TWI619500B - 聚乙炔糖苷用於抑制顆粒球骨髓來源抑制細胞活性及腫瘤轉移的用途 - Google Patents

聚乙炔糖苷用於抑制顆粒球骨髓來源抑制細胞活性及腫瘤轉移的用途 Download PDF

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魏紋祈
Wen-Chi Wei
林聖晏
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蕭培文
Pei-Wen Hsiao
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Abstract

本發明係揭示一種醫藥組合物，在有需要的個體中抑制顆粒球骨髓來源抑制細胞(gMDSCs)的分化、功能活性以及細胞群體及/或抑制腫瘤轉移的用途。該組合物包含治療有效劑量的大花咸豐草萃取物，或超過一個由大花咸豐草萃取物分離而得的聚乙炔化合物，以及藥學上可接受載體。

Description

聚乙炔糖苷用於抑制顆粒球骨髓來源抑制細胞活性及腫瘤轉移的用途
本發明一般關於用於抑制骨髓來源抑制細胞的方法。
基於近來在精密手術、癌症的早期診斷、以及使用化療藥物的輔助性治療上的進步，目前的癌症死亡率主要反映了從原發性腫瘤部位轉移至第二組織標的部位而殘留或循環的腫瘤細胞的程度及狀態。有60%至70%的病患被證明在診斷時或其後時間中開始了轉移程序。因此，控制、阻斷及預防這樣的轉移，被確認是能成功干預癌症轉移的關鍵步驟。目前，針對轉移疾病的治療仍遭遇相當的挑戰。
骨髓來源抑制細胞(MDSCs)被證明為可負向調控針對癌症的免疫反應的主要免疫抑制細胞。據顯示MDSCs主要負責抑制宿主抗腫瘤的免疫反應，並因此而妨害抗腫瘤免疫抑制療法的有效性。MDSCs是異質細胞群體，其含有骨髓前驅細胞及未成熟的骨髓細胞(IMCs)，存在於腫瘤發展、組織發炎及病原感染的過程中。兩種不同的MDSCs亞型，稱為單核球MDSCs與顆粒球MDSCs(分別為mMDSCs及gMDSCs)，已根據其細胞型態、生物標誌、及功能而被鑑定出。因此，被辨識出的各種MDSCs在腫瘤誘導的免疫抑制反應中扮演著功能分級的角色。因此，預防或阻斷癌症病患身上MDSCs的發育策略被視為是治療癌症的主要方式。
一方面，本發明關於一種醫藥組合物，其包含：(i)治療有效劑量的大花咸豐草(Bidens pilosa )萃取物，或超過一個由大花咸豐草萃取物中純化出或分離出的聚乙炔化合物；以及(ii)藥學上可接受載體，而用於在有需要的個體中抑制、阻斷及/或預防腫瘤轉移。
另可選擇地，本發明關於前述醫藥組合物在製造用於在有需要的個體中抑制、減少、阻斷及/或預防腫瘤轉移的藥劑的用途。
本發明亦關於一種用於在有需要的個體中抑制、阻斷及/或預防腫瘤轉移的方法，其包含將前述醫藥組合物給藥予該有需要的個體。
另一方面，本發明關於一種醫藥組合物，其包含：(i)治療有效劑量的大花咸豐草(Bidens pilosa )萃取物，或超過一個由大花咸豐草萃取物中純化出或分離出的聚乙炔化合物；以及(ii)藥學上可接受載體，而用於在有需要的個體中抑制顆粒球骨髓來源抑制細胞(gMDSCs)的分化、功能活性、及細胞群體及/或抑制轉移性癌症或癌症轉移。
另可選擇地，本發明關於前述醫藥組合物在製造用於在有需要的個體中抑制顆粒球骨髓來源抑制細胞(gMDSCs)的分化、功能活性、及細胞群體及/或抑制轉移性癌症或癌症轉移的藥劑的用途。
本發明關於一種用於在有需要的個體中抑制顆粒球骨髓來源抑制細胞(gMDSCs)的分化、功能活性、及細胞群體及/或抑制轉移性癌症或癌症轉移的方法，其包含將前述醫藥組合物給藥予該有需要的個體。
在本發明的另一實施例中，該醫藥組合物包含至少80%或不少於89%(wt/wt)的2-β-D-吡喃葡萄糖氧基-1-羥基-5(E)-十三烯-7,9,11-三炔、2-D-吡喃葡萄糖氧基-1-羥基十三碳-5,7,9,11-四炔、以及3-β-D-吡喃葡萄糖氧基-1-羥基-6(E)-十四烯-8,10,12-三炔化合物。
在本發明的另一實施例中，該醫藥組合物包含：(a)2-β-D-吡喃葡萄糖氧基-1-羥基-5(E)-十三烯-7,9,11-三炔、(b)2-D-吡喃葡萄糖氧基-1-羥基十三碳-5,7,9,11-四炔、以及(c)3-β-D-吡喃葡萄糖氧基-1-羥基-6(E)-十四烯-8,10,12-三炔化合物，其比例範圍由1:1:2至1:2:4或由1:1:1至1:2:4。
在本發明的另一實施例中，該個體患有乳癌，或者是接受癌症手術的術後病患，或有需要進行癌症轉移控制、阻斷或預防的病患。
在本發明的另一實施例中，該醫藥組合物抑制顆粒球骨髓來源抑制細胞(gMDSCs)的分化、功能活性、及細胞群體，以及在不對gMDSCs造成細胞毒性或使其凋亡的情況下抑制腫瘤轉移。
在本發明的另一實施例中，該醫藥組合物係選自由口服、靜脈內、肌肉內及皮下所組成的群組中的劑型。
在本發明的另一實施例中，該大花咸豐草萃取物或超過一個由大花咸豐草萃取物中純化出或分離出的聚乙炔化合物的劑量係有效於抑制腫瘤轉移至有需要的個體的肺部，以及使顆粒球MDSCs累積在肺部、周邊血液及脾臟中。
