KR20150000827A

KR20150000827A - 항균 및 방부 활성을 갖는 녹농균 배양액 추출물을 포함하는 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20150000827A
Application number: KR20140075507A
Authority: KR
Inventors: 최승현; 박가인
Original assignee: 재단법인 제이씨비 공동생물과학연구소
Priority date: 2013-06-24
Filing date: 2014-06-20
Publication date: 2015-01-05
Also published as: KR101633888B1; JP2017519824A

Abstract

본 발명은 녹농균 배양액 추출물을 유효성분으로 포함하는 방부용 및 항생 조성물을 제공한다. 본 발명은 녹농균 배양액 추출물을 유효성분으로 포함하는 여드름 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 녹농균 배양액 추출물을 포함하는 조성물은 다양한 균들에 대해 폭넓은 항균 스펙트럼 및 높은 항산화 효과를 나타내며 이러한 조성물은 화장품과 같은 화장료 조성물에 적용이 가능하며 이외에도 식품, 의약품, 농약 및 생활용품 등의 다양한 분야에서 항균, 살균, 방부 목적으로 유용하게 이용가능하다. 본 발명은 녹농균 배양액 추출물의 항균효과를 야기하는 특정한 유효성분을 규명하고 그 구조를 제공한다.

Description

항균 및 방부 활성을 갖는 녹농균 배양액 추출물을 포함하는 조성물 및 이의 용도{Composition Comprising of Pseudomonas aeruginosa Media Extract Having Antimicrobial and Antiseptic Activity and The Use Thereof}

본 발명은 항균 및 방부 활성을 갖는 녹농균 배양액 추출물을 포함하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

파라벤은 주로 화장품, 식품, 약품 등에 미생물의 성장을 억제하고 보존기간을 증가시키는데 이용되는 살균성방부제로 일반적으로 독성을 갖지 않는 것으로 알려져 1920년 중반에 약품에 처음 사용된 이래 오랫동안 사용되어 오고 있다. 파라벤의 사용이 광범위하며, 다양한 제품에서 사용이 장기화되고 있는 반면 파라벤의 에스트로젠성에 대한 연구들이 보고되면서 사람에 대한 파라벤류의 안전성 문제가 제기되고 있다.

실험동물을 대상으로 한 다양한 분석결과를 토대로 파라벤의 급성, 아급성 및 만성독성에 대한 연구들이 이루어져 메틸파라벤의 피부염증반응, 메틸과 프로필 파라벤의 지연성, 접촉성, 과민성유발 등 감작반응이 보고되었고, 파라벤의 발암성에 관해서는 파라벤이 에스트로젠성을 가지므로 화장품 사용을 통한 파라벤과 유방암과의 관련성이 제시되었다. 파라벤의 항안드로젠성 또한 수컷 생식계의 기능을 방해하는 것으로 알려졌고, 또한 하수로 방출된 파라벤이 생태계를 비롯한 환경에 미치는 내분비장애 영향에 대해서도 논의가 되고 있다. 그 잠재적인 유해성에도 불구하고 계속적으로 다양한 분야에서 파라벤이 사용되어지고 있는 이유는 천연성분의 방부력이 기존의 화학 합성 방부제만큼 뛰어나지 못하기 때문인 것으로 분석되고 있다. 그러나 위에서 언급한 파라벤류의 위험성이 보고되면서 소비자들은 파라벤류 방부제 사용에 대한 거부감을 표현하고 있고 대체 천연보존제의 요구가 증가되고 있는 실정이다.

생물 계면활성제(biosurfactant)는 미생물, 동물, 식물과 같은 생물 소재로부터 얻어지는 계면활성제로서 저독성이며, 생태계에 의한 분해가 용이하기 때문에 주목을 받고 있다. Biosurfactant가 화학합성 계면활성제에 대해 가지는 장점은 첫째, 무독성이며 생분해가 용이하며 따라서 이를 사용한 경우 이차오염원이 안 된다는 점, 둘째, 기존의 방법으로는 합성하기 어려운 복잡한 화학구조로 인해서 특수한 목적로 사용될 수 있다는 점, 셋째, 표면장력 저하능력, 온도, pH에 대한 안정성 등 계면활성제의 물리·화학적 성능면에서 기존의 화학합성 계면활성제와 거의 대등한 결과를 보인다는 점이 있다.

실제 생물 계면활성제는 의약품, 식품, 화장품, 세제, 원유의 2차 회수, 펄프와 제지 산업, 육상과 해상의 유류 오염 정화, 처리조의 유지방 분해 등 화학합성 계면활성제가 사용되는 대부분의 다양한 산업분야에서 사용 되고 있고, 또한 Pseudomonas sp.으로부터 생산된 람노리피드-생물 계면활성제는 세포 표면 형태를 변화시켜 병원균에 대한 저해효과를 발휘하므로 생물의학의 새로운 분야로서 접목될 가능성이 있다는 연구도 발표되었다. 따라서 이와 같은 장점을 갖는 생물 계면활성제에 대한 연구가 전 세계적으로 활발하게 진행되어 많은 종류의 생물 계면활성제가 보고되고 있다.

