KR20150114122A - 유방암 재발 또는 전이 억제용 제제의 스크리닝 방법 - Google Patents

유방암 재발 또는 전이 억제용 제제의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Wnt 신호전달 억제제의 처리에 의하여 발현수준이 변화되는 유방암 줄기세포 마커 유전자의 발현수준 변화를 이용하여 유방암 전이 또는 재발 억제용 제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하면, 신속하고 용이하면서도 우수한 정확성을 갖고 유방암의 재발 또는 전이를 예방 또는 치료할 수 있는 제제를 스크리닝할 수 있으므로, 유방암의 효과적인 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

유방암 재발 또는 전이 억제용 제제의 스크리닝 방법{Mehtod for screening agent having inhibitory activity against recurrence or metastasis of breast cancer}
본 발명은 유방암 재발 또는 전이 억제용 제제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 유방암 줄기세포 특이적으로 발현하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 감소시키는 피검 화합물을 유방암 재발 또는 전이 억제제로 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.
현재, 한국의 여성들은 고칼로리 영양식, 저출산, 초산 연령, 모유 수유 기피 등으로 인해 유방암 재발률이 높아지고 있다. 우리나라 유방암 재발률은 40대에 40%로 최고에 달하며, 이후 50대, 30대, 60대, 70대, 20대 순으로 연령에 관계없이 발생한다. 하지만, 개선된 검출방법, 집단 스크리닝(mass screening) 및 과거 십 년간에 걸친 치료방법의 발달로 유방암으로 진단된 여성의 생존률이 현저하게 증가하고 있다. 오늘날, 유방암 환자들 중 약 80%는 생존율이 가장 높은 질병의 초기 단계에 진단되고 있으며, 그 결과 유방암 환자의 약 85%는 진단 후 적어도 5년 이상 생존하는 것으로 나타났다.
이러한 진단기술의 발전에도 불구하고, 초기 단계에서 유방암으로 진단된 여성의 약 20%는 10년 후 예후가 나빠, 재발, 전이되거나 또는 이 기간 내에 사망하기도 한다. 그러나, 나머지 80%의 유방암 환자는 10년 후 예후가 우수하여, 추가적인 적극적 보조요법(예, 화학치료)을 요구하지 않는다. 즉, 초기 단계의 임파선-음성(node-negative) 유방암 환자들 중 적어도 일부는 보조적인 화학치료를 받아야 하지만, 환자에 대한 보다 적합한 치료를 위해서는 이들을 위험군별로 분류하여 치료하는 것이 요구된다.
실제로 초기 단계의 암환자 대다수는 수술 및/또는 방사선 치료 이후에 추가적인 치료가 없이도 장기간 생존하므로, 이러한 환자들 모두에게 적극적 보조요법을 추천하는 것은, 암의 화학치료와 관련된 상당한 부작용을 고려할 때 부적절한 것임에 틀림없다. 또한, 초기 단계의 유방암 환자 집단을 초기 진단으로 예후가 양호한 그룹과 양호하지 않은 그룹으로 구분하는 것은 임상학자들이 적합한 치료방법을 선정하는데 유용할 것이다. 따라서, 유방암 환자의 예후를 평가하는 방법의 개발이 절실히 필요한 실정이다.
현재까지 상당수 연구는 유방암 예후를 분석하고 치료반응을 예측하기 위한 방법 및 인자의 동정에 집중되어 있다. 예후 표시자(indicator)는 종양 크기, 림프절 상태 및 조직학적 등급뿐만 아니라 예후에 대한 일부 정보를 제공하며 특정 치료제에 반응할 것 같은 분자 마커와 같은, 통상적인 많은 인자를 포함한다. 예컨대, 에스트로겐(ER) 및 프로게스테론(PR)의 스테로이드 호르몬 수용체 상태 측정법은 유방암 환자를 평가하기 위하여 통상적으로 수행되고 있다. 호르몬 수용체 양성인 종양은 호르몬 요법에 반응할 것임이 틀림없으며, 또한 전형적으로 보다 덜 적극적으로 증식하므로, ER+/PR+ 종양이 있는 환자의 예후는 보다 양호한 편이다.
