CN117721171A - 在细胞增殖过程中的氯化钴的加入方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞实验领域，尤其涉及一种在细胞增殖过程中的氯化钴的加入方法，该方法包括激活实验载体；选择待培养人心肌细胞组；将所述待培养人心肌细胞组置于所述实验载体上进行增殖；在增殖过程中的选定的加入时刻加入若干浓度的氯化钴；通过利用实时无标记细胞分析仪记录的待培养人心肌细胞的成长情况确定在最佳加入时刻加入氯化钴的最佳浓度；按照最佳浓度和最佳加入时刻培养人心肌细胞以模拟构建待培养细胞在低氧环境下的活力状态，以进行观察或实验。通过培育人心肌细胞，并利用人心肌细胞在不同浓度的氯化钴加入之后的增殖状态来模拟人心肌细胞在低氧环境下的状态，便于进行低氧环境下的有效实验和观察，提高营造低氧环境的效率。
Description
技术领域
本发明涉及细胞实验领域，尤其涉及一种在细胞增殖过程中的氯化钴的加入方法。
背景技术
心血管疾病（cardio vascular disease，CVD）是目前人类健康的头号杀手，全球每年死于心血管疾病的人数多于其它任何原因。随着人民生活水平的提高和饮食结构的变化，心血管疾病的患病率和死亡率仍呈明显上升趋势。
心肌细胞凋亡参与多种心血管疾病病理生理过程，包括原发性高血压、缺血性心脏病和再灌注损伤、心肌炎、心肌病、心律失常、心脏衰竭、先天性心脏病等。心肌细胞凋亡机能异常是发生多种重症心血管病的重要机制。通过干预细胞凋亡程序的进行，抑制心肌细胞凋亡的发生，挽救心脏和心功能，已成为心血管疾病药物研究的重要方向之一。为了研究在缺血缺氧环境下心肌细胞的情况，需要模拟心肌细胞的病理环境。
公开号为CN112566646A的专利文献公开了一种用于治疗缺血和缺氧引起的组织坏死或改善心脏功能的药物，该药物含有来自非人动物的羊水和/或其提取物，和任选的药学上可接受的载体，所述羊水来自于胚龄为5-12天的鸡蛋、发育时期相对应的其他禽类的蛋、胎龄为8-20天啮齿类动物的胚胎或发育时期相对应的其他非人哺乳动物的胚胎。能促进人脐静脉内皮细胞、AC16细胞和鸡胚胎成纤维细胞的生长，提高心肌梗塞后的心脏功能，促进心肌梗死后心脏细胞再生。
但是，现有技术中对于人心肌细胞在低氧环境下的干预为药物干预，对于药物与细胞的作用过程无法监测，因此需要构建低氧环境来完成对人心肌细胞的观察和实验，但是现有构建细胞的低氧环境手段多且效果不好，且不经济。
发明内容
为此，本发明提供一种在细胞增殖过程中的氯化钴的加入方法，可以解决现有技术中构建细胞低氧环境的费用高昂进而使得对于细胞在低氧环境下的增殖观测存在局限性的问题。
为实现上述目的，本发明提供一种在细胞增殖过程中的氯化钴的加入方法，该方法包括：
激活实验载体，所述试验载体包括E-Plate16孔板和培养基；
选择待培养人心肌细胞组，所述待培养人心肌细胞组包括AC16人心肌细胞、基因过表达组人心肌细胞、过表达空载对照组人心肌细胞、基因敲降组人心肌细胞以及敲降空载对照组人心肌细胞；
将所述E-Plate16孔板从实时无标记细胞分析仪中取出，沿所述E-Plate16孔板的每个孔的边界吸掉所述培养基，以避免碰到底部电极；
对于任意需要吸掉培养基的孔而言，预先设置有标准培养孔图像M0，存储在图像对比单元内，对于任意第i培养孔在吸掉培养基之后进行图像采集，形成实际培养孔图像Mi，将所述实际培养孔图像与所述标准培养孔图像进行比较，并根据比较结果确定是否加入人心肌细胞溶液；
按照100μL/孔体积将各人心肌细胞稀释液加入E-Plate16孔板中，使每孔内所述人心肌细胞的数量为5000个；
将E-Plate16孔板在室温下静置30min，使人心肌细胞沉降到底部；
将E-Plate16孔板，移入恒温细胞培养箱中的实时无标记细胞分析仪中，平衡15min后，所述恒温细胞培养箱的温度为37℃，且占比为5%；
监测阻抗240h，每30min读取一次读数，观察各人心肌细胞的增殖曲线；
在增殖过程中的选定的加入时刻加入若干浓度的氯化钴；
通过利用实时无标记细胞分析仪记录的所述待培养人心肌细胞的成长情况确定在最佳加入时刻加入氯化钴的最佳浓度；
按照所述最佳浓度和最佳加入时刻培养人心肌细胞以模拟构建待培养细胞在低氧环境下的活力状态，以进行观察或实验。
进一步地，激活实验载体包括：
提前30min预热培养基；
使用移液器在E-Plate16孔板中每个观察孔加入100μL预热的所述培养基；
将E-Plate16孔板放入实时无标记细胞分析仪中，自动检测点击板以使横向平行复孔电极值接近和纵向对称孔电极值接近。
进一步地，选择待培养人心肌细胞组包括：
使用T75培养瓶各收集1瓶AC16人心肌细胞、基因过表达组人心肌细胞、过表达空载对照组人心肌细胞、基因敲降组人心肌细胞以及敲降空载对照组人心肌细胞，弃上清，10mLPBS洗1次，1mL0.25%胰酶于37℃消化2min，加入7mL10%FBS的DMEM/F12培养基，吹打均匀后收集细胞，1000rpm/min离心5min;
