KR101231590B1 - 항바이러스, 항산화 및 항균 효과를 가지는 비파 추출물 또는 이의 분획물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비파 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 항바이러스용, 항균용 또는 항균용 조성물 및 상기 조성물을 유효성분으로 함유하는 항바이러스, 항산화 또는 항균 활성 증가용 식품에 관한 것이다.

Description

항바이러스, 항산화 및 항균 효과를 가지는 비파 추출물 또는 이의 분획물{Eriobotrya japonica extract or its fraction having antiviral, antioxidative and antimicrobial effects}

본 발명은 비파 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 항바이러스용, 항산화용 또는 항균용 조성물 및 상기 조성물을 유효성분으로 함유하는 항바이러스, 항산화 또는 항균 활성 증가용 식품에 관한 것이다.

비파(Eriobotrya japonica Lindl.)는 장미과의 상록 교목으로 높이가 5 m 내외로 잎은 어긋나고 타원상 긴 난형이며, 길이 15~25 cm, 너비 3~5 cm로 표면에 털이 없으며, 윤채가 있고 뒷면에 연한 갈색 밀모가 덮여 있다. 꽃은 10~11월에 백색으로 피며, 향기가 좋고 열매는 이듬해 6월에 황색으로 익는데, 사과, 배, 감귤, 감 등과 같이 과육이 발달된 인과류에 속한다. 우리나라에서는 제주도, 경남 및 전남지방 등 온화한 기후 조건에서 주로 자생하고, 예로부터 민간요법으로 청폐, 진해, 거담, 건위, 이뇨, 폐열해소, 기관지염, 구역질, 딸꾹질 및 부종 등에 효능이 있다고 알려져 있다.

비파는 약 20여 종이 있으나 그 특성이 확실하게 알려진 것은 11종밖에 되지 않는다. 그 중 대부분이 중국에 원생하고 일본에서는 1종이 자생한다고 한다. 비파는 중국에서 가장 오래 재배된 과수의 하나로 약 2,000년 전부터 기록이 있고 6세기에 대과, 소과, 백색, 주황색 과육 등 여러 재배품종이 이미 존재하였다고 한다. 경제적인 품종개량은 일본에서 주로 이루어져 많은 품종이 육성되었고, 대부분 품종이 내한성이 약하여 우리나라에서는 품종 고유의 특성이 나타나지 않는다. 본 발명에서 공시된 품종은 대방, 부방, 재래종으로 대방 품종은 일본 농림성 원예시험장에서 전중 품종에 남 품종을 교배하여 육성한 품종으로 추위에 강하고 6월 초순이면 수확이 가능한 조생종이다. 부방 품종은 진운 품종과 서수 품종의 교잡 품종으로 수세는 중정도이며 하우스 적응성이 높아 하우스 재배에 적합하다. 재래종은 중국산 비파, 이른바 당비파가 주류를 이루기 전에 재배되었던 품종을 말한다.

비파잎은 폐를 맑게 하고 위를 조화시키며 기를 강하시키고 담을 삭이는 효능이 알려져 있다. 또한 염증과 관련된 피부질환, 기침, 가래 등에도 효과가 있으며, 혈당강하, 간 기능 개선 및 여러 가지 항염증활성 등의 약리활성도 보고되어 있다. 비파잎의 성분으로는 우르솔산(ursolic acid), 올레아놀산(oleanolic acid), 마스리닌산(maslinic acid) 및 토멘틱산(tormentic acid)을 비롯한 다양한 트리테르페노이드(triterpenoids) 화합물이 많이 함유되어 있으며, 이외에도 세스퀴테르펜 배당체(sesquiterpene glycosides), 플라보노이드 배당체(flavonoid glycosides) 및 여러 가지 폴리페놀 등이 함유되어 있는 것으로 보고되어 있다.

한국특허공개 제2010-0117988호에는 비파 추출물을 함유하는 당뇨병 예방 또는 개선용 조성물이 개시되어 있으며, 한국특허등록 제0673068호에는 비파엽 추출물을 함유하는 비만 관련 질환의 치료 및 예방을 위한 조성물이 개시되어 있으나, 본 발명의 항바이러스, 항산화 및 항균 효과를 가지는 비파 추출물 또는 비파 분획물과는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 비파잎을 에탄올을 이용하여 추출한 추출물이 항바이러스, 항산화 및 항균 효과를 나타냄으로써, 이를 통하여 상기 비파잎의 다양한 유용성을 밝히는 데 그 목적이 있다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 비파 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 항바이러스용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 비파 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 항산화용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 비파 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항바이러스용 조성물을 유효성분으로 함유하는 항바이러스 활성 증가용 식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항산화용 조성물을 유효성분으로 함유하는 항산화 활성 증가용 식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항균용 조성물을 유효성분으로 함유하는 항균 활성 증가용 식품을 제공한다.

본 발명에 따르면, 비파 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 항바이러스용, 항산화용 및 항균용 조성물은 식물로부터 얻어진 물질을 함유하기 때문에 부작용을 일으키지 않고 건강 지향의 기능성 식품을 제공하여, 식품류 및 차 등의 기능성 식품에 유용하게 쓰일 수 있으며, 이를 통해 농가의 생산력 향상 및 부가가치 증대를 기대할 수 있다.

도 1은 비파 80% 에탄올 추출물에 물과 n-헥산을 1:1(v:v)의 비율로 혼합한 혼합물을 가하여 n-헥산 분획물을 얻고, 상기 분획물을 얻고 남은 물층에 에틸아세테이트를 가하여 에틸아세테이트 분획물을 얻고, 상기 분획물을 얻고 남은 물층에 n-부탄올을 가하여 n-부탄올 분획물을 얻고, 상기 분획물을 얻고 남은 용액을 물 분획물으로 하여 얻는 과정을 도식화한 것이다.
도 2는 비파잎의 품종별 80% 에탄올 추출물 및 이의 분획물(n-헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 분획물)의 농도별 환원력을 흡광도 수치로 나타낸 것이다.
도 3은 RAW 264.7 세포에서 리포폴리사카라이드(LPS)로 유도된 NO(nitric oxide) 생성에 대한 비파잎의 품종별 80% 에탄올 추출물 및 이의 분획물(n-헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 분획물)의 농도별 저해 효과를 나타낸 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비파 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 항바이러스용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 비파 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 항산화용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 비파 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

상기 비파 추출물은 비파 에탄올 추출물일 수 있는데, 상기 비파 에탄올 추출물은

(a) 건조된 비파잎 80~120 중량부에 70~90% 에탄올을 800~1200 중량부 가하여 10~30분간 초음파 분해한 후, 100~200 rpm 및 20~30℃에서 10~14시간 동안 진탕 추출하는 단계; 및

(b) 상기 추출된 추출액을 여과한 후 30~50℃에서 농축하는 단계에 의해 제조될 수 있으며,

바람직하게는

(a) 건조된 비파잎 100 중량부에 80% 에탄올을 1000 중량부 가하여 20분간 초음파 분해한 후, 150 rpm 및 25℃에서 12시간 동안 진탕 추출하는 단계; 및

(b) 상기 추출된 추출액을 여과한 후 40℃에서 농축하는 단계에 의해 제조될 수 있다.

