CN114990160B - 一种Navβ2-ICD低表达转基因鼠模型的构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种Navβ2‑ICD低表达转基因鼠模型的构建方法及其应用，包括如下步骤：(1)设计gRNA靶向载体和供体寡核苷酸；(2)构建pCRISPR‑gRNA载体；(3)将构建好的质粒载体转入菌种进行DNA的提取；(4)寡核苷酸序列的合成、鉴定、纯化，备用；(5)显微注射液制备；(6)用显微注射法制作转基因小鼠；PCR鉴定阳性转基因鼠；(7)利用特异引物通过PCR法进行检测；(8)建立Navβ2‑ICD低表达转基因鼠模型。本发明解决了现有BACE1及PS/γ‑secretase抑制剂的应用副作用较大且底物靶点广泛的缺陷，避免了酶解底物抑制剂应用造成的其他广泛副作用。

Description

一种Navβ2-ICD低表达转基因鼠模型的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及动物模型技术领域，具体涉及一种Navβ2-ICD低表达转基因鼠模型的构建方法及其应用。
背景技术
全球人口快速老龄化导致越来越多的老年人面临学习能力的下降与记忆功能丧失的问题，包括轻度认知功能障碍(mild cognitive impairment，MCI)以及程度更为严重的痴呆或失智(dementia)。阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease，AD)作为老年人认知功能丧失的代表性疾病，是最常见的引起失智的原因，影响了超过600万美国人，如果仍未找到有效的治疗方法加以制止，估计到2050年，AD将影响全球超过1.315亿的人口[1]。AD早期的症状包括记忆丧失、遗忘和行为变化；进展到AD的晚期，认知衰退会干扰大多数日常活动，极大地影响了患者的生活质量，也给社会和家庭带来巨大的负担，将对人类的发展产生深刻影响。鉴于AD的巨大潜在危害，全球研究机构甚至政府已经开展了相关措施积极进行应对，据统计，截止2021年，全球在AD和其他痴呆症在医疗保健方面的花费近3550亿美元，预计到2050年，这些费用可能超过1万亿美元。在这样的高投入背景下，近年来陆续研发上市了包括乙酰胆碱酯酶抑制剂、N-methyl-D-aspartic acid(NMDA)拮抗剂、甘露特纳、阿杜卡奴单抗(Aducanumab)等药物，可以部分减轻患者认知和行为症状，或仅对处于疾病中早期的患者有一定疗效。遗憾的是，目前依然没有能够延缓或阻止疾病进展的有效方法，AD仍然是难以避免和不可治愈的。
研究人员认为AD药物开发失败率高的源于对该病复杂的病理机制认识不足。有研究指出，AD从早期的MCI、PAD(pre-clinicalAD)阶段发展到认知功能全面丧失往往历经数年到数十年，而年龄增长相关的认知功能障碍一旦发生便不可逆转，因此，在认知功能丧失始发阶段积极采取适当干预措施有望成为预防和治疗最为有效的途径，而这些适当干预措施的制定依赖于对其发生、进展机制的进一步阐明。
以往对于AD认知功能障碍的研究集中在以记忆丧失作为一种最初及主要症状特征的报道，但这种记忆丧失的认知本质尚未被明确揭示。记忆的形成、巩固和检索是支持记忆行为表现的，然而，限制这些功能的过程，包括遗忘(forgetting)，更是鲜为人知。遗忘被认为是被动的或主动的，它对记忆的去除、灵活性和更新等认知过程至关重要。
来自灵长类和啮齿类(大鼠)动物的数据均表明，海马神经元的过度兴奋性是大脑老化的一个特征，并可能导致海马回路与年龄相关的脆弱性，而这种脆弱性与AD病例中观察到的认知障碍有关。神经元的兴奋性改变在AD疾病进展中发挥了作用，早期出现高兴奋性，后期呈现低兴奋性。进一步的研究证实，皮质或海马神经元的高兴奋性是AD等神经退行性疾病的典型特征；而降低神经元的兴奋性与大鼠和轻度认知障碍(MCI)的人的记忆表现改善直接相关。有研究证据提出，神经元兴奋性的增加可能导致遗忘的加速。此前对哺乳动物和果蝇的研究表明，抗惊厥药物左乙拉西坦(Levetiracetam，LEV)可改善Aβ介导的认知功能缺陷。LEV可以挽救啮齿类和人MCI患者的神经元放电频率，并改善AD动物的学习和记忆。
鉴于神经元的兴奋性改变在AD认知功能障碍进展、遗忘发生中的重要作用，本发明把目光转到了动作电位的触发器、神经元兴奋性的维护者--电压门控性钠离子通道蛋白家族(Voltage-gated sodium channels，Navs)上。通过文献回顾，目前，鲜见有关Navβ2与AD认知功能障碍发生发展的研究报道。
Navβ2作为电压门控性钠离子通道的亚基之一，是一种跨膜的糖蛋白，在钠通道Nav1亚基在细胞膜定位的指向、促进和/或者位置的稳固过程中发挥重要的作用，Navβ2可以引起钠通道Nav1.1以及Nav1.8电压依赖性的去极化或失活，并在钠离子通道信号的传导、电压依赖性的激活与失活、通道蛋白在神经元表面的表达水平调节、以及神经元兴奋性调节、与其他信号分子(如细胞外基质及细胞骨架等)相互作用的过程中起到了重要作用。
前期的研究发现明确了Navβ2在脑老化中的作用。Navβ2的编码基因SCN2B在快速老化小鼠大脑海马和额叶组织中呈现出增龄性表达上调的变化趋势，提示脑老化的加速老化进程触发了其异常的表达增加，该基因可能与快速老化小鼠海马和额叶的老化进程密切相关。而进一步的研究证实SCN2B下调60.68％通过增加海马神经元棘突的数量，显著改善转基因小鼠海马依赖性的空间认知记忆并且有利于易化海马神经元的长时程电势(long-term potentiation，LTP)。另外，与淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)的酶解过程类似，作为I型跨膜蛋白的Navβ2可经由BACE1及PS/γ-secretase酶解，并依次产生酶解片段Navβ2C端片段(Navβ2-C-terminal fragment，Navβ2-CTF)、Navβ2细胞内片段(Navβ2-intracellular domain，Navβ2-ICD)，释放到胞内，Navβ2-ICD还可进入到核内，但是目前对这些肽段在生理及病理状态下的作用尚未明确，Navβ2-ICD是否也有类似于APP细胞内片段(APP-intracellular domain，AICD)的生物活性，阐明Navβ2-CTF、Navβ2-ICD在AD进展过程中的确切作用有助于洞悉AD发病的分子机制，从而在AD进展的早期及时阻断认知功能衰退的进程，为靶点治疗奠定基础，也为研发治疗药物另辟蹊径，具有重要的现实意义和应用价值。而Navβ2酶解位点点突变引发的Navβ2-ICD表达抑制动物模型为此项研究的深入提供了精准动物平台，并克服了运用广谱的BACE1及PS/γ-secretase酶抑制剂引发的其他副作用。
发明内容
针对现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种Navβ2-ICD低表达转基因鼠模型的构建方法及其应用。
为了解决现有技术的问题，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种Navβ2-ICD低表达转基因鼠模型的构建方法，包括如下步骤：