본 발명에 앞서 Pseudomonas sp. 배양액으로부터 람노리피드를 포함한 혼합물 상태의 생물 계면활성제를 추출하여 다양한 병원균에 대한 저해효과를 측정하였고 그 결과 특정 병원균들(여드름 유발균 :Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus)에 대하여 기존의 항생제와 비교했을 때 탁월한 저해효과를 가짐을 확인하였다. 또한 다양한 병원균들에 대하여 낮은 농도에서 살균효과를 가짐을 확인하였으며 이러한 결과를 바탕으로 기존에 화장품방부제로서 사용되어지고 있지만 인체에 대한 위험성이 보고되고 있는 메틸 파라벤을 대처할 수 있는 환경 친화적이면서도 생체 친화적인 보존제의 개발과, 동시에 항생제의 내성을 갖은 여드름 유발균들을 저해하여 여드름을 완화 시킬 수 있는 원료의 개발을 연구하였고 아래의 실험 결과는 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 근거가 될 수 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 미생물의 생장을 효과적으로 억제하여 화장품 또는 식품의 저장 기간을 증가시킬 수 있는 천연 물질 유래 방부용 조성물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 배양액 추출물이 각종 세균에 항균 효과를 나타내는 것을 규명하고 본 발명의 녹농균 배양액 추출물이 합성 파라벤류의 화장품 방부제를 대체하여 화장품 방부제 및 식품 방부제로 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 녹농균 배양액 추출물을 유효성분으로 포함하는 방부용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 녹농균 배양액 추출물을 유효성분으로 포함하는 항생 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 녹농균 배양액 추출물을 유효성분으로 포함하는 여드름 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 녹농균 배양액 추출물의 항균효과를 야기시키는 유효성분을 밝히려는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 녹농균 배양액 추출물을 유효성분으로 포함하는 방부용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 녹농균 배양액 추출물을 유효성분으로 포함하는 항생 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 녹농균 배양액 추출물을 유효성분으로 포함하는 여드름 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 미생물의 생장을 효과적으로 억제하여 화장품 또는 식품의 저장 기간을 증가시킬 수 있는 천연 물질 유래 방부용 조성물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 배양액 추출물이 피부 상재균 및 여드름 유발균을 포함하는 각종 세균에 항균 효과를 나타내는 것을 규명하고 본 발명의 녹농균 배양액 추출물이 합성 파라벤류의 화장품 방부제를 대체하여 화장품 방부제 및 식품 방부제로 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 조성물은 녹농균 배양액 추출물을 유효성분으로 포함한다.

본 명세서에서 용어 “녹농균 배양액 추출물”은 녹농균을 배양한 배양액으로부터 추출하여 얻은 것을 의미한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 녹농균 배양액 추출물은 생물 계면활성제(biosurfactant)인 람노리피드(rhamnolipid)를 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 포함되는 람노리피드는 다음의 화학식 1로 표시되는 디-람노리피드 또는 화학식 2로 표시되는 모노-람노리피드이다:

화학식 1

화학식 2

본 발명에 따르면, 녹농균 배양액 추출물은 다양한 구조의 람노리피드가 존재하는데 이 가운데 상기 화학식 1 또는 2의 람노리피드가 녹농균 배양액 추출물에서 추출된 다른 람노리피드와 비교하여 현저히 높은 항균 활성을 갖는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 녹농균 배양액 추출물은 녹농균을 배지에 접종하여 배양한 후 배양액을 원심분리하여 상등액을 수득하고 상등액에 염산용액을 첨가하여 침전시킨 다음, 다시 원심분리하여 침전물만을 수득하고 그 침전물에 에틸 에테르를 첨가한 후 에틸 에테르층만 분리하여 농축함으로써 수득한다.

본 발명의 추출물은 상술한 용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 추출물에 포함되는 것이다.

본 발명의 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에서 상기 녹농균 배양액 추출물의 함량은 전체 조성물을 100 중량부를 기준으로 하여 0.005-1.0 중량부이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에서 상기 녹농균 배양액 추출물의 함량은 전체 조성물을 100 중량부를 기준으로 하여 0.01-0.5 중량부이다.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에서 상기 녹농균 배양액 추출물의 함량은 전체 조성물을 100 중량부를 기준으로 하여 0.02-0.1 중량부이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 항세균 활성 및/또는 항진균 활성을 갖는다. 본 발명의 조성물은 다양한 미생물, 특히 세균, 진균 및 효모에 대해 광범위한 항생 활성을 나타낸다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 스타필로코커스(Staphylococcus) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 칸디다(Candida) 속, 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 프로테우스(Proteus) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 클렙시엘라(Klebsiella) 속 및 대장균(Escherichia coli)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세균에 대하여 항생 활성을 나타낸다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 0.5%이상의 농도에서 항산화 효과를 갖는 대표성분인 아스코르브산(AA)과 같은 수준의 높은 항산화 효과를 갖는다.

