KR20150059761A - 탈모증 및/또는 모발 탈색소를 치료하기 위해 사용되는 pedf-유도 폴리펩티드의 용도 - Google Patents

Abstract

본원에는 20 내지 44개의 아미노산 잔기를 가지는 PEDF로부터 유도된 합성 펩티드가 개시된다. 또한 본원에는 그 합성 펩티드를 함유하는 약학적 조성물 및 그것의 용도가 개시된다. 펩티드는 대상의 탈모증 및/또는 모발 탈색소를 치료하는 데 유용하다.

Description

탈모증 및/또는 모발 탈색소를 치료하기 위해 사용되는 PEDF-유도 폴리펩티드의 용도{USE OF PEDF-DERIVED POLYPEPTIDES FOR TREATING ALOPECIA AND/OR HAIR DEPIGMENTATION}

본 발명은 탈모증 및/또는 모발 탈색소의 치료에 관한 것이다. 특히 개시된 발명은 탈모증 및/또는 모발 탈색소를 치료하기 위해 사용되는 PEDF-유도 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.

탈모증은 머리 또는 신체로부터의 모발의 손실을 의미하고, 반흔성(흉터 있음) 탈모증 또는 비-반흔성(흉터 없음) 탈모증 중 어느 하나로 분류될 수 있다. 반흔성 탈모증 환자에서, 모낭은 파괴되고 흉터 조직으로 대체되는 한편, 비-반흔성 탈모증 환자에서는 그런 비가역적 손상은 없다. 탈모증은 생명을 위협하지는 않지만, 개인의 외모에 영향을 미치고, 그러므로 개인의 사회적 상호작용, 자존감 및 심리적 웰빙에 영향을 미친다.

비-반흔성 탈모증은 성장기 탈모증, 휴지기 탈모증, 안드로겐성 탈모증 및 원형 탈모증을 포함하고, 이것들은 각각 뚜렷한 생물학적 결함으로부터 초래된다. 대상이 경험하게 될 탈모증의 유형에 따라 모낭에 미치는 그것의 효과도 따라서 상이하다.

성장기 탈모증은 일반적으로 성장기 모낭의 모기질(hair matrix) 세포의 유사분열 촉진 활성의 갑작스러운 중단에 의해 유발된다. 그 자체로서 모낭은 모발 또는 균열이나 손실되기 쉬운 성향을 가지는 좁은 결함성 모근초를 생성하지 않는다. 성장기 탈모증은 화학요법 또는 방사선 요법을 진행한 환자들에서는 흔한 일이다. 일반적으로, 모낭은 성장기 탈모증의 원인이 더 이상 존재하지 않게 되면 그것의 원래의 성장 사이클을 재개할 것이다. 그러므로 대부분의 경우 모발의 재성장은 단부를 치료한 후에 시작한다. 그러나, 새롭게 성장한 모발의 색 및 촉감은 원래의 모발의 그것과 상이할 수 있다.

휴지기 탈모증은 모낭이 모발 성장 사이클의 휴지 단계에 너무 이르게 돌입하고, 그로써 모발의 과잉 탈모를 유발할 때 일어난다. 그것은 다양한 스트레스-관련 상태, 이를테면 불균형적인 다이어트, 약물치료(예컨대 베타 차단제, 칼슘 채널 차단제, 항우울제 및 비-스테로이드성 항-염증제 등), 출산, 고열, 대수술, 갑상선 기능 항진 또는 저하, 심각한 감염, 심각한 만성 질환 및 심각한 심리적 스트래스에 의해 유발될 수 있다. 일반적으로 모발 손실은 개인이 어떠한 스트레스 사건을 경함하고 3 내지 4개월 후에 나타나고, 손실된 모발은 6 내지 12개월 이내에 교체될 것이다.

안드로겐성 탈모증(남성형 대머리로도 알려져 있음)은 가장 흔한 유형의 남성 모발 손실이다. 안드로겐성 탈모증은 남성과 여성에게 나타나지만, 여성이 남성보다 더 적게 모발이 손실되는 경향이 있다. 안드로겐성 탈모증의 기저 메커니즘은 잘 알려져 있지 않다. 그러나 다이하이드로테스토스테론(안드로겐의 유도체)에 대한 모낭의 과민성이 남성의 안드로겐성 탈모증의 발달과 결합되는 것으로 여겨진다. 과민성은 모낭의 소형화를 유발할 수 있고, 모낭 세포의 성장기를 단축시킴으로써 궁극적으로는 모낭으로부터 빠지는 곤봉상 모발의 형성을 초래할 수 있다.

현재, 안드로겐성 탈모증의 치료를 위해 미국 식품의약청(FDA)에 의해 승인된 약물은 두 가지가 있다: 국소용 미녹시딜(상품명: ROGAINE^®) 및 경구용 피나스테라이드(상품명: Propecia^®). 미녹시딜은 모낭의 성장기를 확장시키고, 휴지기-대 성장기 전환을 자극하며, 모낭 크기 확대를 촉진함으로써 모낭에 영향을 미치는 칼륨 채널 아고니스트이다. 미녹시딜은 또한 원형 탈모증뿐 아니라 화학요법에 의해 유발된 성장기 탈모증의 치료에도 사용될 수 있다. 피나스테라이드는 테스토스테론을 다이하이드로테스토스테론(DHT)로 전환시키는 효소인 유형 II-α-환원효소의 경합성 억제제이다. 그러므로, 피나스테라이드는 유형 II-α-환원효소의 활성을 차단함으로써 안드로겐성 탈모증을 치료한다. 비록 이들 두 가지 약물이 일부 환자에서 모발의 재성장을 자극하지만, 그것들은 단지 약물치료 기간 중에만 효과적이고, 따라서 환자들은 지속적으로 약물치료를 받도록 권장된다. 또한, 미녹시딜 또는 피나스테라이드의 사용은 때로 많은 부작용이 수반되는 것으로 밝혀진다. 미녹시딜의 가능한 부작용은 두피 가려움 또는 발진; 성욕의 감퇴; 심박수의 상승; 호흡 곤란; 체중 증가; 및 다모증을 포함한다. 피나스테라이드의 가능한 부작용은 피부 발진; 유방 확대 또는 압통; 고환의 통증; 성욕의 감퇴; 사정액 부피의 감소; 및 발기부전을 포함한다.

모발 색은 모발의 색소침착의 결과이다. 멜라닌 형성 세포로부터 색소(즉 멜라닌)의 공급이 감소될 때 새롭게 성장한 모발은 그것의 원래의 색을 잃게 될 것이고 더 밝거나 심지어 백색, 일반적으로 모발 탈색소로 알려진 현상을 나타낸다. 모발 탈색소를 유발하는 요인들로는 적어도 노화, 스트레스, 장애(예컨대 얼룩백색증) 등을 포함한다. 또한 모발 탈색소는 자주 이전에 화학요법 또는 방사선요법을 경험한 환자들의 새롭게 성장한 모발에서 발견된다. 오늘날까지, 탈색소된 모발이 이전의 색을 회복하도록 유도하는 데 효과적인 의학적 치료는 존재하지 않는다. 그러므로 모발 탈색소를 경험하는 대부분의 사람들은 그들의 외모에 대처하거나 모발을 염색하거나 가발을 착용함으로써 탈색소된 모발을 감춰야 한다.

전술한 관점에서, 해당 기술분야에는 다양한 유형의 탈모증 및/또는 모발 탈색소를 효과적으로 치료하는 수단에 대한 필요가 존재한다.

발명의 요약

다음의 설명은 독자에게 기본적인 이해를 제공하기 위하여 본 발명의 개시 내용을 간단하게 요약하여 나타낸 것이다. 이 요약은 개시내용의 광범위한 개관이 아니며 본 발명의 핵심/결정적 요소를 확인하거나 본 발명의 범주를 설명하기 위한 것이 아니다. 그것의 유일한 목적은 본원에 개시된 몇 가지 개념을 이후에 제공되는 보다 상세한 설명에 대한 전주로서 단순한 형태로 제공하는 것이다.

본 발명은 적어도 색소 상피-유도 인자(PEDF)로부터 유도된 합성 펩티드가 모낭을 보호하고, 따라서 그것들은 대상의 모발 손실 및/또는 모발 탈색소를 방지하거나 및/또는 개선하는 데 효과적이라는 발견을 토대로 한다. 구체적으로, 본원에 제공된 작업 실시예는 다양한 PEDF-유도 합성 펩티드가 모낭 이영양증 및 모낭 세포 아폽토시스를 억제할 수 있고, 및/또는 모낭의 멜라닌 형성 세포 줄기 세포(MSC)의 미성숙한 분화를 방지할 수 있음을 가리킨다. 그러므로 본 발명의 PEDF-유도 합성 펩티드는 모발 손실 및/또는 모발 탈색소의 방지 및/또는 개선을 위한 제제 또는 의약으로서 유용하다.

따라서, 한 측면으로, 본 발명은 대상의 탈모증 및/또는 모발 탈색소를 치료하기 위한 합성 펩티드에 관한 것이다.

본 발명의 구체예에 따르면, 합성 펩티드는 20 내지 44 아미노산 잔기의 길이를 가지고, SEQ ID NO:10에 대해 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 가진다. 또한 아미노산 서열은 적어도 20개의 연속적인 잔기를 포함하는데, 그것은 SEQ ID NO:10의 잔기 16 내지 35에 대해 적어도 90% 동일함으로써, 합성 펩티드는 탈모증 및/또는 모발 탈색소의 치료에 유용하다.

본 발명의 임의의 구체예에 따르면, 합성 펩티드의 적어도 4개의 연속적인 잔기는 SEQ ID NO:10의 잔기 16 내지 19(즉 "SLGA 잔기")에 동일하다. 그런 합성 펩티드의 비-제한적인 실례로는 각각 SEQ ID NO:10(44-량체), SEQ ID NO:1(39-량체), SEQ ID NO:2(34-량체), SEQ ID NO:3(29-량체), SEQ ID NO:5(24-량체), SEQ ID NO:6(20-량체), SEQ ID NO:8(MO 29-량체) 및 SEQ ID NO:9(MO 20-량체)의 아미노산 서열을 가지는 것들을 포함한다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 합성 펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:10(44-량체), SEQ ID NO:3(29-량체), SEQ ID NO:5(24-량체) 또는 SEQ ID NO:6(20-량체) 중 어느 것이다.

본 발명의 다양한 구체예에 따르면, 탈모증은 성장기 탈모증(예컨대 화학요법 또는 방사선 요법에 의해 유발되는 탈모증), 휴지기 탈모증(예컨대 스트레스, 다이어트 불균형, 약물 처리 또는 감염에 의해 유발되는 탈모증) 또는 안드로겐성 탈모증일 수 있다.

어떤 구체예에서, 모발 탈색소는 화학요법 또는 방사선 요법에 의해 유발될 수 있다. 어떤 다른 구체예에서, 모발 탈색소는 스트레스 또는 노화에 의해 유발될 수 있다.

본 발명의 다양한 구체예에 따르면, 대상은 인간을 포함하여 포유류로서 분류된 어떠한 동물일 수 있다.

다른 측면으로, 본 발명은 대상의 탈모증 및/또는 모발 탈색소를 치료하기 위한 국소용 약학적 조성물에 관한 것이다. 대상은 인간을 포함하여, 포유류로서 분류된 어떠한 동물일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에 따르면, 국소용 약학적 조성물은 상기 언급된 측면/구체예 중 어느 것에 따르는 합성 펩티드를 포함하고, 그 합성 펩티드는 대상의 탈모증 및/또는 모발 탈색소를 치료하기에 충분히 유효한 양으로 존재한다. 약학적 조성물은 또한 합성 펩티드에 대한 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.