(1)根据数据库公布的Navβ2的编码基因SCN2B序列(SCN2B gene,GenBankaccession number:NM_001014761.2；Ensembl:ENSMUSG00000070304)，与人SCN2B基因序列进行比对,寻找同源突变位点；设计gRNA靶向载体和供体寡核苷酸，供体寡核苷酸p.V173A(GTC-GCC)和p.L175K(TTG-AAG)通过同源性定向修复被引入第4外显子：
设计Navβ2上PS/γ-secretase的酶解位点V173A及V175K点突变，SCN2B基因位于小鼠9号染色体上，共鉴定出4个外显子，ATG起始密码子在外显子1，TAA终止密码子位于外显子4，靶点的酶解位点p.V173及p.L175均位于第4外显子；
(2)构建pCRISPR-gRNA载体：选用pCRISPR-LvSG06载体质粒，使用EcoRⅠ和NheⅠ限制性内切酶酶切载体质粒，将EcoRⅠ和NheⅠ同时切开的载体片段回收，后用T4链接酶将回收后的载体片段与退火后的gRNA连接。将载体与gRNA连接后的产物转化，提取质粒，将提取后的质粒从载体U6启动子后开始测序，测序结果与gRNA靶点序列进行比对；
(3)将构建好的质粒载体转入菌种进行DNA的提取，通过大量制备质粒DNA，电泳、用凝胶回收试剂盒回收DNA片断，凝胶柱纯化DNA，并用TE溶液对DNA进行溶解回收；
(4)寡核苷酸序列的合成、鉴定、纯化，备用：设计和获得供体寡核苷酸Donoroligo，将原有p.V173A位点序列“GTC”突变为“GCC”、原有p.L175K“TTG”突变为“AAG”；供体寡核苷酸p.V173A(GTC-GCC)和p.L175K(TTG-AAG)通过同源性定向修复被引入第4外显子；
(5)显微注射液制备：用0.22μm的滤膜过滤的TE显微注射稀释液稀释核酸样品，pCRISPR-gRNA以及Donor oligo，12000g，离心2小时，上清液的2/3进行分装，用于显微注射；
(6)将构建好的转基因片段pCRISPR-gRNA以及Donoroligo线性化，用显微注射法制作转基因小鼠；PCR鉴定阳性转基因鼠；
(7)PCR法鉴定阳性转基因鼠，转基因小鼠在出生9-14天用剪趾法标记，收集剪下的组织，用碱裂解法提取基因组DNA，利用特异引物通过PCR法进行检测；
(8)运用RT-PCR及Westernblot技术筛选出Navβ2-ICD表达水平最低的品系，建立稳定的Navβ2V173A,V175K点突变制得Navβ2-ICD低表达转基因鼠模型。
进一步地，在步骤(1)中，所述的突变前的野生型等位基因序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述的突变后的等位基因序列为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；gRNA目标序列：gRNA-A1的匹配正向链的基因序列为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；gRNA-B1的匹配反向基因链的基因序列为SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
进一步地，在步骤(4)中，所述的寡核苷酸序列为SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。
进一步地，在步骤(5)中，用0.22μm的滤膜过滤的TE显微注射稀释液稀释核酸样品，pCRISPR-gRNA以及Donor oligo，11000g-12000g，离心1.5-2小时，上清液的2/3进行分装，用于显微注射。
更进一步地，在步骤(7)中，所述的检测引物序列的上游引物为SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，所述的检测引物序列的下游引物为SEQ ID No.7所示的核苷酸序列。
本发明所述的Navβ2-ICD低表达转基因鼠模型的构建方法构建Navβ2V173A,V175K点突变所致Navβ2-ICD低表达转基因鼠模型在研究、制备预防或者治疗学习记忆能力衰退药物中的应用。
有益效果：本发明的Navβ2V173A，V175K点突变诱导的全身Navβ2-ICD低表达转基因小鼠模型的构建方法及其应用，解决了现有BACE1及PS/γ-secretase抑制剂的应用副作用较大且底物靶点广泛的缺陷，实现了从源头特异性抑制Navβ2-ICD生成，而避免了酶解底物抑制剂应用造成的其他广泛副作用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)本发明首次获得Navβ2V173A，V175K点突变所致全身低表达Navβ2-ICD转基因小鼠新品系，为研究Navβ2的基因功能在全身各个器官系统疾病尤其是中枢神经系统提供了研究模式工具；
(2)本发明首次获得Navβ2V173A，V175K点突变低表达Navβ2-ICD转基因鼠模型，为制备预防或者治疗钠离子通道相关疾病及靶点药物提供了新的策略。在本发明中，针对Navβ2基因4号外显子上两个临近位点(661以及666、667)实施pCRISPR-gRNA诱导的同源定向修护替换点突变，将原有p.V173A位点序列“GTC”突变为“GCC”、原有p.L175K“TTG”突变为“AAG”，并将构建好的转基因片段pCRISPR-gRNA以及Donor oligo线性化，用显微注射法制作转基因小鼠；基因型鉴定、DNA测序以获得稳定遗传的Navβ2V173A，V175K点突变转基因小鼠。
(3)本发明发现，电压门控性钠离子通道亚基Nav1.6参与了Aβ1-42诱发的神经元兴奋性增加及AD动物的学习记忆能力下降；Nav1.1a亚基在神经元内的异常聚集与AD模式动物的神经元高兴奋性及认知功能障碍相关，其在神经元内的异常累积是由辅助亚基Navβ2经由BACE1的过度酶解导致的；Navβ2的编码基因SCN2B随着年龄的增加在人海马与额前皮质呈现过度表达，而作为淀粉样前体蛋白(amyloidprecursorprotein，APP)水解酶β位点APP分泌酶1(beta-siteAPP cleaving enzyme 1，BACE1)以及γ-分泌酶(γ-secretase)的新发现底物之一，Navβ2可能参与到了AD的致病过程中。
(4)由于Navβ2-ICD的生成依赖于PS/γ-secretase对于Navβ2特定酶解位点的识别，而PS/γ-secretase在生物体内存在大量的底物，涉及到体内多种重要生理过程与细胞活动，广谱的抑制剂如DAPT的应用可能会引起其他未知的副作用，因此特异性针对Navβ2-ICD生成途径的干扰措施如PS/γ-secretase酶解位点点突变有望为靶点治疗钠离子通道相关疾病如阿尔茨海默病提供有益参考。
附图说明
图1为本发明的Navβ2的编码基因SCN2B基因点突变目标策略示意图；
图中示意了SCN2B位点的基因组区域。实心棒表示开放读码框(ORF)；空心棒标示非编码区(UTRs)。
