KR20150035726A - 2,4-다이하이드록시부티레이트의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 호모세린의 1차 아미노기를 카르보닐기로 변환하여 2-옥소-4-하이드록시부티레이트를 수득하는 제1 단계, 및 상기 수득된 2-옥소-4-하이드록시부티레이트 (OHB)를 2,4-다이하이드록시부티레이트로 환원하는 제2 단계를 포함하는, 호모세린으로부터 2,4-다이하이드록시부티르산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

2,4-다이하이드록시부티레이트의 제조 방법{METHOD FOR THE PREPARATION OF ２,4-DIHYDROXYBUTYRATE}
본 발명은 2-단계 경로를 포함하는, 호모세린으로부터 2,4-다이하이드록시부티레이트 (2,4-DHB)를 제조하는 새로운 방법에 관한 것이다:
- 호모세린의 1차 아미노기를 카르보닐기로 변환하여 2-옥소-4-하이드록시부티레이트를 수득하는 제1 단계, 및
- 상기 수득된 2-옥소-4-하이드록시부티레이트 (OHB)를 환원시켜 2,4-DHB를 수득하는 제2 단계.
본 출원에서 언급되는 카르복실산은 이의 염 (예를 들어, 2,4-다이하이드록시부티레이트) 또는 산 형태 (예를 들어, 2,4-다이하이드록시부티르산)로 동일하게 지칭된다.
2,4-다이하이드록시부티르산 (2,4-DHB 또는 DHB와 동일시됨)은 상당히 경제적으로 이로운 화합물이다. DHB는 pH를 적절히 조정함으로써, 수성 매질에서 α-하이드록시-γ-부티로락톤으로 쉽게 변환될 수 있다. α-하이드록시-γ-부티로락톤은 거대 동물 영양 시장이 형성된, 메티오닌 대체제인 2-하이드록시-4-(메틸티오)-부티레이트 (HMTB)를 제조하기 위한 주요 전구체이다 (US 2009/318715). 현재, α-하이드록시-γ-부티로락톤은, γ-부티로락톤을 α 위치에서 할로겐화하고, 이어서 할로겐 원자를 알칼리 매질에서 하이드록실기로 치환시키는 것을 포함하는 다단계 공정에 의해, γ-부티로락톤으로부터 유래된다 (US 2009/318715).
유가 상승으로 인해, 재생가능한 자원으로부터 DHB를 제조할 필요성이 생기고 있다. 미생물은 바이오매스 유래의 원료, 예를 들어 당이나 유기산을 여러 가지 화학적 화합물로 변환할 수 있다 (Werpy & Petersen, 2004). 생화학적 및 게놈학적 정보의 증가로, 미생물이 천연적인 대사 중간산물을 고수율로 그리고 고 생산성으로 과다생성하도록, 미생물을 변형할 수 있다 (Bailey, 1991). 생산 미생물의 최적화에는, 때때로, 특히, 대상 대사물질을 생합성하는데 필수적인 효소가 과다발현되고 생성물의 피드백 저해가 완화되도록, 대사성 네트워크의 합리적인 조작이 요구된다. 다른 가능성은 대상 대사물질의 생성을 촉매하는 새로운 효소 시스템을 구현하는 것이다.
대사 공학적 방식과 효소적 촉매 방식은, 대상 대사물질을 생성하는 대사 경로의 조절과 생화학에 대해 상세한 지식을 필요로 한다. DHB를 제조하는 경우, 이러한 정보는 이용가능하지 않다. 단지 몇몇 연구들에서, 숙신산 세미알데하이드 데하이드로게나제(dehydrogenase)가 결핍된 환자에서의 DHB의 생성이 보고되어 있지만, DHB 생성과 관련된 효소 반응은 규명되어 있지 않다 (Shinka et al., 2002). 따라서, 발효에 의해 또는 효소에 의해 DHB를 제조하는 방법에는, (i) 이용가능한 전구체를 DHB로 변환하는, 열역학적으로 실현가능한 경로의 규명, (ii) 상기 경로에서 각각의 반응 단계를 촉매할 수 있는 효소의 동정 및 구축, (iii) 적절한 생산 유기체에서, 경로의 효소들의 기능적 발현이 요구된다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시키는 것을 목적으로 한다.
Chambellon, E., Rijnen, L., Lorquet, F., Gitton, C., van Hylckama Vlieg, J. E. T., Wouters, J. A. & Yvon, M.(2009). The D-2-hydroxyacid dehydrogenase incorrectly annotated PanE is the sole reduction system for branched-chain 2-keto acids in Lactococcus lactis. J. Bacteriol191, 873-881. Cherepanov, P. P. & Wackernagel, W.(1995). Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene158, 9-14. Datsenko, K. A. & Wanner, B. L.(2000). One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A97, 6640-6645. Dykxhoorn, D. M., St Pierre, R. & Linn, T.(1996). A set of compatible tac promoter expression vectors. Gene177, 133-136. Haedicke, O. & Klamt, S.(2010). CASOP: a computational approach for strain optimization aiming at high productivity. J. Biotechnol147, 88-101. Klamt, S., Saez-Rodriguez, J. & Gilles, E. D.(2007).Structural and functional analysis of cellular networks with CellNetAnalyzer. BMC Syst Biol1, 2. Rothman, S. C. & Kirsch, J. F.(2003). How does an enzyme evolved in vitro compare to naturally occurring homologs possessing the targeted function? Tyrosine aminotransferase from aspartate aminotransferase. J. Mol. Biol327, 593-608. Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T.(1989).Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Schuster, S., Dandekar, T. & Fell, D. A.(1999). Detection of elementary flux modes in biochemical networks: a promising tool for pathway analysis and metabolic engineering. Trends Biotechnol17, 53-60. Wellner, D. & Lichtenberg, L. A.(1971). Assay of amino acid oxidase. Methods in Enzymology17, Part B, 593-596.
따라서, 본 발명의 일 목적은, 2-단계 경로를 포함하는, 호모세린으로부터 2,4-DHB의 제조 방법을 제공하는 것이다 (도 1 참조):
- 호모세린의 1차 아미노기를 카르보닐기로 변환하여 OHB를 수득하는 제1 단계, 및
- 상기 수득된 OHB를 환원시켜 2,4-DHB를 수득하는 제2 단계.
본 발명에 따른 방법의 제1 단계 및/또는 제2 단계(들)는 내인성 유전자 또는 이종성 유전자에 의해 코딩되는 효소에 의해 촉매될 수 있다.
상세한 설명에서, 효소 활성은 또한, 이러한 활성을 가진 효소를 코딩하는 유전자를 언급함으로써 명시된다. 유전자의 디노미네이션(denomination)의 사용은 특정한 유기체로 한정되지 않지만, 다른 유기체 (예를 들어, 미생물, 이의 기능성 유사체, 기능성 변이체, 및 이들이 효소 활성을 유지하는 한 기능성 단편)에서 상응되는 모든 유전자 및 단백질을 망라한다.
본 발명의 추가적인 측면에서, 호모세린의 1차 아미노기를 카르보닐기로 변환하여 OHB를 수득하는 효소는 호모세린 트랜스아미나제, 호모세린 데하이드로게나제, 또는 호모세린 옥시다제일 수 있다.
본 발명의 추가적인 측면에서, 호모세린 트랜스아미나제 활성을 가진 제1 효소는 아스파테이트 트랜스아미나제 (EC2.6.1.1) 활성, 분지쇄-아미노산 트랜스아미나제 (EC2.6.1.42) 활성, 또는 방향족-아미노산 트랜스아미나제 (EC2.6.1.57) 활성을 가진 효소들 중에서 동정될 수 있다.
본 발명의 추가적인 측면에서, 호모세린 트랜스아미나제는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli ) 유래의 분지쇄-아미노산 트랜스아미나제, Ec-IlvE 및 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis ) 유래의 분지쇄-아미노산 트랜스아미나제, Ll-BcaT, 에스케리키아 콜라이 유래의 방향족-아미노산 트랜스아미나제, Ec-TyrB, 락토코커스 락티스 유래의 방향족-아미노산 트랜스아미나제, Ll-AraT 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae ) 유래의 방향족-아미노산 트랜스아미나제, Sc-Aro8, 또는 에스케리키아 콜라이 유래의 아스파테이트 트랜스아미나제, Ec-AspC일 수 있다.
본 발명의 제2 단계는 OHB 리덕타제 활성을 가진 효소에 의해 촉매된다. 본 발명의 추가적인 측면에서, OHB 리덕타제 활성을 가진 효소는 2-하이드록시산 데하이드로게나제 활성을 가진 효소들 중에서 동정될 수 있으며, 특히 락테이트 데하이드로게나제 (Ldh) (EC1.1.1.27, EC1.1.1.28), 말레이트 데하이드로게나제 (Mdh) (EC1.1.1.37, EC1.1.1.82, EC1.1.1.299) 활성, 또는 분지쇄 (D)-2-하이드록시산 데하이드로게나제 (EC1.1.1.272, EC1.1.1.345) 활성을 가진 효소들 중에서 동정될 수 있다. 보다 구체적으로는, 호모세린 트랜스아미나제 활성을 가진 효소는 ilvE , tyrB, aspC , araT , bcaT, 또는 ARO8 유전자에 의해 코딩된다.
보다 더 구체적인 측면에서, 호모세린 트랜스아미나제 활성을 가진 효소는 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67 또는 서열 번호 69로 표시되는 서열, 또는 상기 서열과 적어도 50%의 상동성을 공유하는 임의의 서열에 의해 코딩되거나, 또는 서열 번호 60, 서열 번호 62, 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 또는 상기 서열과 적어도 50%의 상동성을 공유하는 임의의 서열에 해당된다.
본 발명의 추가적인 측면에서, OHB 리덕타제 효소는 락토코커스 락티스 유래의 (L)-락테이트 데하이드로게나제 (Ll-LdhA), 오릭탈라구스 쿠니쿨루스(Oryctalagus cuniculus ) 유래의 (L)-락테이트 데하이드로게나제 (Oc-LldhA), 게오바실러스 스테아로터모필루스(Geobacillus stearothermophilus ) 유래의 (L)-락테이트 데하이드로게나제 (Gs-Lldh), 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis ) 유래의 (L)-락테이트 데하이드로게나제 (Bs-Ldh), 에스케리키아 콜라이 유래의 (D)-락테이트 데하이드로게나제 (Ec-LdhA), 에스케리키아 콜라이 유래의 (L)-말레이트 데하이드로게나제 (Ec-Mdh), 또는 락토코커스 락티스 유래의 분지쇄 (D)-2-하이드록시산 데하이드로게나제 (Ll-PanE)일 수 있다.
본 발명의 보다 더 구체적인 측면에서, OHB 리덕타제 효소는 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 288, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 102, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 108, 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 114, 서열 번호 116 또는 서열 번호 118의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 50%의 상동성을 공유하는 임의의 서열로 표시되거나, 또는 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 287, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 101, 서열 번호 103, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115 또는 서열 번호 117로 표시되는 핵산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 50%의 상동성을 공유하는 임의의 서열에 의해 코딩된다.
추가의 측면에서, 본 발명은 또한, OHB를 상기 2,4-DHB로 환원하는 효소의 사용에 관한 것이다.
기능성 변이체 또는 기능성 단편과 같이 상기 효소들과 상동성(homology)을 공유하는 단백질 또한, 본 발명의 또 다른 측면이기도 하다.
"실질적인 상동성"이란 표현은, 구조 및/또는 아미노산 성분 및/또는 생물학적 활성에 관한 상동성을 망라한다.
보다 일반적으로는, 본 발명의 의미에서, 2개의 단백질 서열들 간의 상동성은 당해 기술분야의 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다. 이는 일반적으로, 대상 단백질의 서열과 참조 서열 간의 서열 동일성 %로서 정의된다.
본원에서, 본원에서 동정되는 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열에 대한 "서열 동일성 퍼센트(%)"는, 최대 서열 동일성 %를 달성하도록 서열을 정렬하고 필요에 따라 갭(gap)을 도입하며 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않은 다음, 효소 서열의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드와 일치하는 후보 서열의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 백분율로서 정의된다. 서열 정렬 방법과 서열 동일성을 결정하는 방법은 당업자에게 알려져 있으며, 과도한 실험 없이도 수행할 수 있으며, 동일성 값은 명시된 조건에서 계산하여 구할 수 있다. 예를 들어, Ausubel, et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York); 및 ALIGN program (Dayhoff (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure 5:Suppl. 3 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.)을 참조한다. 서열 정렬과 서열 동일성의 결정에 다수의 알고리즘이 이용될 수 있으며, 예를 들어, Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443의 상동성 정렬 알고리즘; Smith, et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482의 로칼 상동성 알고리즘; Pearson, et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444의 유사성 방법 연구; 스미스-워터맨 알고리즘(Smith-Waterman algorithm) (Meth. Mol. Biol. 70:173-187 (1997); 및 BLASTP, BLASTN, 및 BLASTX 알고리즘 (Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 참조)을 포함한다. 이들 알고리즘을 이용하는 전산화된 프로그램 또한 이용가능하며, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어, 또는 WU-BLAST-2 (Altschul, et al., Meth. Enzym., 266:460-480 (1996)); 또는 GAP, BESTFIT, BLAST (Altschul, et al .), FASTA, 및 TFASTA (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 Genetics Computing Group (GCG) package에서 이용가능함); 및 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 Intelligenetics사의 PC/유전자 프로그램의 CLUSTAL을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 당해 기술분야의 당업자는 비교 서열의 길이에 대한 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 알고리즘을 비롯하여, 정렬을 측정하는 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 바람직하게는, 서열 동일성은 프로그램에 의해 결정되는 디폴트 파라미터(default parameter)를 사용하여 결정된다. 구체적으로는, 서열 동일성은 어파인 갭 검색(affine gap search)과 더불어 하기의 검색 파라미터인 갭 오픈 페널티(gap open penalty) 12, 및 갭 익스텐션 페널티(gap extension penalty) 1을 이용하는 MSPRCH 프로그램 (Oxford Molecular)에서 수행되는 스미스-워터맨 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정된다 (Meth. Mol. Biol. 70:173-187 (1997)). 바람직하게는, 페어드(paired) 아미노산 비교는, blosum62 아미노산 치환 매트릭스, 갭 중량 12 및 길이 중량 2를 적용하는, 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 Genetics Computer Group, Inc.의 GCG 서열 분석 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 2개의 아미노산 서열을 최적으로 정렬하는 것과 관련하여, 변이체 아미노산 서열의 인접한 세그먼트는 참조 아미노산 서열에 대해 아미노산 잔기를 부가할 수 있거나 또는 아미노산 잔기를 제거할 수 있다. 참조 아미노산 서열과의 비교에 사용되는 인접한 세그먼트는 인접한 아미노산 잔기를 20개 이상 포함할 것이며, 30개, 40개, 50개 또는 그 이상의 아미노산 잔기일 수 있다. 유도체의 아미노산 서열에 갭을 포함하는 것과 관련된 서열 동일성 증가에 대한 보정은 갭 페널티(gap penalty)를 지정함으로써 이루어질 수 있다.
동일한 활성을 가진 본 발명에 따른 효소 (OHB 리덕타제, 또는 호모세린의 1차 아미노기를 카르보닐기로 변환하여 OHB를 수득하는 효소)는 약 50%, 70% 또는 85% 이상의 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 약 85% 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 약 95% 이상의 아미노산 서열 동일성, 더욱 더 바람직하게는 98%의 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 바람직하게는, 임의의 아미노산 치환은 L-아미노산을 사용하는 "보존적 아미노산 치환"으로서, 여기서 하나의 아미노산은 생물학적으로 유사한 또 다른 아미노산으로 대체된다. 보존적 아미노산 치환은 치환되는 아미노산의 일반적인 전하(general charge), 소수성/친수성 및/또는 입체 모양(steric bulk)을 보존하는 것들이다. 보존적 치환의 예는 하기의 기들 사이에 존재하는 것들이다: Gly/Ala, Val/Ile/Leu, Lys/Arg, Asn/Gln, Glu/Asp, Ser/Cys/Thr, 및 Phe/Trp/Tyr. 유도체는 예를 들어, 아미노산 잔기가 1개 내지 10개, 예컨대 아미노산 잔기가 6개 내지 10개, 5개, 4개, 3개, 2개, 또는 심지어 1개만큼 차이날 수 있다.
기능성 변이체라는 용어는, 본 출원에 구체적으로 기술된 서열과 비교 시 실질적인 서열 변형을 제시할 수 있지만 본래의 효소 활성은 여전히 가지고 있는 효소를 포함한다.
상기 용어는 또한, 효소의 서열이 본래의 아미노산보다 적은 수의 아미노산을 포함할 수 있지만 본래의 효소 활성은 여전히 가지고 있는 것을 의미한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명의 방법의 제1 단계 및/또는 제2 단계를 촉매하는 효소의 활성은 증가된다. 이러한 증가는 실시예 1 또는 4에 기술된 효소적 분석법에 의해 측정될 수 있다.
상기 효소의 개선은 1가지 이상의 돌연변이에 의해 수득될 수 있으며, 상기 돌연변이(들)는 (i) 호모세린 또는 OHB 각각에 대한, 돌연변이 효소의 활성 및/또는 기질 친화성을 개선하거나, 또는 (ii) 이들의 천연 기질에 대한 돌연변이 효소의 활성 및/또는 기질 친화성을 감소시키는 것이다.
본 발명에서, "활성 및/또는 기질 친화성을 개선한다"라는 표현은, 돌연변이 전의 효소가:
- 기질을 사용할 수 없었거나, 및/또는
- 반응 산물을 적어도 3배 더 낮은 최대 비속도 (specific rate)로 합성하였거나, 및/또는
- 호모세린 또는 OHB에 대한 친화성이 적어도 3배 더 낮았으며,
- 천연 기질에 대한 최대 비활성은 3배 이상 더 높았으며, 및/또는
- 천연 기질에 대한 친화성이 3배 이상 더 높았음을 의미한다.
보다 추가적인 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법의 제1 단계 및 제2 단계를 촉매하는 효소를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 보다 더 구체적인 측면에서, OHB 리덕타제 효소는 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 287, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 101, 서열 번호 103, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115 또는 서열 번호 117로 표시되는 핵산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 50%의 상동성을 공유하는 임의의 서열에 의해 코딩된다.
본 발명에 따른 OHB 리덕타제는 구체적인 측면에서, 야생형 효소와 비교해 V17, Q85, E89, I226, 또는 A222의 위치들 중 하나 이상에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 (L)-락테이트 데하이드로게나제 A에 상응한다. 이들 위치는 락테이트 데하이드로게나제 패밀리에 보존되어 있으며, 이들은 본 맥락에서 락토코커스 락티스 (L)-락테이트 데하이드로게나제 A (서열 번호 6)를 참조하여 명시된다. 그런 다음, 당해 기술분야의 당업자는 상응하는 아미노산 서열들을 정렬함으로써 다른 락테이트 데하이드로게나제에서 상응하는 아미노산 잔기를 쉽게 동정할 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 다른 락테이트 데하이드로게나제 효소에서 이들 아미노산을 변화시킨다.