또한, 인간 상피세포 성장인자 수용체 2(HER-2/neu)의 과다 발현은 양호하지 않은 유방암 예후와 관련성이 있다고 알려져 있다. 현재, 유방 종양에서의 Her2/neu 발현수준을 이용하여 항-Her-2/neu 항체 치료제인 트라스투주맙(trastuzumab)(Herceptin; Genentech)에 대한 반응을 예측하는 방법이 개발되어 있다. 또한, 유방암의 약 1/3은 종양 억제유전자 p53에 돌연변이가 있으며, 이러한 돌연변이는 질병의 공격성 증가 및 양호하지 않은 예후와 연관되어 있다고 알려져 있다. 또한, 비-히스톤성 핵 단백질로 세포 증식 마커인 Ki-67의 과다 발현은 유방암의 양호하지 않은 예후와 상관성이 있음이 입증되었다.
상기와 같은 예후 기준 및 분자 마커는 환자의 운명을 예측하고 적절한 치료방법을 선정하는데 일부 지침을 제공하지만, 유방암의 재발 및 예후를 평가하는 특이적이며 민감한 방법으로서는 부족하여 새로운 방법의 개발이 매우 필요한 실정이다. 이러한 방법은 예후가 양호한 유방암 환자와 예후가 양호하지 않은 유방암 환자를 특이적으로 식별할 수 있어야 하며, 고위험도 유방암 환자를 식별할 수 있어야 한다.
한편, 이러한 단점을 극복하는 방안으로서 유방암으로부터 유래된 암줄기세포를 활용하여 유방암의 재발 및 예후를 평가하는 기술을 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 암줄기세포란, 암세포 내에 암을 촉발시키는 시원세포를 의미하는데, 암세포와는 별도로 존재하고, 정상 줄기세포의 특성을 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 유방암의 치료후에도 환자의 체내에 유방암을 유발시킨 원인이 되는 암줄기세포가 존재한다면, 상기 암줄기세포에 의하여 유방암이 재발되거나 전이되는 등의 나쁜 예후를 나타낼 수 있기 때문에, 이러한 유방암 유래 암줄기세포의 존재 여부를 검출함으로써, 유방암의 재발 및 예후를 평가할 수 있을 것으로 예상되고 있다. 그러나, 아직까지는 이러한 유방암 유래 암줄기세포를 검출하는 방법이 개발되어 있지 않아, 유방암 유래 암줄기세포를 이용하는 방법이 활용되지 못하고 있는 실정이다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 유방암 유래 암줄기세포를 활용하는 방안을 개발하기 위하여, 예의 연구노력한 결과, Wnt 신호전달 억제제의 처리에 의하여 발현수준이 변화되는 유방암 유래 암줄기세포에서 특이적으로 발현되는 마커 유전자를 확인하고, 상기 마커 유전자의 발현수준의 변화를 측정함으로써 유방암 전이 또는 재발 억제용 제제를 스크리닝할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 유방암 유래 암 줄기세포의 마커 유전자의 발현수준 변화를 이용하여 암 전이 또는 재발 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 유방암 유래 암줄기세포를 검출함으로써 유방암의 재발 및 예후를 평가하는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던중, 암줄기세포에서 특이적으로 발현되는 유전자에 주목하게 되었다. 즉, 암세포를 줄기세포 배양방법으로 배양할 경우, 일반적인 부착배양시 보다도 현저하게 발현수준이 증가하는 암줄기세포에서 특이적으로 발현되는 유전자를 발굴할 수 있었는데, 이는 Wnt 신호전달 경로에 관여하는 유전자임을 확인하였다. 이에, 암줄기세포에서 상기 Wnt 신호전달 경로를 억제할 경우, 암줄기세포에서 필수적으로 발현되는 마커 유전자의 발현수준이 유의하게 감소할 것으로 예상하고, 이를 확인하였다. 그 결과, 암줄기세포에서 상기 Wnt 신호전달 경로를 억제할 경우, IGF1(Insulin-like growth factor 1), Id2(Inhibitor of DNA binding 2), MMp2(matrix metalloproteinase-2), MMp9(matrix metalloproteinase-9) 및 Wnt5a(Wingless-type MMTV integration site family, member 5A) 유전자의 발현수준이 유의하게 감소하였고, 상기 5종의 유전자는 유방암세포에서는 발현되지 않고, 유방암 유래 암줄기세포에서만 발현됨을 알 수 있었다.