图2为本发明的Navβ2V173A，V175K点突变转基因鼠基因型鉴定及测序图；其中，a为4只转基因首建鼠PCR检测结果；M，DNA2000分子量标准；2、13、21、23分别为首建鼠编号Founder 2、13、21、23；WT，野生型小鼠；b为F0代首建鼠Founder 2PCR产物测序峰图，黑色箭头标示的为碱基突变位点；c为F0代首建鼠Founder 2、13、21、23的碱基序列；d为F0代首建鼠Founder 2、13、21、23的氨基酸序列；绿色标示的为目标靶点位置，红色标示661及666、667位点发生替换的正确碱基及氨基酸，蓝色标示计划外发生替换的碱基及氨基酸，-标示缺失。
图3为本发明的Navβ2V173A，V175K点突变转基因鼠F1代氨基酸序列示意图。绿色标示的为目标靶点位置，红色标示661及666、667位点发生替换的正确氨基酸，-标示缺失。
图4为本发明的Navβ2V173A，V175K点突变转基因鼠F1代鼠大脑组织中Navβ2及Navβ2-ICD的表达检测结果；其中，WT，野生型鼠；F1-1、F1-3、F1-5分别代表F1代三只杂合子鼠编号；a为Navβ2mRNA在各组脑组织中的RT-PCR检测结果；b为Navβ2完整蛋白(Navβ2-fulllength)在各组脑组织中的蛋白免疫印迹检测印迹图及量化结果；c为Navβ2-ICD蛋白在各组脑组织中的蛋白免疫印迹检测印迹图及量化结果；PCR及免疫印迹实验每组重复5次，取每次数据的平均值进行统计。
图5为本发明的Navβ2V173A，V175K点突变转基因鼠条件性恐惧实验的检测结果。Navβ2V173A，V175K点突变转基因鼠与同窝野生型对照小鼠进行了24小时的条件性恐惧追踪实验以及48小时(48hr)/96小时(96hr)后的情景恐惧记忆检测，WT，野生型鼠；Navβ2-MU，Navβ2V173A，V175K点突变转基因鼠；B.L.，各组小鼠在遭受电击实验之前的基础活动水平；Pre-CS，足电击之前；CS，足电击之后；其中，a为24小时条件性恐惧追踪实验不动行为百分比统计的结果；b为遭受电击前后各组小鼠不动行为百分比的比较；c为48hr/96hr后的情景恐惧记忆对于不动行为百分比的对比。n＝9。*，vs.WT，P<0.05；**，vs.WT，P<0.01；***，vs.WT，P<0.001。
图6为本发明的Navβ2V173A，V175K点突变转基因鼠新物体识别任务的检测结果。a与c为新物体识别任务的训练检测策略示意图，NOR，新物体识别；WT，野生型鼠；Navβ2-MU，Navβ2V173A，V175K点突变转基因鼠。其中，b，从训练(training)到测试(test)间隔的4小时(4hr)、24小时(24hr)、72小时(72hr)、120小时(120hr)对各组动物的DI进行记录、计算与统计，绘制记忆衰减曲线；d，为了干扰动物对于对象A和B的原始记忆，训练阶段后，在相同的背景下间隔22小时，引入了两个新的对象，C和D，2小时后，把测试对象A或B替换为C或D，测定各组动物辨别指数DI。n＝9。*，vs.WT，P<0.05；**，vs.WT，P<0.01；***，vs.WT，P<0.001。
图7为本发明的Navβ2V173A，V175K点突变转基因鼠在水迷宫中的表现评估的结果1。WT，野生型鼠；Navβ2-MU，Navβ2V173A，V175K点突变转基因鼠；Probe test 1，探针实验1。其中，a为移除平台后训练1-5天每日的寻找平台时间，即逃避潜伏期(Escape latency)(s)，b为在逃生平台所在象限(Target)的停留时间百分数；c为经过训练之后达到空间记忆标准所需要的训练次数；d为在进行了达标系列训练之后第二次实施的探针实验2中，各组小鼠在逃生平台所在象限(training quadrant)的停留时间百分数比较；e为在进行了达标系列训练之后间隔10分钟、7天以及7周测量各组小鼠在逃生平台所在象限(trainingquadrant)的停留时间百分数，以明确小鼠的空间记忆遗忘情况；f为7周后对各组小鼠分别进行4次重新训练之后对小鼠在移除平台之后逃避潜伏期的比较；g为上述训练测试结束之后进行的最后一次探针实验(PT5)中各组小鼠在逃生平台所在象限的停留时间百分数。n＝9。*，vs.WT，P<0.05；**，vs.WT，P<0.01；***，vs.WT，P<0.001。
图8为本发明的Navβ2V173A，V175K点突变转基因鼠在水迷宫中的表现评估的结果2。WT，野生型鼠；Navβ2-MU，Navβ2V173A，V175K点突变转基因鼠；a为水迷宫检测实验方案2中实施线索实验各组小鼠在撤去平台后寻找平台的逃避潜伏期(latency)比较；b为在5次不同空间记忆任务(spatial location)的空间记忆训练中达到标准所需的训练次数比较；c为在5次不同空间记忆任务(spatial location)的训练结束后10分钟进行的探针实验中，首次穿越逃生平台位置所需要的时间(The first cross latency)；d为训练达标后探针实验中各组小鼠在目标区域(逃生平台所在区域)的停留时间占比。n＝9。*，vs.WT，P<0.05；**，vs.WT，P<0.01；***，vs.WT，P<0.001。
图9为本发明的Navβ2V173A，V175K点突变转基因鼠在Y迷宫中的表现，检测指标为自发交替率(Rate of spontaneous alteration)。WT，野生型鼠；Navβ2-MU，Navβ2V173A，V175K点突变转基因鼠；n＝9。*，vs.WT，P<0.05；**，vs.WT，P<0.01；***，vs.WT，P<0.001。
图10为本发明的Navβ2V173A，V175K点突变转基因鼠海马膜片钳检测长时程增强。WT，野生型鼠；Navβ2-MU，Navβ2V173A，V175K点突变转基因鼠；fEPSP，兴奋性突触后电位。a为海马CA1区兴奋性突触后电位随时间记录的情况，经过前20分钟(-20-0min)静息状态记录后给予持续60分钟的连续高强度电刺激(1X TBS)，诱发兴奋性突触后电位；b为各组小鼠海马脑片兴奋性突触后电位的统计值。n＝3。*，vs.WT，P<0.05。
图11为本发明的Navβ2V173A，V175K点突变转基因鼠海马透射电镜检测结果。WT，野生型鼠；Navβ2-MU，Navβ2V173A，V175K点突变转基因鼠。a、b、c、d中标尺为1μm，e和f标尺为500nm。
图12为本发明的Navβ2V173A，V175K点突变转基因鼠海马区BDNF exon I-V以及蛋白水平的表达检测。WT，野生型鼠；Navβ2-MU，Navβ2V173A，V175K点突变转基因鼠。a为各组小鼠海马BDNF exon ImRNA表达水平的检测统计图；b为各组小鼠海马BDNF exon II mRNA表达水平的检测统计图；c为各组小鼠海马BDNF exon III mRNA表达水平的检测统计图；d为各组小鼠海马BDNF exon IV mRNA表达水平的检测统计图；e为各组小鼠海马BDNF exonVmRNA表达水平的检测统计图；f为各组小鼠海马成熟BDNF蛋白表达的检测免疫印迹图及定量统计图。n＝9。*，vs.WT，P<0.05；**，vs.WT，P<0.01；***，vs.WT，P<0.001。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明的一种Navβ2V173A，V175K点突变转基因小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