본 발명에 따른 OHB 리덕타제는 구체적인 측면에서, 야생형 효소와 비교해 I12, R81, M85, D86, V93, G179, T211 또는 M227의 위치들 중 하나 이상에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 (L)-락테이트 데하이드로게나제에 상응한다. 이들 위치는 말레이트 데하이드로게나제 패밀리에 보존되어 있으며, 이들은 본 맥락에서 에스케리키아 콜라이 (L)-말레이트 데하이드로게나제의 서열 (서열 번호 2)을 참조하여 명시된다. 그런 다음, 당해 기술분야의 당업자는 상응하는 아미노산 서열들을 정렬함으로써 다른 말레이트 데하이드로게나제에서 상응하는 아미노산 잔기를 쉽게 동정할 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 다른 말레이트 데하이드로게나제 효소에서 이들 아미노산을 변화시킨다.
본 발명에 따르면, "핵산 서열"은 단일 또는 이중 가닥 형태의 DNA 또는 RNA 분자, 바람직하게는 DNA 분자를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "분리된 DNA"는, 천연적이지 않거나, 또는 더 이상 원래 존재하였던 천연 환경에 있지 않은 DNA를 지칭하며, 예를 들어, 키메라 유전자 형태로 또 다른 조절 인자와 조합된 DNA 코딩 서열, 다른 숙주 세포로 이동된 DNA, 또는 임의의 자연 발생 DNA 서열과 비교해 상이한 뉴클레오티드 서열을 가진 인공적인 합성 DNA 서열을 지칭한다.
본 발명은 또한, 숙주 유기체에서 기능하는 하나 이상의 프로모터, 본 발명에 따라 정의된 방법의 제1 단계 및 제2 단계를 촉매하는 효소 중 임의를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 동일한 숙주 유기체에서 기능하는 종결 인자를 서로 기능적으로 연결하여 포함하는, 키메라 유전자에 관한 것이다. 키메라 유전자에 포함될 수 있는 다양한 요소는, 첫째, 프로모터, 신호 펩티드나 트랜지트 (transit) 펩티드를 코딩하는 서열, 또는 폴리아데닐화 신호를 구성하는 종결 인자와 같이, 단백질의 전사, 번역 및 성숙을 조절하는 요소이며, 둘째, 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. "서로 기능적으로 연결된"이라는 표현은, 키메라 유전자의 상기 요소들 중 어느 하나의 기능이 또 다른 요소의 기능에 의해 영향을 받도록, 이들 요소들이 서로 연결되어 있다는 것을 의미한다. 예로, 프로모터가, 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있을 때, 상기 코딩 서열에 기능적으로 연결되어 있는 것이다. 본 발명에 따른 키메라 유전자의 제작, 및 이의 다양한 요소들의 어셈블리는, 당해 분야의 당업자에게 잘 공지된 기술로 수행될 수 있다. 키메라 유전자를 이루는 조절 인자들의 선택은, 이들이 기능해야 하는 숙주 유기체에 따라 필연적으로 다르며, 당해 분야의 당업자는 소정의 숙주 유기체에서 기능하는 조절 인자를 선택할 수 있다. "기능성"이라는 용어는, 소정의 숙주 유기체에서 기능할 수 있음을 의미하는 것이다.
본 발명에 따른 키메라 유전자에 포함될 수 있는 프로모터는 구성적 프로모터(constitutive promoter) 또는 유도성 프로모터(inducible promoter)이다. 예로, 박테리아의 발현에 사용되는 프로모터는 후술하는 프로모터들로부터 선택될 수 있다. 에스케리키아 콜라이에서의 발현의 경우, lac, trp, lpp, phoA, recA, araBAD, prou, cst-l, tetA, cadA, nar, tac, trc, lpp-lac, Psyn, cspA, PL, PL-9G-50, PR-PL, T7, [람다]PL-PT7, T3-lac, T5-lac, T4 유전자 32, nprM-lac, VHb 및 단백질 A 프로모터, 또는 심지어 Ptrp 프로모터 (WO 99/64607)가 언급될 수 있다. 코리네박테리아나 스트렙토마이세스와 같은 그람-양성 박테리아에서 발현하는 경우, PtipA 또는 PS1 및 PS2 (FR91/09870) 프로모터나, 특허 출원 제EP0629699A2 호에 기술된 것들이 언급될 수 있다. 효모와 균류에서 발현하는 경우, 클루이베로마이세스 락티스 PLAC4 프로모터 또는 클루이베로마이세스 락티스 Ppgk 프로모터 (특허 출원 제FR 91/05294 호), 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei) tef1 또는 cbh1 프로모터 (WO 94/04673), 페니실리움 푸니쿨로숨(Penicillium funiculosum) his, csl 또는 apf 프로모터 (WO 00/68401), 및 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) gla 프로모터가 언급될 수 있다.
본 발명에 따르면, 키메라 유전자는, 프로모터와 코딩 서열 사이에 위치된, 전사 활성자 (인핸서)와 같은 다른 조절 서열도 포함할 수 있다.
이처럼, 본 발명의 키메라 유전자는, 구체적인 실시 양태에서, 숙주 유기체에서 기능하는 하나 이상의 프로모터 조절 서열, 본 발명에 따라 정의된 방법의 제1 단계 및 제2 단계를 촉매하는 임의의 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 코딩하는 핵산 서열, 및 상기 숙주 유기체에서 기능하는 종결인자 조절 서열을, 전사 방향으로 기능적으로 연결된 방식으로 포함한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 키메라 유전자 또는 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 클로닝 벡터 및/또는 발현 벡터에 관한 것이다. 본 발명에 따른 벡터는 숙주 유기체를 형질전환하고, 이 유기체에서 본 발명의 방법의 제1 단계 및/또는 제2 단계(들)를 촉매하는 효소 중 어느 하나를 발현하는데 사용된다. 이 벡터는 플라스미드, 코스미드, 박테리오파지 또는 바이러스일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 형질전환 벡터는 플라스미드이다. 일반적으로, 이 벡터의 주 특징은, 숙주 유기체 세포에서 스스로 유지하고, 특히 복제 기원이 존재해서 자가복제하며, 본 발명의 방법의 제1 단계 및/또는 제2 단계(들)를 촉매하는 효소 중 어느 하나를 세포 안에서 발현할 수 있어야 하는 것이다. 숙주 유기체의 안정적인 형질전환을 위해서는, 벡터가 게놈에 삽입될 수도 있다. 이러한 벡터의 선택과, 본 발명에 따른 키메라 유전자를 상기 벡터에 삽입하는 기술은, 당해 분야의 당업자가 가지고 있는 일반적인 지식의 일부이다. 유리하게는, 본 발명에서 사용되는 벡터는, 본 발명에 따른 키메라 유전자 외에도, 선별 마커를 코딩하는 키메라 유전자도 포함한다. 상기 선별 마커는, 효과적으로 형질전환된 숙주 유기체, 즉, 벡터가 삽입된 유기체를 선별할 수 있게 한다. 본 발명의 특정 실시 양태에 따르면, 형질전환되는 숙주 유기체는 박테리아, 효모, 균류이다. 사용될 수 있는 선별 마커 중에서도, 예를 들어, 하이그로마이신포스포트랜스퍼라아제(hygromycinphosphotransferase) 유전자와 같은 항생제 내성 유전자를 포함하는 마커가 언급될 수 있다. 다른 마커로는, 영양요구를 보완하는(complement) 유전자, 예컨대 pyrA, pyrB, pyrG, pyr4, arg4, argB 및 trpC 유전자, 몰리브도프테린 신타제(synthase) 유전자, 또는 아세타미다아제(acetamidase) 유전자일 수 있다. GUS 효소와 같이 쉽게 동정될 수 있는 효소를 코딩하는 유전자나, 형질전환된 세포에서 색소를 코딩하는 유전자 또는 색소 생성을 조절하는 효소가 언급될 수도 있다. 이러한 선별 마커 유전자는 특히 특허 출원 제WO 91/02071 호, 제WO 95/06128 호, 제WO 96/38567 호, 및 제WO 97/04103 호에 기술되어 있다.
본 발명은 또한, 변형된 미생물에 관한 것이다.
보다 구체적으로는, 본 발명의 변형된 미생물에서, 하기를 포함하는 2-단계 경로에 의해 호모세린으로부터 2,4-DHB를 제조할 수 있다:
- 호모세린의 1차 아미노기를 카르보닐기로 변환하여 2-옥소-4-하이드록시부티레이트를 수득하는 제1 변환 단계, 및
- 상기 수득된 2-옥소-4-하이드록시부티레이트를 환원시켜 2,4-다이하이드록시부티레이트를 수득하는 제2 단계.
상기 2가지 단계에 관여하는 효소는 전술한 것들이다.
"미생물"이라는 용어는, 2,4-DHB를 제조하기 위해, 본 발명에 따른 키메라 유전자(들), 핵산(들) 또는 벡터(들)가 도입될 수 있는 임의의 하등 단세포 유기체를 의미하는 것이다. 바람직하게는, 숙주 유기체는 미생물, 특히 균류, 예를 들어, 페니실리움, 아스페르길루스, 특히 아스페르길루스플라부스 (Aspergillusflavus), 크리소스포리움 (Chrysosporium) 또는 트리코데르마 속의 균류; 효모, 특히 사카로마이에테이시이(Saccharomycetaceae), 피키에이시이(Pichiaceae) 또는 스키조사카로마이세테이시이(Schizosaccharomycetaceae)과의 효모, 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마륵시아누스(Kluyveromyces marxianus), 또는 피키아 야디니이(Pichia jadinii), 피키아 스티피티스(Pichia stipitis) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris); 박테리아, 바람직하게는 엔테로박터리아세애(Enterobacteriaceae), 클로스트리디에이시이(Clostridiaceae), 바실레이시이(Bacillaceae), 스트렙토마이세테이시이, 스트렙토코케이시이(Streptococcaceae), 메틸로박터리에이시(Methylobacteriacae), 및 코리네박테리에이시이(Corynebacteriaceae)로부터 선택되는 박테리아, 가장 바람직하게는 에스케리키아 콜라이, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 코리네박테리아 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 메틸로박테리아 엑스토?스(Methylobacterium extorquens), 또는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)이다.
본 발명은 또한, 게놈에 병합되거나 또는 플라스미드와 같은 염색체-외 유전자 요소로 전달된 본 발명에 따른 하나 이상의 키메라 유전자를 포함하는 변형된 미생물에 관한 것이다. 본 발명의 보다 구체적인 측면에서, 형질전환된 숙주 유기체는, 호모세린의 1차 아미노산 기를 카르보닐기로 변환하여 OHB를 수득하는 폴리펩타이드를 코딩하는 본 발명의 핵산, 및/또는 2,4-DHB에서 OHB를 환원하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 또는 호모세린의 1차 아미노산 기를 카르보닐기로 변환하여 OHB를 수득하는 폴리펩타이드 및/또는 OHB 리덕타제를 코딩하는 핵산을 포함하는 키메라 유전자, 또는 호모세린의 1차 아미노산 기를 카르보닐기로 변환하여 OHB를 수득하는 폴리펩타이드 또는 OHB 리덕타제 활성을 가진 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함한다.
본 발명의 추가적인 측면에서, 호모세린을 DHB로 변환시키는 합성 경로는 호모세린의 생성이 증가된 미생물에서 발현된다. 미생물에서 호모세린의 생성 증가는 (i) 아스파테이트 키나제, 아스파테이트 세미알데하이드 데하이드로게나제, 및 호모세린 데하이드로게나제 효소의 과발현, (ii) 라이신, 메티오닌, 또는 트레오닌에 의해 발생될 수 있는 생성물 저해에 대한 아스파테이트 키나제 효소의 둔감화, 및 (iii) 호모세린 생합성 경로에서 분기된 대사 경로를 없앰으로써 달성될 수 있다. 아스파테이트 키나제, 아스파테이트 세미알데하이드 데하이드로게나제, 및 호모세린 데하이드로게나제의 과발현은 적절한 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터의 조절 하에 멀티카피수의(multicopy) 플라스미드로부터 효소를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 다른 예로, 상기 효소의 과발현은 아스파테이트 키나제, 아스파테이트 세미알데하이드 데하이드로게나제, 및 호모세린 데하이드로게나제를 코딩하는 유전자의 전사를 제한하는 전사 억제자를 제거함으로써 달성될 수 있다. 아스파테이트 키나제는, 적절한 돌연변이를 이들의 아미노산 서열에 도입함으로써 아스파테이트-유래 아미노산에 의한 저해에 둔감해질 수 있다. 호모세린 생합성 경로에서 분기되는 대사 경로의 도입점(entry point)은 O-숙시닐 호모세린 신타제 활성 또는 O-아세틸 호모세린 신타제 활성 (메티오닌 생합성으로의 도입), 호모세린 키나제 활성 (트레오닌 생합성으로의 도입), 또는 다이아미노피멜레이트 데카르복실라제 활성 (라이신 생합성으로의 도입)을 가진 효소에 의해 촉매된다. 상기 효소 활성을 가진 단백질을 코딩하는 유전자의 결손은 아스파테이트-유래 아미노산의 형성을 방지하므로, 따라서 호모세린 형성에 도움이 된다.
이에, 에스케리키아 콜라이에서 metA, thrB, 및 lysA 유전자의 결손은 호모세린 생합성 경로로부터 분기된 경로를 약화시킨다. 에스케리키아 콜라이에서 호모세린 경로의 효소 활성의 증가는 예를 들어, 2가지 기능을 가진 아스파테이트 키나제-호모세린 데하이드로게나제 돌연변이 thrA S345F (트레오닌 저해에 둔감함) 및 asd (둘 다 에스케리키아 콜라이 유래의 유전자임)의 과발현; 또는 1가지 기능을 가진 아스파테이트 키나제 돌연변이 lysC E250K (라이신에 둔감함), asd (둘 다 에스케리키아 콜라이 유래의 유전자임), 및 사카로마이세스 세레비지애 유래의 호모세린 데하이드로게나제 유전자 HOM6의 과발현에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 미생물은 또한, 호모세린을 유출하는 능력이 약화되어 있어, 이러한 아미노산의 세포내 이용가능성이 증가될 수 있다. 세포로부터 호모세린의 유출을 낮추기 위해, 호모세린을 유출할 수 있는 퍼미아제(permease)가 결손될 수 있다. 이 퍼미아제는 게놈 라이브러리를 미생물에서 과발현시키고, 상기 미생물을 호모세린, 또는 트레오닌, 루신 또는 아스파테이트와 같이 구조적으로 유사한 아미노산의 저해성 농도에서 배양함으로써 동정할 수 있다 (Zakataeva et al. 1999/FEBS Lett/452/228-232). 과발현 시 상기 아미노산들 중 어느 하나가 증가된 농도에서 증식을 부여하는 유전자는 호모세린 유출에 참여하는 것임이 틀림없다.
추가의 측면에서, 본 발명의 미생물인 에스케리키아 콜라이는 호모세린 유출 수송체인 rhtA , rhtb , 및/또는 rhtC가 결손된 것이다.
효율적인 DHB 생성은, DHB 합성을 위한 보조인자의 공급 최적화와 DHB 이외의 대사 부산물의 형성을 유발하는 경쟁 경로의 약화와 관련하여, 숙주 유기체의 대사 네트워크에서 탄소 흐름의 재분배를 최적화함으로써 확보할 수 있다. 균주ㅜ개량을 위한 중요한 툴은 제약 기반의 유량 밸런스 분석(constraint-based flux balance analysis)이다. 이 방법으로 배양 조건에 따른 해당 대사 네트워크의 이론적인 수율을 계산할 수 있으며, 과발현 또는 결손시킬 대사 표적을 쉽게 동정할 수 있다. 대사적인 표적 반응을 과발현 또는 제거하는 데 사용되는 실험 기술은 개시되어 있다 (실시예 8).
이에, 본 발명의 미생물은 또한, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, 이소시트레이트 리아제, 피루베이트 카르복실라제 및 헥소스 심포터 퍼미아제로부터 선택되는 효소 활성의 증가, 및/또는 락테이트 데하이드로게나제, 알코올 데하이드로게나제, 아세테이트 키나제, 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제, 피루베이트 옥시다제, 이소시트레이트 리아제, 푸마라제, 2-옥소글루타레이트 데하이드로게나제, 피루베이트 키나제, 말릭(malic) 효소, 포스포글루코스 이소머라제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, 피루베이트-포르메이트 리아제, 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제, 당-수송 포스포트랜스퍼라제, 케토하이드록시글루타레이트 알돌라제, 호모세린-O-숙시닐 트랜스퍼라제, 호모세린 키나제, 호모세린 유출 수송체, 다이아미노피멜레이트 데카르복실라제, 및/또는 메틸글리옥살 신타제로부터 선택되는 하나 이상의 효소 활성의 감소를 나타낼 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명의 미생물인 에스케리키아 콜라이는, 모두 에스케리키아 콜라이 유래의 ppc , pck , aceA , galP , asd , thrA , metL , lysC; 락토코커스 락티스 유래의 pycA로부터 선택되는 유전자들 중 하나 이상을 과발현하거나, 및/또는 ldhA , adhE , ackA , pta , poxB , focA , pflB , sad , gabABC , sfcA , maeB , ppc , pykA , pykF, mgsA , sucAB , ptsI , ptsG , pgi , fumABC , aldA , lldD , iclR , metA , thrB , lysA , eda , rhtA , rhtB , rhtC로부터 선택되는 유전자들 중 하나 이상이 결손되어 있다.
본 발명은 또한, 하기의 단계를 포함하는 2,4-DHB의 제조 방법을 포함한다:
- 본 발명의 변형된 미생물을 적절한 배양 배지에서 배양하는 단계,
- 상기 배양 배지로부터 2,4-DHB를 회수하는 단계.
상기 2,4-DHB는 추가로 정제될 수 있다.
생성물 분리 및 정제는 총 공정 효율과 생성물 단가에 크게 영향을 미치는 매우 중요한 요소이다. 생성물 회수 방법은 보편적으로, 세포 분리, 뿐만 아니라 생성물 정제, 농축 및 건조 단계를 각각 포함한다.
세포 분리
발효 배지에서 세포를 분리하기 위해, 한외여과 및 원심분리가 사용될 수 있다. 발효 배지에서의 세포 분리는, 배지의 높은 점성으로 인해 종종 복잡해진다. 따라서, 본 발명자들은, 세포 분리를 최적화하기 위해, 무기산이나 알칼리염과 같은 첨가제를 첨가하거나, 배양 브로스(culture broth)를 열처리할 수 있다.
생성물 회수
바이오매스 제거 전이나 후에, DHB 분리에 다양한 이온-교환 크로마토그래피 방법이 이용될 수 있다. 이 방법은, 생성물을 이들의 등전점에 따라 쉽게 분리하는, 1차 양이온 교환 수지의 사용을 포함한다. 전형적으로, 수지에 용액을 넣고 용리액의 pH를 (예를 들어, 수산화암모늄의 첨가에 의해) 높임으로써 체류 산물을 분리하여 용리시킨다. 다른 가능성으로는, 고정층 또는 모사 이동층 수지를 사용하는 이온-교환 크로마토그래피를 이용하는 것이다. 적합한 생성물 순도를 수득하기 위해서는, 여러 가지 크로마토그래피 단계를 조합해야 할 수도 있다. 이러한 정제 방법은 고비용의 결정화 단계에 비해 보다 경제적이며, 최종 산물의 형태와 관련해 부가적인 이점과 유연성을 제공해준다.