在本發明的另一實施例中，該大花咸豐草萃取物為：(i)大花咸豐草的乙醇萃取物；或(ii)由裝載了含有大花咸豐草的乙醇萃取物混合物的HPLC管柱所洗提出的第一分餾物；或(iii)大花咸豐草乙醇萃取物的重複再層析分餾物。
在本發明的另一實施例中，該大花咸豐草萃取物包含不少於89%(w/w)的聚乙炔化合物。
在本發明的另一實施例中，該醫藥組合物包含人體等效劑量：(a) 10-1000 mg的大花咸豐草乙醇萃取物/Kg體重x (0.025 Kg/以Kg計的人體重)0.33 ，或(b) 0.5 -1000 mg的第一分餾物/ Kg體重x (0.025 Kg/以Kg計的人體重)0.33 。
在本發明的另一實施例中，該醫藥組合物包含通式(I)、(II)及(III)化合物：，, 和
這些和其他方面將由以下較佳實施例的說明連同以下圖式而變得明顯。說明一或多個本發明實施例的圖式，連同書面的描述，可作為解釋本發明的原理之用。只要可能，在整個圖式中使用相同的引用序號來指示實施例的相同或類似的元件。
當與現有技術比較時，本發明的獨特特徵及優點
現今，越來越多的證據證明作為轉移性癌症的全身性療法的化療，並非對於所有癌症患者皆有利，反而損害宿主免疫，進而導致其促進腫瘤生長和擴散。本發明關於發現口服給藥BP-E或BP-E的F1分餾物可顯著地抑制轉移。F1分餾物對於抑制轉移及MDSC累積的效果與多西紫杉醇的治療一樣好。再者，相較於經多西紫杉醇治療的小鼠而言，以F1分餾物餵食小鼠顯示出較佳的一般健康狀況。在本研究小鼠乳腺腫瘤切除模型中，不同於多西紫杉醇，F1分餾物並不會誘發體重下降或脫髮現象。
本發明的商業應用
藉由比較F1分餾物與目前的臨床藥物多西紫杉醇間的功效、藥物給藥及副作用得知，本發明是根據一個非預期的發現，由大花咸豐草製備而得的植物化學成分(包括BP-E及F1分餾物)可抑制MDSC的分化及功能，且能抑制乳腺腫瘤轉移。這些萃取物可被用於對抗MDSC及乳癌腫瘤轉移的抗癌藥劑。
如在本文的描述及整個隨後的申請專利範圍中，「一」、「一個」及「該」的含義包括複數對象，除非上下文另有明確說明。此外，如在本文的描述及整個隨後的申請專利範圍中，「在..其中」的含意包括「在..其中」及「在..上面」，除非上下文另有明確說明。
定義
在本說明書中所使用的術語通常具有其在本領域中的普通含義，在本發明的範圍內，且在所使用的各術語的具體上下文中。用於描述本發明的某些術語將於下述或在本說明書其他地方中討論，以提供關於本發明的描述而對施行者進一步的指導。為了方便起見，某些術語可被強調凸顯，例如使用斜體字及/或引號。強調的使用對於術語的範圍及含意沒有影響；無論是否有強調，術語的範圍及含意在相同的上下文中是相同的。應理解的是，相同的事情可以用超過一種方式陳述。因此，替代語言和同義詞可用於本文中所討論的任一個或一個以上的術語中，無論術語是否在本文中被闡述或討論，其也非具有任何的特殊意義。提供某些術語的同義詞。一個或多個同義詞的陳述不排除使用其它同義詞。在本說明書中任何地方所使用的包含本文所討論的任何術語示例的實例僅是說明性的。
除非另有定義，本文使用的所有技術及科學術語具有與本領域技術人員對於本發明所屬領域的理解相同的含義。在衝突的情況下，包含定義的本文件將獲得控制。
術語「治療(treating)」或「醫治(treatment)」係指將一有效量的藥劑給藥予患有疾病(例如腫瘤及/或腫瘤轉移)或有該疾病的症狀，或有罹患該疾病傾向的有需要的個體，而達到治癒、減輕、解除、補救、改善、或預防該疾病、該疾病的症狀、或傾向罹患該疾病、或者減輕該症狀的發生率的目的。此類個體可藉由保健專家基於來自任何合適的診斷方法的結果來鑑定。
「有效量」係指一種針對經治療的個體產生治療效果的活性化合物的劑量。如本領域技術人員所理解的，有效劑量可因給藥途徑、賦形劑的使用、以及與其他治療方法共同使用的可能性而改變。
術語「大花咸豐草乙醇萃取物」及「BP-E植物萃取物」可交替使用。大花咸豐草乙醇萃取物係指由整株大花咸豐草(菊科)的新鮮或乾燥組織中以乙醇(例如，95% EtOH)萃取出的「植物化學成分」。
術語「F1分餾物」係指「由BP-E獲得的F1植物化學成分」。「F1分餾物」是以HPLC進行分餾而分離出的BP-E植物萃取物的一個次分餾物。舉例而言，使用PR-18製備型HPLC管柱(例如，COSMOSIL™ C18, 4.6 mm × 250 mm)，搭配及UV 235 nm偵測器，並在MeOH/ H2 O梯度及0.5 ml/min的流速下進行，在滯留時間40分鐘至46分鐘間收集沖提分餾物。
在美國衛生和公眾服務部食品藥品監督管理局(U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration)所出版的「針對健康成人志願者進行治療的臨床試驗中進行安全起始劑量估算的企業及審查員指南(Guidance for Industry and Reviewers Estimating the Safe Starting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)」中揭示的「人體等效劑量」可經由下述公式計算而得：
HED = 以 mg/kg 計的動物劑量 ´ ( 以 Kg 計的動物體重 / 以 Kg 計的人 體重 )0.33 .