본 발명의 다양한 구체예에서, 국소용 약학적 조성물은 용액, 스프레이, 에어로졸, 발포체, 크림, 로션, 연고, 겔 또는 패치로 제형될 수 있다.

본 발명의 임의의 구체예에 따르면, 합성 펩티드는 약학적 조성물에 약 0.1 내지 100μM, 바람직하게는 약 1 내지 25μM의 양으로 존재한다.

또 다른 측면으로, 본 발명은 대상의 탈모증 및/또는 모발 탈색소를 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 대상은 인간을 포함하여 포유류로서 분류되는 어떠한 동물일 수 있다.

한 구체예에서, 그 방법은 대상에게 상기 언급된 측면/구체예 중 어느 것에 따르는 합성 펩티드의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 다양한 구체예에 따르면, 합성 펩티드는 국소적으로 또는 전신적으로 전달될 수 있다. 바람직하게는 합성 펩티드는 국소적으로 투여된다.

임의의 구체예에 따르면, 합성 펩티드는 본 발명의 상기 언급된 측면/구체예에 따르는 국소용 약학적 조성물로 제형된다. 한 실례로, 본 발명의 국소용 약학적 조성물은 대상의 두피에 적용될 수 있다.

본 발명의 부수적인 많은 특징 및 장점들은 첨부되는 도면과 함께 고려되는 다음의 상세한 설명을 참조로 더 잘 이해될 것이다.

특허 또는 출원 파일은 칼라로 그려진 적어도 하나의 도면을 포함한다. 칼라 도면이 포함된 본 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 필요한 비용이 요구되고 지불될 때 관청에 제공될 것이다.
본 설명은 첨부되는 도면에 비추어 다음의 상세한 설명을 판독하면 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 CYP 주사 후 0, 7 및 36일째에 각 실험 조건에서 털이 뽑힌 마우스들의 외관을 예시하는 대표적인 사진을 제시한다; 표시한 직사각형에 해당하는 고배율의 거시적 영상도 또한 제시된다.
도 2는 TUNEL-포지티브 아폽토시스성 세포를 예시하는 대표적인 면역염색된 영상(녹색)을 제시한다; 핵은 Hoechst 33258에 의해 대비염색되었다(푸른색); 원래 배율, xlOOO.
도 3은 티로시나제(녹색) 및 c-kit(적색)에 대한 이중-면역형광 염색에 의해 분석된 모낭 견본으로부터의 대표적인 사진을 제시한다; 핵은 Hoechst 33258에 의해 염색되었다(푸른색); 원래 배율, xlOOO.
도 4는 과산화수소를 피하로 주입한 후 0일 및 22일째에 각각의 실험 조건에서 마우스들의 외관을 나타내는 대표적인 사진을 제시한다.
도 5는 헤마톡실린 및 에오신(H&E)에 의해 염색된 마우스 수염 견본의 중간-성장기 모낭으로부터의 대표적인 사진을 제시한다; ORS, 외근초; IRS, 내근초; DP, 모유두 진피; HM, 모기질; 상부 패널의 원래의 배율, xlOO; 하부 패널의 원래의 배율, x400.
도 6은 H&E에 의해 염색된 마우스의 등쪽 피부로부터의 대표적인 사진을 제시한다; 원래의 배율, xlOO.
도 7은 털뽑기 후 0 및 18일째에 각각의 실험 조건에서 모발 재성장을 예시하는 대표적인 사진, 및 헤마톡실린 및 에오신(H&E)에 의해 염색된 등쪽 피부로부터의 대표적인 사진을 제시한다; 원래의 배율, xlOO.

첨부된 도면과 관련하여 아래에 제공되는 상세한 설명은 본 발명의 실례의 설명으로서 의도된 것이고 본 실례가 구성되거나 활용될 수 있는 유일한 형태를 나타내려는 의도는 아니다. 설명은 실례의 기능과 실례의 제조 및 작동 단계 순서를 나타낸다. 그러나, 동일하거나 동등한 기능 및 순서는 상이한 실례에 의해서도 이루어질 수 있다.

편리를 위해, 전체 출원(명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위를 포함하여)에 사용된 특정 용어들을 여기에 모았다. 본원에서 다르게 정의되지 않는 한, 본 발명에서 사용된 과학적이고 기술적인 전문용어들은 관련된 기술분야에서 숙련된 기술을 가진 사람에 의해 통상적으로 이해되고 사용되는 것과 같은 의미를 가질 것이다. 맥락에 의해 다르게 요구되지 않는 한, 단일 형태의 용어는 동일한 복수의 형태를 포함하고 다수의 용어는 단일한 것을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 구체적으로, 본원과 청구범위에서 사용되는 것과 같이 하나를 나타내는 용어들은 맥락이 명백하게 다른 것을 가리키지 않는 한 다수의 항목을 포함한다.

본 발명의 광범위한 범주를 나타내는 수치 범위와 매개변수들이 근사치임에도 불구하고, 특수한 실례에서 나타나는 수치는 가능한 정확한 것으로 기록된다. 그러나 어떠한 수치든지 본질적으로 각각의 시험 측정에서 발견되는 표준 편차로부터 필연적으로 유발되는 특정 오차를 고유하게 함유한다. 또한 본원에서 사용되는 것과 같이, 용어 "약"은 일반적으로 주어진 값 또는 범위의 10%, 5%, 1% 또는 0.5% 내에 있는 것을 의미한다. 또는 다르게는, 용어 "약"은 해당 기술분야의 숙련된 기술을 가진 사람이 인지할 때 평균의 허용되는 표준 오차 내에 있는 것을 의미한다. 작동/작업 실시예 이외에, 또는 다르게 표시되지 않는 한, 본원에서 개시된 본원의 모든 수치 범위, 양, 값 및 백분율, 예컨대 재료의 양, 시간의 기간, 온도, 작동 조건, 양의 비율 등은 모든 경우에 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서 반대를 나타내지 않는 한, 본 발명 및 첨부된 청구범위에 나타낸 수로 표시된 매개변수들은 의도된 대로 변할 수 있는 근사치이다. 최소한 각각의 수로 표시된 매개변수는 적어도 기록된 많은 유의할만한 숫자를 고려하여, 그리고 통상적인 라운딩 기법을 적용함으로써 해석되어야 한다.

본원에서 사용되는 것과 같이, 용어 "펩티드"는 아미노산 잔기의 중합체를 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "합성 펩티드"는 전체적으로 자연적으로 발생하는 단백질 분자를 포함하지 않는 펩티드를 의미한다. 펩티드는 그것이 화학적 합성, 재조합 유전자 기법 또는 전체 단백질의 단편화 등과 같은 기법을들 사용하여 인간이 개입함으로써 제조될 수 있을 때 "합성"이다. 본 명세서를 통틀어 펩티드 내에 있는 어떠한 명시된 아미노산의 위치는 펩티드의 N-말단으로부터 시작하여 넘버링된다.

본원에서 사용되는 용어 "줄기 세포"는 특정 상황 하에서 실질적으로 분화하지 않고 증식하는 능력뿐 아니라 특별한 상황 하에서 보다 특수화되거나 분화된 표현형으로 분화하는 능력 또는 잠재력을 보유하는 세포를 말한다.

본원에서 사용되는 "증식하는" 및 "증식"은 세포 분할에 의해 집단의 세포의 수를 증가시키는 것을 나타낸다.

본원에서 확인된 합성 폴리펩티드 서열과 관련하여 "백분율(%) 아미노산 서열 동일성"은 서열을 일렬 배열하고, 필요하다면 최대 % 서열 동일성을 이루기 위하여 갭을 도입한 후에 특정 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의되고, 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존성 치환을 고려하지 않는다. 백분율 서열 동일성을 측정하는 목적을 위한 배열은 해당 기술분야의 숙련도 내에 있는 다양한 방법으로, 예를 들면 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 활용할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 이루어질 수 있다. 해당 기술분야의 숙련자들은 배열을 측정하기 위한 적절한 매개변수, 이를테면 비교하고자 하는 서열의 전체 길이에 대해 최대 배열을 이루기 위해 필요한 어떠한 알고리즘을 측정할 수 있다. 본원의 목적에 대해 두 개의 아미노산 서열 사이의 서열 비교는 Nation Center for Biotechnology Information(NCBI)에 의해 온라인으로 제공되는 컴퓨터 프로그램 Blastp(단백질-단백질 BLAST)에 의하여 수행될 수 있다. 주어진 아미노산 서열 A의 주어진 아미노산 서열 B에 대한 백분율 아미노산 서열 동일성(다르게 표현하면 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 %의 아미노산 서열 동일성을 가지는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현할 수 있다)은 다음과 같은 식에 의해 계산되고:

상기 식에서, X는 서열 배열 프로그램 BLAST에 의해 A와 B의 그 프로그램의 배열에서 동일한 매치로서 기록된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 어느 것이 더 짧든지간에 A 또는 B의 총 아미노산 잔기의 수이다.

본원에서 용어 "치료" 및 "치료하는"은 원하는 약학적 및/또는 생리적 효과를 초래하는 방지성(예컨대 예방적), 치유적 또는 완화적 치료를 포함하는 것으로 사용된다. 바람직하게는 그 효과는 탈모증 또는 모발-탈색소를 부분적으로 또는 완전하게 치유 또는 방지하는 관점에서 치료적이다. 또한 본원에서 사용되는 것과 같은 용어 "치료하는"은 의학적 질환, 질환의 증상, 그 질환에 이차적인 질병 또는 장애, 또는 그 질환에 대한 경향성을 가지고 있는 대상에게, 특별한 질병, 장애 및/또는 질환의 하나 또는 그것보다 많은 증상 또는 특징을 부분적으로 또는 완전하게 경감, 개선, 완화, 개시의 지연, 진전의 억제, 심각성의 감소 및/또는 발생의 감소를 목적으로, 본 발명의 합성 펩티드 또는 약학적 조성물을 적용 또는 투여하는 것을 말한다. 치료는 질병, 장애 및/또는 질환과 관련된 병리학의 발생 위험을 감소시킬 목적에 대해 질병, 장애 및/또는 질환의 징후를 나타내지 않는 대상 또는 단지 질병, 장애 및/또는 질환의 초기 징후만을 나타내는 대상에게 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 것과 같이, 증상, 질병, 장애 또는 질환은 탈모증 또는 모발-탈색소증일 수 있다. 치료는 일반적으로 만약 하나 또는 더 많은 증상 또는 임상적 마커가 그 용어가 본원에서 정의된 것과 같이 감소된다면 "효과적"이다.

본원에서 사용된 용어 "유효량"은 원하는 반응을 생성하기에 충분한 성분의 양을 말한다. 본원에서 사용된 용어 "치료적으로 유효한 양"은 상기에서 정의된 것과 같은 원하는 "효과적인 치료"를 유발하기 위한 약학적 조성물의 치료적 제제의 양을 말한다. 구체적인 치료적으로 유효한 양은 치료되는 특별한 질환, 환자의 신체적 상태(예컨대 환자의 체중, 연령 또는 성별), 치료되는 포유류 또는 동물의 유형, 치료 기간, 공존하는 치료법(만약 있다면)의 본질 및 사용되는 특이한 제형과 같은 인자들에 따라 달라질 것이다. 치료적으로 유효한 양은 또한 화합물 또는 조성물의 어떠한 독성 또는 유해한 효과보다 치료적으로 유익한 효과가 훨씬 더 크다.