생성물 농축 및 건조
정제 공정은, 분무 과립 건조기, 분무 건조기, 드럼 건조기, 회전 건조기, 및 터널 건조기와 같은 임의의 적절한 건조 수단을 수반할 수 있는 건조 단계를 포함할 수도 있다. 농축된 DHB 용액은, 다목적 농축기나 박막 증발기를 사용하는 경우, 130℃에서 증기로, 감압 하에 발효조를 가열함으로써 수득할 수 있다.
도 1: 호모세린의 1차 아미노기를 카르보닐기로 변환하여 OHB를 수득하는 제1 단계, 및 상기 수득된 OHB를 2,4-DHB로 환원하는 제2 단계를 이용하는 2-단계 경로를 포함하는, 호모세린으로부터 2,4-DHB를 제조하는 방법.
도 2: Q85 위치에서 돌연변이된, 정제된 락토코커스 락티스 락테이트 데하이드로게나제의 비활성. (A) OHB에 대한 비활성, (B) 피루베이트에 대한 비활성, (C) OHB 및 피루베이트에 대한 Vmax 값의 비로서 표현된 기질 특이성. 그래프 C에서 1보다 큰 값은 OHB에 대한 선호성을 의미한다 (효소 활성의 포화는 0 mM 내지 50 mM OHB 또는 피루베이트에서 돌연변이된 효소에 대한 기질에서 수득되지 않았음). 활성은 20 mM의 기질 농도에서 측정하였다.
도 3: R81 위치에서 돌연변이된, 정제된 에스케리키아 콜라이 말레이트 데하이드로게나제의 비활성. (A) OHB에 대한 비활성, (B) 옥살로아세테이트에 대한 비활성. 활성은 20 mM OHB 또는 0.5 mM 옥살로아세테이트의 기질 농도에서 측정하였다.
하기의 비-한정적인 실시예는 본 발명을 예시한다.
실시예 1: OHB 리덕타제 활성의 시험
락테이트 데하이드로게나제 또는 말레이트 데하이드로게나제를 코딩하는 야생형 유전자를 포함하는 플라스미드의 제작:
에스케리키아 콜라이의 (L)-말레이트 데하이드로게나제, Ec - mdh (서열 번호 1), 에스케리키아 콜라이의 (D)-락테이트 데하이드로게나제, Ec - ldhA (서열 번호 3), 락토코커스 락티스의 (L)-락테이트 데하이드로게나제, Ll - ldhA (서열 번호 5), 바실러스 서브틸리스의 (L)-락테이트 데하이드로게나제, Bs - ldh (서열 번호 7), 게오바실러스 스테아로터모필루스의 (L)-락테이트 데하이드로게나제, Gs - ldh (서열 번호 9), 오릭탈라구스 쿠니쿨루스의 (L)-락테이트 데하이드로게나제의 2가지 이소형, Oc - ldhA (서열 번호 11 및 서열 번호 13)을 코딩하는 유전자는 하이-피델리티 폴리머라제 PhusionTM (Fermentas) 및 표 1에 열거된 프라미어를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 에스케리키아 콜라이 MG1655, 락토코커스 락티스 IL1403, 및 바실러스 서브틸리스 균주 168의 게놈 DNA를 주형으로 사용하였다. 유전자 Oc - ldhA , 및 Gs - ldh는 에스케리키아 콜라이에서 발현을 위해 코돈-최적화하고, MWG Eurofins에서 합성하였다. 프라이머로 개시 코돈의 상류와 정지 코돈의 하류에 각각 제한효소 부위 (표 1)를 도입하여, PCR 절단 산물이 T4 DNA 리가제 (Fermentas)에 의해 pET28a+ (Novagen) 발현 벡터의 상응하는 부위에 쉽게 연결되게 하였다. 연결 산물을 에스케리키아 콜라이 DH5α 세포 (NEB)에 형질전환하였다. 제조된 pET28-Ec-mdh, pET28-Ec-ldhA, pET28-Ll-ldhA, pET28-Bs-ldh, pET28-Gs-ldh, 및 pET28-Oc-ldhA 플라스미드를 분리하고, 에스케리키아 콜라이 mdh , 에스케리키아 콜라이 ldhA , 락토코커스 락티스 ldhA , 바실러스 서브틸리스 ldh , 게오바실러스 스테아로터모필루스 ldh , 및 오릭탈라구스 쿠니쿨루스 ldhA 유전자의 올바른 전장 서열의 함유 여부를 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다. 해당 단백질 서열은 각각 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12 및 서열 번호 14로 표시된다.
표 1: 후보 효소의 증폭 및 클로닝에 사용되는 프라이머 서열 및 제한효소 부위
유전자 정방향 프라이머 서열 및 역방향 프라이머 서열
5'-3' 		제한효소 부위
Ec - mdh TATAATCATATGAAAGTCGCAGTCCTC (서열 번호 15)

TATAATGGATCCTTACTTATTAACGAACTC (서열 번호 16)		 NdeI

BamHI
Ll - ldhA TATAATCATATGGCTGATAAACAACGTAAAAAA (서열 번호 17)

TATAATGGATCCTTAGTTTTTAACTGCAGAAGCAAA (서열 번호 18)		 NdeI

BamHI
Bs _ ldh TATAATGCTAGCATGATGAACAAACATGTAAATAAAGT (서열 번호 19)
TATAATGGATCCTTAGTTGACTTTTTGTTC (서열 번호 20)		 NdeI
BamHI
Gs - ldh 유전자는 pET28a 벡터에서 MWG Eurofins™에 의해 전달되었음. NdeI
BamHI
Oc - ldhA TATAATGCTAGCATGGCGGCGTTGAAAGAC (서열 번호 21)

ATTATAGAATTCTTAAAATTGCAGTTCTTT(서열 번호 22)
 NheI
EcoRI
Ll - panE TATAATCATATGAGAATTACAATTGCCGG(서열 번호 23)

TATAATGGATCCTTATTTTGCTTTTAATAACTCTTCTTTGC(서열 번호 24)
 NdeI
BamHI
Ec - ldhA TATAATCATATGAAACTCGCCGTTTATAG(서열 번호 25)

TATAATGGATCCTTAAACCAGTTCGTTCGG(서열 번호 26)
 NdeI
BamHI
효소 발현: 에스케리키아 콜라이 BL21 (D3) star 세포를 표준 유전자 프로토콜을 이용해 적절한 플라스미드로 형질전환하였다 (Sambrook, Fritsch, & Maniatis, 1989). 하룻밤 배양한 배양물을 OD600 0.1로 접종하여 OD600 0.6으로 증식시킨 후, 1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토파리노시드 (IPTG)를 배양 배지에 첨가하여 단백질 발현을 유도하여, 50 mL LB 배양액에서, N-말단 헥사-His 태그가 결합된 효소를 발현시켰다. 단백질 발현 15시간 후, 4℃, 4000 g에서 10분 동안 원심분리하여 상층액은 제거하고, 세포를 회수하였다. 세포 펠렛은 다음 분석시까지 -20℃에 보관하였다. 증식 및 단백질 발현은 25℃에서 수행하였다. 배양 배지에는 50 ㎍/mL로 카나마이신을 첨가하였다.
효소 정제: 동결시킨 발효 배양물의 세포 펠렛을 0.5 mL의 분해 완충액 (50 mM Hepes, 300 mM NaCl, pH 7.5)에 재현탁하고, 전력 출력이 30%로 세팅된 초음파를 4 회 연속으로 처리하여, 분해하였다 (초음파 처리 간격: 20초, 파워 출력: 30%, 소니케이터(sonicator): Bioblock Scientific사 제품, Vibracell™ 72437). 조 (crude) 추출물을 4℃, 4000 g에서 15 분 동안 원심분리하여 세포 파편들을 제거하고, 맑은 상층액을 수득하였다. 15 mg/mL로 스트렙토마이신 설페이트 (시그마 (Sigma) 사 제품)를 첨가하고, 샘플을 4℃, 13000 g에서 10 분 동안 원심분리하여, 상층액을 수득함으로써, RNA 및 DNA를 추출물에서 제거하였다. 맑은 단백질 추출물을, Talon™ 코발트 친화성 수지 (Clontech사 제품) 0.75 mL (베드 부피)과 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 현탁물을 테이블 탑 원심분리기, 700 g에서 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 10 베드 부피의 세정 완충액 (50 mM Hepes, 300 mM NaCl, 15 mM 이미다졸, pH 7.5)으로 수지를 세정한 후, 0.5 mL의 용리 완충액 (50 mM Hepes, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸, pH 7.5)으로 단백질을 용리하였다. 용리된 효소의 순도는 SDS-PAGE 분석으로 확인하였다. 단백질 농도는 브래드포드(Bradford) 방법으로 측정하였다 (Bradford (1976, Anal. Biochem. 72: 248-54). 락테이트 데하이드로게나제 효소를 안정화하기 위해, 용리 완충액을 pH 7로 조절한 100 mM 포스페이트 완충제에 의해 체계적으로 교체하였다. 단백질 샘플을 AmiconTM Ultra 원심분리 필터 (컷-오프 10 kDa)로 옮기고, 4000 g, 4℃에서 8분간 원심분리하여, 완충제를 제거하였다. 단백질은 포스페이트 완충제로 희석하고, 이 과정을 4번 반복하였다.
효소적 분석법: 반응 혼합물에는 60 mM Hepes (pH 7), 50 mM 포타슘 클로라이드, 5 mM MgCl2, 0.25 mM NADH, (선택적으로는 5 mM 프룩토스-1,6-비스포스페이트) (모두 Sigma사 제품), 및 적절한 양의 정제된 말레이트 또는 락테이트 데하이드로게나제 또는 세포 추출물이 포함되었다. 2-옥소-4-하이드록시부티레이트(OHB), 피루베이트, 또는 옥살로아세테이트(OAA)를 적당량 첨가하여 반응을 개시하였다. 효소적 분석은 96-웰 평판 마이크로타이터 플레이트에서 최종 부피 250 ㎕로 37℃에서 수행하였다. 반응물은 이후 마이크로플레이트 판독기 (BioRad 680XR)에서 340 nm (εNADH = 6.22 mM-1 cm-1)에서의 NADH의 특징적인 흡광도 분석을 수행하였다.
OHB는, 37℃, pH 7.8, 100 mM Tris 완충제에서 125 mM 호모세린을 뱀독 (L)-아미노산 옥시다제 (1.25 U/mL, Sigma) 및 카탈라제 (4400 U/mL, Sigma)와 함께 90분 동안 인큐베이션하여 합성하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 컷-오프 10 kDa의 AmiconTM Ultra 원심분리 필터에서 정제하여, 효소를 제거하였다 (Wellner & Lichtenberg, 1971에서 개량된 방법).
시험 용액 100 ㎕를, 1 M 소듐 아르세네이트 및 1 M 붕산을 포함하는 용액 1 mL와 함께 pH 6.5에서 혼합함으로써 OHB를 정량하였다. 상기 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하고, 325 nm에서의 흡광도를 이용하여 OHB를 정량하였다. 케톤의 흡광도와 농도 간의 관계는 기지 농도의 피루베이트 용액을 사용하여 보정하였다 ((Wellner & Lichtenberg, 1971)로부터 채택된 방법). 상기 방법의 전형적인 OHB 수율은 90%였다.
결과: 시험 효소의 천연 기질 및 OHB에 대한 카이네틱 파라미터를 표 2에 열거한다. 유의한 OHB 리덕타제 활성이 서로 다른 생물학적 기원의 락테이트 데하이드로게나제 모두에서 확인되었다. 에스케리키아 콜라이의 말레이트 데하이드로게나제인 Mdh만 OHB에 대해 매우 미미한 활성을 나타내었다. 락토코커스 락티스 유래의 분지쇄 2-옥소산 데하이드로게나제인 PanE 또한, OHB에 대해 유의한 활성을 나타내었다.
표 2: 천연 기질 및 OHB에 대한 선별된 후보 효소의 카이네틱 파라미터에 대한 요약
최대 비활성
[μ mol /( mg min )] 		기질 친화성, Km
[ mM ]
효소 천연 기질 a OHB b 천연 기질 a OHB
Ec-Mdh 95.6 0.01 0.04 ns
Ll-Ldh 184 18 2.7 ns
Gs-Ldh 87.7 66.8 1.2 1.3
Bs-Ldh 170 15.7 nd ns
Ll-PanE nd 2.58 nd ns
Oc-LdhA 68.3 6.5 1.5 13
Ec-LdhA 265 0.56 1.8 4.8
(a) Mdh 및 Ldh에 대한 천연 기질은 각각 옥살로아세테이트 및 피루베이트임.
(b) 효소가 포화될 수 없는 경우, 최대 비활성은 20 mM 기질 농도에서 추정되는 활성을 지칭함.
ns - 포화되지 않음.
nd - 측정되지 않음.
실시예 2: OHB 리덕타제 활성이 향상된 락테이트 데하이드로게나제 효소의 제작
주형으로 pET28-Ll-ldhA 플라스미드를 사용하여, 락토코커스 락티스 ldhA 유전자의 부위 특이적인 돌연변이유발을 수행하였다. 아미노산 서열을 바꾸기 위해, 표 3에 열거된 올리고뉴클레오타이드 쌍을 사용하여 PCR (Phusion 1 U, HF 완충액 20% (v/v), dNTPs 0.2 mM, 정방향 및 역방향 프라이머 각각 0.04 μM, 주형 플라스미드 30-50 ng, 물)로 점 돌연변이를 도입하였다. PCR에 의해 돌연변이화된 유전자는 표 3에 열거된 새로운 제한효소 부위 (침묵 돌연변이로 도입됨) 외에도, 돌연변이된 클론의 동정을 용이하게 하는 기능성 돌연변이를 포함하였다. 주형 DNA를 제거하기 위해, PCR 산물을 37℃에서 1시간 동안 Dpnl로 분해하고, 컴피턴트 에스케리키아 콜라이 DH5α (NEB) 세포에 형질전환하였다. 돌연변이된 플라스미드를 제한효소 부위 분석으로 동정하고, 원하는 돌연변이가 생겼는지를 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
표 3: 락토코커스 락티스 유래의 락테이트 데하이드로게나제 ldhA를 돌연변이화하는 데 사용되는 올리고뉴클레오타이드 (nnk는 퇴행된 코돈을 지칭하며, k는 티민 또는 시토신을 의미함)
단백질 돌연변이 프라이머 서열 5'-3' 제한효소 부위
Ll-LdhA Q85nnk GTCTTGACTTCTGGTGCTCCANNKAAACCAGGTGAAACGCGTCTT (서열 번호 27)

AAGACGCGTTTCACCTGGTTTMNNTGGAGCACCAGAAGTCAAGAC (서열 번호 28)		 MluI
Ll-LdhA I226V CGTGATGCTGCTTACTCGATCGTCGCTAAAAAAGGTG (서열 번호 99)

CACCTTTTTTAGCGACGATCGAGTAAGCAGCATCACG (서열 번호 100)		 PvuI
돌연변이 효소를 발현시키고, 정제하고, 실시예 1에 기술된 바와 같이 OHB 및 피루베이트 리덕타제 활성을 시험하였다. 두 가지 기질에 대한 활성 측정은 도 2에 요약되어 있다. 결과에서, Gln85를 바람직하게는 알라닌, 시스테인, 아스파라긴, 또는 메티오닌으로 대체하면, OHB에 대한 효소의 특이성이 증가되거나, 및/또는 OHB 리덕타제의 최대 비활성이 증가되는 것으로 보인다.
Ll-Ldh의 돌연변이 Q85N을 돌연변이 I226V와 조합하였다. 이러한 조합은 OHB에 대한 기질 친화성에 상당한 긍정적인 효과를 발휘하는 것으로 나타났다.
표 4: 피루베이트 및 OHB에 대한 락토코커스 락티스 락테이트 데하이드로게나제 A, Ll-LdhA, 돌연변이의 카이네틱 파라미터에 대한 요약
최대 비활성
[μmol/( mg min )] 		Km
[ mM ]
돌연변이 효소 서열 번호 피루베이트 OHB 피루베이트 OHB
Q85N 서열 번호 30 184 63.9 22.1 29.2
Q85NI226V 서열 번호 32 11.5 4.9 1.4 3.3
실시예 3: OHB 리덕타제 활성이 향상된 말레이트 데하이드로게나제 효소의 제작
에스케리키아 콜라이 유래의 mdh 유전자의 부위 특이적인 돌연변이유발은 표 5에 열거된 프라이머를 사용해 실시예 2에 기술된 대로 수행하였다. 플라스미드 pET28-Ec-mdh를 주형으로 사용하였다.
표 5: 에스케리키아 콜라이 유래의 말레이트 데하이드로게나제 mdh의 돌연변이에 사용되는 올리고뉴클레오타이드 (nnk는 퇴행된 코돈을 지칭하며, k는 티민 또는 시토신을 의미함)
단백질 돌연변이 프라이머 서열 5'-3' 제한효소 부위
Ec-Mdh R81nnk TTATCTCTGCAGGCGTAGCGNNKAAACCCGGGATGGATCGTTC
(서열 번호 33)
GAACGATCCATCCCGGGTTTMNNCGCTACGCCTGCAGAGATAA
(서열 번호 34)		 Sma1
Ec-Mdh R81AM85E TTATCTCTGCAGGCGTAGCGGCTAAACCGGGTGAGGATCGTTCCGACCTG (서열 번호 35)
CAGGTCGGAACGATCCTCACCCGGTTTAGCCGCTACGCCTGCAGAGATAA (서열 번호 36)		 Sma1이 아님
Ec-Mdh R81A M85Q TTATCTCTGCAGGCGTAGCGGCTAAACCGGGTCAGGATCGTTCCGACCTG (서열 번호 37)
CAGGTCGGAACGATCCTGACCCGGTTTAGCCGCTACGCCTGCAGAGATAA (서열 번호 38)		 Sma1이 아님
Ec-Mdh I12V GTCGCAGTCCTCGGCGCCGCTGGCGGTGTCGGCCAGGCGCTTGCAC (서열 번호 39
GTGCAAGCGCCTGGCCGACACCGCCAGCGGCGCCGAGGACTGCGAC (서열 번호 40)		 Nar1
Ec-Mdh G179D CCG GTT ATT GGC GGC CAC TCT GAT GTT ACC ATT CTG CCG CTG CTG (서열 번호 41)
CAGCAGCGGCAGAATGGTAACATCAGAGTGGCCGCCAATAACCGG (서열 번호 42)		 Eae1
Ec-Mdh R81AD86S GGCGTAGCGGCTAAACCGGGTATGTCTCGTTCCGACCTG (서열 번호 43)
CAGGTCGGAACGAGACATACCCGGTTTAGCCGCTACGCC (서열 번호 44)		 Sma1이 아님
돌연변이 효소를 발현 및 정제한 후, 실시예 1에 기술된 바와 같이 OHB 및 옥살로아세테이트 리덕타제 활성을 시험하였다. OHB 및 옥살로아세테이트에 대한 활성 측정은 도 3에 요약되어 있다. 그 결과, Arg81을 알라닌, 시스테인, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 메티오닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌 또는 발린으로 대체하면, 유의한 OHB 리덕타제 활성이 부여되며, 부수적으로는 옥살로아세테이트 리덕타제 활성이 감소되는 것으로 보인다.
