KR20150038010A - 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩된 면역원성 폴리펩티드를 포함하는 프라임-부스팅 요법 - Google Patents

폴리누클레오티드에 의해 엔코딩된 면역원성 폴리펩티드를 포함하는 프라임-부스팅 요법 Download PDF

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알프레도 니코시아
리카도 코르테스
알렉산드라 비텔리
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Abstract

본 발명은 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하는 백신 조합물에 특히 적합한 투여 요법에 관한 것이다. 상기 투여 요법은 백신 조성물의 반복 투여를 포함하며, 면역원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증강시킨다.

Description

폴리누클레오티드에 의해 엔코딩된 면역원성 폴리펩티드를 포함하는 프라임-부스팅 요법 {NOVEL PRIME-BOOSTING REGIMENS INVOLVING IMMUNOGENIC POLYPEPTIDES ENCODED BY POLYNUCLEOTIDES}
본 발명은 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하는 백신 조성물에 특히 적합한 투여 요법에 관한 것이다. 상기 투여 요법은 백신 조성물의 반복된 투여를 포함하며, 면역원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증강시킨다.
감염성 질환은 여전히 인류에 대한 주요 위험요소이다. 감염성 질환을 예방하거나 치료하기 위한 한 방법은 백신접종에 의한 면역 반응의 인위적 유도이며, 백신접종은 각각의 항원에 대한 적합한 면역 반응이 발생하도록 개체에 항원 물질을 투여하는 것이다. 항원 물질은 구조적으로 온전하나 불활성화되거나 (즉, 비-감염성) 약화된 (즉, 저하된 감염성을 지닌) 병원체 (예를 들어, 미생물 또는 바이러스), 또는 고도로 면역원성인 것으로 밝혀진 병원체의 정제된 구성요소일 수 있다. 병원체에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 또 다른 접근법은 병원체의 면역원성 단백질 또는 펩티드를 엔코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 발현 시스템의 제공이다. 이러한 벡터는 네이키드 플라스미드 DNA 형태일 수 있거나, 면역원성 단백질 또는 펩티드는 예를 들어, 변형된 백시니아 바이러스 (예를 들어, Modified Vaccinia Ankara; MVA) 또는 아데노바이러스 벡터를 기반으로 하는 바이러스 벡터를 사용하여 전달된다. 이러한 발현 시스템은 환경 조건에 대해 낮은 민감성을 갖는 잘-특성 결정된 구성요소를 포함하는 이점을 갖는다.
벡터 기반 발현 시스템을 개발할 경우, 환자에 대한 이러한 발현 시스템의 적용이 각 병원체에 의한 감염에 대해 보호성인 면역 반응을 유도하는 것이 특정 목적이다. 그러나, 병원체에 대한 면역원성 반응 유도에도 불구하고, 일부 발현 시스템은 병원체에 의한 감염에 대해 완전히 보호하기에 충분히 강한 면역 반응을 유도할 수 없다. 따라서, 병원체에 대한 보호성 면역 반응을 유도할 수 있는 개선된 발현 시스템뿐만 아니라 증강된 면역 반응을 유도하는 공지된 발현 시스템의 신규한 투여 요법이 여전히 요구된다.
제 1 양태에서, 본 발명은
(a) 적어도 하나의 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 작제물을 포함하는 제 1 벡터를 포함하는 프라이밍 조성물 및
(b) 적어도 하나의 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 작제물을 포함하는 제 2 벡터를 포함하는 적어도 하나의 부스팅 조성물을 포함하며,
제 1 벡터에 포함된 핵산 작제물에 의해 엔코딩된 면역원성 폴리펩티드의 적어도 하나의 에피토프는 제 2 벡터에 포함된 핵산 작제물에 의해 엔코딩된 면역원성 폴리펩티드의 적어도 하나의 에피토프와 면역학적으로 동일한, 프라임-부스트 백신접종 요법에 사용하기 위한 백신 조합물로서,
(i) 프라이밍 조성물이 비내 투여되고, 후속하여 적어도 하나의 부스팅 조성물이 근육내 투여되거나;
(ii) 프라이밍 조성물이 비내 투여되고, 후속하여 적어도 하나의 부스팅 조성물이 비내 투여되거나;
(iii) 프라이밍 조성물이 근육내 투여되고, 후속하여 적어도 하나의 부스팅 조성물이 근육내 투여되거나;
(iv) 프라이밍 조성물이 근육내 투여되고, 후속하여 적어도 하나의 부스팅 조성물이 비내 투여되는, 백신 조합물에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은
(a) 적어도 하나의 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 작제물을 포함하는 벡터를 포함하는 프라이밍 조성물 및
(b) 적어도 하나의 면역원성 폴리펩티드를 포함하는 적어도 하나의 부스팅 조성물을 포함하며,
프라이밍 조성물에 포함된 핵산 작제물에 의해 엔코딩된 면역원성 폴리펩티드의 적어도 하나의 에피토프는 부스팅 조성물에 포함된 면역원성 폴리펩티드의 적어도 하나의 에피토프와 면역학적으로 동일한, 프라임-부스트 백신접종 요법에 사용하기 위한 백신 조합물로서, 프라이밍 조성물이 근육내 투여되고, 후속하여 적어도 하나의 부스팅 조성물이 투여되는 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 상세한 설명
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업자에게 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
바람직하게는, 본원에 사용된 용어는 문헌 ["A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Klbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)]에 기술된 바와 같이 정의된다.
본 명세서 및 하기 청구범위에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되는 않는 한, 단어 "포함하다" 및 "포함하는" 및 "포함하여"와 같은 변형은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군을 내포하며, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군을 배제하지 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
여러 문헌이 본 명세서의 본문 전반에 걸쳐 언급된다. 상기에 언급되어 있던지 하기에 언급되어 있던지 본원에 언급된 문헌 (모든 특허, 특허 출원, 과학 출판물, 제조업체 명세서, 설명서 등) 각각은 그 전체가 본원에 참조로서 통합된다. 본원의 어떤 것도, 본 발명이 종래 발명에 의한 그러한 공개에 선행하는 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되지 않는다. 본 발명의 일 양태의 문맥에서 본원에 제공된 모든 정의는 본 발명의 다른 양태에도 또한 적용된다.
본 발명의 근간이 되는 연구에서, 특정 투여 요법이 면역원성 펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 백신 조성물에 의해 부여된 면역을 현저하게 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 제 1 양태에서, 본 발명은
(a) 적어도 하나의 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 작제물을 포함하는 제 1 벡터를 포함하는 프라이밍 조성물 및
(b) 적어도 하나의 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 작제물을 포함하는 제 2 벡터를 포함하는 적어도 하나의 부스팅 조성물을 포함하며,
제 1 벡터에 포함된 핵산 작제물에 의해 엔코딩된 면역원성 폴리펩티드의 적어도 하나의 에피토프는 제 2 벡터에 포함된 핵산 작제물에 의해 엔코딩된 면역원성 폴리펩티드의 적어도 하나의 에피토프와 면역학적으로 동일한, 프라임-부스트 백신접종 요법에 사용하기 위한 백신 조합물로서,
(i) 프라이밍 조성물이 비내 투여되고, 후속하여 적어도 하나의 부스팅 조성물이 근육내 투여되거나;
(ii) 프라이밍 조성물이 비내 투여되고, 후속하여 적어도 하나의 부스팅 조성물이 비내 투여되거나;
(iii) 프라이밍 조성물이 근육내 투여되고, 후속하여 적어도 하나의 부스팅 조성물이 근육내 투여되거나;
(iv) 프라이밍 조성물이 근육내 투여되고, 후속하여 적어도 하나의 부스팅 조성물이 비내 투여되는, 백신 조합물에 관한 것이다.
일부 예에서, 바람직한 프라임-부스트 백신접종 요법은 (i)인데, 이는 예를 들어, 코 및 상기도에서 강한 면역 반응을 유도함으로써 특정한 효과적인 보호 면역을 제공하기 때문이다.
벡터
본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 적어도 하나의 폴리누클레오티드 또는 적어도 하나의 폴리누클레오티드와 적어도 하나의 단백질의 혼합물로서, 그 안에 포함된 폴리누클레오티드를 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 지칭한다. 벡터에 의해 포함된 적어도 하나의 폴리누클레오티드는 적어도 하나의 면역원성 단백질을 엔코딩하는 적어도 하나의 핵산 작제물을 포함하거나 이들로 구성된다. 본 발명의 핵산 작제물로 구성되거나 이를 포함하는 폴리누클레오티드 이외에, 추가적인 폴리누클레오티드 및/또는 폴리펩티드가 세포 내로 도입될 수 있다. 추가적인 폴리누클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 부가는 상기 추가적인 폴리누클레오티드 및/또는 폴리펩티드가 본 발명의 핵산 작제물을 세포 내로 도입시키는데 필요한 경우 또는 추가적인 폴리누클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 도입이 본 발명의 핵산 작제물에 의해 엔코딩된 면역원성 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 경우 특히 바람직하다.
본 발명의 문맥상, 도입된 핵산 작제물에 의해 엔코딩된 면역원성 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들은 벡터 또는 벡터들의 도입시 세포 내에서 발현되는 것이 바람직하다. 적합한 벡터들의 예로는 비제한적으로, 플라스미드, 코스미드, 파아지, 바이러스 또는 인공 크로모좀을 포함한다.
특정 바람직한 구체예에서, 본 발명의 핵산 작제물을 포함하는 제 1 및 제 2 벡터는 플라스미드, 코스미드, 파아지, 바이러스 및 인공 크로모좀으로 구성된 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 본 발명을 실시하는데 적합한 벡터는 파아지 벡터, 바람직하게는, 람다 파아지 및 필라멘트형 파아지 벡터, 또는 바이러스 벡터이다.
적합한 바이러스 벡터는 자연 발생 벡터를 기반으로 하며, 이는 또한, 비-복제로서 불리는 복제 불능으로 개질된다. 비-복제 바이러스에는 복제를 위해 트랜스 단백질의 공급이 요구된다. 전형적으로, 이러한 단백질은 바이러스 생산자 세포주에서 안정하게 또는 일시적으로 발현되어, 바이러스의 복제를 허용한다. 따라서, 바이러스 벡터는 바람직하게는, 감염성 및 비-복제성이다. 당업자는 어떻게 다양한 바이러스가 복제 불능을 띠게 하는지 인지하고 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터 (예를 들어, AAV 타입 5 및 타입 2), 알파바이러스 벡터 (예를 들어, 베네주엘라 이콰인 뇌염 바이러스 (VEE), 신드비스 바이러스 (SIN), 셈리키 삼림 바이러스 (SFV), 및 VEE-SIN 키메라), 헤르페스 바이러스 벡터 (예를 들어, 사이토메갈로바이러스, 예컨대, 리세스 사이토메갈로바이러스 (rhesus cytomegalovirus) (RhCMV) (14)로부터 유래된 벡터), 아레나 바이러스 벡터 (예를 들어, 림프구성 맥락수막염바이러스 (LCMV) 벡터 (15)), 홍역 바이러스 벡터, 폭스 바이러스 벡터 (예를 들어, 백시니아 바이러스, 개질된 백시니아 바이러스 안카라 (Modified Vaccinia Virus Ankara) (MVA), NYVAC (백시니아의 코펜하겐 균주로부터 유래됨), 및 조류폭스 (avipox) 벡터: 카나리아폭스 (ALVAC) 및 조류폭스 (FPV) 벡터), 수포성 구내염 바이러스 벡터, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 바이러스 유사 입자, 및 박테리아 스포어로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 바람직한 벡터는 아데노바이러스 벡터, 특히, 인간 또는 인간외 대형 유인원으로부터 유래된 아데노바이러스 벡터 및 폭시바이러스 벡터, 바람직하게는, MVA이다. 아데노바이러스가 유래되는 바람직한 대형 유인원에는 침팬지 (판), 고릴라 (고릴라) 및 오랑우탄 (풍고), 바람직하게는, 보노보 (판 파니스쿠스 (Pan paniscus)) 및 침팬지 (판 트로글로디테스 (Pan troglodytes))가 있다. 전형적으로, 인간외 대형 유인원의 자연 발생 아데노바이러스는 각각의 대형 유인원의 대변 샘플로부터 분리된다. 가장 바람직한 벡터는 hAd5, hAd11, hAd26, hAd35, hAd49, ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd55, ChAd63, ChAd73, ChAd82, ChAd83, ChAd146, ChAd147, PanAd1, PanAd2, 및 PanAd3 벡터를 기반으로 하는 비-복제 아데노바이러스 벡터 또는 복제-가능 Ad4 및 Ad7 벡터이다. 인간 아데노바이러스 hAd4, hAd5, hAd7, hAd11, hAd26, hAd35 및 hAd49는 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. 자연 발생 ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 및 ChAd82를 기반으로 하는 벡터는 WO 2005/071093에 상세히 기술되어 있다. 자연 발생 PanAd1, PanAd2, PanAd3, ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146, 및 ChAd147을 기반으로 하는 벡터는 WO 2010/086189에 상세히 기술되어 있다.
용어 "비-복제 아데노바이러스"는 적어도 기능 손실 또는 바리어스 복제에 필수적인 유전자 생성물 예컨대, E1, E2, E3 및 E4로부터 선택된 아데노바이러스 유전자 중 하나 이상의 완전한 제거를 포함하도록 조작되었기 때문에 복제할 수 없게 된 아데노바이러스를 지칭한다.
바람직하게는, 사용된 제 1 벡터는 아데노바이러스 벡터, 더욱 바람직하게는, 인간외 대형 유인원 예를 들어, 침팬지 또는 보노보 유래된 아데노바이러스 벡터, 특히, ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd55, ChAd63, ChAd73, ChAd82, ChAd83, ChAd146, ChAd147, PanAd1, PanAd2, 및 PanAd3를 기반으로 하는 비-복제 아데노바이러스 벡터 또는 hAd4 및 hAd7을 기반으로 하는 복제-가능 벡터이다. 가장 바람직한 벡터는 PanAd3을 기반으로 한다.
바람직하게는, 제 2 벡터는 폭시바이러스 벡터, 특히, MVA 또는 아데노바이러스 벡터, 바람직하게는, 인간외 대형 유인원 유래된 아데노바이러스 벡터이다. 바람직한 비-복제 아데노바이러스 벡터는 ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd55, ChAd63, ChAd73, ChAd82, ChAd83, ChAd146, ChAd147, PanAd1, PanAd2, 및 PanAd3 벡터 또는 복제-가능 Ad4 및 Ad7 벡터를 기반으로 한다.
제 1 및 제 2 벡터가 아데노바이러스 벡터인 경우, 제 1 및 제 2 벡터로서 면역학적으로 상이한 아데노바이러스 벡터를 사용하는 것이 때때로 바람직하다. 두 벡터 모두가 면역학적으로 동일하다면, 면역 반응의 프라이밍 동안 제 1 벡터에 대해 생성된 항체가 면역 반응을 부스팅하는데 사용된 제 2 벡터로의 환자의 형질도입을 손상시킬 잠재적인 위험이 있을 수 있다. 아데노바이러스 및, 따라서, 아데노바이러스 벡터는 전형적으로 세 개의 외피 단백질, 즉, 헥손, 펜톤 및 섬유를 포함한다. 해당 아데노바이러스에 대한 숙주의 면역학적 반응은 헥손 단백질에 의해 주로 결정된다. 따라서, 두 개의 아데노바이러스는, 두개의 아데노바이러스의 헥손 단백질의 적어도 하나의 에피토프가 상이하다면 본 발명의 의미 내에서 면역학적으로 상이한 것으로 간주된다. 헥손은 T-세포 및 B-세포 에피토프는 맵핑되었다.