상기 비파잎의 품종은 대방, 부방 또는 재래종일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 분획물은 n-헥산(n-hexane), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 n-부탄올(n-butanol)을 순차적으로 가하여 얻어진 n-헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물, n-부탄올 분획물 또는 물 분획물인 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 항바이러스용 조성물에서, 상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스 A(influenza virus A), PEDV(Porcine epidemic diarrhoea coronavirus), BRV(bovine rotavirus) 또는 PRV(Pseudorabies virus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 항균용 조성물에서, 항균 효과는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 대장균(Escherichia coli)을 억제하는 효과일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 상기 항바이러스용 조성물을 유효성분으로 함유하는 항바이러스 활성 증가용 식품을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 항산화용 조성물을 유효성분으로 함유하는 항산화 활성 증가용 식품을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 항균용 조성물을 유효성분으로 함유하는 항균 활성 증가용 식품을 제공한다.

상기 식품은 항바이러스, 항산화 또는 항균 활성을 증가시키기 위해 섭취할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01~0.04 g, 바람직하게는 약 0.02~0.03 g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

1. 실험재료

본 실험에 사용된 비파잎은 전남 진해 농업기술센터에서 2008년도 5월에 수확한 대방, 부방, 재래종 품종을 제공받아 사용하였다. 각 시료는 수세하여 잎 표면의 털을 제거하고, 3일 동안 음건한 후, -70℃에 보관하면서 사용하였다.

2. 용매추출

건조된 비파잎 100 g에 10배의 80% 에탄올을 가하여 20분간 초음파 분해(sonication)한 후, 25℃에서 150 rpm으로 진탕배양기(shaking incubator, Wisecube, DAIHAN Scientific, Korea)에서 12시간 진탕 추출하였으며, 이 과정을 3회 반복하였다. 상기 추출된 추출액은 여과지(Whatman No.4)로 여과한 후 회전진공농축기(Eyela A-1000S, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 40℃에서 감압 농축하여 80% 에탄올 추출물을 얻었다.

3. 용매분획 및 추출 수율 측정

농축된 80% 에탄올 추출물을 극성의 차이를 이용해 서로 다른 용매를 첨가하여 단계적으로 분획하였다. 비파잎의 80% 에탄올 추출물을 증류수에 용해시킨 후 분획 깔대기에 넣고 n-헥산(n-hexane), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 n-부탄올(n-butanol)을 순차적으로 가하여 각 분획물을 얻었고 최종 남은 용액은 물 분획물이라 칭하였다(도 1). 이 분획물들은 감압농축과 동결 건조를 통해 용매를 제거한 후 실험에 사용하였다. 추출물 및 각 분획 별로 얻어진 추출물의 추출 수율은 건조된 비파잎의 고형분 중량에 추출물 및 분획물의 고형분 함량(%)으로 표시하였다(표 1).

4. 항산화 활성 분석

4-1. 총 폴리페놀( total polyphenol ) 화합물 함량 측정

총 폴리페놀 화합물 함량은 Folin-Ciocalteu(1912)의 방법을 사용하여 분석하였다. 각 추출물 및 분획물을 메탄올(methanol)로 녹여 최종농도를 0.5 mg/mL로 하였고, 각각의 시료 0.1 mL에 Folin-Ciocalteu's reagent(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 0.2 mL를 첨가하고 23℃에서 1분간 유지시켰다. 그 후 5% Na₂CO₃ 3 mL을 가하여 23℃에서 1시간 방치 후, UV/Vis-spectrophotometer(UV-1800, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)을 사용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 gallic acid(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 이용하여 검량 곡선을 작성한 후 함량 계산에 활용하였다.

4-2. DPPH 라디칼 ( DPPH radical ) 소거능 분석

각 추출물 및 분획물에 대한 DPPH(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl) 라디칼(radical) 소거능은 Blois MS(1958)의 방법에 의하여 측정하였다. 즉, 시료 1 mL와 2×10^-4 M DPPH(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl) 용액 3 mL를 5초 동안 볼텍스 믹서(voltex mixer)로 혼합하여 실온에서 30분간 방치한 후 UV/Vis-spectrophotometer(UV-1800, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼(DPPH radical) 소거능은 하기과 같은 계산식에 의해 환산하였으며, 대조구에 대한 50% 흡광도의 감소를 나타내는 검체의 농도(IC₅₀)로 표시하였다. 대조구는 시료 대신 메탄올 1 mL을 첨가하여 측정하였다.

DPPH-라디칼 소거 능력(DPPH-radicals scavenging activity, %)=(1-A/B)×100

A: 샘플 흡광도(absorbance of sample)

B: 대조구 흡광도(absorbance of blank)

4-3. ABTS 라디칼 소거능

ABTS[2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] radical cation decolorization의 측정은 Pellegrin 등(1998)의 방법에 의해 측정하였다. 7 mM ABTS와 140 mM K₂S₂O₈을 5 mL:88 μL로 섞어 어두운 곳에 14~16시간 방치시킨 후, 이를 무수 에탄올(absolute ethanol)과 1:88의 비율로 섞어 734 nm에서 대조구의 흡광도 값이 0.7±0.002가 되도록 조절한 ABTS 용액을 사용하였다. 시료용액 50 μL와 ABTS 용액 1 mL를 30초 동안 섞은 후 2.5분간 항온처리(incubation)한 후 734 nm에서 흡광도를 측정하여 아래의 식에 의해 저해율을 계산하였다.

저해율(inhibition rate, %)=(1-샘플 흡광도/대조구 흡광도)×100

4-4 환원력 측정

환원력은 Oyaizu M(1986)의 방법에 따라 측정하였다. 농도별로 희석한 각 추출물 및 분획물(0.1~1 mg/mL) 1 mL에 200 mM sodium phosphate buffer(pH 6.6) 1 mL와 1% 적혈염(potassium ferricyanide) 1 mL를 넣어 50℃에서 20분간 반응시킨 후, 10% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)를 1 mL 첨가하여 교반시켜 3,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 그리고 상층액 1 mL와 증류수 1 mL, 1% 염화철(ferric chloride) 0.1 mL을 혼합한 후 UV/Vis-spectrophotometer(UV-1800, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)를 사용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.

4-5. FRAP ( Ferric - reducing antioxidant potential ) 측정

각 추출물 및 분획물의 FRAP 측정은 Benzie IFF and Strain JJ(1996)의 방법을 참고하여 측정하였다. FRAP reagent는 25 mL acetate buffer(300 mM, pH 3.6)를 37℃에서 가온한 후, 40 mM HCl에 용해한 10 mM 2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-tri-azine(TPTZ, Sigma Chemical co., st. Louis, MO, USA) 2.5 mL과 20 mM ferric chloride(FeCl₃) 2.5 mL을 가하여 제조하였다. 제조된 0.9 mL FRAP reagent에 시료 0.03 mL과 증류수 0.09 mL을 넣은 후 37 ℃에서 10분간 반응시킨 후 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료 대신 에탄올을 넣어 측정하였다. 아스코르브산(ascorbic acid)을 1 mg/mL 농도로 제조하여 대조군으로 사용하였고 계산은 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 및 1 mM의 농도로 반복하여 작성한 FeSO₄의 검량식에 대입하여 구하였다.