Ec-Mdh의 돌연변이 R81A를 다른 단백질 서열 변화와 조합하였다. 그 결과는 표 6에 열거한다. 돌연변이 M85Q, M85E, I12V, D86S 또는 G179D의 도입이 OHB에 대한 활성을 증가시키는 것으로 나타났다.
옥살로아세테이트 (OAA) 및 OHB에 대한 에스케리키아 콜라이 말레이트 데하이드로게나제 돌연변이의 카이네틱 파라미터에 대한 요약
돌연변이 효소 서열 번호
최대 비활성
[μ mol /( mg min )] 		Km
[ mM ]
OAA a OHB b OAA OHB
야생형 서열 번호 2 95 0.01 0.04 ns
R81A 서열 번호 102 1.16 1.8 ns ns
R81A M85Q 서열 번호 104 0.5 4.99 ns ns
R81A M85E 서열 번호 106 1 3 ns ns
R81A M85Q I12V 서열 번호 108 1.84 18.9 ns 15
R81A M85E I12V 서열 번호 110 2.2 12.54 ns ns
R81A G179D 서열 번호 112 0.37 4.16 ns ns
R81A D86S 서열 번호 1114 0.67 14.6 ns ns
R81A I12V 서열 번호 115 0.5 4.9 ns ns
R81A G179D D86S 서열 번호 118 0.54 19 ns ns
(a) - 활성을 0.5 mM 옥살로아세테이트에서 측정하였음
(b) - 활성을 20 mM OHB에서 측정하였음
(ns) - 50 mM 이하의 OHB 및 0.5 mM 이하의 옥살로아세테이트 농도에서 포화되지 않음
실시예 4: 선별된 트랜스아미나제에 대한 호모세린 트랜스아미나제 활성 시험
에스케리키아 콜라이, 사카로마이세스 세레비지애, 및 락토코커스 락티스에서 서로 다른 트랜스아미나제를 코딩하는 유전자를 하이-피델리티 폴리머라제 PhusionTM (Finnzymes) 및 표 7에 열거된 프라이머를 사용해 PCR로 증폭시켰다. 에스케리키아 콜라이 MG1655, 사카로마이세스 세레비지애 BY4741, 및 락토코커스 락티스 IL1403의 게놈 DNA를 주형으로 사용하였다. 프라이머로 개시 코돈의 상류와 정지 코돈의 하류에 각각 제한효소 부위 (표 7)를 도입하여, PCR 절단 산물이 T4 DNA 리가제 (Biolabs)에 의해 pET28a+ (Novagen) 발현 벡터의 상응하는 부위에 쉽게 연결되게 하였다. 연결 산물을 에스케리키아 콜라이 DH5α 세포에 형질전환하였다. 제조된 플라스미드를 분리하고, 상응하는 유전자의 올바른 전장 서열의 함유 여부를 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다. 해당 단백질 서열에 대한 참조는 표 7에 열거되어 있다.
표 7: 후보 효소의 증폭 및 클로닝에 사용되는 프라이머 서열 및 제한효소 부위 (소스 유기체에 사용되는 약어: Ec - 에스케리키아 콜라이, Sc - 사카로마이세스 세레비지애, Ll - 락토코커스 락티스). 모든 유전자는 pET28a+ (Novagen)에 클로닝하고, N-말단 Hexa-HisTag를 첨가하였다.
유전자 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머
5'-3'		 유전자
서열		 단백질
서열		 제한효소 부위
Ec - ilvE tataatgctagcatgaccacgaagaaagctgattaca(서열 번호 47)
tataatggatccttattgattaacttgatctaacc (서열 번호 48)		 서열 번호 59 서열 번호 60 NheI
BamHI
Ec - tyrB Tataatgctagcgtgtttcaaaaagttgacg (서열 번호 49)
Tataatggatccttacatcaccgcagcaaac (서열 번호 50)		 서열 번호 61 서열 번호 62 NheI
BamHI
Ec - aspC Tataatgctagcatgtttgagaacattaccgc (서열 번호 51)
Tataatggatccttacagcactgccacaatcg (서열 번호 52)		 서열 번호 63 서열 번호 64 NheI
BamHI
Ll - araT Tataatgctagcatggatttattaaaaaaatttaaccctaa (서열 번호 53)
Tataatggatcctcagccacgttttttagtcacataa (서열 번호 54)		 서열 번호 65 서열 번호 66 NheI
BamHI
Ll - bcaT Tataatgctagcatggcaattaatttagactg (서열 번호 55)
Tataatggatccttaatcaactttaactatcc (서열 번호 56)		 서열 번호 67 서열 번호 68 NheI
BamHI
Sc - ARO8 Tataatcatatgatcatgactttacctgaatcaaaaga (서열 번호 57)
Tataatggatccctatttggaaataccaaattcttcg (서열 번호 58)		 서열 번호 69 서열 번호 70 NheI
BamHI
효소를 실시예 1에 기술된 바와 같이 발현시키고 정제하였으며, 후술하는 조건 하에 호모세린 트랜스아미나제 활성을 시험하였다.
효소적 분석법: 2-옥소글루타레이트를 아미노기 수여체로서 사용하여, 몇몇 후보 아미노트랜스퍼라제의 트랜스아미나제 활성을 정량하였다. 트랜스아미나제 반응은 호모세린, 및 효소의 바람직한 아미노산을 사용해 수행하였다. 반응 후, 커플링된 데하이드로게나제 반응에서 NADH의 아미노산-의존성 산화를 수행하였다.
트랜스아미나제 분석법 (반응 도식)
트랜스아미나제: 아미노산 + 2-옥소글루타레이트 → 2-옥소산 + 글루타메이트
데하이드로게나제: 2-옥소산 + NADH → 2-하이드록시산 + NAD+
반응 혼합물에는 60 mM Hepes (pH 7), 50 mM 포타슘 클로라이드, 5 mM MgCl2, 4 mM 2-옥소글루타레이트, 0.1 mM 피리독살-5'-포스페이트 (PLP), 0.25 mM NADH, (선택적으로는 5 mM 프룩토스-1,6-비스포스페이트) (모두 Sigma사 제품), 4 Units/mL 보조(auxiliary) 2-하이드록시산 데하이드로게나제, 및 적당량의 정제된 아미노트랜스퍼라제 또는 세포 추출물이 포함되었다. 보조 데하이드로게나제 효소는 페닐알라닌 및 루신 아미노산의 경우 락토코커스 락티스 유래의 정제된 PanE (Chambellon, Rijnen, Lorquet, Gitton, van HylckamaVlieg, Wouters, &Yvon, 2009)이며, 아스파테이트의 경우 말레이트 데하이드로게나제 (Sigma)이고, 호모세린을 출발 기질로서 사용하는 경우 래빗 근육 (L)-락테이트 데하이드로게나제 (Sigma)였다. 반응은 50 mM의 아미노산을 첨가함으로써 개시하였다.
효소적 분석은 96-웰 평판 마이크로타이터 플레이트에서 최종 부피 250 ㎕로 37℃에서 수행하였다. 반응 후, 마이크로플레이트 판독기 (BioRad 680XR)에서 340 nm (εNADPH = 6.22 mM-1 cm-1)에서의 NAD(P)H의 특징적인 흡광도 분석을 수행하였다.
결과: 여러 가지 아미노트랜스퍼라제의 카이네틱 파라미터는 표 8에 열거한다. 유의한 호모세린 트랜스아미나제 활성이 열거한 트랜스아미나제 효소에서 확인되었다.
표 8: 호모세린 및 이들의 바람직한 아미노산 기질에 대한 시험된 후보 효소의 트랜스아미나제 활성 (소스 유기체에 사용되는 약어: Ec - 에스케리키아 콜라이, Sc - 사카로마이세스 세레비지애, Ll - 락토코커스 락티스).
효소 서로 다른 기질에 대한 최대 비활성 [μmol/(min mgprot)]
호모세린* 바람직한 아미노산
Ec-IlvE 0.077 10.6(L)
Ec-TyrB 0.057 9.03(P)
Ec-AspC 0.082 74.031(A)
Ll-AraT 0.109 11.72(P)
Ll-BcaT 0.028 30.39(L)
Sc-ARO8 0.076 20.5(P)
(*) 50 mM 호모세린에서 측정한 활성
실시예 5: 호모세린 경로 효소의 과발현을 위한 플라스미드의 제작
플라스미드 pTAC-op-HMS1 및 pACT3-op-HMS1의 제작
개시 코돈의 상류와 정지 코돈의 하류에 각각 NdeI 및 BamHI 제한효소 부위를 도입한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 5'CACGAGGTACATATGTCTGAAATTGTTGTCTCC3' (서열 번호 71) 및 5'CTTCCAGGGGATCCAGTATTTACTCAAAC3' (서열 번호 72) 및 하이-피델리티 폴리머라제 PhusionTM (Finnzymes)을 사용해 PCR에 의해 lysC 유전자를 증폭시킴으로써 플라스미드 pET28-LYSCwt를 제작하였다. 에스케리키아 콜라이 MG1655 유래의 게놈 DNA를 주형으로 사용하였다. PCR 산물을 NdeI 및 BamHI으로 분해하고, T4 DNA 리가제 (Biolabs)에 의해 pET28a (Novagen) 발현 벡터의 상응하는 부위에 연결한 다음, 에스케리키아 콜라이 DH5α 세포에 형질전환하였다. 제조되는 pET28-LYSCwt 플라스미드를 분리하고, 올바른 서열 (서열 번호 73)을 가진 전장 lysC 유전자의 함유 여부를 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
라이신에 의한 저해를 완화하기 위한 lysC의 부위 특이적인 돌연변이유발은 pET28-LYSCwt 플라스미드를 주형으로 사용하여 수행하였다. 250의 위치에서 글루타메이트를 라이신으로 아미노산 서열을 변화시키기 위한 점 돌연변이 (E250K, 서열 번호 36)는 올리고뉴클레오타이드 5'GCGTTTGCCGAAGCGGCAAAGATGGCCACTTTTG3' (서열 번호 74) 및 5'CAAAGTGGCCATCTTTGCCGCTTCGGCAAACGC3' (서열 번호 75)를 사용해 PCR (Phusion 1U, HF 완충제 20 % (v/v), dNTPs 0.2 mM, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 각각 0.04 μM, 주형 플라스미드 50 ng, 물)에 의해 도입하였다. PCR 산물 (서열 번호 35)은 37℃에서 DpnI을 사용해 1시간 동안 분해하여 주형 DNA를 제거하고, 컴피턴트 에스케리키아 콜라이 DH5α (NEB) 세포에 형질전환하였다. 돌연변이된 플라스미드 pET28-LYSC*는 제한효소 부위 분석에 의해 확인하고, 바람직한 돌연변이의 함유 여부를 DNA 시퀀싱에 의해 입증하였다.
개시 코돈의 상류와 정지 코돈의 하류에 각각 NdeI 및 BamHI 제한효소 부위를 도입한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 5'TATAATGCTAGCATGAAAAATGTTGGTTTTATCGG3' (서열 번호 76) 및5 'TATAATGGA-TCCTTACGCCAGTTGACGAAGC3' (서열 번호 77) 및 하이-피델리티 폴리머라제 PhusionTM (Finnzymes)을 사용해 PCR에 의해 에스케리키아 콜라이의 asd 유전자를 증폭시킴으로써 플라스미드 pET28-ASDwt를 제작하였다. 에스케리키아 콜라이 DH5α 유래의 게놈 DNA를 주형으로 사용하였다. PCR 산물을 NdeI 및 BamHI으로 분해하고, T4 DNA 리가제 (Biolabs)에 의해 pET28a (Novagen) 발현 벡터의 상응하는 부위에 연결한 다음, 에스케리키아 콜라이 DH5α 세포에 형질전환하였다. 제조되는 pET28-ASDwt 플라스미드를 분리하고, 올바른 서열 (서열 번호 98)을 가진 전장 asd 유전자의 함유 여부를 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
개시 코돈의 상류와 정지 코돈의 하류에 각각 NdeI 및 BamHI 제한효소 부위를 도입한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 5'TATAATCATATGAGCACTAAAGTTGTTAATG3' (서열 번호 78) 및 5'TATAATGGATC-CCTAAAGTCTTTGAGCAATC3' (서열 번호 79) 및 하이-피델리티 폴리머라제 PhusionTM (Finnzymes)을 사용해 PCR에 의해 사카로마이세스 세레비지애의 HOM6 유전자를 증폭시킴으로써 플라스미드 pET28-HOM6wt를 제작하였다. 사카로마이세스 세레비지애 BY4741 유래의 게놈 DNA를 주형으로 사용하였다. PCR 산물을 NdeI 및 BamHI으로 분해하고, T4 DNA 리가제 (Biolabs)에 의해 pET28a (Novagen) 발현 벡터의 상응하는 부위에 연결한 다음, 에스케리키아 콜라이 DH5α 세포에 형질전환하였다. 제조되는 pET28-HOM6wt 플라스미드를 분리하고, 올바른 서열 (서열 번호 97)을 가진 전장 HOM6 유전자의 포함 여부를 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
플라스미드 pET28-LYSC*는 라이신-둔감성 아스파테이트 키나제, 아스파테이트 세미알데하이드 데하이드로게나제, 및 호모세린 데하이드로게나제를 유도성 tac 프로모터로부터 발현시키는 pTAC-op-HMS 플라스미드의 제작을 위한 백본으로 사용하였다.
asd 유전자는 pET28-asdwt로부터 PCR에 의해 수득하였다. 전체 코딩 영역, 및 pET28 리보좀 결합 부위 (rbs) 및 인-프레임(in-frame) N-말단 His-Tag을 포함하는 상류 영역의 일부는, 개시 코돈의 상류와 정지 코돈의 하류에 각각 BamHI 및 EcoRI 제한효소 부위를 도입한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 5'TATAAGGATCCGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGG3' (서열 번호 80) 및 5'TATAAGAATTCTTACGCCAGTTGACGAAG3' (서열 번호 81) 및 하이-피델리티 폴리머라제 PhusionTM (Finnzymes)을 사용해 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 산물을 BamHI 및 EcoRI으로 분해하고, T4 DNA 리가제 (Biolabs)에 의해 pET28-LYSC*의 상응하는 부위에 연결한 다음, 에스케리키아 콜라이 DH5α 세포에 형질전환하였다. 제조되는 pET28-LYSC*-ASD 플라스미드를 분리하고, 올바른 서열의 함유 여부를 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
HOM6 유전자는 pET28-HOM6wt로부터 PCR에 의해 수득하였다. 전체 코딩 영역, 및 pET28 리보좀 결합 부위 및 인-프레임 N-말단 His-Tag을 포함하는 상류 영역의 일부는, 개시 코돈의 상류와 정지 코돈의 하류에 각각 NotI 및 PspXI 제한효소 부위를 도입한 정방향 프라이머 5'TATAAGCGGCCGCGTTTAACTTTAAGAAGGAGATAT3' (서열 번호 82) 및 역방향 프라이머 5'TATAAACTCGAGCCTAAAGTCTTTGAGCAAT3' (서열 번호 83) 및 하이-피델리티 폴리머라제 PhusionTM (Finnzymes)을 사용해 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 산물을 NotI 및 PspXI으로 분해하고, T4 DNA 리가제 (Biolabs)에 의해 pET28-LYSC*-ASD의 상응하는 부위에 연결한 다음, 에스케리키아 콜라이 DH5α 세포에 형질전환하였다. 제조되는 pET28-op-HMS1 플라스미드를 분리하고, 올바른 서열의 함유 여부를 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
3가지 유전자의 발현을 동시에 조절하는 5' 상류 프로모터 영역 (즉, pET28a+에서 T7 프로모터)은 상기 플라스미드를 SphI 및 XbaI으로 분해하고 또 다른 프로모터 영역을 적절한 제한효소 부위를 사용해 클로닝함으로써 유도성 프로모터 또는 구성적 프로모터인 임의의 다른 프로모터로 대체할 수 있다.
본 발명의 비-제한적인 실시예에서, pET28a+ 백본의 T7 프로모터는 인공 IPTG-유도성 tac 프로모터로 대체하였다 (de Boer et al ., 1983). tac 프로모터는 상기 플라스미드를 SphI 및 XbaI으로 분해함으로써 플라스미드 pEXT20 (Dykxhoorn et al ., 1996)로부터 수득하였다. 상기 프로모터를 포함하는 DNA 단편을 정제하고, SphI 및 XbaI에 의해 분해된 pET28-op-HMS1으로 클로닝하여, pTAC-op-HMS1을 수득하였다. 제조되는 pTAC-op-HMS 플라스미드를 분리하고, 올바른 서열의 함유 여부를 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
lysC * , asd, 및 HOM6의 코딩 서열을 포함하는 오페론은 프라이머 5'- TATAAAGATCTTAGAAATAATTTTGTTTA-3' (서열 번호 84) 및 5'-TATAATCTAGACTAAAGTCTTTGAGCAAT-3' (서열 번호 85)을 사용해 플라스미드 pTAC-op-HMS1로부터 PCR 증폭시키고, PCR 단편의 5' 말단 및 3' 말단에 각각 BglII 및 XbaI 제한효소 부위를 도입하였다. 단편을 정제하고, BglII 및 XbaI으로 분해한 다음, pACT3의 해당 부위로 클로닝하여 (Dykxhoorn et al ., 1996), pACT3-op-HMS1 벡터를 수득하였다. 제조되는 pACT3-op-HMS1 플라스미드를 분리하고, 올바른 서열의 함유 여부를 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
플라스미드 pEXT20-op-HMS2 및 pACT3-op-HMS2의 제작
개시 코돈의 상류와 정지 코돈의 하류에 각각 NdeI 및 BamHI 제한효소 부위를 도입한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 5'-TATAATCATATGCGAGTGTTGAAGTTCG-3' (서열 번호 86) 및 5'-TATAATGGATCCTCAGACTCCTAACTTCCA-3' (서열 번호 87) 및 하이-피델리티 폴리머라제 PhusionTM (Finnzymes)을 사용한 PCR에 의해 2가지 기능을 가진 효소 아스파테이트 키나제/호모세린 데하이드로게나제 I을 코딩하는 에스케리키아 콜라이 thrA 유전자를 증폭시킴으로써 플라스미드 pET28-thrAwt를 제작하였다. 에스케리키아 콜라이 MG1655 유래의 게놈 DNA를 주형으로 사용하였다. PCR 산물을 NdeI 및 BamHI으로 분해하고, T4 DNA 리가제 (Biolabs)에 의해 pET28a+ (Novagen) 발현 벡터의 상응하는 부위에 연결한 다음, NEB 5-알파 컴피턴트 에스케리키아 콜라이 세포 (NEB)에 형질전환하였다. 제조되는 pET28-thrAwt 플라스미드를 분리하고, 올바른 서열 (서열 번호 88)을 가진 전장 thrA 유전자의 함유 여부를 DNA 시퀀싱으로 확인하였다. 상응하는 단백질은 서열 번호 89로 표시한다.