본 발명의 바람직한 한 특정 구체예에서, 제 1 벡터는 아데노바이러스 벡터, 특히, PanAd3이며, 제 2 벡터는 폭시바이러스 벡터, 특히, MVA, 또는 아데노바이러스 벡터이다.
본 발명의 바람직한 한 구체예에서, 제 1 벡터 PanAd3이며, 제 2 벡터는 MVA이다. MVA에 대한 설명은 문헌 [Mayr A, Stickl H, Mueller HK, Danner K, Singer H. "The smallpox vaccination strain MVA: marker, genetic structure, experience gained with the parenteral vaccination and behavior in organisms with a debilitated defence mechanism." Zentralbl Bakteriol B. 1978 Dec;167(5-6):375-90 and in Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V. & Stickl, H. (1975). "Abstammung, Eigenschaften und Verwendung des attenuierten Vaccinia-Stammes MVA." Infection 3, 6-14]에서 찾아볼 수 있다.
용어 "폴리누클레오티드" 및 "핵산"은 본 출원 전반에 걸쳐 상호교환적으로 사용된다. 폴리누클레오티드는 누클레오티드 단량체로부터 제조된 중합성 거대분자로서 이해된다. 누클레오티드 단량체는 핵염기, 5-탄당 (예컨대, 비제한적으로, 리보스 또는 2'-데옥시리보스), 및 1 내지 3개의 인산염 기로 이루어진다. 전형적으로, 폴리누클레오티드는 개별적 누클레오티드 단량체간의 포스포디에스테르 결합을 통해 형성된다. 본 발명에 있에서, 바람직한 핵산 분자는 비제한적으로, 리보핵산 (RNA) 및 데옥시리보핵산 (DNA)을 포함한다. 게다가, 용어 "폴리누클레오티드"는 또한 DNA 또는 RNA의 인공 유사체, 예컨대, 펩티드 핵산 (PNA)을 포함한다.
추가적인 적합한 벡터는 PCT/EP2011/074307에 상세히 기술되어 있다. 이러한 출원의 내용은 본원에 제시된 발현 시스템과 관련된 이의 내용에 있어서 본원에 참조로서 통합된다.
폴리펩티드
용어 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 번역-동시 또는 번역-후 수식 길이에 상관없이 아미노산의 임의의 펩티드-연결된 사슬을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "번역-후"는 누클레오티드 트리플렛의 아미노산으로의 번역 및 서열에서 선행하는 아미노산으로의 펩티드 결합의 형성 후 발생하는 사건을 지칭한다. 이러한 번역-후 사건은 전체 폴리펩티드가 형성된 후 또는 번역 프로세스 동안 이미 번역된 폴리펩티드의 이러한 부분에 대해 미리 발생할 수 있다. 번역-후 사건은 전형적으로, 생성된 폴리펩티드의 화학적 또는 구조적 특성을 변형 또는 변화시킨다. 번역-후 사건의 예로는 비제한적으로, 아미노산의 글리코실화 또는 포스포릴화, 또는 예를 들어, 엔도펩티다제에 의한 펩티드 사슬의 절단과 같은 사건을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "번역-동시"는 누클레오티드 트리플렛의 아미노산 사슬로의 변역 프로세스 동안 발생하는 사건을 지칭한다. 이러한 사건은 전형적으로, 생성된 아미노산 사슬의 화학적 또는 구조적 특성을 변형 또는 변화시킨다. 동시-번역 사건의 예로는 비제한적으로, 번역 프로세스를 전적으로 중단시킬 수 있거나 펩티드 결합 형성을 방해하여 두 개의 별개의 번역 생성물을 생성시킬 수 있는 사건을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "다단백질" 또는 "인공 다단백질"은 서로 자연적으로 연결되지 않는 두 개의 아미노산 사슬을 포함하거나 이들로 필수적으로 구성되거나 이들로 구성되는 아미노산 사슬을 지칭한다. 다단백질은 하나 이상의 추가의 아미노산 사슬을 포함할 수 있다. 각각의 아미노산 사슬은 완전 단백질, 즉 전체 ORF에 걸친 단백질, 또는 이의 단편, 도메인 또는 에피토프일 수 있다. 다단백질의 개별적 부분은 서로 영구적으로 또는 일시적으로 연결될 수 있다. 영구적으로 연결되는 다단백질의 부분들은 단일 ORF로부터 번역되며, 번역-동시적으로 또는 번역-후속적으로 나중에 분리되지 않는다. 일시적으로 연결되는 다단백질의 부분들 또한 단일 ORF로부터 유래될 수 있으나, 번역 프로세스 동안 분리로 인해 번역-동시적으로 또는 예를 들어, 엔도펩티다제에 의한 펩티드 사슬의 절단으로 인해 번역-후속적으로 분할된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 다단백질의 부분들은 또한 두개의 상이한 ORF로부터 유래될 수 있으며, 예를 들어, 공유 결합을 통해 번역-후속적으로 연결된다.
본 발명에 사용가능한 단백질 또는 다단백질 (단백질 유도체, 단백질 변이체, 단백질 단편, 단백질 세그먼트, 단백질 에피토프 및 단백질 도메인 포함)은 화학 수식 (chemical modification)에 의해 추가로 수식될 수 있다. 따라서, 이렇게 화학적으로 수식된 폴리펩티드는 20개의 자연 발생 아미노산에서 발견된 잔기 이외의 화학적 기를 포함할 수 있다. 이러한 그 밖의 화학적 기의 예는 비제한적으로, 글리코실화된 아미노산 및 포스포릴화된 아미노산을 포함한다. 폴리펩티드의 화학 수식은 모폴리펩티드 (parent polypeptide)와 비교하여 유리한 특성 예를 들어, 향상된 안정성, 연장된 생물학적 반감기 또는 증가된 수용성 중 하나 이상을 제공할 수 있다. 본 발명에 이용가능한 변이체에 적용가능한 화학 수식은 하기를 포함하나 이에 제한되지 않는다: 페길화, 비-글리코실화된 모폴리펩티드의 글리코실화, 또는 모폴리펩티드에 존재하는 글리코실화 패턴의 수식. 본 발명에 사용가능한 변이체에 적용가능한 이러한 화학 수식은 번역-동시에 또는 번역-후에 발생할 수 있다.
본 출원에 언급된 바와 같은 "면역원성 폴리펩티드"는 적어도 하나의 에피토프를 함유하는 상기 정의된 바와 같은 폴리펩티드이다. 항원결정기로서 또한 공지된 "에피토프"는 면역 시스템에 의해 인식되는 폴리펩티드의 그러한 부분이다. 바람직하게는, 이러한 인식은 해당 에피토프로의 항체, B 세포 또는 T 세포의 결합에 의해 매개된다. 이와 관련하여, 용어 "결합"은 바람직하게는, 특이적 결합에 관한 것이다. 바람직하게는, 에피토프로의 항체의 특이적 결합은 항체의 Fab (단편, 항원 결합) 영역에 의해 매개되며, B-세포의 특이적 결합은 B-세포 수용체에 의해 포함된 항체의 Fab 영역에 의해 매개되며, T-세포의 특이적 결합은 T-세포 수용체의 가변 (V) 영역에 의해 매개된다.
본 발명에 따른 면역원성 폴리펩티드는 바람직하게는, 바이러스, 박테리아 및 원생동물로 구성된 군으로부터 선택된 병원체로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 이는 바이러스로부터 유래되며, 특히 유리한 한 구체예에서, 이는 호흡기세포융합바이러스 (RSV)로부터 유래된다. 그러나, 본 발명의 대안적 구체예에서, 면역원성 폴리펩티드는 암에 의해 발현된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 단편이다.
바람직한 면역원성 폴리펩티드는 B-세포 반응 또는 T-세포 반응 또는 B-세포 반응과 T-세포 반응을 유도한다.
에피토프는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹 (grouping)으로 구성되며, 일반적으로 특이적 삼-차원 구조 특성뿐만 아니라 특이적 전하 특성을 갖는다. 용어 "에피토프"는 입체형태적 에피토프 뿐만 아니라 비-입체형태적 에피토프를 지칭한다. 입체형태적 및 비-입체형태적 에피토프는, 전자로의 결합은 변성 용매의 존재하에 손실되지만 후자로의 결합은 손실되지 않는다는 점에서 구별된다.
두 개 이상의 면역원성 폴리펩티드는 이들이 동일한 항체, T-세포 또는 B-세포에 의해 인식된다면 "면역학적으로 동일"하다. 동일한 항체, T-세포 또는 B-세포에 의한 두 개 이상의 면역원성 폴리펩티드의 인식은 또한, 상기 항체, T-세포 또는 B-세포의 "교차 반응성"으로서 공지되어 있다. 동일한 항체, T-세포 또는 B-세포에 의한 두 개 이상의 면역학적으로 동일한 폴리펩티드의 인식은 모든 폴리펩티드 내의 동일하거나 유사한 에피토프의 존재로 인한 것이다. 유사한 에피토프는 동일한 항체 또는 B-세포 수용체의 Fab 영역에 의해 또는 동일한 T-세포 수용체의 V 영역에 의해 결합되기에 충분한 구조 및/또는 전하 특성을 공유한다. 항체, T-세포 수용체 또는 B-세포 수용체의 결합 특성은 전형적으로, 해당 에피토프로의 수용체의 결합 친화력에 의해 규정된다. 두 개의 면역원성 폴리펩티드는 더 낮은 친화상수를 갖는 폴리펩티드의 친화상수가 더 높은 친화상수를 갖는 폴리펩티드의 친화상수의 적어도 30 %, 적어도 40 %, 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 95 % 또는 적어도 98 %라면 본 출원에 의해 이해되는 바와 같이 "면역학적으로 동일"하다. 평형 투석 또는 효소 결합 면역흡착 측정법 (ELISA)과 같은 수용체로의 폴리펩티드의 결합 친화력을 측정하기 위한 방법은 본 기술분야에 널리 공지되어 있다.
바람직하게는, 두 개 이상의 "면역학적으로 동일한" 폴리펩티드는 적어도 하나의 동일한 에피토프를 포함한다. 가장 강한 백신접종 효과는 면역원성 폴리펩티드가 동일한 에피토프를 포함하는 경우 또는 이들이 동일한 아미노산 서열을 갖는 경우 일반적으로 획득될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 아미노산 서열이 또 다른 폴리펩티드의 아미노산 서열과 "실질적으로 동일"한 폴리펩티드는 아미노산 서열의 하나 이상의 변화에 의해 다른 폴리펩티드 (또는 세그먼트, 에피토프 또는 도메인)과 비교하여 상이한 폴리펩티드 변이체이다. 단백질 변이체가 유래되는 폴리펩티드는 또한, 모폴리펩티드로서 공지되어 있다. 전형적으로, 변이체는 유리하게는 유전자-기술 수단에 의해 인위적으로 작제된다. 전형적으로, 모폴리펩티드는 야생형 단백질 또는 야생형 단백질 도메인이다. 본 발명에 있어서, 모폴리펩티드 (또는 모세그먼트)는 또한, 두 개 이상의 야생형 폴리펩티드 (또는 야생형 세그먼트)의 컨센서스 서열일 수 있다. 추가로, 본 발명에 이용가능한 변이체는 또한, 모폴리펩티드의 상동체 (homolog), 오솔로그 (ortholog) 또는 파랄로그 (paralog)로부터 또는 인위적으로 작제된 변이체로부터 유래될 수 있으며, 단 변이체는 모폴리펩티드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 나타낸다. 바람직하게는, 변이체에 의해 공유된 모폴리펩티드의 적어도 하나의 생물학적 활성은, 두 폴리펩티드 모두가 상기 정의된 바와 같이 "면역학적으로 동일"하게 되게 하는 적어도 하나의 에피토프의 존재하에서 이다 (또는 존재를 포함한다).
아미노산 서열의 변화는 아미노산 교환, 삽입, 결실, N-말단 절두 또는 C-말단 절두 또는 이들 변화의 임의의 조합일 수 있으며, 이는 하나 또는 수개의 부위에서 발생할 수 있다. 유리한 특정 구체예에서, 본 발명에 이용가능한 변이체는 아미노산 서열에서 총 200개 이하 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200 이하)의 수의 변화 (즉, 교환, 삽입, 결실, N-말단 절두, 및/또는 C-말단 절두)를 나타낸다. 아미노산 교환은 보존적 및/또는 비-보존적일 수 있다. 유리한 특정 구체예에서, 본 발명에 이용가능한 변이체는, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 개 이하의 아미노산 교환, 바람직하게는, 보존적 아미노산 교환에 의해 변이체가 유래되는 단백질 또는 도메인과 상이하다.
대안적으로 또는 추가적으로, 본원에 사용된 바와 같은 "변이체"는 변이체가 유래되는 모폴리펩티드 또는 모폴리누클레오티드와의 어느 정도의 서열 동일성을 특징으로 할 수 있다. 더욱 정확하게는, 또 다른 폴리펩티드와 "실질적으로 동일"한 단백질 변이체는 다른 폴리펩티드와 적어도 80% 서열 동일성을 나타낸다. 본 발명에 있어서 폴리누클레오티드 변이체는 이의 모폴리누클레오티드와 적어도 80% 서열 동일성을 나타낸다. 바람직하게는, 단백질 변이체의 서열 동일성은 20, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 개 또는 그 초과의 아미노산의 연속 스트레치 (continuous stretch)를 아우른다. 바람직하게는, 폴리누클레오티드 변이체의 서열 동일성은 60, 90, 120, 135, 150, 180, 210, 240, 270, 300 개 또는 그 초과의 누클레오티드의 연속 스트레치를 아우른다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 모폴리펩티드와 "실질적으로 동일"한 폴리펩티드는 상기 모폴리펩티드와 적어도 80 %의 서열 동일성을 갖는다. 더욱 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 모폴리펩티드와 면역학적으로 동일하며, 모폴리펩티드와 적어도 80 %의 서열 동일성을 갖는다.
용어 "적어도 80% 서열 동일성"은 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드 서열 비교와 관련하여 명세서 전반에 걸쳐 사용된다. 이러한 표현은 각각의 기준 폴리펩티드 또는 각각의 기준 폴리누클레오티드와의 적어도 80 %, 적어도 81 %, 적어도 82 %, 적어도 83 %, 적어도 84 %, 적어도 85 %, 적어도 86 %, 적어도 87 %, 적어도 88 %, 적어도 89 %, 적어도 90 %, 적어도 91 %, 적어도 92 %, 적어도 93 %, 적어도 94 %, 적어도 95 %, 적어도 96 %, 적어도 97 %, 적어도 98 %, 또는 적어도 99 %의 서열 동일성을 지칭한다. 바람직하게는, 해당 폴리펩티드 및 기준 폴리펩티드는 기준 폴리펩티드의 전체 길이에 걸쳐 또는 20, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 개 또는 그 초과의 아미노산의 연속 스트레치에 걸쳐 지시된 서열 동일성을 나타낸다. 바람직하게는, 해당 폴리누클레오티드 및 기준 폴리누클레오티드는 기준 폴리펩티드의 전체 길이에 걸쳐 또는 60, 90, 120, 135, 150, 180, 210, 240, 270, 300 개 또는 그 초과의 누클레오티드의 연속 스트레치에 걸쳐 지시된 서열 동일성을 나타낸다.