상기한 바와 같이 광범위한 항생 스펙트럼　및 항산화 효과를 갖는 본 발명의 방부/항생 조성물은 화장품 뿐 아니라 식품, 생활용품, 농약, 의약 등에서 항균, 살균, 소독, 방 부 등의 목적을 달성하기 위해 광범위하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 방부용 조성물은 화장료 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 제조될 경우, 녹농균 배양액 추출물은 세균에 의해 화장료 조성물이 변질되는 것을 예방하므로 화장품 방부제를 대체하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 조성물은 상기 유효성분인 녹농균 배양액 추출물, 그의 염, 또는 그들의 용매화물 또는 수화물뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 방부용 조성물은 식품 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조될 경우, 녹농균 배양액 추출물은 세균에 의해 식품이 변질되는 것을 예방하므로 식품 방부제를 대체하여 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 녹농균 배양액 추출물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 녹농균 배양액 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 명세서에서 용어 “항생 조성물(antibiotic composition)”은 바이러스, 균류(fungi), 원생동물(protozoa) 및 세균(bacteria)을 포함하는 미생물을 죽이거나 성장을 억제시키는 항생 물질(antibiotics)을 함유한 조성물을 의미한다. 따라서, 상기 항생 물질은 항생 활성, 즉, 항세균 활성(antibacterial activity), 항진균 활성(antifungal activity) 또는 항바이러스 활성(antiviral activity)을 갖는다.

본 발명의 조성물은 상기 세균에 의하여 유발된 피부감염 또는 여드름의 예방 및 치료에 유의한 효과를 나타낸다. 하기 일 실시예에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 조성물은 여드름 유발균으로 잘 알려진 프로피오니박테리움 액크니스 및 그람 양성균인 스타필로코커스 아우레우스, 바실러스 세레우스, 그람 음성균인 슈도모나스 아에로지노사, 칸디다 알비칸스 등과 같은 여러 세균의 성장을 유의하게 억제한다.

본 발명의 여드름 예방 또는 치료용 조성물은 상술한 본 발명의 유효성분인 녹농균 배양액 추출물의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount) 및 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하여 제조할 수 있다.

본 명세서에서 용어 “화장품학적 유효량”은 상술한 본 발명의 조성물의 미생물에 대한 항생 효능을 달성하는데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 피부 외용제 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 피부 외용제 조성물에 포함되는 성분은 상기 유효 성분 및 담체 성분 이외에, 피부 외용제 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 녹농균 배양액 추출물을 유효성분으로 포함하는 방부용 및 항생 조성물을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명은 녹농균 배양액 추출물을 유효성분으로 포함하는 여드름 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

(ⅲ) 본 발명의 녹농균 배양액 추출물을 포함하는 조성물은 다양한 균들에 대해 폭넓은 항균 스펙트럼 및 높은 항산화 효과를 나타내며 이러한 조성물은 화장품과 같은 화장료 조성물에 적용이 가능하며 이외에도 식품, 의약품, 농약 및 생활용품 등의 다양한 분야에서 항균, 살균, 방부 목적으로 유용하게 이용가능하다.

(ⅳ) 본 발명의 녹농균 배양액 추출물의 높은 항균 효과를 야기하는 유효성분은 다양한 람노리피드 중에서도 특정 구조(Rha C10 C10, Rha Rha C10 C10)의 람노리피드인 것을 규명하였고, 이를 통해 람노리피드의 산업적 적용에 대한 효율성을 높였다.

도 1은 종이-디스크 확산법(paper disk diffusion test)을 수행하여 녹농균 배양액 추출물(R1)의 항균 효과를 확인한 결과이다.
도 2는 녹농균 배양액 추출물을 포함하는 토너 제형의 제품에 대한 방부력 시험(challenge test) 결과로서 cfu를 나타낸 그래프이다.
도 3은 녹농균 배양액 추출물을 포함하는 토너 제형의 제품에 대한 방부력 시험 시 플레이트 도말 후 모습을 나타낸 사진이다.
도 4는 녹농균 배양액 추출물의 함유 농도에 따른 여드름 관련 트러블 개선율을 측정한 결과이다(적색 막대는 밤 제형, 보라색 막대는 크림 제형을 의미함).
도 5는 녹농균 배양액 추출물을 포함하는 본 발명의 조성물을 피험자들의 피부에 도포한 후, 여드름 관련 트러블 개선을 사진 촬영을 통해 확인한 결과이다.
도 6은 람노오스 및 람노리피드의 구조를 나타낸 도면이다.
도 7은 1D 1H-NMR 스펙트럼을 통해 람노리피드를 분석한 결과이다.
도 8은 람노오스 양성자 분석 결과이다.
도 9는 2D-NMR 분석 결과이다.
도 10은 2D NMR ROESY 실험 결과이다.
도 11은 1D 1H-NMR 스펙트라 예비 분석을 통한 샘플 내 람노오스의 상대적인 밀도를 측정한 결과이다.
도 12는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 배양액 추출물 R1의 항산화 효과 시험 결과이다.
도 13은 R1과 R1으로부터 분리된 분획들의 S. aureus에 대한 항균활성을 시험한 결과이다.
도 14는 R1과 R1으로부터 분리된 분획들의 LC 분석 결과이다.
도 15는 LC-MS, LC-MS/MS를 활용한 유효성분 피크 1, 피크 2의 구조 분석 결과이다.
도 16은 R1의 LC 분석 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

