항산화 시스템의 주요 구성성분은 비타민 C, E, A와 무기질, 카로테노이드(carotenoid)와 같은 기능성 물질들로, 대부분 식물성 식품을 통해 얻을 수 있다.

즉, 식물성 식품의 섭취는 인체의 항산화 수준에 긍정적인 영향을 미치며(문헌 Liu RH, Finley J. Potential cell culture models for antioxidant research. 2005. J Agric Food Chem 53 : 4311-4314 참조), 이는 식물성 식품보다 동물성 식품의 비중이 높은 사람일수록 항산화 체계가 불균형하다는 것이다. 따라서 궤양성 대장염의 예방 및 치료를 위해서는 식단 내 식물성 식품의 비중을 높이는 것이 중요하다.

이러한 노력에도 불구하고 자연계에는 아직도 알려지지 않은 무수한 항산화 물질이 존재하고 있으며, 따라서 보다 우수한 항산화 활성을 지니는 천연 항산화 소재에 대한 연구 및 개발의 필요성은 날로 증대되고 있다.

무(Radish)는 뿌리와 잎에 비타민 등과 같은 다량의 영양소를 함유하고 있는 주요 채소류의 하나이다. 특히 무잎에는 광합성 작용을 하는 엽록소가 넓게 분포되어 있고 당질 함량이 낮은 반면, 비타민 A, B1, B2, C, 나이아신, 단백질, 지질(脂質) 및 철분, 칼슘이 골고루 함유되어 있을 뿐 아니라, 풍부한 섬유질 식품으로 성인병 예방에도 좋은 것으로 알려져 있으며, 최근 연구에 따르면 비만, 변비의 치료에 유용하고, 전분 분해효소인 디아스타아제(Diastase) 성분이 함유되어 있어서 위장에도 유익한 것으로 보고되고 있어 우리네 식단에서 매우 중요한 위치를 차지하고 있다. 무청은 무(Radish) 뿌리의 윗부분 즉, 줄기와 잎부분에 해당하며, 이를 건조시킨 시래기(시래기 및/또는 무거지; 이하에서는 무청으로 통일하여 기재함)는 우리 국민 대부분이 좋아하는 기호식품이지만 수확시기가 한정되어 있을 뿐 아니라 년중 상식(常食)할 수 있게 상품화되어 있지 못한 관계로 여타의 다른 전통식품들처럼 상품으로서의 역할을 다하지 못하고 있는 실정이다. 상기 시래기 제조과정을 살펴보면, 무로부터 채취된 생(生)무청을 짚이나 새끼줄, 나이론 끈 등으로 엮은 다음, 적당한 장소에 매달아 자연 건조시킨 후, 보관하면서 필요할 때 삶아 식용하는 전근대적인 방법에 의존하고 있어서 영양 손실이 많은 편이고, 또한 비위생적이어서 먹거리로서의 가치가 크게 떨어질 수밖에 없다. 이러한 점을 고려하여 무청을 활용할 수 있는 다양한 식품 제조방법들이 제안되고 있으나, 제조원가가 비싸고 상품성이 떨어져 대중화와는 거리가 먼 실정이다.

한국 공개특허 제2004-0011578호는 무청을 이용한 식품 제조방법을 기술하고 있으며, 여기에서는 생(生)무청을 장기간 보관하면서 언제나 즐길 수 있는 상품(건식의 시래기 및/또는 습식의 무우거지)으로 상식화(常食化), 대중화 할 수 있으며, 양념이 같이 포장되어 소비자의 기호에 맞게 국이나, 찌개용 또는 이에 첨가하여 바로 조리해 먹을 수 있도록 한다는 내용이 기재되어 있다.

본 발명은 무청 추출물의 항산화 및 항염 활성 및 궤양성 대장염 예방 효과를 갖는 무청 추출물 또는 상기 무청 추출물을 분말화한 추출분말을 함유하는 식이조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명에 따른 무청 추출물을 포함하는 항염 및 항산화를 위한 조성물은, 무청 추출물을 유효활성성분으로 포함함을 특징으로 한다.

상기 무청 추출물은 무청을 탄소수 1 내지 4의 저급알코올로 이루어지는 군으로부터 선택되는 알코올로 추출된 것일 수 있다.

상기 알코올은 바람직하게는 에탄올일 수 있다.

상기 무청 추출물은 무청을 건조시킨 건조분말을 추출한 것일 수 있다.

상기 무청 추출물은 무청을 추출하여 제조되며, 이때 추출비율은 무청의 건조물을 70% 내지 90% 에탄올 90 내지 99중량% 및 상기 무청의 건조분말 1 내지 10중량%의 비율로 혼합하고, 상온에서 40 내지 54시간 동안 현탁시킨 후, 다시 20 내지 28시간 동안 침지시킨 후, 여과하는 과정을 1 내지 5번 반복하여 얻은 추출물을 합하여 1 내지 20℃의 온도조건에서 농축시킨 것일 수 있다.

상기 무청 추출물은 상기 조성물 총 중량을 기준으로 1 내지 99중량%, 바람직하게는 1 내지 50중량%, 보다 바람직하게는 1 내지 20중량%의 범위 이내의 양으로 포함되는 것이 경제적이고 또한 효과적이다.

상기 수득된 농축액은 후속하여 동결건조되어 추출분말로 제조된 것일 수 있으며, 이 추출분말은 상기 조성물 총 중량을 기준으로 1 내지 99중량%, 바람직하게는 1 내지 50중량%, 보다 바람직하게는 1 내지 20중량%의 범위 이내의 양으로 포함되는 것이 경제적이고 또한 효과적이다.

상기 동결건조된 추출분말은 다시 70% 내지 90% 에탄올에 용해시켜 사용할 수 있다.

본 발명에 따르면, 무청 추출물의 항산화 활성을 가진 기능성 성분들이 염증으로 인해 발생하는 산화 스트레스를 줄이는 역할을 함으로써 궤양성 대장염증 발병 시 동반되는 혈변 및 체중감소, 탈수 현상을 완화시킬 수 있는 무청 추출물을 포함하는 항염 및 항산화를 위한 조성물을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 정상군, 대조군, 무청 급이군, 신선초 급이군에서의 변성세척겔에 전기영동하여 다양한 장내세균총을 확인한 전기영동 사진이다.
도 2는 결장 내 염증 세포의 외양을 나타내는 사진이다.