상기 발현수준이 감소된 유전자는 유방암세포에서는 발현되지 않고, 유방암 유래 암줄기세포에서만 특이적으로 발현되므로, 상기 5종의 유전자는 유방암 유래 암줄기세포에 의하여 유방암이 재발 또는 전이되는 것을 억제할 수 있는 억제제의 스크리닝에 활용할 수 있을 것으로 분석되었다.
상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 유방암 유래 암줄기세포에 의한 유방암의 재발 또는 전이를 예방 또는 치료할 수 있을 것으로 예상되는 피검 화합물을 유방암 유래 암줄기세포에 처리하고, 상기 투여된 암줄기세포에서 IGF1, Id2, MMp2, MMp9, Wnt5a 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 유방암의 재발 또는 전이 억제용 제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 유방암 재발 또는 전이에 대한 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법은 (a) 유방암 유래 암줄기세포에 유방암의 재발 또는 전이를 예방 또는 치료할 수 있을 것으로 예상되는 피검 화합물을 처리하는 피검 화합물 처리단계; (b) 상기 피검 화합물을 처리한 세포 내 IGF1(Insulin-like growth factor 1), Id2(Inhibitor of DNA binding 2), MMp2(matrix metalloproteinase-2), MMp9(matrix metalloproteinase-9) 및 Wnt5a(Wingless-type MMTV integration site family, member 5A)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 피검 화합물을 처리하지 않은 음성 대조군과 비교하여 상기 유전자의 mRNA 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 감소시킨 피검 화합물을 선별하는 단계를 포함한다.
이때, 상기 각 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준은 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 이용하거나 또는 상기 제제를 포함하는 조성물 또는 키트를 이용하여 측정할 수 있고, 대조군에서 측정된 수준에 비하여 실험군에서 측정된 수준이 유의하게 감소하는 경우, 상기 피검 화합물을 유방암의 재발 또는 전이를 예방 또는 치료할 수 있는 제제로서 사용할 수 있는 것으로 판정할 수 있다.
본 발명의 용어 "유방암 세포"란, 유방암 환자의 암조직으로부터 유래된 세포를 의미하는데, 통상적으로 불멸화되어 계대배양을 통해 무한증식이 가능한 유방암 세포주와 동일한 의미로 사용될 수도 있다. 상기 유방암 세포로는 헬라세포(HeLa cell) 등이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "암줄기세포(cancer stem cell)"란, 면역억제 쥐에 주입하였을 때 고효율적으로 종양을 생성할 수 있고, 상기 형성된 종양에서는 원발 종양이 가지고 있던 고유의 이질성(heterogeneity)이 명확히 나타나며, 무제한 재생능력을 지닌 암세포의 일종을 의미한다.
본 발명의 용어 "일반 세포 배양방법"이란, 줄기세포와는 다른 특성을 나타내는 일반세포를 배양하는 방법을 의미하는데, 통상적으로 배양용기의 바닥에 부착시켜서 단일층을 형성하도록 배양하는 방법이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "줄기세포 배양방법"이란, 일반 세포와는 다른 특성을 나타내는 줄기세포를 배양하는 방법을 의미하는데, 통상적으로 배양용기의 바닥에 부착시키지 않고 부유시키며 배양하는 방법이 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는 4T1 마우스 유방암세포주를 EGF, bFGF, 헤파린 및 B27이 포함된 DMEM 배지에 접종하고, 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 7일 동안 부유배양시켜서, 구상체(sphere) 형태의 암줄기세포를 수득하였다.