폴리펩티드의 변이체는 아미노산의 결실을 추가적으로 또는 대안적으로 포함하며, 이는 N-말단 절두, C-말단 절두 또는 내부 결실 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. N-말단 절두, C-말단 절두 및/또는 내부 결실을 포함하는 이러한 변이체는 본 출원에 있어서 "결실 변이체" 또는 "단편"으로서 지칭된다. 용어 "결실 변이체" 및 "단편"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 단편은 자연 발생적일 수 있거나 (예를 들어, 스플라이스 변이체) 예를 들어, 유전자-기술 수단에 의해 인위적으로 작제될 수 있다. 단편 (또는 결실 변이체)은 모폴리펩티드와 비교하여 바람직하게는, N-말단에서, N- 및 C-말단에서, 또는 C-말단에서 또는 내부적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 개 이하의 아미노산 결실을 가질 수 있다. 두 서열을 비교하고, 서열 동일성 백분율이 비교하여 계산될 기준 서열이 특정되는 않은 경우, 달리 구체적으로 명시되지 않는 한, 서열 동일성은 비교할 두 개의 서열 중 더 긴 서열을 기준으로 계산되어야 한다. 기준 서열이 지시된 경우, 달리 구체적으로 명시되지 않는 한, 서열 동일성은 SEQ ID로 나타낸 기준 서열의 전장을 기준으로 결정된다.
추가적으로 또는 대안적으로, 결실 변이체는 상기 기술된 바와 같이 각 아미노산의 구조적 결실로 인해 발생할 수 있으나, 이들 아미노산이 억제되거나 다르게는 이들의 생물학적 기능을 수행할 수 없음으로 인해서도 발생할 수 있다. 전형적으로, 이러한 기능 손실은 비제한적으로, 생성 단백질의 화학적 특성 변화 (즉, 소수성 아미노산의 친수성 아미노산으로의 교환), 생성 단백질의 번역-후 수식 (예를 들어, 번역-후 절단 또는 글리코실화 패턴)에서의 변화, 또는 이차 또는 삼차 단백질 구조의 변화와 같은 생성 단백질의 기능적 특성을 변화시키는 아미노산 서열의 교환 또는 삽입으로 인해 발생한다. 바람직하게는, 상기 기술된 바와 같은 기능 결실은 면역원성 폴리펩티드의 에피토프의 파괴를 유도하는 적어도 하나의 아미노산의 삽입 또는 교환에 의해 초래된다.
누클레오티드 및 아미노산 서열의 유사성 즉, 서열 동일성의 백분율은 서열 정렬을 거쳐 결정될 수 있다. 이러한 정렬은 여러 기술분야에 공지된 알고리즘 바람직하게는, 칼린 및 알취일의 수학적 알고리즘 (Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877), hmmalign (HMMER package, http://hmmer.wustl.edu/) 또는 예를 들어, http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ 또는 http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html 또는 http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.html에서 입수가능한 CLUSTAL 알고리즘 (Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80)으로 수행될 수 있다. 사용된 바람직한 변수는 이들이 http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ 또는 http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html에서 설정될 때의 디폴트 변수 (default parameter)이다. 서열 동일성 (서열 매칭)의 등급은 예를 들어, BLAST, BLAT 또는 BlastZ (또는 BlastX)을 사용하여 계산될 수 있다. 유사한 알고리즘은 알취일 등의 BLASTN 및 BLASTP 프로그램으로 통합된다 (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410). BLAST 폴리누클레오티드 서치는 BLASTN 프로그램 (스코어 = 100, 워드 길이 = 12)으로 수행되어 F, N 또는 M2-1을 엔코딩하는 이러한 핵산에 상동성인 폴리누클레오티드 서열을 수득한다. BLAST 단백질 서치는 BLASTP 프로그램 (스코어 = 50, 워드 길이 = 3)으로 수행되어, F 폴리펩티드, N 폴리펩티드, 또는 M2-1 폴리펩티드에 상동인 아미노산 서열을 수득한다. 비교 목적을 위해 갭핑된 정렬을 수득하기 위해, Gapped BLAST가 문헌 [Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402]에 기술된 바와 같이 사용된다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우, 각각의 프로그램의 디폴트 변수가 사용된다. 서열 매칭 분석은 확립된 상동성 맵핑 기법 예컨대, Shuffle-LAGAN (Brudno M., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1:I54-I62) 또는 Markov 랜덤 필드에 의해 보완될 수 있다. 서열 동일성의 백분율이 본 출원에서 언급되는 경우, 이러한 백분율은 달리 구체적으로 명시되지 않는 한, 더 긴 사슬의 전장과 관련하여 계산된다.
본 발명의 폴리누클레오티드는 이들의 단백질, 펩티드 또는 변이체를 엔코딩하며, 이들은 달리 명시되지 않는 한 WIPO 표준 ST.25에 따른 표준 1- 또는 3-문자 코드에 따라 표기된다. 달리 명시되는 않는 한, 1- 또는 3 문자 코드는 자연 발생 L-아미노산을 가리키며, 아미노산 서열은 이들의 각각의 단백질, 펩티드 또는 변이체의 N-말단으로부터 C-말단으로의 방향으로 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "컨센서스"는 관련 서열이 서로 필적하는 다중 서열 정렬의 결과를 나타내는 아미노산 또는 누클레오티드 서열을 지칭한다. 이러한 컨센서스 서열은 각 위치에서 가장 공통적으로 관찰된 아미노산 또는 누클레오티드로 구성된다. 본 발명에 있어서, 컨센서스 서열을 수득하기 위한 서열 정렬에 사용된 서열은 전세계적으로 발병하는 다양한 상이한 질환에서 분리된 다양한 바이러스 아류형/혈청혈 균주의 서열이 바람직하다. 서열 정렬에 사용된 각 개별적 서열은 특정 바이러스 "분리물"의 서열로서 지칭된다. 예를 들어, 단지 두 개의 분리물을 비교했기 때문에 해당 위치에 있어서 "컨센서스 누클레오티드" 또는 "컨센서스 아미노산"이 확인되지 않은 경우, 분리물 중 각각 하나의 아미노산을 사용하는 것이 바람직하다.
문구 "T 세포 반응의 유도"는 병원체 특이적, 바람직하게는, 바이러스 특이적인 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 생성 또는 재-자극을 지칭한다. 본 발명의 일 구체예에서, 프라이밍 조성물 및/또는 부스팅 조성물은 핵산 작제물에 의해 발현된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들에 존재하는 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 에피토프로 향하는 T 세포 매개된 적응 반응을 유도하거나 재-자극할 수 있다. 이러한 T 세포 반응은 본 기술분야에 공지된 방법 예를 들어, 전체 폴리펩티드에 걸친 합성 펩티드로의 T 세포의 생체외 재-자극 및 증식 또는 인터페론-감마 생성의 분석에 의해 측정될 수 있다.
문구 "B 세포 반응의 유도"는 클래스 IgG 또는 IgA의 면역글로불린을 생성하는 병원체 특이적 예를 들어, 바이러스 특이적 B 세포의 생성 또는 재-자극을 지칭한다. 본 발명의 일 구체예에서, 프라이밍 조성물 및/또는 부스팅 조성물은 핵산 작제물에 의해 발현된 병원성의 예를 들어, 바이러스, 항원에 특이적인 항체를 생성하는 B 세포를 유도 또는 재-자극할 수 있다. 이러한 B 세포 반응은 혈청 또는 점막 면역글로불린의 합성 항원으로 ELISA에 의해 측정될 수 있다. 대안적으로, 유도된 항체 역가는 바이러스 중화 검정에 의해 측정될 수 있다.
문구 "항-병원성 B 세포 반응의 유도"는 각 병원체를 불활성화, 제거, 블록화 및/또는 중화시켜 병원체에 의해 초래되는 질환이 발병하지 않고/거나 증상이 완화되게 하는 클래스 IgG 또는 IgA의 면역글로불린을 생성하는 병원체 특이적 예컨대, 바이러스 특이적 B 세포의 생성 또는 재-자극을 지칭한다. 이는 또한, 병원체에 대한 "보호 면역 반응"으로 불린다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 프라이밍 및/또는 부스팅 조성물은 핵산 작제물에 의해 발현된 병원성의 예를 들어, 바이러스, 항원에 대해 특이적인 항체를 생성하는 B 세포를 유도하거나 재-자극할 수 있다. 이러한 B 세포 반응은 혈청 또는 점막 면역글로불린의 합성 항원으로 ELISA에 의해 측정될 수 있다. 대안적으로, 유도된 항체 역가는 바이러스 중화 검정에 의해 측정될 수 있다.
문구 "면역 반응 증강"은 면역원 바람직하게는, 병원체 예컨대, 바이러스에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응의 강화 또는 증대를 지칭한다. 면역 반응의 증강은 본원에 기술된 테스트 및/또는 본 기술 분야에 널리 공지된 테스트를 이용하여 본 발명의 발현 시스템에 의해 유도된 면역 반응을 동일한 항원/면역원을 단독으로 발현하는 발현 시스템의 면역 반응과 비교함으로써 측정될 수 있다.
적합한 면역원성 폴리펩티드는 PCT/EP2011/074307에 상세히 기술되어 있다. 이러한 출원의 내용은 본원에 기술된 면역원성 폴리펩티드에 대한 이의 기재내용과 관련하여 본원에 참조로서 통합된다.
바람직한 특정 구체예에서, 면역원성 폴리펩티드는 하기 약어를 사용하여 하기에 기술된다: "F" 또는 "F0"은 본원에 상호교환적으로 사용되며, 파라믹소바이러스 (Paramyxovirus) 바람직하게는, RSV의 융합 단백질을 지칭하며; "G"는 파라믹소바이러스 바람직하게는, 뉴모비리내 (pneumovirinae), 더욱 바람직하게는, RSV의 당단백질을 지칭하며; "H"는 파라믹소바이러스 바람직하게는, 모빌리바이러스 (morbillivirus)의 헤마그글루티닌 단백질을 지칭하며; "HN"은 파라믹소바이러스 특히, 레스피로바이러스 (Respirovirus), 아불라바이러스 (Avulavirus) 및 루불라바이러스 (Rubulavirus)의 헤마그글루티닌-뉴라미니다제 단백질을 지칭하며; "N"은 파라믹소바이러스 바람직하게는, RSV의 뉴클레오캡시드 단백질을 지칭하며; "M"은 파라믹소바이러스 바람직하게는, RSV의 글리코실화된 매트릭스 단백질을 지칭하며; 파라믹소바이러스에 있어서, 약어 "M2" 또는 "M2-1"은 파라믹소바이러스 바람직하게는, RSV의 비-글리코실화된 매트릭스 단백질을 지칭하며; "P"는 파라믹소바이러스 바람직하게는, RSV의 인단백질을 지칭하며; 파라믹소바이러스에 있어서, 약어 "NS1" 및 "NS2"는 파라믹소바이러스 바람직하게는, RSV의 비-구조 단백질 1 및 2를 지칭하며; "L"은 파라믹소바이러스 바람직하게는, RSV의 폴리머라제의 촉매 서브유닛을 지칭하며; "HA"는 오르토믹소바이러스 (orthomyxovirus) 바람직하게는, 인플루엔자 바이러스, 더욱 바람직하게는, 인플루엔자 A 바이러스의 헤마그글루티닌을 지칭하며; "HA0"은 오르토믹소바이러스 바람직하게는, 인플루엔자 바이러스, 더욱 바람직하게는, 인플루엔자 A 바이러스의 헤마그글루티닌 서브유닛 HA1 및 HA2의 전구체 단백질을 지칭하며; "H1p"는 오르토믹소바이러스 바람직하게는, 인플루엔자 바이러스, 더욱 바람직하게는, 인플루엔자 A 바이러스의 개질된 헤마그글루티닌을 지칭하며; "NA"는 오르토믹소바이러스 바람직하게는, 인플루엔자 바이러스, 더욱 바람직하게는, 인플루엔자 A 바이러스의 뉴라미니다제를 지칭하며; "NP"는 오르토믹소바이러스 바람직하게는, 인플루엔자 바이러스, 더욱 바람직하게는, 인플루엔자 A 바이러스의 핵단백질을 지칭하며; "M1"은 오르토믹소바이러스 바람직하게는, 인플루엔자 바이러스, 더욱 바람직하게는, 인플루엔자 A 바이러스의 매트릭스단백질 1을 지칭하며; 오르토믹소바이러스에 있어서, 약어 "M2"는 오르토믹소바이러스 바람직하게는, 인플루엔자 바이러스, 더욱 바람직하게는, 인플루엔자 A 바이러스의 매트릭스 단백질 M2를 지칭하며; 오르토믹소바이러스에 있어서, 약어 "NS1"은 오르토믹소바이러스 바람직하게는, 인플루엔자 바이러스, 더욱 바람직하게는, 인플루엔자 A 바이러스의 비-구조 단백질 1을 지칭하며; "NS2/NEP"는 오르토믹소바이러스 바람직하게는, 인플루엔자 바이러스, 더욱 바람직하게는, 인플루엔자 A 바이러스의 비-구조 단백질 2를 지칭하며 (또한, NEP 즉, 핵 방출 단백질로 불림); "PA"는 오르토믹소바이러스 바람직하게는, 인플루엔자 바이러스, 더욱 바람직하게는, 인플루엔자 A 바이러스의 폴리머라제 서브유닛 단백질을 지칭하며; "PB1"은 오르토믹소바이러스 바람직하게는, 인플루엔자 바이러스, 더욱 바람직하게는, 인플루엔자 A 바이러스의 폴리머라제 서브유닛 단백질을 지칭하며; "PB2"는 오르토믹소바이러스 바람직하게는, 인플루엔자 바이러스, 더욱 바람직하게는, 인플루엔자 A 바이러스의 폴리머라제 서브유닛 단백질을 지칭하며; "PB1-F2" 또는 "PB1F2"는 오르토믹소바이러스 바람직하게는, 인플루엔자 바이러스, 더욱 바람직하게는, 인플루엔자 A 바이러스의 PB1 유전자 세그먼트에서 대체 리딩 프레임에 의해 엔코딩된 단백질을 지칭한다.