이하, 본 발명의 구체적인 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 상세히 설명한다.

본 발명은 무청 추출물을 유효활성성분으로 포함함을 특징으로 하며, 특히 상기 무청 추출물은 무청을 탄소수 1 내지 4의 저급알코올로 이루어지는 군으로부터 선택되는 알코올, 바람직하게는 에탄올, 보다 바람직하게는 50 내지 90% 에탄올, 가장 바람직하게는 70 내지 90% 에탄올을 추출용매로 사용하여 추출된 것일 수 있다. 특히, 상기 무청 추출물의 제조에 사용되는 무청은 무(Radish) 뿌리의 윗부분 즉, 줄기와 잎부분에 해당하는 것으로서, 주로 식용하는 무 뿌리를 제외하고 남는 부분이며, 엽록소가 넓게 분포되어 있고 당질 함량이 낮은 반면, 비타민 A, B1, B2, C, 나이아신, 단백질, 지질(脂質) 및 철분, 칼슘이 골고루 함유되어 있을 뿐 아니라, 풍부한 섬유질 식품으로 성인병 예방에도 좋은 것으로 알려져 있다. 상기 무청 추출물은 상기 무청을 수세, 건조, 바람직하게는 동결건조 후, 분쇄시켜 수득되는 건조분말을 추출용매, 바람직하게는 에탄올로 추출하여 수득되는 것일 수 있으며, 이때 동결건조 및 분쇄는 당업자에게는 용이하게 수행할 수 있을 정도로 공지된 것으로 이해될 수 있는 것으로서, 본 발명이 동결건조 및 분쇄의 방법이나 공정조건으로 제한되는 것은 아니다.

무청을 시래기로 만드는 기존의 방법으로는 무청이 가진 무기질 및 영양성분의 함량이 적고, 시료의 오염도가 큰 관계로 이를 방지하기 위해 건조방법인 동결건조를 통해 무청을 건조시켰다. 동결건조를 통해 건조한 시래기의 추출 및 농축 과정에서 가장 중요한 것은 온도이다. 추출 및 농축과정에서 열을 가하게 되면 무청이 가진 유용성분이 파괴되고, 남은 유용성분 잔존량 역시 적어진다. 따라서 본 실험에서는 농도가 결코 20℃ 이상으로 넘어가지 않도록 하여 추출된 유용성분의 변화 가능성을 줄였다.

본 발명에서 무청이라 함은 무 뿌리를 제외한 잎과 줄기를 생물 상태, 건조 상태 모두를 포함하는 것으로 의미하며, 달리 시래기 등과 같이 건조된 상태를 전제로 불리워지는 칭호 또한 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

달리 시래기라고도 불리우는 무청, 특히 무청 건조물은 글리코나스투르티인(glyconasturtiin), 글리코시놀레이트(glycosinolate), 메틸머캅탄(methyl mercaptane)과 겨자유(mustard oil) 등의 항암성분은 물론 유해활성산소 소거능력이 밝혀진 베타-카로텐(-carotene), 안토시아닌(문헌 Malisorn C, Suntornsuk W. 2008. Improved -carotene production of Rhodotorula glutinis in fermented radish brine by continuous cultivation. Biochem Engineer J doi:10.1016/j.bej.2008.08.005 참조), 클로로필(문헌 Yu BP. 1996. Aging and antioxidative stress: Modulation by dietary restriction. Free Rad Biol Med 21: 651-668 참조), 비타민 C(문헌 Anatol K, Ulrike M, Sonke A, Amaar U, Charlotte L, Tomas MT, Ulrike B. 2001. Influence of vitamin E and C supplementation on lipoprotein oxidation in patients with Alzheimerdisease. Free Rad Biol Med 31: 345-354 참조)를 함유하고 있으며, 건물량 중 35% 이상이 식이섬유이고, 20% 내외의 단백질과 철분, 칼슘 등을 함유한 양질의 식재료이다(문헌 Ku KH, Lee KA, Kim YL, Lee YW. 2006. Quality characteristics of hot-air dried radish(Raphanus sativus L.) leaves. J Korean Soc Food Sci Nutr 34 : 780-550 참조).

관련 연구로는 조리방법에 따른 상용채소의 무기질 함량 변화(문헌 Han JS, Kim JS, Kim MS, Choi YH. 1999. Changes on mineral contents of vegetable by various cooking methods. Korean J Soc Food Sci 15 : 382-387 참조), 사료로 사용하기 위한 무청에서의 단백질 추출(문헌 Yasui T. 1996. Effect of the pretreatment with dilute hydrochloric acid solutions on the extractability of grass proteins. Nippon Eiyo Shokuryo Gakkaishi 49: 29-37; Yasui T. 1995. Method for extraction of grass proteins by dilute-alkaline acetone solution. Nippon Eiyo Shokuryo Gakkaishi 48: 391-397 참조)에 관한 것이 있으며, 그 밖에도 시래기 에탄올 추출물이 폐암에 미치는 영향(문헌 Yim HB, Lee GS, Chae HJ. 2004. Cytotoxicity of ethanol extract of Raphanuse sativus on a human lung cancer cell line. J Korean Soc Food Sci Nutr 33: 287-290 참조), 시래기 추출물의 위장 내 자극과 자궁 수축 활성능(문헌 Ghayur MN, Gilani AH. 2005. Gastrointestinal stimulatory and uterotonic activities of dietary radish leaves extract are mediated through multiple pathways. Phytother Res 19: 750-755 참조), 장내 자극 변화(문헌 Gilani AH, Ghayur MN. 2004. Pharmacological basis for the gut stimulatory activity of Raphanus sativus leaves. J Ethnopharmacol 95: 169-172 참조) 및 생리활성(문헌 Ku KH, Lee KA, Kim YE. 2008. Physiological Activity of Extracts from Radish (Raphanus sativus L.) Leaves. J Korean Soc Food Sci Nutr 37(3) : 390-395 참조)에 관한 연구결과가 보고되었다. 그 외에도 시래기 분말의 항고혈압효과(문헌 Kim BR, Park JH, Kim SH, Cho KJ, Chang MJ. 2010. Antihypertensive Properties of Dried Radish Leaves Powder in Spontaneously Hypertensive Rats. Korean J Nutr 43(6): 561~ 569 참조)와 콜레스테롤 식이를 공급한 흰쥐의 간(문헌 Rhee SJ, Ahn JM, Ku KH, Choi JH. 2005. Effects of Radish Leaves Powder on Hepatic Antioxidative System in Rats Fed HighCholesterol Diet. J Korean Soc Food Sci Nutr 34(8) : 1157-1163 참조) 및 장기능과 지질대사 개선(문헌 Jang HS, Ahn JM, Ku KH, Rhee SJ, Kang SK, Choi JH. 2008. Effect of Radish Leaves Powder on the Gastrointestinal Function and Fecal Triglyceride and Sterol Excretion in Rats Fed a Hypercholesterolemic Diet. J Korean Soc Food Sci Nutr 37(10) : 1258-1263 참조)에 대한 연구가 진행되었다. 그러나 직접적인 대장염증과 관련한 연구는 미비하였다.