본 발명의 용어 "IGF1 유전자"란, Insulin-like growth factor 1를 코딩하는 유전자를 의미하는데, 상기 단백질은 성장호르몬의 수용체 역할을 수행하여 성장호르몬에 의한 신체의 성장반응을 매개하는 역할을 수행한다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_000618).
본 발명의 용어 "Id2 유전자"란, DNA-binding protein inhibitor 2를 코딩하는 유전자를 의미하는데, 상기 단백질은 helix-loop-helix (HLH) domain을 포함하는 전사조절제로 사용된다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_002166).
본 발명의 용어 "MMp2 유전자"란, matrix metalloproteinase-2를 코딩하는 유전자를 의미하는데, 상기 단백질은 배아의 발달, 혈관신생, 골형성 등의 세포생리학적 작용에서 세포외 간질을 분해하는 역할을 수행한다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_001127891).
본 발명의 용어 "MMp9 유전자"란, Matrix metalloproteinase 9 를 코딩하는 유전자를 의미하는데, 상기 단백질은 배아의 발달, 혈관신생, 골형성 등의 세포생리학적 작용에서 세포외 간질을 분해하는 역할을 수행한다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_004994).
본 발명의 용어 "Wnt5a 유전자"란, Wnt-5a를 코딩하는 유전자를 의미하는데, 상기 단백질은 Wnt 신호전달에 관여한다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_001256105).
본 발명의 용어 "유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 표적 유전자의 발현여부를 확인하기 위하여, 상기 표적 유전자로부터 전사된 mRNA의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 바람직하게는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), DNA 칩 분석법 등의 방법에 사용되는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 또는 프라이머가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 IGF1, Id2, MMp2, MMp9 또는 Wnt5a 유전자의 증폭에 사용될 수 있는 프라이머가 될 수 있고, 상기 IGF1, Id2, MMp2, MMp9 또는 Wnt5a 유전자와 상보적으로 결합하여 PCR 방법으로 증폭시킬 수 있는 한, 상기 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로브는 IGF1, Id2, MMp2, MMp9 또는 Wnt5a 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 될 수 있고, 상기 IGF1, Id2, MMp2, MMp9 또는 Wnt5a 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 한, 상기 프로브의 뉴클레오티드 서열은 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "단백질의 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 표적 단백질의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 바람직하게는 웨스턴 블럿(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩 분석법(protein chip assay) 등의 방법에 사용되는 항체가 될 수 있다.
본 발명의 용어 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 IGF1, Id2, MMp2, MMp9 또는 Wnt5a 유전자로부터 발현된 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 될 수 있고, 바람직하게는 상기 각 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 그의 일부가 될 수 있다.
한편, 본 발명의 방법을 수행함에 있어서, 사용될 수 있는 상기 각 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 키트는 상기 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 항체 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수도 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명의 IGF1, Id2, MMp2, MMp9 또는 Wnt5a 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
다른 일례로서, 본 발명의 키트는 DNA 칩 분석법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 분석용 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