弃上清，加入10%FBS的完全培养基重悬细胞，并计数；
将各组人心肌细胞稀释至5×cells/mL，以完成对所述待培养人心肌细胞组的处理。
进一步地，在对实际培养孔图像与标准培养孔图像进行对比的过程中，所述图像对比单元内设置有标准差异度S0，若所述实际培养孔图像与标准培养孔的差异度Si小于所述标准差异度S0，则进行后续实验以加入人心肌细胞溶液，否则延长吸取时间，以使得实际培养孔图像与标准培养孔图像之间的差异减小，直至两者之间的差异度小于所述标准差异度。
进一步地，在实际培养孔图像与标准培养孔图像的差异度大于等于所述标准差异度时，根据实际培养孔图像中的培养基的分布情况确定吸取轨迹，以根据所述吸取轨迹完成对培养基的吸取进而使得两张图像的差异度小于所述标准差异度。
进一步地，在增殖过程中的多个选定的加入时刻加入若干浓度的氯化钴包括：
将E-Plate16孔板取出，根据组别设置加入100μL/孔的氯化钴溶液；
将E-Plate16孔板，再次移入到所述恒温细胞培养箱中的实时无标记细胞分析仪中，平衡20min;
开始监测阻抗，每30min读取一次数。
进一步地，根据组别设置加入100μL/孔的氯化钴溶液包括：
在所述AC16人心肌细胞中分别采用不加入氯化钴溶液、加入终浓度为125μmol/L和250μmol/L的氯化钴溶液；
在所述基因过表达组人心肌细胞中分别采用不加入氯化钴溶液、加入终浓度为125μmol/L、250μmol/L和500μmol/L的氯化钴溶液；
在所述过表达空载对照组人心肌细胞中分别采用不加入氯化钴溶液、加入终浓度为125μmol/L、250μmol/L和500μmol/L的氯化钴溶液；
在所述基因敲降组人心肌细胞中分别采用不加入氯化钴溶液、加入终浓度为125μmol/L、250μmol/L和500μmol/L的氯化钴溶液；
在所述敲降空载对照组人心肌细胞中分别采用不加入氯化钴溶液、加入终浓度为125μmol/L、250μmol/L和500μmol/L的氯化钴溶液。
进一步地，通过利用实时无标记细胞分析仪记录所述待培养人心肌细胞的成长情况包括：
所述AC16人心肌细胞铺板后2小时CI值达到4.3；
所述基因过表达组人心肌细胞在铺板之后的第24小时CI值达到2.6，在第24小时加入不同浓度氯化钴后，与空白组、125μmol/L和250μmol/L氯化钴处理组相比，浓度为500μmol/L氯化钴的效果最好，会使得基因过表达组人心肌细胞在加入药物后第14小时CI值下降，经过50小时细胞全部死亡；
所述过表达空载对照组人心肌细胞在铺板之后的第24小时CI值达到2.0，在第24小时加入不同浓度氯化钴后，与空白组、125μmol/L和250μmol/L氯化钴处理组相比，浓度为500μmol/L氯化钴的效果最好，会使得所述过表达空载对照组人心肌细胞在加入药物后第14小时CI值下降，经过24小时细胞全部死亡；
所述基因敲降组人心肌细胞在铺板之后的第24小时CI值达到2.5，在第24小时加入不同浓度氯化钴后，与空白组、125μmol/L和250μmol/L氯化钴处理组相比，浓度为500μmol/L氯化钴的效果最好，会使得所述基因敲降组人心肌细胞在加入药物后第30小时CI值下降，经过40小时细胞全部死亡；
所述敲降空载对照组人心肌细胞在铺板之后的第24小时CI值达到1.6，在第24小时加入不同浓度氯化钴后，与空白组、125μmol/L和250μmol/L氯化钴处理组相比，浓度为500μmol/L氯化钴的效果最好，会使得敲降空载对照组人心肌细胞在加入药物后第30小时CI值下降，经过36小时细胞全部死亡。
进一步地，确定加入氯化钴的最佳浓度和最佳加入时刻包括：
氯化钴以剂量和时间依赖性方式降低AC16人心肌细胞的活力，选择将AC16人心肌细胞温育24h时加入250μmol/L的氯化钴溶液来构建人心肌缺氧模型。
进一步地，还包括对所述最佳浓度进行验证，验证过程为：
将人心肌细胞铺于96孔板中，每孔5000个细胞，培养过夜；
待细胞贴壁完全，弃去上清液，加入用不同种浓度的氯化钴（0，250，500，750，1000μmol/L）温育不同时间（0，24，48，72h）后，弃去上清液，每孔各加入10μlCCK-8溶液CCK-8试剂及90μ完全培养基，避光孵育1.5h，酶标仪检测450nm下吸光度；
人心肌细胞存活率=[(实验组-空白组)/(对照组-空白组)]×100%；
其中，实验孔：含细胞、培养基、CCK-8溶液和氯化钴溶液；
对照孔：含细胞、培养基、CCK-8溶液，不含氯化钴；
空白组：含培养基、CCK-8溶液，不含细胞、氯化钴；
根据检测的AC16人心肌细胞活力筛选建立人心肌细胞低氧损伤模型最优氯化钴浓度。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于，通过培育人心肌细胞，并利用人心肌细胞在不同浓度的氯化钴加入之后的增殖状态来模拟人心肌细胞在低氧环境下的状态，便于进行低氧环境下的有效实验和观察，提高对于人心肌细胞的低氧环境研究，提高营造低氧环境的效率。
