TWI398253B - 三萜類化合物用於抑制腫瘤之用途 - Google Patents
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Description
本發明係有關一種自牛樟芝萃取物中分離而得並可抑制腫瘤之化合物。
Antrodia camphorata
俗稱牛樟芝，係生長在台灣特有且稀少的牛樟樹(Cinnamomum kanehirae
)上，廣泛使用於中藥材中解毒、治療腹瀉、高血壓、皮膚癢甚至抗癌等。已有研究指出Antrodia camphorata
的菌絲(mycelium)及子實體(fruiting bodies)對於癌細胞具有抗性，但卻不影響正常的細胞，對於不同癌症抑制的機制也陸陸續續的被研究出。樟菇成分非常複雜，含有很多生理活性物質，例如多醣體、超氧歧化酵素(SOD)、腺苷、小分子蛋白質、維生素、微量元素、核酸、固醇類、血壓穩定物質，其中最重要的當屬三萜類化合物(triterpenoid)。關於Antrodia camphorata
之三萜類化合物，Yeh等人從Antrodia camphorata
純化出8種化合物，並對大腸癌細胞(HT-29)做出測試，並發現這8種化合物能夠對大腸癌細胞(HT-29)引發細胞凋亡(apoptosis)(Yeh CT,Rao YK,Yao CJ,Yeh CF,Li CH,Chuang SE,Luong JH,Lai GM,Tzeng YM. Cytotoxic triterpenes fromAntrodia camphorata
and their mode of action in HT-29 human colon cancer cells. Cancer Lett. 2009 Nov. 18;285(1):73-9)。但Antrodia camphorata
三萜類化合物對於其他種類癌細胞是否亦有誘導其死亡功效，且同時對於正常細胞產生毒殺效能不高，仍未有定論。
本發明即針對來自Antrodia camphorata
的11種三萜類化合物，期能找出誘導多種癌細胞之細胞凋亡、且同時對於正常細胞毒性不高之化合物，以應用於抑制腫瘤之藥物或保健食品。
是以，本發明係提供一種以包括分別如下式之化合物製備抑制腫瘤之組成物之用途：
用於本發明之化合物為三萜類化合物，係從牛樟芝(Antrodia camphorata
)萃取物中分離而得。這些化合物可用於製備抑制腫瘤之組成物，該等腫瘤包括但不限於為口腔癌、胰臟癌、乳癌、骨癌、子宮頸癌、卵巢癌、胃癌、血癌、前列腺癌或非小細胞肺癌之腫瘤。這些所用化合物中較佳者為化合物1、2、3、9及11，更佳者為化合物11。
本發明同時提供一種抑制腫瘤之組成物，其係包括如上述之三萜類化合物。該化合物係從牛樟芝(Antrodia camphorata
)萃取物中分離而得。這些化合物可用於製備抑制腫瘤之組成物，該等腫瘤包括但不限於為口腔癌、胰臟癌、乳癌、骨癌、子宮頸癌、卵巢癌、胃癌、血癌、前列腺癌或非小細胞肺癌之腫瘤。這些所用化合物中較佳者為化合物1、2、3、9及11，更佳者為化合物11。該組成物可作為癌症預防保健食品成分之一。
前述組成物除包括有效劑量之化合物11外，尚可包括藥學上可接受的載體。載體包括但不限於為賦形劑、填充劑、黏合劑、稀釋劑、崩解劑、吸收促進劑或矯味劑。本發明之組成物可依一般習知藥學之製備方法生產製造，將有效成分劑量之化合物與一種以上之載體相混合，製備出所需之劑型，此劑型可包括但不限於膠囊、錠劑、粉劑、粒劑或其他液體製劑。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉之實施例係用以說明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可進行些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
本發明可能以不同的形式來實施，並不僅限於下列文中所提及的實例。下列實施例僅作為本發明不同面向及特點中的代表。所述實施例不限制在申請權利範圍中所描述的本發明的範圍。
將風乾之Antrodia camphorata
子實體粉末(101.9g)依序以正己烷、三氯甲烷及甲醇於加熱迴流萃取裝置進行萃取(3×1000mL)。在完整萃取步驟後，收得之萃取物分別於減壓條件下濃縮，分別獲得3.02g(以乾重計算占2.96%)正己烷殘餘物、46.3g(45.43%)三氯甲烷殘餘物及2.7g(2.64%)甲醇殘餘物。藉由己烷/乙酸乙酯混合液增加極性，將三氯甲烷萃取殘餘物以重覆性矽膠管柱層析(5×90cm)沖提。在薄層層析(TLC)分析後，將具相似層析結果之沖出物合併，得到6組分液(F1-F6)。分液F2以己烷/乙酸乙酯於矽膠管柱梯度沖提方式進行再層析，分別產出牛樟芝甲酯B(methyl antcinate B)(1)
、去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid)(2)
及15α-乙醯去氫硫色多孔菌酸(15α-acetyl dehydrosulphurenic acid)(3)