(1)根据数据库公布的Navβ2的编码基因SCN2B序列(SCN2B gene，GenBankaccession number:NM_001014761.2；Ensembl:ENSMUSG00000070304)，与人SCN2B基因序列进行比对，寻找同源突变位点。
设计Navβ2上PS/γ-secretase的酶解位点V173A及V175K点突变。SCN2B基因位于小鼠9号染色体上，共鉴定出4个外显子，ATG起始密码子在外显子1，TAA终止密码子位于外显子4。靶点的酶解位点p.V173及p.L175均位于第4外显子。因此，将外显子4选为目标位点(见图1)。
设计向导核糖核酸(gRNA)靶向载体和供体寡核苷酸(具有靶向序列，两侧结合120bp的同源序列)。其中，所述突变前的野生型等位基因序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列：GAGCGGGACTCCACGGTGGCGGTCATCGTGGGTGCCTCAGTGGGGGGTTTCCTGGC//TGTG(GTC)A//TC(TTG)GTGCTGATGGTGGTCAAATGTGTGAGGAGGAAAAAAGAGCAGAAGCTGAGCACGGATGAC(“//”标示gRNA切割位置)；
所述突变后的野生型等位基因序列为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列：GAGCGGGACTCCACGGTGGCGGTCATCGTGGGTGCCTCAGTGGGGGGTTTCCTGGCTGTG(GCC)ATC(AAG)GTGCTGATGGTGGTCAAATGTGTGAGGAGGAAAAAAGAGCAGAAGCTGAGCACGGATGAC(注：在靶向突变成功后，野生型等位基因括号中的序列将被突变等位基因括号中的序列所取代)；
gRNA目标序列：
所述的gRNA-A1的匹配正向链的基因序列为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；gRNA-A1(匹配正向链的基因)：TTTCCTGGCTGTGGTCATCT-TGG
所述的gRNA-B1的匹配反向基因链的基因序列为SEQ ID No.4所示的核苷酸序列：GCACCAAGATGACCACAGCC-AGG；
(2)构建pCRISPR-gRNA载体。选用pCRISPR-LvSG06载体质粒，使用EcoRⅠ和NheⅠ限制性内切酶酶切载体质粒，将EcoRⅠ和NheⅠ同时切开的载体片段回收，后用T4链接酶将回收后的载体片段与退火后的gRNA连接。将载体与gRNA连接后的产物转化，提取质粒。将提取后的质粒从载体U6启动子后开始测序，测序结果与gRNA靶点序列进行比对。
(3)将构建好的质粒载体转入菌种进行DNA的提取，通过大量制备质粒DNA，电泳、用凝胶回收试剂盒回收DNA片断，凝胶柱纯化DNA，并用TE溶液对DNA进行溶解回收；
(4)设计和获得供体寡核苷酸(Donor oligo)，将原有p.V173A位点序列“GTC”突变为“GCC”、原有p.L175K“TTG”突变为“AAG”，所述的寡核苷酸序列为SEQ ID No.5所示的核苷酸序列：
GAGCGGGACTCCACGGTGGCGGTCATCGTGGGTGCCTCAGTGGGGGGTTTCCTGGCTGTGGCCATCAAGGTGCTGATGGTGGTCAAATGTGTGAGGAGGAAAAAAGAGCAGAAGCTGAGCACGGATGAC(突变序列用红色标示)。供体寡核苷酸p.V173A(GTC-GCC)和p.L175K(TTG-AAG)通过同源性定向修复被引入第4外显子；寡核苷酸序列的合成、鉴定、纯化，备用。
(5)显微注射液制备。用0.22μm的滤膜过滤的TE显微注射稀释液稀释核酸样品(pCRISPR-gRNA以及Donor oligo)，12000g，离心2小时，上清液的2/3进行分装，用于显微注射。
(6)将构建好的转基因片段pCRISPR-gRNA以及Donoroligo线性化，用显微注射法制作转基因小鼠；PCR鉴定阳性转基因鼠。
其中，显微注射法制作转基因小鼠方法包含以下实验步骤：
a.超数促排卵操作。第一天注射孕马血清促性腺激素，10IU/只(0.2ml/只)，48小时后注射人绒毛膜促性腺激素10IU/只(0.2ml/只)；同时，选取健康雄性6周左右C57BL/6J小鼠与上述接受促排卵操作的雌性小鼠1:1合笼交配，观察阴栓情况，有阴栓的小鼠提出待用，即为供卵小鼠，备用。
b.取卵。将供卵小鼠麻醉后腹部向上放置，备皮暴露腹部，用剪刀和镊子逐层分离皮肤、筋膜、肌肉，暴露卵巢、输卵管和子宫，分离输卵管，用镊子将输卵管放置到M2培养基中，解剖显微镜下打开输卵管的壶腹部，使卵流到培养液里。向培养液里加入l mg/ml的透明质酸酶，并用M2培养基冲洗3-4遍，去除颗粒细胞。在显微镜下进行观察，对受精卵与其他细胞进行鉴别，因受精卵排出第二极体，而未受精卵和其他变成异常形态的卵可以容易地进行区别。选好的受精卵，移到盛着M2培养基液滴的塑料皿(直径35mm)中，移至二氧化碳孵箱(37℃，5％二氧化碳，95％空气)中培养直到受精卵适合注射为止。
c.显微注射。显微注射法将线性化的转基因载体片段注射到C57BL/6J小鼠的受精卵雄性原核中，其中含有前期纯化的pCRISPR-gRNA以及Donor oligo的混合物，gRNA浓度为10ng/μL，Cas9 mRNA浓度为35ng/μL，寡核苷酸浓度为15ng/μL。在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。在载物玻片上作成约有20个左右受精卵的培养液滴和转基因载体片段溶液滴，固定到载物台上，用持卵吸管将受精卵加以固定，玻璃吸管注入转基因载体片段溶液滴，将其缓慢地注入雄性原核。注射完毕后收集受精卵，37℃二氧化碳培养箱中培养一夜。
d.移植。将假孕小鼠麻醉，手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。显微镜下，挑出分裂为两细胞的受精卵，备用。吸取上述受精卵，将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，逐层缝合。
(7)PCR法鉴定阳性转基因鼠，转基因小鼠在出生9-14天用剪趾法标记，收集剪下的组织，用碱裂解法提取基因组DNA，利用特异引物通过PCR法进行检测，检测引物序列如下：
所述的检测引物序列的上游引物为SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；5′GAAGACATCCACACCTTCCCT 3′；
所述的检测引物序列的下游引物为SEQ ID No.7所示的核苷酸序列：5′AATCTCAGATACCAAGG CAGT 3′。
PCR鉴定阳性者作为实验组，阴性者作为同窝野生型对照；并经PCR产物测序再次确认获得目的基因点突变的F0代小鼠。从图2a可知，成功获得表达250bp目的片段的Navβ2V173A，V175K点突变转基因小鼠，共4个品系，根据脚趾编号分别命名为FounderN(Founder2，13，21，23)，与野生型(wild type，WT)相比，均可以在鼠尾DNA基因组检测中检测到250bp目的片段。