용어 "적용" 또는 "투여"는 본원에서 본 발명의 합성 펩티드 또는 약학적 조성물을 탈모증 및/또는 모발-탈색소를 치료하기 위하여 대상에게 제공하는 수단을 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 본 발명의 다양한 구체예에 따르면, 국소 적용이 바람직한 투여 경로이다. 예를 들어 본 발명의 합성 펩티드 또는 약학적 조성물은 대상의 생물학적 표면(예컨대 피부, 두피 또는 모발)에 국소적으로 적용되어 합성 펩티드 또는 본 발명의 약학적 조성물이 탈모증 및/또는 모발 탈색소를 방지 또는 개선하기 위하여 표적 부위(예컨대 모낭)에 도달한다.

본원에서 사용된 것과 같은 용어 "부형제"는 본 발명의 합성 PEDF 펩티드(들)에 대한 비히클/담체를 형성하는 어떠한 비활성 물질(예컨대 분말 또는 액체)을 의미한다. 부형제는 보통 안전하고 비-독성이며, 넓은 의미로는, 또한 약학적 조성물을 제조하기에 유용한 약학 산업분야에서 공지되어 있는 어떠한 물질, 예를 들면 충전제, 희석제, 점착제, 결합제, 윤활제, 연화제, 안정화제, 착색제, 습윤제, 붕괴제 등을 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 것과 같이, "약학적으로 허용되는" 성분은 타당한 유익/위험률과 비례하는 지나친 유해한 부작용(예컨대 독성, 염증 및 알레르기 반응) 없이 인간 및/또는 동물과 사용하기에 적당한 것이다. 또한 각각의 부형제는 약학적 제형의 다른 성분들과 부합한다는 의미에서 "허용되는" 것이어야 한다.

용어 "대상"은 본 발명의 합성 펩티드, 조성물 및/또는 방법으로 치료가능한 인간 종을 포함한 포유류를 말한다. 용어 "대상"은 한 가지 성이 구체적으로 표시되지 않는 한 남성과 여성 둘 다를 말하는 것으로 의도된다.

동물의 모발 성장에는 세 단계가 있다: 퇴행기, 휴지기 및 성장기. 성장기는 그 기간 동안 모구의 세포가 빠르게 분할되고 모간으로 분화하는 모발의 활동적인 성장 단계이다. 평균적으로 인간의 두발은 이 활동적인 성장 단계에 약 3 내지 5년 동안 머무르고, 한편 쥐과의 모발은 성장 단계에 약 11년 동안 머무른다. 성장기에는 퇴행기가 이어진다. 이 시간 동안 모발 성장은 중지되고 약 70%의 모낭 세포가 아폽토시스 및 재-흡수를 진행함으로써, 곤봉상모의 형성을 초래한다. 퇴행기는 인간 두발에 대해 약 1 내지 2주 동안 지속되는 과도기이다. 퇴행기 후에, 모발은 휴지기에 들어간다. 휴지기는 휴식기이고, 인간 두발의 경우 약 3개월 동안 지속된다. 이 단계 동안에, 모낭은 완전히 정지상태이고, 곤봉상모가 전체적으로 형성된다. 성장기 모발과 비교하면, 휴지기 모발(곤봉상모)은 상대적으로 쉽게 빠질 수 있고 털갈이되는 경향이 있다.

모낭 줄기 세포(FSC) 및 멜라노사이트 줄기 세포(MSC)는 모낭의 벌지(bulge) 영역에 존재하고, 각각 모발 재생 및 모발 색소침착을 담당한다. 많은 인자들이 모낭 줄기 세포 및/또는 멜라노사이트 줄기 세포의 줄기성(stemness)을 위태롭게 하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어 이들 줄기세포는 노화, 환경적 산화제, 모낭과 관련된 장애, 화학요법 또는 대상의 유전자 구성의 작용 하에 그것들의 줄기성을 상실할 수 있다. 줄기성의 상실은 그것들의 자손의 수명에 영향을 미칠 수 있고, 그것은 다시 탈모증 또는 모발 탈색소를 유발한다.

색소 상피-유도 인자(PEDF)는 혈관형성 억제, 종양 형성 억제 및 신경영양성 기능을 가지는 다중기능성 분비된 단백질이다. 인간 PEDF 단백질(SEQ ID NO:11)은 대략 50 kDa의 길이가 418 아미노산인 분비된 단백질이다. PEDF의 34-량체 단편(잔기 44 내지 77) 및 44-량체 단편(잔기 78 내지 121; SEQ ID NO:10)은 각각 혈관형성 억제 및 신경영양성 특성을 가지는 것으로 확인되었다.

본 발명은 적어도, 44-량체 PEDF로부터 유도된 합성 펩티드가 다양한 메커니즘을 통해 모낭을 보호할 수 있다는 발견을 토대로 한다. 예를 들어 합성 펩티드는 모낭의 소형화를 억제할 수 있고, 멜라노사이트 줄기 세포의 멜라노사이트로의 미성숙한 분화를 방지할 수 있으며, 멜라닌 군집을 감소시킬 수 있다. 어떠한 이론에 구속되지는 않지만, 이들 보호 메커니즘은 모낭의 줄기 세포의 줄기성을 유지하고 및/또는 그런 줄기 세포의 자손 세포를 정상 수명으로 보유함으로써, 모낭이 비정상적으로 머리털이 빠지는 경향이 더 적고 및/또는 모발의 원래 색을 보존하는 건강하고 정상적인 모발을 생성하는데 도움을 줄 수 있는 것으로 여겨진다. 본 발명의 또 다른 진보적인 특징은 합성 펩티드가 전체-길이 PEDF보다 훨씬 더 짧고(20 내지 44 아미노산 잔기) 그로써 고가의 제조 비용, 낮은 생체내 활용성 및 불량한 약물역학을 포함한, 종래의 단백질 약물을 임상적으로 사용할 때에 관련된 한계점들을 극복한다는 데 있다. 따라서, 본 발명의 합성 펩티드는 탈모증 및/또는 모발 탈색소의 치료에 유용하다.

그러므로 한 측면으로, 본 발명은 대상의 탈모증 및/또는 모발 탈색소를 치료하기 위한 합성 펩티드에 관련된다.

본 발명의 구체예들에 따르면, 합성 펩티드는 길이가 20 내지 44 아미노산 잔기이고, VLLSPLSVATALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT(SEQ ID NO:10)의 아미노산 서열과 적어도 80%의 아미노산 서열 동일성을 가진다. 예를 들어 합성 펩티드는 SEQ ID NO:10와 약 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 또한, 합성 펩티드는 SEQ ID NO:10의 잔기 16 내지 35에 대해 적어도 90% 동일한 적어도 20개의 연속적인 잔기를 포함한다. 구체적으로, 20개의 연속적인 아미노산 잔기는 SEQ ID NO:10의 잔기 16 내지 35와 약 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다.

한 구체예에서, 합성 펩티드는 44-량체이다. 본 발명자들에 의해 수행된 선행 실험, 예컨대 공동 계류중인 출원 US 13/428,996 및 TW 100138168(그 전체 내용은 참고로 본원에 포함된다)에 개시된 것들 및 아래에서 제공되는 실험들은 44-량체로부터 유도된 여러 개의 짧은 합성 PEDF 펩티드가 대상의 탈모증 및/또는 모발 탈색소를 치료할 수 있음을 나타낸다. 구체적으로, 대만 특허 출원 번호 100138168호는 PEDF 44-량체가 화학요법 또는 스트레스에 의해 유도된 탈모증 및 모발 탈색소를 방지하는 데뿐만 아니라 안드로겐성 탈모증을 방지 및/또는 개선하는 데에도 효과적임을 나타낸다.

예를 들어, 선행 출원 및 본 출원 둘 다에 개시된 실험을 토대로, LSVATALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT(SEQ ID NO:1)의 서열을 가지는 39-량체 합성 펩티드는 대상의 탈모증 및/또는 모발 탈색소를 치료하는 데 효과적이다. 이 39-량체 펩티드는 인간 PEDF의 잔기 83 내지 121에 해당하고, 따라서 공지된 PEDF 44-량체(PEDF의 잔기 78 내지 121에 해당함)로부터 유도된 짧은 변이체이다. 상기에서 제공된 어떠한 두 가지 주어진 서열 사이의 서열 동일성의 백분율을 추정하는 방법에 따르면, 39-량체는 44-량체에 대해 100%의 아미노산 서열 동일성을 가지고, 39-량체의 11번째 내지 30번째 아미노산 잔기는 44-량체의 아미노산 잔기 16 내지 35에 대해 100%의 아미노산 서열 동일성을 가진다.

다른 실례에서, ALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT(SEQ ID NO:2)의 서열을 가지는 34-량체 합성 펩티드는, 선행 출원 및 본 출원 둘 다에 개시된 실험을 토대로, 대상의 탈모증 및/또는 모발 탈색소를 치료하는 데 효과적이다. 이 34-량체 펩티드는 인간 PEDF의 잔기 88 내지 121에 해당한다. 34-량체는 44-량체에 대해 100%의 아미노산 서열 동일성을 가지고, 34-량체의 여섯번째 내지 25번째 아미노산 잔기는 44-량체의 아미노산 잔기 16 내지 35에 대해 100%의 아미노산 서열 동일성을 가진다.

추가로, 아래의 다양한 실시예에 따르면, SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT(SEQ ID NO:3)의 서열을 가지는 29-량체 합성 펩티드는 대상의 안드로겐성 탈모증의 방지 및/또는 개선에 효과적인 것으로 확인되었다. 29-량체는 또한 선행 출원 및 본 출원 둘 다에 개시된 실험들을 토대로, 화학요법 또는 스트레스에 의해 유발된 탈모증 및/또는 모발 탈색소를 치료하는 데 효과적인 것으로 여겨진다. 이 29-량체 펩티드는 44-량체에 대해 100%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 인간 PEDF의 잔기 93 내지 121에 해당한다. 또한 29-량체의 첫 번째부터 20번째 아미노산 잔기는 44-량체의 아미노산 잔기 16 내지 35에 대해 100%의 아미노산 서열 동일성을 가진다.

일부 실례에서, 24-량체는 대상의 안드로겐성 탈모증을 방지 및/또는 개선하는 데 효과적인 것으로 확인되었다. 또한, 24-량체는 선행 출원 및 본 출원 둘 다에 개시된 실험들을 토대로, 화학요법 또는 스트레스에 의해 유발된 탈모증 및/또는 모발 탈색소를 치료하는 데 효과적인 것으로 여겨진다. 24-량체는 SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSP(SEQ ID NO:5)의 서열을 가지고, 그것은 인간 PEDF의 잔기 93 내지 116에 해당한다. 이 24-량체 펩티드는 44-량체에 대해 100%의 아미노산 서열 동일성을 가지고, 그것의 처음 20개의 아미노산 잔기는 44-량체의 아미노산 잔지 16 내지 35에 대해 100%의 아미노산 서열 동일성을 가진다.

다른 실례에서, 20-량체가 대상의 안드로겐성 탈모증을 방지 및/또는 개선할 수 있는 것으로 수립되었다. 또한, 20-량체는 선행 출원 및 본 출원 둘 다에 개시된 실험들을 토대로, 화학요법 또는 스트레스에 의해 유발된 탈모증 및/또는 모발 탈색소를 치료하는 데 효과적인 것으로 여겨진다. 20-량체는 SLGAEQRTESIIHRALYYDL(SEQ ID NO:6)의 서열을 가지고, 그것은 인간 PEDF의 잔기 93 내지 112에 해당한다. 이 20-량체 펩티드는 44-량체의 아미노산 잔기 16 내지 35에 완전히 동일하고(100% 아미노산 서열 동일성), 44-량체에 대해 100%의 아미노산 서열 동일성을 가진다.