트레오닌에 의한 저해에 대한 감수성이 매우 감소된 아스파테이트 키나제 / 호모세린 데하이드로게나제는, 345 위치의 세린을 페닐알라닌 (S345F)으로 대체하는 부위 특이적인 돌연변이유발에 의해 제작하였다. 부위 특이적인 돌연변이유발은 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 5'-TGTCTCGAGCCCGTATTTTCGTGGTGCTG-3' (서열 번호 90) 및 5'-CAGCACCACGAAAATACGGGCTCGAGACA-3' (서열 번호 91), 및 주형으로서 pET28-thrAwt 플라스미드를 사용해 수행하였다. 아미노산 서열을 변화시키는 단일 점 돌연변이는 PCR (Phusion 1U, HF 완충제 20 % (v/v), dNTPs 0.2 mM, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 각각 0.04 μM, 주형 플라스미드 30-50 ng, 물)에 의해 도입하였다. PCR에 의해 제작된 플라스미드는 침묵 돌연변이에 의해 도입되는 XhoI에 대한 새로운 제한효소 부위 (밑줄이 그어져 있음) 외에도, 돌연변이된 클론의 동정을 용이하게 하는 기능성 돌연변이를 포함하였다. 주형 DNA를 제거하기 위해, PCR 산물을 37℃에서 1시간 동안 Dpnl로 분해하고, DH5α 컴피턴트 에스케리키아 콜라이 (NEB) 세포에 형질전환하였다. 돌연변이된 플라스미드 pET_Ec_thrA_S345F를 제한효소 부위 분석으로 동정하고, 원하는 돌연변이의 발생 여부를 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
2가지 기능을 가진 에스케리키아 콜라이 아스파테이트 키나제/호모세린 데하이드로게나제의 thrAS345F 코딩 영역을 플라스미드 pET_Ec_thrA_S345F를 주형 (서열 번호 92)으로 사용하여 PCR에 의해 수득하였다. 개시 코돈의 상류와 정지 코돈의 하류에 각각 SacI 및 XmaI 제한효소 부위 (밑줄이 그어져 있음)를 도입한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 5'-TATAATGAGCTCGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGCGAGTGTTGAAGTTCGGCG-3' (서열 번호 93) 및 5'-TATAATCCCGGGTCAGACTCCTAACTTCCA-3' (서열 번호 94) 및 하이-피델리티 폴리머라제 PhusionTM (Finnzymes)을 사용한 PCR에 의해 전체 코딩 영역을 증폭시켰다. 직접적인 프라이머는 pET28의 리보좀 결합 부위 (볼드체) 서열을 포함한다. PCR 산물을 SacI 및 XmaII으로 분해하고, T4 DNA 리가제 (Biolabs)에 의해 pEXT20 또는 pACT3 (Dykxhoorn, St Pierre, & Linn, 1996)의 상응하는 부위에 연결한 다음, 에스케리키아 콜라이 DH5α 세포에 형질전환하였다. 제조되는 pEXT20-op-HMS2_step1 및 pACT3-op-HMS2_step1 플라스미드를 분리하고, 올바른 서열의 함유 여부를 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
개시 코돈의 상류와 정지 코돈의 하류에 각각 (서열 번호 98) XmaI 및 BamHI 제한효소 부위를 도입한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 5'-TATAATCCCGGGGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGAAAAATGTTGGTTTTATCGGC-3' (서열 번호 95) 및 5'-TATAATGGATCCTTACGCCAGTTGACGAAG-3' (서열 번호 96) 및 하이-피델리티 폴리머라제 PhusionTM (Finnzymes)을 사용한 PCR에 의해 에스케리키아 콜라이 아스파테이트 세미알데하이드 데하이드로게나제 asd를 증폭시켰다. 직접적인 프라이머는 pET28의 리보좀 결합 부위 서열을 포함한다. 에스케리키아 콜라이 MG1655의 게놈 DNA를 주형으로 사용하였다. PCR 산물을 XmaI 및 BamHI으로 분해하고, T4 DNA 리가제 (Biolabs)에 의해 에스케리키아 콜라이 thrA 유전자의 바로 하류에서 pEXT20-op-HMS2_step1 및 pACT3-op-HMS2_step1의 상응하는 부위에 연결한 다음, 에스케리키아 콜라이 DH5α 세포에 형질전환하였다. 제조되는 pEXT20-op-HMS2 및 pACT3-op-HMS2 플라스미드를 분리하고, 올바른 서열의 함유 여부를 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
실시예 6: 포스포에놀피루베이트 ( PEP ) 카르복시키나제 , PEP 카르복실라제 , 피루베이트 키나제 , 피루베이트 카르복실라제 , 이소시트레이트 리아제 효소 및 갈락토스 심포터 퍼미아제의 과발현을 위한 플라스미드의 구축:
주형으로 에스케리키아 콜라이 MG1655 유래의 게놈 DNA와, 각각 정방향 및 역방향 프라이머인 5'TATAATCCCGGGATGCGCGTTAACAATGGTTTGACC3' (서열 번호 119 및 5'TATAATTCTAGATTACAGTTTCGGACCAGCCG3' (서열 번호 120)를 사용하여, pck 코딩 서열을 증폭시켜, 에스케리키아 콜라이의 PEP 카르복시키나아제 코딩 pck 유전자를 가지는 플라스미드 pACT3-pck를 제작하였다. DNA 단편은 XmaI 및 XbaI으로 분해하고, T4 DNA 리가제 (Biolabs)에 의해 pACT3 발현 벡터 (Dykxhoorn et al., 1996)의 상응하는 부위에 연결한 다음, 에스케리키아 콜라이 DH5α 세포에 형질전환하였다. 형질전환체는 클로람페니콜 (25 ㎍/mL)을 포함하는 고형 LB 배지 상에서 선별하였다. 제조되는 플라스미드를 분리하고, pck 유전자의 올바른 삽입 여부는 시퀀싱으로 확인하였다. aceA, ppc, galP, 또는 pck (모두 에스케리키아 콜라이 유래) 또는 락토코커스 락티스 유래의 pycA를 각각 포함하는 플라스미드 pACT3-aceA, pACT3-ppc, pACT3-galP, pACT3-pck 및 pACT3-pycA는 표 9에 열거된 프라이머를 사용해 유사하게 제작하였다.
표 9: 유전자 과발현용 플라스미드 제작에 사용되는 프라이머. pACT3으로의 클로닝에 사용되는 제한효소 부위는 밑줄이 그어져 있음
유전자 프라이머 링커 서열
Ec _ pck Ec _ pck _ clon _ for XmaI tataatcccgggatgcgcgttaacaatggtttgacc
(서열 번호 121)
Ec _ pck _ clon _ rev XbaI tataattctagattacagtttcggaccagccg
(서열 번호 122)
Ec _ ppc Ec _ ppc _ clon _ for XmaI tataatcccgggatgaacgaacaatattcc
(서열 번호 123)
Ec _ ppc _ clon _ rev XbaI tataattctagattagccggtattacgcat
(서열 번호 124)
Ec _ aceA Ec _ aceA _ clon _ for XmaI tataatcccgggatgaaaacccgtacacaacaaatt (서열 번호 125)
Ec _ aceA _ clon _ rev XbaI tataattctagattagaactgcgattcttcag
(서열 번호 126)
Ll _ pycA Ll _ pycA _ clon _ for XmaI tataatcccgggatgaaaaaactactcgtcgccaat (서열 번호 127)
Ll _ pycA _ clon _ rev XbaI tataattctagattaattaatttcgattaaca
(서열 번호 128)
Ec _ galP Ec _ galP _ clon _ for XmaI tataatcccgggatgcctgacgctaaaaaacaggggcggt (서열 번호 129)
Ec _ galP _ clon _ rev XbaI tataattctagattaatcgtgagcgcctatttc
(서열 번호 130)
실시예 7: 호모세린 트랜스아미나제 및 OHB 리덕타제 과발현용 플라스미드의 제작
에스케리키아 콜라이 유래의 분지쇄 아미노트랜스퍼라제, IlvE의 코딩 서열은 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 5'-ACAATTTCACACAGGAAACAGAATTCGAGCTCGGTACCGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGACCACGAAGAAAGCTGATTAC-3' (서열 번호 131) 및 5'-GGATAACTTTTTTACGTTGTTTATCAGCCATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACGGATCCTTATTGATTAACTTG-3' (서열 번호 132), 및 주형으로서 플라스미드 pET28-Ec-ilvE (실시예 4)를 사용해 PCR 증폭시켰다. 락토코커스 락티스 유래의 락테이트 데하이드로게나제, LdhA의 코딩 영역을 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 5'-TAATATGGATCCGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGCTGATAAACAACGTAAAAAAGTTATCC-3' (서열 번호 133) 및 5'-CAATGCGGAATATTGTTCGTTCATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACTCTAGATTAGTTTTTAACTGCAGAAGCAAATTC-3' (서열 번호 134), 및 주형으로서 플라스미드 pET28-Ll-ldhA (실시예 1)를 사용해 PCR 증폭시켰다. 증폭된 PCR 단편은, 각각의 단편 150 ng을 반응 혼합물 50 ㎕에 첨가하고, 프라이머 5'-ACAATTTCACACAGGAAACAGAATTCGAGCTCGGTACCGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGACCACGAAGAAAGCTGATTAC-3' (서열 번호 135) 및 5'-CAATGCGGAATATTGTTCGTTCATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACTCTAGATTAGTTTTTAACTGCAGAAGCAAATTC-3' (서열 번호 136)을 사용하여 PCR을 진행시킴으로써 오버랩 익스텐션 PCR(overlap extension PCR)로 융합하였다. 제조되는 PCR 단편을 정제하고, KpnI 및 XbaI으로 분해한 다음, T4 DNA 리가제 (Fermentas)에 의해 pEXT20 (Dykxhoorn, St Pierre, & Linn, 1996)의 상응하는 부위에 연결하였다. 연결 산물은 에스케리키아 콜라이 DH5α에 형질전환하였다. 제조되는 플라스미드 pEXT20-DHB를 분리하고, Ec-ilvE and Ll-ldhA의 올바른 전장 코딩 서열의 함유 여부를 DNA 시퀀싱으로 확인하였다. 그런 다음, 플라스미드를 에스케리키아 콜라이 MG1655-유래 돌연변이 균주로 형질전환하고, DHB 생성에 대해 시험하였다.
실시예 8: DHB 생성용 최적화된 균주의 제작
DHB 생성을 위한 탄소 흐름 재분배 및 보조인자 공급을 최적화하기 위해, 에스케리키아 콜라이 균주 MG1655에서 유전자 수종을 파괴하였다. 유전자 결손은 파지 형질도입 방법, 또는 Datsenko et al. (Datsenko & Wanner, 2000)에 따른 람다 레드 리컴비나제 방법에 의해 수행하였다.
파지 형질도입 방법을 이용하여 유전자 결손을 도입하기 위한 프로토콜:
바람직한 단일 결손을 포함하는 균주를 Keio collection (Baba et al ., 2006)에서 수득하였다. 단일 결손 돌연변이의 파치 파쇄물은 50 ㎍/mL 카나마이신, 2 g/L 포도당, 및 5 mM CaCl2와 하룻밤 예비배양물 100 ㎕를 포함하는 LB 배지 10 mL을 접종함으로써 제조하였다. 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 야생형 MG1655 균주 유래의 파지 파쇄물 200 ㎕를 첨가하고, 배양물은 세포 파쇄가 완료될 때까지 2-3시간 더 인큐베이션하였다. 클로로포름 200 ㎕를 첨가한 후, 세포 조제물을 먼저 격렬히 보텍싱(vortexing)한 다음, 4500 x g에서 10분간 원심분리하였다. 깨끗한 파쇄물을 회수하고 4℃에 보관하였다.
수여체 균주(receptor strain)는 37℃, LB 배지에서 밤새 배양함으로써 파지 형질도입용으로 제조하였다. 예비배양물 1.5 mL을 1500 x g에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 폐기하고, 세포 펠렛을 10 mM MgSO4 및 5 mM CaCl2를 포함하는 용액 600 ㎕에 재현탁하였다. 형질도입은, 수여체 균주를 포함하는 용액 100 ㎕를 파쇄물 100 ㎕와 혼합한 다음, 이 혼합물을 30℃에서 30분간 인큐베이션함으로써 수행하였다. 이후, 1 M 소듐 시트레이트 용액 100 ㎕를 첨가한 다음, 격렬히 보텍싱하였다. LB 배지 1 mL을 첨가한 후, 세포 현탁액을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 50 ㎍/mL 카나마이신을 포함하는 LB 한천 접시에 세포를 살포하였다. 항생제의 존재 하에 생장할 수 있는 클론은 표 11에 열거된 프라이머를 사용하여 원하는 결손의 함유 여부를 콜로니 PCR로 확인하였다. 각각의 유전자 결손의 도입 후, 항생제 마커는 전술한 바와 같이 그리고 (Cherepanov & Wackernagel, 1995)의 방법에 따라 제거하였다. △ ldhA , △ adhE , △ metA , △ thrB , △ rhtB , 및 △ lldD 결손은 상기 방법에 의해 성공적으로 도입되었다.
람다 레드 리컴비나제 방법을 이용한 유전자 결손의 도입 프로토콜:
하이-피델리티 폴리머라제 Phusion™ (핀자임스 사 제품), 및 주형으로 플라스미드 pKD4의 FRT-플랭크된 카나마이신 내성 유전자 (kan)를 사용한 PCR에 의해, 결손 카세트를 제조하였다 (Datsenko & Wanner, 2000). 센스 프라이머는, 각 표적 유전자 (밑줄이 그어져 있음)의 5' 말단에 상응하는 서열과, 뒤이어, pKD4의 FRT-kan-FRT 카세트에 상응하는 20 bp를 포함하였다. 안티-센스 프라이머는, 각 표적 유전자 (밑줄이 그어져 있음)의 3' 말단 영역에 상응하는 서열과, 뒤이어 카세트에 상응하는 20 bp를 포함하였다. 하기 표 10에 프라이머를 기술한다. 형질전환하기 전에, PCR 산물을 DpnI으로 분해하고, 정제하였다.
에스케리키아 콜라이 MG1655 균주는, 세포를 37℃의 LB 액상 배지에서 OD600 0.6으로 증식시키고, 상기 세포를 100-배 농축시킨 다음, 아이스콜드 10% 글리세롤로 2 회 세정함으로써, 일렉트로-컴피턴트(electro-competent)로 만들었다. 형질전환체를, 30℃에서, 앰피실린 (100 ㎍/mL)이 든 LB 고형 배지에서 선별하였다.
람다 레드 리컴비나제-발현 플라스미드 pKD46을 가진 일렉트로-컴피턴트 에스케리키아 콜라이 균주를 파괴 카세트로 형질전환하였다. 상기 세포를 앰피실린 (100 ㎍/mL)이 첨가된, 30℃, 액상 SOB 배지에서 증식시켰다. 배양물의 OD600이 0.1에 도달했을 때, 10 mM의 아라비노스를 첨가하여, 람다 레드 리컴비나제 시스템을 유도하였다. 원심분리로 세포를 회수하기 전에, 상기 세포를 0.6의 OD600으로 더 증식시키고, 아이스콜드 10% 글리세롤로 2회 세정하고, 전기천공에 의해 파괴 카세트로 형질전환하였다. 30℃, LB 액상 배지에서 밤새 표현형이 발현되도록 한 다음, 상기 세포를 25 ㎍/mL 카나마이신이 첨가된 고형 LB 배지에 평판 배양하였다. 30℃에서 배양한 후, 형질전환체를 선별하였다.
크림슨 택 폴리머라제 (Crimson Taq polymerase) (NEB 사 제품)를 사용한 콜로니 PCR에 의해, 유전자 치환을 확인하였다. 동시적인, 모 절편의 소실과 신규 돌연변이 특이 절편의 생성을 확인하기 위해, 플랭킹 유전자 좌-특이(flanking locus-specific) 프라이머 (표 11 참조)로 제1 반응을 수행하였다. FRT-카나마이신 내성 카세트 내에 정렬된 하나의 유전자 좌-특이 프라이머와, 상응하는 프라이머인 k1rev, 또는 k2for (표 11 참조) (센스 유전자 좌 프라이머/k1rev 및 k2for/역방향 유전자 좌 프라이머) 중 하나를 함께 사용해, 2회의 추가적인 반응을 수행하였다.
이어서, FLP 리컴비나제를 가지는 플라스미드 pCP20 (Cherepanov & Wackernagel, 1995)을 사용해 내성 유전자 (FRT-kan-FRT)를 염색체에서 절단하였고, 이로써, FRT 부위가 하나 포함된 스카 영역 (scar region)이 형성되었다. pCP20은 앰피실린 및 CmR 플라스미드로서, 열 유도성 FLP 리컴비나제 합성과 온도-민감성 복제를 나타낸다. 카나마이신 내성 돌연변이를 pCP20으로 형질전환하고, 30℃에서 앰피실린-내성 형질전환체를 선별하였다. 다음, 형질전환체를 37℃, 고형 LB 배지에서 증식시키고, 항생제 내성이 모두 소실되었는지 테스트하였다. 크림슨 택 폴리머라제와 플랭킹 유전자 좌-특이 프라이머를 사용한 콜로니 PCR에 의해, FRT-카나마이신 카세트의 절단을 분석하였다 (표 11). 전술한 단계의 반복으로, 다중 결손이 이루어졌다.