如本文所使用，當描述一個數字或一個範圍時，本領域技術人員理解其旨在關於本發明的特定領域中包含一個適當、合理的範圍。
由0.5-1000 mg，這意味著在該範圍內的所有十分之一和整數單位的劑量，是特別揭示為本發明的一部分。因此，0.5、0.6、0.7及1、2、3、4 . . . 999.7、999.8、999.9及1000單位劑量係包含於本發明的實施例中。
本研究探討大花咸豐草乙醇萃取物(BP-E)對於MDSC擴增及腫瘤轉移的免疫調節及抗癌症活性。結果顯示，BP-E可有效地抑制4T1腫瘤的轉移並提高小鼠乳腺腫瘤切除模型中動物的存活率。BP-E顯著地降低腫瘤誘導的脾臟腫脹現象，且實質上，其可具體地抑制顆粒球MDSCs的分化及功能活性，並使這些細胞在試驗小鼠中的細胞群體減少。生物有機化學分析顯示來自BP-E的F1分餾物的特定聚乙炔糖苷為負責所偵測到的MDSC及抗轉移活性的主要植物化學成分。本研究的發現說明來自大花咸豐草的特定聚乙炔化合物或F1分餾物可立即且高度地純化出，且其對於未來植物藥的發展而言是有用的應用。
本研究發現，在帶有腫瘤的小鼠的小鼠4T1乳腺癌模型中不同階段的模式裡可偵測到高度表現的G-CSF及gMDSC細胞群體。大花咸豐草乙醇萃取物(BP-E)表現出高度的免疫調節能力，使其可有效地抑制由G-CSF誘導的活體外骨髓細胞分化成gMDSCs，並具有高度抑制腫瘤切除模型中的4T1腫瘤轉移的潛力。大花咸豐草乙醇萃取物(BP-E)可有效地抑制轉移，並提高小鼠乳腺腫瘤切除模型中動物的存活率。BP-E顯著地減少因腫瘤誘導的脾臟腫大，且直接地，其可特定地抑制顆粒球MDSCs的分化及功能活性，並且使這些細胞在試驗小鼠中的細胞群體減少。
本研究進一步證實由口服輸送BP-E可經由抑制試驗小鼠中gMDSCs的分化及功能而抑制腫瘤轉移。生物有機化學分析顯示，特定的聚乙炔糖苷族群，其大部分組合物(≥ 89%)為BP-E的F1分餾物，可明顯地作為對於活體外及體內MDSC活性，以及所得體內抗轉移活性有功效的活性植物化學成分。此說明了BP植物萃取物或其衍生的乙醇分餾物中的植物化學成分可能具有治療或其他臨床應用。
實例
根據本發明的實施例的示例性儀器、裝置、方法以及其相關結果說明如下。
材料與方法
植物組織的萃取、化合物的分離及鑑定
大花咸豐草（Bidens pilosa Linn. var. Radiata）(菊科)植物係生長於2013年的台灣省台北市三峽區。整株植物的風乾芽苗、葉及根部組織，重量為228.2g，將其置於2.28公升的95%乙醇(EtOH)中在室溫下萃取三天。在真空下使這個總粗萃取物蒸發而獲得乾燥的殘餘物(6.3955g)，然後將其重新懸浮在甲醇(MeOH)中，並使用以極性降低的水-MeOH混合物，在PR-18製備型HPLC管柱[COSMOSIL™ C18, 4.6mm x 250mm]中，以0.5 ml/min的流速進行沖提，並在UV 235 nm下進行偵測，而獲得總數為4的次分餾物(F1-F4)。在滯留時間為40分鐘至46分鐘時收集F1(由PR-18管柱，沖提液為73.5% MeOH/水)，並鑑定為生物活性分餾物。亦以相同的方式，使用70%至72%的MeOH/水進行F1的重複分離，而用於進一步的體外及體內試驗。
接著藉由RP-18 UPLC管柱[Acquity UPLC HSS C-18 column 2.1x150mm, 1.8um]進行F1的層析，並以含0.2%三氟醋酸(TFA)的30%至32%乙腈(ACN)進行沖提而獲得總共4個2nd 次分餾物，FF. A-FF. D。進一步以PR-18製備型HPLC管柱[COSMOSIL™ C18, 10mm x 250mm]從Fr.1 (40 mg)中分離出這些 2nd 次分餾物，並以含0.05% TFA 的31.2% CAN進行沖提而獲得化合物A (FF. A, 7 mg)、化合物B (FF. B, 10 mg)、以及化合物C (FF. C+D, 18.79 mg)。以NMR及MS/MS數據比對出其結構：2-β-D-吡喃葡萄糖氧基-1-羥基-5(E)-十三烯-7,9,11-三炔(A )、2-D-吡喃葡萄糖氧基-1-羥基十三碳-5,7,9,11-四炔(B )、以及3-β-D-吡喃葡萄糖氧基-1-羥基-6(E)-十四烯-8,10,12-三炔化合物(C )。
動物試驗
將4T1-luc2細胞(5 × 105 個細胞/100 μl PBS)原位植入BALB/c小鼠的乳房脂肪墊。藉由每7天測量腫瘤重量以及監測乳房腫瘤的生物冷光影像(BLI)以評估原發性腫瘤的生長。對於腫瘤切除小鼠模式而言，將4T1-luc2細胞 (5 × 105 個細胞/100 μl PBS) 原位植入試驗小鼠的乳房脂肪墊中。在腫瘤植入後第21天，溫和地以手術將腫瘤塊移除。使用非侵入式體外影像系統(IVIS)監測轉移腫瘤的生物冷光影像。試驗小鼠的體重約略為25 g。
建構 4T1-luc2 細胞
以pMD.G、pCMVΔR8.91、以及pIF4g.As2.luc.bla轉染293T細胞以建構帶有luc2基因的慢病毒。24小時後，收集細胞培養基並加入而以建構的病毒轉染細胞。使用10 μg/mL滅瘟素S (blasticidin S)篩選4T1-luc2細胞的單一殖株。在37°C及5% CO2及95%濕度下，將4T1-luc2細胞培養並維持於補充有10 μg/mL 滅瘟素S、10%胎牛血清、1 mM 青黴素/鏈黴素、以及1 mM丙酮酸鈉的RPMI-1640中。
細胞群體分析