尤其，通过获取到不同类型的待培养人心肌细胞，为后续的实验提供不同组细胞的比较和分析基础。通过对不同组细胞的处理和稀释，可以保证每组细胞的初始浓度和数量相似，以确保实验的可比性和准确性。
尤其，通过观察和记录待培养人心肌细胞的增殖曲线。通过连续监测阻抗并每30分钟读取一次数据，获得人心肌细胞的生长情况和增殖速度，进而分析不同组人心肌细胞的增殖曲线差异，以研究人心肌细胞增殖的特征和机制。
尤其，通过实时无标记细胞分析仪记录人心肌细胞的成长情况，评估不同浓度氯化钴对人心肌细胞的影响，从而研究细胞增殖、细胞凋亡以及药物对人心肌细胞的作用机制。
附图说明
图1为本发明实施例提供的在细胞增殖过程中的氯化钴的加入方法的流程示意图；
图2为本发明实施例中激活实验载体的流程示意图；
图3为本发明实施例中选择待培养人心肌细胞组的流程示意图；
图4为本发明实施例中的人心肌细胞增殖过程流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明作进一步描述；应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
下面参照附图来描述本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当理解的是，这些实施方式仅仅用于解释本发明的技术原理，并非在限制本发明的保护范围。
需要说明的是，在本发明的描述中，术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”等指示的方向或位置关系的术语是基于附图所示的方向或位置关系，这仅仅是为了便于描述，而不是指示或暗示所述装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，还需要说明的是，在本发明的描述中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域技术人员而言，可根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
请参阅图1所示，本发明实施例提供的在细胞增殖过程中的氯化钴的加入方法包括：
步骤S100：激活实验载体；
步骤S200：选择待培养人心肌细胞组；
步骤S300：将所述待培养人心肌细胞组置于所述实验载体上进行增殖；
步骤S400：在增殖过程中的选定的加入时刻加入若干浓度的氯化钴；
步骤S500：通过利用实时无标记细胞分析仪记录的所述待培养人心肌细胞的成长情况确定在最佳加入时刻加入氯化钴的最佳浓度；
步骤S600：按照所述最佳浓度和最佳加入时刻培养人心肌细胞以模拟构建待培养细胞在低氧环境下的活力状态，以进行观察或实验。
具体而言，本发明实施例中的低氧环境中氧气浓度的参数范围为3％至20.9％。
具体而言，本发明实施例中的在细胞增殖过程中的氧化钴的加入方法通过培育人心肌细胞，并利用人心肌细胞在不同浓度的氯化钴加入之后的增殖状态来模拟人心肌细胞在低氧环境下的状态，便于进行低氧环境下的有效实验和观察，提高对于人心肌细胞的低氧环境研究，提高营造低氧环境的效率。
具体而言，如图2所示，激活实验载体包括：
步骤S101：提前30min预热培养基；
步骤S102：使用移液器在E-Plate16孔板中每个观察孔加入100μL预热的所述培养基；
步骤S103：将E-Plate16孔板放入实时无标记细胞分析仪中，自动检测点击板以使横向平行复孔电极值接近和纵向对称孔电极值接近。
具体而言，本发明实施例中的E-Plate16孔板为电子细胞培养板，设置有16个观察孔来观察细胞的变化和发展。
具体而言，激活实验载体的步骤包括预热培养基和在观察孔中加入预热的培养基，然后将载体放入实时无标记细胞分析仪中进行检测，为后续的细胞增殖实验提供一个适宜的环境和条件，预热培养基使细胞在最适宜的温度下进行增殖，而将载体放入实时无标记细胞分析仪中进行检测确保仪器的参数和电极值在合适的范围内，以保证实验的准确性和可靠性。
具体而言，如图3所示，选择待培养人心肌细胞组包括：
步骤S201：使用T75培养瓶各收集1瓶AC16心肌细胞、基因过表达组心肌细胞、过表达空载对照组心肌细胞、基因敲降组心肌细胞以及敲降空载对照组心肌细胞，弃上清，10mLPBS洗1次，1mL0.25%胰酶于37℃消化2min，加入7mL10%FBS的DMEM/F12培养基，吹打均匀后收集细胞，1000rpm/min离心5min;
步骤S202：弃上清，加入10%FBS的完全培养基重悬细胞，并计数；
步骤S203：将各组心肌细胞稀释至5×cells/mL，以完成对所述待培养人心肌细胞组的处理。
具体而言，本发明实施例中的基因过表达组人心肌细胞的基因序列示于SEQ IDNO: 1，其中，在上述基因序列中的插入序列的基因序列示于SEQ ID NO: 2；
本发明实施例中基因敲降组人心肌细胞的一个基因序列示于SEQ ID NO: 3，其中在基因敲降组人心肌细胞的基因序列中的对应的短发夹RNA的基因序列示于SEQ ID NO:4；