표 10: 유전자 방해에 사용되는 프라이머. 표적 유전자에 상동성인 서열은 밑줄이 그어져 있음
유전자 프라이머 서열
ldhA △_ldhA_ for gaaggttgcgcctacactaagcatagttgttgatgagtgtaggctggagctgcttc
(서열 번호 137)
△_ ldhA _ rev ttaaaccagttcgttcgggcaggtttcgcctttttcatgggaattagccatggtcc
서열 번호 138)
adhE △_adhE_ for atggctgttactaatgtcgctgaacttaacgcactcgtagagcgtgtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 139)
△_ adhE _ rev ttaagcggattttttcgcttttttctcagctttagccggagcagccatatgaatatcctccttag
(서열 번호 140)
ackA △_ackA_ for atgtcgagtaagttagtactggttctgaactgcggtagttcttcagtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 141
△_ackA_ rev tcaggcagtcaggcggctcgcgtcttgcgcgataaccagttcttccatatgaatatcctccttag (서열 번호 142)
focA -
pflB 		△_focA - pflB _ for ttactccgtatttgcataaaaaccatgcgagttacgggcctataagtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 143)
△_focA - pflB _ rev atagattgagtgaaggtacgagtaataacgtcctgctgctgttctcatatgaatatcctccttag (서열 번호 144)
pta △_pta _ for gtgtcccgtattattatgctgatccctaccggaaccagcgtcggtgtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 145)
△_pta _ rev ttactgctgctgtgcagactgaatcgcagtcagcgcgatggtgtacatatgaatatcctccttag (서열 번호 146)
poxB △_poxB _ for atgaaacaaacggttgcagcttatatcgccaaaacactcgaatcggtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 147)
△_poxB _ rev ttaccttagccagtttgttttcgccagttcgatcacttcatcacccatatgaatatcctccttag
(서열 번호 148)
sad △_ sad _ for atgaccattactccggcaactcatgcaatttcgataaatcctgccgtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 149)
△_sad _ rev tcagatccggtctttccacaccgtctggatattacagaattcgtgcatatgaatatcctccttag (서열 번호 150)
gabD △_gabD _ for atgaaacttaacgacagtaacttattccgccagcaggcgttgattgtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 151)
△_gabD _ rev ttaaagaccgatgcacatatatttgatttctaagtaatcttcgatcatatgaatatcctccttag
(서열 번호 152)
gadA △_gadA _ for atggaccagaagctgttaacggatttccgctcagaactactcgatgtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 153)
△_gadA _ rev tcaggtgtgtttaaagctgttctgctgggcaataccctgcagtttcatatgaatatcctccttag (서열 번호 154)
gadB △_gadB _ for atggataagaagcaagtaacggatttaaggtcggaactactcgatgtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 155)
△_gadB _ rev tcaggtatgtttaaagctgttctgttgggcaataccctgcagtttcatatgaatatcctccttag
(서열 번호 156)
gadC △_gadC _ for atggctacatcagtacagacaggtaaagctaagcagctcacattagtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 157)
△_gadC _ rev ttagtgtttcttgtcattcatcacaatatagtgtggtgaacgtgccatatgaatatcctccttag
(서열 번호 158)
sfcA △_sfcA _ for atggaaccaaaaacaaaaaaacagcgttcgctttatatcccttacgtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 159)
△_sfcA _ rev ttagatggaggtacggcggtagtcgcggtattcggcttgccagaacatatgaatatcctccttag (서열 번호 160)
maeB △_maeB _ for atggatgaccagttaaaacaaagtgcacttgatttccatgaatttgtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 161)
△_maeB _ rev ttacagcggttgggtttgcgcttctaccacggccagcgccaccatcatatgaatatcctccttag (서열 번호 162)
ppc △_ppc _ for atgaacgaacaatattccgcattgcgtagtaatgtcagtatgctcgtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 163)
△_ppc _ rev ttagccggtattacgcatacctgccgcaatcccggcaatagtgaccatatgaatatcctccttag (서열 번호 164)
pykA △_pykA _ for atgtccagaaggcttcgcagaacaaaaatcgttaccacgttaggcgtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 165)
△_pykA _ rev ttactctaccgttaaaatacgcgtggtattagtagaacccacggtcatatgaatatcctccttag (서열 번호 166)
pykF △_pykF _ for atgaaaaagaccaaaattgtttgcaccatcggaccgaaaaccgaagtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 167)
△_pykF _ rev ttacaggacgtgaacagatgcggtgttagtagtgccgctcggtaccatatgaatatcctccttag (서열 번호 168)
mgsA △_mgsA _ for atggaactgacgactcgcactttacctgcgcggaaacatattgcggtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 169)
△_mgsA _ rev ttacttcagacggtccgcgagataacgctgataatcggggatcagcatatgaatatcctccttag (서열 번호 170)
iclR △_iclR _ for atggtcgcacccattcccgcgaaacgcggcagaaaacccgccgttgtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 171)
△_iclR _ rev tcagcgcattccaccgtacgccagcgtcacttccttcgccgctttcatatgaatatcctccttag (서열 번호 172)
icd △_icd _ for atggaaagtaaagtagttgttccggcacaaggcaagaagatcaccgtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 173)
△_icd _ rev ttacatgttttcgatgatcgcgtcaccaaactctgaacatttcagcatatgaatatcctccttag (서열 번호 174)
sucA △_sucA _ for atgcagaacagcgctttgaaagcctggttggactcttcttacctcgtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 175)
△_sucA _ rev ttattcgacgttcagcgcgtcattaaccagatcttgttgctgtttcatatgaatatcctccttag
(서열 번호 176)
sucB △_sucB _ for atgagtagcgtagatattctggtccctgacctgcctgaatccgtagtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 177)
△_sucB _ rev ctacacgtccagcagcagacgcgtcggatcttccagcaactctttcatatgaatatcctccttag (서열 번호 178)
frdA △_frdA _ for gtgcaaacctttcaagccgatcttgccattgtaggcgccggtggcgtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 179)
△_frdA _ rev tcagccattcgccttctccttcttattggctgcttccgccttatccatatgaatatcctccttag
(서열 번호 180)
frdB △_frdB _ for atggctgagatgaaaaacctgaaaattgaggtggtgcgctataacgtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 181)
△_frdB _ rev ttagcgtggtttcagggtcgcgataagaaagtctttcgaactttccatatgaatatcctccttag (서열 번호 182)
frdC △_frdC _ for atgacgactaaacgtaaaccgtatgtacggccaatgacgtccaccgtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 183)
△_frdC _ rev ttaccagtacagggcaacaaacaggattacgatggtggcaaccaccatatgaatatcctccttag (서열 번호 184)
frdD △_frdD _ for atgattaatccaaatccaaagcgttctgacgaaccggtattctgggtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 185)
△_frdD _ rev ttagattgtaacgacaccaatcagcgtgacaactgtcaggatagccatatgaatatcctccttag (서열 번호 186)
ptsI △_ptsI _ for atgatttcaggcattttagcatccccgggtatcgctttcggtaaagtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 187)
△_ptsI _ rev ttagcagattgttttttcttcaatgaacttgttaaccagcgtcatcatatgaatatcctccttag
(서열 번호 188)
ptsG △_ptsG _ for atgtttaagaatgcatttgctaacctgcaaaaggtcggtaaatcggtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 189)
△_ptsG _ rev ttagtggttacggatgtactcatccatctcggttttcaggttatccatatgaatatcctccttag
(서열 번호 190)
lacI △_lacI _ for gtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtcgtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 191)
△_lacI _ rev tcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcatcatatgaatatcctccttag (서열 번호 192)
lldD △_lldD _ for atgattatttccgcagccagcgattatcgcgccgcagcgcaacgcgtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 193)
△_lldD _ rev ctatgccgcattccctttcgccatgggagccagtgccgcaggcaacatatgaatatcctccttag (서열 번호 194)
pgi △_pgi _ for atgaaaaacatcaatccaacgcagaccgctgcctggcaggcactagtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 195)
△_pgi _ rev
ttaaccgcgccacgctttatagcggttaatcagaccattggtcgacatatgaatatcctccttag (서열 번호 196)
metA
△_metA _ for
atgccgattcgtgtgccggacgagctacccgccgtcaatttcttggtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 197)
△_metA _ rev
ttaatccagcgttggattcatgtgccgtagatcgtatggcgtgatcatatgaatatcctccttag (서열 번호 198)
thrB
△_thrB _ for
atggttaaagtttatgccccggcttccagtgccaatatgagcgtcgtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 199)
△_thrB _ rev
ttagttttccagtactcgtgcgcccgccgtatccagccggcaaatcatatgaatatcctccttag (서열 번호 200)
lysA △_lysA _ for atgccacattcactgttcagcaccgataccgatctcaccgccgaagtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 201)
△_lysA _ rev ttaaagcaattccagcgccagtaattcttcgatggtctggcgacgcatatgaatatcctccttag (서열 번호 202)
eda △_eda _ for atgaaaaactggaaaacaagtgcagaatcaatcctgaccaccggcgtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 203)
△_eda _ rev ctcgatcgggcattttgacttttacagcttagcgccttctacagccatatgaatatcctccttag (서열 번호 204)
recA △_recA _ for atggctatcgacgaaaacaaacagaaagcgttggcggcagcactggtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 205)
△_recA _ rev ttaaaaatcttcgttagtttctgctacgccttcgctatcatctaccatatgaatatcctccttag (서열 번호 206)
asd △_asd _ for atgaaaaatgttggttttatcggctggcgcggtatggtcggctccgtgtaggctggagctgcttc (서열 번호 207)
△_ asd _ rev ttacgccagttgacgaagcatccgacgcagcggctccgcggcccccatatgaatatcctccttag (서열 번호 208)
표 11: 유전자 방해의 입증에 사용되는 프라이머 쌍
결손된 유전자 서열 (5'-3')
정방향 프라이머 역방향 프라이머
K2 for / k1 rev cggtgccctgaatgaactgc
(서열 번호 209)		 cagtcatagccgaatagcct
(서열 번호 210)
ldhA atacgtgtcccgagcggtag
(서열 번호 211)		 tacacatcccgccatcagca
(서열 번호 212)
adhE Gaagtaaacgggaaaatcaa
(서열 번호 213)		 Agaagtggcataagaaaacg
(서열 번호 214)
ackA ccattggctgaaaattacgc
(서열 번호 215)		 gttccattgcacggatcacg
(서열 번호 216)
focA _ pflB atgccgtagaagccgccagt
(서열 번호 217)		 tgttggtgcgcagctcgaag
(서열 번호 218)
pta gcaaatctggtttcatcaac
(서열 번호 219)		 tcccttgcacaaaacaaagt
(서열 번호 220)
poxB ggatttggttctcgcataat
(서열 번호 221)		 agcattaacggtagggtcgt
(서열 번호 222)
sad gctgattctcgcgaataaac
(서열 번호 223)		 aaaaacgttcttgcgcgtct
(서열 번호 224)
gabD tctgtttgtcaccaccccgc
(서열 번호 225)		 Aagccagcacctggaagcag
(서열 번호 226)
gadA aagagctgccgcaggaggat
(서열 번호 227)		 gccgccctcttaagtcaaat
(서열 번호 228)
gadB ggattttagcaatattcgct
(서열 번호 229)		 cctaatagcaggaagaagac
(서열 번호 230)
gadC gctgaactgttgctggaaga
(서열 번호 231)		 ggcgtgcttttacaactaca
(서열 번호 232)
sfcA tagtaaataacccaaccggc
(서열 번호 233)		 tcagtgagcgcagtgtttta
(서열 번호 234)
maeB attaatggtgagagtttgga
(서열 번호 235)		 tgcttttttttattattcgc
(서열 번호 236)
ppc gctttataaaagacgacgaa
(서열 번호 237)		 gtaacgacaattccttaagg
(서열 번호 238)
pykA tttatatgcccatggtttct
(서열 번호 239)		 atctgttagaggcggatgat
(서열 번호 240)
pykF ctggaacgttaaatctttga
(서열 번호 241)		 ccagtttagtagctttcatt
(서열 번호 242)
iclR gatttgttcaacattaactcatcgg
(서열 번호 243)		 tgcgattaacagacaccctt
(서열 번호 244)
mgsA tctcaggtgctcacagaaca
(서열 번호 245)		 tatggaagaggcgctactgc
(서열 번호 246)
icd cgacctgctgcataaacacc
(서열 번호 247)		 tgaacgctaaggtgattgca
(서열 번호 248)
sucA acgtagacaagagctcgcaa
(서열 번호 249)		 catcacgtacgactgcgtcg
(서열 번호 250)
sucB tgcaactttgtgctgagcaa
(서열 번호 251)		 tatcgcttccgggcattgtc
(서열 번호 252)
frdA Aaatcgatctcgtcaaatttcagac
(서열 번호 253)		 aggaaccacaaatcgccata
(서열 번호 254)
frdB gacgtgaagattactacgct
(서열 번호 255)		 agttcaatgctgaaccacac
(서열 번호 256)
frdC tagccgcgaccacggtaagaaggag
(서열 번호 257)		 cagcgcatcacccggaaaca
(서열 번호 258)
frdD atcgtgatcattaacctgat
(서열 번호 259)		 ttaccctgataaattaccgc
(서열 번호 260)
ptsG ccatccgttgaatgagtttt
(서열 번호 261)		 tggtgttaactggcaaaatc
(서열 번호 262)
ptsI gtgacttccaacggcaaaag
(서열 번호 263)		 ccgttggtttgatagcaata
(서열 번호 264)
lacI Gaatctggtgtatatggcga
(서열 번호 265)		 Tcttcgctattacgccagct
(서열 번호 266)
lldD Cgtcagcggatgtatctggt
(서열 번호 267)		 Gcggaatttctggttcgtaa
(서열 번호 268)
pgi Ttgtcaacgatggggtcatg
(서열 번호 269)		 Aaaaatgccgacataacgtc
(서열 번호 270)
lysA Tctcaaagcgcgcaagttcg
(서열 번호 271)		 Ggtattgatgtaccgggtgagatt
(서열 번호 272)
metA Tcgacagaacgacaccaaat
(서열 번호 273)		 Cactgtgaacgaaggatcgt
(서열 번호 274)
thrB Tgttggcaatattgatgaag
(서열 번호 275)		 Gacatcgctttcaacattgg
(서열 번호 276)
eda Gacagacaggcgaactgacg
(서열 번호 277)		 Gcgcagatttgcagattcgt
(서열 번호 278)
recA Tggcggcagtgaagagaagc
(서열 번호 279)		 Gcaataacgcgctcgtaatc
(서열 번호 280)
asd
Acaaagcaggataagtcgca
(서열 번호 281)		 Gacttcaggtaaggctgtga
(서열 번호 282)
rhtA CAGAGAACTGCGTAAGTATTACGCA (서열 번호 283) TAGTGGTAACAAGCGTGAAAAACAA (서열 번호 284)
rhtB ATGAAGACTCCGTAAACGTTTCCCC (서열 번호 285) CAAAAATAGACACACCGGGAGTTCA (서열 번호 286)
아스파테이트 키나제, 아스파테이트 세미알데하이드 데하이드로게나제, 및 호모세린 데하이드로게나제를 공동-발현하는 플라스미드 (pACT3-op-HMS1)는 호모세린 트랜스아미나제 및 OHB 리덕타제를 발현하는 플라스미드 (pEXT20-DHB)와 함께, 최적화된 숙주 균주에 형질전환하였다. 형질전환체는 클로람페니콜 (25 ㎍/mL) 및 암피실린 (100 ㎍/mL)를 포함하는 고형 LB 배지에서 선별하였다. 제작된 균주의 비-제한적인 실시예는 표 12에 열거한다.
표 12: DHB 생성용으로 제작된 균주의 예
균주 관련 유전형
MG1655 야생형
ECE73 △ldhA △adhE △metA △thrB
ECE74 △ldhA △adhE △metA △thrB
pACT3-op-HMS1
ECE75 △ldhA △adhE △metA △thrB
pEXT20-DHB
ECE76 △ldhA △adhE △metA △thrB
pACT3-op-HMS1 pEXT20-DHB
ECE77 △ldhA △adhE △metA △thrB △lldD
pACT3-op-HMS1 pEXT20-DHB
ECE78 △ldhA △adhE △metA △thrB △rhtB
pACT3-op-HMS1 pEXT20-DHB
상기 플라스미드의 백본으로부터 lacI 유전자를 제거하고, 숙주 균주에서 lacI을 게놈 결손시키는 것은 상기 플라스미드 구축물로부터 단백질을 발현시킬 수 있는 것으로 이해된다.
실시예 9: 호모세린- OHB 경로에 의한 DHB 의 자이모틱 ( zymotic ) 제조에 대한 설명
균주 및 배양 조건: 실험은 표 12에 열거된 균주를 이용하여 수행하였다. 37℃, 170 rpm으로 운행되는 인포스(Infors) 회전 쉐이커에서 모든 배양을 수행하였다. 글리세롤 스탁 유래의 하룻밤 배양물 (테스트 튜브 내 3 mL 배지)을 접종하였으며, 이를 이용하여 500 mL 쉐이크 플라스크 내 100 mL 증식 배양물의 OD600을 0.05로 적정하였다. 증식 배양물의 OD600이 0.8에 도달했을 때, IPTG를 1 mmol/L의 농도로 첨가하였다. 1 리터 배양 배지는, 20 g 글루코스, 18 g Na2HPO4 * 12 H2O, 3 g KH2PO4, 0.5 g NaCl, 2 g NH4Cl, 0.5 g MgSO4 * 7 H2O, 0.015 CaCl2 * 2 H2O, 100배 희석된 농축 HCl에서 제조된 0.06 mol/L FeCl3 스탁 용액 1 mL, 10 mM 티아민 HCl 스탁 용액 2 mL, 20 g MOPS 및 미량 원소 용액 1 mL (containing per liter: 0.04 g Na2EDTA * 2H2O, 0.18 g CoCl2 * 6 H2O, ZnSO4 * 7 H2O, 0.04 g Na2MoO4 * 2 H2O, 0.01 g H3BO3, 0.12 g MnSO4 * H2O, 0.12 g CuCl2 * H2O)을 포함하였다. 배지의 pH는 pH 7로 조정하였으며, 배지를 여과-멸균하였다. 항생제 카나마이신 설페이트, 암피실린 및 클로람페니콜을 필요한 경우 각각 50 mg/L, 100 mg/L, 및 25 mg/L의 농도로 첨가하였다.
LC - MS 분석에 의한 DHB 농도 측정: 액체 음이온 교환 크로마토그래피는 자동 용리액(automatic eluent) (KOH) 발생기 시스템 (RFIC, Dionex), 및 샘플을 4℃에 유지시키는 오토샘플러 (AS50, Dionex)를 구비한, Dionex (Sunnyvale, USA)의 ICS-3000 시스템에서 수행하였다. 분석물은 AG11 HC (50 x 2 mm, Dionex) 예비-컬럼에 의해 보호된 IonPac AS11 HC (250 x 2 mm, Dionex) 컬럼 상에서 분리하였다. 컬럼 온도는 25℃로 유지시켰으며, 유속은 0.25 mL/min로 유지시켰고, 분석물은 전술한 KOH 구배를 적용함으로써 용리하였다 (Groussac E, Ortiz M & Francois J (2000) Improved protocols for quantitative determination of metabolites from biological samples using high performance ionic-exchange chromatography with conductimetric and pulsed amperometric detection. Enzyme . Microb . Technol .26, 715-723). 주입된 샘플 부피는 15 ㎕였다. 백그라운드를 배제하기 위해, ASRS ultra II (2 mm, 익스터널 워터 모드(external water mode), 75 mA) 음이온 서프레서(anion suppressor)를 사용하였다. 분석물은 ESI mode (스플릿(split)은 1/3였으며, 질소 압력은 90 psi였고, 모세관 전압(capillary voltage)은 3.5 kV였고, 프로브 온도는 450℃였음)에서 진행되는 질량-감수성 검출기(mass-sensitive detector)(MSQ Plus, Thermo)에서 정량하였다.
결과: 24시간 배양한 후, 서로 다른 균주의 상층액 내 DHB 농도를 LC-MS 분석으로 정량하였다. 균주 ECE73, ECE74, ECE75, 및 ECE76은 각각 DHB를 0 mg/L, 3.7 mg/L, 0.67 mg/L, 및 11.9 mg/L로 생성하였다.
