KR20150020192A

KR20150020192A - 인간 사이클로옥시게나아제 및 독소루비신 또는 독소루비신 유사체를 함유한 약제 조성물, 이의 제조방법, 및 약물을 제조하는데 이의 용도

Info

Publication number: KR20150020192A
Application number: KR20147034747A
Authority: KR
Inventors: 슈잉 린
Original assignee: 슈잉 린
Priority date: 2012-05-10
Filing date: 2012-12-13
Publication date: 2015-02-25
Also published as: EP2851079A1; EP2851079A4; CN102961440A; US20150118214A1; WO2013166833A1; AU2012379443A1; JP2015515993A; CN102961440B

Abstract

살비아 플렉트란토이드(Salvia plectranthoides)(또한 rare grass로서 지칭됨)를 사용하여 인간 사이클로옥시게나아제 및 독소루비신 또는 독소루비신 유사체를 함유한 약제 조성물, 이를 제조하는 방법, 및 신장염, 담낭염 및 담낭 용종, 종양을 치료하기 위한 약물, 또는 항염증제 및 진통제를 제조하는데 있어서의 이의 용도가 제공된다.

Description

인간 사이클로옥시게나아제 및 독소루비신 또는 독소루비신 유사체를 함유한 약제 조성물, 이의 제조방법, 및 약물을 제조하는데 이의 용도{PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING HUMAN CYCLOOXYGENASE AND DOXORUBICIN OR DOXORUBICIN ANALOGUE, PREPARATION METHOD THEREFOR AND USE THEREOF IN PREPARING DRUGS}

본 발명은 천연 식물로부터 추출된 한 유형의 약용 조합물, 특히 천연 인간 에폭시다아제 (COX-2) 및 천연 독소루비신 (atm) 또는 천연 파라-독소루비신을 함유한 한 유형의 약용 조합물, 이러한 유형의 약용 조합물의 제조방법, 및 신장염(nephritis), 담낭염(cholecystitis), 담낭 용종(gall bladder polypus) 또는 종양을 치료하는 약물 또는 소염제의 제조에서 이러한 약용 조합물의 적용에 관한 것이다.

독소루비신(doxorubicin)의 화학명은 (2R,4S)-4-(3-아미노-2,3,6-트리데옥시-α-L-릭소-헥소피라노실옥시)-2-하이드록시아세틸-1,2,3,4-테트라하이드로-2,5,12-트리하이드록시-7-메톡시나프타센-6,11-디온이다. 이는 RNA 및 DNA의 합성을 억제할 수 있는 항종양 항생제이고, RNA의 가장 강력한 억제를 갖는다. 이는 비교적 넓은 항종양 스펙트럼 및 다양한 종양들에 대한 효과를 갖는다. 이는 세포 주기 비특이성 작용제에 속하고 다양한 성장 주기의 종양 세포들을 사멸시킬 수 있다. 이는 주로 급성 백혈병( acute leucemia )에 적용 가능하고, 급성 림프성 백혈구 및 과립성 백혈구 둘 모두에 효과적이다. 악성 림프종에 대하여, 이는 대체 용도에서 사용되는 제1 약물일 수 있다. 이는 유방암, 육종( fleshy tumor ), 폐암, 및 방광암, 등의 치료에서 어느 정도까지 효과적이고, 일반적으로 다른 항종양 약물들과 함께 사용된다.

이러한 생성물은 인간 신체에 대한 넓은 생화학적 효과를 발생시킬 수 있고 강력한 세포 독성을 갖는 넓은 스펙트럼의 항종양 약물이다. 이의 주요 작용 메카니즘은 핵산의 합성을 억제하기 위해 DNA에 엠베딩되는 것이다. 이는 임상적으로, 급성 림프성 백혈병, 급성 과립성 백혈병, 호지킨 및 비-호지킨 림프종, 유방암, 폐암, 난소종 ( oophoroma ), 연조직 육종, 골형성 육종, 횡문근 육종, 신장의 배아종, 신경 모세포 종양, 방광 종양, 갑상선 종양, 융모상 피종(chorionepithelioma), 전립선암, 고환암, 위암, 및 간암, 등을 치료하기 위해 사용된다.

인간 에폭시다아제 (사이클로옥시게나아제 COX), 또한 프로스타글란덴하이퍼옥사이드 합성 효소(prostaglandenhyperoxidesynthase; PGHS)는 아라키돈산을 프로스타글란딘 및 에이코실렌으로 전환시키는 속도-제한 효소이다. 상이한 구조 및 상이한 생리학적 기능을 갖는 두 가지 유형의 에폭시다아제, 즉 COX-1 및 COX-2가 존재한다. 인간 에폭시다아제(COX-2)는 1988년에 발견되었다. 천연 인간 에폭시다아제는 1991년에 식물로부터 분리되었다. 천연 인간 에폭시다아제는 단백질의 한 유형 및 또한 유도된 효소의 한 유형인데, 이는 일부 화학적 신호의 발생을 촉진시키기 위해 효소로서 작용할 수 있다. 이는 염증 및 통증의 경우에 활성적이다. COX-2의 활성이 억제될 때에, 통증은 줄어들 것이다. 활성화된 COX-2는 아라키돈산의 발생을 도울 수 있어, 인간 신체의 다양한 생리학적 공정들 및 병리학적 공정들에 참여하는, 다양한 프로스타글란딘을 발생시킬 수 있다. 현재, 널리 인지된 견해는, COX-2가 종양 증식의 촉진, 세포 고사(cell withering)의 억제, 혈관 형성(angiopoiesis)의 촉진, 및 면역 기능의 억제를 통해 종양 발생 및 발달에 참여할 수 있다는 것이다.

인간 에폭시다아제(COX-2)에 대한 여러 연구 논문이 존재하지만, 종래 기술에서는 풍부한 양의 COX-2를 함유한 천연 식물이 발견되었는데, 이는 천연 독소루비신 (atm) 및 인간 에폭시다아제 (COX-2)의 산업적 생산을 실현시키기 위해 전통적인 한약(traditional Chinese medicine)의 방법을 택할 수 있다.

참조문헌:

Xue Peini, Chang Xiaohong, Yang Lirong, Journal of Yanan University (medical science) 2011 Volume 09 Session 03: "Progress in research of correlation between COX-2 and non-small cell carcinoma of the lung";

Zou Yingying, Yao Nan, Wang Fang, Gao Qian, Song Jinglin, Journal of Kunming Medical College 2010 Volume 31 Session 01: "Characteristics of expression of CDX2 and COX2 in human large intestine cancer and their relation with metastasis";

Zhang Huifeng, Gao Xiaoqin, Li Rongshan, Journal of Shanxi Medical University 2009 Volume 40 Session 12: "P_(38)MAPK/COX_2 Experimental research in protection effect of signal transduction path in second window of pre-treatment of rat kidney ischemia";

Shi Bainian, Liu Jiang, He Jiangfang, Dai Licheng, Zhou Jianfang, Zhao Weifeng, Gan Jianhe, Zhongyuan Medical Journal 2007 Volume 34 Session: "Expression of epoxidation enzyme 2 in liver injury of hepatic failure model"

종래 기술의 상술된 단점들을 보상하기 위하여, 본 발명의 목적은 천연 인간 에폭시다아제 (COX-2) 및 천연 독소루비신 (atm) 또는 천연 파라-독소루비신을 함유한 한 유형의 약용 조합물, 이러한 유형의 약용 조합물의 제조방법, 및 신장염, 담낭염, 담낭 용종 또는 종양을 치료하는 약물, 또는 소염제의 제조에서 이러한 약용 조합물의 적용을 제공하기 위한 것이다. 본 발명은 인간 에폭시다아제 (COX-2) 및 천연 독소루비신 또는 파라-독소루비신이 풍부한 천연 약용 식물로부터 제조된 약용 조합물을 제공하며, 이러한 약용 조합물은 전통적인 한약 방법을 이용하여 천연 독소루비신 (atm) 및 인간 에폭시다아제 (COX-2)의 약용 산업화를 실현시킬 수 있다. 화학적으로 합성된 약물의 여러 부작용들이 방지될 수 있으며, 양호한 치료 효과가 제공된다.

본 발명의 기술적 구체예(technical scheme)는 조합물의 원료가 기진초(treasures grass) (또한, 구이저우 기진초(Guizhou treasures grass)로서 지칭됨)인, 천연 인간 에폭시다아제 (COX-2) 및 천연 독소루비신 (atm) 또는 천연 파라-독소루비신의 한 유형의 약용 조합물이다.

이러한 기술적 구체예에서, "이러한 조합물의 원료가 기진초이다"는 전체 기진초(뿌리를 포함함) 또는 신선한 기진초 또는 기진초의 추출물의 탈수, 건조 및 분쇄로부터 얻어진 분말이 사용될 수 있다는 것을 의미한다.

상기 기진초 추출물은 하기들 중 하나를 나타낸다:

울(wool)로 찧어진 신선한 기진초;

기진초의 전탕액(water decoction liquid);

기진초 전탕액의 농축 및 건조로부터 얻어진 분말;

알코올 추출물에 의해 얻어진 기진초 전탕액의 알코올 추출액;

알코올 추출물에 의해 얻어진 기진초 전탕액의 알코올 추출액의 농축 및 건조로부터 얻어진 분말;

전체 기진초 또는 기진초 전탕액의 유기 추출로부터 얻어진 추출물;

전체 기진초 또는 기진초 전탕액의 유기 추출로부터 얻어진 추출물의 재농축 및 건조로부터 얻어진 분말;

전체 기진초 또는 기진초 전탕액의 CO₂ 초임계 추출로부터 얻어진 추출물;

전체 기진초 또는 기진초 전탕액의 CO₂ 초임계 추출로부터 얻어진 추출물의 농축 및 건조로부터 얻어진 분말; 및

전체 기진초로부터 추출된 휘발성 오일.

상기 원료 기진초 또는 이의 추출물에 추가하여, 천연 인간 에폭시다아제 (COX-2) 및 천연 독소루비신 (atm) 또는 천연 파라-독소루비신을 함유한 이러한 약용 조합물은 또한 약학 분야에서 허용되는 보조 재료들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 정제를 제조하기 위해 사용되는 부형제, 조미료(condiment), 또는 항산화제; 캡슐을 제조하기 위해 사용되는 항산화제 또는 안정화제; 경구용 액제 또는 시럽을 제조하기 위해 사용되는 조미료, 안정화제 또는 항산화제; 외용 약용 추출물을 제조하기 위해 사용되는 유화제 또는 바셀린; 및 주사제를 제조하기 위해 사용되는 유화제, 용매 또는 안정화제.