本发明实施例中基因敲降组人心肌细胞的另一个基因序列示于SEQ ID NO: 5，其中在基因敲降组人心肌细胞的基因序列中的短发夹RNA的基因序列示于SEQ ID NO: 6；
本发明实施例中基因敲降组人心肌细胞的第三种基因序列示于SEQ ID NO: 7，其中在基因敲降组人心肌细胞的基因序列中的短发夹RNA的基因序列示于SEQ ID NO: 8。
具体而言，本发明实施例中的敲降空载对照组人心肌细胞的基因序列示于SEQ IDNO: 9。
具体而言，本发明实施例中的过表达空载对照组人心肌细胞和AC16人心肌细胞的基因序列属于本领域技术人员的常规选择，在此不做限定，以实际实施为准。
具体而言，本发明通过获取到不同类型的待培养人心肌细胞，为后续的实验提供不同组细胞的比较和分析基础。通过对不同组细胞的处理和稀释，可以保证每组细胞的初始浓度和数量相似，以确保实验的可比性和准确性。
具体而言，如图4所示，将所述待培养人心肌细胞组置于所述实验载体上进行增殖包括：
步骤S301：将E-Plate16孔板从实时无标记细胞分析仪中取出，弃掉所述培养基；
步骤S302：按照100μL/孔体积将各心肌细胞稀释液加入E-Plate16孔板中，使每孔内所述心肌细胞的数量为5000个；
步骤S303：将E-Plate16孔板在室温下静置30min，使心肌细胞沉降到底部；
步骤S304：将E-Plate16孔板，移入恒温细胞培养箱中的实时无标记细胞分析仪中，平衡15min后，所述恒温细胞培养箱的温度为37℃，且占比为5%；
步骤S305：监测阻抗240h，每30min读取一次读数；
步骤S306：观察各所述心肌细胞的增殖曲线。
具体而言，本发明实施例通过观察和记录待培养人心肌细胞的增殖曲线。通过连续监测阻抗并每30分钟读取一次数据，获得人心肌细胞的生长情况和增殖速度，进而分析不同组人心肌细胞的增殖曲线差异，以研究人心肌细胞增殖的特征和机制。
具体而言，弃掉所述培养基包括：
沿所述E-Plate16孔板的每个孔的边界吸掉所述培养基，以避免碰到底部电极。
具体而言，本发明实施例中对于任意需要吸掉培养基的孔而言，预先设置有标准培养孔图像M0，存储在图像对比单元内，对于任意第i培养孔在吸掉培养基之后进行图像采集，形成实际培养孔图像Mi，将所述实际培养孔图像与所述标准培养孔图像进行比较，并根据比较结果确定是否加入人心肌细胞溶液。
具体而言，本发明实施例中的标准培养孔图像为所述培养孔内无培养基的时候的图像。
具体而言，本发明实施例通过设置标准培养孔图像，并对实际培养孔图像进行采集，确定实际培养孔图像与标准培养孔的对比差异，并根据对比结果确定是否加入人心肌细胞溶液，本发明实施例利用图像中的特征对比，确定实际培养孔中培养基是否吸取完全，使得在培养孔内能够保留更多的空间来容纳人心肌细胞溶液，进而提升实验效率，提高实验精度。
具体而言，在对实际培养孔图像与标准培养孔图像进行对比的过程中，所述图像对比单元内设置有标准差异度S0，若所述实际培养孔图像与标准培养孔的差异度Si小于所述标准差异度S0，则进行后续实验，也就是加入人心肌细胞溶液，否则延长吸取时间，以使得实际培养孔图像与标准培养孔图像之间的差异减小，直至两者之间的差异度小于所述标准差异度。
具体而言，本发明实施例中的标准差异度S0设置为10%。
具体而言，本发明实施例通过设置标准差异度，通过比较实际培养孔图像与标准培养孔图像的差异度，来判断是否进行后续实验。如果实际培养孔图像与标准培养孔的差异度小于标准差异度S0，则表示两者相似度高，可以进行后续实验，即加入人心肌细胞溶液。如果差异度大于S0，则需要延长吸取时间，以减小实际培养孔图像与标准培养孔图像之间的差异，直到差异度小于S0为止，进而确保实验条件更加准确，提高实验的可靠性和精确度。
具体而言，在实际培养孔图像与标准培养孔图像的差异度大于等于所述标准差异度时，根据实际培养孔图像中的培养基的分布情况确定吸取轨迹，以根据所述吸取轨迹完成对培养基的吸取进而使得两张图像的差异度小于所述标准差异度。
具体而言，本发明实施例根据实际培养孔图像中培养基的分布情况确定吸取轨迹，以完成对培养基的吸取，并使得实际培养孔图像与标准培养孔图像的差异度小于所述标准差异度，通过确定吸取轨迹，准确地吸取培养基，使得实际培养孔图像中的培养基分布与标准培养孔图像更接近，从而减小两者之间的差异度进而确保实验结果的准确性和可靠性，提高实验的成功率。
具体而言，本发明实施例通过沿着边界吸掉培养基，确保在更换培养基的过程中不会干扰底部电极的正常工作和测量，通过吸掉培养基，保持实验载体的稳定性和准确性，以确保后续实验的可靠性和准确性。
具体而言，在增殖过程中的多个选定的加入时刻加入若干浓度的氯化钴包括：
将E-Plate16孔板取出，根据组别设置加入100μL/孔的氯化钴溶液；
将E-Plate16孔板，再次移入到所述恒温细胞培养箱中的实时无标记细胞分析仪中，平衡20min;
开始监测阻抗，每30min读取一次数。
具体而言，本发明实施例通过在不同时间点加入氯化钴并监测阻抗的变化，研究氯化钴对人心肌细胞生长和增殖的效应，通过不同浓度和时间点的处理，确定最佳的氯化钴浓度和加入时刻，以促进或抑制人心肌细胞的增殖，以深入了解氯化钴在细胞增殖中的作用机制。