SEQUENCE LISTING <110> ADISSEO FRANCE SAS <120> Method for the preparation of 2,4-dihydroxybutyrate from homoserine <130> BR079221 <150> 61/670,405 <151> 2012-07-11 <160> 288 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 939 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 atgaaagtcg cagtcctcgg cgctgctggc ggtattggcc aggcgcttgc actactgtta 60 aaaacccaac tgccttcagg ttcagaactc tctctgtatg atatcgctcc agtgactccc 120 ggtgtggctg tcgatctgag ccatatccct actgctgtga aaatcaaagg tttttctggt 180 gaagatgcga ctccggcgct ggaaggcgca gatgtcgttc ttatctctgc aggcgtagcg 240 cgtaaaccgg gtatggatcg ttccgacctg tttaacgtta acgccggcat cgtgaaaaac 300 ctggtacagc aagttgcgaa aacctgcccg aaagcgtgca ttggtattat cactaacccg 360 gttaacacca cagttgcaat tgctgctgaa gtgctgaaaa aagccggtgt ttatgacaaa 420 aacaaactgt tcggcgttac cacgctggat atcattcgtt ccaacacctt tgttgcggaa 480 ctgaaaggca aacagccagg cgaagttgaa gtgccggtta ttggcggtca ctctggtgtt 540 accattctgc cgctgctgtc acaggttcct ggcgttagtt ttaccgagca ggaagtggct 600 gatctgacca aacgcatcca gaacgcgggt actgaagtgg ttgaagcgaa ggccggtggc 660 gggtctgcaa ccctgtctat gggccaggca gctgcacgtt ttggtctgtc tctggttcgt 720 gcactgcagg gcgaacaagg cgttgtcgaa tgtgcctacg ttgaaggcga cggtcagtac 780 gcccgtttct tctctcaacc gctgctgctg ggtaaaaacg gcgtggaaga gcgtaaatct 840 atcggtaccc tgagcgcatt tgaacagaac gcgctggaag gtatgctgga tacgctgaag 900 aaagatatcg ccctgggcga agagttcgtt aataagtaa 939 <210> 2 <211> 312 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Lys Val Ala Val Leu Gly Ala Ala Gly Gly Ile Gly Gln Ala Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Leu Lys Thr Gln Leu Pro Ser Gly Ser Glu Leu Ser Leu 20 25 30 Tyr Asp Ile Ala Pro Val Thr Pro Gly Val Ala Val Asp Leu Ser His 35 40 45 Ile Pro Thr Ala Val Lys Ile Lys Gly Phe Ser Gly Glu Asp Ala Thr 50 55 60 Pro Ala Leu Glu Gly Ala Asp Val Val Leu Ile Ser Ala Gly Val Ala 65 70 75 80 Arg Lys Pro Gly Met Asp Arg Ser Asp Leu Phe Asn Val Asn Ala Gly 85 90 95 Ile Val Lys Asn Leu Val Gln Gln Val Ala Lys Thr Cys Pro Lys Ala 100 105 110 Cys Ile Gly Ile Ile Thr Asn Pro Val Asn Thr Thr Val Ala Ile Ala 115 120 125 Ala Glu Val Leu Lys Lys Ala Gly Val Tyr Asp Lys Asn Lys Leu Phe 130 135 140 Gly Val Thr Thr Leu Asp Ile Ile Arg Ser Asn Thr Phe Val Ala Glu 145 150 155 160 Leu Lys Gly Lys Gln Pro Gly Glu Val Glu Val Pro Val Ile Gly Gly 165 170 175 His Ser Gly Val Thr Ile Leu Pro Leu Leu Ser Gln Val Pro Gly Val 180 185 190 Ser Phe Thr Glu Gln Glu Val Ala Asp Leu Thr Lys Arg Ile Gln Asn 195 200 205 Ala Gly Thr Glu Val Val Glu Ala Lys Ala Gly Gly Gly Ser Ala Thr 210 215 220 Leu Ser Met Gly Gln Ala Ala Ala Arg Phe Gly Leu Ser Leu Val Arg 225 230 235 240 Ala Leu Gln Gly Glu Gln Gly Val Val Glu Cys Ala Tyr Val Glu Gly 245 250 255 Asp Gly Gln Tyr Ala Arg Phe Phe Ser Gln Pro Leu Leu Leu Gly Lys 260 265 270 Asn Gly Val Glu Glu Arg Lys Ser Ile Gly Thr Leu Ser Ala Phe Glu 275 280 285 Gln Asn Ala Leu Glu Gly Met Leu Asp Thr Leu Lys Lys Asp Ile Ala 290 295 300 Leu Gly Glu Glu Phe Val Asn Lys 305 310 <210> 3 <211> 990 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 3 atgaaactcg ccgtttatag cacaaaacag tacgacaaga agtacctgca acaggtgaac 60 gagtcctttg gctttgagct ggaatttttt gactttctgc tgacggaaaa aaccgctaaa 120 actgccaatg gctgcgaagc ggtatgtatt ttcgtaaacg atgacggcag ccgcccggtg 180 ctggaagagc tgaaaaagca cggcgttaaa tatatcgccc tgcgctgtgc cggtttcaat 240 aacgtcgacc ttgacgcggc aaaagaactg gggctgaaag tagtccgtgt tccagcctat 300 gatccagagg ccgttgctga acacgccatc ggtatgatga tgacgctgaa ccgccgtatt 360 caccgcgcgt atcagcgtac ccgtgatgct aacttctctc tggaaggtct gaccggcttt 420 actatgtatg gcaaaacggc aggcgttatc ggtaccggta aaatcggtgt ggcgatgctg 480 cgcattctga aaggttttgg tatgcgtctg ctggcgttcg atccgtatcc aagtgcagcg 540 gcgctggaac tcggtgtgga gtatgtcgat ctgccaaccc tgttctctga atcagacgtt 600 atctctctgc actgcccgct gacaccggaa aactatcatc tgttgaacga agccgccttc 660 gaacagatga aaaatggcgt gatgatcgtc aataccagtc gcggtgcatt gattgattct 720 caggcagcaa ttgaagcgct gaaaaatcag aaaattggtt cgttgggtat ggacgtgtat 780 gagaacgaac gcgatctatt ctttgaagat aaatccaacg acgtgatcca ggatgacgta 840 ttccgtcgcc tgtctgcctg ccacaacgtg ctgtttaccg ggcaccaggc 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tacttcacct 180 aaaaagattt actctgcaga ctactctgat gcaagcgacg ctgacctcgt agtcttgact 240 tctggtgctc cacaaaaacc aggtgaaact cgtcttgacc ttgttgaaaa aaatcttcgt 300 atcactaaag atgttgtcac taaaattgtt gcttcaggtt tcaaaggaat cttccttgtt 360 gctgctaacc cagttgatat cttgacatac gctacttgga aattctcagg tttccctaaa 420 aaccgcgttg taggttcagg tacttcactt gatactgcac gtttccgtca agcattggca 480 gaaaaagttg atgttgacgc tcgttcaatc cacgcataca tcatgggtga acacggtgac 540 tcagaatttg ccgtttggtc acacgctaac gttgctggtg ttaaattgga acaatggttc 600 caagaaaatg actaccttaa cgaagctgaa atcgttgaat tgtttgaatc tgtacgtgat 660 gctgcttact caatcatcgc taaaaaaggt gcaacattct atggtgtcgc tgtagctctt 720 gctcgtatta ctaaagcaat tcttgatgat gaacatgcag tacttccagt atcagtattc 780 caagatggac aatatggcgt aagcgactgc taccttggtc aaccagctgt agttggtgct 840 gaaggtgttg ttaacccaat ccacattcca ttgaatgatg ctgaaatgca aaaaatggaa 900 gcttctggtg ctcaattgaa agcaatcatt gacgaagctt ttgctaaaga agaatttgct 960 tctgcagtta aaaactaa 978 <210> 6 <211> 325 <212> PRT <213> Lactococcus 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gtgcatgcct acatcattgg ggaacatggc 540 gataccgaat tgccagtgtg gtcgcaagcg tatattggtg taatgccgat tcgcaaactg 600 gtggaatcga aaggcgaaga agcccagaaa gacttggaac gcatctttgt caacgtacgc 660 gatgcagcgt atcagatcat cgagaaaaaa ggtgcgacct attacggcat cgcaatgggc 720 ttagctcgtg taactcgggc tattctgcac aacgagaacg cgattctcac agtgtcagcg 780 tatctcgatg ggctgtatgg cgaacgcgat gtgtacattg gcgttccagc cgtcatcaat 840 cgcaatggca ttcgtgaggt gattgaaatc gaactgaacg atgacgagaa gaatcgcttc 900 catcactctg cggctacact gaaaagcgtt ctcgcacgtg cgtttacgcg ctaa 954 <210> 10 <211> 317 <212> PRT <213> Geobacillus sterarothermophillus <400> 10 Met Lys Asn Asn Gly Gly Ala Arg Val Val Val Ile Gly Ala Gly Phe 1 5 10 15 Val Gly Ala Ser Tyr Val Phe Ala Leu Met Asn Gln Gly Ile Ala Asp 20 25 30 Glu Ile Val Leu Ile Asp Ala Asn Glu Ser Lys Ala Ile Gly Asp Ala 35 40 45 Met Asp Phe Asn His Gly Lys Val Phe Ala Pro Lys Pro Val Asp Ile 50 55 60 Trp His Gly Asp Tyr Asp Asp Cys Arg Asp Ala Asp Leu Val Val Ile 65 70 75 80 Cys Ala Gly Ala Asn Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp Leu Val 85 90 95 Asp Lys Asn Ile Ala Ile Phe Arg Ser Ile Val Glu Ser Val Met Ala 100 105 110 Ser Gly Phe Gln Gly Leu Phe Leu Val Ala Thr Asn Pro Val Asp Ile 115 120 125 Leu Thr Tyr Ala Thr Trp Lys Phe Ser Gly Leu Pro His Glu Arg Val 130 135 140 Ile Gly Ser Gly Thr Ile Leu Asp Thr Ala Arg Phe Arg Phe Leu Leu 145 150 155 160 Gly Glu Tyr Phe Ser Val Ala Pro Gln Asn Val His Ala Tyr Ile Ile 165 170 175 Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Leu Pro Val Trp Ser Gln Ala Tyr Ile 180 185 190 Gly Val Met Pro Ile Arg Lys Leu Val Glu Ser Lys Gly Glu Glu Ala 195 200 205 Gln Lys Asp Leu Glu Arg Ile Phe Val Asn Val Arg Asp Ala Ala Tyr 210 215 220 Gln Ile Ile Glu Lys Lys Gly Ala Thr Tyr Tyr Gly Ile Ala Met Gly 225 230 235 240 Leu Ala Arg Val Thr Arg Ala Ile Leu His Asn Glu Asn Ala Ile Leu 245 250 255 Thr Val Ser Ala Tyr Leu Asp Gly Leu Tyr Gly Glu Arg Asp Val Tyr 260 265 270 Ile Gly Val Pro Ala Val Ile Asn Arg Asn Gly Ile Arg Glu Val Ile 275 280 285 Glu Ile Glu Leu Asn Asp Asp Glu Lys Asn Arg Phe His His Ser Ala 290 295 300 Ala Thr Leu Lys Ser Val Leu Ala Arg Ala Phe Thr Arg 305 310 315 <210> 11 <211> 999 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 11 atggcggcgt tgaaagacca actgattcat aaccttttaa aagaggaaca tgtgccgcag 60 aacaaaatta ccgttgtagg cgtaggtgca gttggtatgg cctgtgccat tagcatcctg 120 atgaaagact tggcggatga acttgctctg gtcgatgtaa tggaggataa actgaaaggc 180 gaaatgatgg acttgcagca tgggtcgctg tttcttcgca cacccaagat cgtaagcggc 240 aaagattact ccgtgactgc aaattccaaa ttggtcatca ttaccgccgg agcacgccag 300 caagaaggtg aaagccgcct gaacctggtg caacggaacg tcaacatttt caaatttatc 360 attccgaacg tggtgaaata ctctccacac tgcaaactcc tcgttgttag taaccctgtt 420 gacatcctga cgtatgttgc ctggaaaatt agcggcttcc cgaagaatcg cgtaattggc 480 tcaggatgca atctggattc ggcgcgtttt cgctatctga tgggcgaacg tttaggtgtt 540 catgcactgt catgccacgg gtggattctg ggtgaacatg gcgatagttc tgtgcctgtg 600 tggtctggca tgaatgtggc tggtgtgtca ctgaaaacgt tacacccaga acttggcact 660 gacgcggata aagagcagtg gaaacaggta cacaaacagg tggtcgatag cgcgtatgag 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Primer for amplification <400> 47 tataatgcta gcatgaccac gaagaaagct gattaca 37 <210> 48 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 48 tataatggat ccttattgat taacttgatc taacc 35 <210> 49 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 49 tataatgcta gcgtgtttca aaaagttgac g 31 <210> 50 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 50 tataatggat ccttacatca ccgcagcaaa c 31 <210> 51 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 51 tataatgcta gcatgtttga gaacattacc gc 32 <210> 52 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 52 tataatggat ccttacagca ctgccacaat cg 32 <210> 53 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 53 tataatgcta gcatggattt attaaaaaaa tttaacccta a 41 <210> 54 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 54 tataatggat cctcagccac gttttttagt cacataa 37 <210> 55 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 55 tataatgcta gcatggcaat taatttagac tg 32 <210> 56 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 56 tataatggat ccttaatcaa ctttaactat cc 32 <210> 57 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 57 tataatcata tgatcatgac tttacctgaa tcaaaaga 38 <210> 58 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 58 tataatggat ccctatttgg aaataccaaa ttcttcg 37 <210> 59 <211> 930 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 59 atgaccacga agaaagctga ttacatttgg ttcaatgggg agatggttcg ctgggaagac 60 gcgaaggtgc atgtgatgtc gcacgcgctg cactatggca cttcggtttt tgaaggcatc 120 cgttgctacg actcgcacaa aggaccggtt gtattccgcc atcgtgagca tatgcagcgt 180 ctgcatgact ccgccaaaat ctatcgcttc ccggtttcgc agagcattga tgagctgatg 240 gaagcttgtc gtgacgtgat 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tgttgccaca acccaacggg tgccgatctc actaatgatc agtgggatgc ggtgattgaa 600 attctcaaag cccgcgagct tattccattc ctcgatattg cctatcaagg atttggtgcc 660 ggtatggaag aggatgccta cgctattcgc gccattgcca gcgctggatt acccgctctg 720 gtgagcaatt cgttctcgaa aattttctcc ctttacggcg agcgcgtcgg cggactttct 780 gttatgtgtg aagatgccga agccgctggc cgcgtactgg ggcaattgaa agcaacagtt 840 cgccgcaact actccagccc gccgaatttt ggtgcgcagg tggtggctgc agtgctgaat 900 gacgaggcat tgaaagccag ctggctggcg gaagtagaag agatgcgtac tcgcattctg 960 gcaatgcgtc aggaattggt gaaggtatta agcacagaga tgccagaacg caatttcgat 1020 tatctgctta atcagcgcgg catgttcagt tataccggtt taagtgccgc tcaggttgac 1080 cgactacgtg aagaatttgg tgtctatctc atcgccagcg gtcgcatgtg tgtcgccggg 1140 ttaaatacgg caaatgtaca acgtgtggca aaggcgtttg ctgcggtgat gtaa 1194 <210> 62 <211> 397 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 62 Val Phe Gln Lys Val Asp Ala Tyr Ala Gly Asp Pro Ile Leu Thr Leu 1 5 10 15 Met Glu Arg Phe Lys Glu Asp Pro Arg Ser Asp Lys Val Asn Leu Ser 20 25 30 Ile Gly Leu Tyr Tyr Asn 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gccaacacct cgtcgatgga ttactaccat cagttgcgtt atgcggcgga aaaatcgcgg 1800 cgtaaattcc tctatgacac caacgttggg gctggattac cggttattga gaacctgcaa 1860 aatctgctca atgcaggtga tgaattgatg aagttctccg gcattctttc tggttcgctt 1920 tcttatatct tcggcaagtt agacgaaggc atgagtttct ccgaggcgac cacgctggcg 1980 cgggaaatgg gttataccga accggacccg cgagatgatc tttctggtat ggatgtggcg 2040 cgtaaactat tgattctcgc tcgtgaaacg ggacgtgaac tggagctggc ggatattgaa 2100 attgaacctg tgctgcccgc agagtttaac gccgagggtg atgttgccgc ttttatggcg 2160 aatctgtcac aactcgacga tctctttgcc gcgcgcgtgg cgaaggcccg tgatgaagga 2220 aaagttttgc gctatgttgg caatattgat gaagatggcg tctgccgcgt gaagattgcc 2280 gaagtggatg gtaatgatcc gctgttcaaa gtgaaaaatg gcgaaaacgc cctggccttc 2340 tatagccact attatcagcc gctgccgttg gtactgcgcg gatatggtgc gggcaatgac 2400 gttacagctg ccggtgtctt tgctgatctg ctacgtaccc tctcatggaa gttaggagtc 2460 tga 2463 <210> 93 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 93 tataatgagc tcgtttaact ttaagaagga 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60 atggttgaag agcgcgactt cgacgccatt cgccctgtct tcttttctac ttctcagctt 120 ggccaggctg cgccgtcttt tggcggaacc actggcacac ttcaggatgc ctttgatctg 180 gaggcgctaa aggccctcga tatcattgtg acctgtcagg gcggcgatta taccaacgaa 240 atctatccaa agcttcgtga aagcggatgg caaggttact ggattgacgc agcatcgtct 300 ctgcgcatga aagatgacgc catcatcatt cttgaccccg tcaatcagga cgtcattacc 360 gacggattaa ataatggcat caggactttt gttggcggta actgtaccgt aagcctgatg 420 ttgatgtcgt tgggtggttt attcgccaat gatcttgttg attgggtgtc cgttgcaacc 480 taccaggccg cttccggcgg tggtgcgcga catatgcgtg agttattaac ccagatgggc 540 catctgtatg gccatgtggc agatgaactc gcgaccccgt cctctgctat tctcgatatc 600 gaacgcaaag tcacaacctt aacccgtagc ggtgagctgc cggtggataa ctttggcgtg 660 ccgctggcgg gtagcctgat tccgtggatc gacaaacagc tcgataacgg tcagagccgc 720 gaagagtgga aagggcaggc ggaaaccaac aagatcctca acacatcttc cgtaattccg 780 gtagatggtt tatgtgtgcg tgtcggggca ttgcgctgcc acagccaggc attcactatt 840 aaattgaaaa aagatgtgtc tattccgacc gtggaagaac tgctggctgc gcacaatccg 900 tgggcgaaag 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Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 138 ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttcgcc tttttcatgg gaattagcca tggtcc 56 <210> 139 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 139 atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac gcactcgtag agcgtgtgta ggctggagct 60 gcttc 65 <210> 140 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 140 ttaagcggat tttttcgctt ttttctcagc tttagccgga gcagccatat gaatatcctc 60 cttag 65 <210> 141 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 141 atgtcgagta agttagtact ggttctgaac tgcggtagtt cttcagtgta ggctggagct 60 gcttc 65 <210> 142 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 142 tcaggcagtc aggcggctcg cgtcttgcgc gataaccagt tcttccatat gaatatcctc 60 cttag 65 <210> 143 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 143 ttactccgta tttgcataaa aaccatgcga gttacgggcc 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Primer for amplification <400> 149 atgaccatta ctccggcaac tcatgcaatt tcgataaatc ctgccgtgta ggctggagct 60 gcttc 65 <210> 150 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 150 tcagatccgg tctttccaca ccgtctggat attacagaat tcgtgcatat gaatatcctc 60 cttag 65 <210> 151 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 151 atgaaactta acgacagtaa cttattccgc cagcaggcgt tgattgtgta ggctggagct 60 gcttc 65 <210> 152 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 152 ttaaagaccg atgcacatat atttgatttc taagtaatct tcgatcatat gaatatcctc 60 cttag 65 <210> 153 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 153 atggaccaga agctgttaac ggatttccgc tcagaactac tcgatgtgta ggctggagct 60 gcttc 65 <210> 154 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 154 tcaggtgtgt ttaaagctgt tctgctgggc aataccctgc agtttcatat gaatatcctc 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amplification <400> 160 ttagatggag gtacggcggt agtcgcggta ttcggcttgc cagaacatat gaatatcctc 60 cttag 65 <210> 161 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 161 atggatgacc agttaaaaca aagtgcactt gatttccatg aatttgtgta ggctggagct 60 gcttc 65 <210> 162 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 162 ttacagcggt tgggtttgcg cttctaccac ggccagcgcc accatcatat gaatatcctc 60 cttag 65 <210> 163 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 163 atgaacgaac aatattccgc attgcgtagt aatgtcagta tgctcgtgta ggctggagct 60 gcttc 65 <210> 164 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 164 ttagccggta ttacgcatac ctgccgcaat cccggcaata gtgaccatat gaatatcctc 60 cttag 65 <210> 165 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 165 atgtccagaa ggcttcgcag aacaaaaatc gttaccacgt taggcgtgta ggctggagct 60 gcttc 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cagtcatagc cgaatagcct 20 <210> 211 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 