상기 기술적 구체예에서 상기 기진초 (가칭)의 식물 분류 위치는 하기와 같다:

구이저우 기진초(Guizhou 기진초):

사이비아 플렉트란토이드 그리프(Saivia plectranthoides Griff)

속씨 식물(Angiospermae)

쌍떡잎식물(Dicotyledoneae)

합판화류(Sympetalae)

관상화류(Tubiflorae)

마편초과(Verbenineae)

꿀풀과(Labiatae)

살비아 린(Salvia linn)

이러한 기진초는 섬유상 뿌리 시스템, 및 직립 또는 상승 포복성 근경(erect or rising repent rhizome)을 갖는, 한해살이 초본 또는 다년생 초본이다. 포복성 줄기는 이의 포복성 줄기는 이의 마디에서 뿌리(rootage)(단일 또는 클러스터)를 갖는다. 이러한 줄기는 둔각 사각형(obtuse quadrangle)(네모(square))의 형상을 가지고, 그루브(groove)들을 가지고, 두껍고 짧은 솜털(lanugo)로 덮혀있다.

이러한 기전초(가칭)의 종자는 보존을 위해 2011년 4월 2일에 후한 대학교의 중국 전형 배양물 보존 센터로 보내었다. 보존 번호(Preservation number)는 CCTCC No: P201102이다(본 발명의 개요의 첨부물 1 참조). 이러한 식물의 신규 종의 권리는 USA: 수리번호: 12/215.016; USA 상표 수리번호: 776M688로 신청하였다.

국가 약물 스크리닝 센터(National Center for Drug Screening)에 따르면, 독소루비신 (또는 파라-독소루비신, 즉 독소루비신 내성을 지님)을 함유한 샘플번호 nc00168954가 효과적이다 (본 발명의 개요의 첨부물 2 참조). 국가 약물 스크리닝 센터에 따르면, 인간 에폭시다아제-2 (COX-2) 활성 억제 보고서; 면역 생물학적 활성, T 및 B 림프구의 증식, 및 세포 독성에 대한 항종양 물질 효과의 실험 결과의 평가(본 발명의 개요의 첨부물 2 참조). 항저우 고처리량 약물 스크리닝 센터(Hangzhou High Throughput Drug Screening Center)에 의해 수행된 스크리닝에 따르면, 이러한 식물은 7개 유형의 암세포 억제 활성 물질을 함유한다(본 발명의 개요의 첨부물 3 참조).

이러한 식물 종의 정보는 농업부(Ministry of Agriculture)에 제출되었고 완성되었다.

본 출원의 제2 양태의 기술 구체예는 천연 인간 에폭시다아제 (COX-2) 및 천연 독소루비신 (atm) 또는 천연 파라-독소루비신을 함유한 상기 약용 조합물을 제조하는 방법으로서,

(1) 전체 기진초를 세척하는 단계;

(2) 단계 (1)에서 얻어진 세척된 전체 기진초를 탈수, 건조, 및 분쇄시켜 분말을 수득하는 단계;

(3) 상기 단계 (2), 또는 하기 (2)-1, (2)-2, (2)-3, (2)-4, 또는 (2)-5에서 수득된 분말 및/또는 휘발성 오일을 약용 보조 재료와 혼합하여 요망되는 투약 패턴(dose pattern)을 제조하는 단계;

(4) 멸균하는 단계;

(5) 분석하는 단계; 및

(6) 포장하는 단계를 포함하며,

상기 단계 (2)가 또한

(2)-1 기진초 전탕액 또는 이러한 전탕액의 재농축 및 건조에 의해 수득된 분말;

(2)-2 알코올 추출물에 의해 얻어진 기진초 전탕액의 알코올 추출액, 또는 이러한 알코올 추출액의 재농축 및 건조에 의해 얻어진 분말;

(2)-3 유기 추출에 의해 수득된 전체 기진초 또는 기진초 전탕액의 추출물, 또는 이러한 추출물의 재농축 및 건조에 의해 얻어진 분말;

(2)-4 전체 기진초 또는 기진초 전탕액의 CO₂ 초임계 추출에 의해 얻어진 추출물, 또는 이러한 추출물의 재농축 및 건조에 의해 수득된 분말;

(2)-5 전체 기진초로부터 추출된 휘발성 오일 중 하나에 의해 수득된 기진초 추출물을 채택할 수 있는 방법이다.

본 출원의 제3 양태의 구체예는 신장염(nephritis)을 치료하는 약물의 제조에서 천연 인간 에폭시다아제 (COX-2) 및 천연 독소루비신 (atm) 또는 천연 파라-독소루비신을 함유한 상기 약용 조합물의 적용이다.

본 출원의 제4 양태의 구체예는 담낭염(cholecystitis) 및 담낭 용종(gall bladder polypus)을 치료하는 약물의 제조에서 천연 인간 에폭시다아제 (COX-2) 및 천연 독소루비신 (atm) 또는 천연 파라-독소루비신을 함유한 상기 약용 조합물의 적용이다.

본 출원의 제5 양태의 구체예는 종양을 치료하는 약물의 제조에서 천연 인간 에폭시다아제 (COX-2) 및 천연 독소루비신 (atm) 또는 천연 파라-독소루비신을 함유한 상기 약용 조합물의 적용이다.

본 출원의 제6 양태의 구체예는 소염제의 제조에서 천연 인간 에폭시다아제 (COX-2) 및 천연 독소루비신 (atm) 또는 천연 파라-독소루비신을 함유한 상기 약용 조합물의 적용이다.

천연 인간 에폭시다아제 (COX-2) 및 천연 독소루비신 (atm) 또는 천연 파라-독소루비신을 함유한 상기 약용 조합물이 신장염, 담낭염, 또는 종양을 치료하기 위한 약물, 또는 소염제를 제조하기 위해 사용될 때에, 투여 모드는 경구 투여 정제, 캡슐, 경구용 액제 또는 시럽, 경구 투여 증류액, 외용 점안액, 외용 안연고, 외용 화상 통증 완화 연고, 및 외용 항-염증, 지혈, 자극 분산, 및 통증 완화 분말일 수 있다. 주사제가 배제되는 것은 아니다.

투여 용량: 성인의 경우에, 하루에 5 g 내지 6 g의 구이저우(Guizhou) 기진초 분말과 같음; 이러한 적용은 하루에 5.4 gm 즉 하루에 3회 및 각 횟수 당 1.8 g을 제안한다.

치료 기간(치료 과정)은 7일이다. 일반 염증(ordinary phlogosis)을 치료하기 위해 2 과정이 요구된다. 만성 염증을 치료하기 위해 6 과정이 요구된다. 신장염, 담낭염 또는 종양을 치료하기 위해 대개 6 또는 그 초과의 과정이 보통 요구된다.

본 발명의 약용 조합물은 염증을 빠르게 치료하고, 부종(swelling)을 제거하고, 통증을 경감시킬 수 있다. 이는 또한 바이러스를 제거하고, 종양 세포를 억제하고, 인간 신체 면역계의 활력(vitality)을 활성화시킬 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 약용 조합물은 만성 신장염, 급성 담낭염 (담즙 역류 담낭염을 포함), 및 림프, 폐, 간, 위 및 젖샘에서의 다양한 종양들, 뿐만 아니라 유섬유종 종양(fibroid tumor) 및 백혈병을 치료할 수 있다. 이는 또한 트라코마(trachoma) 및 홍안병(pink eye)을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

외용 약물로서, 본 발명의 약용 조합물은 외상성 손상, 뜨거운 물 또는 화염에 의한 화상, 및 천공성 궤양의 상처 및 고름 발생(running with pus)을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 약용 조합물의 새로운 원료 식물의 외용 빻아진 페이스트(pounded paste)는 골 결합(bone union)을 도울 수 있다.

본 발명의 약용 조합물은 또한 미화 효과(beautification effect)의 특징을 가지고 미화 제품(beautification product)의 개발을 위해 사용될 수 있다.

하기는 신장염, 담낭염 및 담낭 용종, 및 종양에 대한 본 발명에 따라 제조된 약물의 치료 효과의 증거를 제공한다.

천연 인간 에폭시다아제 (COX-2) 및 천연 독소루비신 (atm) 또는 천연 파라-독소루비신을 함유한 약용 조합물이 신장염을 치료하기 위한 약물을 제조하기 위해 적용될 때에, 환자의 확정된 진단은 표준 기준을 채택하며, "효과적인," "분명하게 효과적인," 및 "치료된" 등은 또한 전통적인 기준을 채택한다. 본 발명의 약물의 투여 용량은 성인의 경우에, 하루에 세번 및 1회에 1.8g이며, 치료 과정은 7일이다. 6 이상의 과정 후에, 치료 효과 비교는 하기 표에 나타낸다:

표 1

본 발명의 약물을 사용하는 그룹의 치료 시간은 7 내지 15일이다.

천연 인간 에폭시다아제 (COX-2) 및 천연 독소루비신 (atm) 또는 천연 파라-독소루비신을 함유한 약용 조합물이 담낭염을 치료하기 위한 약물을 제조하기 위해 적용될 때에, 환자의 확정된 진단은 표준 기준을 채택하며, "효과적인," "분명하게 효과적인," 및 "치료된" 등은 또한 전통적인 기준을 채택한다. 본 발명의 약물의 투여 용량은 성인의 경우에, 하루에 세번 및 1회에 1.8g이며, 치료 과정은 7일이다. 6 이상의 과정 후에, 치료 효과 비교는 하기 표에 나타낸다:

표 2

천연 인간 에폭시다아제 (COX-2) 및 천연 독소루비신 (atm) 또는 천연 파라-독소루비신을 함유한 약용 조합물이 종양을 치료하기 위한 약물을 제조하기 위해 적용될 때에, 종양(림프 종양) 환자의 확정된 진단은 표준 기준을 채택하며, "효과적인," "분명하게 효과적인," 및 "치료된" 등은 또한 전통적인 기준을 채택한다. 본 발명의 약물의 투여 용량은 성인의 경우에, 하루에 세번 및 1회에 1.8g이며, 치료 과정은 7일이다. 8 이상의 과정 후에, 치료 효과 비교는 하기 표에 나타낸다:

표 3

천연 인간 에폭시다아제 (COX-2) 및 천연 독소루비신 (atm) 또는 천연 파라-독소루비신을 함유한 약용 조합물이 일반 항-염증 통증 완화 약물을 제조하기 위해 적용될 때에, 염증 환자의 확정된 진단은 표준 기준을 채택하며, "효과적인," "분명하게 효과적인," 및 "치료된" 등은 또한 전통적인 기준을 채택한다. 본 발명의 약물의 투여 용량은 성인의 경우에, 하루에 세번 및 1회에 1.8g이며, 치료 과정인 7일이다. 2 이상의 과정 후에, 치료 효과 비교는 하기 표에 나타낸다:

표 4

본 발명의 적용의 약물들의 기술적 효과와 관련하여, 본 발명의 개요에 대한 첨부물 2, 3 및 4를 첨부한다. 항저우 고처리량 약물 스크리닝 센터의 실험 보고서(본 발명의 개요에 대한 첨부물 3):

기진초 약물의 스크리닝에 따르면, 비교적 강한 억제는 세포 폐암, 섬유 육종, 자궁 경부 암종, 및 간암에 대해 확인되었으며, 비교적 약한 억제는 대장의 암종, 전립선 암 및 유방암에 대해 확인되었다.