마우스 PEDF로부터 유도된 2개의 합성 펩티드는 또한 선행 출원 및 본 출원 둘 다에 개시된 실험들을 토대로, 대상의 화학요법 또는 스트레스에 의해 유도된 안드로겐성 탈모증 또는 탈모증 및/또는 모발 탈색소를 방지 및/또는 개선할 수 있다. 첫 번째 마우스-유도된 펩티드는 본 발명에서 "Mo 29-량체"로 언급된다. Mo 29-량체는 SLGAEHRTESVIHRALYYDLITNPDIHST(SEQ ID NO:8)의 서열을 가지며, 그것은 44-량체에 대해 83%의 아미노산 서열 동일성을 가지고, 그것의 처음 20개의 아미노산 잔기는 44-량체의 16 내지 35 아미노산 잔기에 대해 90%의 아미노산 서열 동일성을 가진다. 또 다른 마우스-유도된 펩티드, Mo 20-량체는 SLGAEHRTESVIHRALYYDL (SEQ ID NO:9)의 서열을 가진다. Mo 20-량체는 44-량체 및 44-량체의 16 내지 35 아미노산 잔기 두 가지에 대해 90%의 아미노산 서열 동일성을 가진다.

임의로, 합성 펩티드는 SEQ ID NO:10의 잔기 16 내지 19에 동일한 4개의 연속적인 잔기를 포함한다. SEQ ID NO;10의 잔기 16 내지 19(즉 SLGA)는 짧은 PEDF 펩티드의 생물학적 기능을 유지하는 데 중요한 역할을 담당하는 것으로 여겨진다. 예를 들어 아래에 제공되는 다양한 실례를 따르면, SLGA 잔기가 없는 18-량체 펩티드(EQRTESIIHRALYYDLIS; SEQ ID NO:7)는 대상에서 모낭에 대해 어떠한 보호도 일으키지 못한다. 또한, 선행 출원 및 본 출원 둘 다에 개시된 실험들을 토대로, SLGA가 없는 25-량체 펩티드(EQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT; SEQ ID NO:4)는 대상에서 탈모증 및/또는 모발 탈색소를 치료하는데 효과적이지 않다는 것이 시사된다.

본 발명의 합성 펩티드는 알파-아미노기의 t-BOC 또는 FMOC 보호와 같은 통상적으로 사용되는 방법들에 의해 합성될 수 있다. 두 가지 방법 모두 단계식 합성을 포함하고, 그로써 단일 아미노산이 펩티드의 C 말단으로부터 시작하여 각 단계에서 첨가된다. 본 발명의 펩티드는 또한 잘 알려져 있는 고상 펩티드 합성법에 의해 합성될 수 있다.

39-량체와 관련하여 보존성 변이를 가지는 다른 합성 펩티드도 또한 포함된다. 본원에서 사용된 것과 같은 용어 "보존성 변이"는 생물학적으로 유사한 다른 잔기에 의해 한 아미노산 잔기가 대체되는 것을 나타낸다. 보존성 변이의 실례로는 이소로이신, 발린, 로이신 또는 메티오닌과 같은 하나의 소수성 잔기가 서로 치환되는 것, 또는 한 극성 잔기가 다른 극성 잔기로 치환되는 것, 예를 들면 아르기닌의 라이신에 대한 치환, 글루탐산의 아스파트산에 대한 치환 또는 글루타민의 아스파라긴에 대한 치환 등을 포함한다. 용어 "보존성 변이"는 또한 치환된 폴리펩티드에 대해 발생된 항체가 또한 미치환 폴리펩티드와 면역학적으로 반응한다면, 원래의 미치환 아미노산 대신 치환된 아미노산이 사용되는 것을 포함한다.

본 발명의 다양한 구체예에 따르면, 탈모증은 성장기 탈모증(예컨대 화학요법 또는 스트레스에 의해 유발된 것들), 휴지기 탈모증(예컨대 스트레스, 다이어트 불균형, 약물처리 또는 감염에 의해 유발된 것들) 또는 안드로겐성 탈모증일 수 있다.

어떤 구체예에서, 모발 탈색소는 화학요법 또는 방사선요법에 의해 유발될 수 있다. 다른 어떤 구체예에서, 모발 탈색소는 스트레스 또는 노화에 의해 유발될 수 있다.

본 발명의 다양한 구체예에 따르면, 대상은 인간을 포함하여 포유류로서 분류된 어떠한 동물일 수 있다.

상기 언급된 구체예에 따르는 합성 펩티드는 대상의 탈모증 및/또는 모발 탈색소를 치료하기 위한 국소용 약학적 조성물로 제형될 수 있고, 그것은 본 발명의 다른 측면에 속한다.

본 발명의 한 구체예에 따르면, 국소용 약학적 조성물은 상기 언급된 측면/구체예 중 어느 것에 따르는 합성 펩티드를 포함하고, 그 합성 펩티드는 대상의 탈모증 및/또는 모발 탈색소를 치료하기에 충분히 유효한 양으로 존재한다. 약학적 조성물은 또한 합성 펩티드에 대한 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.

약학적 조성물은 허용되는 약학적 과정, 예를 들면 Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th edition, ed. Alfonoso R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, Pa (1985)에 기술되어 있는 과정을 따라 제조된다.

합성 펩티드와 함쎄 사용될 수 있는 약학적으로 허용되는 부형제의 선택은 기본적으로 국소용 약학적 조성물이 투여될 방법에 의해 결정된다. 본 발명의 한 가지 임의의 구체예에 따르면, 국소용 약학적 조성물은 대상의 생물학적 표면(예컨대 피부, 두피 또는 모발)에 확산되거나, 발라지거나, 마사지되거나, 분무되거나, 또는 그렇지 않으면 도포될 수 있어서, 합성 펩티드는 모낭의 활발한 흡수(transappendageal route)에 의해 또는 세포간 경로 또는 세포내 경로를 통한 경피 전달을 통해 표적 부위(예컨대 모낭)에 도달한다.

해당 기술분야에 잘 알려져 있는 피부과학적으로 허용되는 광범위한 비활성 부형제가 사용될 수 있다. 전형적인 비활성 부형제의 예를 들면 물, 에틸 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 프로필렌 글리콜, 미네랄 오일, 스테아릴 알코올, 연고 베이스 및 겔-생성 물질일 수 있다.

임의로, 본 발명의 약학적 조성물은 또한 해당 기술분야에 잘 알려져 있는 다양한 약학적으로 -(특히, 피부과학적으로)- 허용되는 첨가제를 포함할 수 있다. 상기 첨가제로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 건조제, 가려움 억제제, 발포 억제제, 완충제, 중화제, pH 조정제, 착색제, 탈색제, 진정제, 유화제, 에멀션 안정화제, 점도 증강제, 보습제, 취기제, 보존제, 항산화제, 화학 안정제, 농축제, 경화제 또는 현탁제를 포함한다.

본 발명의 다양한 구체예에서, 국소용 약학적 조성물은 다양한 단위용량 형태, 예컨대 용액, 스프레이, 에어로졸, 발포체, 크림, 로션, 연고, 겔 또는 패치로 제형될 수 있다.

본 발명의 임의의 구체예에 따르면, 합성 펩티드는 약 0.1 내지 100μM, 바람직하게는 약 1 내지 25μM의 양으로 약학적 조성물 중에 존재한다. 예를 들어 합성 펩티드의 농도는 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100μM이다. 구체적으로, 마우스(약 20그램의 체중)에 대해 하기 작업 실시예에 사용된 농도는 약 25μM이다. 통상적인 지식을 가진 사람들은 본원에 제공된 동물 용량을 토대로 본 발명의 합성 펩티드 또는 약학적 조성물에 대한 인간 동등량(HEQ)을 계산할 수 있을 것이다. 예를 들어, 미국 식품의약국(FDA)은 "Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers"란 제목의 산업분야에 대한 안내서를 발표하였다.

임의로, 합성 펩티드는 치료의 더 많이 연장된 치료 작용을 보장하기 위하여 지속성-방출 단위용량 형태로 제형될 수 있다. 예를 들어 합성 펩티드는 리포솜, 마이크로스피어 또는 나노솜과 같은 비히클로 먼저 캡슐화된 후에, 원하는 단위용량 형태로 제형될 수 있다. 이들 비히클-형성 비히클의 일부(예컨대 리포솜)는 또한 본 발명의 합성 펩티드 또는 약학적 조성물의 전달 속도를 촉진하는 데에도 유익하다.

또 임의로, 합성 펩티드는 코팅 물질로 제형될 수 있고, 나중에 기질의 표면에 또는 구멍에 코팅되거나, 침지되거나 또는 그렇지 않으면 보유됨으로써 패치 등이 생성되기도 한다. 기질은 적어도 하나의 천연 물질, 적어도 하나의 합성 물질 또는 둘 다의 조합으로부터 제조될 수 있다. 예를 들어 천연 물질은 콜라겐, 히알루론산, 알긴산염 또는 키토산, 또는 그것들의 유도체일 수 있고; 합성 물질은 폴리우레탄, 폴리글리콜산 또는 폴리비닐 피롤리돈, 또는 그것의 유도체일 수 있다. 상기 코팅 물질 및/또는 기질은 적절한 생체점착성을 가질 수 있어서, 패치는 대상의 생물학적 표면에 부착될 수 있고 패치가 제거될 때 모발 성장에 해로운 효과를 나타내지 않을 것이다.

또 다른 측면으로, 본 발명은 대상의 탈모증 및/또는 모발 탈색소를 치료하기 위한 방법에 관련된다. 대상은 인간을 포함한, 포유류로서 분류된 어떠한 동물일 수 있다.

한 구체예에서, 그 방법은 대상에게 상기 언급된 측면/구체예 중 어느 것에 따르는 합성 펩티드의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 다양항 구체예에 따르면, 합성 펩티드는 국소적으로 또는 전신적으로 전달될 수 있다. 바람직하게는 합성 펩티드는 국소적으로 투여된다. 보다 바람직하게는, 합성 펩티드는 대상의 생물학적 표면(예컨대 피부, 두피 또는 모발)에 국소적으로 투여되어서 합성 펩티드는 표적 부위(예컨대 모낭)에 도달하여 모발 성장 및/또는 모발 색소침착이 촉진된다.

임의의 구체예에 따르면, 합성 펩티드는 상기 언급된 측면/구체예에 따르는 국소용 약학적 조성물로 제형된다. 한 실례에서, 본 발명의 국소용 약학적 조성물은 대상의 생물학적 표면(예컨대 피부, 두피 또는 모발)에 적용될 수 있다.

따라서, 본 발명에 따르는 합성 펩티드 또는 국소용 약학적 조성물은 명시된 조건(예를 들면 특정 습도 또는 온도) 하에서 투여될 수 있다. 예를 들어 보다 습하고 따뜻한 환경 하에서의 투여는 표적 부위에 의한 합성 펩티드의 흡착을 촉진할 수 있다.

어떤 구체예에 따르면, 대상은 비정상적인 모발 손실을 유발하는 성장기 탈모증, 휴지기 탈모증 또는 안드로겐성 탈모증과 같은 탈모증으로 고생할 수 있다. 어떤 다른 구체예에 따르면, 대상은 화학요법, 방사선요법, 산화성 자극 또는 노화에 의해 유발된 모발 탈색소로 고생할 수 있다. 또한 대상은 그/그녀의 유전자 구성으로 인한 탈모증 및/또는 모발 탈색소로 고생할 수 있다.

다음 실시예는 본 발명의 특정 측면을 설명하고 해당 기술분야의 숙련자들이 본 발명을 실시하는 것을 돕기 위해 제공된다. 이들 실시예는 결코 어떤 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 간주되지 않는다. 추가로 더 자세하게 설명하지 않아도, 해당 기술분야의 숙련자는 본원의 설명을 토대로, 본 발명을 충분한 정도로 활용할 수 있을 것으로 여겨진다. 본원에서 인용된 모든 공보는 참고로 그것의 전체 내용이 포함된다.