具体而言，根据组别设置加入100μL/孔的氯化钴溶液包括：
在所述AC16人心肌细胞中分别采用不加入氯化钴溶液、加入终浓度为125μmol/L和250μmol/L的氯化钴溶液；
在所述基因过表达组人心肌细胞中分别采用不加入氯化钴溶液、加入终浓度为125μmol/L、250μmol/L和500μmol/L的氯化钴溶液；
在所述过表达空载对照组人心肌细胞中分别采用不加入氯化钴溶液、加入终浓度为125μmol/L、250μmol/L和500μmol/L的氯化钴溶液；
在所述基因敲降组人心肌细胞中分别采用不加入氯化钴溶液、加入终浓度为125μmol/L、250μmol/L和500μmol/L的氯化钴溶液；
在所述敲降空载对照组人心肌细胞中分别采用不加入氯化钴溶液、加入终浓度为125μmol/L、250μmol/L和500μmol/L的氯化钴溶液。
具体而言，本发明实施例通过在不同类型的人心肌细胞中应用不同浓度的氯化钴溶液，以观察氯化钴对人心肌细胞增殖的影响。通过比较不同组人心肌细胞在不同氯化钴浓度下的增殖曲线，确定氯化钴对不同类型人心肌细胞的生长和增殖的效应。这有助于研究氯化钴在人心肌细胞生物学和疾病研究中的作用机制。
具体而言，通过利用实时无标记细胞分析仪记录所述待培养人心肌细胞的成长情况包括：
所述AC16人心肌细胞铺板后2小时CI值达到4.3；
所述基因过表达组人心肌细胞在铺板之后的第24小时CI值达到2.6，在第24小时加入不同浓度氯化钴后，与空白组、125μmol/L和250μmol/L氯化钴处理组相比，浓度为500μmol/L氯化钴的效果最好，会使得基因过表达组人心肌细胞在加入药物后第14小时CI值下降，经过50小时细胞全部死亡；
所述过表达空载对照组人心肌细胞在铺板之后的第24小时CI值达到2.0，在第24小时加入不同浓度氯化钴后，与空白组、125μmol/L和250μmol/L氯化钴处理组相比，浓度为500μmol/L氯化钴的效果最好，会使得所述过表达空载对照组人心肌细胞在加入药物后第14小时CI值下降，经过24小时细胞全部死亡；
所述基因敲降组人心肌细胞在铺板之后的第24小时CI值达到2.5，在第24小时加入不同浓度氯化钴后，与空白组、125μmol/L和250μmol/L氯化钴处理组相比，浓度为500μmol/L氯化钴的效果最好，会使得所述基因敲降组人心肌细胞在加入药物后第30小时CI值下降，经过40小时细胞全部死亡；
所述敲降空载对照组人心肌细胞在铺板之后的第24小时CI值达到1.6，在第24小时加入不同浓度氯化钴后，与空白组、125μmol/L和250μmol/L氯化钴处理组相比，浓度为500μmol/L氯化钴的效果最好，会使得敲降空载对照组人心肌细胞在加入药物后第30小时CI值下降，经过36小时细胞全部死亡。
具体而言，本发明实施例通过实时无标记细胞分析仪记录人心肌细胞的成长情况，评估不同浓度氯化钴对人心肌细胞的影响，从而研究细胞增殖、细胞凋亡以及药物对人心肌细胞的作用机制。
具体而言，确定加入氯化钴的最佳浓度和最佳加入时刻包括：
氯化钴以剂量和时间依赖性方式降低人心肌AC16细胞的活力，选择将人心肌AC16细胞温育24h时加入250μmol/L的氯化钴溶液来构建人心肌缺氧模型。
具体而言，本发明实施例中的人心肌细胞包括细胞核和线粒体，通常线粒体聚集在细胞核的两端，氯化钴溶液中的钴离子通过抑制丙酮酸和其他酮酸脱羧和脱氢酶的活性进而使得线粒体无法正常吸收氧气，进而致使人心肌细胞缺氧；另外，亚铁螯合酶使原卟啉Ⅸ与人心肌细胞中的Fe2+螯合并进一步形成血红素，但是由于加入了钴离子，其能够代替人心肌细胞中的Fe2+，使原卟啉Ⅸ结合O2的能力低于含铁原卟啉Ⅸ，从而使人心肌细胞处于缺氧状态，稳定并激活细胞内缺氧诱导因子-1α，实现人心肌细胞缺氧模型的建立和表达。
具体而言，本发明实施例中的CoCl2对不同的细胞诱导HIF-1α表达所需的浓度及处理时间有所不同，高浓度或长时间作用人心肌细胞会诱导人心肌细胞的凋亡，氯化钴对AC16细胞产生细胞毒性作用，并随着药物浓度增加而增强，在CoCl2浓度超过250μmol/L时及作用24h后人心肌细胞存活率明显降低。
具体而言，本发明实施例通过选择250μmol/L的氯化钴浓度，在24小时内降低人心肌AC16细胞的活力，氯化钴对细胞的作用呈剂量依赖性，且该效应在一定时间范围内逐渐发生。通过加入250μmol/L的氯化钴溶液，模拟心肌缺氧的情况，心肌缺氧是指人心肌细胞由于供氧不足而受到损害，这种模型可以用于研究心肌缺血和心肌病等相关疾病的发生机制。将人心肌AC16细胞在温育24小时后加入250μmol/L的氯化钴溶液构建心肌缺氧模型。
具体而言，还包括对所述最佳浓度进行验证包括：
将人心肌细胞铺于96孔板中，每孔5000个细胞，培养过夜；
待细胞贴壁完全，弃去上清液，加入用不同种浓度的氯化钴（0，250，500，750，1000μmol/L）温育不同时间（0，24，48，72h）后，弃去上清液，每孔各加入10μlCCK-8溶液CCK-8试剂及90μ完全培养基，避光孵育1.5h，酶标仪检测450nm下吸光度；