。分液F3以己烷/乙酸乙酯於矽膠管柱梯度沖提方式進行純化，獲得化合物3β,15α-二羥羊毛甾-7,9(11),24-三烯-21酸(3β,15α-dihydroxy lanosta-7,9(11),24-triene-21-oic acid)(4)
及樟芝酸A(zhankuic acid A)(5)
。分液F4及F5以正己烷/乙酸乙酯梯度沖提管柱層析純化，產出4種次分液(D-1至D-4)。去氫硫色多孔菌酸(dehydrosulphurenic acid)(6)
、樟芝酸C(zhankuic acid C)(7)
及硫色多孔菌酸(sulphurenic acid)(8)
分別來自次分液D-2、D-3及D-4。使用100%三氯甲烷至20%甲醇之三氯甲烷/甲醇混合液，進行分液F6矽膠管柱層析純化，產出牛樟芝甾A(antcin A)(9)
，其他混合化合物進一步使用三氯甲烷/甲醇沖提液以管柱層析分離，產出牛樟芝甾C(antcin C)(10)
及牛樟芝甲酯A(methyl antcinate A)(11)
。化合物1-11結構以1
H和13
C核磁共振(NMR)光譜測定，所得光譜資料並與已發表數值比較(Shen,C.C.,Kuo,Y.C.,Huang,R.L.,Lin,L.C.,Don,M.J.,Chang,T.T.,Chou,C.T.,(2003). New ergostane and lanostane fromAntrodia camphorata
. Journal of Chinese Medicine,14,247-258；Male,K.B.,Rao,Y.K.,Tzeng,Y.M.,Montes,J.,Kamen,A.,Luong,J.H.,(2008). Probing inhibitory effects ofAntrodia camphorata
isolates using insect cell-based impedance spectroscopy:inhibition vs chemical structure. Chemical Research in Toxicology 21,2127-2133；Yeh,C.T.,Rao,Y.K.,Yao,C.J.,Yeh,C.F.,Li,C.H.,Chuang,S.E.,Luong,J.H.,Lai,G.M.,Tzeng,Y.M.,(2009). Cytotoxic triterpenes fromAntrodia camphorata
and their mode of action in HT-29 human colon cancer cells. Cancer Letters 285,73-79；Geethangili,M.,Fang,S.H.,Lai,C.H.,Rao,Y.K.,Lien,H.M.,Tzeng,Y.M.,(2010). Inhibitory effect ofAntrodia camphorata
constituents on theHelicobacter pylori
-associated gastric inflammation. Food Chemistry 119,149-153)。11種化合物的分子量列於表1。
TSCCa、GNM、KB、OEC-M1、OC-2、Panc-1、AsPc、BT474、T47D、U2-OS、PC-3、OVCAR-3、HeLa、AGS、MCF-12A及GF
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide；MTT(Amresco)PE Active Caspase-3 Apoptosis Kit(BD Biosciences)ApoAlert Annexin V-FTIC Apoptosis Kit(Clontech Laboratories)
MTT化合物原為黃色，可於活細胞粒線體作用，生成藍紫色的formazan；用相對細胞存活數量初步篩選11種化合物及其於不同濃度下，何者可殺死癌細胞。
使用96孔盤，每個孔加入200μL培養基(內含3×103
個細胞)，置入37℃培養箱12小時後施以11種藥劑，每種均測試6種濃度(5μM、10μM、50μM、100μM、150μM及200μM)，培養24小時。於24小時後，抽掉96孔盤中含藥劑之培養基，加入含MTT的培養基200μL，適當反應後加入DMSO使其色素釋出，利用分光光譜儀測定波長595nm之吸光值。
第一階段，我們先使用11種從牛樟芝萃取物中分離之化合物，對不同種的癌細胞作測試，利用MTT測定法將破壞癌細胞生長的化合物篩選出來。實驗結果如表2所示，化合物4、
5、6、7、8及10，可抑制少數癌細胞的生長，化合物1、2、3、9及11對多數癌細胞具有抑制性，尤其是口腔癌細胞。我們將化合物1、2、3、9及11的濃度降低，使用口腔癌細胞(OC-2及OEC-M1)再做一次MTT測試(圖2)。綜合兩項結果，發現化合物11在低濃度下的抑癌效果優於其他化合物，因此將化合物11(methyl antcinate A)作為主要研究對象。