상기 무청 추출물은 무청을 추출하여 제조되며, 이때 추출비율은 무청의 건조분말을 70% 내지 90% 에탄올 90 내지 99중량% 및 상기 무청의 건조분말 1 내지 10중량%의 비율로 혼합하고, 상온에서 40 내지 54시간 동안 현탁시킨 후, 다시 20 내지 28시간 동안 침지시킨 후, 여과하는 과정을 1 내지 5번 반복하여 얻은 추출물을 합하여 1 내지 20℃의 온도조건에서 농축시킨 것일 수 있다.

상기 수득된 농축액은 후속하여 동결건조하여 추출분말로 제조될 수 있다.

상기 동결건조된 추출분말은 다시 70% 내지 90% 에탄올에 용해시켜 사용할 수 있다.

상기 무청 추출물은 동결건조시켜 과립형의 식이 분말로 만들어질 수 있다.

이하에서 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예들이 기술되어질 것이다.

이하의 실시예들은 본 발명을 예증하기 위한 것으로서 본 발명의 범위를 국한시키는 것으로 이해되어져서는 안될 것이다.

1.추출물 및 식이 분말 조제

1)무청 추출물 조제

일반 마트에서 구입한 국내산 무청은 오염도 및 영양성분의 파괴를 막기 위해 흐르는 물로 깨끗이 세척한 후, 동결건조 한 다음, 믹서기로 분쇄하여 입자형태의 건조분말로 만든 후, 80% 에탄올(EtOH)을 용매로 농도 5%가 되도록 하여 무청 추출물을 제조하였다. 이때, 보다 구체적으로는 80% 에탄올 95중량%에 무청 건조분말 5중량%를 혼합하고, 48시간 동안 상온에서 현탁시킨 후, 다시 24시간 동안 방치시켜 침지시킨 후, 여과하였다. 이 과정을 3회 반복하여 수득된 추출물을 모아 20℃ 이하의 온도조건에서 감압 농축기로 농축시켰다. 수득된 농축액을 동결건조하여 추출분말(고형분)로 만든 것을 저장하고, 후속하는 실험에 사용하였다.

상기 동결건조된 추출분말 형태의 무청 추출물을 메탄올에 중량비로 1 : 19의 비율(파우더를 액체에 용해시킬 때 사용하는 단위로 무청 파우더 1중량부 : 99.9% 메탄올 19중량부) 비율로 용해시켜 항산화 활성 실험에 사용하였다.

상기 동결건조된 추출분말 형태의 무청 추출물을 분말화하여 동물 실험에서의 식이 분말로 사용하였다.

2)무청 추출물을 포함하는 과립형의 식이 분말의 실험동물 급이

3주령 된 ICR(imprinting control regions) 생쥐 54마리를 정상군(Normal), 염증 유발군, 염증유발 식이 분말 급이군으로 나누어 사료를 제공하여 생육시켰다. 그 처방을 하기 표 1에 요약하였다. 실험동물은 습도 50%, 온도 25℃의 조절된 환경조건에서 사육하였으며, 명암주기는 12시간 주기로 조절하였다.

성분	N, DN	DV
옥수수 녹말(Corn starch)	38	33
슈크로스(Sucrose)	20	20
카제인(Casein)	20	20
L-시스테인(L-cystein)	0.3	0.3
대두유(soybean oil)	10	10
셀룰로오스 분말(cellulose powder)	5	5
비타민 혼합물(vitamin mixture)	1	1
미네랄 혼합물(Mineral mixture)	3.7	3.7
콜린 염화물(Choline chloride)	2	2
식이 분말	-	5
* N : 정상군(Normal group) * DN : 염증유발군(AIN-93G 사료 + DSS로의 염증 유발) * DV : 염증유발 식이 분말 급이군(AIN-93G 사료 + 분말 식이 + DSS로의 염증 유발) 단위 : 중량%

3)실험 동물 및 사육 조건

3주령 된 ICR 생쥐 54마리를 정상군, 염증유발군, 염증유발 식이 분말 급이군으로 나누어 AIN-93G사료를 제공하되, 염증유발 식이 분말 급이군에는 각각의 상기 식이 분말을 5%의 비율로 혼합하여 만든 사료를 제공하였다. 제조방법은 상기 표 1에 기재하였으며, 실험동물은 습도 50%, 온도 25℃의 조절된 환경조건에서 사육하였으며 명암주기는 12시간 주기로 조절하였다.

4)실험 일정 및 대장염 유발 방법

실험기간은 총 5주로, 4주간의 대장염증 비-유발기간과 5일의 대장염증 유발기간으로 나누어 진행하였으며, 후쿠다(Fukata) 등의 방법에 따라 생쥐에 3%의 DSS(Dextran sulfate sodium, 분자량 36,000 내지 50,000달톤(Da))를 섭취시켜 대장염을 유발시켰다.