人心肌细胞存活率=[(实验组-空白组)/(对照组-空白组)]×100%；
其中，实验孔：含细胞、培养基、CCK-8溶液和氯化钴溶液；
对照孔：含细胞、培养基、CCK-8溶液，不含氯化钴；
空白组：含培养基、CCK-8溶液，不含细胞、氯化钴；
根据检测的AC16人心肌细胞活力筛选建立人心肌细胞低氧损伤模型最合适的氯化钴浓度。
具体而言，使用浓度为250，500，750，1000μmol/L氯化钴的DMEM／F12完全培养基，在37℃，5％CO2环境中温育不同时间(24，48或72h)。CCK-8检测结果显示：随着氯化钴浓度增加（0，250，500，750，1000μmol/L），培养24h后，与0μmol/L氯化钴组相比，其它氯化钴浓度组人AC16人心肌细胞活力显著降低(P<0.0001)。与250μmol/L氯化钴浓度组相比，500，1000μmol/L氯化钴浓度组对AC16人心肌细胞的活力抑制效能达到最大（P<0.0001），细胞活力低于50%。随着温育时间的延长，500μmol/L及以上氯化钴浓度组的AC16人心肌细胞的活力达到最低（P<0.0001）。故从药效学和经济学角度选择250μmol/L温育24h构建心肌缺氧模型。
具体而言，本发明实施例通过加入CCK-8试剂并测定吸光度，评估细胞的存活率，根据计算公式，将实验组与对照组的吸光度值进行比较，得到人心肌细胞的存活率。通过对比实验组中不同浓度氯化钴处理后的细胞存活率，确定最适合建立人心肌细胞低氧损伤模型的氯化钴浓度，比较不同浓度氯化钴处理组与空白组的细胞存活率，可以找到最佳浓度，即能够引起一定程度低氧损伤且不至于导致细胞完全死亡的浓度。通过测定人心肌细胞的存活率，并比较不同浓度氯化钴处理组的效果，筛选出最合适建立人心肌细胞低氧损伤模型的氯化钴浓度。这将为进一步研究人心肌细胞低氧损伤和相关疾病提供可靠的实验依据。
至此，已经结合附图所示的优选实施方式描述了本发明的技术方案，但是，本领域技术人员容易理解的是，本发明的保护范围显然不局限于这些具体实施方式。在不偏离本发明的原理的前提下，本领域技术人员可以对相关技术特征做出等同的更改或替换，这些更改或替换之后的技术方案都将落入本发明的保护范围之内。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明；对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种在细胞增殖过程中的氯化钴的加入方法，其特征在于，包括：
激活实验载体，所述试验载体包括E-Plate16孔板和培养基；
选择待培养人心肌细胞组，所述待培养人心肌细胞组包括AC16人心肌细胞、基因过表达组人心肌细胞、过表达空载对照组人心肌细胞、基因敲降组人心肌细胞以及敲降空载对照组人心肌细胞；
将所述E-Plate16孔板从实时无标记细胞分析仪中取出，沿所述E-Plate16孔板的每个孔的边界吸掉所述培养基，以避免碰到底部电极；
对于任意需要吸掉培养基的孔而言，预先设置有标准培养孔图像M0，存储在图像对比单元内，对于任意第i培养孔在吸掉培养基之后进行图像采集，形成实际培养孔图像Mi，将所述实际培养孔图像与所述标准培养孔图像进行比较，并根据比较结果确定是否加入人心肌细胞溶液；
按照100μL/孔体积将各人心肌细胞稀释液加入E-Plate16孔板中，使每孔内人心肌细胞的数量为5000个；
将E-Plate16孔板在室温下静置30min，使人心肌细胞沉降到底部；
将E-Plate16孔板，移入恒温细胞培养箱中的实时无标记细胞分析仪中，平衡15min后，所述恒温细胞培养箱的温度为37℃，且占比为5%；
监测阻抗240h，每30min读取一次读数，观察各人心肌细胞的增殖曲线；
在增殖过程中的选定的加入时刻加入若干浓度的氯化钴；
通过利用实时无标记细胞分析仪记录的所述待培养人心肌细胞的成长情况确定在最佳加入时刻加入氯化钴的最佳浓度；
按照所述最佳浓度和最佳加入时刻培养人心肌细胞以模拟构建待培养细胞在低氧环境下的活力状态，以进行观察或实验。
2.根据权利要求1所述的在细胞增殖过程中的氯化钴的加入方法，其特征在于，激活实验载体包括：
提前30min预热培养基；
使用移液器在E-Plate16孔板中每个观察孔加入100μL预热的所述培养基；
将E-Plate16孔板放入实时无标记细胞分析仪中，自动检测点击板以使横向平行复孔电极值接近和纵向对称孔电极值接近。
3.根据权利要求2所述的在细胞增殖过程中的氯化钴的加入方法，其特征在于，选择待培养人心肌细胞组包括：
使用T75培养瓶各收集1瓶AC16人心肌细胞、基因过表达组人心肌细胞、过表达空载对照组人心肌细胞、基因敲降组人心肌细胞以及敲降空载对照组人心肌细胞，弃上清，10mLPBS洗1次，1mL0.25%胰酶于37℃消化2min，加入7mL10%FBS的DMEM/F12培养基，吹打均匀后收集细胞，1000rpm/min离心5min;