細胞凋亡啟動後，因細胞膜的性質改變使內膜磷脂絲胺酸(phosphatidylserine)暴露出來，而使Annexin V可以結合磷脂絲胺酸；碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)為一特殊染色劑，可嵌入DNA的鹼基對中，當細胞凋亡發生時，細胞膜的通透性改變，使PI得以進入細胞內結合DNA，此兩種染色配合流式細胞儀可用來偵測細胞凋亡的程度。
以Annexin V/propidium iodide測定法，測試化合物對癌細胞的影響之時間相依性，實驗設計係對細胞(1×106
)施予50μM藥物劑量的培養基，放入37℃培養箱，分別於3、6及9小時之時間點，收取細胞做測試；對照組係以加入含50μM DMSO的培養基，培養細胞9小時。
我們進行了Annexin V/PI的雙重染色，FL1-H表示Annexin V螢光強度，FL3-H表示propidium iodide的強度，利用流式細胞儀偵測10000個OC-2細胞的螢光強度。含50μM化合物11分別培養3、6及9小時後(圖3)，細胞族群所測得的螢光強度都有明顯上昇，因此我們斷定化合物11於作用3小時後確實會導致癌細胞的凋亡。
硫胱胺酸蛋白酶(cysteine asparate protease，簡稱為caspase)家族為細胞凋亡的重要因子，而caspase-3是細胞凋亡的指標，以未活化態存在細胞內。利用PE標記的抗活化態Caspase-3抗體以結合細胞內被活化之Caspase-3，配合流式細胞儀的使用，偵測細胞凋亡是否被啟動。以Caspase-3測定法及Annexin V/propidium iodide測定法，測試化合物對癌細胞的影響之劑量相依性，期能取得可引發癌細胞進行細胞凋亡的最低有效劑量，此測試也以口腔癌細胞(OC-2及OEC-M1)進行Caspase-3及Annexin V/PI測定法。實驗設計係對細胞(1×106
)施予含四種藥劑濃度的培養基，分別為5μM、10μM、25μM及50μM，放入37℃培養箱培養3小時後，收取細胞做測試；其對照組為含同樣劑量DMSO的培養基培養細胞3小時。
實驗結果發現，無論是OC-2或者OEC-M1兩株細胞都會受到化合物11的影響，走向細胞凋亡。在Caspase-3測定法的結果，同樣以對照組為基準，含化合物11培養癌細胞的結果波峰都明顯的Caspase-3活性增加(圖4)，不同濃度之間對於癌細胞的影響，有明顯差異；另外在Annexin V/PI測定法的部份，發現加入不同濃度的化合物11，結果FL1-H和FL3-H帶螢光強度的細胞均有增加(圖5)，隨著劑量的增強而使癌細胞發生細胞凋亡的數目增加(圖6)。由這兩項實驗顯示化合物11於劑量10μM就足以引發癌細胞凋亡。
當OEC-M1細胞以50μM化合物11(methyl antcinate A)處理後，所含的截切態caspase-3量較多(圖7)。聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)於DNA有單股或雙股斷裂時會受強烈活化，一般認為與參與細胞對DNA受損之反應有關。PARP於細胞凋亡過程中會被caspase-3大量截切(圖7)。在健康細胞中，粒線體外膜表面會呈現Bcl-2蛋白質。Bcl-2會抑制細胞凋亡。細胞內損害會造成Bax蛋白質移至粒線體表面、抑制Bcl-2保護作用並插入粒線體的外膜，使粒線體外膜產生孔洞。如圖7所示，從西方點墨法結果，確實有觀察到經強化之PARP活化作用及Bax表現(圖7)。
我們找到了一一系列的藥劑能夠誘導癌細胞進行細胞凋亡，但不會對正常細胞產生影響，藥物引發癌細胞進行細胞凋亡後，使癌細胞漸進式的死亡、消失，對於癌症病患的身體負擔也可以相對的減少。
在牛樟芝(A. camphorate
)的11種萃取物中，由MTT檢測中，我們發現化合物11與其它化合物相較之下，對於癌細胞的毒殺性甚佳，尤其是對口腔癌細胞，因此進一步朝化合物11與口腔癌細胞的關係與抑制機制研究；在Caspase-3測定法及Annexin V/PI測定法中也證明了化合物11確實會誘導口腔癌細胞進行細胞凋亡；綜合以上結果，從牛樟芝中萃取出的化合物可以進一步發展為抗口腔癌藥物或者癌症預防保健食品。在細胞凋亡的後期，細胞的內切酶(endonuclease)會切斷核小體(nucleosome)與核小體間的DNA間隙，因此會形成DNA片段，表示細胞凋亡即將走向最終；此現象可藉由DNA斷裂檢測測定，以了解化合物11誘導口腔癌細胞凋亡的有效程度及完整性。
圖1 11種化合物詳細結構。
圖2 將化合物1、2、3、9及11濃度範圍縮小後的MTT結果。
圖3 Annexin V/PI測定法觀察10000顆OC-2細胞的結果。
Data.001：對照組，含50μM DMSO，培養9小時
Data.002：含50μM化合物11的培養基，培養3小時
Data.003：含50μM化合物11的培養基，培養6小時
Data.004：含50μM化合物11的培養基，培養9小時
圖4 化合物11(methyl antcinate A)對口腔癌細胞株之抗增生作用。於24小時後，相較於DMSO對照組及正常口腔纖維母細胞(GF)，OC-2及OEC-M1的生長率有顯著性下降。OC-2相對於DMSO對照組，P<0.01；OEC-M1相對於DMSO對照組，P<0.001。