또 다른 일례로서, 본 발명의 키트는 IGF1, Id2, MMp2, MMp9 또는 Wnt5a 유전자로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하기 위한 단백질 칩 분석용 키트가 될 수 있는데, 상기 키트는 특별히 이에 제한되지 않으나, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기 기재는 특별히 이에 제한되지 않으나 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있으며, 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나 FITC, RITC 등이 될 수 있고, 발색 기질액은 특별히 이에 제한되지 않으나 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 마우스유래 유방암세포주를 대상으로 일반 세포 배양방법과 줄기세포 배양방법으로 각각의 배양물을 수득하고, 상기 각 배양물로부터 발현되는 유전자의 발현수준을 비교하여 Wnt 신호전달 관련 유전자가 줄기세포 배양방법에 의하여 배양된 배양물에서 발현수준이 유의하게 증가함을 확인하고(실시예 1), 상기 Wnt 신호전달을 억제할 경우 암줄기세포에서 발현이 감소되는 유전자를 선별한 결과, IGF1, Id2, MMp2, MMp9 또는 Wnt5a 유전자가 선별되었고, 상기 선별된 유전자는 유방암세포에서는 발현되지 않고, 유방암 유래 암줄기세포에서만 특이적으로 발현되며, 암줄기세포에서 Wnt 신호전달을 억제할 경우 그의 발현수준이 감소됨을 확인하였으므로(도 1 및 2), 상기 5종의 유전자는 암줄기세포에 대한 마커 유전자로 활용될 수 있음을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명의 IGF1, Id2, MMp2, MMp9 또는 Wnt5a 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 이용하면 유방암 유래 암줄기세포에 의하여 유방암이 재발 또는 전이되는 것을 억제할 수 있는 억제제의 스크리닝에 활용할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 방법을 이용하면, 신속하고 용이하면서도 우수한 정확성을 갖고 유방암의 재발 또는 전이를 예방 또는 치료할 수 있는 제제를 스크리닝할 수 있으므로, 유방암의 효과적인 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 일반 세포배양된 배양세포에 비하여, 줄기세포 배양방법으로 배양된 4T1 마우스 유방암세포주에서 발현양상이 변화된 유전자를 Ingenuity Pathways Analysis(IPA)로 분석한 결과를 나타내는 Heatmap이다.
도 2는 Wnt 신호전달 억제제의 처리에 의하여 유방암 유래 암줄기세포에서 발현이 감소하는 유전자를 분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 마우스유래 유방암 세포주인 4T1과 사람유래 유방암 세포주인 MCF7을 Wnt 신호전달 억제제(CWP232228, 중외제약)를 처리하거나 처리하지 않은 조건에서 부착배양 및 부유배양하여 수득한 배양물을 IGF1 유전자를 대상으로 면역형광염색한 결과를 나타내는 사진이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 유방암 유래 암줄기세포 특이적인 신호전달 유전자의 발굴
실시예 1-1: 유방암 세포 배양
먼저, 4T1 마우스 유방암세포주에 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM(Invitrogen) 배지를 가하고, 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 3일 동안 부착배양하여 배양물을 수득하였다.
다음으로, 4T1 마우스 유방암세포주에 20ng/㎖ EGF, 20ng/㎖ bFGF, 4㎍/㎖ 헤파린, B27이 포함된 DMEM 배지를 가하고, 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 7일 동안 부유배양하여 구상체(sphere) 형태의 배양물을 수득하였다.
실시예 1-2: 유방암 유래 암줄기세포 특이적인 신호전달 유전자의 발굴
상기 실시예 1-1에서 배양한 각각의 배양물을 RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen Inc, Valencia, CA)에 적용하여 각 배양물로부터 총 RNA를 추출하였다. 상기 추출된 각각의 총 RNA를 random hexamer와 ReverAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo scientific)에 적용하여 각각의 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 cDNA를 이용하여, 줄기세포와 관련된 84개의 key gene들의 primer가 내재된 Stem cell PCR array(SABioscience (www.sabiosciences.com), cat no: PAMM-405)를 사용하여 RTQ-PCR(ABI 7300)을 수행하였다.
또한, 상기 RTQ-PCR을 통해 얻어진 데이터를 Ingenuity system 프로그램(www.ingenuity.com)에 적용하여, Ingenuity Pathways Analysis(IPA)를 수행함으로써, 줄기세포 배양된 4T1 마우스 유방암세포주에서만 특이적으로 증가하는 신호전달 경로를 분석하였다(도 1). 상기 도 1에서 보듯이, 줄기세포 배양방법으로 배양된 암줄기세포에서는 Wnt 신호전달에 관여하는 유전자의 발현수준이 유의적으로 증가함을 확인하였다.