실시예

재료 및 방법

재료

둘베코 변형 이글스 배지(DMEM), 우태아 혈청(FBS) 및 0.25%의 트립신을 Invitrogen(Carlsbad, CA)으로부터 구매하였다. 다이하이드로테스토스테론(DHT), 에틸 알코올, 1-올레일-rac-글리세롤, 경 미네랄 오일, 하이드록시 프로필 메틸셀룰로스, 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 인슐린, 하이드로코르티손, 우혈청 알부민(BSA), 5-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU), Hoechst 33258 염료 및 Hoechst 33342 염료는 모두 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO) 제품이었다. 항-BrdU 항체는 GeneTex(Taipei, Taiwan) 제품이었다. 항-c-kit 항체(No. 3074)는 Cell Signaling Technology(No. 3074; Beverley, MA, USA) 제품이었다. 항-티로시나제 항체(No.sc-7833) 및 모든 형광 염료-포합된 이차 항체를 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)로부터 구매하였다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염료를 Merck(Rayway, NJ, USA)로부터 구입하였다.

FITC-포합된 29-량체 및 44-량체(SEQ ID NO:10), 29-량체(SEQ ID NO:3), 24-량체(SEQ ID NO:5), 20-량체(SEQ ID NO:6), 18-량체(SEQ ID NO:7) 및 Mo 20-량체(SEQ ID NO:9)를 포함한 다른 짧은 합성 PEDF 펩티드를 합성하였고, NH₂ 말단에서의 아세틸화 및 COOH 말단에서의 아미드화에 의해 변형시켰다. 변형된 펩티드를 이어서 질량 분광학에 의해 특성확인하였다(>95% 순도)(GenScript(Piscataway, NJ)).

동물

본 발명의 구체예에 사용된 모든 동물을 온도 제어(24 내지 25℃) 및 12:12 명-암 주기 하에 동물 방에 가두어 두었다. 표준 실험실 음식과 수돗물을 마음대로 먹을 수 있게 하였다. 실험 과정은 맥케이 메모리얼 호스피탈 리뷰 보드(New Taipei City, Taiwan, R.O.C.)에 의해 승인받았고, 대만 동물 복지 규정에 따라 수행하였다.

국소용 연고 또는 겔 제형

각각의 PEDF-유도된 짧은 합성 펩티드(PEDF-포합된 29--량체, 44-량체, 29-량체, 24-량체, 20-량체, 18-량체 또는 Mo 20-량체; 이하 PEDF 펩티드)를 DMSO에 스톡(5mM)으로서 재구성하여 나중에 사용하기 위해 -20℃에 보관하였다.

사용 전에, 44-량체를 함유하고 있는 스톡을 작업 희석률로 준비하였고, 그런 다음 그것을 5mg/g의 네오마이신 설페이트 및 12.5mg/g의 바시트라신을 함유하고 있는 항생물질 연고와 혼합하여 25μM의 44-량체를 함유하고 있는 항생물질 연고를 얻었다. 다른 PEDF 펩티드에 대한 것과 같이, 5㎕의 5mM PEDF 펩티드 스톡을 점차로 에틸 알코올(증류수 중에 30% w/w)에 녹이고, 그런 다음 1-올레일-rac-글리세롤(1% w/w, 피부 경피흡수 촉진제) 및 경 미네랄 오일(1% w/w)을 점차로 첨가하였다. 마지막으로 하이드록시프로필 메틸셀룰로스(5% w/w)를 1ml의 최종 부피로 첨가함으로써 그 용액을 겔화하였다. 펩티드 제형에 해당하는 DMSO 비히클을 생체 내 비교의 목적으로 제조하였다. FITC-29-량체를 또한 동일한 제형에 녹여서 피부 위에 적용하여 FITC-29-량체의 모낭 분포를 측정하였다.

국소 치료를 위해, 25μM의 PEDF 펩티드를 함유하는 350mg의 연고 또는 겔을 마우스당 등쪽 피부 위에 부드럽게 펴 발랐다.

조직학, 면역조직화학 및 정량

쥐의 등피부를 추골선과 평행하게 수확하여 모낭을 통과하는 세로 방향 단편을 얻었다. 등쪽 피부를 4% 파라폼알데하이드에 고정시키고 파라핀 블록에 박아서 세로방향 단편을 얻었다. 조직을 5-㎛ 단편으로 잘랐다. 사용 전에 고정된 샘플을 자일렌으로 파라핀을 제거하고 등급별 시리즈의 에탄올로 다시 수화하였다. 일반적인 조직학을 H&E 염료를 사용하여 수행하였다. 디지털 현미경사진(Zeiss epifluorescence microscope; Jena, Germany)을 100x의 고정 배율에서 대표적인 영역으로부터 취하였다.

HF 형태형성의 분석을 위해 동물의 털을 뽑은 후 15일에 동물을 안락사시켰다. 형태형성의 상이한 단계에서의 모낭의 백분율을 Muller-Rover 등에 의해 기술된 바와 같이(Journal of Investigative Dermatology (2001) 117, 3-15) 쥐 HF 형태학적 범주의 허용된 기준을 토대로 평가하였다. 6 내지 10마리의 DHT-처리된 동물로부터 얻어진 적어도 24개의 세로 방향으로 절단된 HF 단편을 분석하였다. DHT-처리된 피부에서 PEDF 펩티드-의존성 퇴행기 지연을 증명하기 위하여 하나의 대표적인 피부 단편의 5 내지 7개의 연속적인 현미경 영역을 취하여 컴퓨터-보조 영상 분석기(Adobe Photoshop CS3 10.0)를 사용하여 하나로 합쳤다.

면역염색을 위해 파라핀 제거된 조직 단편을 10% 염소 혈청으로 1시간 동안 차단하였다. 이중 염색을 c-kit에 대한 일차 항체(1:100 희석; 적색) 및 티로시나제에 대한 일차 항체(1:100 희석)를 사용하여 37℃에서 2시간 동안 시행한 후, 이어서 로다민-포합 염소 항-토끼 IgG 항체(1:500 희석)와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 헤마톡실린으로 약 7분 동안 대비염색하였다(파란색).

비모난포 크리오섹션을 PBS로 3회 세척하였다. 포르말린으로 고정하고, 파라핀에 박은 피부 시편을 자일렌으로 파라핀을 제거하고, 등급별 시리즈의 에탄올로 다시 수화하였다. 그런 다음 단편들을 TdT-중재된 dUTP 닉-단부 표지화(TUNEL)-기초 키트(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)로 제조자의 지시를 따라 염색하였다. 세포 수를 Hoechst 33258로 대비염색함(파란색)으로써 모니터하였다. 핵을 3개의 상이한 챔버의 10개의 무작위로 선택된 영역에서 Zeiss 에피형광 현미경(400x, 10 영역/샘플)에 의해 계산하였다. 사진을 Zeiss 소프트웨어에 기록하였다.

세포를 4% 파라폼알데하이드로 고정한 후, 저온 메탄올에 2분 동안 노출시킨 다음, 1N HCl로 실온에서 1시간 동안 처리한 후, 면역형광을 수행하였다. BrdU-표지된 DNA를 다클론성 항-BrdU 항체 및 로다민-포합된 당나귀 항-토끼 IgG에 의해 검출하였다.

동물연구를 위하여, BrdU를 DMSO에 스톡(80mM)으로서 재구성하였다. 90㎕의 PBS와 혼합한 10㎕의 BrdU를 마우스의 복강에 주사하고, 16시간 후에 안락사시켰다. 포르말린-고정되고, 파라핀에 박은 피부 시편들을 자일렌으로 파라핀을 제거하고 등급별 시리즈의 에탄올로 다시 수화한 다음 면역조직화학을 수행하였다. 비모난포 크리오섹션을 PBS로 3회 세척한 다음, 이어지는 면역조직화학을 위해 1N HCl에 실온에서 1시간 동안 노출시켰다.

세포 배양

마우스 비모난포를 다음과 같이 배양하였다. 간단히 설명하면, 휘스커 패드를 마우스 얼굴로부터 절단해 내어 PBS와 1% 항생물질 혼합물을 함유하고 있는 페트리 접시에 옮겼다. 성장기에 있는 각각의 비모난포를 휘스커 패드로부터 분리하여 인슐린(10㎍/ml), 하이드로코르티손(10ng/ml, Sigma-Aldrich), 1% 페니실린/스트렙토마이신 항생물질 혼합물 및 L-글루타민(2mM)이 첨가된 DMEM 중에서, 24-웰 배양 플레이트(웰당 3개의 비모난포)를 사용하여 배양하고 37℃, 5% CO₂ 중에서 인큐베이션하였다. 10 내지 15개의 HF를 각 실험 그룹에서 연구하였고, 3회 반복하였따. DMSO에 녹인 DHT와 PEDF 펩티드를 인슐린과 하이드로코르티손이 첨가된(DMSO의 최종 농도는 0.05% 미만이었다) HF 배양에 첨가하였다.

불멸화된 인간 케라틴 생성세포 셀라인(HaCaT)을 37℃에서 10% FBS-DMEM 중에서 배양하였다. PEDF 펩티드 및 재조합 인간 TGF31(R&D Systems)로의 처리를 5% FBS-DMEM에 시딩한 세포에 대해 수행하였다.

통계학

결과들을 평균±평균의 표준 오차(SEM)로서 표시하였다. 통계학적 비교를 위해 1-방향 ANOVA를 사용하였다. P<0.05를 다른 표시가 없는 한 유의미한 것으로 간주하였다.

실시예 1

PEDF 펩티드는 화학요법에 의해 유도된 모발 손실 및 탈색소를 방지/개선한다

보통의 검은색 털을 가진(즉 매우 진한 흑색의 말단 모간을 가진) 생후 6주의 암컷 C57BL/6 마우스를 이 실시예에서 사용하였다. 4개의 독립적인 실험에서, 총 80마리의 마우스를 사용하였다. C57BL-6 마우스는 화학요법에 의해 유도된 탈모증 및 모발-탈색소의 연구에 광범위하게 사용되어 왔다. 모발 주기의 휴식 단계(휴지기)에 있는 마우스들만을 이 연구에서는 사용하였다. 마우스에서 색소 생성(멜라닌 형성)은 성장기 모낭에서 집중적으로 일어나기 때문에, 휴지기 C57BL-6 마우스들은 균질하게 분홍색인 그것들의 등피부에 의해 인식할 수 있었다. 성장기를 털뽑기에 의해 휴지기 마우스의 등피부에서 유도하였다.

정확히 동일한 단계의 성장기 발달단계에 있는 마우스들을 얻기 위하여, 등쪽 털을 조심스럽게 전기 면도기로 깎았다. 털뽑기 후 9일 후에, 털은 분홍색(휴지기 피부)으로부터 회색(성장기 VI의 초기 단계)으로 바뀐 피부 색에 의해 판단되는 바 성장 단계로 돌입하였다.

털뽑기 후 9일째에, 마우스를 졸레틸(6mg/kg)과 자일라진(3mg/kg)의 혼합물을 복강 내 주사함으로써 안락사시켰다. 마우스들을 무작위로 다음의 실험 그룹으로 배정하였다. CYP/비히클 그룹에서는 마우스들에게 사이클로포스파미드(CYP, 항암 약물)(150mg/kg)를 복강 내 주사하고, 350mg의 항생물질 연고를 동시에 등 피부에 발라주었다. CYP/44-량체 그룹에서는 마우스들에게 CYP(150mg/kg)를 복강 내 주사하고 44-량체 PEDF를 함유하고 있는 350mg의 항생물질 연고를 동시에 등 피부에 발라주었다. 비히클 그룹 및 44-량체 그룹에서는, 마우스들에게 CYP를 복강 내 주사하고, 350mg의 항생물질 연고와 44-량체 PEDF를 함유하고 있는 350mg의 항생물질 연고로 각각 처리하였다. 그런 다음 350mg의 항생물질 연고(44-량체 PEDF가 있거나 없음)를 마우스들에게 7일 동안 매일 등 피부에 발라주었다. 블랭크 대조표준을 위해, 마우스들에게 CYP를 주사나 항생물질 연고 도포를 하지 않았다.