바람직한 기타 구체예에서, 면역원성 폴리펩티드는 종양-특이적 단백질 또는 병원체 특이적 단백질이다. 특정 구체예에서, 병원체는 바이러스 특히, 파라믹소바이러스 또는 이의 변이체이며, 바람직하게는, 뉴모비리내 (Pneumovirinae), 파라믹소비리내 (Paramyxovirinae), Fer-de-Lance-바이러스, 나리바-바이러스 (Nariva-Virus), 살렘-바이러스 (Salem-Virus), 투파이아-파라믹소바이러스 (Tupaia-Paramyxovirus), 베이롱-바이러스 (Beilong-Virus), J-바이러스 (J-Virus), 메낭글-바이러스 (Menangle-Virus), 모스만-바이러스 (Mossmann-Virus), 및 무라야마-바이러스 (Murayama-Virus)의 서브패밀리로부터 선택된다. 추가로 더욱 바람직한 구체예에서, 뉴모비리내는 뉴모바이러스 바람직하게는, 인간 호흡기세포융합 바이러스 (RSV), 쥣과 뉴모니아 바이러스, 소 RSV, 양 RSV, 염소 RSV, 칠면조 리노트라세이티스 바이러스 (rinotracheitis virus) 및 메타뉴모바이러스 (Metapneumovirus), 바람직하게는, 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV) 및 새 메타뉴모바이러스로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가로 더욱 바람직한 구체예에서, 파라믹소비리내는 레스피로바이러스 바람직하게는, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1 및 3, 및 루불라바이러스, 바람직하게는, 인간 파라인플루엔자 바이러스 2 및 4; 박테리아, 또는 원생 동물 바람직하게는, 엔토모에바 히스톨리티카 ( Entomoeba histolytica), 트리코모나스 테나스 (Trichomonas tenas), 트리코모나스 호미니스 (Trichomonas hominis), 트리코모나스 바기날리스 (Trichomonas vaginalis), 트리파노소마 감비엔스 (Trypanosoma gambiense), 트리파노소마 로데시엔스 (Trypanosoma rhodesiense), 트리파노소마 크루지 (Trypanosoma cruzi), 레이쉬마니아 도노바니 (Leishmania donovani), 레이쉬마니아 트로피카 (Leishmania tropica), 레이쉬마니아 브라질리엔시스 (Leishmania braziliensis), 뉴모사이스티스 뉴모니아 (Pneumocystis pneumonia), 톡소플라스마 곤디 (Toxoplasma gondii), 테일레리아 로렌시 (Theileria lawrenci), 테일레리아 파르바 (Theileria parva ), 플라스모듐 비박스 (Plasmodium vivax), 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum) 및 플라스모듐 말라리아 (Plasmodium malaria)로 구성된 군으로부터 선택된다.
핵산 작제물
용어 "핵산 작제물"은 적어도 하나의 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 지칭한다. 바람직하게는, 상기 폴리누클레오티드는 핵산 작제물에 의해 엔코딩된 적어도 하나의 폴리펩티드의 전사 및 번역을 지시하는 엘리먼트를 추가로 포함한다. 이러한 엘리먼트는 세포-자유 또는 세포-기반 시스템 바람직하게는, 세포-기반 시스템에서 mRNA의 전사를 지시하는 프로모터 및 인핸서 엘리먼트를 포함한다. 핵산 작제물이 번역가능한 RNA로서 제공되는 또 다른 구체예에서, 핵산 작제물은 적어도 하나의 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 RNA의 번역 및/또는 안정화에 필요한 그러한 엘리먼트 예를 들어, 폴리A-테일, IRES, 캡 단백질 등을 포함하는 것으로 구상된다.
상기 개략된 바와 같이, 본 발명의 벡터는 바이러스 벡터가 바람직하며, 따라서, 핵산 작제물은 바람직하게는, 바이러스 벡터의 복제에 필요한 핵산 서열 및/또는 면역원성 폴리펩티드의 발현을 지시하는 조절 엘리먼트를 추가로 포함하는 더 큰 폴리누클레오티드에 의해 포함된다.
본 발명의 일 구체예에서, 핵산 작제물은 단일 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩한다.
본 발명의 바람직한 특정 구체예에서, 핵산 작제물은 적어도 두 개의 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩한다.
면역원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 적합한 핵산 작제물은 PCT/EP2011/074307에 상세히 기술되어 있다. 이러한 출원의 기재내용은 본원에 제시된 면역원성 폴리펩티드에 대한 이의 기재내용과 관련하여 참조로서 본원에 통합된다.
T-세포 반응을 유도하는 면역원성 폴리펩티드를 B-세포 반응을 유도하는 면역원성 폴리펩티드에 첨가하면 후자 폴리펩티드에 대한 B-세포 반응이 증강됨이 PCT/EP2011/074307을 근간으로 하는 연구에서 놀랍게도 밝혀졌다. 항원에 대한 B-세포 반응의 강도를 측정하는 방법이 상기에 기술되었다. 해당 항원에 대해 특이적인 항체의 역가는 B-세포 반응을 유도하는 적어도 하나의 면역원성 폴리펩티드와 T-세포 반응을 유도하는 적어도 하나의 면역원성 폴리펩티드의 조합물로 면역화시킨 후 적어도 2 주, 적어도 4 주, 적어도 8 주, 적어도 4 개월, 적어도 8 개월 또는 적어도 1 년째에 측정될 수 있다. 바람직하게는, B-세포 반응을 유도하는 면역원성 폴리펩티드에 대해 특이적인 항체의 역가는 B-세포 반응을 단독으로 유도하는 적어도 하나의 면역원성 폴리펩티드로의 면역화와 비교할 경우 조합물에 의해 적어도 10 %, 적어도 20 %, 적어도 30 %, 적어도 50 %, 적어도 75 %, 적어도 100 %, 적어도 150 % 또는 적어도 200 % 증가되었다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 핵산 작제물은 B-세포 반응을 유도하는 적어도 하나의 면역원성 폴리펩티드 및 T-세포 반응을 유도하는 적어도 하나의 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩한다.
B-세포 반응을 유도하는 면역원성 폴리펩티드는 바람직하게는, 바이러스 또는 이의 단편 또는 변이체에 의해 포함된 구조 단백질이다. 예를 들어, 외피보유 바이러스의 경우, 구조 바이러스 단백질은 유리하게는, 융합 단백질 (F) 및 부착 당단백질 G, H 및 HN으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
부착 당단백질은 모든 외피보유 바이러스에서 발견되며, 숙주 세포의 형질막상의 단백질 또는 기타 분자의 세포 부착 도메인 또는 탄수화물 부분으로의 이들의 결합을 통해 바이러스 외피와 숙주 세포의 형질막 사이의 초기 상호작용을 매개한다. 이렇게 하여, 부착 당단백질은 바이러스와 숙주 세포의 형질막 사이의 갭을 이어준다. "H"로서 표기된 부착 당단백질은 헤마글루티닌 활성을 지니며, 모빌리바이러스 및 헤니파바이러스에서 발견되며, "HN"으로서 표기된 당단백질은 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제 활성을 지니며, 레스피로바이러스, 루불라바이러스 및 아불라바이러스에서 발견된다. 부착 당단백질은 이들이 헤마글루틴화 또는 뉴라미니다제 활성을 지니지 않는 경우 "G"로서 표기된다. G 부착 당단백질은 뉴모비리내의 모든 구성원에서 발견될 수 있다.
융합 단백질 "F"는 모든 외피보유 바이러스에서 발견되며, 바이러스 외피와 숙주 세포의 형질막의 융합을 매개한다. F는 결합하는 숙주 세포의 세포 표면상에 존재하는 수용체를 인식하는 타입 I 당단백질이다. F는 막관통 도메인이 인접하여 위치하고 이어서 두 개의 헵타드 반복 (HR) 영역 HR1 및 HR2가 각각 뒤따르는 융합 펩티드로 구성된다. 숙주 세포 형질막으로의 융합 펩티드의 삽입시, HR1 영역은 삼량체 코일드 코일 구조를 형성하며, 이의 소수성 그루브 내로 HR2 영역이 뒤로 접혀진다. 이렇게 하여, 헤어핀 구조가 형성되며, 이는 바이러스 지질 이중층과 세포 형질막이 더욱 가깝도록 함께 끌어당겨 융합 포어의 형성을 허용하고, 연속하여, 바이러스 캡시드가 숙주 세포의 세포질 내로 유입가능하게 하는 지질 이중층 둘 모두의 완전한 융합을 허용한다. 이러한 특징들 모두는 외피보유 바이러스의 융합-매개 단백질에서 공통적이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, F는 하나의 RSV 분리물의 F의 아미노산 서열 또는 두 개 이상의 상이한 RSV 분리물의 컨센서스 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나 이들로 구성된다. 바람직한 특정 구체예에서, F 단백질의 아미노산 서열은 바람직하게는, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 또는 이의 변이체에 따른다.
T-세포 반응을 유도하는 면역원성 폴리펩티드는 유리하게는, 바이러스 또는 이의 단편 또는 변이체에 의해 포함된 내부 단백질이다. 상기 구조 바이러스 단백질은 핵단백질 N, 매트릭스 단백질 M 및 M2, 인단백질 P, 비구조 단백질 NS1 및 NS2, 및 폴리머라제 (L)의 촉매 서브유닛으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
핵단백질 N은 RNA아제-내성 누클레오캡시드 내로의 RNA 게놈의 캡시드화를 포함하는 여러 기능을 수행한다. N은 또한 바이러스 어셈블리 동안 M 단백질과 상호작용하며, 유전체의 전사 및 복제 동안 P-L 폴리머라제와 상호작용한다.
매트릭스 단백질 M은 파라믹소바이러스에서 가장 풍부한 단백질이며, 누클레오캡시드와 내재막 단백질의 세포질 테일과의 상호작용에 의해 바이러스 형태의 중앙 형성체인 것으로 간주된다. M2는 글리코실화되지 않고 뉴모바이러스에서 주로 발견된 제 2 막-관련 단백질이다.
인단백질 P는 N 및 L 단백질에 결합하며, 모든 파라믹소바이러스에서 RNA 폴리머라제 복합물의 일부를 형성한다. 대 단백질 L은 RNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매적 서브유닛이다.
비-구조 단백질 NS1 및 NS2의 기능은 확인되지 않았다; 그러나, 이들이 바이러스 복제 사이클에 관련된다는 암시가 있다.
바람직한 특정 구체예에서, N은 하나의 RSV 분리물의 N의 아미노산 서열 또는 두 개 이상의 상이한 RSV 분리물의 컨센서스 아미노산 서열 예를 들어, SEQ ID NO:3에 따른 서열을 포함하며, 여기서 M2는 하나의 RSV 분리물의 M2의 아미노산 서열 또는 두 개 이상의 상이한 RSV 분리물의 컨센서스 아미노산 서열 예를 들어, SEQ ID NO:5에 따른 서열을 포함한다. 추가의 바람직한 한 구체예에서, N은 SEQ ID NO:4에 따른 아미노산 서열을 포함하며, M2는 SEQ ID NO:5에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 한 구체예에서, 적어도 두 개의 상이한 면역원성 폴리펩티드는 동일한 수의 오픈 리딩 프레임 (ORF)에 의해 엔코딩되며, 즉 각 폴리펩티드는 별도의 오픈 리딩 프레임에 의해 엔코딩된다. 이러한 경우, 각 ORF는 상기 폴리펩티드의 발현을 허용하는 적합한 발현 제어 서열과 조합되는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 적어도 두 개의 상이한 면역원성 폴리펩티드는 단일 ORF에 의해 엔코딩되며, 펩티드 링커에 의해 연결된다. 따라서, 핵산 작제물의 전사 및 번역은 기능성 즉, 면역원성 도메인을 지닌 단일 폴리펩티드를 생성시킨다. 용어 "상이한 면역원성 폴리펩티드"는 이들이 유래되는 바이러스 또는 유기체에서 연속 핵산에 의해 엔코딩되지 않는 본 출원의 상기에 정의된 바와 같은 면역원성 폴리펩티드를 지칭한다. 이들이 유래되는 바이러스 또는 유기체에서, 이들은 다양한 ORF에 의해 엔코딩될 수 있다. 대안적으로, 이들은 이들의 자연적 상황에서 상기 도메인을 연결시키는 아미노산 서열의 결실 및 펩티드 링커에 의한 상기 연결 아미노산 서열의 대체에 의해 단일 ORF로 엔코딩된 폴리펩티드의 다양한 도메인으로부터 유래될 수 있다. 후자의 구체예는 면역 반응의 유도에 필요한 모든 에피토프를 여전히 함유하는 자연 발생 폴리펩티드보다 짧은 폴리펩티드의 생성을 허용한다. 예를 들어, 자연 발생 폴리펩티드는 면역원성이 아닌 90개 아미노산의 아미노산 서열에 의해 연결된 면역 반응을 유도하는데 유용한 두 개의 에피토프를 포함한다. 10 또는 15개 아미노산의 펩티드 링커에 의한 상기 90개 아미노산의 대체는 더 짧은 폴리펩티드를 생성시키며, 이는 그럼에도 불구하고 중요한 에피토프 둘 모두를 포함한다.
본 발명의 바람직한 한 특정 구체예에서, 적어도 두 개의 상이한 면역원성 폴리펩티드는 단일 ORF에 의해 엔코딩되며 절단 부위에 의해 연결된다. 따라서, 핵산 작제물의 전사 및 번역은 단일 폴리펩티드를 생성시키며, 이는 번역-동시적 또는 번역-후속적으로 다양한 더 작은 폴리펩티드로 절단된다.
상기 부위에 대해 언급된 절단은 바람직하게는, 자가-절단 또는 엔도펩티다제 절단 부위이다.
용어 "오픈 리딩 프레임" (ORF)은 누클레오티드의 서열로서 아미노산으로 번역될 수 있는 서열을 지칭한다. 전형적으로, 이러한 ORF는 개시 코돈, 일반적으로 다중의 3개 누클레오티드 길이를 갖는 후속 영역을 함유하나, 해당 리딩 프레임내에 정지 코돈 (TAG, TAA, TGA, UAG, UAA, 또는 UGA)을 함유하지 않는다. 전형적으로, ORF는 자연 발생적이거나 인공적으로 즉, 유전자-기술 수단에 의해 작제된다. ORF는 단백질에 대해 코딩하며, 여기서 이러한 단백질로 번역될 수 있는 아미노산은 펩티드-연결된 사슬을 형성한다.