재료 및 방법

1. 생물 계면활성제의 생산

실험에 앞서 균주(CJM01)가 선발되었다. 동정 결과 Pseudomonas aeruginosa 인 것으로 밝혀졌고 균주를 M9 배지(CaCl₂ 0.015 g/L, Na₂HPO₄ 6 g/L, KH₂PO₄ 3 g/L, NaCl 0.5 g/L, NH₄Cl 1 g/L, MgSO₄ 0.0625 g/L, 글루코오스 20 g/L)에 접종하여 37℃에서 72시간 배양하였다. 배양 후 배양액을 원심분리하여 세포가 완전히 제거된 배양액을 얻었다. 세포가 제거된 배양액을 HCL를 이용하여 pH 2로 낮춘 후 하루 동안 4℃에서 침전시켰다. 침전 후 다시 원심분리 하여 상등액을 제거하고 침전물만을 얻었다. 그 침전물을 에틸 에테르를 이용하여 추출하고 난 후 에틸 에테르층만 분리하여 회전 증발농축기로 농축하여 에틸 에테르를 모두 증발시켜 얻어진 추출물(biosurfactants crude)을 R1 이라 명명하였다.

2. 추출한 생물 계면활성제의 항균력 TEST(paper disk diffusion test)

미생물(P. aeruginosa) 배양액으로부터 추출된 혼합물 상태의 생물 계면활성제를 R1이라 명명하고 그람 양성 병원성균(Staphylococcus aureus , Bacillus cereus), 그람 음성 병원성균(Pseudomonas aeroginosa, Escherichia coli)에 대하여 종이-디스크 확산법(paper disk diffusion test)을 시행하였다.

S. aureus, B.cereus, P.aeroginosa와 E.coli를 각각 LB(Luria-Bertani) 배지(트립톤 10 g/L, NaCl 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L)에 접종하여 37℃ 호기성 조건에서 18시간 액체배양 하였다. 배양 후 각각의 균 배양액 200 μl를 LB 아가 플레이트에 도말하였다. 미생물(P. aeruginosa) 배양액으로부터 추출된 R1은 메탄올에 2 mg/ml의 농도로 용해하였고, 비교구로 사용된 메틸파라벤(Methyl Paraben), 페녹시에탄올(Phenoxy Ethanol), 네츄로틱스(Naturotics)는 메탄올에 10 mg/ml의 농도로 용해하였다. 용해된 R1, 메틸파라벤, 페녹시에탄올, 네츄로틱스 용액을 각각 종이 디스크(지름: 6 mm) 위에 20 μl씩 묻힌 후 종이 디스크를 충분히 건조시켰다. 그 후 종이 디스크를 S. aureus, B.cereus, P.aeroginosa와 E.coli가 도말된 아가 플레이트 위에 올렸다. 각각의 아가 플레이트는 37℃ 호기성 조건에서 18시간 배양 되었다. 18시간 후 종이 디스크 주변으로 생성된 클리어 존을 관찰하였다.

3. 추출한 생물 계면활성제의 방부력 시험(challenge test)

메틸파라벤과 비교하여 R1의 보존제로서의 가능성을 확인하기 위하여 토너 제형과 로션제형에서 그람 양성 병원성균(Staphylococcus aureus , Bacillus cereus), 그람 음성 병원성균(Pseudomonas aeroginosa), 진균류(Candida albicans)에 대한 살균력을 측정하는 방부력 시험을 시행하였다. 방부력 시험은 미국화장품 협회, 즉 CTFA(The cosmetics, Toiletry and Fragrance Association)의 법을 기준으로 시행되었고, 그 기준은 특정물질이 토너와 로션제형에서 7일 이내에 접종된 균수의 99.9%를 사멸시키면 보존제로서의 가능성을 가진다는 것이다. 실험에 앞서 토너와 로션제형이 제작되었고 그 조성은 표 1 및 2와 같다.

토너 조성

	R1-0%	R1-0.01%	R1-0.05%	R1 또는 메틸파라벤-0.1%	R1 또는 메틸파라벤-0.5%	R1 또는 메틸파라벤-1%	MeoH
히알루론산	2 g	2 g	2 g	2 g	2 g	2 g	2 g
글리세린	3 g	3 g	3 g	3 g	3 g	3 g	3 g
알로에수(aloewater)	40 g	40 g	40 g	40 g	40 g	40 g	40 g
금잔화 추출물	2.8 g	2.8 g	2.8 g	2.8 g	2.8 g	2.8 g	2.8 g
증류수	52.2 g	52.18 g	52.1 g	52 g	51.2 g	50.2 g	50.2 g
R1 또는 메틸파라벤 (500 mg/ml MeOH)	0 g	20 μl	100 μl	200 μl	1 ml	2 ml	0
MeOH	0	0	0	0	0	0	2 ml
총	100 g	100 g	100 g	100 g	100 g	100 g	100 g