4-6. SOD 유사 활성(SOD - likely activity ) 분석

각 추출물 및 분획물의 SOD 유사 활성은 피로갈롤(pyrogallol)의 자동 산화가 SOD 유사 활성 물질의 첨가에 의해 산화속도가 억제되는 원리를 이용한 Marklund & Marklund 의 방법(1974)을 변형하여 사용하였다. 즉, 분획 별 추출한 시료 0.1 g에 트리스 아미노 메탄(tris amino methane)과 카코딜산(cacodylic acid)으로 제조한 50 mM tris-cacodylic acid buffer(TCB, pH 8.2) 10 mL를 가하여 실온에서 1시간 동안 shanking incubation 시킨 후 3,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 그 상등액을 여과한 후 TCB로 희석하여 시료로 사용하였다. 1회용 큐벳(cuvette)에 시료 0.9 mL을 취하고 10 mM HCl을 용매로 제조한 20 mM pyrogallol(1,2,3-benzenetriol) 용액을 0.1 mL 가하여 피펫(pipet)으로 3회 혼합한 후 실온을 유지하면서 420 nm에서 2분간 흡광도 변화를 측정하였다. SOD 유사 활성은 TCB 0.9 mL를 사용하여 동일한 방법으로 측정한 흡광도 변화를 대조구로 하여 피로갈롤(pyrogallol)의 자동 산화 억제 정도를 아래의 식에 따라 계산식에 의해 환산하였다.

SOD 유사 활성(SOD like activity, %) = (1-B/A) × 100

A: 대조구의 피로갈롤 자동산화율

B: 샘플의 피로갈롤 자동산화율

4-7. 아질산염 소거능( Nitrite - scavenging ability , NSA )

각 추출물 및 분획물의 아질산염 소거능(nitrite-scavenging ability, NSA)은 Gray와 Dugan(1975)의 방법에 준하여 다음과 같이 측정하였다. 즉, 1 mM 아질산 나트륨 용액 0.1 mL에 각각의 추출물을 0.2 mL을 가하고, 여기에 0.1 N 염산(pH 1.2) 및 0.2 N 구연산 완충용액(pH 3.0, 4.2 및 pH 6.0)을 0.7 mL 가하여 반응용액의 부피를 1 mL로 하였다. 이를 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 여기에 2% 초산 5 mL, Griess 시약(acetic acid에 1% sulfanilic acid와 1% naphthylamine을 1:1 비율로 혼합한 것으로 사용 직전에 제조) 0.4 mL를 가하여 혼합시키고 15분간 실온에서 방치시킨 후 UV/Vis-spectrophotometer(UV-1800, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)를 사용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존하는 아질산염량을 구하였다. 그리고 대조구는 Griess 시약 대신 증류수 0.4 mL를 가하여 상기와 동일하게 행하였다. 아질산염 소거능은 추출액 첨가 전 후의 아질산염 백분율(%)로 표기하였다.

N(%)= (1-(A-C/B))×100

N : 아질산염 소거율

A : 1 mM NaNO₂ 용액에 시료를 첨가하여 1시간 반응시킨 후의 흡광도

B : 1 mM NaNO₂ 용액에 시료 대신 증류수를 첨가하여 1시간 반응시킨 후의 흡광도

C : 시료 추출물 자체의 흡광도

5. 항균활성

실험에 사용한 균주는 그람(gram) 양성균으로서 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus KCTC 3881)과 바실러스 세레우스(Bacillus cereus KCTC 1012), 바실러스 서브틸리스(Bacilus subtilis KCTC 1022)를 사용하였고, 그람(gram) 음성균으로서 대장균(Escherichia coli KCTC 2441), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa KCTC 1636), 살모넬라 엔트리카(Salmonella enterica KCTC 1925)를 한국생물자원센터에서 분양받아 사용하였다. 균 생육 배지로는 한천배지(nutrient agar)를 사용하였다.

각 추출물의 항균활성은 각 균주를 대상으로 disc diffusion assay(Collins et. al 1995)로 측정하였다. 항균시험용 평판 배지는 계대 배양된 각 균주를 멸균 면봉을 이용하여 200 uL씩 도말하여 준비하였고 200 mg/mL 농도로 조제한 시료를 disc 당 10 mg이 되도록 페이퍼 디스크(paper disc, 8 mm)에 천천히 흡수시킨 뒤 건조과정을 거쳐 용매를 휘발시킨 후 평판 배지 위에 밀착시킨 상태로 30~37℃에서 24시간 배양한 후 디스크(disc) 주변에 생성된 생육 저해환(clear zone, mm)을 측정하여 항균활성을 비교하였다. 대조군으로 암피실린(ampicillin, 10 ug/disc)을 사용하였다.

6. Nitric oxide ( NO ) 농도 측정

6-1. 세포배양

RAW 264.7 macrophage cell은 DMEM에 10% FBS, 페니실린(penicillin, 100 U/mL), 스트렙토마이신(streptomycin, 100 μg/mL)을 첨가하여 배양하였으며, 배양기를 이용하여 37℃와 5% CO₂를 유지하였다.

6-2 산화질소( nitric oxide ) 농도 측정

산화질소(nitric oxide) 측정은 cellular media에서 Griess의 방법(Park PH et al., 2009)을 이용하여 측정하였다. 세포를 96-웰 플레이트에 분주하고 LPS(1 μg/mL) 를 처리하여 18시간 동안 배양하였다. 배양 마지막 단계에 배양액으로 유리되어 나온 아질산염(nitrite) 양을 측정하였다. 세포 부유액과 Griess reagent와 동량으로 혼합하여 각 시료별 흡광도를 540 nm 파장에서 측정하였다. 산화질소(Nitric oxide, μM)의 농도는 DMEM에 녹인 먼저 알고 있는 농도의 아질산 나트륨(sodium nitrite)를 이용하여 표준곡선을 구한 뒤 계산하였다. 측정은 3번 반복 실시하여 결과는 평균값으로 나타내었다.

7. 항바이러스 활성 측정

7-1. 바이러스 및 세포 배양

인플루엔자 바이러스 A(Influenza virus A PR8 strain)를 배양하기 위해 MDCK 세포, porcine epidemic diarrhea virus(PEDV, KPED-9 strain)와 Pseudorabies virus(PRV, YS400 strain)를 배양하기 위해 Vero 세포, bovine rotavirus(BRV, P44 strain)를 배양하기 위해 MA104 세포를 사용하였으며, 이 세포들을 배양하기 위해 minimal essential medium(MEM)(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 10% fetal bovine serum(FBS) 및 0.01% antibiotic-antimycotic이 사용되었다. 그리고 Influenza A virus (PR8 strain), PEDV(KPED-9 strain), BRV(P44 strain)를 배양하기 위해서 각각 2.5, 10 ug/ml의 트립신(trypsin, sigma)이 첨가되고 FBS가 무첨가된 MEM을 사용하였다.

7-2. 비파 추출물에 의한 세포 독성( cytotoxicity ) 실험

Vero, MDCK, MA-104 세포를 96 웰 세포 배양 플레이트에 3X10⁴ 만큼 분주하고 20시간 배양하였다. 그리고, 비파 추출물을 10¹~10⁴ 희석하여, 각 4개 웰씩 분주하고, 3일간 배양하였다. 현미경상에서 세포의 세포변성효과(cytopathic effect, CPE)를 확인하여 생존능력(viability)을 측정하였다.