본 발명의 문맥상 "펩티드 링커" (또는 짧게 "링커")는 1 내지 100 개 아미노산의 아미노산 서열을 지칭한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 펩티드 링커는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 개 아미노산의 최소 길이를 갖는다. 추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 펩티드 링커는 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 또는 15 개 아미노산 또는 그 미만의 최대 길이를 갖는다. 펩티드 링커는 함께 연결되는 두 개의 아미노산 단백질, 단편, 세그먼트, 에피토프 및/또는 도메인 간에 유연성을 제공하는 것이 바람직하다. 이러한 유연성은 아미노산이 작은 경우 일반적으로 증가된다. 따라서, 바람직하게는, 본 발명의 펩티드 링커는 특히, 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 류신 및 이소류신의 증가된 함량의 작은 아미노산을 갖는다. 바람직하게는, 펩티드 링커의 아미노산의 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 또는 그 초과의 초과는 작은 아미노산이다. 바람직한 구체예에서, 링커 아미노산은 글리신 및 세린으로부터 선택된다. 특히 바람직한 구체예에서, 상기 언급된 바람직한 최소 및 최대 길이의 본 발명에 따른 펩티드 링커는 조합될 수 있다. 당업자는 어느 조합이 수리적으로 타당한지 즉시 이해할 것이다. 바람직한 특정 구체예에서, 본 발명의 펩티드 링커는 비-면역원성이다; 인간 투여를 위해 고안되는 경우, 펩티드 링커는 전형적으로 인간에 비-면역원성인 것으로 선택된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "절단 부위"는 예를 들어, 절단 효소에 의해 인식될 수 있는 때문에 분할로 유도되고/거나 분할될 수 있는 아미노산 서열을 지칭한다. 전형적으로, 폴리펩티드 사슬은 아미노산을 연결하는 하나 이상의 펩티드 결합의 가수분해에 의해 절단된다. 펩티드 결합의 절단은 화학적 또는 효소적 절단으로부터 발생할 수 있다. 효소적 절단은 단백질분해 효소 엔도- 또는 엑소-펩티다제 또는 -프로테아제 (예를 들어, 세린-프로테아제, 시스테인-프로테아제, 메탈로-프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 아스파르테이트 프로테아제, 글루탐산 프로테아제)에 의해 달성되는 그러한 절단을 지칭한다. 전형적으로, 효소적 절단은 자가-절단으로 인해 발생되거나 독립적인 단백질분해 효소에 의해 수행된다. 단백질 또는 폴리펩티드의 효소적 절단은 번역-동시 또는 번역-후에 발생할 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "엔도펩티다제 절단 부위"는 엔도펩티다제 (예를 들어, 트립신, 펩신, 엘라스타제, 트롬빈, 콜라게나제, 푸린, 서몰리신, 엔도펩티다제 V8, 카텝신)에 의해 절단되거나 절단가능한 아미노산 또는 누클레오티드 서열 내의 절단 부위를 지칭한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 오토프로테아제 즉, 프로테아제를 또한 포함하는 동일한 단백질 분자의 펩티드 결합을 절단하는 프로테아제에 의해 절단될 수 있다. 이러한 오토프로테아제의 예로는 플라비바이러스로부터의 NS2 프로테아제 또는 비르나바이러스의 VP4 프로테아제가 있다.
대안적으로, 용어 "절단 부위"는 아미노산 간의 펩티드 결합의 형성을 방지하는 아미노산 서열을 지칭한다. 예를 들어, 결합 형성은 폴리펩티드 또는 다단백질의 번역-동시적 자가-프로세싱으로 인해 방지될 수 있어 단일 오픈 리딩 프레임의 단일 번역 사건으로부터 유래되는 두 개의 불연속적 번역 생성물을 생성시킨다. 전형적으로, 이런 자가-프로세싱은, 번역 복합물이 펩티드 결합을 형성하지 않으면서 하나의 코돈으로부터 다음 코돈으로 이동하게 하는 슈도 정지-코돈 서열에 의해 초래된 "리보좀 스킵"에 의해 수행된다. 리보좀 스킵을 유도하는 서열의 예로는 비제한적으로, 바이러스 2A 펩티드 또는 2A-유사 펩티드 (여기서 이 둘 모두는 총괄적으로 "2A 펩티드" 또는 상호교환적으로 "2A 부위" 또는 "2A 절단 부위"로서 불림)를 포함하며, 이는 피코르나바이러스 (Picornavirus), 곤충 바이러스, 아프토비리대 (Aphtoviridae), 로타바이러스 및 트리파노소마 (Trypanosoma)를 포함하는 여러 바이러스 패밀리에 의해 사용된다. 단일 ORF로부터 다중 폴리펩티드를 생성하는데 전형적으로 사용되는 피코르나비리대 패밀리의 족구병 바이러스 및 리노바이러스의 2A 부위가 가잘 잘 알려져 있다.
따라서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "자가-절단 부위"는 아미노산 또는 누클레오티드 서열 내의 절단 부위를 지칭하는 것으로서, 상기 이러한 서열은 임의의 추가의 분자를 수반하는 이러한 절단 없이 절단되거나 절단가능하거나, 이러한 서열에서의 펩티드- 또는 포스포디에스테르-결합 형성은 제 1 장소에서 방지된다 (예를 들어, 상기 기술된 바와 같이 번역-동시적 자가-프로세싱을 통해).
절단 부위는 전형적으로, 수개의 아미노산을 포함하거나 수개의 코돈에 의해 엔코딩되는 것으로 이해된다 (예를 들어, 그러한 경우, "절단 부위"는 단백질로 번역되지 않으며, 번역의 방해로 이어짐). 따라서, 절단 부위는 또한 펩티드 링커의 목적을 수행할 수 있으며 즉, 입체적으로 두 펩티드를 분리한다. 따라서, 일부 구체예에서, "절단 부위"는 두 펩티드 링커 모두이며, 상기 기술된 절단 기능을 제공한다. 이러한 구체예에서, 절단 부위는 추가적인 N- 및/또는 C-말단 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명의 특정한 한 바람직한 구체예에서, 자가 절단 부위는 피코르나바이러스, 곤충 바이러스, 아프토비리대, 로타바이러스 및 트리파노소마의 바이러스 2A 펩티드 또는 2A-유사 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된다. 유리한 일 예에서, 2A 절단 부위는 족구병 바이러스의 2A 펩티드이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 제 1 및/또는 제 2 벡터에 의해 포함된 핵산 작제물은 적어도 두 개의 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩하며, 적어도 하나의 상기 폴리펩티드는 T-세포 반응을 유도하며, 적어도 하나의 또 다른 폴리펩티드는 B-세포 반응을 유도한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 제 1 및 제 2 핵산 작제물에 의해 엔코딩된 면역원성 폴리펩티드의 아미노산 서열은 실질적으로 동일하다.
본 발명의 바람직한 또 다른 구체예에서, 핵산 작제물중 적어도 하나는 (i) 호흡기세포융합바이러스 (RSV)의 융합 단백질 F, (ii) RSV의 핵단백질 N 및 (iii) RSV의 매트릭스 단백질 M2로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드를 엔코딩한다.
본 발명의 바람직한 특정 구체예에서, 제 1 및 제 2 벡터에 의해 포함된 핵산 작제물은 (i) 호흡기세포융합바이러스 (RSV)의 융합 단백질 F, (ii) RSV의 핵단백질 N 및 (iii) RSV의 매트릭스 단백질 M2로 구성된 군으로부터 선택된 동일한 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들을 엔코딩한다. 용어 "동일한 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들"은 상기 정의된 바와 같이 면역학적으로 동일하거나 상기 정의된 바와 같이 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "동일한 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들"은 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다.
본 발명의 바람직한 특정 구체예에서, 적어도 하나의 핵산 작제물은 (i) 호흡기세포융합바이러스 (RSV)의 융합 단백질 F, (ii) RSV의 핵단백질 N 및 (iii) RSV의 매트릭스 단백질 M2를 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩한다. 유리한 한 구체예에서, 상기 핵산 작제물은 상기 언급된 세 개의 폴리펩티드 이외의 어떠한 폴리펩티드도 엔코딩하지 않는다. 예를 들어, 벡터는 (i) 호흡기세포융합바이러스 (RSV)의 융합 단백질 F, (ii) RSV의 핵단백질 N 및 (iii) RSV의 매트릭스 단백질 M2를 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 상기 언급된 핵산 작제물 이외의 추가의 핵산 작제물을 포함하지 않는다.
본 발명의 매우 바람직한 한 구체예에서, 핵산 작제물 둘 모두는 (i) 호흡기세포융합바이러스 (RSV)의 융합 단백질 F, (ii) RSV의 핵단백질 N 및 (iii) RSV의 매트릭스 단백질 M2를 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩한다. 본 구체예의 예에 있어서, 핵산 작제물 둘 모두는 상기 언급된 세 개의 폴리펩티드 이외에 어떠한 폴리펩티드도 엔코딩하지 않는다. 예를 들어, 벡터 둘 모두는 (i) 호흡기세포융합바이러스 (RSV)의 융합 단백질 F, (ii) RSV의 핵단백질 N 및 (iii) RSV의 매트릭스 단백질 M2를 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 상기 언급된 핵산 작제물 이외의 추가의 핵산 작제물을 포함하지 않는다.
백신
용어 "백신"은 특정 질환에 대한 면역을 증대시키는 생물학적 제조물을 지칭한다. 상기 제조물은 치사된 또는 약화된 생 병원체를 포함할 수 있다. 이는 또한, 면역 반응을 유도하는데 적합한 병원체로부터 유래된 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 화합물은 상기 병원체의 폴리펩티드와 실질적으로 동일하거나 면역학적으로 동일한 폴리펩티드이다. 또한, 바람직하게는, 백신은 상기 병원체의 폴리펩티드와 실질적으로 동일하거나 면역학적으로 동일한 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 작제물을 포함한다. 후자의 경우, 폴리펩티드는 백신으로 처리된 개체에서 발현되는 것이 요망된다. 백신접종을 근간으로 하는 원리는 면역학적 "메모리"의 발생이다. 개체의 면역 시스템의 백신으로의 자극은 백신에 의해 포함된 화합물을 특이적으로 인식하는 면역 세포의 형성 및/또는 증식을 유도한다. 상기 면역 세포의 적어도 일부는 백신 접종 후 10, 20 또는 30년까지 연장될 수 있는 기간 동안 생존된채 유지된다. 개체의 면역계가 상기 언급된 기간 내에 면역 반응을 유도할 수 있는 화합물이 유래되는 병원체와 접하는 경우, 백신접종에 의해 생성된 면역 세포는 백신으로 자극되지 않고 처음으로 병원체의 면역원성 화합물과 접하게 되는 개체의 면역 반응과 비교하여, 병원체에 대한 면역 반응을 재활성화시키고 증강시킨다.
프라임 - 부스트 백신접종 요법
많은 경우에, 백신의 단일 투여는 해당 병원체로의 미래의 감염의 경우 효과적인 보호에 필요한 수의 장기간-지속 면역 세포를 발생시키거나, 종양 질환을 포함하는 질환에 대해 보호하거나 종양 질환과 같은 질환을 치료학적으로 처리하기에 충분하지 않다. 결론적으로, 특이적 병원체 또는 질환에 특이적인 생물학적 제조물로의 반복된 자극이 상기 병원체 또는 질환에 대한 지속되고 보호성인 면역을 확립하거나 해당 질환을 치유하기 위해 필요하다. 동일한 병원체 또는 질환에 대해 처방된 백신의 반복 투여를 포함하는 투여 요법은 본 출원에서 "프라임-부스트 백신접종 요법"으로서 지칭된다. 바람직하게는, 프라임-부스트 백신접종 요법은 특이적 병원체, 병원체의 군 또는 질환에 대해 처방된 백신 또는 백신 조성물의 적어도 2회 투여를 수반한다. 백신의 제 1 투여는 "프라이밍"으로서 지칭되며, 제 1 백신과 동일한 병원체에 대해 처방된 백신 또는 동일한 백신의 임의의 후속 투여는 "부스팅"으로서 지칭될 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 프라임-부스팅 백신접종 요법은 면역 반응을 프라이밍하기 위한 백신의 1회 투여 및 면역 반응을 부스팅하기 위한 적어도 1회의 후속 투여를 포함한다. 면역 반응을 부스팅하기 위한 2, 3, 4 또는 심지어 5회 투여가 또한 본 발명에 의해 고려되는 것으로 이해해야 한다.
프라임과 후속 투여 사이의 기간은 바람직하게는, 1주, 2 주, 4 주, 6 주 또는 8 주이다. 더욱 바람직하게는, 4 주이다. 1회 초과의 부스트가 수행되는 경우, 후속 부스트는 바람직하게는, 선행 부스트 후 1 주, 2 주, 4 주, 6 주 또는 8 주째에 투여된다. 예를 들어, 간격은 4 주이다.
본 발명에 따른 프라임-부스트 요법으로 처리될 대상체 또는 환자는 바람직하게는, 포유동물 또는 조류, 더욱 바람직하게는, 영장류, 마우스, 래트, 양, 염소, 소, 돼지, 말, 거위, 닭, 오리 또는 칠면조, 및 가장 바람직하게는, 인간이다.
바람직하게는, 본 발명의 제 1 또는 제 2 양태에 따른 백신 조합물의 사용은 병원체 또는 질환에 대한 보호성 면역을 확립하거나 병원체에 의한 감염에 의해 초래된 질환 또는 감염의 억제 및/또는 근절을 유도할 것이다.
백신 조성물
"프라이밍 조성물" 및 "부스팅 조성물"에 사용된 바와 같은 용어 "조성물"은 핵산 작제물, 및 약제학적으로 허용되는 담체, 약제학적 부형제 및 애주번트로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 화합물을 포함하는 벡터의 조합물을 지칭한다. 부스팅 조성물이 벡터 대신에 면역원성 폴리펩티드를 포함하는 경우, 부스팅 조성물은 상기 적어도 하나의 면역원성 폴리펩티드, 및 약제학적으로 허용되는 담체, 약제학적 부형제 및 애주번트로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 화합물을 포함한다.
"약제학적으로 허용되는"은 동물 및 더욱 특히, 인간에 사용도록 연방 주 정부의 관리 기관에 의해 승인되거나 U.S. 약전 또는 기타 일반적으로 인정된 약전에 기록됨을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "담체"는 치료학적 활성 성분과 투여되는 약물학적으로 불활성인 물질 예컨대, 비제한적으로, 희석제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약제학적 담체는 액체 또는 고체일 수 있다. 액체 담체는 비제한적으로, 멸균 액체 예컨대, 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원 예컨대, 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 및 기타 등등의 것을 포함하는 오일 및 물중의 살린 용액을 포함한다. 살린 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 특히, 주입용 용액을 위한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 살린 용액은 약제 조성물이 누블라이저에 의해 비내 또는 정맥내 투여되는 경우 바람직한 담체이다.
적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 소듐 클로라이드, 건조된 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 및 기타 등등을 포함한다.
적합한 약제학적 담체의 예는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin]에 기술되어 있다.
용어 "애주번트"는 세포성 또는 체액성 수준의 조성물의 활성 성분에 대한 면역 반응을 증가시키거나, 자극하거나, 활성화시키거나, 강화시키거나 조절하는 제제를 지칭하며, 예를 들어, 면역학적 애주번트는 실제 항원에 대한 면역계 반응을 자극하나, 그 자체는 면역학적 효과를 갖지 않는다. 이러한 애주번트의 예는 비제한적으로, 무기 애주번트 (예를 들어, 무기 금속 염 예컨대, 알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 하이드록시드), 유기 애주번트 (예를 들어, 사포닌 또는 스쿠알렌), 오일-계 애주번트 (예를 들어, 프로인트 완전 애주번트 및 프로인트 불완전 애주번트), 사이토카인 (예를 들어, IL-1β IL-2, IL-7, IL-12, IL-18, GM-CFS, 및 INF-γ), 미립자 애주번트 (예를 들어, 면역-자극 복합물 (ISCOMS), 리포좀, 또는 생체분해성 마이크로스피어), 바이로좀, 박테리아 애주번트 (예를 들어, 모노포스포릴 지질 A, 또는 무라밀 펩티드), 합성 애주번트 (예를 들어, 비-이온성 블록 공중합체, 무라밀 펩티드 유사체, 또는 합성 지질 A), 또는 합성 폴리누클레오티드 애주번트 (예를 들어, 폴리아르기닌 또는 폴리리신)을 포함한다.