5일간 정상군을 제외한 모든 군에게 3% DSS가 포함된 음용수를 섭취하게 한 이유는 대식세포 때문으로, 대식세포는 고유판과 점막하층 전체에 균일하게 분포하지만 DSS에 노출된 6일째부터 염증이 침윤된 장소에 대식세포의 수가 증가하므로 염증으로 인한 대장 손상정도를 가장 정확하게 파악하기 위해 5일 동안 염증을 유발시켰다.

5)체중 증가량, 식이 및 음용수 섭취량 측정

체중 증가량과 식이 및 음용수 섭취량은 염증유발 전에는 매주 1회 측정하였으며, 염증 후에는 매일 측정하였다. 이를 토대로 개체군별 식이효율과 DSS 섭취량을 하기 수학식 1에 의하여 산출하였다. 또한 3% DSS로 대장염을 유도하는 5일 동안 매일 수거하여 혈변수와 무게를 측정하였다.

[수학식1]

식이 효율(Food Efficiency Ratio) = 체중 증가량(g/일)/식이섭취량(g/일)

DSS 부하(load) = (총 음용량(㎖) * DSS 농도(㎎/㎖)) / 초기 체중(g)

6)희생 및 시료수집

①대장 길이 측정

실험동물은 희생 전날 12시간 금식한 후, 이산화탄소(CO₂)로 마취 후, 개복하여 대장 부위 중 맹장(cecum)부터 항문(anus) 직전 부위까지의 대장을 적출하였다. 적출한 장기는 생리식염수에 세척하여 혈액과 지방을 제거하고 흡습지로 수분을 빨아들인 후, 길이를 측정하였다.

②대장염의 조직학적 평가

중성 포르말린에 고정한 대장조직을 48시간 내에 근위부, 중간부, 원위부를 한 조각씩 취하여 일반적인 조직처리과정을 거쳐 파라핀에 포매한 후, 5 내지 6의 두께로 절편을 만들었으며, 헤마톡실린 앤드 에오신(Hematoxylin & Eosin) 용액으로 염색 후, 궤양 유무 및 염증 정도를 점수의 합계로 계산하였다.

③ 판독기준

DSS에 의하여 유도된 대장 염증의 소견은 유안(Yuan)의 기준(표 2)에 따라 판독하여 점수화하였다. 점수화는 각 개체별로 3곳의 절편에서 판독한 점수를 모두 합한 값에 대하여 각 군별로 평균과 표준편차로 표시하였으며, 6단계로 염증의 정도를 나누었다.

등급	점막 손상의 점수의 기준	등급의 정도
0	무손상의 소낭선(Intact crypt)	0%
1	포낭 팽창(Cystic dilatation)	1 내지 20%
2	소낭선의 기저 1/3 손실	20 내지 40%
3	소낭선의 기저 2/3 손실	40 내지 60%
4	무손상이 잔존하는 상피 표면을 수반하는 전체 소낭선의 손실	60 내지 80%
5	소낭선 및 상피 표면 전체의 손실	80 내지 100%

7)대장염 유발 동물의 장내 미생물 변화 비교

대조군과 상기 식이 분말 급이군을 구분하여 동물실험 수행 후, 대장 조직 적출하여 3 내지 5㎛ 정도의 쌀알크기로 절편한 후, 조직용 DNA 미니프렙 킷트(DNA miniprep kit for tissue: 미합중국 소재 키아젠사(Quiagen co.)와 QIAcube(미합중국 키아젠사)를 사용하여 DNA를 분리한 후, 338f-GC와 518r 프라이머쌍(primer pair)으로 박테리아 유전자 DNA(bacterial genomic DNA) 중 16S rDNA 유전자만을 증폭하여 변성세척겔(denaturing detergent gel)에 전기영동하여 장내 미생물 패턴 분석하였다.

2.항산화 성분

1)총 폴리페놀 함량

상기 무청 추출물 200㎕에 2% Na₂CO₃ 2㎖을 넣어 섞어준 다음, 1M FC 시약(50% 폴린-시오칼토 페놀 시약(Folin-ciocalteu's phenol regent), 2N 100㎎/㎖ in 1차 증류수(1st distilled water))(미합중국 소재 시그마사(Sigma Co.) 200㎕를 첨가하여 실온에서 30분 동안 반응시키고, 750㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 탄닌산(Tannin acid: 미합중국 시그마사)을 사용하였으며, 검량선은 하기 수학식 2를 통해 산출하였다.

[수학식2]

검량선 공식 : Y = aX+b

여기에서, X는 시료액의 농도별 흡광도 값이고, Y는 시료액의 농도이고, a는 기울기이고, b는 절편이며, 이들 a 및 b는 샘플 스톡 용액(sample stock solution)의 단계별 농도(X)에 대한 억제 농도(inhibition concentration) (Y)에 대해 작성된 방정식으로부터 얻었다. 시료 중 총 폴리페놀 함량은 하기 수학식 3을 통해 산출하였다.

[수학식3]

시료 중 총 폴리페놀 함량 = Y * V/S

상기 식에서, Y는 시료의 흡광도 값을 검량선에 대입하여 얻은 Y값이고, V는 시료 추출액의 조제단계에서 사용된 추출용매의 부피이고, 그리고 S는 추출시료의 무게이다.

2)총 플라보노이드 함량

상기 무청 추출물 1㎖에 디에틸렌글리콜(Diethylenglycol) 10㎖을 넣어 섞어준 다음, 1N 수산화나트륨(NaOH) 1㎖을 첨가하여 상온에서 1시간 반응 후, 분광광도계로 420㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로 갈산(gallic acid: 미합중국 소재 시그마사)을 사용하였다. 검량선 공식은 하기 수학식 4에 나타내었다.

[수학식4]

검량선 공식 : Y = aX+b

상기 식에서, X는 시료액의 농도별 흡광도 값이고, Y는 시료액의 농도이고, a는 기울기이고, b는 절편이며, 이들 a 및 b는 샘플 스톡 용액의 단계별 농도(X)에 대한 억제 농도 (Y)에 대해 작성된 방정식으로부터 얻었다.

시료 중 총 플라보노이드 함량은 하기 수학식 5를 통해 산출하였다.