(1) 한약 추출액은 A549 세포에 대하여 세포 증식의 분명한 억제 효과를 가지며, 이러한 억제 효과는 약물 농도에 대한 의존성을 갖는다.

(2) 한약 추출액은 HK9 세포에 대한 세포 증식 억제의 분명한 효과를 가지며, 이러한 억제 효과는 약물 농도에 대한 의존성을 갖는다.

(3) 한약 추출액은 PC3 세포에 대한 세포 증식 억제의 분명한 효과를 가지며, 이러한 억제 효과는 약물 농도에 대한 의존성을 갖는다.

(4) 한약 추출액은 HT1080 세포에 대한 세포 증식 억제의 분명한 효과를 가지며, 이러한 억제 효과는 약물 농도에 대한 의존성을 갖는다.

(5) 한약 추출액은 Hela 세포에 대한 세포 증식 억제의 분명한 효과를 가지며, 이러한 억제 효과는 약물 농도에 대한 의존성을 갖는다.

(6) 한약 추출액은 MDA-MB-231 세포에 대한 세포 증식 억제의 분명한 효과를 가지며, 이러한 억제 효과는 약물 농도에 대한 의존성을 갖는다.

(7) 한약 추출액은 Hepc2 세포에 대한 세포 증식 억제의 분명한 효과를 가지며, 이러한 억제 효과는 약물 농도에 대한 의존성을 갖는다.

실험 결과:

8 그램의 건조 한약 추출액을 사용하여 1:15 농도 (55.56 ㎍/㎖)의 120 그램의 주스를 제조하였다. 이러한 주스는 세포에 대한 분명한 독성 작용을 갖는다. 이러한 독성 작용 하에서, 상부 챔버에서의 세포들이 사멸하거나 낮은 활성을 갖기 때문에, 하부 챔버로 이동하는 세포의 수가 감소한다. 약물 농도가 55.56 ㎍/㎖ 보다 낮을 때에, 기본적으로 세포에 대한 독성 작용을 나타내지 않는다(실험 정보는 하기에 첨부됨).

본 발명은 인간 에폭시다아제 (COX-2) 및 천연 독소루비신 또는 파라-독소루비신이 풍부한 천연 식물로부터 제조된 약용 조합물을 제공한다. 이러한 조합물은 천연 독소루비신 (atm) 및 인간 에폭시다아제 (COX-2)의 의학 산업화된 제조를 실현시키기 위해 전통적인 한약 방법을 채택할 수 있다. 이는 화학적으로 합성된 약물의 여러 부작용을 피하고 양호한 치료 효과를 제공할 수 있다.

도 1은 한약 추출액의 의한 A549 세포주외 증식 억제의 동적 측정 및 억제 효과 관찰의 곡선을 도시한 것이다.
도 2는 한약 추출액의 의한 HT29 세포주외 증식 억제의 동적 측정 및 억제 효과 관찰의 곡선을 도시한 것이다.
도 3은 한약 추출액의 의한 PC3 세포주외 증식 억제의 동적 측정 및 억제 효과 관찰의 곡선을 도시한 것이다.
도 4는 한약 추출액의 의한 HT1080 세포주외 증식 억제의 동적 측정 및 억제 효과 관찰의 곡선을 도시한 것이다.
도 5는 한약 추출액의 의한 Hela 세포주외 증식 억제의 동적 측정 및 억제 효과 관찰의 곡선을 도시한 것이다.
도 6은 한약 추출액의 의한 MDA-MB-231 세포주외 증식 억제의 동적 측정 및 억제 효과 관찰의 곡선을 도시한 것이다.
도 7은 한약 추출액의 의한 HepG2 세포주외 증식 억제의 동적 측정 및 억제 효과 관찰의 곡선을 도시한 것이다.
도 8은 화합물의 특이성 지도(specificity atlas)를 도시한 것이다.
도 9는 한약 추출액에 의한 A549 세포주외 이동 능력의 측정된 억제의 곡선을 도시한 것이다.
도 10은 한약 추출액에 의한 PC3 세포주외 이동 능력의 측정된 억제의 곡선을 도시한 것이다.
도 11은 한약 추출액에 의한 HT1080 세포주외 이동 능력의 측정된 억제의 곡선을 도시한 것이다.
도 12는 한약 추출액에 의한 Hela 세포주외 이동 능력의 측정된 억제의 곡선을 도시한 것이다.
도 13은 한약 추출액에 의한 MDA-MB-231 세포주외 이동 능력의 측정된 억제의 곡선을 도시한 것이다.
도 14는 한약 추출액에 의한 HepG2 세포주외 이동 능력의 측정된 억제의 곡선을 도시한 것이다.
도 15는 한약 추출액에 의한 HT29 세포주외 이동 능력의 측정된 곡선을 도시한 것이다.
도 16은 실시간 세포 분석기를 도시한 것이다.
도 17 및 도 18은 심근 세포 박동(cardiac muscle cell beating) 특징 및 상태를 반영하는 측정된 곡선을 도시한 것이다.
도 19는 심근 세포 모델에서 파라미터 및 데이타의 분석 페이지이다.
도 20은 신생 래트(new born rat)의 제1 발생 심근 세포의 활성에 대한 한약 추출액의 효과 곡선을 도시한 것이다.
도 21은 약물을 첨가한 후에 시간에 따른 제1 발생 심근 세포의 박동 곡선(beating curve)의 변화를 도시한 것이다.
도 22는 박동수에 대한 한약 추출액 효과의 곡선을 도시한 것이다.
도 23은 진폭에 대한 한약 추출액 효과의 곡선을 도시한 것이다.
도 24는 신생 래트의 제1 발생 심근 세포의 박동수 및 진폭에 대한 한약 추출액 효과의 IC50 곡선을 도시한 것이다.

바람직한 구체예

바람직한 구체예 1: 천연 인간 에폭시다아제 (COX-2) 및 천연 독소루비신 (atm) 또는 천연 파라-독소루비신을 함유한 혼합된 약용 조합물의 정제를 제조하는 방법, 및 이들의 임상 용도.

천연 독소루비신 (atm) (또는 천연 파라-독소루비신) 및 인간 에폭시다아제의 정제를 제조하는 방법:

스팀 증류액을 제조하는 방법:

기진초를 세척하고 멸균시키고, 500 g의 이러한 기진초를 5 kg의 물과 혼합하였다. 스팀 증류를 이용하여 휘발성 오일 및 증류액을 수득하였다. 후속 사용을 위하여 휘발성 오일을 보관하였다. 증류액을 24 시간 이상 동안 저온으로 처리하고, 이를 여과하여 상청액을 수득하고, 알코올 냄새가 나지 않을 때까지 에탄올을 회수하고, 진한 페이스트로 농축하였다. 이를 건조시키고 분쇄하여 추출물 분말을 수득하였다. 휘발성 오일 및 침전물을 취하고, 이를 추출물 분말 상에 균일하게 분무하였다. 보조 약제(medical material), 즉 단일 산 칼슘 포스페이트, 락토즈, 전분, 및 마그네슘 스테아레이트, 등을 마이크로-분말 형태로 첨가하여, 상응하는 투약 패턴을 제조하였다.

추출물 분말 정제를 제조하는 방법: 건조 추출물을 미세 분말로 분쇄하고, 5 내지 6 메시 시브를 통해 여과하고, 습윤화 및 펠렛화를 위해 에탄올을 사용하고, 이후에 정제화를 수행하였다.

분무 회전 펠렛화 방법: 단일 산 칼슘 포스페이트, 락토즈, 및 전분을 첨가하고, 건조 추출물 미세 분말을 코팅 팬에 배치시켰다. 팬을 회전시키면서, 습윤화 및 점진적인 펠렛화를 위해 미스트(mist)를 분무하였다.

분말로부터의 정제화: 약물 물질을 세척하고, 멸균하고, 건조식으로 제조하고, 건조시키고, 10 ㎛ (1 내지 20 ㎛) 입도의 한약의 마이크로 분말을 처리하였다. 300 메시 시브를 통해 여과하여 정제를 제조하였다.

캡슐 제조 방법: 500 g의 약물 물질을 5 kg의 물과 혼합하였다.

3. 캡슐을 제조하는 방법: 약물 물질 처리: 세척하고, 처리하고, 정제하고, 멸균하고, 75 ㎛로 분쇄하였다.

4.1 200 ㎛ 메시 시브를 통해 여과하고, 캡슐을 채웠다.

용매 추출 공정: 기진초를 적절하게 분쇄하고 500 g의 이러한 분쇄된 기진초를 5 kg의 물과 혼합하였다. 함침법, 삼출법, 및 비등(coction)법을 이용하였다. 추출 공정 동안에 유기 용매로서, 친지방성(Lipotropy)을 선택할 수 있다: 원유 에테르.벤젠>디에틸 에테르>에틸 아세테이트>아세톤>에탄올>메탄올>물 (친수성), 등.

이러한 기진초 생약을 스크리닝을 위해 2006년에 상하이 국가 약물 스크리닝 센터(Shanghai National Center for Drug Screening)로 보내었다. 결과는, 이러한 식물이 천연 인간 에폭시다제-2 (cox-2) 활성 및 면역 생물학적 활성, 및 항-염증 처리에서 매우 양호한 효과를 가짐을 나타낸다. 또한, T 및 B 림프구의 매우 양호한 억제 효과를 가지고, 이에 따라 앞으로 적용에 있어 매우 양호하다.