로션 조성

	R1 또는 메틸 파라벤-0%	R1 또는 메틸 파라벤-0.5%	MeOH
알로에수	82.5 g	81.5 g	81.5 g
글리세린	5 g	5 g	5 g
소르비탄 올리베이트	1.5 g	1.5 g	1.5 g
올리브오일	7 g	7 g	7 g
히알루론산	2 g	2 g	2 g
금잔화 추출물	2 g	2 g	2 g
R1 또는 메틸 파라벤 (500 mg/ml MeOH)	0	1 ml	0
MeOH	0	0	1 ml
총	100 g	100 g	100 g

4. 토너제형에서의 그람 양성 병원성균(Staphylococcus aureus, Bacillus cereus)에 대한 실험

제작된 토너제형에 메탄올에 용해시킨 R1을 첨가하여 R1의 최종농도가 0%, 0.01%, 0.05%, 0.1%가 되도록 하였고 각각의 용기에 S. aureus, B. cereus 배양액을 접종하였다. 또한 토너 제형에 메탄올에 용해시킨 메틸 파라벤을 첨가하여 메틸 파라벤의 최종농도가 0%, 0.1%, 0.5%, 1%가 되도록 하였고 각각의 용기에 S. aureus, B. cereus 배양액을 접종하였다. 접종균수는 10⁶-10⁷cfu(colony forming unit)/ml이 되게 하였다. 균이 접종된 토너를 상온에서 보관하면서 균 접종 직후, 1일, 3일, 5일, 7일 후에 각 토너를 희석하여 LB 아가 플레이트에 200 μl 도말하여 세포 수를 계산한 후 초기 접종균수와 비교하여 사멸여부를 파악하였다. 대조구로서 토너 제형에 메탄올만을 첨가하여 균 배양액을 접종한 뒤 반복 실험하였다.

5. 토너제형에서의 그람 음성 병원성균(Pseudomonas aeroginosa), 진균류(Candida albicans)에 대한 실험

제작된 토너 제형에 메탄올에 용해시킨 R1과 메틸파라벤을 각각 첨가하여 최종농도가 0%, 0.1%, 0.5%, 1%가 되도록 하였고 각각의 용기에 P. aeruginosa, C. albicans 배양액을 접종하였다. 접종균수는 10⁶-10⁷cfu(colony forming unit)/ml이 되게 하였다. 균이 접종된 토너를 상온에서 보관하면서 균 접종 직후, 1일, 3일, 5일, 7일 후에 각 토너를 희석하여 P. aeruginosa가 접종된 토너는 LB 아가 플레이트에, C. albicans이 접종된 토너는 YPD 아가 플레이트에 200 μl 도말하여 세포 수를 계산한 후 초기 접종균수와 비교하여 사멸여부를 파악하였다. 대조구로서 토너 제형에 메탄올만을 첨가하여 균 배양액을 접종한 뒤 반복 실험하였다.

*YPD 아가(펩톤 5 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 덱스트로오스 5 g/L, 아가 15 g/L)

6. 로션제형에서의 그람 양성 병원성균(Staphylococcus aureus, Bacillus cereus), 그람 음성 병원성균(Pseudomonas aeroginosa), 진균류(Candida albicans)에 대한 실험

제작된 로션 제형에 메탄올에 용해시킨 R1과 메틸파라벤을 각각 첨가하여 최종농도가 0%, 0.5%가 되도록 하였고 각각의 용기에 S. aureus, B. cereus, P. aeruginosa, C. albicans 배양액을 접종하였다. 접종균수는 10⁶-10⁷cfu(colony forming unit)/ml이 되게 하였다. 균이 접종된 로션을 상온에서 보관하면서 균 접종 직후, 1일, 3일, 5일, 7일 후에 각 로션을 희석하여 S. aureus, B. cereus, P. aeruginosa가 접종된 로션은 LB 아가 플레이트에 C. albicans이 접종된 로션은 YPD 아가 플레이트에 200 μl 도말하여 세포 수를 계산한 후 초기 접종균수와 비교하여 사멸여부를 파악하였다. 대조구로서 로션 제형에 메탄올만을 첨가하여 균 배양액을 접종한 뒤 반복 실험하였다.

7. 추출한 생물 계면활성제를 함유하는 제품의 여드름 관련 트러블 개선효과

7-1. 제품의 종류, 제품의 분량 및 제형

미생물(P. aeruginosa) 배양액으로부터 추출된 생물 계면활성제 R1을 함유하는 천연화장품을 제조하여 여드름 관련 트러블 증상(화농성, 좁쌀, 여드름흉터, 뾰루지 등)을 갖고 있는 피험자들에게 적용(5 g/1인/2주)하여 개선효과를 관찰하였다.