收取試驗小鼠的肺部組織並在組織切碎器中以150 U/mL的第一型膠原蛋白酶(Type I Collagenase)將其切碎20至50次。以ACK緩衝液進行消化並水解後，收集被切碎的組織並以40 µm細胞濾網過濾。在組織切碎器中以PBS將脾臟組織切碎。以ACK緩衝液進行水解後，收集細胞以進行進一不分析。以ACK緩衝液水解血液3次，收集後進行進一步分析。收集所有細胞，並以抗-CD11b及抗-Ly6G/Ly-6C進行染色而以流式細胞儀分析。
gMDSCs分離
為了純化Ly-6G+ MDSCs，收取帶有腫瘤小鼠的脾臟細胞並以ACK緩衝液將紅血球去除。然後，以抗-Ly-6G-生物素抗體與脾臟細胞一起培養20分鐘，接著使用抗-生物素微珠，依照製造商(MiltenyiBiotec)的操作流程進行陽性篩選。
骨髓細胞製備
以ACK裂解緩衝液將來自BALB/c小鼠股骨和脛骨的骨髓細胞中的紅血球去除，並在37℃，含5 % CO2 的增濕培養箱中將其培養於補充有20 ng/ml GM-CSF、10 %胎牛血清、50 μM 2-巰基乙醇、100 unit/ml青黴素及100 μg/ml鏈黴素的RPMI 1640培養基中。
免疫墨點
使用M-PER哺乳動物蛋白質萃取試劑 [5mM bicine緩衝液、4-(2-氨乙基)苯磺醯氟 (AEBSF 0.3 mM)、亮肽素(10 μg/ml)以及抑肽酶(2 μg/ml)]製備細胞裂解物。以梯度為5%至20%的聚丙烯醯胺-十二烷基硫酸鈉(SDS)膠體(每一條帶有20 μg的蛋白質)進行裂解物的電泳分析，將蛋白質轉印至Hybond-ECL薄膜(GE-Healthcare, Amersham, UK)上，並以抗-G-CSFR抗體、抗-stat3抗體及抗-磷酸化stat3抗體進行免疫墨點分析。以增強的化學冷光偵測蛋白質條帶(Clarity Western ECL Substrate, BioRad)並以放射自顯影法呈現。
以ELISA偵測血清 G-CSF
收集來自試驗小鼠的血清及條件培養基，並儲存在-80ºC 下直到進行檢測。確認樣本中G-CSF (R&D Systems) 的表現量，並使用BiotekPowerWave HT 分光光度計在450 nm的波長下進行定量。
抗體
抗-stat3抗體及抗-磷酸化stat3抗體係購自Cell Signaling Technology。抗-G-CSFR抗體係購自Abcam。
統計分析
數據以倍率變化或以圖例中所指的平均值± s.e.m.的百分比表示。使用GraphPad軟體進行所有統計分析。當進行多個數據組間的比較時，以Tukey–Kramer方法執行單向ANOVA分析。
結果
帶有小鼠4T1腫瘤的小鼠血液和脾臟組織中骨髓 來源抑制細胞群體及 G-CSF 含量的變化。
據顯示，在癌症病患中MDSCs的細胞群體會有擴增現象。據顯示，顆粒細胞聚落刺激因子(G-CSF)是由腫瘤細胞分泌而可介導MDSC產生的關鍵細胞因子。為了鑑定帶有4T1腫瘤的小鼠中MDSC細胞群體的動態變化以及G-CSF的表現，將基因轉殖的4T1-luc2細胞原位植入試驗小鼠的乳腺脂肪墊中。每週紀錄原位4T1-luc2腫瘤生長的代表性生物冷光影像(圖1A)。測定試驗小鼠腫瘤中生物冷光強度(BLI)及G-CSF含量。根據時間進程圖譜如同在試驗小鼠中所觀察到的G-CSF表現量，在腫瘤植入後第7天至第42天的小鼠中可測到高量的BLI(即，BLI＞ 2 × 109 光子/秒)(圖1B)。周邊血液白血球(WBCs)中表現有CD11b+ Ly6G+ 的gMDSCs細胞群體在第7天時達到66.7%，且從第14天至第42天皆維持在高量(總WBCs的89%至52%)(圖1C)。從第14至第42天，可在試驗小鼠的脾臟中偵測到高量的gMDSCs(≧35%的脾臟細胞)(圖1C)。發現在周邊血液及脾臟組織的WBCs中，表現有CD11b+ Ly6C+ 的單核球MDSCs (mMDSCs)有1%~6%(圖1C)。此外，在腫瘤植入後，試驗小鼠的腫瘤及脾臟組織重量再第7天到第21天之間逐漸增加，但在第21天時大幅增加(圖1D)。
gMDSCs 、 G-CSF 的表現量和腫瘤生長及轉移速率之間的關聯性
先前顯示在小鼠模型中，gMDSCs及G-CSF的表現量與腫瘤生長的進程密切相關。為了探討gMDSCs及G-CSF在小鼠乳腺腫瘤的生長及轉移中所扮演的角色，將4T1-luc2細胞原位植入試驗小鼠的乳腺脂肪墊中。在腫瘤植入後第21天，溫和地以手術移除原發性腫瘤塊。每週測量腫瘤生物冷光強度以及G-CSF表現量(圖2A)。在腫瘤切除後第21天，試驗小鼠血清中的G-CSF表現量很快地大幅降低，代表在帶有4T1腫瘤的小鼠中所偵測到的高量G-CSF主要由腫瘤塊的細胞所分泌(圖2A)。腫瘤切除後，在帶有轉移腫瘤的試驗小鼠的血液血清中，會逐漸恢復高量的G-CSF表現量。在試驗小鼠中G-CSF表現模式與顆粒球MDSCs細胞群體的增加成高度相關(圖2B)，而在試驗小鼠中G-CSF含量的增加則與腫瘤切除後的小鼠存活時間呈負相關(圖2B-C)。這些結果說明gMDSC細胞群體可被分泌G-CSF的腫瘤細胞有效地誘導，而腫瘤中的基質細胞可促進腫瘤生長及轉移。本文進一步共同注射4T1腫瘤細胞(5 × 105 個細胞)及gMDSCs (1 × 107 個細胞)至測試小鼠的乳腺脂肪墊中。在腫瘤植入後第18天，溫和地以手術移除原發性腫瘤塊。試驗結果顯示共同移植的gMDSCs的確可促進腫瘤生長及轉移(圖2D-E)。所有經過gMDSC共同治療的小鼠在腫瘤移除後第34天即死亡，然而，有60%的對照組小鼠可維持生命而無轉移現象(圖2E)。因此證明，MDSCs及G-CSF可做為一種治療標靶的組合物，而用於預防乳腺腫瘤生長及轉移。