첨부물-1 (보존 증명서, 1 쪽)

첨부물-2 (국가 신규 약물 스크리닝 증명서, 3 쪽)

첨부물-3 (항저우 스크리닝 증명서, 23 쪽)

첨부물-1

첨부물-2

첨부물-3

1. 한약 추출액에 의해 제공된 세포 독성 효과의 연구

(I) 프로젝트 개요

본 실험은 한약 추출액에 의한 세포 증식의 억제 및 약물에 의한 세포 증식의 억제의 IC50을 측정하기 위해 xCELLigence 실시간 세포 분석 시스템을 채택하였다. 채택된 세포는 A549, HT1080, Hela, MDA-MB-231, HT29, HepG2, 및 PC3을 포함한다.

(II) 실험 기기:

ACEA 및 Roche에 의해 함께 개발된 xCELLigence 실시간 세포 분석 시스템

(III) 실험 시약 및 소모품:

DMEM 배양 배지: 상품 번호: SH30022.01B, Hyclone (중국)

개선된 RPMI-1640 배양 배지: 상품 번호: SH30809.01B, Hyclone (중국)

MEM 배양 배지: 상품 번호: SH30024.01B, Hyclone (중국)

F12 배양 배지: 상품 번호: SH30526.01, Hyclone (중국)

MyCOA's 5A 배양 배지: 상품 번호: GNM 16600, Gino (중국)

혈청: 상품 번호: 16000-044, Gibco (USA)

췌장 효소: 상품 번호: 27250-018, Gibco (USA)

PBS: 상품 번호: SH30256.01B, Hyclone (중국)

흡수 피펫: 상품 번호: 4487, Costar

원심분리 튜브: 상품 번호: 430791, Corning

96x E-플레이트: ACEA

A549 (폐 세포주의 비소세포 암종), PC3 (인간 전립선 암 세포주), HT1080 (인간 형성 섬유 육종 세포주), Hela (인간 자궁 경부 암종 세포주), MDA MB-231 (인간 유방암 세포주), 및 HepG2 (인간 간암 세포주): ATCC

한약 추출액: Lin Qiuying에 의해 제공됨.

(IV) 약물 구성 방법

클라이언트(client)에 의해 제공된 정보에 따르면, 125 ml의 한약 추출액의 주스를 20 g의 약물로부터, 즉 160 ㎎/㎖의 농도로 수득하였다. 실험 동안에, 이를 실제 요구에 따라 배양 배지로 희석시키고, 이후에 세포에 첨가하였다.

(V) 시험 디자인 및 방식

시험 방법:

96x E-플레이트 상에, 배치(layout)에 따라 세포를 접종하였다: A549 (5000 세포/웰), Hela (2500 세포/웰), HT1080 (2500 세포/웰), MDA-MB-231 (4000 세포/웰), HT29 (10000 세포/웰), HepG2 (10000 세포/웰), 및 PC3 (10000 세포/웰). 하룻밤 동안 세포를 증식시킨 후에, 배치에 따라 약물을 첨가하고, 72시간 동안 계속 측정하였다.

실험 배치는 하기와 같다:

플레이트 1

플레이트 2

획득 신호 셋업은 하기와 같다:

(VI) 실험 결과

1. RTCA 플롯

(1) (도 1) 한약 추출액에 의한 A549 세포주외 증식의 억제 및 억제 효과의 동적 측정

도 1은 한약 추출액에 의한 A549 세포주외 증식의 억제 및 억제 효과의 관찰의 동적 측정을 도시한 것이다. A는 세포 성장 및 약물 효과의 실시간 동적 다이아그램이다. 이러한 다이아그램에서, 가로좌표는 세포 증식 및 약물 효과의 시간을 지시하는 것이며, 세로좌표는 일반화된 세포 지수(NCI)를 지시하는 것이다. 세포 지수는 세포 성장 상태를 나타내는 것으로서, 이러한 수치가 높을수록, 살아있는 세포의 수가 많다는 것이다. 투약 시간 및 투약 농도에 대한 화살표 포인트가 이러한 다이아그램에 도시되어 있다. 이러한 다이아그램은 한약 추출액의 작용 하에서의 세포의 약물 농도 의존성 동적 반응 곡선을 나타낸다. 대조군 1은 정상 세포 성장 동적 곡선을 나타내는 음성 비교이다. B는 A549 세포에 한약 추출액을 첨가한 후에 12h, 24h, 및 48h의 약물 작용 시간 포인트에서의 IC50 수치, 및 실시간 세포 분석 시스템에 의해 자동적으로 측정되고 계산된 IC50 피팅 곡선을 나타낸 것이다. 이러한 도면으로부터 한약 추출액이 A549 세포의 증식을 분명하게 억제하고 이러한 억제가 약물 농도 의존성의 특징을 갖는다는 것을 알 수 있다.

(2) (도 2) 한약 추출액에 의한 HT29 세포주외 증식의 억제 및 억제 효과의 동적 측정

도 2는 한약 추출액에 의한 HT29 세포주외 증식의 억제 및 억제 효과의 동적 측정을 도시한 것이다. A는 세포 성장 및 약물 효과의 실시간 동적 다이아그램이다. B는 HT29 세포에 한약 추출액을 첨가한 후에 48h 및 72h의 약물 작용 시간 포인트에서의 IC50 수치, 및 실시간 세포 분석 시스템에 의해 자동적으로 측정되고 계산된 IC50 피팅 곡선을 나타낸 것이다. 이러한 도면으로부터 한약 추출액이 HT29 세포의 증식을 분명하게 억제하고 이러한 억제가 약물 농도 의존성의 특징을 갖는다는 것을 알 수 있다.

(3) (도 3) 한약 추출액에 의한 PC3 세포주외 증식의 억제 및 억제 효과의 동적 측정

도 3은 한약 추출액에 의한 PC3 세포주외 증식의 억제 및 억제 효과의 동적 측정을 도시한 것이다. A는 세포 성장 및 약물 효과의 실시간 동적 다이아그램이다. B는 PC3 세포에 한약 추출액을 첨가한 후에 24h, 48h 및 72h의 약물 작용 시간 포인트에서의 IC50 수치, 및 실시간 세포 분석 시스템에 의해 자동적으로 측정되고 계산된 IC50 피팅 곡선을 나타낸 것이다. 이러한 도면으로부터 한약 추출액이 PC3 세포의 증식을 분명하게 억제하고 이러한 억제가 약물 농도 의존성의 특징을 갖는다는 것을 알 수 있다.

(4) (도 4) 한약 추출액에 의한 HT1080 세포주외 증식의 억제 및 억제 효과의 동적 측정

도 4는 한약 추출액에 의한 HT1080 세포주외 증식의 억제 및 억제 효과의 동적 측정을 도시한 것이다. A는 세포 성장 및 약물 효과의 실시간 동적 다이아그램이다. B는 HT1080 세포에 한약 추출액을 첨가한 후에 12h, 24h 및 48h의 약물 작용 시간 포인트에서의 IC50 수치, 및 실시간 세포 분석 시스템에 의해 자동적으로 측정되고 계산된 IC50 피팅 곡선을 나타낸 것이다. 이러한 도면으로부터 한약 추출액이 HT1080 세포의 증식을 분명하게 억제하고 이러한 억제가 약물 농도 의존성의 특징을 갖는다는 것을 알 수 있다.

(5) (도 5) 한약 추출액에 의한 Hela 세포주외 증식의 억제 및 억제 효과의 동적 측정

도 5는 한약 추출액에 의한 Hela 세포주외 증식의 억제 및 억제 효과의 동적 측정을 도시한 것이다. A는 세포 성장 및 약물 효과의 실시간 동적 다이아그램이다. B는 Hela 세포에 한약 추출액을 첨가한 후에 12h, 24h 및 48h의 약물 작용 시간 포인트에서의 IC50 수치, 및 실시간 세포 분석 시스템에 의해 자동적으로 측정되고 계산된 IC50 피팅 곡선을 나타낸 것이다. 이러한 도면으로부터 한약 추출액이 Hela 세포의 증식을 분명하게 억제하고 이러한 억제가 약물 농도 의존성의 특징을 갖는다는 것을 알 수 있다.

(6) (도 6) 한약 추출액에 의한 MDA-MB-231 세포주외 증식의 억제 및 억제 효과의 동적 측정

도 6은 한약 추출액에 의한 MDA-MB-231 세포주외 증식의 억제 및 억제 효과의 동적 측정을 도시한 것이다. A는 세포 성장 및 약물 효과의 실시간 동적 다이아그램이다. B는 MDA-MB-231 세포에 한약 추출액을 첨가한 후에 24h, 48h 및 72h의 약물 작용 시간 포인트에서의 IC50 수치, 및 실시간 세포 분석 시스템에 의해 자동적으로 측정되고 계산된 IC50 피팅 곡선을 나타낸 것이다. 이러한 도면으로부터 한약 추출액이 MDA-MB-231 세포의 증식을 분명하게 억제하고 이러한 억제가 약물 농도 의존성의 특징을 갖는다는 것을 알 수 있다.

(7) (도 7) 한약 추출액에 의한 HepG2 세포주외 증식의 억제 및 억제 효과의 동적 측정

도 7은 한약 추출액에 의한 HepG2 세포주외 증식의 억제 및 억제 효과의 동적 측정을 도시한 것이다. A는 세포 성장 및 약물 효과의 실시간 동적 다이아그램이다. B는 HepG2 세포에 한약 추출액을 첨가한 후에 48h 및 72h의 약물 작용 시간 포인트에서의 IC50 수치, 및 실시간 세포 분석 시스템에 의해 자동적으로 측정되고 계산된 IC50 피팅 곡선을 나타낸 것이다. 이러한 도면으로부터 한약 추출액이 HepG2 세포의 증식을 분명하게 억제하고 이러한 억제가 약물 농도 의존성의 특징을 갖는다는 것을 알 수 있다.

2. 세포주에 대한 한약 추출액의 세포 독성 효과

(VII) 실험의 결론, 가능한 문제, 및 제안

1. 이러한 실험은 7개의 상이한 장기의 세포주에 대한 한약 추출액의 세포 독성 효과를 시험하였다: 폐 세포주의 인간 비-소세포 암종 (A549), 대장 세포주의 인간 암종 (HT29), 인간 전립선 암종 세포주 (PC3), 인간 형성 섬유 육종 세포주 (HT1080), 인간 자궁 경부 암종 세포주 (Hela), 인간 유방암 세포주 (MDA-MB-231), 및 인간 간암 세포주 (HepG2).