실시예 2: Wnt 신호전달 억제제의 처리에 따른 유방암 유래 암줄기세포 마커 유전자의 발굴
상기 실시예 1의 결과에서 보듯이 암줄기세포에서는 Wnt 신호전달에 관여하는 유전자의 발현수준이 유의적으로 증가함을 확인하였으므로, 상기 Wnt 신호전달을 억제할 경우, 발현수준이 감소되는 유전자가 암줄기세포에서 중요한 역할을 수행하는 마커 유전자로서 사용할 수 있을 것으로 예상하였으므로, 상기 유전자를 발굴하고자 하였다.
먼저, Wnt 신호전달 억제제(CWP232228, 중외제약)를 처리하거나 또는 처리하지 않은 조건하에서, 실시예 1-1의 부유배양 방법으로 8일 동안 4T1 마우스 유방암세포주를 배양하였다. 이때, Wnt 신호전달 억제제는 1μM의 농도로 2일에 한번씩 총 4회 처리하였다.
다음으로, 상기 배양된 배양물을 RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen Inc, Valencia, CA)에 적용하여 각 배양물로부터 총 RNA를 추출하였다. 상기 추출된 각각의 총 RNA를 random hexamer와 ReverAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo scientific)에 적용하여 각각의 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 cDNA를 이용하여, 줄기세포와 관련된 84개의 key gene들의 primer가 내재된 Stem cell PCR array(SABioscience (www.sabiosciences.com), cat no: PAMM-405)를 사용하여 RTQ-PCR(ABI 7300)을 수행하였다. 상기 RTQ-PCR을 통해 얻어진 데이터를 분석하여 각 배양된 세포간의 2-deltadelta ct값을 기준으로, 차이가 2-fold 이상의 값이며, P value < 0.05인 유전자를 선별하였다. 그 결과, IGF1, Id2, MMp2, MMp9 및 Wnt5a가 Wnt 저해제를 처리함에 따라 유의적으로 변화하는 유전자임을 확인하였다.
끝으로, 상기 선별된 유전자가 Wnt 저해제를 처리함에 따라 유의적으로 변화하는지 여부를 확인하기 위하여, 하기의 프라이머를 사용한 RTQ-PCR(ABI 7300) 방법으로 검증하였다(도 2).
ID2 F: 5'-TCT GGG GGA TGC TGG GCA CC-3'(서열번호 1)
ID2 R: 5'-GCT TGG GCA TCT CCC GGA GC-3'(서열번호 2)
MMP2 F: 5'-TTT CTA TGG CTG CCC CAA GG-3'(서열번호 3)
MMP2 R: 5'-GTC AAG GTC ACC TGT CTG GG-3'(서열번호 4)
MMp9 F: 5'-TGA GTC CGG CAG ACA ATC CT-3'(서열번호 5)
MMp9 R: 5'-CCA GTA CCA ACC GTC CTT GAA-3'(서열번호 6)
WNT5A F: 5'-ACT ATG GCT ACC GCT TCG C-3'(서열번호 7)
WNT5A R: 5'-GCG CTC TCA TAG GAA CCC TT-3'(서열번호 8)
IGF1 F: 5'-GTG GAT GAG TGT TGC TTC CG-3'(서열번호 9)
IGF1 R: 5'-TTT GTA GGC TTC AGT GGG GC-3'(서열번호 10)
도 2에서 보듯이, IGF1, Id2, MMp2, MMp9 및 Wnt5a 유전자가 Wnt 저해제를 처리함에 따라 유의적으로 발현수준이 감소하는 유전자임을 확인하였다.
실시예 3: 세포수준에서 마커 유전자의 발현수준 감소 검증
상기 실시예 2에서 발굴된 5종의 유전자가 Wnt 저해제를 처리함에 따라 유의적으로 발현수준이 감소하는지의 여부를 세포수준에서 확인하고자 하였다.