[수학식 5]

시료 중 총 플라보노이드 함량 = Y * V/S

상기 식에서, Y는 시료의 흡광도 값을 검량선에 대입하여 얻은 Y 값이고, V는 무청 추출물의 조제단계에서 사용된 추출용매의 부피이고, 그리고 S는 추출시료의 무게이다.

2)항산화 활성

(1)전자 공여능

전자공여능(Electron Donating Ability : EDA)은 시료에 대한 DPPH(1,1-디페닐-2-피크리드라질(1,1-diphenyl-2-picrydrazyl))의 전자공여 효과로 시료의 환원력을 측정하는 방법으로 추(Chu)의 방법을 변형하여 측정하였다(문헌 Chu SM. 2007. Antioxidative and antimicrobial activities of medicinal plants collected from Nepal. Dankook University. Master's thesis를 참조하시오). 농도별 희석한 무청 추출물을 96웰 플레이트(96 well plate)의 각 웰에 100㎕씩 분주하고, 다시 여기에 150μM DPPH(메탄올(MeOH) 중의 59.145㎎/㎖: 미합중국 소재 시그마사)용액 150㎕를 첨가하여 섞은 다음, 실온에서 30분간 반응시키고 518㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 아스코르빈산(Ascorbic acid: 미합중국 소재 시그마사)를 사용하였다. 억제 농도는 하기 수학식 6을 통해 산출하였다.

[수학식 6]

억제 농도(%) = (1-D/C) * 100

Y = aX+b

IC₅₀ = (0.5-b)/a

상기 식에서, D는 무청 추출물 첨가구의 흡광도이고, C는 블랭크(blank) 흡광도이고, a는 기울기이고, b는 절편이며, 이들 a 및 b는 샘플 스톡 용액의 단계별 농도(X)에 대한 억제 농도 (Y)에 대해 작성된 방정식으로부터 얻었다. IC₅₀은 유리 라디칼(free radical)의 활성을 50%로 저해하는데 필요한 농도이다.

(2)과산화물 제거효소(SOD: Superoxide dismutase) 유사 활성

SOD 유사활성은 마크룬드(Marklund) 등의 방법을 변형하여 측정하였다(문헌 Marklund S and Marklund G. 1974. Involvement of superoxide anon radical in the oxidaton of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. Eur J Biochem 47 : 468을 참조하시오). 상기 무청 추출물 20㎕에 희석용 완충제(Dilution Buffer)와 효소 작업용액(Enzyme Working solution)을 20㎕씩 넣어준 후, 상온에서 20분간 반응시킨 후, 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 블랭크는 시료 대신 3차 증류수를 넣어주었으며, SOD 활성 억제율(SOD activity inhibition rate)을 계산하는 계산식은 하기 수학식 7을 통해 구하였다.

[수학식7]

SOD 활성 억제율 = [(블랭크1-블랭크3) - (샘플-블랭크2)] / (블랭크1-블랭크3) * 100

상기 식에서, 블랭크1은 3차 증류수 + WST-1 작업용액(2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfo-phenyl)-2H-tetrazolium monosodium salt) + 효소 작업용액이고, 블랭크2는 샘플용액(대조군으로 사용할 물질) + WST-1 작업용액(2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfo-phenyl)-2H-tetrazolium monosodium salt) + 희석용 완충제이고, 그리고 블랭크3은 WST-1 작업용액(2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfo-phenyl)-2H-tetrazolium monosodium salt) + 희석용 완충제이다.

(3) ABTS + 라디칼 소거활성

상기 식이 분말에 대한 ABTS(2,2'-아지노비스-(3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산)(2,2'-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)) 라디칼 소거활성은 반덴버그(Van den Berg) 등의 방법을 변형하여 측정하였다(문헌 Van den Berg R, Haenen GR, Van den Berg H. Bast A. 1999. Applicability of an improved Trolox equivalent antioxidant capacity(TEAC) assay for evaluation of antioxidant capacity measurements of mixtures. Food Chem 66 : 511-517을 참조하시오). 7.4mM의 ABTS 시약과 2.6mM 과황산칼륨(potassium persulfate)을 3차 증류수에 녹인 후, 14시간 동안 암소 속에서 반응 및 안정화시킨 다음, 50배 희석하여 735㎚에서 흡광도를 측정하였을 때 흡광도 값이 1.4 내지 1.5 사이로 나오도록 하였다. 시료 10㎕와 ABTS 시약 200㎕를 혼합한 후, 상온에서 30분간 반응시켰으며, 대조군으로는 아스코르빈산을 사용하였다. ABTS 라디칼 소거능은 하기 수학식 8을 통해 산출하였다.

[수학식8]

ABTS 라디칼 소거능 (%) = ((블랭크 광학밀도 - 샘플 광학밀도) / 블랭크 광학밀도) * 100

상기 식에서, 블랭크 광학밀도(blank O.D)는 아스코르빈산 + ABTS 시약의 흡광도 값이다.

3.통계분석

실험결과는 SAS(Satistic Analysis System)을 이용하여 통계처리 하였으며, 평균표준편차(Mean)를 구하였다. 실험군 간의 평균값의 차이를 검증하기 위하여 일원배치 분산분석(one-way analysis of variance)를 한 후, 던칸 다중검정(Duncanmultiple range test)으로 변인간의 차이를 검증하였다. 모든 통계적인 유의성은 0.05 미만인 수준에서 실시하였다. 또한 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 함량과 항산화 활성과의 연관성은 선형회귀분석을 실시하여 검토하였다.

4.결과

1)무청 추출물의 항산화 활성 검정

(1)전자 공여능

본 발명에 따른 무청 추출물의 IC₅₀값은 대조군으로 사용된 비타민 C(아스코르빈산)에 비해 높은 것으로 확인되었다(표3 참조). 특히, 비슷한 계통의 열무가 5608.1㎍/㎖란 것을 감안하면, 일반 채소로서는 상당히 높다(문헌 Lim HW, Yoon JH, Kim YS, Lee MW, Park SY, Choi HK. 2007. Free radical scavenging and inhibition of nitric oxide production by four grades of pine mushroom(Tricholoma matsutake Sing.). Food Chem 103 : 1337-1342 참조). 이러한 결과가 나온 것은 무청에 함유된 총 폴리페놀의 함량이 식용으로 사용되는 채소들 중에서 많기 때문이다.