与正常野生型小鼠Navβ2基因序列比对，发现Founder2 PCR产物扩增片段序列，确定661位点的碱基由“T”变为“C”且未出现套峰，666、667位点的碱基由“TT”变为“AA”也未出现套峰，说明Founder 2在173位Val氨酸(V)突变为Ala丙氨酸(A)、175位Leu亮氨酸(L)突变为Lys赖氨酸(K)，Founder 2为Navβ2V173A，V175K点突变纯合子，其峰图鉴定结果如图2b所示。另外，首建鼠Founder 13、21以及23为Navβ2V173A，V175K点突变杂合子。四只首建鼠碱基序列和氨基酸序列如图2c及2d所示。基因型鉴定发现，所有F0代4个品系小鼠均发生了Navβ2基因的突变，突变类型有碱基插入、替换和缺失，以碱基替换和缺失为主。
为了验证利用本发明中由gRNA-Cas9介导的突变是否可以稳定遗传至子代，将F0代小鼠中纯合子Founder 2的雄鼠在正常饲养环境下生长至性成熟期(约5-6周龄)后与两只WT的C57BL/6J雌鼠合笼，共获得5只F1代小鼠，将其编号为F1-1至F1-5。对F1代小鼠进行基因型检测，方法同F0代。结果发现，获得的5只F1子代鼠中有3只(F1-1、F1-3、F1-5)为Navβ2V173A，V175K鼠，突变情况如图3所示，突变类型有碱基替换和缺失，表明这种突变可以稳定遗传，本发明成功获得了可稳定遗传的Navβ2V173A，V175K点突变转基因小鼠。运用F0与F1代通过回交与杂交，扩大群体，获得足够数量的杂合子与纯合子转基因小鼠。
步骤8、运用RT-PCR及Westernblot技术筛选出Navβ2-ICD表达水平最低的品系，建立稳定的Navβ2V173A，V175K点突变即Navβ2-ICD低表达小鼠模型；首建鼠合笼后得到数只F0代鼠，为排除不同重组方式对诱导点突变效果的影响，运用RT-PCR及WB技术对F1代鼠(F1-1、F1-3、F1-5)进行Navβ2基因、蛋白以及Navβ2-ICD蛋白表达检测，筛选出Navβ2-ICD表达水平最低的品系，留种繁殖。
如图4a、b所示，与WT组相比，因为是裂解酶位点点突变未影响Navβ2的mRNA在转基因鼠大脑中的表达，因此Navβ2的转录及总蛋白水平也无改变；如图4c所示，与WT组相比，Navβ2V173A，V175K点突变诱导成功诱导了Navβ2的细胞内片段ICD在三个杂合子子代F1-1、F1-3、F1-5大脑中的表达被显著抑制，均可作为后续研究，亦说明杂合子鼠即可满足研究需求。
本发明成功获得Navβ2V173A，V175K点突变转基因小鼠数只，这些小鼠中Navβ2-ICD的表达均受到了显著抑制，首次运用酶解位点突变的方法构建成功了Navβ2-ICD低表达的转基因小鼠，并进行了表型检测，发现Navβ2V173A，V175K点突变转基因小鼠表现出了较好的条件恐惧记忆与空间学习记忆，为进一步的深入研究尤其是学习记忆调节机制提供了模式动物平台。并克服了γ-secretas酶抑制剂靶点广泛、副作用明显等不足，为精准研究钠离子通道疾病奠定了基础。
本发明所述的Navβ2-ICD低表达转基因鼠模型在酶解底物抑制剂中的应用。
以下将配合运用该转基因小鼠模式动物进行试验例来详细说明本发明的效能及部分运用效果，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
试验例1
条件性恐惧实验检测Navβ2V173A，V175K点突变转基因小鼠的认知功能
为了检测Navβ2V173A，V175K点突变对转基因小鼠的记忆影响，运用恐惧条件反射追踪小鼠的行为表现。实验动物被放置在一个房间中，并允许其自由探索3min。然后，用20s的声噪(80分贝，12000Hz)进行5次电击，随后实施2s 0.6mA电击，每次重复间隔4min。动物在接受最后一次电击30s后被移开，声噪和电击间隔20s。在追踪恐惧记忆测试中，小鼠在第二天的3min适应环境后，在一个新的环境中呈现相同的声噪刺激。在情境恐惧记忆测试中，小鼠在48小时后或96小时后暴露于训练情境中3min。检测记录小鼠的不动次数及持续时长。计算每次试验之间的比值以绘制训练曲线。在测试阶段，在音调刺激实施后1min记录不动次数及持续时长。(实验方法参照以下文献：[1]LiuY，Du S，Lv L，Lei B，Shi W，Tang Y，Wang L，Zhong Y.HippocampalActivation ofRac1 Regulates the Forgetting ofObjectRecognition Memory.CurrBiol.2016；26(17):2351-2357.)
结果如图5所示。随着条件恐惧实验的延续，各组小鼠对声噪及电击刺激的记忆逐渐强化，表现为在24小时追踪的观察期内不动时间比例(Freezing％)逐渐增加(图5a)，在受到足电击后不动时间比例增加(图5b)，在随后的48小时或96小时的测试中不动时间比例随遭受刺激后间隔时间的延续有所降低(图5c)；其中，Navβ2V173A，V175K点突变转基因小鼠(Navβ2-MU)对条件性恐惧的记忆更为清晰，表现为遭受刺激后不动时间比例增加且随时间延续对刺激的恐惧记忆加强、消退减弱，与野生型组小鼠相比差异具有统计学意义。
试验例2
新物体识别任务测试Navβ2V173A，V175K点突变转基因小鼠的遗忘行为
在习惯适应阶段，各组小鼠被放置在一个房间(50厘米×50厘米×40厘米)，允许他们自由探索环境10分钟，记录此过程。这一阶段还进行了开放场地测试，以评估动物的基础运动活动，记录动物活动的平均速度、花在场地中间位置(30厘米×30厘米)的时间百分比。在训练阶段，动物被放置在包含两个不同物体的同一个房间中5分钟，并允许探索物体。在测试阶段，将其中一个物体与一个新的物体交换，使用ANY-MAZE软件分别记录探索这两个物体的时间。辨别指数(discrimination index，DI)的计算公式为：(探索新物体的时间-探索熟悉物体的时间)/(探索新物体的时间+探索熟悉物体的时间)×100％。从训练到测试间隔的4小时、24小时、72小时、120小时对各组动物的DI进行记录与计算，绘制记忆衰减曲线。为了干扰动物对于对象A和B的原始记忆，训练阶段后，在相同的背景下不同的时间间隔(2小时、8小时或22小时)下，引入了两个新的对象，C和D，把测试对象A或B替换为C或D。为了在测试阶段平衡动物对于不同对象的偏好，将一半的动物暴露在物体A下，另一半暴露在物体B下作为熟悉的物体。(实验方法参照以下文献并有所改良：[1]LiuY，Du S，Lv L，Lei B，Shi W，TangY，Wang L，ZhongY.HippocampalActivation of Rac1 Regulates theForgetting of Object Recognition Memory.Curr Biol.2016；26(17):2351-2357.[2]WuW，Du S，Shi W，LiuY，HuY，Xie Z，Yao X，LiuZ，MaW，Xu L，Ma C，ZhongY.InhibitionofRac1-dependent forgetting alleviates memory deficits in animal modelsofAlzheimer's disease.Protein Cell.2019；10(10):745-759.)