상기 발굴된 5종의 유전자 중의 하나인 IGF1 유전자의 발현수준을 세포내에서 확인하기 위하여, 마우스유래 유방암 세포주인 4T1과 사람유래 유방암 세포주인 MCF7을 Wnt 신호전달 억제제(CWP232228, 중외제약)를 처리하거나 처리하지 않은 조건에서 실시예 1의 방법으로 부착배양 및 부유배양하여 각각의 배양물을 수득하였다. 상기 수득한 각 배양물에 항-IGF1 마우스 항체(Milipore, cat.#05-172)를 가하여 1차 반응을 수행하고, 다시 FITC(fluorescein isothiocyanate)가 결합된 항-마우스 IgG 항체(Invitrogen cat.A11001)를 가하여 2차 반응을 수행함으로써, IGF1 유전자에 대한 형광면역염색을 수행하였으며, 이를 형광현미경(Zeiss LSM 510)하에서 관찰하여, IGF1의 발현수준을 측정하였다(도 3).
도 3에서 보듯이, 두 종류의 유방암 세포주에서는 모두 부착배양시에는 Wnt 신호전달 억제제의 처리여부에 상관없이 IGF1 유전자가 발현되지 않았으나, 부유배양시에는 IGF1 유전자의 발현이 확인되었으므로, 상기 IGF1 유전자는 유방암 유래 암줄기세포에 특이적인 마커 유전자로서 사용할 수 있음을 알 수 있었다. 또한, 부유배양된 유방암 유래 암줄기세포에 Wnt 저해제를 처리한 경우에는 두 종류의 유방암 세포주로부터 수득한 두 종류의 암줄기세포에서 모두 상기 유전자의 발현수준이 감소되었고, 사람의 유방암세포주 유래 암줄기세포 보다는 마우스의 유방암세포주 유래 암줄기세포에서 IGF1 유전자의 발현억제수준이 현저히 높은 수준을 나타내었다.
상기 결과에서 보듯이, 본 발명에서 제공하는 5종의 유전자는 유방암 세포에서는 발현되지 않고, 유방암 유래 암줄기세포에서만 특이적으로 발현되는 마커 유전자이므로, 상기 유전자의 발현 또는 활성 수준을 감소시키는 피검 화합물을 유방암의 전이 및/또는 재발 억제제로 스크리닝 하는데 유용하게 활용할 수 있다.
<110> Gachon University of Industry-Academic cooperation Foundation GIL MEDICAL CENTER JW PHARMACEUTICAL CORPORATION <120> Mehtod for screening agent having inhibitory activity against recurrence or metastasis of breast cancer <130> PA130976/KR <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ID2 F <400> 1 tctgggggat gctgggcacc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ID2 R <400> 2 gcttgggcat ctcccggagc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MMP2 F <400> 3 tttctatggc tgccccaagg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MMP2 R <400> 4 gtcaaggtca cctgtctggg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MMp9 F <400> 5 tgagtccggc agacaatcct 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MMp9 R <400> 6 ccagtaccaa ccgtccttga a 21 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer WNT5A F <400> 7 actatggcta ccgcttcgc 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer WNT5A R <400> 8 gcgctctcat aggaaccctt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GF1 F <400> 9 gtggatgagt gttgcttccg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GF1 R <400> 10 tttgtaggct tcagtggggc 20

Claims (2)

  1. (a) 유방암 유래 암줄기세포에 유방암의 재발 또는 전이를 예방 또는 치료할 수 있을 것으로 예상되는 피검 화합물을 처리하는 피검 화합물 처리단계;
    (b) 상기 피검 화합물을 처리한 세포 내 IGF1(Insulin-like growth factor 1), Id2(Inhibitor of DNA binding 2), MMp2(matrix metalloproteinase-2), MMp9(matrix metalloproteinase-9) 및 Wnt5a(Wingless-type MMTV integration site family, member 5A)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 피검 화합물을 처리하지 않은 음성 대조군과 비교하여 상기 유전자의 mRNA 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 감소시킨 피검 화합물을 선별하는 단계를 포함하는, 유방암 재발 또는 전이에 대한 예방 또는 치료용 제제의 스크리닝 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 피검 화합물은 Wnt 신호전달 저해활성을 나타내는 신호전달 저해제인 것인 방법.
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