"비내 투여"는 폐를 포함하는 완전 기도의 점막으로의 본 발명의 백신 조성물의 투여이다. 더욱 바람직하게는, 조성물은 코의 점막으로 투여된다. 바람직하게는, 비내 투여는 점안, 분무 또는 에어로졸에 의해 달성된다. 바람직하게는, 상기 투여는 기계적 수단 예컨대, 바늘에 의한 점막의 천공을 수반하지 않는다.
용어 "근육내 투여"는 개체의 임의의 근육 내로의 백신 조성물의 주입을 지칭한다. 바람직한 근육내 주입물은 삼각근, 외층광근 또는 복둔근 및 배둔근 영역으로 투여된다.
놀랍게도, 폴리누클레오티드 벡터와 단백질의 투여의 조합은 백신접종의 특징 (예를 들어, 강도)에 이점을 부가함이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 추가의 양태는
(a) 적어도 하나의 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 작제물을 포함하는 벡터를 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성하거나 이들로 구성되는 프라이밍 조성물 및
(b) 적어도 하나의 면역원성 폴리펩티드를 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나 이들로 구성되는 적어도 하나의 부스팅 조성물을 포함하며,
프라이밍 조성물에 포함된 핵산 작제물에 의해 엔코딩된 면역원성 폴리펩티드의 적어도 하나의 에피토프는 부스팅 조성물에 포함된 면역원성 폴리펩티드의 적어도 하나의 에피토프와 면역학적으로 동일한, 프라임-부스트 백신접종 요법에 사용하기 위한 백신 조합물로서, 프라이밍 조성물이 근육내 또는 비내 투여되며, 후속하여 적어도 하나의 부스팅 조성물이 투여되는 백신 조합물에 관한 것이다.
본 발명의 제 2 양태에 있어서, 모든 용어는 본 발명의 제 1 양태에 대해 상기 정의된 의미 및 지시된 경우, 바람직한 의미를 지닌다. 특히, 용어 벡터, 핵산 작제물, 면역원성 폴리펩티드, 근육내 또는 비내 투여, 프라임 부스팅 백신접종 요법은 상기 개략된 의미를 지닌다. 면역원성 폴리펩티드에 대한 교시는 벡터의 핵산에 의해 엔코딩된 면역원성 폴리펩티드 및 투여되는 그러한 폴리펩티드 둘 모두에 적용가능한 반면, 핵산 작제물에 대한 교시는 단지 벡터에 포함된 핵산에 관한 것임을 이해해야 한다.
적어도 하나의 부스팅 조성물은 근육내 또는 비내 투여용임이 바람직하다. 바람직하게는, 부스팅 조성물 각각은 근육내 또는 비내 투여된다.
바람직한 투여 요법은 하기와 같다:
(i) 프라이밍 조성물이 비내 투여되고, 후속하여 적어도 하나의 부스팅 조성물이 근육내 투여되거나;
(ii) 프라이밍 조성물이 비내 투여되고, 후속하여 적어도 하나의 부스팅 조성물이 비내 투여되거나;
(iii) 프라이밍 조성물이 근육내 투여되고, 후속하여 적어도 하나의 부스팅 조성물이 근육내 투여되거나;
(iv) 프라이밍 조성물이 근육내 투여되고, 후속하여 적어도 하나의 부스팅 조성물이 비내 투여되며, 가장 바람직한 투여 요법 (i)가 이용된다.
본 양태의 바람직한 구체예에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터 (예를 들어, AAV 타입 5 및 타입 2), 알파바이러스 벡터 (예를 들어, 베네주엘라 이콰인 뇌염 바이러스 (VEE), 신드비스 바이러스 (SIN), 셈리키 삼림 바이러스 (SFV), 및 VEE-SIN 키메라), 헤르페스 바이러스 벡터 (예를 들어, 사이토메갈로바이러스, 예컨대, 리세스 사이토메갈로바이러스 (RhCMV) (14)로부터 유래된 벡터), 아레나 바이러스 벡터 (예를 들어, 림프구성 맥락수막염바이러스 (LCMV) 벡터 (15)), 홍역 바이러스 벡터, 폭스 바이러스 벡터 (예를 들어, 백시니아 바이러스, 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA), NYVAC (백시니아의 코펜하겐 균주로부터 유래됨), 및 조류폭스 벡터: 카나리아폭스 (ALVAC) 및 조류폭스 (FPV) 벡터), 수포성 구내염 바이러스 벡터, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 바이러스 유사 입자, 및 박테리아 스포어로 구성된 군으로부터 선택된다.
매우 바람직한 벡터는 아데노바이러스 벡터, 특히, 인간 또는 인간외 대형 유인원으로부터 유래된 아데노바이러스 벡터 또는 폭시바이러스 벡터, 바람직하게는, MVA이다. 아데노바이러스가 유래되는 바람직한 대형 유인원에는 침팬지 (판), 고릴라 (고릴라) 및 오랑우탄 (풍고), 바람직하게는, 보노보 (판 파니스쿠스) 및 침팬지 (판 트로글로디테스)가 있다. 전형적으로, 자연 발생 인간외 대형 유인원 아데노바이러스는 각각의 대형 유인원의 대변 샘플로부터 분리된다. 가장 바람직한 벡터는 hAd5, hAd11, hAd26, hAd35, hAd49, ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd55, ChAd63, ChAd 73, ChAd82, ChAd83, ChAd146, ChAd147, PanAd1, PanAd2, 및 PanAd3 벡터를 기반으로 하는 비-복제 아데노바이러스 벡터 또는 복제-가능 Ad4 및 Ad7 벡터이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 프라이밍 조성물에 의해 포함된 핵산 작제물은 상기 정의된 바와 같은 구조를 지닌다.
본 발명의 바람직한 한 구체예에서, 핵산 작제물은 호흡기세포융합바이러스 (RSV)의 적어도 융합 단백질 F를 엔코딩한다. 특정 구체예에서, 상기 핵산 작제물은 상기 언급된 폴리펩티드 이외에 어떠한 폴리펩티드도 엔코딩하지 않는다. 예를 들어, 벡터는 호흡기세포융합바이러스 (RSV)의 융합 단백질 F를 엔코딩하는 상기 언급된 핵산 작제물 이외에 추가의 핵산 작제물을 포함하지 않는다.
본 발명의 바람직한 특정 구체예에서, 핵산 작제물은 (i) 호흡기세포융합바이러스 (RSV)의 융합 단백질 F, (ii) RSV의 핵단백질 N 및 (iii) RSV의 매트릭스 단백질 M2를 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩한다. 이러한 구체예의 예에서, 상기 핵산 작제물은 상기 언급된 세 개의 폴리펩티드 이외의 어떠한 폴리펩티드도 엔코딩하지 않는다. 예를 들어, 벡터는 (i) 호흡기세포융합바이러스 (RSV)의 융합 단백질 F, (ii) RSV의 핵단백질 N 및 (iii) RSV의 매트릭스 단백질 M2를 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 상기 언급된 핵산 작제물 이외의 추가의 핵산 작제물을 포함하지 않는다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 부스팅 조성물에 의해 포함된 적어도 하나의 면역원성 폴리펩티드는 상기 정의된 바와 같은 구조를 갖는다. 바람직하게는, (i) 호흡기세포융합바이러스 (RSV)의 융합 단백질 F, (ii) RSV의 핵단백질 N 및 (iii) RSV의 매트릭스 단백질 M2, 또는 상기 언급된 폴리펩티드의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 상기 언급된 폴리펩티드와 면역학적으로 동일한 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 더욱 바람직한 구체예에서, 부스팅 조성물에 의해 포함된 적어도 하나의 면역원성 폴리펩티드는 호흡기세포융합바이러스 (RSV)의 융합 단백질 F이다. 예를 들어, 부스팅 조성물은 상기 폴리펩티드 (융합 단백질 F) 이외의 면역원성 폴리펩티드를 포함하지 않는다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 핵산 작제물은 (i) 호흡기세포융합바이러스 (RSV)의 융합 단백질 F, (ii) RSV의 핵단백질 N 및 (iii) RSV의 매트릭스 단백질 M2를 엔코딩하며, 부스팅 조성물에 포함된 유일한 면역원성 폴리펩티드는 RSV의 융합 단백질 F이다.
본 발명의 특히 바람직한 한 구체예에서, 면역 반응의 프라이밍은 아데노바이러스 벡터 (예를 들어, 본원에 제공된 아데노바이러스 벡터 목록으로부터 선택됨)의 비내 투여에 의해 수행되며, 부스팅은 면역원성 폴리펩티드의 근육내 투여에 의해 수행된다. 예를 들어, 유리하게는, 아데노바이러스 벡터는 PanAd3일 수 있다. 본 구체예에서, 면역원성 폴리펩티드는 유리하게는 RSV의 융합 단백질 F일 수 있으며, 벡터에 의해 포함된 핵산 작제물은 유리하게는, RSV의 융합 단백질 F, RSV의 핵단백질 N 및 RSV의 매트릭스 단백질 M2를 엔코딩한다.
본 발명의 또 다른 특히 바람직한 구체예에서, 면역 반응의 프라이밍은 아데노바이러스 벡터의 비내 투여에 의해 수행되며, 부스팅은 폭스바이러스 벡터의 근육내 투여에 의해 수행된다. 프라이밍에 폭스바이러스 벡터를 사용하고, 면역 반응의 부스팅에 아데노바이러스 벡터를 사용하는 것이 또한 바람직하다. 예를 들어, 유리하게는, 아데노바이러스 벡터는 PanAd3일 수 있으며, 폭스바이러스 벡터는 MVA일 수 있다. 본 구체예에서, 두 벡터 모두에 의해 포함된 핵산 작제물은 바람직하게는, RSV의 융합 단백질 F, RSV의 핵단백질 N 및 RSV의 매트릭스 단백질 M2를 엔코딩한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제 1 및 제 2 양태에 따른 백신 조합물 및 사용 설명서를 포함하는 제조 물품을 제공한다.
도 1: 재조합 단백질 F에 대해 Elisa로 측정된 F 단백질에 대한 항체의 혈청 역가. 역가는 혈청 풀 (pool)의 연속 희석에 의해 측정되고, 배경 + 3x 표준 편차보다 높은 값을 제공하는 희석을 나타낸다. 막대의 숫자는 재조합 단백질의 단일 투여와 관련하여 다양한 요법의 항체 역가의 배수 증가를 나타낸다.
도 2: 중화 역가는 GFP 단백질을 발현하는 재조합 RSV-A 바이러스를 사용하여 Hep2 세포에 대한 RSV 감염 검정을 기반으로 하는 FACS에서 측정하였다. 데이타는 EC50으로 표현하였으며, 이는 바이러스 감염을 50% 억제하는 혈청의 희석물이다.
도 3: 전체 F 단백질 항원에 걸친 펩티드 풀로의 생체외 재자극 후 지라 및 폐 림프구에 대한 INFγ T 세포 Elispot. 막대는 다양한 요법에 의해 면역화된 동물의 3 군에서 측정된 T 세포 반응의 평균 + 표준 오차를 나타낸다. PanAd3 벡터로 프라이밍된 그러한 동물만이 지라 및 폐 둘 모두에서 T 세포 반응을 보인다.
도 4: 코튼랫의 폐 (왼쪽 패널) 및 코 (오른쪽 패널)에서 RSV 복제. 바이러스 역가는 다양한 기관으로부터의 용해물을 사용하여 Hep-2 세포에 대한 플라크 측정법으로 측정하였으며, 조직의 그램 당 Log10 pfu의 평균으로서 표현하였다. 청색 선은 측정법의 검출 한계를 나타낸다.
도 5: 전체 RSV 백신 항원에 걸친 펩티드 풀로의 생체외 재자극 후 지라 및 폐 림프구에 대한 IFNγ T 세포 Elispot. 검정 막대는 근육에서 PanAd3 및 이어서 근육에서 MVA-RSV로 면역화된 동물의 군에서 측정된 T 세포 반응의 평균을 나타낸다. 회색 막대는 코에서 PanAd3 및 이어서 근육에서 MVA-RSV로 면역화된 동물의 군에서 측정된 T 세포 반응의 평균 + 표준 오차를 나타낸다.
도 6: F 단백질에 대한 항체의 혈청 역가 (패널 A)를 재조합 단백질 F에 대한 ELISA에 의해 측정하였다. 중화 역가 (패널 B)는 GFP 단백질을 발현하는 재조합 RSV-A 바이러스를 사용하여 Hep2 세포에 대한 FACS 기반 RSV 감염 검정법으로 측정하였다. 데이타는 EC50으로 표현하였으며, 이는 바이러스 감염을 50% 억제하는 혈청의 희석물이다.
도 7: 코튼랫의 폐 (진회색 막대) 및 코 (연회색 막대)에서 RSV 복제. 바이러스 역가는 다양한 기관으로부터의 용해물을 사용하여 Hep-2 세포에 대한 플라크 측정법으로 측정하였으며, 조직의 그램 당 Log10 pfu의 평균으로서 표현하였다.
도 8: 감염된 송아지의 코 분비물 (왼쪽 패널) 및 폐 (오른쪽 패널)에서 RSV 복제. 바이러스 역가는 폐의 다양한 부분으로부터의 용해물 또는 코 스왑 (swab)을 사용하여 MDBK 세포에 대한 플라크 측정법으로 측정하였으며, 샘플의 ml 당 Log10 pfu의 평균으로서 표현하였다. Log 10 = 2는 검정법의 검출 한계를 나타낸다.
도 9: 코튼랫의 코에서 RSV 복제. 바이러스 역가를 코 점막으로부터의 용해물을 사용하여 Hep-2 세포에 대한 플라크 측정법으로 측정하였으며, 조직의 그램 당 Log10 pfu의 평균으로서 표현하였다. 점선은 검정법의 검출 한계를 나타낸다.
도 10: 부스트 일 (백색 삼각형 = 프라임 후 4주) 및 자극 일 (흑색 삼각형 = 부스트 후 3, 8 및 12 주)에 측정된 RSV 혈청 중화 항체 역가. 중화 역가를 인간 RSV Long 균주로 감염된 Hep2 세포에 대한 플라크 감소 측정법으로 측정하였다. 데이타는 EC60으로 표현하였으며, 이는 대조군 대비 플라크를 60% 억제하는 혈청의 희석물이다.
하기 실시예는 본 발명을 단지 설명하기 위한 것이다. 이들은 어떤 방식으로든 청구범위의 범위를 제한하지 않아야 한다.
실시예 1: PanAd3 - RSV 및 MVA - RSV 의 생성
백신 설계
본 발명의 백신 항원을 설계하기 위해, RSV의 F0-, N-, 및 M2-1- 단백질의 단백질 서열을 미국 국립생물공학정보센터 (National Center for Biotechnology Information (NCBI)) RSV Resource 데이타베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 검색하였다. 단백질 서열을 다양한 RSV 서브타입 A 균주로부터 선택하였다.