7-3. 항바이러스 효과( antiviral effect) 측정

Vero, MDCK, MA-104 세포를 96 웰 세포 배양 플레이트에 3X10⁴ 만큼 분주하고 20시간 동안 배양하였다. 비파 추출물에 의한 세포 독성(cytotoxicity) 실험을 통해 선택한 150 ug/ml의 비파 추출물 50 ul와 각각의 바이러스를 10¹~10⁴ 희석하여, 50 ul를 비파 추출물과 섞어 주고 1시간 30분 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에 정치시킨 후, 세포가 자라고 있는 96 웰 세포 배양 플레이트의 배지를 버리고, 바이러스와 비파 추출물 혼합액 100 ul를 분주한다. 3일 후 바이러스가 일으키는 CPE을 통해 바이러스의 적정 농도(titer)를 Reed and Muench method를 이용하여 50% tissue culture infective dose(TCID₅₀)를 측정하였다. PEDV의 경우 CPE를 보이지 않았기 때문에 immunofluorescence assay(IFA) 방법을 통해 적정 농도(titer)를 측정하였다. 이 방법은 배양 3일 후 세포를 PBS로 세척하고, 70% 아세톤으로 세포를 고정한 후, anti-PEDV spike protein 단클론 항체(3F12, 제노바이오택)를 첨가하여 1시간 동안 방치하고 세척한 후, anti-mouse IgG-FITC 항체를 첨가하여 1시간 동안 방치하고 세척한 후, 형광 현미경(Olympus, Japan)에서 바이러스의 감염(infection)을 확인하였다. 그리고 동시에 비파 추출물을 첨가하지 않고 바이러스만 배양하여 비파 추출물에 의해 바이러스에 의한 CPE와 전염성(infectivity)가 감소한 것을 비교하였다.

실시예 1: 비파잎 품종별 추출물 및 용매 분획물의 추출 수율

비파잎의 품종별 80% 에탄올 추출물을 용매별로 분획한 후 80% 에탄올 추출물에 대한 추출 수율을 측정한 결과를 표 1에 나타내었다. 80% 에탄올 추출물의 용매별 분획의 추출 수율은 대방의 경우, 물 분획물이 가장 높았으며(40.10%), 부탄올 분획물(22.56%) > 에틸아세테이트 분획물(18.16%) > 헥산 분획물(4.35%)의 순으로 나타났다. 부방 또한 물 분획물이 37.72%로 수율이 가장 높았으며, 부탄올 분획물(27.30%) > 에틸아세테이트 분획물(22.0%) > 헥산 분획물(3.70%)의 순으로 나타났다. 재래종은 물 분획물(40.28%) > 부탄올 분획물(25.43%) > 에틸아세테이트 분획물(23.75%) 순으로 높게 나타났고, 헥산 분획물이 2.60%로 다른 품종과 함께 가장 낮게 추출되었다.

비파잎 품종별 추출물 및 용매 분획물의 추출 수율

용매	분획 수율(%)
	종
	대방	부방	재래종
80% 에탄올 추출물	100	100	100
n-헥산 분획물	4.35	3.70	2.60
에틸아세테이트 분획물	18.16	22.00	23.75
n-부탄올 분획물	22.56	27.30	25.43
물 분획물	40.10	37.72	40.28

실시예 2: 비파잎 품종별 추출물 및 용매 분획물의 총 폴리페놀( total polyphenol) 함량 분석

폴리페놀계 물질들은 한 분자 내에 2개 이상의 phenolic hydroxyl(-OH)기를 가진 방향족 화합물들을 총칭하며, 식물체에 특수한 색깔을 부여하고 산화-환원 반응에서 기질로 작용한다. 플라보노이드와 탄닌이 주된 식물계 폴리페놀 물질이며, 충치 예방, 고혈압 억제, 항산화, 항암 등의 다양한 생리활성을 가진다. 일반적으로 식물성분의 항산화 활성은 페놀성 화합물이 원인물질로 관련되어 있는 것으로 알려져 있어 갈산(gallic acid)을 표준용액으로 하여 작성한 검정곡선으로부터 비파잎의 품종별 추출물 및 분획물의 총 폴리페놀 화합물 함량을 측정하여 표 2에 나타내었다.

그 결과, 각 분획물의 총 폴리페놀 화합물 함량은 부탄올 분획물이 가장 높았고, 그 다음은 에틸아세테이트 분획물, 헥산 분획물, 80% 에탄올 추출물, 물 분획물 순으로 나타났다. 비파잎 3품종 중에서 총 폴리페놀 화합물이 가장 높은 품종은 재래종 품종으로 부탄올 분획물이 478.50±6.89 mg/g로 측정되었고, 에틸아세테이트 분획물(296.59±4.76 mg/g) > 헥산 분획물(219.45±0.42 mg/g) > 80% 에탄올 추출물(208.5±3.78 mg/g) > 물 분획물(132.07±2.58 mg/g) 순으로 측정되었다.

비파잎 품종별 추출물 및 용매 분획물의 총 폴리페놀(total polyphenol) 함량

용매	총 폴리페놀 함량(mg/g fr. extract)
	대방	부방	재래종
80% 에탄올 추출물	166.83±4.651) d2 )B3)	200.64±5.67cA	208.5±3.78dA
n-헥산 분획물	218.50±2.48cA	198.02±5.17cB	219.45±0.42cA
에틸아세테이트 분획물	267.07±5.00bC	278.02±5.17bB	296.59±4.76bA
n-부탄올 분획물	389.45±4.60aC	410.88±7.19aB	478.50±6.89aA
물 분획물	84.93±2.58eC	100.64±3.57dB	132.07±2.58eA

¹⁾ 평균±표준편차(n=3)

^{2) a~e}같은 칸에서 서로 다른 문자는 p<0.05에서 유의적인 차이가 있다.

^{3) A~C}같은 열에서 서로 다른 문자는 p<0.05에서 유의적인 차이가 있다.

실시예 3: 비파잎 품종별 추출물 및 용매 분획물의 DPPH 라디칼( DPPH radical) 소거능

항산화 활성 측정방법 중 DPPH 라디칼 소거법은 실제 항산화 활성과 연관성이 높은 방법으로서, 활성 라디칼에 전자를 공여하여 지방질의 산화를 억제시키는 척도로 사용되고 있을 뿐 아니라, 인체 내에서 활성 라디칼에 의한 노화를 억제하는 작용의 척도로 이용되고 있다. 따라서 비파잎 추출물 및 분획물의 항산화 활성을 평가하기 위해 DPPH 라디칼 소거능을 측정하여 DPPH 자유 라디칼(DPPH free radical)을 50% 저해했을 때의 시료 농도(IC₅₀)를 표 3에 나타내었다.