2. 상이한 세포주에 대한 약물의 상이한 작용으로 인하여, 4회의 포인트(투약 후 12hr, 24hr, 48hr, 및 72hr)를 선택하였으며, 대응하는 시간 포인트의 IC50 수치를 각 세포의 특정 조건에 따라 획득하였다.

3. 한약 추출액은 모두 7개의 선택된 세포주의 증식에 대한 억제 효과를 가지며, 매우 양호한 농도 구배를 나타낸다. HT1080, Hela, MDA-MB-231, 및 A549 세포에 대한 효과는 비교적 강력하며, HepG2, HT29, 및 PC3 세포에 대한 효과는 비교적 약하다.

4. 약물 개발의 관점으로부터, 비-종양 세포주에 대한 이러한 약물의 세포 독성 효과를 측정하기 위한 실험을 고려하면서, 폐암, 자궁 경부 암종, 및 유방암 등에 대한 이러한 약물의 효과 연구를 계속할 수 있다.

5. 화합물 메카니즘의 연구: 화합물 특이성 반응 지도에 따르면, 한약은 이러한 세포주에 대한 분명한 세포 독성 효과를 가지며, HT29 및 PC3 세포에 대한 지도는 DNA 손상 세포 독성 효과 특징을 나타낸다(도 8 참조).

도 8 화합물 특이성 지도

xCELLigence 시스템으로부터의 실시간 임피던스 데이타는 화합물 특이성 지도를 제공한다. 이러한 지도는 화합물 생물학적 작용 메카니즘에 의존적이다. 이러한 예에서, 상이한 생물학적 작용 메카니즘 및 타겟 포인트 특이성의 화합물 첨가는 특별한 화합물 지도를 산출할 수 있다. 특이성이 없는 화합물에 대하여, 이러한 지도는 예측 모드를 이용하여 입증될 수 있는 일부 추정을 셋팅하기 위하여 사용될 수 있다.

실험 기록

ACEA Biosciences (항저우) Co., Ltd. 클라이언트 데이타베이스에 저장됨.

번호: 1112051511P3, 1112081603P3, 1112141440P5, 1112201057P5

2. 세포 이동에 대한 한약 추출액 효과의 시험

(I) 프로젝트 개요

본 실험은 Guizhou Chinese Medicine Co., Ltd.에 의해 제공된 특정 한약 추출액에 의해 세포 이동의 억제를 시험하기 위하여 xCELLigence 실시간 세포 분석 시스템을 채택한다. 사용된 세포는 A549, PC3, HT1080, Hela, MDA-MB-231, 및 HepG2를 포함한다.

(II) 실험 기기

본 실험은 ACEA 및 Roche에 의해 함께 개발된 xCELLigence DP 실시간 세포 분석 시스템을 채택한다.

(III) 실험 시약 및 소모품

DMEM 배양 배지: 상품 번호: SH30022.01B, Hyclone (중국)

개선된 RPMI-1640 배양 배지: 상품 번호: SH30809.01B, Hyclone (중국)

MEM 배양 배지: 상품 번호: SH30024.01B, Hyclone (중국)

F12 배양 배지: 상품 번호: SH30526.01, Hyclone (중국)

췌장 효소:상품 번호: 27250-018, Gibco (USA)

DMSO: 상품 번호: D2650, Sigma (USA)

PBS: 상품 번호: SH30256.01B, Hyclone (중국)

흡수 피펫: 상품 번호: 4487, Costar

원심분리 튜브: 상품 번호: 430791, Corning

96x E-플레이트: ACEA

CIM 플레이트: ACEA

한약 추출액: Lin Qiuying에 의해 제공됨.

(IV) 약물 구성 방법

클라이언트(client)에 의해 제공된 정보에 따르면, 125 ml의 한약 추출액의 의학 주스를 20 g의 약물로부터, 즉 160 ㎎/㎖의 농도로 수득하였다. 실험 동안에, 이를 실제 요구되는 농도에 따라 배양 배지로 희석시켰다.

(V) 시험 디자인 및 방식

시험 방법:

배치에 따라, CIM 플레이트 하단 챔버에 10%의 혈청을 함유한 배양 배지를 사용하여 제조된 약물을 첨가하고, 하단 챔버에 혈청-부재 배지를 사용하여 제조된 약물을 첨가하였다. DP 시스템 상에서, 베이스 라인을 측정하였다. 이후에, 상단 챔버에 대상 세포를 첨가하여 혈청-부재 배지를 사용하여 재현탁하고, 1시간 동안 각 화합물과 함께 공동 인큐베이션하였다. DP 상에서, 24시간 내지 48시간 동안 측정하였다.

동시에, 96x E-플레이트 상에 세포 증식의 병용 비교를 제공하였다. 배치에 따라, 10% 혈청을 함유한 배양 배지를 사용하여 제조된 약물을 첨가하고, SP 상에서 베이스 라인을 측정하였다. 이후에, 대상 세포를 첨가하여 10% 혈청을 함유한 배지를 사용하여 재현탁하고, 1시간 동안 각 화합물과 함께 공동 인큐베이션하였다. SP 상에서, 24시간 내지 48시간 동안 측정하였다.

사용된 세포 농도: A549 (60k/웰), PC3 (40k/웰), HT1080 (30k/웰), Hela (30k/웰), MDA-MB-231 (80k/웰), HepG2 (80k/웰)

실험 배치는 하기에 제공된 바와 같다:

획득 신호 셋업은 하기와 같다:

실험 결과

1. RTCA 플롯

(1) (도 9) 한약 추출액에 의한 A549 세포외 이동 능력의 측정된 억제

도 9는 한약 추출액에 의한 A549 세포외 이동 능력의 측정된 억제를 나타낸 것이다.

이러한 도면의 왼쪽 부분은 약물에 의해 억제된 세포 이동의 곡선을 도시한 것이다. 이러한 도면의 오른쪽 부분은 세포 증식에 대한 약물 효과의 병행 시험의 실시간 동적 다이아그램이다. 가로좌표는 세포 배양 및 약물 작용의 시간을 지시하는 것이다. 세로좌표는 일반화된 세포 지수(NCI)를 지시한 것이다. NCI는 세포 성장 상태를 나타낸다. 세포 이동 시험에서, NCI가 높을수록, 하단 챔버로 이동되는 세포가 더욱 많다는 것이다. 세포 증식 시험에서, NCI가 높을수록, 살아있는 세포가 더욱 많다는 것이다. 투약 농도는 이러한 도면에 나타내었다.

이러한 도면의 왼쪽 부분은 한약 추출액에 의한 작용 하에서 약물 농도 의존성에 대한 세포 이동 능력의 반응 곡선을 나타낸 것이다. 대조군은 정상 세포 이동 동적 곡선을 나타낸 음성 비교이다.

이러한 도면의 오른쪽 부분은 한약 추출액에 의한 작용 하에서 약물 농도 의존성에 대한 세포 증식의 억제를 나타낸 것이다. 대조군은 정상 세포 증식 동적 곡선을 나타낸 음성 비교이다.

첨가된 약물의 농도가 55.56 ㎍/㎖를 초과할 때, 세포에 대한 분명한 독성 작용이 존재한다. 이러한 독성 작용 하에서, 상단 챔버에서의 세포가 사멸하거나 감소된 활성을 갖기 때문에, 하단 챔버로 이동하는 세포의 수는 감소한다. 약물 농도가 55.56 ㎍/㎖ 보다 낮을 때에, 기본적으로 세포에 대한 독성 작용이 존재하지 않지만, 세포 이동은 어느 정도 억제되며, 이는 약물 농도 의존성을 나타낸다. 이에 따라, 이러한 약물은 A549 세포의 이동에 대한 특정 억제 효과를 갖는다.

(2) (도 10) 한약 추출액에 의한 PC3 세포외 이동 능력의 측정된 억제

도 10은 한약 추출액에 의한 PC3 세포외 이동 능력의 측정된 억제를 나타낸 것이다.

이러한 도면의 왼쪽 부분은 약물에 의해 억제된 세포 이동의 곡선을 도시한 것이다. 이러한 도면의 오른쪽 부분은 세포 증식에 대한 약물 효과의 병행 시험의 실시간 동적 다이아그램이다. 투약 농도는 이러한 도면에 나타내었다.

이러한 시험은 상이한 농도의 한약 추출액의 첨가가 세포에 대한 분명한 독성 작용을 가짐을 나타낸다. 이러한 독성 작용 하에서, 상단 챔버에서의 세포가 사멸하거나 감소된 활성을 갖기 때문에, 하단 챔버로 이동하는 세포의 수는 감소한다. 그러나, 한약 추출액의 농도가 7.11 mg/㎖ 보다 낮을 때에, 약물에 의한 작용 하에서, 세포 이동은 대조군에 비해 더욱 높은데, 이는 이동에 대한 자극을 나타내는 것이다.

(3) (도 11) 한약 추출액에 의한 HT1080 세포외 이동 능력의 측정된 억제

도 11은 한약 추출액에 의한 HT1080 세포외 이동 능력의 측정된 억제를 나타낸 것이다.

첨가된 약물의 농도가 18.52 ㎍/㎖를 초과할 때, 세포에 대한 분명한 독성 작용이 존재한다. 이러한 독성 작용 하에서, 상단 챔버에서의 세포가 사멸하거나 감소된 활성을 갖기 때문에, 하단 챔버로 이동하는 세포의 수는 감소한다. 약물 농도가 18.52 ㎍/㎖ 보다 낮을 때에, 기본적으로 세포에 대한 독성 작용이 존재하지 않지만, 세포 이동은 어느 정도 억제되며, 이는 약물 농도 의존성을 나타낸다. 이에 따라, 이러한 약물은 A549 세포의 이동에 대한 특정 억제 효과를 갖는다.

(4) (도 12) 한약 추출액에 의한 Hela 세포외 이동 능력의 측정된 억제

도 12는 한약 추출액에 의한 Hela 세포외 이동 능력의 측정된 억제를 나타낸 것이다.

첨가된 약물은 세포에 대한 분명한 독성 작용을 갖는다. 이러한 독성 작용 하에서, 상단 챔버에서의 세포가 사멸하거나 감소된 활성을 갖기 때문에, 하단 챔버로 이동하난 세포의 수는 감소한다. 이러한 약물은 세포 이동의 분명한 억제를 나타내지 못한다.