선행 연구를 통해 총 폴리페놀 함량에 비례하여 DPPH 라디칼 소거능이 달라진다는 것은 널리 알려져 있다(문헌 Kim OK, Lee MW, Park WB, Ham SS, Kung SS. 1992. The Nutritional Components of Aerial Whole Plant and Juice of Angelica keiskei Koidz. Kor J Food Sci Technol 24(6) : 592-596) 따라서 무청 추출물의 DPPH 라디칼 소거능의 높은 활성에는 폴리페놀 함량과 관계에 있다.

식물	항산화 활성 (IC 50, ㎍/㎖)
무청 추출물	183.37 ± 48.17
아스코르빈산(비타민 C)	221.87 ± 34.77
1) 각 수치는 3중 실험들의 평균표준편차로 표현되었음. 2) 던칸 다중검정에 의한 그룹들 간의 유의적인 차이(p<0.05) 확인 3) IC: 억제활성은 농도-억제 곡선의 외삽에 의하여 수득된 3중 실험들의 50% 억제 농도의 평균으로 표현됨.

(2) 총 폴리페놀 함량

본 발명에 따른 무청 추출물의 총 폴리페놀 함량은 2.84g/100g으로 나왔다(표 4 참조). 선행연구에서(문헌 Jin SY. 2011. Study on Antioxidant Activities of Extracts from Different Parts of Korean and Iranian Pomegranates. J Korean Soc Food Sci Nutr 40(8) : 1063-1072 참조), 상용채소인 브로콜리, 시금치, 양파, 감자, 오이의 총 페놀함량과(80.8 1.2, 79.6 8.4, 68.9 1.8, 23.3 5.8, 14.4 1.5 mg/100g) 비교하였을 때, 많은 양의 폴리페놀이 무청 추출물에 함유되어 있는 것을 알 수 있다.

식물	총 폴리페놀 함량 (g/100g, 건물량(dry weight)
무청 추출물	2.84 ± 0.11
탄닌산 (Tannin acid)	0.02 ± 0.00
1) 각 수치는 3중 실험들의 평균±표준편차로 표현되었음. 2) 던칸 다중검정에 의한 그룹들 간의 유의적인 차이(p<0.05) 확인

(3) 총 플라보노이드 함량 측정

플라보노이드(flavonoid)는 많은 염증관련 연구들에서 부작용 없는 염증 치료제로서의 가능성을 가지고 있는 것으로 확인되었는데, 특히 LPS로 자극된 쥐의 섬유모세포에서 NF-kB의 활성 및 장 상피세포인 IEC18 세포와 골수 수지상 세포에서 IkB 키나아제 활성 및 TNF- 분비가 억제하며, 크론병 모델에서도 염증을 억제한다고 입증되었다(문헌 Kim JS, Jobin C. 2005. The flavonoid luteolin prevents lipopolysaccharide-induced NF-kappaB cignalling and gene expression by blocking IkappaB kinase activity in intestinal epithelial cells and bone-marrow derived dendritic cells. Immunology Jul 115(3_ : 375-387; Kim HP, Son KH, Kim JS, Kang SS. Flavonoids : potential anti-inflammatory agents. Natural Products Sci 58(9) :537-552; Lee SJ, Son KH, Chang HW, Do JC, Jung KY, Kang SS, Kim HP. 1993. Antiinflammatory activity of naturally occurring flavone and flavonol glycosides. Arch Pharm Res 16(1) : 25-28 참조). 따라서 무청 추출물의 총 플라보노이드 함량은 100g 당 0.19g를 대조군으로 사용된 갈산(Galic acid)과 비교했을 때 항산화 활성이 높은 것을 알 수 있으며, 이들 성분이 궤양성 대장염의 증상 완화에 도움을 주었음을 알 수 있다.

식물	총 플라보노이드 함량 (g/100g, 건물량)
무청 추출물	0.19 ± 0.00
갈산	0.00 ± 0.00
1) 각 수치는 3중 실험들의 평균표준편차로 표현되었음. 2) 던칸 다중검정에 의한 그룹들 간의 유의적인 차이(p<0.05) 확인

(4)과산화물 제거효소(SOD) 유사 활성

SOD 유사활성 측정 결과, 무청 추출물이 63%, 대조군으로 사용한 BHT가 36%의 활성을 가진 것으로 나타났다.

(5)ABTS + 라디칼 소거활성

무청 추출물과 신선초 추출물의 ABTS 양이온 라디칼 소거능을 100㎍/㎖의 농도에서 측정한 결과, 무청 추출물이 17%로 가장 높았으며, 대조군으로 사용된 아스코르빈산이 13%의 활성을 가진 것으로 나타났다.

(6) 무청의 항산화 성분과 항산화 활성 간의 상관관계

플라보노이드 성분과 DPPH, ABTS 등의 실험 결과 간에 유의한 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 선행연구에서 플라보노이드 화합물이 비타민 E에 비해 3배 내지 5배 이상의 항산화 작용을 나타내었다고 보고한 것을 볼 때(문헌 Kim DO, Lee KW, Lee HJ, Lee CY. 2002. Vitamin C equivalent antioxidant capacity(VCEAC) of phenolic phytochemicals. J Agric Food Chem 50 : 3713-3717 참조), 본 실험에서 다른 계열의 폴리페놀 화합물보다 플라보노이드 화합물의 양이 더 많이 존재하며, 이들이 궤양성 대장염 억제 활성에 큰 영향을 미쳤다는 결론은 내릴 수 있다.

	총 폴리페놀 함량	총 플라보노이드 함량	DPPH 라디칼 소거능	SOD 유사 활성	ABTS 라디칼 소거능
총 폴리페놀 함량	1
총 플라보노이드 함량	0.0796	1
DPPH 라디칼 소거능	0.0578	0.9611	1
SOD 유사 활성	0.0101	0.1813	0.2367	1
ABTS 라디칼 소거능	0.1438	0.9727	0.9233	0.0921	1
1) 선형 회귀 분석과 상관계서에 의한 그룹들 간의 p<0.05에서의 유의성은 -1과 1 사이에 옴.