분획물 중 가장 활성이 높은 분획물은 부탄올 분획물로, IC₅₀값이 재래종 품종 0.18 mg/mL, 부방 품종 0.22 mg/mL, 대방 품종 0.23 mg/mL로 나타나 3품종 중에서 재래종 품종이 가장 높은 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었다. 3품종의 비파잎 부탄올 분획물은 아스코르브산(ascorbic acid)의 IC₅₀(0.03 mg/mL)과 비교해 보았을 때, 아스코르브산(ascorbic acid)가 단일물질이라는 점을 감안하면 비교적 높은 DPPH 라디칼 소거능이 있다고 평가되었다. 그 다음으로 높은 활성을 보이는 분획물은 3품종 모두 에틸아세테이트 분획물 > 80% 에탄올 추출물 > 물 분획물 > 헥산 분획물 순으로 나타났다. 이처럼 각 시료들의 DPPH 라디칼 소거능은 추출용매별로 상이하며 시료의 특성에 따라 추출물별 활성도 상이함을 확인할 수 있었다.

비파잎 품종별 추출물 및 용매 분획물의 DPPH 라디칼 소거능

용매	IC50(mg/mL)1)
	대방	부방	자생종
80% 에탄올 추출물	0.43±0.002) c3 )B4)	0.44±0.02cB	0.50±0.00bA
n-헥산 분획물	2.05±0.05aB	1.14±0.01aC	4.87±0.21aA
에틸아세테이트 분획물	0.40±0.01cA	0.34±0.00dB	0.40±0.01bA
n-부탄올 분획물	0.23±0.01dA	0.22±0.01eA	0.18±0.01cB
물 분획물	0.80±0.01bA	0.78±0.02bA	0.57±0.01bB

¹⁾ 저해활성은 3번 반복하여 50% 저해하는 농도의 의미로 나타낸 것이다.

²⁾ 평균±표준편차(n=3)

^{3) a~e}같은 칸에서 서로 다른 문자는 p<0.05에서 유의적인 차이가 있다.

^{4) A~C}같은 열에서 서로 다른 문자는 p<0.05에서 유의적인 차이가 있다.

실시예 4: 비파잎 품종별 추출물 및 용매 분획물의 ABTS 라디칼 소거능

ABTS[2,2'-azinobis(3 ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)]는 비교적 안정한 자유 라디칼(free radical)로서 DPPH 방법과 함께 항산화활성을 스크리닝하는데 많이 이용되고 있다. 또한 친유성 또는 친수성 항산화 물질의 측정에 적용 가능한 방법으로 이 방법에 의한 항산화 활성은 ABTS 라디칼을 억제하거나 소거하는 것에 의해 이루어진다. ABTS를 페록시다아제(peroxidase), H₂O₂와 반응시켜 활성 양이온인 ABTS⁺이 형성되면 추출물의 항산화력에 의해 ABTS⁺이 소거되어 라디칼 특유의 색인 청록색이 탈색되는데 이를 흡광도 수치로 나타내어 추출물의 항산화 활성을 평가할 수 있다.

비파잎 추출물 및 분획물의 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정한 결과, 3품종 모두 500 ug/mL 농도에서 부탄올 분획물이 가장 높은 활성(96.98~99.29%)을 나타내었고, 에틸아세테이트 분획물(71.82~91.74%), 80% 에탄올 추출물(51.97~66.87%), 물 분획물(5.69~31.51%) 순으로 나타났고, 헥산 분획물이 8.1~16.82%로 가장 낮은 활성을 보였다. 본 실험 결과와 양성 대조군으로 사용한 아스코르브산(ascorbic acid)의 활성(99.42%)을 비교하였을 때, 부탄올 분획물은 매우 높은 활성이 있는 것으로 나타났다. 품종별로 살펴보면 부방 품종이 에탄올 및 헥산 분획물에서 가장 높은 활성을 보였고, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 분획물에서는 부방과 재래종 품종이 가장 높은 활성을 보였으며 두 품종간의 유의차는 보이지 않았다. 대방 품종은 모든 분획물에서 가장 낮은 활성을 보였다.

비파잎 품종별 추출물 및 용매 분획물의 ABTS 라디칼 소거능

용매	ABTS 라디칼 소거능 (%) (500 ug/mL)1)
	대방	부방	자생종
80% 에탄올 추출물	51.97±1.542) c3 ) C4 )	66.87±1.61cA	63.57±0.39cB
n-헥산 분획물	-5)	16.82±0.44eA	8.1±0.59eB
에틸아세테이트 분획물	71.82±0.73bB	90.88±0.53bA	91.74±1.40bA
n-부탄올 분획물	96.98±1.10aB	99.29±0.09aA	99.02±0.09aA
물 분획물	5.69±1.48dB	31.51±0.46dA	30.2±1.21dA

¹⁾ 샘플 농도

²⁾ 평균±표준편차(n=3)

^{3) a~e}같은 칸에서 서로 다른 문자는 p<0.05에서 유의적인 차이가 있다.

^{4) A~C}같은 열에서 서로 다른 문자는 p<0.05에서 유의적인 차이가 있다.

⁵⁾ 데이터 없음.

실시예 5: 비파잎 품종별 추출물 및 용매 분획물의 환원력

항산화 반응과 같은 환원력은 리덕톤(reductone)이 제공하는 수소 원자가 자유 라디칼(free radical) 사슬을 분해함으로써 시작되며 흡광도 수치 자체가 시료의 환원력을 나타내고, 높은 환원력을 가지는 물질일수록 흡광도 값이 높게 나타난다. 비파잎 추출물 및 분획물을 0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 1.0 mg/mL 농도로 하여 환원력을 측정한 결과를 도 2에 나타내었다. 그 결과 3품종의 모든 용매 분획물에서 분획물의 농도가 증가함에 따라 흡광도 수치가 유의적으로 증가함을 확인할 수 있었다. 부방과 재래종 품종의 부탄올 분획물의 환원력은 1.0 mg/mL 농도일 때 1.334, 1.245로 분획물 중 가장 높은 활성을 나타내었고, 양성 대조군으로 사용한 아스코르브산(ascorbic acid)의 환원력(1.173)보다 높게 나타났다. 대방 품종 분획물의 환원력은 에틸아세테이트 분획물 > 부탄올 분획물 > 80% 에탄올 추출물 > 물 분획물 > 헥산 분획물 순으로 나타났고, 부방 품종은 부탄올 분획물 > 에틸아세테이트 분획물 > 80% 에탄올 추출물 > 물 분획물 > 헥산 분획물 순으로 나타났다. 재래종 품종은 부탄올 분획물 > 에틸아세테이트 분획물 > 물 분획물 > 80% 에탄올 추출물 > 헥산 분획물 순으로 나타나 3품종의 분획물의 환원력이 서로 다른 경향을 보였다. 품종별로 살펴보면 부방 품종이 가장 높은 환원력을 나타내었고, 재래종, 대방 순으로 나타났다(도 2).

환원력은 potassium ferricyanide reduction method를 사용한 화합물의 환원력을 평가하는 것으로서, 리덕톤(reductone)의 항산화 반응은 수소 원자를 기부함으로써 자유 라디칼(free radical) 사슬을 변환시키며, 리덕톤(reductone)은 또한 과산화의 일정한 전구물질과 반응하여 과산화의 형성을 방해한다. 플라보놀 화합물(flavonol compound)은 안정된 생성물로 그들을 전환하기 위해 자유 라디칼(free radical)과 반응하거나 전자를 줌으로써 리덕톤(reductones)과 같은 유사한 형태에서 반응하고 자유 라디칼 사슬 반응(free-radical chain reaction)을 끝낸다. 환원력에서의 흡광도 수치는 그 자체가 시료의 환원력을 나타내며, 높은 환원력을 가지는 물질은 흡광도의 수치가 높게 나타난다. 또한 항산화 활성은 환원력(reducing power)과 함께 수반된다고 보고되었으며, 일반적인 특징은 리덕톤(reductone)의 존재가 관련되어 있으며, 리덕톤(reductones) 또한 과산화물(peroxide)의 어떤 전구체로서 반응하기 때문에 과산화물(peroxide) 형성을 억제한다.