弃上清，加入10%FBS的完全培养基重悬细胞，并计数；
将各组人心肌细胞稀释至5×cells/mL，以完成对所述待培养人心肌细胞组的处理。
4.根据权利要求3所述的在细胞增殖过程中的氯化钴的加入方法，其特征在于，在对实际培养孔图像与标准培养孔图像进行对比的过程中，所述图像对比单元内设置有标准差异度S0，若所述实际培养孔图像与标准培养孔的差异度Si小于所述标准差异度S0，则进行后续实验以加入人心肌细胞溶液，否则延长吸取时间，以使得实际培养孔图像与标准培养孔图像之间的差异减小，直至两者之间的差异度小于所述标准差异度。
5.根据权利要求4所述的在细胞增殖过程中的氯化钴的加入方法，其特征在于，在实际培养孔图像与标准培养孔图像的差异度大于等于所述标准差异度时，根据实际培养孔图像中的培养基的分布情况确定吸取轨迹，以根据所述吸取轨迹完成对培养基的吸取进而使得两张图像的差异度小于所述标准差异度。
6.根据权利要求5所述的在细胞增殖过程中的氯化钴的加入方法，其特征在于，在增殖过程中的多个选定的加入时刻加入若干浓度的氯化钴包括：
将E-Plate16孔板取出，根据组别设置加入100μL/孔的氯化钴溶液；
将E-Plate16孔板，再次移入到所述恒温细胞培养箱中的实时无标记细胞分析仪中，平衡20min;
开始监测阻抗，每30min读取一次数。
7.根据权利要求6所述的在细胞增殖过程中的氯化钴的加入方法，其特征在于，根据组别设置加入100μL/孔的氯化钴溶液包括：
在所述AC16人心肌细胞中分别采用不加入氯化钴溶液、加入终浓度为125μmol/L和250μmol/L的氯化钴溶液；
在所述基因过表达组人心肌细胞中分别采用不加入氯化钴溶液、加入终浓度为125μmol/L、250μmol/L和500μmol/L的氯化钴溶液；
在所述过表达空载对照组人心肌细胞中分别采用不加入氯化钴溶液、加入终浓度为125μmol/L、250μmol/L和500μmol/L的氯化钴溶液；
在所述基因敲降组人心肌细胞中分别采用不加入氯化钴溶液、加入终浓度为125μmol/L、250μmol/L和500μmol/L的氯化钴溶液；
在所述敲降空载对照组人心肌细胞中分别采用不加入氯化钴溶液、加入终浓度为125μmol/L、250μmol/L和500μmol/L的氯化钴溶液。
8.根据权利要求7所述的在细胞增殖过程中的氯化钴的加入方法，其特征在于，通过利用实时无标记细胞分析仪记录所述待培养人心肌细胞的成长情况包括：
所述AC16人心肌细胞铺板后2小时CI值达到4.3；
所述基因过表达组人心肌细胞在铺板之后的第24小时CI值达到2.6，在第24小时加入不同浓度氯化钴后，与空白组、125μmol/L和250μmol/L氯化钴处理组相比，浓度为500μmol/L氯化钴的效果最好，会使得基因过表达组人心肌细胞在加入药物后第14小时CI值下降，经过50小时细胞全部死亡；
所述过表达空载对照组人心肌细胞在铺板之后的第24小时CI值达到2.0，在第24小时加入不同浓度氯化钴后，与空白组、125μmol/L和250μmol/L氯化钴处理组相比，浓度为500μmol/L氯化钴的效果最好，会使得所述过表达空载对照组人心肌细胞在加入药物后第14小时CI值下降，经过24小时细胞全部死亡；
所述基因敲降组人心肌细胞在铺板之后的第24小时CI值达到2.5，在第24小时加入不同浓度氯化钴后，与空白组、125μmol/L和250μmol/L氯化钴处理组相比，浓度为500μmol/L氯化钴的效果最好，会使得所述基因敲降组人心肌细胞在加入药物后第30小时CI值下降，经过40小时细胞全部死亡；
所述敲降空载对照组人心肌细胞在铺板之后的第24小时CI值达到1.6，在第24小时加入不同浓度氯化钴后，与空白组、125μmol/L和250μmol/L氯化钴处理组相比，浓度为500μmol/L氯化钴的效果最好，会使得敲降空载对照组人心肌细胞在加入药物后第30小时CI值下降，经过36小时细胞全部死亡。
9.根据权利要求8所述的在细胞增殖过程中的氯化钴的加入方法，其特征在于，确定加入氯化钴的最佳浓度和最佳加入时刻包括：
氯化钴以剂量和时间依赖性方式降低AC16人心肌细胞的活力，选择将AC16人心肌细胞温育24h时加入250μmol/L的氯化钴溶液来构建人心肌缺氧模型。
10.根据权利要求9所述的在细胞增殖过程中的氯化钴的加入方法，其特征在于，还包括对所述最佳浓度进行验证，验证过程为：
将人心肌细胞铺于96孔板中，每孔5000个细胞，培养过夜；
待细胞贴壁完全，弃去上清液，加入用不同种浓度的氯化钴（0，250，500，750，1000μmol/L）温育不同时间（0，24，48，72h）后，弃去上清液，每孔各加入10μlCCK-8溶液CCK-8试剂及90μ完全培养基，避光孵育1.5h，酶标仪检测450nm下吸光度；
人心肌细胞存活率=[(实验组-空白组)/(对照组-空白组)]×100%；
其中，实验孔：含细胞、培养基、CCK-8溶液和氯化钴溶液；
对照孔：含细胞、培养基、CCK-8溶液，不含氯化钴；