제품의 종류

-	종류
1	미생물 배양액 추출물이 0% 포함된 크림
2	미생물 배양액 추출물이 0.02% 포함된 크림
3	미생물 배양액 추출물이 0.1% 포함된 크림
4	미생물 배양액 추출물이 0% 포함된 밤
5	미생물 배양액 추출물이 0.02% 포함된 밤
6	미생물 배양액 추출물이 0.1% 포함된 밤
7	미생물 배양액 추출물이 0.5% 포함된 밤

R1 혼합물을 0.5% 함유하는 밤 제형 제품의 조성

성분	g	%
비즈 왁스	7	23.33333
토코페릴 아세테이트	0.3	1
카렌듀라 추출물	0.1	0.333333
티트리 E.O	0.3	1
해바라기 씨 오일	0.15	0.5
로즈마리 잎 추출물	0.15	0.5
토코페롤	0.15	0.5
포도 E.O	0.2	0.666667
큰 달맞이꽃 오일	5	16.66667
호호바 오일	3	10
유기농 타마누 오일	13.65	45.5
R1 (혼합물)	0.15	0.5
총	30	100

R1 혼합물을 0.1% 함유하는 밤 제형 제품의 조성

성분	g	%
비즈 왁스	7	23.33333
토코페릴 아세테이트	0.3	1
카렌듀라 추출물	0.1	0.333333
티트리 E.O	0.3	1
해바라기 씨 오일	0.15	0.5
로즈마리 잎 추출물	0.15	0.5
토코페롤	0.15	0.5
포도 E.O	0.2	0.666667
큰 달맞이꽃 오일	5	16.66667
호호바 오일	3	10
유기농 타마누 오일	13.77	45.9
R1 (혼합물)	0.03	0.1
총	30	100

R1 혼합물을 0.02% 함유하는 밤 제형 제품의 조성

R1 혼합물을 0% 함유하는 밤 제형 제품의 조성

성분	g	%
비즈 왁스	7	23.33333
토코페릴 아세테이트	0.3	1
카렌듀라 추출물	0.1	0.333333
티트리 E.O	0.3	1
해바라기 씨 오일	0.15	0.5
로즈마리 잎 추출물	0.15	0.5
토코페롤	0.15	0.5
포도 E.O	0.2	0.666667
큰 달맞이꽃 오일	5	16.66667
호호바 오일	3	10
유기농 타마누 오일	13.8	46
R1 (혼합물)	0	0
총	30	100

R1 혼합물을 0% 함유하는 크림 제형 제품의 조성

재료	g	%
위치 하젤수	18.5	37
골든 호호바 오일	3	6
달맞이 꽃 오일	2.5	5
올리브 유화 왁스	2.5	5
알로에 베라 잎 추출물	18	36
글리세린
글리세릴아크릴레이트/아크릴산공중합체
프로필렌글리콜
병풀 추출물	3	6
토코페릴 아세테이트	1	2
티트리 에센셜 오일	0.5	1
자몽 에센셜 오일	0.5	1
천연한방보존제	0.5	1
R1(혼합물)	0	0
총	50	100

R1 혼합물을 0.02% 함유하는 크림 제형 제품의 조성

재료	g	%
위치 하젤수	18.49	36.98
골든 호호바 오일	3	6
달맞이 꽃 오일	2.5	5
올리브 유화 왁스	2.5	5
알로에 베라 잎 추출물	18	36
글리세린
글리세릴아크릴레이트/아크릴산공중합체
프로필렌글리콜
병풀 추출물	3	6
토코페릴 아세테이트	1	2
티트리 에센셜 오일	0.5	1
자몽 에센셜 오일	0.5	1
천연한방보존제	0.5	1
R1(혼합물)	0.01	0.02
총	50	100

R1 혼합물을 0.1% 함유하는 크림 제형 제품의 조성

재료	g	%
위치 하젤수	18.45	36.9
골든 호호바 오일	3	6
달맞이 꽃 오일	2.5	5
올리브 유화 왁스	2.5	5
알로에 베라 잎 추출물	18	36
글리세린
글리세릴아크릴레이트/아크릴산공중합체
프로필렌글리콜
병풀 추출물	3	6
토코페릴 아세테이트	1	2
티트리 에센셜 오일	0.5	1
자몽 에센셜 오일	0.5	1
천연한방보존제	0.5	1
R1(혼합물)	0.05	0.1
총	50	100

7-2. 피험자

본 연구는 단일기관에서 대조군, 실험군의 관찰연구 임상시험으로 여드름 관련 트러블을 가진 피험자에게 제품을 발랐을 때 여드름 관련 트러블의 증상 개선 등 유효성 및 안전성을 평가 하고자 하였다.

일차 결과변수(Primary end point)는 제품 사용 후 2주 후의 여드름 관련 트러블의 증상 개선율이며, 시험 전과 시험 후의 여드름 관련 트러블의 증상 개선율이 차이가 있는지를 평하였다. 과거 수행된 임상시험을 바탕으로 탈락률 약 10%를 고려하여 총 피험자 수를 30명으로 하였으며, 개인적인 사정으로 임상시험 동의서에 서명하지 않은 3명은 임상시험에 참여하지 못하였고 임상시험에 참여한 피험자는 총 27명이며 중도 탈락율은 0%로서 최종 평가 가능한 피험자 수는 27명이었다.