(5) (도 13) 한약 추출액에 의한 MDA-MB-231 세포외 이동 능력의 측정된 억제

도 13은 한약 추출액에 의한 MDA-MB-231 세포외 이동 능력의 측정된 억제를 나타낸 것이다.

시험의 초기 단계(20 시간 전)에, 첨가된 약물은 MDA-MB-231 세포의 이동에 대한 특정 자극을 갖는다. 약물 농도가 0.15 ㎎/㎖ 보다 낮을 때에, 세포에 대한 분명한 독성 작용이 존재하지 않는다. 이 때에, 보다 많은 약물이 첨가될수록, 세포 이동에 대한 자극이 더욱 강력하다. 첨가된 약물의 농도가 0.4 ㎎/㎖를 초과할 때, 세포에 대한 비교적 분명한 독성 작용이 존재한다. 이러한 독성 작용 하에서, 상단 챔버에서의 세포가 사멸하거나 감소된 활성을 갖기 때문에, 하단 챔버로 이동하는 세포의 수는 감소한다.

(6) (도 14) 한약 추출액에 의한 HepG2 세포외 이동 능력의 측정된 억제

도 14는 한약 추출액에 의한 HepG2 세포외 이동 능력의 측정된 억제를 나타낸 것이다.

이러한 도면의 오른쪽 부분은 한약 추출액에 의한 작용 하에서 약물 농도 의존성에 대한 세포 증식의 반응 곡선을 나타낸 것이다. 대조군은 정상 세포 증식 동적 곡선을 나타낸 음성 비교이다.

첨가된 약물은 세포에 대한 분명한 독성 작용을 갖는다. 이러한 독성 작용 하에서, 상단 챔버에서의 세포가 사멸하거나 감소된 활성을 갖기 때문에, 하단 챔버로 이동하는 세포의 수는 감소한다. 이러한 약물은 세포 이동의 분명한 억제를 갖지 않는다.

(7) (도 15) 측정된 HT29 세포외 이동 능력

도 15는 HT29 세포주의 시험관내 이동 능력의 측정을 나타낸 것이다. 이러한 도면에 나타낸 바와 같이, 세포 농도가 각각 80k/웰, 40k/웰, 20k/웰, and 10k/웰일 때에, HT29는 분명한 세포 이동 능력을 갖지 않는다. 이에 따라, 약물에 의한 세포 이동 능력의 억제가 측정되지 않을 수 있다.

(VII) 실험의 결론, 가능한 문제, 및 제안

1. 이러한 실험은 7개의 상이한 장기의 세포주에 대한 한약 추출액의 세포 독성 효과를 시험하였다: 폐 세포주의 인간 비-소세포 암종 (A549), 대장 세포주의 인간 암종 (HT29), 인간 전립선 암종 세포주 (PC3), 인간 형성 섬유 육종 세포주 (HT1080), 인간 자궁 경부 암종 세포주 (Hela), 인간 유방암 세포주 (MDA-MB-231), 및 인간 간암 세포주 (HepG2). 동시에, 약물에 의한 세포 이동 능력의 억제가 이의 세포 독성으로 인한 것이 아님을 측정하기 위하여, 세포 증식에 대한 약물 효과의 병행 시험을 수행하였다.

2. 고농도의 이러한 한약 추출액은 A549 및 HT1080 세포에 대한 분명한 독성 작용을 갖는다. 이러한 독성 작용 하에서, 상단 챔버에서의 세포가 사멸하거나 감소된 활성을 갖기 때문에, 하단 챔버로 이동하는 세포의 수는 감소한다. 저 농도에서, 이러한 약물은 세포 이동에 대한 특정 억제 효과를 갖는다.

3. 이러한 한약 추출액은 Hela 및 HepG2 세포에 대한 분명한 독성 작용을 갖는다. 이러한 독성 작용 하에서, 상단 챔버에서의 세포가 사멸하거나 감소된 활성을 갖기 때문에, 하단 챔버로 이동하는 세포의 수는 감소한다. 저 농도에서, 이러한 약물은 세포 이동에 대한 특정 억제 효과를 갖지 않는다. 이러한 약물은 이러한 세포에 대한 이동 억제를 갖지 않는다.

4. 이러한 고농도의 한약 추출액은 PC3 및 MDA-MB-231 세포에 대한 분명한 독성 작용을 갖는다. 이러한 독성 작용 하에서, 상단 챔버에서의 세포가 사멸하거나 감소된 활성을 갖기 때문에, 하단 챔버로 이동하는 세포의 수는 감소한다. 저 농도에서, 이러한 약물은 세포 이동에 대한 특정 자극 효과를 갖는다.

실험 기록

ACEA Biosciences (항저우) Co., Ltd. 클라이언트 데이타베이스에 저장됨

번호: 1112211551D12, 1112211605P4, 1112271558D12, 1112271559P4, 1112311454P6, 1112311452D12, 1201101537D12, 1201101540P2, 1202021535D12, 1202021539P1

4. 심근 세포에 대한 한약 추출액의 효과 시험

1. 프로젝트 개요

이러한 실험은 제1 발생 신생 레트의 심근 세포에 대한 Guizhou Chinese Medicine Co., Ltd.에 의해 제공된 한약 추출액의 심장 안전성의 시험 및 평가를 위한 실시간 심근 세포 분석 시스템을 채택한다. 이러한 실험을 위해 채택된 평가 파라미터는 시험관내 심근 세포 박동수, 박동 진폭, 및 시간에 따른 박동 리듬 및 파형이다.

2. 배경

2.1 연구의 배경

ACEA Bioscience Co., Ltd.는 본 회사가 자체 특허를 보유하고 있는 임피던스 기술을 기반으로 한 실시간 세포 검출 기기의 제작 및 R&D에 전념하는 하이 테크놀로지 생물 회사이다. 혁신적인 디자인을 갖는 마이크로-기공 플레이트의 바닥에 설치된 ACEA 마이크로-전극 센서는 세포 상태의 실시간 비-표지 측정을 위해 사용될 수 있는 것으로서, 고처리량, 높은 정확성, 높은 민감성, 및 정량적 검출을 특징으로 한다.

심장 질환 또는 약물 심장 독성에 기인한 심장 기능 손상은 인간 건강 및 안전을 위협한다. 이는 주요 심장 질환의 발생 메카니즘을 깊이 밝혀내고 이를 기반으로 하여 효과적인 신규한 치료 수단을 발견하고, 신규한 약물 개발 동안에 몇몇 약물의 심장 독성을 밝혀내는 것이 심장 연구자에게는 큰 과제이다. ACEA 및 Roche에 의해 공동으로 개발된 실시간 심근 세포 분석 시스템(xCELLigence RTCA Cardio System)은 심근 세포의 흥분 수축 결합 작용을 동적으로 모니터링하고, 짧은 시간/긴 시간 동안 심근 세포 박동 전기 신호를 실시간으로 측정하고 기록할 수 있다. 화합물이 심근 세포에서 작용하여 세포 형태 및 활성에 영향을 미치거나 관련 채널의 개방 정도의 변화 또는 수축 흥분 전도도의 변화를 야기시킬 때에, 이러한 실시간 심근 세포 분석 시스템은 실시간 모니터링을 위해 사용될 수 있다.

이러한 시스템은 이온 채널 및 비-이온 채널 타겟 포인트 약물을 포함하는, 심근 세포 수축 흥분 전도도의 변화에 영향을 미치는 약물을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. ACEA는 50개가 넘는 유형의 공지된 화합물을 입증하기 위해 마우스 배아 줄기 세포(CorAt, Axiogenesis)에 의해 유도된 심근 세포 및 인간 iPS 세포에 의해 유도된 심근 세포를 사용하였다. 바로 이후에, 제1 발생 래트 심근 세포는 보충적인 확인을 위해 사용되었다. 연구 결과에서는 이러한 실시간 심근 세포 분석 시스템이 심근 세포에 대한 심부정맥(cardiac arrhythmia) 화합물 및 비-ERG 채널 및 전압 게이팅 칼슘 채널 화합물의 효과를 신뢰성 있고 정량적으로 시험할 수 있다. 이에 따라, 이러한 시스템은 관련 약물 고처리량 스크리닝 및 약물 독성의 연구를 위해, 약물 개발의 초기 단계에서 화합물의 심장 독성을 스크리닝하기 위한 도구로서 사용될 수 있다.

연구 내용(Work content):

이러한 프로젝트의 목적은 약물 심장 안전성의 측정 및 평가를 위해 그리고 제1 발생 래트 심근 세포 박동수의 변화에 대한 화합물의 능력의 평가 및 판단을 위해 임피던스 측정 시스템을 사용하기 위한 것이다.

이러한 프로젝트에서, 각 화합물은 7개의 상이한 농도로 시험되었다. 이러한 시험 이전 및 이후에, 세포 박동 상태를 모니터링하기 위하여 상이한 시점이 선택된다. 제1 발생 심근 세포의 박동에 대한 한약 추출액의 효과는 제1 발생 래트 심근 세포에 대한 이러한 액체의 용량 의존성의 관찰을 통해 평가된다.

2.2 시스템에 대한 소개

이러한 실시간 심근 세포 분석 시스템(xCELLigence RTCA Cardio System)은 자체 지적재산권을 갖는 ACEA의 세포를 기반으로 한 현존하는 마이크로-전자기기 임피던스 측정 시스템(RTCA SP, MP, 및 DP 시스템을 포함)의 기능을 이어받고, 심근 세포의 박동 및 약물의 심장 세포 독성을 기능적으로 측정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 시스템의 코어(core)에는 어레이에서 96-웰 배양 플레이트(Cardio-플레이트 96)의 바닥에 마이크로-전자기기 세포 센서가 통합된다. 이는 데이타 획득 속도를 크게 개선한다. RTCA SP, MP, 및 DPRTCA 시스템과 유사한 세포 성장 및 증식의 장시간 측정의 기능 이외에, 이러한 심근 세포 분석 시스템은 또한 흥분 수축 결합에 의해 형성된 심근 세포의 박동의 측정을 특징으로 한다.