실시예 6: 비파잎 품종별 추출물 및 용매 분획물의 FRAP( Ferric - reducing antioxidant potential ) 측정

FRAP 방법은 비교적 최근 Benzie 와 Strain(1996)에 의해 개발된 총 항산화능을 측정하는 방법으로 낮은 pH에서 환원제에 의해 ferric tripyridyltriazine(Fe³⁺- TPTZ) 복합체가 ferrous tripyridyltriazine(Fe^{2 +}-TPTZ)으로 환원되는 원리를 이용한 것으로 대부분의 항산화제가 환원력을 가지고 있다는 점에 착안하여 고안된 방법이다. 비파잎 추출물 및 분획물의 FRAP 값을 측정한 결과 3품종 모두 각 분획물 중 부탄올 분획물의 FRAP 값이 1.49±0.13~1.80±0.06 mM로 가장 높았으며 에틸아세테이트 분획물 > 80% 에탄올 추출물 > 물 분획물 > 헥산 분획물 순으로 나타났다. 3품종 중 80% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물을 제외한 다른 분획물에서는 재래종 품종의 FRAP 값이 높게 나타났다.

비파잎 품종별 추출물 및 용매 분획물의 FRAP(Ferric-reducing antioxidant potential)

용매	FRAP value (mM)(100 ug/mL)1)
	대방	부방	자생종
80% 에탄올 추출물	0.78±0.042) cB3 )	0.86±0.04cA	0.78±0.03cB
n-헥산 분획물	0.55±0.04dAB	0.52±0.03dB	0.61±0.04dA
에틸아세테이트 분획물	0.97±0.07bB	1.14±0.02bA	0.93±0.04bB
n-부탄올 분획물	1.49±0.13aB	1.58±0.03aB	1.80±0.06aA
물 분획물	0.43±0.05dC	0.51±0.01dB	0.68±0.01dA

¹⁾ 샘플 농도

²⁾ 평균±표준편차(n=3)

^{3) a~d}같은 칸에서 서로 다른 문자는 p<0.05에서 유의적인 차이가 있다.

^{4) A~C}같은 열에서 서로 다른 문자는 p<0.05에서 유의적인 차이가 있다.

실시예 7: 비파잎 품종별 추출물 및 용매 분획물의 SOD 유사 활성 분석

SOD 유사 활성 반응에서 피로갈롤(pyrogallol)은 물에 존재하는 슈퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical)에 의해 자동 산화가 일어나 갈색 물질을 형성하여 이를 분광광도계로 분석하고, 슈퍼옥사이드(superoxide) 포착활성이 있는 물질이 존재시 피로갈롤(pyrogallol)의 산화 속도가 낮아지는 원리를 이용하여 슈퍼옥사이드(superoxide) 포착활성을 간접적으로 측정할 수 있다. 비파잎 추출물 및 분획물의 SOD 유사 활성을 측정한 결과, 분획물 중 부탄올 분획물이 5000 ug/mL에서 97.02~98.63%로 가장 높은 활성을 나타내었으며, 물 분획물이 6.34~46.04%로 가장 낮은 활성을 보였다. 대조군인 아스코르브산(ascorbic acid)의 활성(100%)과 비교하였을 때 상당히 높은 활성을 갖는 것으로 나타났다. 각 분획물에서 3품종 간의 유의차는 뚜렷하게 나타나지 않았으나 물 분획물에서는 유의차가 크게 나타나는 경향을 보였고 SOD 유사 활성 또한 가장 낮게 나타났다. 이는 SOD 유사 활성에 영향을 미치는 성분의 대부분이 비극성 용매에 의하여 농축된 것으로 판단된다.

산화 효소의 하나인 superoxide dismutase(SOD)는 세포에 해로운 환원산소 종을 과산화수소로 전환시키는 반응(2O₃ ^-+2H⁺→H₂O₂+O₂)을 촉매하는 효소이며, SOD에 의해 생성된 과산화수소(H₂O₂)는 퍼옥시다제(peroxidase)나 카탈라아제(catalase)에 의해 무해한 물 분자와 산소분자로 전환된다. SOD는 사람과 동물의 장기에 존재하는 생리활성 효소로 유해 산소를 제거하는 역할을 하게 된다. SOD 유사 활성 물질은 이러한 SOD는 아니지만 슈퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical)의 반응성을 억제시켜 SOD와 유사한 역할을 함으로써 생체를 보호한다고 보고되어 있다. 비파잎 분획물에서 페놀성 화합물에 의한 파이토케미칼(phytochemical) 성분들의 영향으로 SOD 유사 활성이 있음이 확인되었고 이러한 SOD 유사 활성을 갖는 물질을 섭취하는 것은 생체내의 슈퍼옥사이드(superoxide)를 제거시킴으로써 노화억제와 산화를 예방할 수 있는 방법이라 할 수 있겠다.

비파잎 품종별 추출물 및 용매 분획물의 SOD 유사 활성

용매	SOD-likely activity(%)(500 ug/mL)1)
	대방	부방	자생종
80% 에탄올 추출물	95.49±0.422) ab3 )B4)	96.32±0.55abA	96.18±0.05aAB
n-헥산 분획물	90.72±2.01cA	92.22±0.77bA	86.31±0.95bB
에틸아세테이트 분획물	93.49±1.26bcA	95.60±0.98abA	94.46±1.34aA
n-부탄올 분획물	97.58±1.71aA	98.63±0.56aA	97.02±1.59aA
물 분획물	6.34±3.14dC	17.53±5.98cB	46.04±4.06cA

¹⁾ 샘플 농도

²⁾ 평균±표준편차(n=3)

^{3) a~d}같은 칸에서 서로 다른 문자는 p<0.05에서 유의적인 차이가 있다.

^{4) A~C}같은 열에서 서로 다른 문자는 p<0.05에서 유의적인 차이가 있다.

실시예 8: 비파잎 품종별 추출물 및 용매 분획물의 아질산염 소거능(n itrate scavenging activity )

pH 조건을 1.2, 4.0, 6.0으로 달리하여 비파잎 추출물 및 분획물의 아질산염 소거능(nitrate scavenging activity)을 측정한 결과는 표 7과 같고 양성 대조군으로 아스코르브산(ascorbic acid)을 사용하였다. 활성이 가장 높은 pH 1.2 조건에서 아질산염 소거능은 3품종 모두 에틸아세테이트 분획물(54.99~60.86%)이 가장 높은 활성을 나타냈으며, 그 다음으로 부탄올 분획물이 51.92~55.0%, 80% 에탄올 추출물이 50.6%의 활성을 가졌다. 이는 양성 대조군인 아스코르브산(ascorbic acid)의 아질산염 소거능을 100%로 놓고 비교하였을 때 약 50%의 아질산염 소거능이 있는 것을 확인하였다. 품종별 아질산염 소거능을 살펴보면 각 분획물마다 부방 품종의 활성이 가장 높게 나타났고 대방과 재래종은 부방보다 낮은 활성을 보였고 두 품종간의 유의적인 차이는 거의 없는 것으로 확인되었다.