7-3. 시험방법

2주일에 5 g의 시험제품을 사용하며, 하루 2회 이상(아침, 저녁, 상시) 2주간 시험자가 지정해준 피부 병변부위에 크림 또는 밤 형태의 제품을 도포한다.

인하대학교와 인천대학교의 학생들을 대상으로 여드름 관련 트러블 화장품 효능 평가 임상시험 참여자를 모집하였고 자발적으로 지원한 지원자 중 선정기준에 합당하고 제외기준에 해당되지 않는 지원자를 대상으로 임상연구를 진행하였다. 모든 피험자들은 스크리닝을 통해서 피험자를 선별하였으며, 총 27명의 피험자가 시험 참여에 동의하였으며, 남자는 16명, 여자는 11명이었고, 피험자들의 연령은 만20세에서 만28세 사이에 분포하였다. 탈락 및 중도 포기 피험자는 0명으로 평가를 완료한 최종피험자는 27명이었다.

여드름 관련 트러블 개선효과에 대한 평가를 위해 매 방문시마다 육안평가 및 이미지 촬영을 실시하였고 매일 자신의 변화정도(변화를 느끼는 정도 및 이상 반응 유무)를 직접 체크하는 피험자의 주관적 의견이 담긴 설문조사를 실시하였다. 육안적 평가로 임상시험 시작 0일이 되는 시점에서 제품을 도포하기 전 시험자가 정해준 병변부위에 존재하는 진행상태의 여드름 개수를 시작점으로 정해두고 이 부위에서 시험경과 2주후 눈으로 개선된 정도를 수치화 하였으며, 임상연구에 참여한 연구대상자의 병변부위를 시험 전과 임상 시험 측정 방문시마다 이미지를 촬영하였다. 또한, 피험자 주관적 의견의 설문조사를 실시하였다.

7-4. 효과 평가기준, 평가방법 및 해석방법

선정기준에 적합한 피험자 및 제공한 제품을 2주간 사용한 피험자를 유효성 평가 대상자로 선정하고 0주, 1주, 2주째에 진행 중인 여드름개수 파악 및 이미지 촬영 등 여드름 관련 트러블 개선에 대한 육안적 평가를 시행하였고 피험자의 주관적 의견이 담긴 설문조사를 시행하였다. 시험의 결과 정리 및 분석은 통계적 추정에 의하여 분석되었다.

8. NMR 분석

미생물(P. aeruginosa) 배양액으로부터 추출된 생물 계면활성제 R1과 같은 P. aeruginosa에 대하여 배양 및 추출방식을 변경하여 얻어진 R2, R3 그리고 람노리피드(생물 계면활성제의 한종류)를 90% 함유하고 있는 SIGMA-ALDRICH로부터 구입한 R90을 NMR 분석하였다.

람노리피드의 구조는 한 개 또는 두 개의 람노오스(당) 부분(도 6 좌측)과 두개의 지방족 사슬(aliphatic chains)을 포함하는 지질 부분으로 구성된다(도 7 우측). 람노리피드 구조의 다양성은 한 개 또는 두 개의 람노오스 링의 수와 지질부분의 두 개의 지방족 사슬의 구조(길이 및 포화도)에 기인하다. 4개의 다른 생물 계면활성제 추출물(샘플 0, 1, 2, 3)과 상업적으로(Sigma) 판매되고 있는 람노리피드(샘플 90)는 클로로프름-메탄올(2:1) 혼합물에 용해 된 후 NMR 분석되었다.

9. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 배양액 추출물의 항산화 효과

녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 배양액 추출물의 방부제로서의 적용을 위하여 항산화 효과에 대한 실험을 진행하였다.

DPPH 라디칼은 보라색을 띄고 있는데 이것이 항산화제와 반응하면 노란색을 띄게 된다. 항산화능이 뛰어난 시료와 반응할수록 DPPH 라디칼의 색의 변화는 뚜렷해진다. R1과 아스코르브산(Ascorbic acid, AA), 메틸 파라벤(MTP)을 각각 다른 농도로 메탄올에 용해시켰다. 이렇게 얻어진 시료(100 μl)들을 각각 0.006%의 농도로 메탄올에 용해시킨 DPPH 라디칼 용액 100 μl에 혼합하여 총 200 μl를 만든 뒤 빛이 차단된 공간에서 30분 동안 반응 시켰다. 반응이 완료 된 후 각 혼합액에 대하여 517 nm에서 흡광도 값을 측정하여 각 시료의 항산화능을 측정하였다.

10. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 배양액 추출물의 항균효과를 야기하는 유효성분의 탐색

녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 배양액 추출물은 단일 성분이 아닌 여러 성분이 혼합된 상태이다. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 배양액 추출물에 포함된 다양한 성분 중 항균효과를 야기하는 유효성분이 무엇인지 탐색하고 그 구조를 밝히는 실험을 진행하였다.