도 1은 털뽑기 후 9일째에(즉 CYP 주사 후 0일) 각 그룹의 마우스들의 사진, 털뽑기 후 16일째에(즉 CYP 주사 후 7일) 각 그룹의 마우스들의 사진 및 털뽑기 후 45일째에(즉 CYP 주사 후 36일) 각 그룹의 마우스들의 사진을 각각 보여준다. CYP/비히클 및 CYP/44-량체 그룹의 마우스들을 비교함으로써, 본 발명자들은 44-량체 마우스가 각각 CYP 주사 후 7일과 36일에 더 좋은 모발 성장 활동을 나타낸 것을 주지하였다.

마우스에게 150mg/kg의 CYP를 투여하는 것은 모낭 파괴뿐 아니라 케라틴 생성세포의 아폽토시스를 유발할 것으로 알려져 있다. 그러므로, 아폽토시스 세포를 염색하기 위해 TUNEL 염색을 수행하여 PEDF 펩티드가 케라틴 생성세포에 미치는 보호 효과를 평가하였다. 도 2는 대표적인 형광 영상을 보여주고 정량적인 결과를 표 1에 요약한다. TUNEL-포지티브 세포의 표지화 지수(%)를 핵을 가진 세포의 총 수에 의해 나눈 표지된 세포의 수로서 계산하였다.

처리	TUNEL 표지화 지수(%)
CYP/비히클	19.3±1.7
CYP/44-량체	10.6±1.4*
비히클	<0.1
44-량체	<0.1

*P < 0.0005 (대 CYP/비히클 그룹).

이들 결과는 44-량체-함유 연고로 처리된 마우스에서 아폽토시스성 TUNEL-포지티브 세포가, 비히클 연고만으로 처리된 마우스와 비교할 때 상당히 감소되었음을 나타냈다. 그러므로, PEDF 펩티드의 투여는 케라틴 생성세포를 화학요법제(예컨대 CYP)에 의해 유발된 손상에 대해 보호할 수 있고, 그로써 화학요법에 의해 유발된 모발 손실을 방지 및/또는 개선할 수 있는 것으로 여겨진다.

멜라노사이트 줄기 세포는 멜라닌 모세포 및 멜라노사이트와 같은 분화된 자손을 모근에 공급하고, 그 자손들의 분화주기를 조절하는 데 기여한다. 최근의 연구는 꼭 맞는 자리에서(in the niche) 성숙한 멜라노사이트로의 MSC의 비정상적인 분화가 MSC의 손실 및 비가역적인 모발 새치를 유도하는 것을 나타냈고; 이런 현상은 "이소적으로 색소침착된 멜라노사이트(EPM)"로 언급된다.

모구에 존재하는 멜라닌만이 모간을 색소침착시킬 수 있다. 구체적으로, 모구의 멜라닌에 의해 생성된 멜라닌 과립은 케라틴 생성세포로 수송될 수 있고, 그로써 색소침착된 모발이 생성될 수 있다. 더욱이, 완전히 분화된 멜라노사이트가 퇴행기 중에 아폽토시스를 진행하고 모낭으로부터 제거될 것이다. 모낭이 파괴적인 영양실조성 성장기를 경험할 때, 성장기 모낭의 멜라닌 수준은 비정상적으로 감소할 것이고 멜라닌 분포는 들쭉날쭉하여, 결국 멜라닌 응집이 일어난다. 영양실조성 퇴행기를 경험하는 모발의 경우, 멜라닌은 모구 외의 곳에서 응집할 것이다.

도 1을 참조하자면, CYP 주사 후 36일에 CYP 및 CYP/비히클 그룹의 마우스들은 더 많은 회색과 백색 털을 가진 반면, CYP/44-량체 그룹의 마우스들은 실질적으로 더 진한 털을 가졌다. 그 결과는 CYP 및 CYP/비히클 그룹에서, MSC가 CYP에 의해 손상될 수 있고, 따라서 그것들은 멜라닌 생성을 위한 충분한 멜라노사이트를 공급할 수 없었음을 시사한다.

MSC의 활성을 멜라노사이트 계통 마커(c-kit) 및 티로시나제의 발현에 의해 평가하였다. 도 3을 참조하면, 면역염색 분석은 c-kit 및 티로시나제 발현이 CYP/비히클 그룹에서 마우스의 벌지에서 드물게 검출된 것을 나타냈고, 그것은 벌지에서의 MSC 활성이 상대적으로 낮은 것을 가리킨다. 대조적으로, c-kit 및 티로시나제 발현은 CYP/44-량체 그룹의 마우스의 벌지에서 발견되었다. 이들 데이터를 함께 취합하면, 본 발명의 PEDF 펩티드가 CYP에 의해 유발된 손상에 대해 MSC를 보호하는 데 효과적임을 시사한다.

결론적으로, 실시예 1의 결과는 44-량체 PEDF 펩티드가 CYP에 의해 유발된 모낭, 멜라닌 군집 및 모낭 세포와 케라틴 생성세포의 아폽토시스의 소형화를 감소시키는데 효과적임을 증명한다. 그러므로, 44-량체 PEDF 펩티드는 화학요법에 의해 유도된 모발 손실 및/또는 모발 탈색소를 방지 및/또는 개선할 수 있다. 더욱이, 본 발명자들의 선행 연구 및 아래의 실시예 3에서 제공된 실시예는 44-량체로부터 유도된 39-량체 PEDF 및 그 39-량체 PEDF로부터 유도된 여러 짧은 PEDF 펩티드들의 생리적 활성이 44-량체의 그것과 유사한 것을 나타냈다. 그러므로 본 발명자들은 SEQ ID NO:1(39-량체), SEQ ID NO:2(34-량체), SEQ ID NO:3(29-량체), SEQ ID NO:5 (24-량체), SEQ ID NO:6(20-량체), SEQ ID NO:8(MO 29-량체) 및 SEQ ID NO:9(MO 20-량체)를 포함하여 이들 짧은 합성 PEDF 펩티드가 또한 화학요법에 의해 유도된 탈모증 및/또는 모발 탈색소를 치료하는 데 효과적이라고 추론하였다.

실시예 2

PEDF 펩티드는 스트레스에 의해 유도된 모발 손실 및 탈색소를 방지/개선한다

다양한 환경적 및 내인성 요인들, 예를 들면 자외선 복사선, 염증 또는 심리정서는 산화성 스트레스를 유발하고, 그것은 다시 노화 과정을 가속화하는 것으로 알려져 있다. 또한 대상의 유전자 구성도 그/그녀의 이들 요인들에 대한 내성에 영향을 미칠 수 있다. 선행 연구는 노화된 모낭 내에 수 마이크로몰의 수소 과산화물이 있음을 밝혀냈다. 또한 동물 모델에서 내인성 산화성 스트레스가 모낭의 멜라노사이트의 아폽토시스를 증가시킬 것이고, 궁극적으로 모발 새치를 유도한다는 것이 확인되었다.

이 실시예에서는, 내인성 도전(예컨대 산화제)에 의해 유발된 스트레스와 모발 손실 및 모발 새치 사이의 관계를 연구하였다. 상기 실시예 1에서 기술한 것과 같이, 마우스들을 선택하고 털을 뽑았다. 털뽑기 후 9일째에 마우스들에게 10ml/kg체중의 용량으로 수소 과산화물을 피하 주사하였다. 비교로서, 44-량체 PEDF가 있거나 없는 350mg의 항생물질 연고를 각각 H2O2/비히클 및 H2O2/44-량체 그룹의 마우스들의 등 피부에 발라주었다.

도 4는 털뽑기 후 9일째(즉 H₂O₂ 주사 후 0일)의 각 그룹의 마우스 및 털뽑기 후 31일째(즉 H₂O₂ 주사 후 22일)의 각 그룹의 마우스의 사진을 각기 보여준다. H₂O₂/비히클 및 H₂O₂/44-량체 그룹의 마우스들을 비교함으로써, H₂O₂/44-량체 마우스들이 H₂O₂ 주사 후 22일에 더 좋은 모발 성장 활성을 나타냈음을 알 수 있다. 또한 모발 색은 25μM의 44-량체 PEDF를 함유한 항생물질 연고로 처리된 마우스에서 더 진하였다. 그러므로, 44-량체 PEDF가 스트레스(예컨대 산화성 스트레스)에 의해 유발된 모발 손실 및/또는 모발 탈색소를 방지 및/또는 개선하는 데 효과적이다.

나아가, 본 발명자들의 선행 연구 및 아래의 실시예 3이 나타내는 것과 같이, 44-량체 PEDF로부터 유도된 여러 짧은 PEDF 펩티드의 생리적 활성은 44-량체의 그것과 유사하다. 그러므로 결과들은 SEQ ID NO:1(39-량체), SEQ ID NO:2(34-량체), SEQ ID NO:3(29-량체), SEQ ID NO:5(24-량체), SEQ ID NO:6(20-량체), SEQ ID NO:8(MO 29-량체) 및 SEQ ID NO:9(MO 20-량체)를 포함하여 이들 짧은 합성 PEDF 펩티드가 또한 스트레스에 의해 유도된 탈모증 및/또는 모발 탈색소를 치료하는 데 효과적인 것을 나타낸다.

실시예 3

PEDF 펩티드는 안드로겐성 탈모증을 방지/개선한다

안드로겐성 탈모증에 미치는 본 발명의 PEDF 펩티드의 효과를 평가하기 위하여 시험관 내 및 생체 내 분석을 수행하였다.

실시예 3.1

PEDF 펩티드는 시험관 내에서 DHT 에 의해 유도된 케라틴 생성세포의 성장 정지 및 아폽토시스를 길항한다

각각의 PEDF 펩티드(29-량체, 24-량체, 20-량체 또는 Mo 20-량체)를 수컷 마우스의 비모 모낭(HF)의 기관 배양에 16시간 동안 첨가한 후, 100nM의 DHT를 추가로 48시간 동안 첨가하였다. 고배율에서의 조직학적 분석은 DHT가 미처리 HF에 비교하여, 모기질의 세포 해체 및 멜라닌 군집을 유발하였음을 나타냈다(도 5). 대조적으로, 20-량체 PEDF-예비처리된 HF의 모기질의 대부분의 영역은 규칙적으로 배열된 케라틴 생성세포 및 훨씬 더 적은 비정상 멜라닌 입자를 가졌다(도 5).

크리오섹션의 TUNEL- 및 BrdU-포지티브 세포의 면역검출을 사용하여 HF 상피에서의 아폽토시스 및 증식 활성을 각각 평가하였다. 정량 결과를 표 2에 요약한다. TUNEL- 및 BrdU-포지티브 세포의 표지화 지수(%)를 핵을 가진 세포의 총수로 나눈 표지된 세포의 수로서 계산하였다.

처리	TUNEL 표지화 지수(%)	BrdU 표지화 지수(%)
미처리	1.7±0.76	15.8±2.08
DHT/비히클	28.5±4.90*	9.0±1.92#
DHT/29-량체	5.8±2.12**	22.6±2.42##
DHT/24-량체	6.5±2.43**	22.0±3.69##
DHT/20-량체	6.8±1.68**	23.6±4.56##
DHT/Mo 20-량체	7.3±1.75**	24.6±2.56##
DHT/18-량체	26.2±4.21	8.4±1.21

*P<0.00001 (대 미처리 그룹); **P<0.00007 (대 DHT/비히클 그룹).