结果如图6所示。野生型(WT)鼠与Navβ2V173A，V175K点突变转基因(Navβ2-MU)小鼠在训练后随着时间的延续，对于新物体的记忆逐渐衰退，WT于间隔72小时后消减到最低水平持续到120小时，而Navβ2V173A，V175K点突变转基因小鼠对新物体记忆的衰退延至120小时后才到最低水平(图6b)，72小时仍保存有部分记忆，与WT组相比差异具有统计学意义(P<0.01)；在常规训练后间隔22小时引入了新的测试对象实施了记忆的重激活干扰(retroactive interference，RI)后，对原有记忆仍然保留。认知指数与WT相比显著增加(P<0.001)(图6d)。
试验例3
改良的Morris水迷宫评价Navβ2V173A，V175K点突变转基因小鼠空间学习记忆及遗忘行为
水迷宫由一个直径2.0米的大圆形水箱组成(深度0.5米；温度25℃±1℃)，加入400毫升液体乳胶，使其不透明。整个训练评估分为两个部分，实验1中逃生平台直径为20cm，实验2中逃生平台直径为13cm，逃生平台顶面埋于水面以下1.5cm处。实验小鼠被放置在面向侧壁的水中，从同一房间的一个运输笼中人工运到那里。标记突出的提示标志被放置在试验室周围迷宫之外，以引导动物熟悉平台的位置。动物的游泳行为由一个视频跟踪系统监控。在线索训练过程中，使用一个20cm高的物体来标记平台(20cm直径)，并在试验中随机放置在不同的位置。泳池被白色窗帘包围，以遮挡外部线索。在空间导航过程中，窗帘会在某个点拉在一起，隐藏的平台不会被任何局部线索标记出来。(实验方法在参照以下文献的基础上有所改进：Daumas S，Sandin J，Chen KS，Kobayashi D，Tulloch J，Martin SJ，Games D，Morris RG.Faster forgetting contributes to impaired spatial memory inthe PDAPP mouse:deficit in memory retrieval associated with increasedsensitivity to interference？Learn Mem.2008Aug26；15(9):625-32.doi:10.1101/lm.990208.)
实验方案1：
训练在概念上被划分为三个不同的阶段——标准训练、遗忘测试和记忆重新激活训练。
标准训练。初始阶段的训练由前三天进行有线索提示的可见平台逃生训练，以及接下来连续5天的空间参考记忆训练组成(共8天)。所有的动物均进行每天四次试验，每次最高试验持续时间90秒(另外附加的30秒的平台在每个试验)每个实验之间间隔10分钟，在第五天训练结束10分钟后，本发明进行了一个探针测试(probe test 1，PT1)，在这个测试中，平台被移除，动物被放置在游泳池中游泳60秒。为了研究遗忘与学习之间的独立关系，有必要让所有动物都处于同等高水平的记忆表现。因此，这一训练阶段的关键最后部分涉及到标准培训(8次/天；8次连续试验的平均值<20秒，或最多开展不超过40次的试验训练)。在所有受试动物均达到上述标准后，休息10min后，进行第二次探针试验2(PT2)。
研究的下一个步骤是确定动物“学习缺陷”的一个组成部分是否包括遗忘率的增加。为了检验这一点，首先必须训练所有的受试动物均达到同等的表现水平。因此，所有的小鼠都继续进行空间导航任务，直到每只都符合严格的表现标准(完成8次连续的逃避潜伏期<20秒的试验任务或完成40个试验任务)。
遗忘测试。在完成了三次连续的“探针实验”或记忆保留测试(PT 2-4)之后，在没有干预训练的情况下对各组实验动物进行比较，以检查遗忘行为的发生。
在实验动物均具有了有效记忆的基线基础上，又进行了一系列的两次探测测试。每次测试之间没有额外的训练干预。在第二次(PT2)探针试验后，将动物放回笼中7d，第八天进行探针试验PT3，再放回笼中7周，之后进行第四次探针试验PT4。
记忆重新激活。在PT4结束之后的第5天，动物们被给予一组有限的，只有4次的再训练，训练其识别之前放置平台的位置。再间隔10分钟后，进行最后一次探查测试(探针试验PT5)，以监测再次训练的结果。
实验方案2
训练划分为三个不同的阶段:线索任务训练、标准任务训练和探针测试。
线索任务训练。开始阶段的训练进行有线索提示的可见平台逃生训练，持续4天。
标准任务训练。接下来，每组动物将接受一系列的空间学习任务训练，包括五项空间参考记忆任务训练。每个任务构成一个独立的空间问题，所有五个问题都发生在同一个实验室内的水迷宫中。每个训练任务中平台的位置不同，有置于内圈(直径1米)，也有置于外圈(直径1.5米)。通过这种方式，每个任务问题的平台位置不同，但在每天的训练和每个训练任务直到达到标准之前均保持一致。通过反复训练，使实验动物的任务表现达到一致的标准，每例动物进行的训练次数最多不超过32次；但如果在连续3次试验中达到了平均逃脱潜伏期<20秒的标准，训练就会停止。训练的每一天进行不一样的空间问题训练。每天最多进行八次试验，每次实验间隔10分钟。
探针测试。为了评估实验动物对每个平台位置的记忆强度，每次动物成功完成5个记忆任务并达到标准后10分钟后，再次进行探针测试。记录动物穿过正确平台位置的潜伏期(首次穿越潜伏期)，以及其在以正确位置为中心的区域中游泳的时间(区域分析)。区域分析评估的是，在到达正确的平台位置附近后，动物继续在那个区域搜索而不是池中的其他地方搜索的程度。在这个目标区域(18厘米半径)所花费的时间与在五个可能的目标位置(即20％的几率水平)所花费的总时间进行比较、分析。
在此项训练检测中为了部分区分学习记忆、遗忘行为的过程，所有的实验动物在PT4之后都被给予非常有限的再训练，以唤起它们之前的对于平台位置的记忆。这样的再次训练主要目的是作为一个平台的存在和位置的线索“提示”，并将只足够恢复潜在的记忆痕迹，这些记忆痕迹以某种方式变得不可访问；如果记忆痕迹强度真的下降到零，那么需要大量的再次训练才能使动物的表现恢复到7周之前的水平。
结果如图7所示，在标准训练阶段(实验方案1)，各组小鼠结果三天的线索提示指引下均可以在接下来连续5天空间参考记忆训练中逐渐对逃生平台的位置熟悉、记忆、强化，各组逃避潜伏期无差异(图7a)；而在第一次探针实验中(PT1)，与野生型鼠相比，Navβ2V173A，V175K点突变转基因鼠在目标平台所在象限停留的时间占比显著增加(图7b)、达到标准所需的训练次数显著减少(图7c)、PT2实验中在目标平台所在象限停留的时间占比显著增加(图7b)、在PT3-4实验中在目标平台所在象限停留的时间占比显著增加(图7d)，在记忆重新激活训练中逃避潜伏期缩短(图7f)，PT5实验中在目标平台所在象限停留的时间占比也显著增加(图7g)，但是在间隔7周后的遗忘测试中在目标平台所在象限停留的时间占比与野生型组相比没有优势(图7e)，以上结果说明，Navβ2V173A，V175K点突变转基因鼠具备较强的空间记忆学习、强化能力，且在结果记忆重新激活训练后，较野生型鼠更快恢复对原有逃生平台的空间记忆，表现出较好的水迷宫空间学习记忆能力。