大花咸豐草乙醇萃取分餾物 (BP-E) 對於 MDSCs 的功能及分化活性以及對於 G-CSF 表現量的效應
為了開發針對腫瘤的治療藥物，針對多種植物萃取物或衍生的植物化學成分對於MDSCs的功能及分化上的抑制效果進行驗證。據發現，大花咸豐草(BP-E)植物萃取物的一種乙醇分餾物可顯著地抑制經由G-CSF誘導而在活體外使骨髓細胞分化成gMDSCs(圖3A)。由MTT測定法顯示，在100及12.5 mg/ml的濃度間，BP-E對於骨髓細胞及衍生的MDSCs的細胞活性無顯著的影響(圖3B)。流式細胞儀分析的結果顯示，BP-E可依不同劑量而顯著地抑制顆粒球MDSCs中活性氧族群(ROS)的生成(圖3C-D)。
大花咸豐草的乙醇分餾植物化學成分 (BP-E) 對於腫瘤轉移的效應
為了驗證口部餵食BP-E對於腫瘤生長的潛在抑制效果，將4T1-luc2小鼠乳腺癌細胞原位植入試驗小鼠的乳腺脂肪墊中，接著在腫瘤切除模型中進行驗證。在腫瘤植入後第7天，將試驗小鼠隨機分成未經治療及經BP-E治療的組別(藉由強迫餵食而補充，口服劑量為100 mg BP-E/kg體重/天)。
圖4A顯示，如所測量的腫瘤體積變化所示，BP-E對於原發性腫瘤的生長無顯著影響。接著，探討在腫瘤切除模型中，以口服給藥BP-E是否對於腫瘤轉移有影響。針對這個試驗，在原位腫瘤植入後第21天，將試驗小鼠中4T1-luc2腫瘤的組織塊以手術移除。然後將試驗動物隨機分成對照組(未治療)及經BP-E治療組(100 mg BP-E /kg/天)。圖4B顯示腫瘤切除後第7天，各試驗組中轉移腫瘤的生物冷光影像分析結果。圖4C顯示對照組的轉移發生率為62.5%(n=8)，而BP-E組的轉移率則僅12.5%。這是令人驚訝的巨大差異，而數據也可藉由生物冷光影像(BLI)數值的鮮明對比而得到強烈的支持，參見圖4B。
重要的是，需注意，在腫瘤切除模型中，在非常短的時程中，僅需7天，BP-E餵食即可有效地抑制腫瘤轉移。同樣重要的是指出目前的腫瘤切除模型是設計來模擬目前人類乳癌病患在手術後所接受的治療。腫瘤植入後第80天，對照組小鼠的轉移率及死亡率達到100%的程度。結果再次強烈的說明，早期出現的抗轉移效果可成功地維持一段延長的時間。相對地，經BP-E治療小鼠的轉移率及死亡率則分別維持在25%及12.5%(圖4C-D)。
在接續的實驗中，在腫瘤植入後第42天將小鼠犧牲，根據圖4C-D所示的差異。圖4E所示的結果顯示4T1腫瘤細胞會誘發強烈的脾臟腫大，而BP-E則可大幅地降低此一由腫瘤誘發的脾臟腫大(P＜0.05)(圖4E)。
探討各試驗組脾臟組織中骨髓來源抑制細胞(MDSC)的細胞群體。4T1腫瘤的生長強烈地誘導脾臟中顆粒球MDSCs的累積，而BP-E則有效地降低(具有≧50%的抑制效果)因腫瘤所誘導的脾臟中gMDSCs的累積。此外，4T1腫瘤細胞亦可稍微增加脾臟中單核球MDSC細胞群體，而以BP-E治療則會抑制脾臟中的這種效果，此意指BP-E不但可有效地抑制gMDSC的生成，亦可抑制mMDSC的生成。
BP-E 的 F1 分餾物 (BP-E-F1) 對於 MDSCs 中 ROS 的表現以及對於由骨髓細胞而來的 MDSCs 的分化狀況的效應
為了鑑別來自BP-E植物萃取物且具有抗轉移活性的活性候選成分或植物化學分，藉由使用HPLC分析法，UV在235 nm的吸光度下將BP-E進一步分餾成4個次分餾物(F1至F4)(圖5A)。在活體外的培養條件下，驗證這4個次分餾物對於抑制MDSCs的分化及ROS的表現效果。圖5B顯示，BP-E以及所衍生的F1分餾物可顯著地抑制由G-CSF誘導的gMDSCs的分化。在者，F1分餾物亦可強烈地抑制gMDCS中ROS的表現(圖5C及D)。這些結果說明，F1分餾物可能含有BP-E的關鍵植物化學成分，其負責抑制MDSCs的分化及功能，以及所產生的抗腫瘤轉移活性。
F1 植物化學成分的化學鑑定結果
使用UPLC、HPLC、NMR及MS/MS檢測法進行F1分餾物植物化學成分的生物有機化學圖譜分析。一開始使用RP-18 UPLC管柱進行F1分餾物的層析，並分離出三個主要的化合物(A-C)(圖6A)，接著藉由分光光度計法鑑定其化學結構(圖6B)。經由MS/MS、NMR以及先前的研究比對並分析出化合物A，2-β-D-吡喃葡萄糖氧基-1-羥基-5(E)-十三烯-7,9,11-三炔，化合物B，2-D-吡喃葡萄糖氧基-1-羥基十三碳-5,7,9,11-四炔，以及化合物C，3-β-D-吡喃葡萄糖氧基-1-羥基-6(E)-十四烯-8,10,12-三炔化合物。在F1分餾物中化合物A-C的含量為89.26%(圖6B)。
BP-E-F1 對於腫瘤轉移的效應
由於本研究可將BP-E萃取物的植物化學成分分離成四個主要的分餾物，本研究探討BP-E的F1分餾物，稱為BP-E-F1，對於原位乳腺腫瘤生長/腫瘤切除小鼠模型中的可能抑制腫瘤生長的效果。腫瘤植入後第7天，將試驗小鼠隨機分成未治療及BP-E-F1組(即，以5 mg的 BP-E-F1/kg體重/天進行口服治療)。圖7A顯示，如同口服給藥BP-E，在測量腫瘤體積後得知，BP-E-F1治療對於原發性腫瘤生長具有少量影響，或者無顯著效果。