2)항산화 활성을 가진 무청 추출 농축액의 궤양성 대장염 억제 효과 규명

(1)대장염증 유도 전과 후의 체중 증가량, 식이섭취량, 식이효율, 음용수 및 DSS 섭취량(표 7 내지 표 9 참조)

무청 추출물 첨가 사료 섭취군의 염증 유도 전과 후에도 식이 섭취량과 체중 증가량이 대조군보다 높았다.

DSS로 대장염증을 유도한 뒤로 무청을 제외한 대조군에서 몸무게와 식이섭취량, 식이효율이 감소하였다.

특히 주목할 점은 대조군이 식이섭취량과 몸무게 증가량이 모두 급격히 감소한데 반해, 무청 추출물 첨가 사료 섭취군은 식이 섭취량은 대장염 유도전과 근접한 수치로 감소하였으며, 무게증가량이 역시 대장염 유도전과 비슷한 수치를 보였다. 이는 무청이 가진 항산화 활성과 연관이 깊다. 다른 선행연구에서 AFB1과 항산화 비타민 투여 시, 체중, 장기 및 식이섭취량을 비교하였더니, AFB1 단독 투여군에서는 체중이 감소하였으나, 항산화 비타민 C, E의 혼합 투여군에서는 체중감소에 대해 유의성이 나타나지 않았으며, 식이섭취량 역시 AFB1에서는 급격히 하강하였으나, 항산화 비타민 투여군에서는 식이섭취량 역시 감소하지 않았다고 보고하였다(문헌 Park SJ, Kim HK, Chung DH. 2002. The effect of antioxidant vitamins on residual Alfatoxin B1 in mice serum. J Korean public Health Assoc28(1) 81-88 참조).

따라서 무청의 항산화 활성을 가진 기능성 성분들이 염증으로 체중감소, 탈수 등의 현상을 완화시킨 것으로 가설을 확인할 수 있었다.

하기 표7은 대장염 미유도 기간 중의 생쥐의 체중 증가, 음식 섭취 및 음식 효율을 나타내고 있다.

그룹	체중 증가 (g/일)	음식 섭취 (g/일)	음식 효율(FER)
정상군	0.29±0.26	4.06±0.33	0.059±0.046
대조군	0.32±0.26	4.08±0.40	0.075±0.057
무청 추출물 급이군	0.26±0.93	4.72±0.76	0.033±0.157
1) 평균표준편차 2) 던칸 다중검정에 의한 그룹들 간의 유의적인 차이(p<0.05) 확인 3) 음식 효율 = 체중 증가(g)/ 음식 섭취(g) 6) 실험군(n=52)은 다음과 같음: N(13): 대조 식이 급이군 C(13): 3% DSS + 5% 대조 식이 급이군 무청(13): 3% DSS + 5% 무청 추출물 분말 급이군

하기 표 8은 대장염 유도 기간 중의 생쥐의 체중 증가, 음식 섭취 및 음식 효율을 나타내고 있다.

그룹	체중 증가 (g/일)	음식 섭취 (g/일)	음식 효율(FER)
정상군	0.15±0.21	3.66±0.71	0.07±0.08
대조군	0.10±0.27	3.44±0.59	0.01±0.11
무청 추출물 급이군	0.65±0.68	4.50±0.87	0.09±0.23
1) 평균표준편차 2) 던칸 다중검정에 의한 그룹들 간의 유의적인 차이(p<0.05) 확인 3) 음식 효율 = 체중 증가(g)/ 음식 섭취(g) 4) 실험군(n=52)은 다음과 같음: N(13): 대조 식이 급이군 C(13): 3% DSS + 5% 대조 식이 급이군 무청(13): 3% DSS + 5% 무청 추출물 분말 급이군

하기 표 9는 5일간의 대장염 유도 기간 동안의 DSS/물 섭취를 나타내고 있다.

그룹	DSS/물 섭취 (㎖/5일)	DSS/물 섭취 (㎎/g)
대조군	11.99±0.16	9.23±0.11
무청 추출물 급이군	10.67±0.07	9.28±0.11
1) 평균표준편차 2) DSS 부하 = 총 음료 섭취(㎖) DSS 농도(㎎/㎖) / 초기 체중(g) 3) 던칸 다중검정에 의한 그룹들 간의 유의적인 차이(p<0.05) 확인

(2) 대장염 유발 전후의 체중변화량

그룹	정상군	대조군	무청 추출물 급이군
대장염 유도전	2.00±0.06	2.37±0.09	1.51±0.25
대장염 유도후	1.77±0.45	0.42±0.63	3.44±1.48
1) 평균표준편차 2) 던칸 다중검정에 의한 그룹들 간의 유의적인 차이(p<0.05) 확인

대장염증 발병 전 무청 추출물 섭취군의 경우, 정상군, 대조군에 비해 체중 증가량이 적었으나, 대장염증 발병 후에는 지속적인 무게증가와 식이 섭취량을 보여 이것이 평균 체중에 영향을 주었다고 판단된다. 이는 무청 추출물의 항산화 성분이 염증을 억제하고, 무청 추출물의 식이섬유 단당류가 분해되면서 대장 내 세포에 연료로 사용되어 대장의 부담을 덜어 실험동물의 장 기능 개선에 긍정적인 영향을 미치었기 때문으로 보고 있다(문헌 Jang HS, Ahn JM, Ku KH, Rhee SJ, Kang SK, Choi JH. 2008. Effect of Radish Leaves Powder on the Gastrointestinal Function and Fecal Triglyceride and Sterol Excretion in Rats Fed a Hypercholesterolemic Diet. J Korean Soc Food Sci Nutr 37(10) : 1258-1263 참조; 문헌 Carol Byrd-Bredbenner, Gail Moe, Donna Beshgetoor, Jacqueline Berning. 2010. Nutrient analysis of varying socioeconomic status home food environments in New Jersey Appetite 54 : 384-389 참조).