另外，在引入变换逃生平台所处位置等空间记忆干扰信息后(实验方案2)，与野生型鼠相比，Navβ2V173A，V175K点突变转基因鼠依然保持对逃生平台较好的记忆力，在1、2、4、5次不同的空间记忆训练中达到标准所需的训练次数较少(图8b)；在2、3次探针实验中，首次穿越逃生平台位置所需要的时间缩短(图8c)；在2-5次探针实验中，在目标区域停留的时间占比增加，且具有统计学差异(图8d)。说明Navβ2V173A，V175K点突变改善了小鼠的空间学习记忆能力。
试验例4
Y迷宫任务测试Navβ2V173A，V175K点突变转基因小鼠学习记忆能力
实验所用Y形迷宫(上海欣软)由三个夹角互为120°的臂组成，臂长30厘米，高15厘米，宽10厘米，三只臂分为1只起始臂和2只非起始臂(包含一只新异臂和一只其他臂，训练时用挡板挡住的臂称之为新异臂，训练阶段可自由探索的臂称为其他臂)，在各臂做好标记，即标记为A、B、C三臂。训练阶段：将小鼠放置在起始臂的末端，小鼠头部朝向Y迷宫中心处。允许小鼠在15分钟内自由探索迷宫，并适应迷宫环境。15分钟适应训练结束后，首先记录结束时间，在此时间点1h后进行测试。测试阶段：测试阶段时间为5分钟，同时撤除新异臂入口处的挡板，让小鼠自由进入全部三个臂中，同时使用摄像机记录小鼠测试阶段的行为，使用Supermaze软件记录小鼠运动路径、进入各臂的总次数(N)、进臂顺序以及进入各臂的持续时间。另外，在每次测试之前，均使用浓度为75％的乙醇溶液擦拭迷宫内部来消除气味，同时清除迷宫内粪便、毛发、尿液等，从而减少混杂因素的影响。
结果如图9所示。与野生型鼠相比，Navβ2V173A，V175K点突变转基因鼠表现出在正确臂的自发交替率增加，提示Navβ2V173A，V175K点突变小鼠具备更好的在Y迷宫任务中的学习记忆能力。
试验例5
神经电生理技术检测转基因鼠海马LTP
脑片的制备。脑片制备采用以下制作程序进行。实验动物麻醉后，用冰浴冷却的切片溶液(cutting solution)做心脏灌流：心脏左心室插入针头重力灌注，剪开静脉窦形成体循环灌流，肝脏颜色变浅或变白为灌流充分标准。切片溶液在被冻冰以前被95％O2和5％CO2饱和。断头取脑、修块并快速移到振动切片机上350微米切片。脑片被移入盛有人工脑脊液的孵育槽中室温孵育1.5h。记录前轻轻的将脑片转移至记录槽中并用压片网压牢，记录槽中温度由温控器控制在30oC。
LTP的记录。本实验均在30oC下进行，脑片移入记录槽内，通过重力灌流系统以95％O2和5％CO2饱和的ACSF持续灌流，流速为2ml/min左右。通过红外显微镜10倍物镜定位海马CA1区，通过40倍水镜观察细胞并通过监视器完成电极的放置。记录细胞均为海马CA1区锥体细胞，实验过程中，只有静息电位负于-55mV的神经元才进行下一步实验。电极内加入内充溶液。刺激隔离器(美国)连接硅硼玻璃管刺激电极，刺激电极放置于Schaffer侧支/联合纤维中，距离所记录神经元的树突50-100μm。随后进行全细胞电流钳记录，20-25min稳定基线后给予pre-post paired Theta-bursts induction诱导LTP，诱导参数为：25mstime window、3AP/burst、10burst/train、5trains。诱导后记录1个小时，与基线相比较计算LTP幅值。
整个记录过程中持续监测输入阻抗，变化率不超过20％为稳定记录，数据方可进行统计学分析。
结果如图10所示。在记录脑片的海马CA1区域随着电刺激强度的增加，记录到的兴奋性突触后电位(fEPSP)信号也成比例的加大，说明记录区脑片的细胞活力良好，细胞状态稳定，可以完成后续实验；由图10a-b可知，在经过20分钟静息状态记录后给予连续高强度电刺激(1XTBS，60分钟)，Navβ2V173A，V175K点突变转基因小鼠脑片呈现出较高的fEPSP，与野生型相比，差异具有显著性，说明Navβ2V173A，V175K点突变后小鼠海马的神经可兴奋性增加，间接反映了学习记忆能力的提高，与之前行为学检测的实验结果一致。
试验例6
透射电镜检测Navβ2V173A，V175K点突变转基因小鼠海马区神经元超微结构的改变
使用无齿镊分别提取各组小鼠大脑额叶区脑皮质及海马组织标本各1-2块，组织块大小不超过1mm×1mm×1mm。取材完成后立即置于4％戊二醛与4％多聚甲醛的混合液中浸泡2h固定，固定完毕后将组织块取出置于0.01mol/L PBS缓冲液中漂洗3次，15min/次。之后将组织标本置于锇酸溶液中常温下行2h后固定，2小时后再次置于双蒸水中漂洗3次，15min/次。随后依次浸入75％乙醇、85％乙醇、90％乙醇、95％乙醇、100％无水乙醇Ⅰ与100％无水乙醇Ⅱ的梯度浓度酒精中进行脱水处理，每个浓度各浸泡10min，最后置于100％丙酮溶液中浸泡15min。将组织块取出行环氧树脂包埋聚合，置于60℃烘箱中聚合固化48h。结束后使用超薄切片机切片，切片用2％醋酸轴饱和酒精浸泡45min以及枸橼酸中电子染色15min。染色结束后切片晾干过夜。随后将切片置于在透射电子显微镜中观察额叶皮质与海马神经元超微结构变化并进行拍照。
结果如图11所示。各组小鼠海马神经元大而圆，染色质分布均匀，细胞质膜完整，核仁明显，细胞器丰富，线粒体结构正常(图11a-b)，可见较多突触结构(图11c-d)；而与野生型鼠相比，Navβ2V173A，V175K点突变转基因小鼠海马区神经毡突触结构增加，可见在形成中的突触结构(图11e-f)。提示，Navβ2V173A，V175K点突变促进了小鼠海马神经突触的形成，从而改善了小鼠在行为学实验中的学习记忆任务表现。
试验例7
通过Navβ2V173A，V175K点突变转基因小鼠验证Navβ2通过对BDNF的转录调控发挥遗忘调节的作用
BDNF基因结构复杂，其mRNA外显子exon存在不同剪接变异体，人类有11个不同的外显子，啮齿类动物有9个，均对应有9个不同的启动子，这些不同的启动子调控的剪接片段在神经系统发生发育、疾病发生时不同脑区的适时表达发挥着各自不同的生物学功能，由此赋予了BDNF应对各种刺激的能力，而在AD等疾病状态下BDNF不同exon的转录水平改变往往与疾病的发生进展密切相关。
本发明的前期研究证实，BDNF exon I-V在Navβ2knockdown后表达增加，提示Navβ2knockdown对BDNF的转录调控作用；本发明推测，Navβ2knockdown发挥了抗脑老化、改善神经元内环境、促进认知功能恢复的作用，其机制可能与Navβ2酶解产生的功能片段Navβ2-ICD触发的BDNF转录调节有关。因此，本发明运用Navβ2V173A，V175K点突变转基因小鼠，检测Navβ2-ICD表达减少后是否会对神经元内BDNF转录水平及蛋白表达的影响，以验证Navβ2/Navβ2-ICD对BDNF转录调控。