本文探討BP-E-F1對於腫瘤切除模型中腫瘤轉移的影響。植入後第21天，溫和地以手術移除腫瘤塊。經手術後，將各治療組別隨機分成對照組、F1以及多西紫杉醇組(即，每隔3天經由靜脈內注射10 mg多西紫杉醇/kg)。圖7B顯示，腫瘤切除後第23天，各試驗組中轉移腫瘤的生物冷光影像結果。針對各試驗組的小鼠，定量地測量並匯集其BLI值。由圖7C所顯示出的幾乎相同圖案，可說明，口服給藥BP-E-F1以及靜脈內注射多西紫杉醇兩者皆可有效地降低由試驗小鼠中所觀察到的BLI值。此外，腫瘤切除後第23天所測得的對照組、F1以及DTX組小鼠的轉移率分別為62.5%、12.5% 及12.5% (圖7D)。可發現，不同治療組別的試驗小鼠體重是有區隔的(圖7E)。不同於以多西紫杉醇治療，BP-E-F1治療不僅不會造成試驗小鼠的體重減少，反而呈現出可使其體重增加的效果。
腫瘤切除後第23天將小鼠犧牲，並摘除試驗小鼠的肺臟、肝臟及脾臟，而藉由生物冷光影像測量腫瘤轉移情況。圖7F顯示，肺臟為試驗小鼠中，4T1腫瘤細胞較佳的轉移器官，而以BP-E-F1以及多西紫杉醇治療可有效地抑制腫瘤轉移至肺部。以F1分餾物或多西紫杉醇治療可顯著地降低試驗小鼠肺部、周邊血液及脾臟中，由4T1腫瘤所誘導的顆粒球MDSCs的累積(圖7G)。
BP-E-F1抑制MDSC對於腫瘤生長及轉移的活性
結果說明BP-E和其F1分餾物可經由抑制骨髓細胞分化成MDSCs以及在腫瘤微環境中MDSCs的累積而有效地抑制腫瘤轉移。在接續的試驗中，注射4T1細胞，或與顆粒球MDSCs共同注射至試驗小鼠的乳腺脂肪墊中。腫瘤植入後第7天，每天針對小鼠進行口服餵食F1(5mg/kg)。腫瘤植入後第18天，溫和地以手術移除試驗小鼠的腫瘤塊，並進行測量。圖8A-B顯示，如每週測量腫瘤體積及腫瘤塊所得結果，F1治療可顯著地抑制MDSCs對於腫瘤生長的效果(圖8A-B)。此外，經F1治療可顯著地抑制腫瘤切除後由MDSC所促進的腫瘤轉移(圖8C-D)。本文的發現說明MDSC的活性在4T1腫瘤轉移中扮演重要角色，且可做為一種對抗腫瘤生長及轉移的治療標的。BP-E及BP-E-F1可經由抑制骨髓細胞分化成MDSCs以及在特定腫瘤微環境中MDSCs的累積而抑制4T1腫瘤轉移。
綜上所述，本文建立一個小鼠乳腺4T1-luc2原位、腫瘤切除以及後續腫瘤轉移的小鼠模型。本文系統性地探討MDSCs在腫瘤生長及轉移中的角色。本文的發現提供一種對抗具有高度MDSCs分化活性的癌症的免疫療法策略。顆粒球MDSCs(gMDSCs)為累積在帶有4T1腫瘤的小鼠的周邊血液及脾臟組織中的主要MDSC細胞群體，其出現在腫瘤生長的早期至後期(圖1C)。在腫瘤植入後第21天，現有腫瘤部位中gMDSCs的百分比可上調至27%(數據未呈現)，而4T1腫瘤細胞可表現一貫高量的G-CSF，而造成試驗小鼠中誘導出大量的gMDSC。腫瘤部位及脾臟組織被認為是MDSCs及其前驅細胞主要的儲存處。由於gMDSCs的大量累積，帶有腫瘤的小鼠的脾臟及腫瘤部位將急遽且快速的腫脹，如腫瘤植入後第21天的結果所示(圖1D)。gMDSC數量及其活性的大量增加可有效地劫持宿主免疫系統，並使其無法有效地誘發抗腫瘤免疫反應。gMDSCs在促進腫瘤生長及轉移的功能可進一步被本文的結果所證實，相較於僅植入腫瘤細胞而言，將腫瘤細胞及gMDSCs共同植入試驗小鼠的乳腺脂肪墊中的試驗使腫瘤有較大的重量且有較高的轉移發生率(圖2D-E)。MDSCs被清楚地證明其在掌管腫瘤誘導的免疫抑制、促進對抗宿主免疫的腫瘤生長及轉移中扮演重要角色。因此，相較於直接靶向並殺死腫瘤細胞而言，有效地控制及抑制MDSC的生成可考慮用於特定病患，且針對其進行個別地修飾或監控，而作為可行的癌症免疫療法的策略。
手術及放射線治療是目前治療各種癌症的標準方法，其往往對於原發性腫瘤部位中原發腫瘤的控制是有效的。然而，轉移性疾病的醫治或治療仍然遭遇很大的挑戰。越來越多的證據證明作為轉移性癌症的全身性療法的化療，並非對於所有癌症患者皆有利，反而損害宿主免疫，進而導致其促進腫瘤生長和擴散。本發明證明口服給藥BP-E植物萃取物及衍生的F1植物化學成分可顯著地抑制4T1乳腺轉移。
F1分餾物對於抑制轉移及MDSC累積的功效恰好與使用多西紫杉醇進行治療的效果一樣好(圖7)。在者，相較於以多西紫杉醇治療的小鼠而言，將主要為三個特定聚乙炔的BP-E-F1植物化學成分進行小鼠餵食，結果顯示其表現出較佳的一般健康狀況。以聚乙炔植物化學成分進行治療，不同於多西紫杉醇，其不會造成試驗小鼠體重的減少(圖7E)或脫髮。藉由直接比較F1分餾物與目前所使用的臨床藥物多西紫杉醇的功效性、藥物輸送的容易性以及細胞毒性及其他副作用，本文證明BP-E及所衍生的BP-E的F1分餾物的聚乙炔可能在臨床應用上有高度潛力，作為新一代的抗癌藥劑，可與現存的化療藥同時或一併使用。
對於藥物應用而言，將在血液循環中試驗藥物可達到系統性劑量的給藥劑量分率被定義為生物利用率。首先決定在試驗小鼠血液中BP-E-F1分餾物的三個主要聚乙炔糖苷化合物(A、B、C)的絕對生物利用率。利用口服給藥探討F1分餾物對於抑制4T1轉移的效果。經由靜脈內(iv)或口服輸送而將F1分餾物給藥予BALB/c小鼠(n=12)，兩者劑量皆為10mg/kg，以評估F1化合物(A-C)的生物利用率。經由試驗而獲得口服給藥以及靜脈內給藥的曲線下面積(AUC)，分別為282.8及1268mg.min/l(圖9A-B)。因而可計算出口服給藥的生物利用率為22.3%。接著，在經由口服給藥而完成F1分餾物的給藥後，測定在骨骼、腎臟、肝臟、肺臟及脾臟組織中三個化合物(A-C)的存在與否以及其濃度。在口服給藥F1後2小時，收集試驗小鼠的不同器官(n=3)。偵測不同器官中該三個化合物(A-C)的濃度。這結果說明，在口服給藥予BALB/c小鼠後20分鐘至2小時，F1分餾物的化合物(A-C)在血清、腎臟、骨骼、肝臟、肺臟及脾臟組織中維持在相對的高濃度，意指F1分餾物的活性植物化合物可立即且直接地被血液循環及標的器官所吸收，進而可有效於抑制gMDSCs的發育及功能。令人驚喜的是，經由口服給藥，可使這些BP-E/F1植物化學成分更具有立即的生物利用率。