RTCA 심근 세포 분석 시스템은 하기를 포함한다(하기 도면을 참조한다):

● A: 실시간 세포 분석 시스템 제어 유닛 (RTCA Cardio 제어 유닛)

● B: 실시간 세포 분석기 (RTCA Cardio 분석기)

● C: 세포 측정 스테이션 (RTCA Cardio 스테이션)

● D: 측정 플레이트 (Cardio-플레이트 96)

(도 16을 참조한다)

전자 센서의 표면에 이러한 세포가 부착되는 96-웰 심근 세포 측정 플레이트에 세포를 접촉하였다. 분석기 및 제어 유닛에 연결된, CO₂ 세포 배양 박스(5% CO₂, 37℃)에 RTCA Cardio 스테이션을 배치시키고 RTCA Cardio 스테이션 상에 Cardio-플레이트 96을 배치시켰다. 측정 스테이션 및 분석기를 통해, 센서 표면 상에 임피던스 신호를 실시간으로 측정할 수 있으며, 세포 골격의 정량, 활성, 형태, 및 동력학적 변화를 포함하는, 세포의 실시간 정량적 생물학적 상태를 제공하기 위하여, 측정된 임피던스 신호를 RTCA 실시간 세포 분석 시스템 제어 유닛 및 Cardio 소프트웨어로 분석하였다.

제1 발생 래트 심근 세포

제1 발생 래트 심근 세포 모델은 심근 세포 형태의 연구, 생물학적 연구, 전기 생리학적 연구, 및 약리학적 연구를 위해 사용될 수 있다. 이러한 모델은 약물 전달, 독성, 및 전기 생리학적 특징의 연구를 위해 사용된 발달 모드(mature mode)이다. 10개의 신생(24 시간 내의) 래트를 취하고, 75% 에탄올을 사용하여 멸균하고, 이후에 가위로 흉골의 중앙을 절단하였다. 소화관의 절단을 피하고, 오염을 방지하기 위하여 주의한다. 무균성 절단을 수행하여 심실 부분을 취하고, 심장 심방 및 큰 혈관 조직을 조심스럽게 떼어내고, 예비-냉각된 혈청-부재 DMEM에 빠르게 넣고, 이를 3회 세척하여 잔류하는 혈액 세포를 제거하고, 이를 0.5mmx0.5mmx0.5mm 크기의 조직 블록으로 절단하고, 이를 작은 유리병에 배치시키고, 소화를 위해 1.5 ml의 0.07% 파렌자임(parenzyme) 및 0.07% 콜라게나제 I을 첨가하였다. 소화 후에 상청액을 모으고, 적합한 양(상청액 부피와 동일함)의 10%의 우태아 혈청을 함유한 DMEM 배양 배지를 첨가하여 소화 효소의 작용을 종결시켰다. 조직 블록이 사라질 때까지 상기 소화 단계를 반복하였다. 200 메시 시브를 사용하여 여과에 의해 소화되지 않은 조직을 제거하였다. 상청액을 5분(800r/min에서) 동안 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 10% 우태아 혈청을 함유한 DMEM 배양 배지를 사용하여 침전된 세포를 분출하였다. 세포를 배양 플라스크에 접종하고, 이러한 플라스크를 배양을 정지시키기 위해 CO₂ 세포 인큐베이터 (5% CO₂, 37℃)에 60분(차동 속도로 벽에 붙음) 동안 배치시켰다. 벽에 붙지 않은 세포를 모으고 이를 웰 당 15000 세포의 밀도로 젤라틴에 의해 처리된 96-웰 심근 세포 측정 플레이트에 접종하였다. 측정을 위한 Cardio 시스템 상에 플레이트를 배치시켰다.

3. 실험 디자인 및 방식

4.

3.1 실험 기기:

이러한 실험은 ACEA 및 Roche에 의해 공동으로 개발될 실시간 심근 세포 분석 시스템을 채택한다.

3.2 실험 시약 및 소모품:

DMEM 배양 용액: 상품 번호: SH30022.08B, Hyclone (중국)

혈청: 상품 번호: 16000-044, Gibco (USA)

췌장 효소: 상품 번호: 27250-018, Gibco (USA)

콜라게나제: 상품 번호: 17101-015, Gibco (USA)

DMSO: 상품 번호: D2650, Sigma (USA)

HBSS 용액: 14175, Gibco (USA)

젤라틴: 상품 번호: 48732, Sigma (USA)

PBS: 상품 번호: SH30256.01B, Hyclone (중국)

3.3 약물 제조 방법

클라이언트에 의해 제공된 정보에 따르면, 125 ml의 한약 추출액의 의료용 주스를 20 g의 약물로부터, 즉 160 ㎎/㎖의 농도로 수득하였다. 실험 동안에, 이를 실제 요청에 따른 배양 배지로 희석시키고, 이후에 세포에 첨가하였다.

3.4 실험 디자인 및 방식

제1 발생 신생 래트 심근 세포의 배양: 웰 당 17000 세포를 접종하였다. 접종 후에, 이를 하기에 제공된 단계 및 파라미터를 이용하여 측정하기 위해 실시간 심근 세포 분석 시스템에 배치시켰다(획득된 신호의 셋업 표를 참조). 48시간 후에, 액체를 교체하였다. 액체를 교체하고 2시간 후에, 세포 신호가 적합할 때에 세포를 상응하는 화합물 농도에 따라 세포벽에 첨가하였다. 투약 후에, 세포를 심근 세포 박동 신호의 실시간 획득을 위한 측정 시스템으로 보내었다. 각 화합물은 둘 이상의 복합 웰을 채택할 것이다.

획득 신호 셋업은 하기와 같다:

3.5 데이타 분석

3.5.1 각 시점에서 세포 박동수 계산 및 박동수 대 시간의 플롯 곡선

3.5.2 분석을 위한 파라미터는 하기를 포함한다:

● 시간 의존적 박동수

● 일반화된 박동수

● 시간 의존적 진폭

● 일반화된 진폭

● 투약 전 및 후 전체 세포 활성(세포 지수)

● 시간 의존적 박동 리듬 불균일성

● 시간 의존적 박동 유사성

분석 파라미터의 정의

세포의 각 박동은 하나의 심근 세포 흥분 수축 결합에 상응한다. 이러한 박동은 차례로 발생하는 양의 피크(+P) 및 음의 피크(-P)를 포함한다. 단위 시간으로 발생하는 양의 피크의 수 및 음의 피크의 수는 심근 세포 박동 특징 및 세포 상태를 반영한다(도 17 참조).

심근 세포 박동 모드 및 주요 관련 파라미터의 설명:

진폭:

음의 피크와 양의 피크 간의 세포 지수의 차이(Amp-1, Amp-2, Amp-3, …, Amp-m은 도면에 도시됨)

박동 기간 :

도면에 도시된 바와 같이, 하나의 스위프 기간(sweep duration)에, m개의 양의 피크(+P1, +P2, +P3,…,+Pm) 및 n개의 음의 피크(-P1, -P2，-P3，…，-Pn)가 존재한다. 하나의 양의 피크와 하나의 음의 피크 간의 시간은 박동 기간으로서 규정된다.

각 박동에 대하여, 파라미터 상승 시간, 하강 시간, IBD50 , 상승 기울기, 및 하강 기울기 등을 사용하여 박동 상승 공정 및 하강 공정을 기술한다(도 18).

3.5.3 심근 세포 모델에서 파라미터 및 데이타의 분석 방법

RTCA 심근 세포 분석 소프트웨어는 심근 세포 박동 특징의 분석으로 위해 사용되는 12개의 파라미터를 제공한다. 이러한 보고서에서, 적합한 파라미터가 분석을 위해 선택된다(도 19).

4. 실험 결과

한약 추출액은 단지 16 ㎎/㎖의 농도에서 세포 활성에 영향을 미쳤으며, 다른 농도에서는 영향을 미치지 않았다. 심근 세포의 박동에 대한 이러한 추출액의 효과는 하기와 같다: 짧은 기간에 래트 제1 발생 심실근 세포의 박동수, 진폭 및 리듬에 대한 분명한 효과가 존재하지 않지만, 특정 심장 독성 작용은 비교적 긴 작용 기간 후에 심실근 세포에 존재한다. 특히, 고농도(16㎎/㎖) 하에서 2 시간의 작용 후에, 심근 세포 박동수는 낮아질 수 있으며, 박동은 6 시간의 작용 후에 완전히 정지할 수 있다.

저농도(5.33 및 1.78 ㎎/㎖) 약물을 첨가하고, 2 내지 12 시간 후에, 심근 세포 박동수는 약간 낮아졌으며, 진폭은 증가하였다. 12시간에, 박동은 정상으로 회복되었다.

0.59㎎/㎖ 미만의 농도에서, 약물은 심근 세포의 박동에 대해 분명한 효과를 갖지 않았다.

4.1 신생 래트 제1 발생 심근 세포의 활성에 대한 한약 추출액의 효과(도 20)

한약 추출액: (H20 ctrl, blank ct, 7.32 ㎍/㎖, 21.95 ㎍/㎖, 65.84 ㎍/㎖, 0.20㎎/㎖, 0.59㎎/㎖, 1.78㎎/㎖, 5.33㎎/㎖, 16.00㎎/㎖)

한약 추출액에 의한 제1 발생 심근 세포의 활성 억제의 동적 측정: 도면은 세포 성장 및 약물 효과의 실시간 동적 다이아그램이다. 이러한 도면에서, 가로좌표는 세포 배양 및 약물 작용의 시간을 지시하는 것이며, 세로좌표는 NCI를 지시하는 것이다. NCI는 세포 성장 상태를 나타내는데, 이러한 수치가 높을수록, 살아있는 세포가 더욱 많다는 것이다. 화살표는 투약 시간을 지시한다. 투약 농도가 이러한 도면에 도시되어 있다. 이러한 도면은 약물 작용 하에서 세포의 약물 농도 의존적 동적 반응 곡선을 나타낸다. ctrl은 음의 비교로서, 정상 세포 성장 동적 곡선을 나타낸 것이다(주석: 또한 H20 ctrl 비교에서, 10% H₂0 (가장 높은 농도의 약물의 본래 액체의 양과 동일함)를 첨가한다).

신생 래트 제1 발생 심근 세포에 대한 한약 추출액의 효과 시험 결과로부터 고농도 (16㎎/㎖) 약물이 사용될 때에, 소정의 시간 후에, 세포 지수가 급격하게 떨어지는 것을 알 수 있는데, 이는 고농도의 약물의 분명한 세포 독성을 반영하는 것으로서, 이는 세포 형태학적 변화, 벽에 대한 불량한 부착성, 및 심지어 사멸을 야기시킬 수 있다. 약물 농도가 5.32㎎/㎖ 미만일 때, 세포 활성에 대한 약물의 분명한 효과가 존재하지 않는다. 그러나, 이러한 농도의 약물은 심근 세포의 박동수 및 진폭의 특정 변화를 야기시킬 수 있다.