#P<0.05 (대 미처리 그룹); P<0.002 (대 DHT/비히클 그룹).

표 2에서 알 수 있는 것과 같이, 모기질의 시험관 내 자발적인 케라틴 생성세포 아폽토시스는 매우 낮은 반면(1.7±0.76%; 미처리 그룹), 100nM의 DHT(28.5±4.90%; DHT/비히클 그룹)의 존재 하에 모유두 진피 세포(DP)를 둘러싸고 있는 케라틴 생성세포에서 상당한 세포 사멸이 관찰되었다. 또한, 본 발명의 PEDF 펩티드(예컨대 29-량체, 24-량체, 20-량체 및 Mo 20-량체)로 처리된 비모는 비히클 또는 18-량체 PEDF 펩티드로 처리된 비모와 비교하여, 훨씬 더 적은 TUNEL-포지티브 케라틴 생성세포를 나타냈다. 이들 결과는 본 발명의 PEDF 처리가 DHT에 의해 유도된 케라틴 생성세포 아폽토시스의 감소에 효과적임을 시사하였다.

표 2의 결과는 또한 모기질의 케라틴 생성세포의 세포 분할이 미처리된 HF와 비교하여 DHT에 의해 억제되었음을 나타냈다(DHT/비히클: 9.0±1.92% 대 미처리: 15.8±2.08%). 다른 한편으로, 본 발명의 PEDF 펩티드로 처리된 세포에 대해 더 높은 BrdU 표지화 지수는 본 발명에 의한 모낭 케라틴 생성세포의 증식성 활성의 개선을 가리켰다.

DHT는 모유두 진피 세포(DPC)에서 변환 성장 인자-β1(TGF-β1)의 발현을 유도하고, TGF-β1은 안드로겐성 탈모증을 가진 대상의 모발 성장 및 모낭의 케라틴 생성세포를 억제할 것으로 알려져 있다. PEDF-유도된 펩티드가 DHT-중재된 성장 억제로부터 케라틴 생성세포를 보호할 수 있는지를 추가로 확인하기 위하여, TGF-β1 및 PEDF-유도된 펩티드에 대한 반응으로 인간 상피 케라틴 생성세포(HaCaT)의 세포 분할을 BrdU 통합에 의해 평가하였다. 정량적 결과를 표 3에 요약한다. BrdU-포지티브 세포의 표지화 지수(%)를 핵을 가진 세포의 총수로 나눈 표지된 세포의 수로서 계산하였다.

처리	BrdU 표지화 지수(%)
미처리	23.6±2.84
TGF-β1	9.9±2.23*
20-량체	23.3±2.46
TGF-β1 + 20-량체	32.3±3.70**

*P<0.002 (대 미처리 세포); **P<0.0001 (대 TGF-β1 처리 세포).

표 3에서 알 수 있는 것과 같이, HaCaT의 TGF-β1(4ng/ml, 24시간)으로의 처리는 미처리 세포와 비교하여 실질적으로 BrdU-포지티브 세포의 수준을 감소시켰다. 그러나, TGF-β1 + 20-량체 처리 그룹에서 TGF-β1은, 세포를 20-량체로 16시간 동안 예비처리하였을 때 HaCaT의 증식성 활성을 억제할 수 없었다.

이들 결과를 함께 취합하면, PEDF-유도된 펩티드는 케라틴 생성세포에 미치는 DHT(및 TGF-β1)의 항-증식성 효과를 차단할 수 있다.

실시예 3.2

PEDF 펩티는 생체 내에서 DHT 에 의해 유도된 퇴행기 발달을 지연시킨다

생체 내 분석을 위해, 5α-다이하이드로테스토스테론(DHT) 동물 모델을 사용하였다. 모발 주기가 휴지기 단계에 있는 생후 6주 된 수컷 C57BL/6 마우스들(체중 15 내지 20g)을 용융 왁스/로진 혼합물(1:1)을 사용하여 일반적인 마취 하에 털을 뽑고, 성장 단계를 유도하였다. DHT를 DMSO에 녹여 50mg/ml 스톡 용액을 만들었다. 털뽑기 후 11일째에, 마우스들(실험 조건당 6 내지 10마리)을 면도한 등 영역에 DHT 용액(30mg/kg 체중; 마우스당 200㎕의 올리브유에 혼합된 1.5mg의 DHT)으로 피하 주사하였다. DHT 주사 후, 350mg의 비히클 겔 또는 25μM의 PEDF 펩티드(29-량체, 24-량체, 20-량체 또는 18-량체)를 함유하는 겔을 마우스의 등 피부에 3일 동안 하루에 1회 국소 적용하였다.

도 6에 제시한 것과 같이, 털뽑기 후 15일(즉 DHT 주사 후 4일)에 수행한 조직학적 분석은, DHT로 처리되지 않은(미처리 그룹) 마우스로부터의 HF는 성장기 및 자연스러운 퇴행기 개시로 구성된 반면, DHT/비히클 및 DHT/18-량체 마우스의 HF는 예상했던 것과 같이 퇴행기에 들어갔음을 나타냈다. 대조적으로, 29-량체 및 20-량체로 처리된 마우스들의 HF는 대부분 성장 단계에 있었는데, 이것은 DHT에 의해 증강된 퇴행기 진전이 차단되었음을 가리킨다. 각 실험 그룹에서 각 주기 단계에서의 모낭의 백분율과 관련된 정량적 평가를 표 4에 요약한다.

	단계 (%)
처리	성장기- 퇴행기 I	퇴행기 II - III	퇴행기 IV -V	퇴행기 VI - VIII
미처리	58.3±1.7	28.85±2.95	17.35±1.25	0±0
DHT/비히클	7.85±2.75*	13.0±4.0	54.65±3.05	34.5±3.7
DHT/29-량체	39.85±1.35**	37.8±1.3	19.15±2.05	3.2±0.6#
DHT/20-량체	39.0±2.8**	33.95±1.25	23.6±1.8	3.45±0.25#
DHT/18-량체	9.7±1.8	13.85±1.75	53.05±0.85	23.4±4.4

*P<0.001 (대 미처리 그룹); **P<0.02 (대 DHT/비히클 그룹).

#P<0.005 (대 DHT/비히클 그룹).

표 4의 데이터는 DHT/29-량체, DHT/24-량체 및 DHT/20-량체 그룹에서 상당히 더 높은 백분율의 모낭이 성장기 및 초기 퇴행기(퇴행기 I 내지 III)에서 발견되었음을 나타냈다. 다른 한편으로, 비히클 또는 18-량체로 처리된 마우스의 대부분의모낭은 중간 및 후기 퇴행기(퇴행기 IV 내지 VIII)에 있었다.

상기 조직형태 계측학적 분석을 확인하기 위하여, BrdU 및 TUNEL 염색을 털뽑기 후 15일에 수행하였다. 정량적인 결과를 표 5에 요약하였다. 모기질(HM) 및 외모근초(ORS)의 TUNEL-포지티브 세포의 수를 모낭당 TUNEL-포지티브 세포로서 표시하였다. 모근(HB)의 BrdU-포지티브 세포의 표지화 지수(%)를 핵을 가진 세포의 총수로 나눈 표지된 세포의 수로서 계산하였다.

처리	HM 및 ORS 에서 TUNEL -포지티브 세포/ HF	HB 에서 BrdU 표지화 지수(%)
미처리	0.30±0.15	43.4±3.38
DHT/비히클	7.5±1.5*	26.4±2.92#
DHT/29-량체	0.57±0.34**	44.89±2.95##
DHT/24-량체	0.73±0.46**	46.9±2.57##
DHT/20-량체	0.71 +0.30**	45.2±2.47##
DHT/18-량체	7.6±1.5	25.6±2.52

*P<0.0002 (대 미처리 그룹); **P<0.007 (대 DHT/비히클 그룹).

#P<0.002 (대 미처리 그룹); ##P<0.004 (대 DHT/비히클 그룹).

미처리 및 DHT/비히클 그룹을 비교함으로써, 성장기 근처의 HF에서 증식 활성의 증가와 함께 모기질 및 외모근초(ORS)의 TUNEL-포지티브 세포의 극적으로 증가된 양에 의해 증명되는 것과 같이, DHT 주사가 퇴행기 발달을 증강시켰음을 관찰하였다. 20-량체, 24-량체 또는 29-량체로 처리된 DHT-주사된 마우스에서, 마우스들은 HF 및 BrdU-포지티브 케라틴 생성세포의 조밀한 클러스터당 거의 TUNEL-포지티브 세포를 갖지 않았고(1 미만), 그것은 본 발명의 PEDF 펩티드가 모낭 퇴행에 미치는 DHT 효과를 길항하는 것을 확인해주었다.

종합적으로, DHT-유도된 퇴행기 전이는 모낭의 케라틴 생성세포의 세포 증식 정지 및 아폽토시스로부터 증명되는 것과 같이, 본 발명의 PEDF-유도된 펩티드(예컨대 29-량체, 24-량체 및 20-량체)를 사용한 국소 적용에 의해 차단된다. 이들 결과는 본 발명의 PEDF-유도된 펩티드가 DHT-유도된 미성숙 성장기의 퇴행기 전이를 지연시킬 수 있음을 확인해준다.

실시예 3.3

PEDF 펩티드는 생체 내에서 모낭의 발달을 지속시킨다

모발 성장을 지연시키는 것에 미치는 PEDF 펩티드의 효과를 평가하기 위하여, C57BL/6 마우스들을 실시예 3.2에서 기술한 것과 같이 털을 뽑았다. 털뽑기 후 11일에 마우스들(각 실험 조건당 6 내지 10마리 마우스)을 DHT 용액(200㎕의 올리브유에 혼합된 1.5mg의 DHT)으로 면도한 등 영역에 피하 주사(30mg/kg 체중)한 후, 마우스에 연구 과정 동안 일주일에 2회 DHT로 주사하였다. 첫 번째 DHT 주사 후에, 350mg의 비히클 겔 또는 25μM의 PEDF 펩티드(29-량체, 24-량체, 20-량체 또는 18-량체)를 함유하는 겔을 14일 동안 하루에 한 번 마우스의 등 피부에 국소 적용하였다. 털 코트의 변화를 디지털 카메라로 사진을 촬영함으로써 기록하고(도 7), 검어진(재성장 털) 면도한 영역의 백분율을 측정하였다. DHT 주사 후 모발 재성장의 기록을 다음 척도를 사용하여 평가하였다: 0, 0% (털 성장 없음); 1, <20%; 2, 20 내지 39%; 3, 40 내지 59%; 4, 60 내지 79%; 5, 80 내지 100%. 피하 조직의 단위 길이(1mm)당 모근의 수를 상기에서 기술한 것과 같이 계수하였다. 그 결과를 표 6에 요약하였다.

처리	털 성장 기록	모근의 수/ mm 깊이 피하조직
미처리	5±0	8.8±0.58
DHT/비히클	1.75±0.45*	4.4±0.51†
DHT/29-량체	3.75±0.37**	7.4±1.03††
DHT/24-량체	4.13±0.40**	7.2±1.07††
DHT/20-량체	4.25±0.25**	6.8±1.24††
DHT/18-량체	1.88±0.40	4.8±0.86

*P<0.0001 (대 미처리 그룹); **P<0.02 (대 DHT/비히클 그룹).

†P<0.0005 (대 미처리 그룹); ††P<0.002 대 DHT/비히클 그룹).