结果如图12所示，Navβ2V173A，V175K点突变后引起海马区BDNF exon I-V的转录水平增加(RT-PCR检测，图12a-e)、成熟BDNF的蛋白表达水平增加(Westernblot检测，图12f)，与野生型鼠相比，差异具有统计学意义。提示，Navβ2V173A，V175K点突变可引发BDNF在学习记忆功能脑区海马的转录增强、表达水平增加，BDNF的表达增加可以解释Navβ2V173A，V175K点突变小鼠海马区神经元电活性增加、空间学习记忆功能的改善，与前面行为学及电生理实验的结果相符；证明了Navβ2V173A，V175K点突变诱发的Navβ2-ICD表达减少后激活了海马神经元内BDNF转录水平、增加了蛋白表达，验证了Navβ2/Navβ2-ICD对BDNF转录调控。
上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改，并能够在本发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 昆明医科大学
<120> 一种Navβ2-ICD低表达转基因鼠模型的构建方法及其应用
<130> 2022
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(突变前的野生型等位基因序列)
<400> 1
gagcgggact ccacggtggc ggtcatcgtg ggtgcctcag tggggggttt cctggctgtg 60
gtcatcttgg tgctgatggt ggtcaaatgt gtgaggagga aaaaagagca gaagctgagc 120
acggatgac 129
<210> 2
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(突变后的野生型等位基因序列)
<400> 2
gagcgggact ccacggtggc ggtcatcgtg ggtgcctcag tggggggttt cctggctgtg 60
gccatcaagg tgctgatggt ggtcaaatgt gtgaggagga aaaaagagca gaagctgagc 120
acggatgac 129
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(gRNA-A1匹配正向链的基因序列)
<400> 3
tttcctggct gtggtcatct tgg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(gRNA-B1的匹配反向基因链序列)
<400> 4
gcaccaagat gaccacagcc agg 23
<210> 5
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(寡核苷酸序列)
<400> 5
gagcgggact ccacggtggc ggtcatcgtg ggtgcctcag tggggggttt cctggctgtg 60
gccatcaagg tgctgatggt ggtcaaatgt gtgaggagga aaaaagagca gaagctgagc 120
acggatgac 129
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(检测引物序列的上游引物)
<400> 6
gaagacatcc acaccttccc t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(检测引物序列的下游引物)
<400> 7
aatctcagat accaaggcag t 21

Claims (4)

1.一种Navβ2-ICD低表达转基因鼠模型的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）设计pCRISPR-gRNA 载体和供体寡核苷酸：gRNA的正向链的基因序列为SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列； gRNA的反向链的基因序列为SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；供体寡核苷酸序列为SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；供体寡核苷酸p.V173A (GTC - GCC)和p.L175K (TTG - AAG)通过同源性定向修复被引入第4外显子：设计Navβ2上PS/γ-secretase的酶解位点V173A及V175K点突变，SCN2B基因位于小鼠9号染色体上，共鉴定出4个外显子，ATG起始密码子在外显子1，TAA终止密码子位于外显子4，靶点的酶解位点p.V173及p.L175均位于第4外显子；
（2）构建pCRISPR-gRNA 载体；
（3）将构建好的pCRISPR-gRNA 载体转入菌种进行DNA的提取，通过大量制备质粒DNA，电泳、用凝胶回收试剂盒回收DNA片断，凝胶柱纯化DNA，并用TE溶液对DNA进行溶解回收；
（4）供体寡核苷酸序列的合成、鉴定、纯化，备用；
（5）显微注射液制备；
（6）将构建好的pCRISPR-gRNA载体以及供体寡核苷酸线性化，用显微注射法制作转基因小鼠；
（7）PCR法鉴定阳性转基因鼠，转基因小鼠在出生9-14天用剪趾法标记，收集剪下的组织，用碱裂解法提取基因组DNA，利用特异引物通过PCR法进行检测；
（8）运用RT-PCR及Western blot技术筛选出Navβ2-ICD表达水平最低的品系，建立稳定的Navβ2V173A，V175K点突变制得Navβ2-ICD低表达转基因鼠模型。
2.根据权利要求1所述的Navβ2-ICD低表达转基因鼠模型的构建方法，其特征在于：在步骤（5）中，用0.22µm的滤膜过滤的TE显微注射稀释液稀释核酸样品，pCRISPR-gRNA载体以及供体寡核苷酸，11000g-12000g，离心1.5-2小时，上清液的2/3进行分装，用于显微注射。
3.根据权利要求1所述的Navβ2-ICD低表达转基因鼠模型的构建方法，其特征在于：在步骤（7）中，所述检测时的检测引物序列的上游引物为SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，所述的检测引物序列的下游引物为SEQ ID No.7所示的核苷酸序列。
4.权利要求1至3任一项所述的Navβ2-ICD低表达转基因鼠模型的构建方法构建得到的Navβ2-ICD低表达转基因鼠模型在制备学习记忆能力衰退药物中的应用。
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Neonatal Scn1b-null mice have sinoatrial node dysfunction, altered atrial structure, and atrial fibrillation;Roberto Ramos-Mondragon;《JCI Insight》;第7卷(第10期);编号e152050 *

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