圖5 以化合物11(methyl antcinate A)處理2種口腔癌細胞株可誘發Annexin V染色結果改變。經溶於DMSO之methyl antcinate A處理(濃度如圖所標示)之(A) OEC-M1及(B) OC-2細胞，於處理72小時後，分別以Annexin V-螢光素異硫氰酸鹽(FITC)及PI染色。Annexin V-FITC訊號列於X軸，PI訊號列於Y軸。每組樣品收集訊號次數為1萬次。
圖6 化合物11(methyl antcinate A)對OEC-M1及OC-2細胞凋亡之作用。Methyl antcinate A處理對細胞凋亡誘發之作用，係以流式細胞儀評估分析OEC-M1及OC-2細胞於接觸DMSO或特定濃度methyl antcinate A後3小時後的(A)與細胞質組織蛋白結合之DNA片段及(B)活化態caspase-3活性。數據為2次或3次重覆試驗之平均±SE。
圖7 化合物11(methyl antcinate A)誘發細胞凋亡之證據。以50μM methyl antcinate A處理OEC-M1細胞6小時後，藉由西方點墨法分析硫胱胺酸蛋白酶-3(caspase-3)、聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)及Bax蛋白質表現。β-肌動蛋白(β-actin)為樣品注入對照組。
Claims (5)
- 一種以包括分別如下式之化合物製備抑制腫瘤之組成物之用途：
- 如申請專利範圍第1項之用途，其中化合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及11係從牛樟芝(Antrodia camphorata )萃取物中分離或化學合成而得。
- 如申請專利範圍第1項之用途，其中該化合物係為化合物1、2、3、9或11。
- 如申請專利範圍第1項之用途，其中該抑制腫瘤係經由細胞凋亡(apoptosis)機制達成。
- 如申請專利範圍第1項之用途，其中該化合物係可作為癌症預防保健藥物或食品。
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| TW99108910A TWI398253B (zh) | 2010-03-25 | 2010-03-25 | 三萜類化合物用於抑制腫瘤之用途 |
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| TW201132344A TW201132344A (en) | 2011-10-01 |
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| TW99108910A TWI398253B (zh) | 2010-03-25 | 2010-03-25 | 三萜類化合物用於抑制腫瘤之用途 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI487531B (zh) * | 2012-02-13 | 2015-06-11 | Joben Bio Medical Co Ltd | 牛樟芝萃取濃縮物及其製造方法 |
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2010
- 2010-03-25 TW TW99108910A patent/TWI398253B/zh active
Non-Patent Citations (3)
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| Majid Ehsan et al.; "Cyclodextrin-modified capillary electrophoresis for achiral and chiral separation of ergostane and lanostane compounds extracted from the fruiting body of Antrodia camphorata"; Electrophoresis,2009,vol.30,no.11,pages 1967~1975. * |
| Song Tuzz-Ying et al.; "Induction of apoptosis in human hepatoma cells by mycelia of Antrodia camphorata in submerged culture"; Journal of Ethnopharmacology,2005,vol.100,no.1~2,pages 158~167. * |
| Yeh Chi-Tai et al.;"Cytotoxic triterpenes from Antrodia camphorata and their mode of action in HT-29 human colon cancer cells";Cancer Letters,2009,vol.285,no.1,pages 73~79. * |
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