F0 컨센서스 서열은 MUSCLE 버젼 3.6을 사용하고 과반수 원칙을 적용하여 F-단백질의 모든 동일하지 않은 서열의 정렬에 의해 얻었다. 백신의 F0 컨센서스 서열을 다양한 RSV 서열의 정렬을 기초로 하여 설계하였다. 백신 컨센서스 FO 서열의 서열 유사성을 BLAST 분석을 수행하여 측정하였으며, 이러한 BLAST 분석은 Basic Local Alignment Search Tool을 나타내며, NCBI를 통해 공개적으로 입수가능하다. 데이타베이스에서 모든 RSV 서열과 비교하여 계산된 컨센서스 서열의 가장 높은 평균 유사성은 인간 호흡기세포융합바이러스 A2 균주 대비 100%였다.
추가로, 백신의 FO 서열은 FOΔTM의 분비를 허용하는 아미노산 525 내지 574에 존재하는 막관통 영역이 결여되어 있다.
최종적으로, 백신 FOΔTM 서열은 진핵 세포에서 발현에 대해 코돈-최적화되었다.
백신의 N 컨센서스 서열은 MUSCLE 버젼 3.6을 사용하고 과반수 원칙을 적용하여 N-단백질의 모든 동일하지 않은 서열의 정렬에 의해 얻었다. N 컨센서스 서열의 BLAST 분석으로 인간 호흡기세포융합바이러스 A2 균주로의 최상의 정렬을 발견하였다. 이어서, 백신의 N 서열은 진핵 세포에서 발현에 대해 코돈-최적화되었다.
M2-1 컨센서스 서열은 MUSCLE 버젼 3.6을 사용하고 과반수 원칙을 적용하여 M2-1-단백질의 모든 동일하지 않은 서열의 정렬에 의해 얻었다. M2-1 컨센서스 서열의 BLAST 분석으로 인간 호흡기세포융합바이러스 A2 균주로의 최상의 정렬을 발견하였다. 최종적으로, 백신 M2-1 서열은 진핵 세포에서 발현에 대해 코돈-최적화되었다.
백신 FOΔTM 서열 및 N 서열은 족구병 바이러스의 절단 서열 2A에 의해 공간이 생긴다. 백신 N 서열 및 M2-1 서열 (GGGSGGG; SEQ ID NO: 6)은 유연성 링커에 의해 분리되었다.
최종적으로, 코돈-최적화된 바이러스 유전자는 단일 오픈 리딩 프레임 FOΔTM-N-M2-1으로서 클로닝하였다.
FOΔ TM 및 FOΔ TM -N- M2 -1을 엔코딩하는 DNA 플라스미드의 생성
컨센서스 FOΔTM, N 및 M2-1 서열을 Kozak 서열의 부가 및 코돈 최적화를 포함하여, 포유동물 발현에 최적화시켰다. 다중-항원 백신을 엔코딩하는 DNA 서열을 화학적으로 합성하고, 이어서 CMV 프로모터의 제어 하에 적합한 제한 효소 EcoRV 및 NotI에 의해 pVJTetOCMV 셔틀 벡터로 서브-클로닝하였다.
PanAd3 바이러스-벡터화된 RSV 백신의 생성
유연성 링커에 의해 융합된 컨센서스 FOΔTM, N 및 M2-1 단백질에 대해 코딩하는 809 aa 다단백질 (SEQ ID NO.: 7)을 함유하는 바이러스-벡터화된 RSV 백신 PanAd3/FOΔTM-N-M2-1을 생성시켰다.
보노보 아데노바이러스 타입 3 (PanAd3)은 개선된 혈청학적 유병률을 지닌 신규한 아데노바이러스 균주이며, 이전에 기술되어 있다.
플라스미드 벡터 pVJTetOCMV/F0ΔTM-N-M2-1로부터 PanAd3 pre-Adeno 벡터로의 FOΔTM-N-M2-1의 클로닝은 상동성 영역 측부에 위치하는 항원 서열의 절단 및 시험관내 효소적 재조합에 의해 수행하였다.
셔틀 플라스미드 벡터 p94-F0ΔTM-N-M2-1으로부터 MVA 벡터로의 FOΔTM-N-M2-1의 클로닝은, 시험관내 효소적 재조합 및 형광 현미경검사에 의한 양성 재조합체 바이러스의 선택의 두 단계에 의해 수행하였다.
실시예 2: 마우스에서 PanAd3 - RSV 로의 프라임 및 단백질 F로의 부스트
재료 및 방법
5 마리 BALB/c 마우스의 군을 코 점안에 의해 또는 근육내 주입에 의해 108 vp의 PanAd3-RSV로 면역화시켰다. 또 다른 군을 알루미늄 하이드록시드로 제형화된 5 ㎍의 재조합 단백질 F (Sino Biologicals Inc. cat n.11049-V08B)로 근육내 면역화시켰다. 4주 후에, 모든 동물의 근육에 알루미늄 하이드록시드로 제형화된 5 ㎍의 재조합 단백질 F를 투여하였다. 4 주 후 모든 동물에서 체혈하여 혈청을 준비하였다. 각 군에서 동물의 혈청 풀을 F 단백질 ELISA에 의해 분석하였다: 간단하게는, 96 웰 마이크로플레이트를 0.5ug 단백질 F (Sino Biologicals Inc. cat n.11049-V08B)로 코팅시키고, 혈청의 연속 희석물과 인큐베이션하였다. 대규모 세척 후, 알칼리성 포스파타제와 컨주게이팅된 2차 항-마우스 IgG 항체에 의해 특이적 결합이 드러나게 하였다. 배경을 BALB/c 사전-면역 혈청을 사용하여 측정하였다. 항체 역가를 배경 + 3 x 표준 편차에 해당하는 값을 제공하는 희석물로서 표현하였다. 중화 항체는 FACS-기반 감염 검정법으로 측정하였다. 간단하게는, GFP를 발현하는 재조합 RSV-A 바이러스 (Chen M. et al. J Immunological Methods 2010; 362:180)를 사용하여, 20% 감염된 세포를 제공하는 감염다중도 (MOI)에서 24 h 동안 배양된 Hep-2 세포를 감염시켰다. 마우스 혈청 풀의 연속 희석물을 바이러스와 1 시간 동안 37℃에서 인큐베이션시킨 후, 세포에 첨가하였다. 24 시간 후에 감염된 세포의 백분율을 전체-세포 FACS 분석법에 의해 측정하였다. 항체 역가를 감염을 50% 억제하는 혈청 희석물 (EC50)로서 표현하였다.
T 세포 반응을 IFNγ T 세포 Elispot으로 측정하였다: 간단하게는, 지라 및 폐 림프구를 항-IFNγ 항체로 코팅된 96 웰 마이크로플레이트상에 플레이팅시키고, 전체 RSV 백신 항원에 걸친 펩티드 풀로 생체외 자극하였다. 대규모 세척 후, 플레이트의 바닥에 스폿을 형성하는 분비된 IFNγ가 알칼리성 포스파타제에 컨주게이팅된 2차 항체에 의해 드러나게 하였다. 스팟의 수를 자동 Elispot 판독기로 계수하였다.
결과
RSV 항원 F, N 및 M2-1을 함유하는 원숭이 아데노바이러스 PanAd3-RSV를 비내 경로 또는 근육내 경로에 의해 BALB/c 마우스의 군에 투여하였다. 별도의 군을 알루미늄 하이드록시드로 제형화시킨 재조합 F 단백질로 근육내 주입에 의해 면역화시켰다. 4 주 후, 마우스의 3 군을 알루미늄 하이드록시드로 제형화시킨 재조합 F 단백질로 근육내 주입에 의해 부스팅시켰다. 부스트 4주 후, 마우스의 혈청을 F-단백질 ELISA에 의해 분석하고, 중화 항체 역가를 FACS 기반 RSV 중화 검정법으로 측정하였다. 지라 및 폐에서의 T 세포 반응을 IFNγ T 세포 Elispot으로 측정하였다.
도 1에 도시된 바와 같이, 프라이밍 백신으로서 PanAd3-RSV을 투여받은 마우스의 군은 혈청중 매우 높은 수준의 항-F 항체 역가에 도달하였다. PanAd3-RSV로의 프라이밍은, F 단백질의 단일 투여로 수득된 항체 역가를 Adeno가 코로 투여되는 경우 87x 내지 Adeno가 근육내로 투여되는 경우 158x 범의 인수로 증가시키는 반면, 단백질 F의 2회 투여는 역가를 22 인수만큼 증가시킨다.
RSV 중화 항체 역가는 GFP를 발현하는 재조합 RSV 바이러스를 사용하여 Hep2 세포에 대한 FACS 기반 세포 배양 감염 검정법으로 측정하였다. 도 2는 50%의 감염 억제 (EC50)를 제공하는 혈청 희석물로서 표현된 중화 역가를 보여준다. 항-F 항체 역가에 대해 관찰된 바와 같이, 중화 항체 역가 또한 단백질/단백질 요법 대비 Adeno 프라임과 단백질 부스트의 조합에 의해 백신접종된 동물에서 증가하였다.
T 세포 반응은 지라 및 폐 림프구에 대한 IFNγ T-세포 Elispot에 의해 동일한 군의 마우스에서 측정하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 프라임에 Adeon 벡터로 백신접종된 그러한 군에서만 전신 및 국소 T 세포 반응 둘 모두가 발생하였다. 반대로, F 특이적 T 세포 반응은 단백질 F로 백신접종된 동물에서 검출되지 않았다.
실시예 3: 코튼랫에서 PanAd3 - RSV 로의 프라임 및 단백질 F로의 부스트
재료 및 방법
5 마리 코튼랫 (Sygmoidon Hispidus)의 군을 코 점안에 의해 108 vp의 PanAd3-RSV 또는 근육에서 알루미늄 하이드록시드로 제형화시킨 5ug의 재조합 단백질 F (Sino Biologicals Inc. cat n.11049-V08B)로 면역화시켰다. 4 주 후, 모든 동물의 근육에 알루미늄 하이드록시드로 제형화시킨 5㎍의 재조합 단백질 F를 투여하였다. 3 주 후, 동물의 두 군과 백신접종하지 않은 대조군을 105 pfu의 RSV Long 균주로의 비내 투여에 의해 감염시켰다. 감염 후 5일째에, 모든 동물을 희생시키고, 코 상피 및 폐를 수집하고 용해시켰다. 조직 용해물의 연속 희석물을 사용하여 배양된 Hep2 세포를 감염시켜 플라크 계수에 의해 바이러스 역가를 측정하였다.
결과
코튼랫의 두 군을 i) 알루미늄 하이드록시드로 제형화시킨 단백질 F로의 프라임 및 부스트 또는 ii) 코에서 PanAd3-RSV 프라임 및 근육에서 알루미늄 하이드록시드로 제형화시킨 단백질 F로의 부스트로 백신접종하였다. 부스트 후 3주째에, 백신접종하지 않은 대조군과 함께 동물에 105 pfu의 RSV Long 균주를 비내 투여하여 자극하였다. 감염 후 5일째에, 동물을 희생시키고, 바이러스를 코 및 폐 조직의 용해물에 대한 플라크 측정법에 의해 역가 측정하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 대조군 동물에서, 폐 및 코에서의 RSV의 역가는 4-5 log10에 도달한 반면, 백신접종된 군에서의 모든 동물은 폐에서의 바이러스 복제를 차단하였다. 반대로, Adeno와 단백질의 조합물이 투여된 그러한 동물만이 또한 상기도에서 완전한 불임 면역을 보였다.
실시예 4: 코튼랫에서 PanAd3 - RSV 로의 프라임 및 단백질 F로의 부스트 후 RSV에 대한 중화 항체의 수명
재료 및 방법
5마리 코튼랫 (Sygmoidon Hispidus)의 군을 코 점안에 의해 108 vp의 PanAd3-RSV 또는 근육에서 알루미늄 하이드록시드로 제형화시킨 5ug의 재조합 단백질 F (Sino Biologicals Inc. cat n.11049-V08B)로 면역화시켰다. 4 주 후, 모든 동물의 근육에 알루미늄 하이드록시드로 제형화시킨 5㎍의 재조합 단백질 F를 투여하였다. 3 주 후, 동물의 두 군과 백신접종하지 않은 대조군을 105 pfu의 RSV Long 균주로의 비내 투여에 의해 감염시켰다. 감염 후 5일째에, 모든 동물을 희생시키고, 코 상피 및 폐를 수집하고 용해시켰다. 조직 용해물의 연속 희석물을 사용하여 배양된 Hep2 세포를 감염시켜 플라크 계수에 의해 바이러스 역가를 측정하였다. 혈청 중화 항체를 RSV Long 균주로 감염시킨 Hep2 세포에서 플라크 감소 측정법으로 측정하였다. 역가는 억제되지 않은 대조군 대비 플라크의 60% 감소를 제공하는 혈청 희석물로서 표현하였다.
결과
코튼랫의 두 군을 i) 코에서 PanAd3-RSV 프라임 및 근육에서 알루미늄 하이드록시드로 제형화시킨 단백질 F로의 부스트 또는 ii) 알루미늄 하이드록시드로 제형화시킨 단백질 F로의 프라임 및 부스트로 백신접종하였다. 부스트 후 3주, 8주및 12주째에, 백신접종하지 않은 대조군과 함께 동물에 105 pfu의 RSV Long 균주를 비내 투여하여 자극하였다. 감염 후 5일째에, 동물을 희생시키고, 바이러스를 코 및 폐 조직의 용해물에 대한 플라크 측정법에 의해 역가 측정하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, 대조군 동물에서, 코에서의 RSV의 역가는 4-5 log10에 도달한 반면, Adeno와 단백질의 조합물이 투여된 그러한 동물만이 상기도에서 완전한 불임 면역을 보였다. 혈청 중화 항체를 부스트 당일 (프라임 후 4주째) 및 부스트 후 3, 8 및 12주 째인 자극 일에 측정하였다. 도 10에 도시된 바와 같이, 중화 역가는 Adeno와 단백질의 조합물로 백신접종된 그러한 군에서만 높게 유지되고 지속된 반면, 단백질로 백신접종된 것의 중화 역가는 시간에 걸쳐 서서히 저하하였다.
실시예 5: PanAd3 - RSV 로의 비내 프라임 및 MVA - RSV 로의 부스트 후 T-세포 반응
재료 및 방법
RSV 항원 F, N 및 M2-1을 함유하는 108 바이러스 입자 (vp)의 PanAd3-RSV를 코 점안에 의해 또는 근육내 경로에 의해 10 CD1 마우스의 군에 투여하였다. 4 주 후, 모든 동물의 근육에 RSV 항원 F, N 및 M2-1을 함유하는 107 플라크 형성 유닛 (pfu)의 MVA-RSV를 투여하였다. 4 주 후, 동물을 희생시키고, 림프구를 지라 및 폐로부터 분리하고, 혈액으로부터의 혈청을 준비하였다. T 세포 반응, 항-F 항체의 역가 및 RSV 중화 항체를 상기 기술된 바와 같이 측정하였다.
결과
프라임에서 코로의 PanAd3-RSV 투여 및 4주 후 근육에서 MVA-RSV로의 부스팅을 기반으로 하는 이종성 프라임/부스트 백신접종 요법을 PanAd3-RSV 프라임 및 MVA-RSV 부스트 (이 둘 모두는 이계 교배시킨 CD1 마우스의 근육에 투여함)를 기반으로 하는 요법과 비교하였다. MVA 부스트 후 4주째에, 마우스를 희생시키고, RSV 특이적 T 세포 반응을 지라 및 폐에서 측정하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 프라임에서 코로의 PanAd3-RSV 투여는 지라 및 폐 둘 모두에서 더 강한 IFN-γ T 세포 반응을 유도하였다.