실험에 제시된 pH 범위는 인체 내 위의 pH 변화를 고려한 것이다. 이는 식품 중에 존재하는 아민류와 반응하여 발암물질인 니트로사민(nitrosamine)을 생성하는데 이 과정은 pH가 낮은 조건에서는 쉽게 일어나는 것으로 알려져 있으며, 니트로화에 영향을 주는 아질산염(nitrite)은 아질산(nitrous acid, HNO₂)를 형성하기 위해서 산성화되고 HNO₂는 H₂NO₂ ⁺으로 프로톤(proton)화되어 선택적으로 아미드(amide)와 반응하여 니트로사민(nitrosamine)을 형성한다. 이러한 산성화 과정 때문에 니트로화 반응은 주로 생체 내 위에서 발생한다. 본 연구 결과에 의하면 3품종 모두 에틸아세테이트 분획물의 아질산염 소거능이 인체의 위내 pH조건과 비슷한 pH 1.2에서 가장 우수한 것으로 측정되어 비파잎의 에틸아세테이트 분획물은 생체 내에서도 효과적인 아질산염 소거작용을 통해 니트로사민(nitrosamine) 생성을 억제할 것으로 사료된다.

비파잎 품종별 추출물 및 용매 분획물의 아질산염 소거능(Nitrate scavenging activity)

샘플	용매	아질산염 소거능 (%)(100 ug/mL)1)
		pH 1.2	pH 4.2	pH 6.0
대방	80% 에탄올	50.64±0.922) b3 )	29.83±4.90a	6.99±1.23bc
	n-헥산 분획물	42.11±1.92d	30.48±2.95a	26.34±4.14a
	에틸아세테이트 분획물	54.99±0.68a	28.66±2.53a	9.95±2.46b
	n-부탄올 분획물	51.92±2.27b	29.31±2.53b	4.30±2.03c
	물 분획물	45.61±1.04c	27.76±1.25a	7.26±2.13bc
부방	80% 에탄올	55.56±3.06b	22.42±0.00bc	5.64±1.60ab
	n-헥산 분획물	48.74±0.26c	24.66±0.45b	15.64±1.60a
	에틸아세테이트 분획물	60.86±0.51a	22.57±0.94bc	8.72±1.18ab
	n-부탄올 분획물	54.88±0.96b	19.88±1.13a	2.31±0.77ab
	물 분획물	49.99±1.15c	19.73±5.28a	8.20±0.44b
자생종	80% 에탄올	53.05±0.46cd	25.63±3.03bc	11.92±2.89c
	n-헥산 분획물	43.94±1.99e	28.57±1.51b	24.50±2.89b
	에틸아세테이트 분획물	56.41±2.03b	25.49±1.35bc	8.39±4.41c
	n-부탄올 분획물	55.00±0.41bc	22.83±1.35cd	9.27±0.00c
	물 분획물	49.34±1.61c	21.85±1.92d	-4)

¹⁾ 샘플 농도

²⁾ 평균±표준편차(n=3)

^{3) a~e}같은 칸에서 서로 다른 문자는 p<0.05에서 유의적인 차이가 있다.

⁴⁾ 데이터 없음.

실시예 9: 비파잎 품종별 추출물 및 용매 분획물의 항균활성

비파잎 추출물 및 분획물을 10 mg/mL의 농도로 하여 항균활성을 측정한 결과, 대방과 부방 품종의 경우 그람양성균인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)와 그람음성균인 대장균(Escherichia coli ) 에서 클리어 존(clear zone)이 관찰되었다. 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에서는 80% 에탄올 추출물(10 mm), 에틸아세테이트 분획물(9 mm), 부탄올 분획물(10 mm)이 생육억제 효과를 나타내었고, 대장균(Escherichia coli)에서는 80% 에탄올 추출물(12 mm), 에틸아세테이트 분획물(10 mm), 부탄올 분획물(14 mm), 물 분획물(10 mm)이 생육억제 효과를 보였다.

또한 부방 품종은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에서 대방 품종과 비슷한 경향을 보였으나 대장균(Escherichia coli)에서는 부탄올 분획물의 클리어 존(clear zone)이 12 mm로 나타났고 다른 분획물의 클리어 존(clear zone)은 확인되지 않았다.

한편, 재래종은 대방 및 부방 품종과는 다르게 대장균(Escherichia coli)에서 헥산 분획물을 제외한 모든 분획물에서 클리어 존(clear zone)이 나타났고 그 직경도 다른 품종보다 크게 확인되었다. 그 중 부탄올 분획물이 19.5 mm로 가장 높게 나타났고, 80% 에탄올 추출물(12.5 mm) > 에틸아세테이트 분획물(12 mm) > 물 분획물(11.5 mm) 순으로 나타났다. 또한, 재래종은 대방과 부방에서 활성이 없었던 Staphylococcus aureus 균주에서 에틸아세테이트 분획물이 10 mm로 클리어 존(clear zone)이 확인되었다..

따라서 비파잎 추출물 및 분획물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)와 대장균(Escherichia coli)에 항균활성을 보이며, 3품종 중 재래종의 부탄올 분획물이 가장 강한 항균활성이 있음을 확인하였다.

비파잎 품종별 추출물 및 용매 분획물의 항균활성

품종	용매	clear zone(mm)(10mg/disk)
		그람 양성			그람 음성
		S.aureus	B.cereus	B.subtilis	E.coli	P.aeruginosa	S.enterica
대방	80% 에탄올 추출물	-1)	11	-	12	-	-
	n-헥산 분획물	-	-	-	-	-	-
	에틸아세테이트 분획물	-	9	-	10	-	-
	n-부탄올 분획물	-	10	-	14	-	-
	물 분획물	-	-	-	10	-	-
부방	80% 에탄올	-1)	10	-	-	-	-
	n-헥산 분획물	-	-	-	-	-	-
	에틸아세테이트 분획물	-	9	-	-	-	-
	n-부탄올 분획물	-	11		12	-	-
	물 분획물	-	-	-	-	-	-
자생종	80% 에탄올	-1)	10.5	-	12.5	-	-
	n-헥산 분획물	-	-	-	-	-	-
	에틸아세테이트 분획물	10	9	-	12	-	-
	n=부탄올 분획물	-	11	-	19	-	-
	물 분획물	-	-	-	11.5	-	-

¹⁾ 데이터 없음.

실시예 10: 비파잎 품종별 추출물 및 용매 분획물의 산화질소( nitric oxide , NO) 생성 저해활성

산화질소는 혈액응고 및 혈압조절 기능, 암세포에 대한 면역기능 등이 있지만, 과량이 존재하면 인체에 유해한 영향을 미치게 되어 세포손상뿐만 아니라 염증 반응 및 퇴행성 질환에 중요한 요인으로 작용한다. 또한 슈퍼옥사이드(superoxide) 음이온(O₂ ^-)과 쉽게 반응하여 매우 반응성이 높고 독성이 강한 산화제인 과산화질소(peroxynitrite, ONOO^-)를 생성한다. 과산화질소(peroxynitrite)는 단백질 및 지질의 과산화를 유도하고 세포독성을 일으키는 것으로 알려져 있고 반응 속도는 과산화수소(H₂O₂)의 수천 배에 이르며 신경세포에서 짧은 시간 동안 급속한 손상을 유발하는 것으로 보고되고 있다.