4.2 투약 후 시간에 따른 제1 발생 심근 세포의 박동 곡선의 변화(도 21)

4.3 신생 래트 제1 발생 심근 세포에 대한 한약 추출액의 독성 작용의 요약

주석: 세포의 박동에 대한 약물의 효과: XX 박동이 없음을 지시함; X는 분명한 불규칙성을 지시함; 및 V는 정상 박동을 지시함

4.4 박동수에 대한 한약 추출액의 효과(도 22)

이러한 도면은 한약 추출물 약물 농도 및 시간에 의존적인 심근 세포 박동수 변화의 정량/효과 관계를 도시한 것이다. 사용된 파라미터는 일반화된 박동수 (NBR)이다. 파라미터 계산 방법: 표준화된 시점(0min)에서의 박동수에 대한 선택된 시점에서의 박동수의 비율.

이러한 도면에서, 파트 A는 투약 후 1시간 내에 세포 박동수 변화의 공정을 도시한 것이다. 파트 B는 투약 전 10분에서 투약 후 24시간까지 세포 박동수 변화의 전체 공정을 도시한 것이다.

이러한 도면으로부터, 투약 전 10분 이내에, 세포 박동수는 일정하고 양호한 균일성을 갖는 것임을 알 수 있다. 투약 후에, 짧은 기간에 약물에 의한 세포 박동에 대한 분명한 효과는 나타나지 않았다. 2시간 후에, 고농도의 약물은 세포 박동수를 낮아지게 하였으며, 투약 후 6시간의 박동의 완전 정지까지 낮아졌다. 5.33㎎/㎖의 약물은 시간의 기간에 약간 낮아진 박동수를 야기시켰다. 1.78㎎/㎖ 미만의 농도의 약물은 세포 박동에 대한 분명한 효과를 갖지 않고, 저농도의 이러한 약물은 심장 박동에 대해 심각한 효과를 갖지 않는다.

4.5 박동 진폭에 대한 한약 추출액의 효과 (도 23)

이러한 도면은 약물 농도 및 시간에 따른 심근 세포 박동 진폭의 변화를 나타낸 것이다. 사용된 파라미터는 일반화된 진폭 (NA)이다. 파라미터 계산 방법: 표준화된 시점(0분)에서의 진폭에 대한 선택된 시점에서의 진폭의 비율

이러한 도면에서, 파트 A는 투약 후 1시간 이내에 세포 박동 진폭의 변화 공정을 나타낸 것이며, 파트 B는 투약 전 10분에서 투약 후 24시간에서의 세포 박동 진폭 변화의 전체 공정을 나타낸 것이다.

이러한 도면으로부터, 투약 전 10분 이내에, 세포 박동 진폭은 적합하다는 것을 알 수 있다. 투약 후 짧은 시간에, 약물은 진폭에 대해 분명한 효과를 나타내지 않는다. 투약 후 2 시간에, 고농도 (16㎎/㎖) 약물은 세포 박동수의 저하를 야기시키며, 이는 투약 후 6시간에 박동의 완전 정지까지 이어진다. 5.33㎎/㎖ 약물은 박동수의 약간의 저하를 야기시킨다. 약물 농도가 1.78㎎/㎖ 미만일 때, 세포 박동에 대해 분명한 효과를 나타내지 않는다. 이는 고농도의 이러한 약물이 심장 박동에 대한 분명한 효과를 나타내는 반면 저농도의 이러한 약물이 심장 박동에 대해 심각한 효과를 나타내지 않음을 나타내는 것이다.

4.6 신생 래트 제1 발생 심근 세포 박동수 및 진폭에 대한 한약 추출액 효과의 IC50 (도 24)

상기 도면에서 4개의 시점의 IC50 피팅 곡선 (박동수/진폭)

세포 박동수 및 진폭의 IC50 수치는 3개의 시점에서 계산되었다.

5. 실험 결론, 가능한 질문, 및 제안

5.1 고농도 (16㎎/㎖)의 이러한 약물은 세포 활성에 빠르게 영향을 미쳐서 세포의 사멸을 야기시킨다.

5.2 이러한 약물은 농도 의존성을 갖는 제1 발생 신생 래트 심근 세포의 박동수 및 진폭에 영향을 미친다. 고농도(16㎎/㎖)의 이러한 약물은 투약 후 약 6시간에 박동의 정지를 야기시킬 수 있으며, 중간 농도(5.33㎎/㎖; 1.78㎎/㎖)의 이러한 약물은 투약 후 약 6시간에 세포의 약간 감소된 박동수 및 약간 증가된 진폭을 야기시킬 수 있다. 이는 고농도의 이러한 약물이 심장 박동에 분명하게 영향을 미치는 반면 저농도의 이러한 약물이 심장 박동에 대한 심각한 효과를 나타내지 않음을 나타내는 것이다.

5.3 이러한 약물에 의해 야기된 특이성 이온 채널과 관련한 심근 세포 파형은 나타나지 않았다.

상기 결과는 단지 참조를 위한 것이다. 특별한 메카니즘은 추가 스크리닝 및 연구를 필요로 한다.

연구 기록

ACEA Biosciences (항저우) Co., Ltd. 클라이언트 데이타베이스에 저장

번호: 1112121715CD。

Claims

천연 인간 에폭시다아제(epoxidase) 및 천연 독소루비신(doxorubicin) 또는 파라-독소루비신을 함유한 한 유형의 약용 조합물(medical combination)로서, 이러한 약용 조합물의 원료가 기진초(treasures grass)인, 약용 조합물.
제1항에 있어서, "이러한 약용 조합물의 원료가 기진초이다"가 전체 기진초 또는 기진초의 추출물의 탈수, 건조 및 분쇄로부터 얻어진 분말이 채택되는 것을 의미하는, 천연 인간 에폭시다아제 및 천연 독소루비신 또는 파라-독소루비신을 함유한 약용 조합물.
제2항에 있어서, 상기 기진초의 추출물이,
기진초 전탕액(water decoction liquid)의 농축 및 건조로부터 얻어진 분말;
알코올 추출물에 의해 얻어진 기진초 전탕액의 알코올 추출액, 또는 이러한 알코올 추출액의 농축 및 건조로부터 얻어진 분말;
전체 기진초 또는 기진초 전탕액의 유기 추출로부터 얻어진 추출물, 또는 이러한 추출물의 재농축 및 건조로부터 얻어진 분말;
전체 기진초 또는 기진초 전탕액의 CO₂ 초임계 추출로부터 얻어진 추출물, 또는 이러한 추출물의 재농축 및 건조로부터 얻어진 분말;
전체 기진초 또는 기진초 전탕액으로부터 추출된 휘발성 오일 중 하나를 나타내는, 천연 인간 에폭시다아제 및 천연 독소루비신 또는 파라-독소루비신을 함유한 약용 조합물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 천연 독소루비신 및 인간 에폭시다아제를 함유한 약용 조합물이 또한 약학 분야에서 허용되는 보조 재료들을 포함하는, 천연 인간 에폭시다아제 및 천연 독소루비신 또는 파라-독소루비신을 함유하는 약용 조합물.
제4항에 있어서, 약학 분야에서 허용되는 보조 재료가 정제를 제조하기 위해 사용되는 부형제, 조미료, 또는 항산화제; 캡슐을 제조하기 위해 사용되는 항산화제 또는 안정화제; 경구용 액제 또는 시럽을 제조하기 위해 사용되는 조미료, 안정화제 또는 항산화제; 외용 약용 추출물을 제조하기 위해 사용되는 유화제 또는 바셀린; 및 주사제를 제조하기 위해 사용되는 유화제, 용매 또는 안정화제를 나타내는, 천연 인간 에폭시다아제 및 천연 독소루비신 또는 파라-독소루비신을 함유하는 약용 조합물.
제1항에 따른 천연 인간 에폭시다아제 및 천연 독소루비신 또는 파라-독소루비신을 함유하는 약용 조합물을 제조하는 방법으로서,
(1) 전체 기진초를 세척하는 단계;
(2) 단계 (1)에서 수득된 세척된 전체 기진초를 탈수, 건조, 및 분쇄시켜 분말을 수득하는 단계로서, 상기 분말이 125 ㎛ 또는 5.8 ㎛의 입도를 갖거나 120 메시 시브를 통과하는 단계;
(3) 상기 단계 (2), 또는 하기 (2)-1, (2)-2, (2)-3, (2)-4, 또는 (2)-5에서 수득된 분말 및/또는 휘발성 오일을 약용 보조 재료와 혼합하여 요망되는 투약 패턴(dose pattern)을 제조하는 단계;
(4) 멸균하는 단계;
(5) 분석하는 단계; 및
(6) 포장하는 단계를 포함하며,
상기 단계 (2)가 또한
(2)-1 기진초 전탕액 또는 이러한 전탕액의 재농축 및 건조에 의해 수득된 분말;
(2)-2 알코올 추출물에 의해 얻어진 기진초 전탕액의 알코올 추출액, 또는 이러한 알코올 추출액의 재농축 및 건조에 의해 얻어진 분말;
(2)-3 유기 추출에 의해 수득된 전체 기진초 또는 기진초 전탕액의 추출물, 또는 이러한 추출물의 재농축 및 건조에 의해 얻어진 분말;
(2)-4 전체 기진초 또는 기진초 전탕액의 CO₂ 초임계 추출에 의해 얻어진 추출물, 또는 이러한 추출물의 재농축 및 건조에 의해 수득된 분말;
(2)-5 전체 기진초로부터 추출된 휘발성 오일 중 하나에 의해 수득된 기진초 추출물을 채택할 수 있는 방법.
신장염(nephritis)을 치료하기 위한 약물의 제조에서 제1항에 따른 천연 인간 에폭시다아제 및 천연 독소루비신 또는 파라-독소루비신을 함유한 약용 조합물의 적용.
담낭염(cholecystitis) 및 담낭 용종(gall bladder polypus)을 치료를 치료하기 위한 약물의 제조에서 제1항에 따른 천연 인간 에폭시다아제 및 천연 독소루비신 또는 파라-독소루비신을 함유한 약용 조합물의 적용.
종양을 치료를 치료하기 위한 약물의 제조에서 제1항에 따른 천연 인간 에폭시다아제 및 천연 독소루비신 또는 파라-독소루비신을 함유한 약용 조합물의 적용.
소염제 및 통증제의 제조에서 제1항에 따른 천연 인간 에폭시다아제 및 천연 독소루비신 또는 파라-독소루비신을 함유한 약용 조합물의 적용.