코에서의 Adeno 프라임 후 면역 반응의 개선은 F 단백질에 대한 항체의 증가 (도 7, 패널 A) 및 혈청중 중화 항체 역가의 증가 (도 7, 패널 B)에 의해 확인되었다.
실시예 6: PanAd3 - RSV 로의 프라임 및 MVA - RSV 로의 부스트 후 코튼랫에서의 면역
재료 및 방법
5마리 코튼랫 (Sygmoidon Hispidus)의 군을 코 점안 또는 근육내 주입에 의해 108 vp의 PanAd3-RSV로 면역화시켰다. 4 주 후, 모든 동물의 근육에 107 pfu의 MVA-RSV를 투여하였다. 3 주 후, 동물의 두 군과 백신접종하지 않은 대조군을 105 pfu의 RSV Long 균주의 비내 투여에 의해 감염시켰다. 감염 후 5일째에 모든 동물을 희생시키고, 코 상피 및 폐를 수집하고 용해시켰다. 조직 용해물의 연속 희석물을 사용하여 배양된 Hep2 세포를 감염시켜 플라크 계수에 의해 바이러스 역가를 측정하였다.
결과
두 군의 코튼랫을 PanAd3-RSV로의 코 또는 근육에서의 프라이밍 간의 차이를 비교하기 위해 PanAd3-RSV/MVA-RSV로 이종성 프라임/부스트에 의해 백신접종하였다. 두 군 모두를 4 주 간격을 두고 근육에서 MVA로 부스팅하였다. 백신접종하지 않은 동물의 제 3 군을 대조군으로서 사용하였다. 부스트 후 3주째에, 동물을 105 pfu의 RSV Long 균주의 비내 투여에 의해 자극하였다. 감염 후 5일 째에, 동물을 희생시키고, 바이러스를 코 및 폐 조직의 용해물에 대한 플라크 측정법에 의해 역가 측정하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, 대조군 동물에서 폐 및 코에서의 RSV의 역가는 4-5 log10에 도달한 반면, 백신 접종된 군의 모든 동물은 폐에서의 바이러스 복제를 차단하였다. 반대로, 프라임에서 코로 Adeno 투여된 그러한 동물만이 상기도에서 또한 완전 불임 면역을 보여주었다.
실시예 7: PanAd3 - RSV 단독으로의 백신접종 대비 PanAd3 - RSV 로의 프라임 및 MVA-RSV로의 부스트 후 소에서의 면역
재료 및 방법
3 마리 및 4 마리의 갓난 (2-4 주령) 혈청음성 송아지 (BRSV 플라크 감소 측정법에 의해 스크리닝됨)의 두 군 (A 및 B)을 분무 장치를 통한 코 전달에 의해 5x1010 vp의 PanAd3-RSV로 면역화시켰다. 프라임 후 8주째에, 군 B에는 근육으로 2x108 pfu의 MVA-RSV를 투여하였다. 제 3 군인 군 C에는 백신접종을 하지 않고 대조군으로서 사용하였다. 프라임 (군 A) 또는 부스트 (군 B) 후 4 주째에, 동물의 두 군과 대조군 C에 104 pfu의 BRSV Snook 균주를 비내 및 기관내 투여함으로써 감염시켰다. 감염 6일 후, 모든 동물을 희생시켰다. 코 분비물을 감염 후 매일 코 스왑으로 수집하였다. 희생 시, 기관 스크레이프 (scrape) 및 폐 세척물을 적합한 완충제에서 용해시킨 폐의 다양한 부분의 절편 (오른쪽 첨엽, 오른쪽 심엽, 왼쪽 심엽)과 함께 수집하였다. 플라크 계수에 의해 바이러스 역가를 측정하기 위해 조직 용해물의 연속 희석물을 사용하여 배양된 소 MDBK 세포를 감염시켰다.
결과
2-4 주령의 혈청음성 송아지의 두 군을 i) PanAd3-RSV의 단일 비내 투여 또는 ii) PanAd3-RSV로의 비내 프라임 이어서 8주 후에 근육내 MVA-RSV 부스트로 백신접종하였다. 백신접종 4주 후에 동물에 104 pfu의 BRSV Snook 균주를 비내 및 기관내 투여함으로써 자극하였다. 감염 후 6일째에, 바이러스 복제가 폐 및 코에서 피크를 이루어 최대 폐 병변을 초래할 때 동물을 희생시켰다. 코 분비물에서의 바이러스 역가를 MDBK 세포에 대한 플라크 측정법에 의해 감염 과정에 걸쳐 측정하였으며, 희생 당일에 폐에서 측정하였다. 도 8 패널 B의 결과는 단지 1회 용량의 PanAd3-RSV가 코로 투여된 군은 폐에서의 바이러스 복제를 거의 완전히 약화시킬 수 있음을 명백히 보여주었다. 코로의 PanAd3-RSV 투여는 대조군 동물 (도 9 패널 A) 대비 코 분비물에서 피크 바이러스 로드의 감소된 일시적 수준을 유도하였다. 코로 PanAd3-RSV가 투여되고 근육으로 MVA-RSV가 투여된 군은 상기도 및 하기도 둘 모두에서 바이러스에 대한 불임 면역을 보여주었다 (도 9).
결론:
PanAd3-RSV (IN)와 재조합 단백질 (IM)의 조합물은 재조합 단백질 F의 2회 IM 투여를 갖는 상동성 요법 대비 더욱 강하고 더 길게 지속되는 면역 (실시예 3 및 4)을 유도하였다. 또한, 더 강한 면역 반응이 PanAd3-RSV으로의 IN 프라임과 재조합 단백질 F로의 IM 부스트의 조합에 의해 발생됨을 알 수 있었다. 따라서, 벡터-기반 백신으로의 면역 반응의 프라이밍은 펩티드 백신으로의 프라이밍 대비 펩티드 백신으로의 부스트의 효능을 향상시켰다.
아데노바이러스 벡터와 폭스바이러스 벡터를 갖는 이종성 프라임/부스트 백신접종 요법이 이용되는 경우, 비내 프라임과 근육내 부스트의 조합은 마우스에 대한 실시예 5 및 코튼랫에 대한 실시예 6에서 볼 수 있는 바와 같은 근육내 프라임과 근육내 부스트보다 더욱 강한 면역 반응을 유도하였다. 따라서, 이종성 프라임/부스트 백신접종 요법은 최상의 면역화를 달성하기 위해 두 백신의 투여 경로의 신중한 선택에 의해 최적화될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Okairos AG, et al. <120> Novel prime-boosting regimens involving immunogenic polypeptides encoded by polynucleotides <130> 578-49PCT2 <150> PCT/EP2012/063196 <151> 2012-07-05 <160> 7 <170> BiSSAP 1.0 <210> 1 <211> 360 <212> PRT <213> Respiratory syncytial virus <220> <221> SOURCE <222> 1..360 <223> /mol_type="protein" /organism="Respiratory syncytial virus" <400> 1 Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu 1 5 10 15 Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu 20 25 30 Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu 35 40 45 Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val 50 55 60 Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu 65 70 75 80 Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu 85 90 95 Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn 100 105 110 Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln 115 120 125 Ser Tyr Ser Ile 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Claims (26)

  1. (a) 적어도 하나의 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 작제물을 포함하는 제 1 벡터를 포함하는 프라이밍 조성물 및
    (b) 적어도 하나의 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 작제물을 포함하는 제 2 벡터를 포함하는 적어도 하나의 부스팅 조성물을 포함하며,
    제 1 벡터에 포함된 핵산 작제물에 의해 엔코딩된 면역원성 폴리펩티드의 적어도 하나의 에피토프가 제 2 벡터에 포함된 핵산 작제물에 의해 엔코딩된 면역원성 폴리펩티드의 적어도 하나의 에피토프와 면역학적으로 동일한, 프라임-부스트 (prime-boost) 백신접종 요법에 사용하기 위한 백신 조합물로서,
    (i) 프라이밍 조성물이 비내 투여되고, 후속하여 적어도 하나의 부스팅 조성물이 근육내 투여되거나;
    (ii) 프라이밍 조성물이 비내 투여되고, 후속하여 적어도 하나의 부스팅 조성물이 비내 투여되거나;
    (iii) 프라이밍 조성물이 근육내 투여되고, 후속하여 적어도 하나의 부스팅 조성물이 근육내 투여되거나;
    (iv) 프라이밍 조성물이 근육내 투여되고, 후속하여 적어도 하나의 부스팅 조성물이 비내 투여되는, 백신 조합물.
  2. 제 1항에 있어서, 제 1 벡터가 아데노바이러스 벡터인 백신 조합물.
  3. 제 2항에 있어서, 아데노바이러스 벡터가 인간외 대형 유인원-유래된 아데노바이러스 벡터, 바람직하게는, 침팬지 또는 보노보 아데노바이러스 벡터인 백신 조합물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 제 2 벡터가 폭스바이러스 벡터, 바람직하게는, MVA 또는 아데노바이러스 벡터인 백신 조합물.
  5. 제 4항에 있어서, 제 1 핵산 작제물을 포함하는 아데노바이러스 벡터가 제 2 핵산 작제물을 포함하는 아데노바이러스 벡터와 면역학적으로 상이한 백신 조합물.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중의 어느 한 항에 있어서, 제 1 및/또는 제 2 핵산 작제물이 적어도 두 개의 폴리펩티드를 엔코딩하는 백신 조합물.
  7. 제 6항에 있어서, 폴리펩티드중 하나가 T-세포 반응을 유도하고, 또 다른 폴리펩티드는 B-세포 반응을 유도하는 백신 조합물.
  8. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 제 1 및/또는 제 2 핵산 작제물에 의해 엔코딩된 적어도 두 개의 폴리펩티드가 절단 부위에 의해 연결된 백신 조합물.
  9. 제 8항에 있어서, 절단 부위가 자가-절단 부위 또는 엔도펩티다제 절단 부위인 백신 조합물.
  10. 제 9항에 있어서, 자가-절단 부위가 피코르나바이러스 (Picornavirus), 곤충 바이러스, 아프토비리대 (Aphtoviridae), 로타바이러스 (Rotavirus) 및 트리파노소마 (Trypanosoma)의 바이러스 2A 펩티드 또는 2A-유사 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 2A 절단 부위이며, 바람직하게는, 2A 절단 부위는 족구병 바이러스의 2A 펩티드인 백신 조합물.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중의 어느 한 항에 있어서, 제 1 및 제 2 핵산 작제물에 의해 엔코딩된 면역원성 폴리펩티드의 아미노산 서열이 실질적으로 동일한 백신 조합물.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중의 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 핵산 작제물이 (i) 호흡기세포융합바이러스 (RSV)의 융합 단백질 F, (ii) RSV의 핵단백질 N 및 (iii) RSV의 매트릭스 단백질 M2를 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 백신 조합물.
  13. 제 12항에 있어서, 제 1 및 제 2 핵산 작제물이 (i) RSV의 융합 단백질 F, (ii) RSV의 핵단백질 N 및 (iii) RSV의 매트릭스 단백질 M2를 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 백신 조합물.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중의 어느 한 항에 있어서,
    (i) 제 1 벡터가 아데노바이러스 벡터이고, 제 2 벡터는 폭스바이러스 벡터이거나; 제 1 벡터가 폭스바이러스 벡터이고, 제 2 벡터는 아데노바이러스 벡터이며;
    (ii) 제 1 및 제 2 핵산 작제물이 (i) RSV의 융합 단백질 F, (ii) RSV의 핵단백질 N 및 (iii) RSV의 매트릭스 단백질 M2를 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 백신 조합물.
  15. 제 14항에 있어서, 프라이밍 조성물이 비내 투여되고, 후속하여 적어도 하나의 부스팅 조성물은 근육내 투여되거나; 프라이밍 조성물이 비내 투여되고, 후속하여 적어도 하나의 부스팅 조성물이 비내 투여되는 백신 조합물.
  16. (a) 적어도 하나의 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 작제물을 포함하는 벡터를 포함하는 프라이밍 조성물 및
    (b) 적어도 하나의 면역원성 폴리펩티드를 포함하는 적어도 하나의 부스팅 조성물을 포함하며,
    프라이밍 조성물에 포함된 핵산 작제물에 의해 엔코딩된 면역원성 폴리펩티드의 적어도 하나의 에피토프가 부스팅 조성물에 포함된 면역원성 폴리펩티드의 적어도 하나의 에피토프와 면역학적으로 동일한, 프라임-부스트 백신접종 요법에 사용하기 위한 백신 조합물로서,
    프라이밍 조성물이 근육내 또는 비내 투여되고, 후속하여 적어도 하나의 부스팅 조성물이 투여되는 백신 조합물.
  17. 제 16항에 있어서, 적어도 하나의 부스팅 조성물의 투여가 근육내 또는 비내 투여되는 백신 조합물.
  18. 제 16항 또는 제 17항에 있어서,
    (i) 프라이밍 조성물이 비내 투여되고, 후속하여 적어도 하나의 부스팅 조성물이 근육내 투여되거나;
    (ii) 프라이밍 조성물이 비내 투여되고, 후속하여 적어도 하나의 부스팅 조성물이 비내 투여되거나;
    (iii) 프라이밍 조성물이 근육내 투여되고, 후속하여 적어도 하나의 부스팅 조성물이 근육내 투여되거나;
    (iv) 프라이밍 조성물이 근육내 투여되고, 후속하여 적어도 하나의 부스팅 조성물이 비내 투여되는, 백신 조합물.
  19. 제 16항 내지 제 18항 중의 어느 한 항에 있어서, 벡터가 아데노바이러스 벡터인 백신 조합물.
  20. 제 19항에 있어서, 아데노바이러스 벡터가 인간외 대형 유인원-유래된 아데노바이러스 벡터, 바람직하게는, 침팬지 또는 보노보 아데노바이러스 벡터인 백신 조합물.
  21. 제 16항 내지 제 20항 중의 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물이 적어도 두 개의 폴리펩티드를 엔코딩하는 백신 조합물.
  22. 제 16항 내지 제 21항 중의 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드중 하나가 T-세포 반응을 유도하고, 또 다른 폴리펩티드는 B-세포 반응을 유도하는 백신 조합물.
  23. 제 22항에 있어서, 절단 부위가 자가-절단 부위 또는 엔도펩티다제 절단 부위인 백신 조합물.
  24. 제 21항 내지 제 23항 중의 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물이 (i) RSV의 융합 단백질 F, (ii) RSV의 핵단백질 N 및 (iii) RSV의 매트릭스 단백질 M2를 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 백신 조합물.
  25. 제 16항 내지 제 24항 중의 어느 한 항에 있어서, 면역 반응을 부스팅하기 위한 폴리펩티드가 RSV의 융합 단백질 F인 백신 조합물.
  26. 제 6항 내지 제 13항 또는 제 22항 내지 제 25항 중의 어느 한 항에 있어서, B-세포 반응을 유도하는 폴리펩티드에 대한 B 세포 반응을 증강시키기 위한 백신 조합물.
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