在體外及體內情況下，F1分餾物可顯著地抑制從骨髓細胞分化成MDSCs的活性以及MDSCs的功能性。腫瘤來源的G-CSF被證明在促進gMDSC的發育上扮演重要的角色。為了探討F1分餾物在抑制gMDSC分化上的機能性作用，本發明亦採用以重組G-CSF進行靜脈給藥的方法以引發gMDSC的活性。以重組G-CSF進行靜脈內給藥可顯著地增加試驗小鼠周邊血液中顆粒細胞的百分比，從16.1%(在未經治療小鼠中的含量)至49.1% (圖10A)。這種活性可在體外，明顯地刺激試驗骨髓細胞中STAT3的磷酸化，其為調控MDSCs分化及功能的主要轉錄因子(圖10B)。口服餵食F1可部分地抑制被治療小鼠周邊血液中的顆粒細胞百分比(圖10A)，且可有效地降低經G-CSF治療的小鼠中骨髓細胞的STAT3磷酸化的程度(圖10B)。在一個活體外的試驗中，以BP-E及F1進行治療亦可顯著地降低gMDSCs的STAT3磷酸化程度(圖10C)。綜上所述，這些結果說明BP-E及BP-E-F1可藉由抑制由腫瘤誘導的STAT3活化而有效地抑制gMDSCs的分化及功能。本文說明，可使用來自傳統藥物植物，大花咸豐草的BP-E以及BP-E-F1聚乙炔，作為新的類別，供開發出天然植物性產物所衍生的免疫治療藥劑，以用於對抗癌症。
無
圖1A-D顯示帶有小鼠4T1腫瘤的小鼠血液和脾臟組織中骨髓來源抑制細胞群體及G-CSF含量的變化。在試驗小鼠中原位植入5 × 105 個4T1-luc2細胞，每週以非侵入式生物冷光影像進行監測。(A)帶有腫瘤小鼠的代表性每週生物冷光影像。(B)試驗腫瘤(A)的生物冷光影像(BLI)定量結果以及在帶有腫瘤小鼠中血清G-CSF的表現量(白色長條)。(C)血球細胞中gMDSCs及mMDSCs(實線)以及帶有腫瘤小鼠中脾臟細胞(虛線)的群體分佈，以流式細胞儀進行分析。(D)在帶有腫瘤小鼠中腫瘤塊(實線)以及脾臟(虛線)的重量。
圖2A-E顯示gMDSCs、G-CSF的表現量和腫瘤生長及轉移速率之間的關聯性。在試驗小鼠中原位植入5 × 105 個4T1-luc2細胞，而在腫瘤植入後第21天時切除原發性腫瘤。(A)在腫瘤切除小鼠中生物冷光影像(BLI，黑色長條)及血清G-CSF含量(白色長條)的定量結果，其係在第7天及第35天間進行評分。(B)在腫瘤切除小鼠中gMDSCs的群體頻率與血清G-CSF含量間的關聯性。(C)存活時間(天)及血清G-CSF含量間的關聯性。(D)將4T1細胞(5 × 105 )及顆粒球MDSCs共同原位注射至試驗小鼠中，而在腫瘤植入後第18天時切除原發性腫瘤。顯示兩個試驗組中的腫瘤塊。(E)顯示僅以4T1進行治療(實心圓形)與4T1加上MDSC(實心正方形)進行治療的小鼠中無轉移的發生率。
圖3A-E顯示大花咸豐草乙醇萃取分餾物(BP-E)對於MDSCs的功能及分化活性以及對於G-CSF表現量的效應。(A)以流式細胞儀確認在經治療的骨髓細胞中顆粒球MDSCs的群體。(B)BP-E對於骨髓細胞的細胞毒性，經治療後24小時以MTT檢測法呈現。(C)在經BP-E治療的4T1細胞中G-CSF受體的表現情況，以西方墨點分析法呈現。(D)以序列濃度(12.5至100 μg/mL)的BP-E治療細胞24小時，將細胞與H2 DCFDA螢光探針一起培養後測量MDSCs中ROS的表現。(E)活體外BP-E對於骨髓細胞的細胞毒性，以MTT檢測法呈現24小時的結果。
圖4A-E顯示由大花咸豐草的乙醇餾分植物化學成分(BP-E)對於腫瘤轉移的效應。(A)顯示未經治療及經BP-E治療的小鼠的腫瘤體積。(B)在腫瘤切除後第7天，未經治療及經BP-E治療的小鼠的生物冷光影像。(C)在對照組及經BP-E治療組別的小鼠中無轉移的發生率。(D)試驗小鼠的存活率。(E)顯示腫瘤切除後第21天，試驗小鼠脾臟組織的重量。
圖5A-D顯示BP-E的F1分餾物 (BP-E-F1)對於MDSCs中ROS的表現以及對於由骨髓細胞而來的MDSCs的分化狀況的效應。(A) 以UV 235nm吸光值的HPLC圖譜而將BP-E分成4個主要的次分餾物(F1、F2、F3、及F4)。(B)以流式細胞儀分析在經治療的細胞中由骨髓細胞分化而得的MDSCs的細胞數。(C) 以流式細胞儀分析在經治療的細胞中由骨髓細胞分化而得的MDSCs的細胞群體。(D)以10 μg/mL的四個次分餾物(F1, F2, F3, and F4)治療細胞24小時，將細胞與H2 DCFDA螢光探針一起培養後測量MDSCs中ROS的表現。
圖6A-B顯示F1植物化學成分的化學鑑定結果。(A)以RP-18 UPLC管柱分析得的F1分餾物層析圖。(B)以光譜法鑑定F1中的3個主要化合物的化學結構(2-β-D-吡喃葡萄糖氧基-1-羥基-5(E)-十三烯-7,9,11-三炔、2-D-吡喃葡萄糖氧基-1-羥基十三碳-5,7,9,11-四炔、以及3-β-D-吡喃葡萄糖氧基-1-羥基-6(E)-十四烯-8,10,12-三炔化合物)。