RAW 264.7 세포에서 리포폴리사카라이드(LPS)로 유도된 NO 생성에 대한 품종별 비파잎 추출물 및 분획물의 저해효과는 도 3과 같다. LPS와 비파잎 추출물을 18시간 동안 동시 처리했을 때 배양액에서의 LPS가 NO 생성을 억제하는 것으로 나타났다. 특히, 대방 품종의 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물, 부방 품종의 헥산과 에틸아세테이트 분획물, 그리고 재래종 품종의 에틸아세테이트 분획물에서는 NO 생성이 농도 의존적으로 감소하였다. 3품종 모두 에틸아세테이트 분획물의 NO 저해 활성이 높게 나타났는데 이 중에서 NO 저해율이 50 ug/mL에서 대방 73%, 부방 77%, 재래종 67%로 부방의 에틸아세테이트가 높은 저해활성을 나타내었다. 반면, 3품종의 물 분획물은 NO 생성 저해 활성이 현저히 낮게 나타났다(도 3).

실시예 11: 비파잎 품종별 추출물 및 용매 분획물의 항바이러스 효과 측정

화학 합성물인 경우 상당히 협소한 작용 범위로 인한 제한된 치료 효과 및 다양한 독성을 가지고 있는 것이 사실이다. Herbal extract의 경우 화학적으로 합성된 의약품에 비해 부작용이 적다는 장점이 있기 때문에 세균, 진균, 바이러스의 방어나 치료제로 널리 사용되고 있다. 그래서 현재까지 herbal extract에 의한 항균(antibacterial)과 항바이러스 효과(antiviral effect)에 관한 연구들이 많이 행해지고 있다. 품종별 비파 용매추출물이 RNA, DNA 헥산을 가지는 각 4가지의 바이러스(virus)를 in vitro system에서 억제할 수 있는지를 알아보았다. 이 실험에서 사용된 바이러스는 Influenza virus A(PR8 strain), PEDV(KPED-9 strain), BRV(p44 strain), PRV(YS 400 strain)이다. Influenza virus A는 Orthomyxoviridae에 속하며 6개의 분절 형태의 단가닥 negative strand RNA를 가지고 있으며, 사람 및 포유류에서 호흡기에 증상을 일으킨다. PEDV는 Coronaviridae에 속하는 단가닥 positive strand RNA를 가지고 있으며 돼지에서 장관계 질병을 야기한다. BRV는 Reoviridae에 속하며, 양가닥의 positive strand RNA 가지고 있으며, 송아지에 감염하여 송아지 설사증을 일으킨다. PRV는 Herpesviridae에 속하며, 약 200 kb의 긴 DNA을 가지고 있는 바이러스로 주로 돼지에 감염하여 유산, 사산 및 생식 문제를 일으키고 있다. 이들 바이러스는 각각 다양한 헥산 양상을 띄고 있으며, 각자의 바이러스가 속하는 과마다 사람에서 감염하여 유사 질병을 일으키는 바이러스가 존재하고 있다.

각 추출물은 수용성인 것은 PBS에 녹였고 수용성이 아닌 것들은 메탄올(methanol)에 녹였기 때문에 세포에 독성을 나타낼 수 있다. 따라서 세포 독성을 나타내지 않은 최고의 농도를 선택하고자 세포 독성 실험을 수행하였다. 수행 결과 150 ug/ml의 농도를 선택하였다. 그리고 각각 비파 추출물 및 분획물의 농도를 150 ug/ml로 희석하여 각각의 바이러스와 반응을 시키고, 세포에 처리하고 바이러스의 전염성을 측정한 결과는 표 9에 나타내었다. 대부분의 추출물 및 분획물은 항바이러스 효과(antiviral effect)를 나타내었지만, 그 효과는 바이러스마다 다른 양상을 나타내고 있다. Influenza virus A 경우, 대방 헥산 분획물, 부방 헥산 분획물, 재래종 에탄올 추출물, 대재종 헥산 분획물이 100배 이상의 바이러스 억제 효과를 나타냈으며, PEDV의 경우, 우르솔산(ursolic acid), 대방 물 분획물, 부방 물 분획물, 재래종 에틸아세테이트 분획물, 재배종 부탄올 분획물 , 재래종 물 분획물을 제외한 분획물에서 100배 이상의 바이러스 억제 효과를 보여 가장 민감한 바이러스라고 생각된다. BRV의 경우, 재래종 에탄올 추출물, 재래종 헥산 분획물, 재래종 부탄올 분획물, 재래종 물 분획물에서 100배 이상의 바이러스 억제 효과를 나타냈으며, DNA 바이러스인 PRV에서는 대방 에탄올 추출물, 대방 에틸아세트 분획물, 부방 에탄올 추출물, 부방 에틸아세테이트 분획물, 부방 부탄올 분획물, 재래종 에탄올 추출물, 재래종 물 분획물에서 100배 이상의 바이러스 억제 효과를 나타내었다.

비파잎 품종별 추출물 및 용매 분획물의 항바이러스 효과 측정

샘플	Log TCID50
	Influenza virus A	PED	BRV	PRV
우르솔산(ursolic acid)	3.5	1.5	2.5	3.66
대방 에탄올 추출물	2.67	0	2.5	1.66
대방 헥산 분획물	0	0	2.5	3.66
대방 에틸아세테이트 분획물	2.5	0	2.5	2.3
대방 부탄올 분획물	3.5	0	2.66	3.66
대방 물 분획물	3	1.5	2.66	4.3
부방 에탄올 추출물	2.5	0	2.5	0.66
부방 헥산 분획물	0	0	2.5	2.5
부방 에틸아세테이트 분획물	2.5	0	2.5	0
부방 부탄올 분획물	3.5	0	4.3	0
부방 물 분획물	2.5	2.28	2.5	4.3
자생종 에탄올 추출물	1.5	0	2.3	1.3
자생종 헥산 분획물	0	0	2.5	2.5
자생종 에틸아세테이트 분획물	3	1.66	1.5	3.5
자생종 부탄올 분획물	2.5	1.5	2	2.5
자생종 물 분획물	3	2	2	0
배지(media)	3.5	2.66	4.3	4.3

Claims (11)

1. 비파 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 PEDV(Porcine epidemic diarrhoea coronavirus)에 대한 항바이러스용 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 비파 추출물은 비파 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 비파 에탄올 추출물은
   (a) 건조된 비파잎 80~120 중량부에 70~90%(v/v) 에탄올을 800~1200 중량부 가하여 10~30분간 초음파 분해한 후, 100~200 rpm 및 20~30℃에서 10~14시간 동안 진탕 추출하는 단계; 및
   (b) 상기 추출된 추출액을 여과한 후 30~50℃에서 농축하는 단계에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 분획물은 n-헥산(n-hexane), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 n-부탄올(n-butanol)을 순차적으로 가하여 얻어진 n-헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물, n-부탄올 분획물 또는 물 분획물인 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제

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