도 7 및 표 6의 결과는 모발 주기의 성장기(성장기)가 등 피부에서 털뽑기에 의해 유도되었음을 나타냈다.

대조적으로, DHT/비히클 및 DHT/18-량체 그룹은 털뽑기 후 18일에도 모발 재성장의 현저한 지연을 나타냈고; 이것은 안드로겐성 탈모증의 잘-허용된 동물 모델의 예상된 발견이다. 다른 한편으로, 29-량체, 24-량체 또는 20-량체를 매일 적용하는 처리를 받은 DHT-주사된 마우스는 털 재성장 및 발생한 실질적인 털 성장의 지연의 개선을 나타냈다. 통계학적 분석의 결과는 29-량체, 24-량체 또는 20-량체로 처리된 DHT-주사된 마우스가 털뽑기 후에 DHT/비히클 대조 그룹보다 더 좋은 성장 기록을 나타냈음을 보여주었다.

표 6을 참조하면, 29-량체, 24-량체 또는 20-량체 중 어느 하나로 처리된 마우스에서 비히클 또는 18-량체로 처리된 마우스들과 비교하여, 모근의 상당히 증가된 총수(1.6-배)가 발견되었다. 이들 결과는 상당한 수의 HF가 DHT의 영향을 벗어났고, 본 발명의 PEDF 펩티드의 보호 효과 하에 성장기로 이동하였음을 시사하였다.

결론적으로, 실시예 3(실시예 3.1 내지 3.3을 포함함)에서 나타낸 데이터는 본 발명의 PEDF 펩티드가 DHT에 의해 유도된 모발 손실을 치료하는 데 효과적이었음을 증명하였다. 그러므로 PEDF 펩티드의 국소 투여는 안드로겐성 탈모증에 의해 유발된 모발 손실을 방지 또는 개선할 수 있을 것이다.

본 발명은 첫째 짧은 합성 PEDF 펩티드의 국소 적용이 모낭에 치료적 효과를 나타내는 지를 증명하는 것이다. 전체 길이의 PEDF 펩티드를 발현하는 벡터의 종래의 정맥 내 또는 근육 내 전달과 비교하여, 짧은 합성 PEDF 펩티드의 국소 전달은 안전하고 덜 비싼 접근법이다.

상기 구체예들의 설명은 실례로만 제공된 것이고, 다양한 변형이 해당 기술분야의 숙련자들에 의해 이루어질 수 있다는 것이 인지될 것이다. 상기 명세서, 실시예 및 데이터는 본 발명의 예시적인 구체예의 구성 및 사용의 완전한 설명을 제공한다. 본 발명의 다양한 구체예들이 상기에서 특정 정도의 구체성으로, 또는 하나 또는 더 많은 개별적인 구체예들을 참조로 기술되긴 하였지만, 해당 기술분야의 숙련자들은 본 발명의 사상 또는 범주로부터 벗어나지 않으면서 개시된 구체예들에 대해 많은 변화를 만들 수 있을 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> TSAO, YEOU-PING HO, TSUNG-CHUAN <120> USE OF PEDF-DERIVED POLYPEPTIDES FOR TREATING ALOPECIA AND/OR HAIR DEPIGMENTATION <130> P2693-1-PCT <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 1 Leu Ser Val Ala Thr Ala Leu Ser Ala Leu Ser Leu Gly Ala Glu Gln 1 5 10 15 Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu Tyr Tyr Asp Leu Ile Ser 20 25 30 Ser Pro Asp Ile His Gly Thr 35 <210> 2 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 2 Ala Leu Ser Ala Leu Ser Leu Gly Ala Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile 1 5 10 15 Ile His Arg Ala Leu Tyr Tyr Asp Leu Ile Ser Ser Pro Asp Ile His 20 25 30 Gly Thr <210> 3 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 3 Ser Leu Gly Ala Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Tyr Asp Leu Ile Ser Ser Pro Asp Ile His Gly Thr 20 25 <210> 4 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 4 Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu Tyr Tyr Asp Leu 1 5 10 15 Ile Ser Ser Pro Asp Ile His Gly Thr 20 25 <210> 5 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 5 Ser Leu Gly Ala Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Tyr Asp Leu Ile Ser Ser Pro 20 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 6 Ser Leu Gly Ala Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Tyr Asp Leu 20 <210> 7 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 7 Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu Tyr Tyr Asp Leu 1 5 10 15 Ile Ser <210> 8 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 8 Ser Leu Gly Ala Glu His Arg Thr Glu Ser Val Ile His Arg Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Tyr Asp Leu Ile Thr Asn Pro Asp Ile His Ser Thr 20 25 <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 9 Ser Leu Gly Ala Glu His Arg Thr Glu Ser Val Ile His Arg Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Tyr Asp Leu 20 <210> 10 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 10 Val Leu Leu Ser Pro Leu Ser Val Ala Thr Ala Leu Ser Ala Leu Ser 1 5 10 15 Leu Gly Ala Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu Tyr 20 25 30 Tyr Asp Leu Ile Ser Ser Pro Asp Ile His Gly Thr 35 40 <210> 11 <211> 418 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Gln Ala Leu Val Leu Leu Leu Cys Ile Gly Ala Leu Leu Gly His 1 5 10 15 Ser Ser Cys Gln Asn Pro Ala Ser Pro Pro Glu Glu Gly Ser Pro Asp 20 25 30 Pro Asp Ser Thr Gly Ala Leu Val Glu Glu Glu Asp Pro Phe Phe Lys 35 40 45 Val Pro Val Asn Lys Leu Ala Ala Ala Val Ser Asn Phe Gly Tyr Asp 50 55 60 Leu Tyr Arg Val Arg Ser Ser Thr Ser Pro Thr Thr Asn Val Leu Leu 65 70 75 80 Ser Pro Leu Ser Val Ala Thr Ala Leu Ser Ala Leu Ser Leu Gly Ala 85 90 95 Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu Tyr Tyr Asp Leu 100 105 110 Ile Ser Ser Pro Asp Ile His Gly Thr Tyr Lys Glu Leu Leu Asp Thr 115 120 125 Val Thr Ala Pro Gln Lys Asn Leu Lys Ser Ala Ser Arg Ile Val Phe 130 135 140 Glu Lys Lys Leu Arg Ile Lys Ser Ser Phe Val Ala Pro Leu Glu Lys 145 150 155 160 Ser Tyr Gly Thr Arg Pro Arg Val Leu Thr Gly Asn Pro Arg Leu Asp 165 170 175 Leu Gln Glu Ile Asn Asn Trp Val Gln Ala Gln Met Lys Gly Lys Leu 180 185 190 Ala Arg Ser Thr Lys Glu Ile Pro Asp Glu Ile Ser Ile Leu Leu Leu 195 200 205 Gly Val Ala His Phe Lys Gly Gln Trp Val Thr Lys Phe Asp Ser Arg 210 215 220 Lys Thr Ser Leu Glu Asp Phe Tyr Leu Asp Glu Glu Arg Thr Val Arg 225 230 235 240 Val Pro Met Met Ser Asp Pro Lys Ala Val Leu Arg Tyr Gly Leu Asp 245 250 255 Ser Asp Leu Ser Cys Lys Ile Ala Gln Leu Pro Leu Thr Gly Ser Met 260 265 270 Ser Ile Ile Phe Phe Leu Pro Leu Lys Val Thr Gln Asn Leu Thr Leu 275 280 285 Ile Glu Glu Ser Leu Thr Ser Glu Phe Ile His Asp Ile Asp Arg Glu 290 295 300 Leu Lys Thr Val Gln Ala Val Leu Thr Val Pro Lys Leu Lys Leu Ser 305 310 315 320 Tyr Glu Gly Glu Val Thr Lys Ser Leu Gln Glu Met Lys Leu Gln Ser 325 330 335 Leu Phe Asp Ser Pro Asp Phe Ser Lys Ile Thr Gly Lys Pro Ile Lys 340 345 350 Leu Thr Gln Val Glu His Arg Ala Gly Phe Glu Trp Asn Glu Asp Gly 355 360 365 Ala Gly Thr Thr Pro Ser Pro Gly Leu Gln Pro Ala His Leu Thr Phe 370 375 380 Pro Leu Asp Tyr His Leu Asn Gln Pro Phe Ile Phe Val Leu Arg Asp 385 390 395 400 Thr Asp Thr Gly Ala Leu Leu Phe Ile Gly Lys Ile Leu Asp Pro Arg 405 410 415 Gly Pro

Claims (20)

1. 대상의 탈모증 및/또는 모발 탈색소를 치료하기 위한 합성 펩티드로서, 20 내지 44개의 아미노산 잔기의 길이와 SEQ ID NO:10에 대해 적어도 80%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지며, 이때 그 아미노산 서열은 SEQ ID NO:10의 잔기 16 내지 35에 대해 적어도 90%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 적어도 20개의 연속적인 잔기를 포함하는 합성 펩티드.
2. 제 1항에 있어서, 합성 펩티드의 적어도 4개의 연속적인 잔기는 SEQ ID NO:10의 잔기 16 내지 19에 동일한 것을 특징으로 하는 합성 펩티드.
3. 제 1항에 있어서, 탈모증은 성장기 탈모증 또는 안드로겐성 탈모증인 것을 특징으로 하는 합성 펩티드.
4. 제 1항에 있어서, 모발 탈색소는 화학요법, 방사선요법, 스트레스, 유전적 또는 노화에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 합성 펩티드.
5. 제 1항에 있어서, 대상은 인간 대상인 것을 특징으로 하는 합성 펩티드.
6. 제 1항의 합성 펩티드의 유효량; 및
   약학적으로 허용되는 담체를 포함하는,
   대상의 탈모증 및/또는 모발 탈색소를 치료하기 위한 국소용 약학적 조성물.
7. 제 6항에 있어서, 합성 펩티드의 적어도 4개의 연속적인 잔기는 SEQ ID NO:10의 잔기 16 내지 19에 동일한 것을 특징으로 하는 국소용 약학적 조성물.
8. 제 6항에 있어서, 국소용 약학적 조성물은 용액, 스프레이, 에어로졸, 발포체, 크림, 로션, 연고, 겔 또는 패치의 형태인 것을 특징으로 하는 국소용 약학적 조성물.
9. 제 6항에 있어서, 탈모증은 성장기 탈모증 또는 안드로겐성 탈모증인 것을 특징으로 하는 국소용 약학적 조성물.
10. 제 6항에 있어서, 모발 탈색소는 화학요법, 방사선요법, 스트레스, 유전적 또는 노화에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 국소용 약학적 조성물.
11. 제 6항에 있어서, 대상은 인간 대상인 것을 특징으로 하는 국소용 약학적 조성물.
12. 제 1항의 합성 펩티드의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는,
    대상의 탈모증 및/또는 모발 탈색소를 치료하기 위한 방법.
13. 제 12항에 있어서, 합성 펩티드의 적어도 4개의 연속적인 잔기는 SEQ ID NO:10의 잔기 16 내지 19에 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 12항에 있어서, 합성 펩티드는 합성 펩티드와 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 국소용 약학적 조성물로 제형되는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 14항에 있어서, 국소용 약학적 조성물은 용액, 스프레이, 에어로졸, 발포체, 크림, 로션, 연고, 겔 또는 패치의 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 14항에 있어서, 합성 펩티드는 0.1 내지 100μM의 농도로 약학적 조성물에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 16항에 있어서, 농도는 1 내지 25μM인 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 11항에 있어서, 탈모증은 성장기 탈모증 또는 안드로겐성 탈모증인 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제 11항에 있어서, 모발 탈색소는 화학요법, 방사선요법, 스트레스, 유전적 또는 노화에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 11항에 있어서, 대상은 인간 대상인 것을 특징으로 하는 방법.

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