211 atacgtgtcc cgagcggtag 20 <210> 212 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 212 tacacatccc gccatcagca 20 <210> 213 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 213 gaagtaaacg ggaaaatcaa 20 <210> 214 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 214 agaagtggca taagaaaacg 20 <210> 215 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 215 ccattggctg aaaattacgc 20 <210> 216 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 216 gttccattgc acggatcacg 20 <210> 217 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 217 atgccgtaga agccgccagt 20 <210> 218 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 218 tgttggtgcg cagctcgaag 20 <210> 219 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 219 gcaaatctgg tttcatcaac 20 <210> 220 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 220 tcccttgcac aaaacaaagt 20 <210> 221 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 221 ggatttggtt ctcgcataat 20 <210> 222 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 222 agcattaacg gtagggtcgt 20 <210> 223 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 223 gctgattctc gcgaataaac 20 <210> 224 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 224 aaaaacgttc ttgcgcgtct 20 <210> 225 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 225 tctgtttgtc accaccccgc 20 <210> 226 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 226 aagccagcac ctggaagcag 20 <210> 227 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 227 aagagctgcc gcaggaggat 20 <210> 228 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 228 gccgccctct taagtcaaat 20 <210> 229 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 229 ggattttagc aatattcgct 20 <210> 230 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 230 cctaatagca ggaagaagac 20 <210> 231 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 231 gctgaactgt tgctggaaga 20 <210> 232 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 232 ggcgtgcttt tacaactaca 20 <210> 233 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 233 tagtaaataa cccaaccggc 20 <210> 234 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 234 tcagtgagcg cagtgtttta 20 <210> 235 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 235 attaatggtg agagtttgga 20 <210> 236 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 236 tgcttttttt tattattcgc 20 <210> 237 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 237 gctttataaa agacgacgaa 20 <210> 238 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 238 gtaacgacaa ttccttaagg 20 <210> 239 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 239 tttatatgcc catggtttct 20 <210> 240 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 240 atctgttaga ggcggatgat 20 <210> 241 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 241 ctggaacgtt aaatctttga 20 <210> 242 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 242 ccagtttagt agctttcatt 20 <210> 243 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 243 gatttgttca acattaactc atcgg 25 <210> 244 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 244 tgcgattaac agacaccctt 20 <210> 245 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 245 tctcaggtgc tcacagaaca 20 <210> 246 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 246 tatggaagag gcgctactgc 20 <210> 247 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 247 cgacctgctg cataaacacc 20 <210> 248 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 248 tgaacgctaa ggtgattgca 20 <210> 249 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 249 acgtagacaa gagctcgcaa 20 <210> 250 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 250 catcacgtac gactgcgtcg 20 <210> 251 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 251 tgcaactttg tgctgagca 19 <210> 252 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 252 tatcgcttcc gggcattgtc 20 <210> 253 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 253 aaatcgatct cgtcaaattt cagac 25 <210> 254 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 254 aggaaccaca aatcgccata 20 <210> 255 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 255 gacgtgaaga ttactacgct 20 <210> 256 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 256 agttcaatgc tgaaccacac 20 <210> 257 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 257 tagccgcgac cacggtaaga aggag 25 <210> 258 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 258 cagcgcatca cccggaaaca 20 <210> 259 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 259 atcgtgatca ttaacctgat 20 <210> 260 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 260 ttaccctgat aaattaccgc 20 <210> 261 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 261 ccatccgttg aatgagtttt 20 <210> 262 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 262 tggtgttaac tggcaaaatc 20 <210> 263 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 263 gtgacttcca acggcaaaag 20 <210> 264 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 264 ccgttggttt gatagcaata 20 <210> 265 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 265 gaatctggtg tatatggcga 20 <210> 266 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 266 tcttcgctat tacgccagct 20 <210> 267 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 267 cgtcagcgga tgtatctggt 20 <210> 268 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 268 gcggaatttc tggttcgtaa 20 <210> 269 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 269 ttgtcaacga tggggtcatg 20 <210> 270 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 270 aaaaatgccg acataacgtc 20 <210> 271 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 271 tctcaaagcg cgcaagttcg 20 <210> 272 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 272 ggtattgatg taccgggtga gatt 24 <210> 273 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 273 tcgacagaac gacaccaaat 20 <210> 274 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 274 cactgtgaac gaaggatcgt 20 <210> 275 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 275 tgttggcaat attgatgaag 20 <210> 276 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 276 gacatcgctt tcaacattgg 20 <210> 277 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 277 gacagacagg cgaactgacg 20 <210> 278 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 278 gcgcagattt gcagattcgt 20 <210> 279 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 279 tggcggcagt gaagagaagc 20 <210> 280 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 280 gcaataacgc gctcgtaatc 20 <210> 281 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 281 acaaagcagg ataagtcgca 20 <210> 282 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 282 cacttcaggt aaggctgtga 20 <210> 283 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 283 cagagaactg cgtaagtatt acgca 25 <210> 284 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 284 tagtggtaac aagcgtgaaa aacaa 25 <210> 285 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 285 atgaagactc cgtaaacgtt tcccc 25 <210> 286 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplification <400> 286 caaaaataga cacaccggga gttca 25 <210> 287 <211> 939 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 287 atgagaatta caattgccgg tgcaggagcg atggggagtc gttttggttt aatgcttcat 60 aaaggtggca atgaagtaac ccttatagat ggatggcctg aacacgttaa agcgattaaa 120 gagcatggtt tgcgagctaa ttacaatgga gaagaactca ccgctcatct atcggttgag 180 ttacaatctg agatttcttc taaagaaaaa acagatttaa ttattttgtt tacaaaagcc 240 atgcaattag ataagatgct acaagatatt aaaccattaa ttgacgagca taccaaggta 300 ctttgcttac taaatggaat tggtcacgaa gatactatag aaaaatatgt ttcgaaaaat 360 aatatcttta ttggtaatac tatgtggact gctggattag aaggtccagg taaagctaaa 420 ttatttggtg atggttcggt tgagctacaa aatcttattt caggtgagga agaaacagct 480 aaaaagttag cagaaatatt atcagaatcg ggactgaatg ctaaatattc taacaatatt 540 cattattcta tttatagaaa agcttgtgtt aatggaacaa tgaatgggct ttgtactatt 600 ttagacacta atatggccgg attaggtgaa acaaaaccag cacatgatat ggttgttact 660 attgttaatg aatttgcagc agtagcaaaa tttgagaatg taaaccttga tattgctgaa 720 gtagttcagc acgttgaaac atgttttgat ccatctacaa ttggattaca ttacccttct 780 atgtatcagg atttgattaa aaataatcga ttgacagaga ttgactatat taatggggct 840 gtttcacgta aaggtaaaaa atataatgta gccacacctt attgtgattt cttaacacaa 900 ttagttcaca gcaaagaaga gttattaaaa gcaaaataa 939 <210> 288 <211> 312 <212> PRT <213> Lactococcus lactis <400> 288 Met Arg Ile Thr Ile Ala Gly Ala Gly Ala Met Gly Ser Arg Phe Gly 1 5 10 15 Leu Met Leu His Lys Gly Gly Asn Glu Val Thr Leu Ile Asp Gly Trp 20 25 30 Pro Glu His Val Lys Ala Ile Lys Glu His Gly Leu Arg Ala Asn Tyr 35 40 45 Asn Gly Glu Glu Leu Thr Ala His Leu Ser Val Glu Leu Gln Ser Glu 50 55 60 Ile Ser Ser Lys Glu Lys Thr Asp Leu Ile Ile Leu Phe Thr Lys Ala 65 70 75 80 Met Gln Leu Asp Lys Met Leu Gln Asp Ile Lys Pro Leu Ile Asp Glu 85 90 95 His Thr Lys Val Leu Cys Leu Leu Asn Gly Ile Gly His Glu Asp Thr 100 105 110 Ile Glu Lys Tyr Val Ser Lys Asn Asn Ile Phe Ile Gly Asn Thr Met 115 120 125 Trp Thr Ala Gly Leu Glu Gly Pro Gly Lys Ala Lys Leu Phe Gly Asp 130 135 140 Gly Ser Val Glu Leu Gln Asn Leu Ile Ser Gly Glu Glu Glu Thr Ala 145 150 155 160 Lys Lys Leu Ala Glu Ile Leu Ser Glu Ser Gly Leu Asn Ala Lys Tyr 165 170 175 Ser Asn Asn Ile His Tyr Ser Ile Tyr Arg Lys Ala Cys Val Asn Gly 180 185 190 Thr Met Asn Gly Leu Cys Thr Ile Leu Asp Thr Asn Met Ala Gly Leu 195 200 205 Gly Glu Thr Lys Pro Ala His Asp Met Val Val Thr Ile Val Asn Glu 210 215 220 Phe Ala Ala Val Ala Lys Phe Glu Asn Val Asn Leu Asp Ile Ala Glu 225 230 235 240 Val Val Gln His Val Glu Thr Cys Phe Asp Pro Ser Thr Ile Gly Leu 245 250 255 His Tyr Pro Ser Met Tyr Gln Asp Leu Ile Lys Asn Asn Arg Leu Thr 260 265 270 Glu Ile Asp Tyr Ile Asn Gly Ala Val Ser Arg Lys Gly Lys Lys Tyr 275 280 285 Asn Val Ala Thr Pro Tyr Cys Asp Phe Leu Thr Gln Leu Val His Ser 290 295 300 Lys Glu Glu Leu Leu Lys Ala Lys 305 310

Claims (22)

  1. 하기의 2-단계 경로를 포함하는, 호모세린으로부터 2,4-다이하이드록시부티레이트 (2,4-다이하이드록시부티르산과 동의어임)를 제조하는 방법:
    - 호모세린의 1차 아미노기를 카르보닐기로 변환하여, 2-옥소-4-하이드록시부티레이트를 수득하는 제1 단계, 및
    - 상기 수득된 2-옥소-4-하이드록시부티레이트 (OHB)를 2,4-다이하이드록시부티레이트로 환원하는 제2 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 단계 및/또는 상기 제2 단계(들)가 내인성 유전자 또는 이종성 유전자에 의해 코딩되는 효소에 의해 촉매되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 제1 단계가 각각 호모세린 트랜스아미나제, 호모세린 데하이드로게나제 또는 호모세린 옥시다제 활성을 가진 효소에 의해 촉매되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 호모세린 트랜스아미나제 활성을 가지는 효소가 ilvE , tyrB , aspC , araT , bcaT, ARO8 유전자에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 호모세린 트랜스아미나제 활성을 가지는 효소가, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67 또는 서열 번호 69로 표시되는 서열, 또는 상기 서열과 적어도 50%의 상동성을 공유하는 서열에 의해 코딩되거나, 또는 서열 번호 60, 서열 번호 62, 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 또는 상기 서열과 적어도 50%의 상동성을 공유하는 서열인 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 제2 단계가 OHB 리덕타제 활성을 가진 효소에 의해 촉매되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 OHB 리덕타제 활성을 가진 효소가 락테이트 데하이드로게나제, 말레이트 데하이드로게나제 또는 분지쇄 2-하이드록시산 데하이드로게나제인 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 OHB 리덕타제가 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli ) 유래의 (D)-락테이트 데하이드로게나제; 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis ), 오릭탈라구스 쿠니쿨루스(Oryctalagus cuniculus ), 게오바실러스 스테아로터모필루스(Geobacillus stearothermophilus) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 (L)-락테이트 데하이드로게나제; 에스케리키아 콜라이 유래의 (L)-말레이트 데하이드로게나제; 락토코커스 락티스 유래의 분지쇄 (D)-2-하이드록시산 데하이드로게나제; 또는 이들의 호모로그(homologue)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 OHB 리덕타제가,
    - 락토코커스 락티스 LdhA (SEQ. ID No. 6)에 따라 규정되는 V17, Q85, E89, I226, 또는 A222의 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 락테이트 데하이드로게나제,
    - 에스케리키아 콜라이 Mdh (서열 번호 2)에 따라 규정되는 I12, R81, M85, D86, V93, G179, T211, 또는 M227의 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 말레이트 데하이드로게나제인 것을 특징으로 하는, 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    상기 OHB 리덕타제가,
    - 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 288, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 102, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 108, 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 114, 서열 번호 116 또는 서열 번호 118, 또는 상기 서열과 적어도 50%의 상동성을 공유하는 서열로 표시되거나,
    - 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 287, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 101, 서열 번호 103, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115 또는 서열 번호 117로 표시되는 핵산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 50%의 상동성을 공유하는 서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  11. 호모세린으로부터 2,4-DHB를 제조하기 위한 변형된 미생물로서,
    상기 제조 방법은 하기 단계로 구성되거나 또는 하기 단계를 포함하는 2-단계 경로를 포함하는 것인, 변형된 미생물:
    - 호모세린의 1차 아미노기를 카르보닐기로 변환하여, 2-옥소-4-하이드록시부티레이트를 수득하는 제1 단계, 및
    - 상기 수득된 2-옥소-4-하이드록시부티레이트를 환원시켜, 2,4-다이하이드록시부티레이트를 수득하는 제2 단계.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 제1 단계 및 상기 제2 단계를 촉매하는 효소가 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 효소인 것을 특징으로 하는, 변형된 미생물.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 호모세린의 생산이, 형질전환되지 않은 동일 미생물과 비교해 증가되는 것을 특징으로 하는, 변형된 미생물.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    아스파테이트 키나제, 아스파테이트 세미알데하이드 데하이드로게나제 및/또는 호모세린 데하이드로게나제의 활성이 증가되는 것을 특징으로 하는, 변형된 미생물.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 2,4-DHB의 생산이, 형질전환되지 않은 동일 미생물과 비교해 증가되는 것을 특징으로 하는, 변형된 미생물.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    박테리아, 바람직하게는 엔테로박테리에이시이(Enterobacteriaceae), 클로스트리디에이시이(Clostridiaceae), 바실레이시이(Bacillaceae), 스트렙토마이세테이시이(Streptomycetaceae), 스트렙토코케이시이(Streptococcaceae), 메틸로박테리에이시이(Methylobacteriacae), 및 코리네박테리에이시이(Corynebacteriaceae), 가장 바람직하게는 에스케리키아 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 코리네박테리아 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 메틸로박테리아 엑스토?스(Methylobacterium extorquens), 또는 락토코커스 락티스로부터 선택되는 박테리아, 또는
    효모, 바람직하게는 사카로마이세테이시이(Saccharomycetaceae), 피키에이시이(Pichiaceae), 및 스키조사카로마이세테이시이(Schizosaccharomycetaceae), 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus), 피키아 야디니이(Pichia jadinii), 피키아 스티피티스(Pichia stipitis), 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)로부터 선택되는 효모, 또는
    균류, 바람직하게는 페니실리움(Penicillium), 아스퍼길러스(Aspergillus), 크리소스포리움(Chrysosporium) 또는 트리코더마(Trichoderma)로부터 선택되는 균류
    인 것을 특징으로 하는, 변형된 미생물.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, 이소시트레이트 리아제, 피루베이트 카르복실라제, 및 헥소스 심포터 퍼미아제(hexose symporter permease)로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소 활성 중 하나 이상의 발현이 증가되거나, 및/또는
    락테이트 데하이드로게나제, 알코올 데하이드로게나제, 아세테이트 키나제, 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제, 피루베이트 옥시다제, 이소시트레이트 리아제, 푸마라제(fumarase), 2-옥소글루타레이트 데하이드로게나제, 피루베이트 키나제, 말산 효소, 포스포글루코스 이소머라제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, 피루베이트-포르메이트 리아제, 숙신산 세미알데하이드 데하이드로게나제, 당-수송 포스포트랜스퍼라제, 케토하이드록시글루타레이트 알돌라제, 호모세린-O-숙시닐 트랜스퍼라제, 호모세린 키나제, 호모세린 유출(efflux) 수송체, 다이아미노피멜레이트 데카르복실라제 및/또는 메틸글리옥살 신타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소 활성 중 하나 이상이 감소되는 것을 특징으로 하는, 변형된 미생물.
  18. 제16항에 있어서,
    에스케리키아 콜라이로부터 모두 유래된, ppc , pck , aceA , galP , asd , thrA , metL, lysC; 및 락토코커스 락티스 유래의 pycA로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자들 중 하나 이상을 과발현하거나, 및/또는 ldhA , adhE , ackA , pta , poxB , focA , pflB , sad , gabABC , sfcA , maeB , ppc , pykA , pykF , mgsA , sucAB, ptsI , ptsG , pgi, fumABC , aldA , lldD , iclR , metA , thrB , lysA , eda , rthA , rthB , rthC로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자들 중 하나 이상이 결손된 에스케리키아 콜라이인 것을 특징으로 하는, 변형된 미생물.
  19. 2,4-DHB의 제조 방법으로서,
    - 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 변형된 미생물을 적절한 배양 배지에서 배양하는 단계, 및
    - 상기 배양 배지로부터 2,4-DHB를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 2,4-DHB가 추가로 정제되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  21. 호모세린을 OHB로 변환하기 위한, 호모세린 트랜스아미나제, 호모세린 데하이드로게나제 또는 호모세린 옥시다제 활성을 가진 효소의 용도.
  22. OHB를 2,4-DHB로 변환하기 위한, (L)-락테이트 데하이드로게나제, (L)-말레이트 데하이드로게나제 또는 2-하이드록시산 데하이드로게나제 활성을 가진 효소의 용도.
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