圖7A-G顯示BP-E-F1對於腫瘤轉移的效應。(A)顯示對照組及BP-E-F1組小鼠的腫瘤體積。(B)顯示在腫瘤切除後第23天所有試驗小鼠的生物冷光影像。(C)所有試驗小鼠全身生物冷光影像的定量數據。(D)經對照組、BP-E-F1以及多西紫杉醇治療的小鼠中無轉移的發生率。 (E)所有試驗小鼠的體中。(F)顯示腫瘤切除後23天，試驗小鼠的肝臟、肺臟、及脾臟的代表性生物冷光影像。(G)以流式細胞儀測定試驗小鼠選定器官中的顆粒球及單核球細胞MDSCs的群體。
圖8A-D顯示BP-E-F1抑制MDSC對於腫瘤生長及轉移的活性。(A)對照組、BP-E-F1、以及BP-E-F1 + MDSCs組小鼠的腫瘤體積。(B)腫瘤植入後18天所有試驗組的腫瘤重量。(C)所有試驗組中無轉移的發生率。(D)腫瘤切除後14天所有試驗組中的生物冷光影像。
圖9A-B顯示F1分餾物的藥物動力學研究結果。(A)以液相層析儀-串聯式質譜儀(LC/MS/MS)測定試驗血清中F1分餾物中的三個化合物(A-C)的濃度。然後，藉由曲線下的口服給藥劑量修正面積(AUC)除以靜脈給藥的AUC而決定口服給藥的絕對生物利用率。(B)收集經BP-E-F1治療的小鼠中骨骼、腎臟、肺臟、肝臟及脾臟組織，並以液相層析儀-串聯式質譜儀(LC/MS/MS)測定三種化合物(A、B及C)的濃度。
圖10A-C顯示F1分餾物抑制經G-CSF-誘導的顆粒細胞分化及訊息傳導。(A)使用血液分析儀測定試驗小鼠周邊血液中顆粒細胞的細胞數。(B)以西方墨點分析法測定代表性骨髓細胞中磷酸化STAT3及總STAT3的表現情況。(C) 以西方墨點分析法測定經治療的活體外gMDSCs中磷酸化STAT3及總STAT3的表現情況。
無
無

Claims (14)

  1. 一種醫藥組合物在製造用於在有需要的個體中抑制、減少、阻斷及/或預防腫瘤轉移的藥劑的用途，該醫藥組合物包含：(i)治療有效劑量的大花咸豐草(Bidens pilosa)乙醇萃取物，或超過一個由大花咸豐草乙醇萃取物中純化出或分離出的聚乙炔化合物；以及(ii)藥學上可接受載體。
  2. 如請求項1的用途，其中該醫藥組合物包含式(I)、(II)及(III)化合物：
    Figure TWI619500B_C0001
    ，和
  3. 如請求項2的用途，其中該醫藥組合物包含至少80%(wt/wt)的2-β-D-吡喃葡萄糖氧基-1-羥基-5(E)-十三烯-7,9,11-三炔、2-D-吡喃葡萄糖氧基-1-羥基十三碳-5,7,9,11-四炔、以及3-β-D-吡喃葡萄糖氧基-1-羥基-6(E)-十四烯-8,10,12-三炔化合物。
  4. 如請求項2的用途，其中該醫藥組合物包含：(a)2-β-D-吡喃葡萄糖氧基-1-羥基-5(E)-十三烯-7,9,11-三炔，(b)2-D-吡喃葡萄糖氧基-1-羥基十三碳-5,7,9,11-四炔，以及(c)3-β-D-吡喃葡萄糖氧基-1-羥基-6(E)-十四烯-8,10,12-三炔，其比例範圍由1：1：1至1：2：4。
  5. 如請求項1的用途，其中該個體患有乳癌，或者是接受癌症手術的術後病患。
  6. 如請求項1的用途，其中該大花咸豐草(Bidens pilosa)乙醇萃取物或超過一個由大花咸豐草乙醇萃取物中純化出或分離出的聚乙炔化合物的劑量係有效於抑制顆粒球骨髓來源抑制細胞(gMDSCs)的分化、功能活性、及細胞群體，以及在不對gMDSCs造成細胞毒性或使其凋亡的情況下抑制腫瘤轉移。
  7. 如請求項1的用途，其中該醫藥組合物係選自由口服劑型、靜脈內給藥劑型、肌肉內給藥劑型及皮下給藥劑型所組成的群組中的劑型。
  8. 如請求項1的用途，其中該大花咸豐草(Bidens pilosa)乙醇萃取物或超過一個由大花咸豐草乙醇萃取物中純化出或分離出的聚乙炔化合物的劑量係有效於抑制腫瘤轉移至有需要的個體的肺部，以及使顆粒球MDSCs累積在肺部、周邊血液及脾臟中。
  9. 如請求項1的用途，其中該大花咸豐草乙醇萃取物為：(i)由裝載了含有大花咸豐草的乙醇萃取物混合物的HPLC管柱所洗提出的第一分餾物；或(ii)大花咸豐草乙醇萃取物的重複再層析分餾物。
  10. 如請求項9的用途，其中該大花咸豐草乙醇萃取物包含不少於89%(w/w)的聚乙炔化合物。
  11. 一種醫藥組合物在製造用於在有需要的個體中抑制顆粒球骨髓來源抑制細胞(gMDSCs)的分化、功能活性、及細胞群體，以及抑制腫瘤轉移的藥劑的用途，該醫藥組合物包含：(i)治療有效劑量的大花咸豐草(Bidens pilosa)乙醇萃取物，或超過一個由大花咸豐草乙醇萃取物中純化出或分離出的聚乙炔化合物；以及(ii)藥學上可接受載體。
  12. 如請求項11的用途，其中該醫藥組合物包含式(I)、(II)及(III)化合物：
    Figure TWI619500B_C0004
    Figure TWI619500B_C0005
    ，和
    Figure TWI619500B_C0006
  13. 如請求項11的用途，其中該個體患有乳癌，或者是接受癌症手術的術後病患，或有需要進行癌症轉移控制、阻斷或預防的病患。
  14. 如請求項11的用途，其中該醫藥組合物包含至少80%(wt/wt)的2-β-D-吡喃葡萄糖氧基-1-羥基-5(E)-十三烯-7,9,11-三炔、2-D-吡喃葡萄糖氧基-1-羥基十三碳-5,7,9,11-四炔、以及3-β-D-吡喃葡萄糖氧基-1-羥基-6(E)-十四烯-8,10,12-三炔化合物。
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