3)대장길이의 변화

청 추출물 섭취군의 경우, 정상군보다 대장의 길이가 더 길은 것으로 나타났으며, 정상군에 비해 DSS 단독 처리 된 대조군의 대장이 축소된 모습이었는데, 이는 DSS가 점막 상피세포에 직접 독성을 나타내어 점막 장벽의 완전성에 영향을 주기 때문으로 생각된다(문헌 Jung HC. 2001. Animal model for inflammatory bowel disease. Korean J Gastroenterol 37(2) : 69-75; Wirtz S,Neurath MF. 2007. Mouse models of inflammatory bowel disease. Adv Drug Deliv Rev 59(11) : 1073-1083 참조).

청 추출물의 항산화 성분이 염증을 억제하고 장내 기능을 개선하였기 때문이다. 하기 표 11은 대장의 변화를 나타내고 있다.

그룹	대장 길이(㎝)
정상군	7.7±0.5
대조군	7.2±1.6
무청 급이군	8.7±1.1
1) 평균표준편차 2) 던칸 다중검정에 의한 그룹들 간의 유의적인 차이(p<0.05) 확인

(4)장내 미생물 변화 비교

16S rDNA V3을 표적(target)으로 한 338f-GC와 518r 프라이머쌍(primer pair)으로 박테리아 유전자(bacterial genomic) DNA를 중합효소 연쇄반응(PCR)하여 약 180bp의 단편(fragment)을 얻었으며, 변성세척겔에 전기영동하여 다양한 장내세균총을 확인하였다. 사진(도 1)에서 왼쪽부터 정상군, 대조군, 무청 추출물 급이군이다.

1번 밴드는 비-배양 박테리아(Uncultured bacterium) 80%, 2번 밴드는 헬리코박터 카나덴시스(H. canadensis) 97%, 3번은 비배양 박테리아 80%, 4번은 비배양 피르미쿠트 박테리움(Uncultured Firmicutes bacterium) 93%, 5번 밴드는 헬리코박터 파이롤리(H. pylori) 92% 일치하는 것으로 나왔다. 2번과 5번 밴드는 유해균인 헬리코박터 균주로 무청에서는 5번만 나와, 무청 추출물에서 헬리코박터 균주의 발현을 감소시킨 것을 알 수 있었다.

(5) 대장 내 염증세포의 조직학적 소견

대장 조직 절편 중 무작위로 선별하여 조직검사를 한 결과, 도 2(결장 내 염증 세포의 외양)에 나타낸 바와 같이, A는 정상군으로 염증단계가 2등급(grade 2)이나 깨끗한 모습을 띄우는데 반해, B는 대조군은 4등급으로 점막하층에 많은 염증세포가 침윤해 있고 점막상피 증식이 뚜렷하게 관찰되었다. 무청 추출물 분말 섭취군은 C는 1등급에 해당되며 점막고유층에 소수의 염증세포 침윤이 관찰되었으며, 점막상피는 약한 과형성이 있지만 전반적으로 대장염 호전 효과가 관찰되었다.

도 2에서 A는 대조 급이군이고, B는 3% DSS + 대조 급이군이고, C는 3% DSS + 5% 무청 추출물 분말 급이군이다.

(6) 대장 내 염증 세포수 측정

표 12에 나타난 바와 같이, 대조군의 대장의 조직절편의 대부분에서 염증세포 출현이 뚜렷이 인지되었으며, 대조군과 비교했을 때 무청 추출물에서 염증세포가 감소하였음을 알 수 있었다. 따라서 무청 추출물의 장 점막 보호효과를 확인할 수 있었다.

그룹	대장염 세포수
정상군	5.00±2.31
대조군	10.75±0.00
무청 추출물 급이군	9.25±0.00
1) 평균표준편차 2) 던칸 다중검정에 의한 그룹들 간의 유의적인 차이(p<0.05) 확인

5.결론

무청 추출물의 항산화 활성을 가진 기능성 성분들로 인해 염증으로 인해 발생하는 산화 스트레스를 줄이는 역할을 함으로써 궤양성 대장염증 발병 시 동반하는 혈변 및 체중감소, 탈수 현상을 완화시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명은 항산화 효과 등을 기대할 수 있는 사료 등을 제조하고, 이를 유통하는 축산업에서 이용될 수 있다.

이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

(도면 부호 없음)

Claims (9)

1. 유효성분으로서 무청 추출물을 포함함을 특징으로 하는 항염 및 항산화를 위한 사료조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 무청 추출물이 무청를 탄소수 1 내지 4의 저급알코올로 이루어지는 군으로부터 선택되는 알코올로 추출된 것임을 특징으로 하는 항염 및 항산화를 위한 사료조성물.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 알코올이 에탄올임을 특징으로 하는 항염 및 항산화를 위한 사료조성물.
4. 제 1 항에 있어서,상기 무청 추출물이 무청을 건조시킨 건조분말을 추출한 것임을 특징으로 하는 항염 및 항산화를 위한 사료조성물.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 무청 추출물이 무청를 추출하여 제조되되, 추출비율이 무청의 70% 내지 90% 에탄올 90 내지 99중량% 및 상기 무청 1 내지 10중량%의 비율로 혼합하고, 상온에서 40 내지 54시간 동안 현탁시킨 후, 다시 20 내지 28시간 동안 침지시킨 후, 여과하는 과정을 1 내지 5번 반복하여 얻은 추출물을 합하여 1 내지 20의 온도조건에서 농축시킨 농축액임을 특징으로 하는 항염 및 항산화를 위한 사료 조성물.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 무청 추출물이 상기 조성물 총 중량을 기준으로 1 내지 99중량%의 범위 이내의 양으로 포함됨을 특징으로 하는 항염 및 항산화를 위한 사료 조성물.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 수득된 농축액이 후속하여 동결건조되어 추출분말로 제조된 것임을 특징으로 하는 항염 및 항산화를 위한 사료 조성물.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 추출분말이 상기 조성물 총 중량을 기준으로 1 내지 99중량%의 범위 이내의 양으로 포함됨을 특징으로 하는 항염 및 항산화를 위한 사료조성물.
9. 청구항 제 1 항 내지 제 8 항들 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 사료 첨가물 .

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