空白组：含培养基、CCK-8溶液，不含细胞、氯化钴；
根据检测的AC16人心肌细胞活力筛选建立人心肌细胞低氧损伤模型最优氯化钴浓度。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118048299A (zh) * | 2024-04-15 | 2024-05-17 | 中国人民解放军总医院第一医学中心 | 一种基于缺氧诱导模型的氯化钴添加方法 |
| CN118086448A (zh) * | 2024-04-23 | 2024-05-28 | 中国人民解放军总医院 | 一种心肌ac16细胞低氧损伤的检测方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130143254A1 (en) * | 2011-12-01 | 2013-06-06 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Co-culture device assembly |
| US20150118214A1 (en) * | 2012-05-10 | 2015-04-30 | Xiuying Lin | Pharmaceutical composition containing human cyclooxygenase and doxorubicin or doxorubicin analogue, preparation method therefor and use thereof in preparing drugs |
-
2024
- 2024-01-04 CN CN202410009400.2A patent/CN117721171A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130143254A1 (en) * | 2011-12-01 | 2013-06-06 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Co-culture device assembly |
| US20150118214A1 (en) * | 2012-05-10 | 2015-04-30 | Xiuying Lin | Pharmaceutical composition containing human cyclooxygenase and doxorubicin or doxorubicin analogue, preparation method therefor and use thereof in preparing drugs |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| TIANXING WANG ET AL.: "A cardiomyocyte-based biosensor for antiarrhythmic drug evaluation by simultaneously monitoring cell growth and beating", 《BIOSENS BIOELECTRON》, vol. 49, 3 May 2013 (2013-05-03), pages 10 * |
| 曹蕾: "阿司匹林调控生长分化因子15蛋白表达对心肌细胞缺氧/复氧损伤保护作用及作用机制的初步研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》, 15 March 2018 (2018-03-15), pages 33 * |
| 生物通: "2010创新产品：RTCA Cardio实时无标记心肌细胞分析系统", 《生物通》, 15 April 2011 (2011-04-15), pages 10 - 11 * |
| 赵可心: "USF2缺失通过调节线粒体稳态诱导人心肌细胞AC16损伤的机制研究", 《万方数据知识服务平台》, 19 September 2023 (2023-09-19), pages 6 - 8 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118048299A (zh) * | 2024-04-15 | 2024-05-17 | 中国人民解放军总医院第一医学中心 | 一种基于缺氧诱导模型的氯化钴添加方法 |
| CN118048299B (zh) * | 2024-04-15 | 2024-09-24 | 中国人民解放军总医院第一医学中心 | 一种基于缺氧诱导模型的氯化钴添加方法 |
| CN118086448A (zh) * | 2024-04-23 | 2024-05-28 | 中国人民解放军总医院 | 一种心肌ac16细胞低氧损伤的检测方法 |
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