미생물(P. aeruginosa) 배양액으로부터 추출된 혼합물 상태의 R1의 분리

미생물(P. aeruginosa) 배양액으로부터 추출된 혼합물 상태의 R1 1 mg을 메탄올에 용해시킨 후 sep-Pak vac 1cc tc18 카트리지 컬럼에 주입하였다. 그 후 컬럼은 용매 A로 세척되었고 전개용매인 용매 B가 주입되었다. 용매 B의 농도를 각각 다르게 컬럼에 주입한 뒤 컬럼을 통과한 분획을 각각 수집하여 분획(fraction) 1, 분획 2, 분획 3, 분획 4, 분획 5, 분획 6 으로 명명하였다. 용매 B의 농도는 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%로 각각 다르게 컬럼에 주입되었으며 용매 A와 용매 B의 조성은 표 11과 같다.

용매 A와 용매 B의 조성

용매 A	0.1% Formic acid in water
용매 B	0.1% Formic acid in ACN

R1으로부터 분리된 분획들의 항균활성 분석

얻어진 각 분획들은 건조 시킨 후 메탄올에 10 mg/ml의 농도로 용해시켰다. 메탄올에 용해된 각 분획들의 20 μl를 S. aureus 배양액이 도말된 아가 플레이트 위에 떨어뜨린 후 18시간동안 37℃에서 배양하였고 18시간 후 아가 플레이트 위에 생성된 클리어 존을 관찰하였다.

R1으로부터 분리된 분획들의 LC/MS를 통한 구조 분석

분리된 분획들의 구조분석을 위해 수행된 LCMS는 네거티브 모드의 이온 극성에서 1.8 μm 2.1 * 100 mm의 SB-Aq RRHD(분석 컬럼)과 2.1 * 5 mm 1.8 μm의 Zorbax SB-C8(가드 컬럼)을 사용하여 진행되었다. 분리된 분획들을 메탄올에 용해시켜서 샘플을 준비하였다. 샘플의 20 μl를 위의 컬럼이 장착된 HPLC에 주입하였고 질량 분석계까지 연결하여 분석하였다. HPLC에는 용매 A와 용매 B의 혼합액이 전개용매로서 사용되었고, 초기의 용매 A와 용매 B의 혼합비율은 50%이며 그 이후의 순서는 다음과 같다. 100% 용매 B(19분), 100% 용매 B(20.5분), 50% 용매 B(21분), 50% 용매 B(25분), HPLC 유속: 0.15 ml/분

스캐닝 질량 범위는 75~1000 m/z으로 준비되었다. 항균효과를 야기하는 특정 성분에 대해서는 MS/MS를 진행하였다.

실험결과

1. 추출한 생물 계면활성제의 항균력 시험

미생물(P. aeruginosa) 배양액으로부터 추출된 혼합물 상태의 생물 계면활성제를 R1이라 명명하고 그람 양성 병원성균(Staphylococcus aureus , Bacillus cereus), 그람 음성 병원성균(Pseudomonas aeroginosa, Escherichia coli)에 대하여 향균력 TEST를 시행하였다. 종이-디스크 확산법(paper disk diffusion test) 결과 R1은 기존의 화장품 보존제로서 사용되어지고 있는 메틸 파라벤, 페녹시에탄올, 네츄로틱스 보다 5배 적은 농도에서 월등히 큰 클리어 존을 생성했다(도 1).

2. 추출한 생물 계면활성제의 방부력 시험

방부력 시험 결과, 토너제형에서 R1은 접종한 모든 균에 대하여 7일 안에 접종균수의 99.9%를 사멸시켰고, 특히 R1은 메틸 파라벤보다 10배 적은 농도인 0.01%에서 그람 양성 병원성균 Staphylococcus aureus, Bacillus cereus에 대하여 1일만에 접종균수의 99.9%를 사멸시켰다. 그람 음성 병원성균(Pseudomonas aeroginosa)과 진균류(Candida albicans)에 대해서는 메틸파라벤과 동일한 농도인 0.5%에서 5일만에 접종균수의 99.9%를 사멸시켰다(도 2-3). 또한 로선제형에서 접종한 모든 균에 대해서 R1은 메틸 파라벤과 같은 농도인 0.5%에서 7일 안에 접종된 균수의 99.9%를 사멸시켰다(표 12). 이러한 결과는 R1의 보존제로서의 가능성 가진다는 것을 보여준다.

로션제형에서 R1의 방부력 시험(%-접종균수의 생존률)

		0일	1일	3일	5일	7일
Staphylococcusaureus	0%	100%	6.74%	0.06%	30%	78%
	MeOH	100%	15.70%	4.27%	0.04%	0.04%
	R10.5%	100%	0%	0%	0%	0%
	MTP0.5%	100%	0%	0%	0%	0%
Bacillus cereus	0%	100%	0.09%	0.23%	35%	54%
	MeOH	100%	0.17%	0.02%	0.02%	0.02%
	R10.5%	100%	0.01%	0%	0%	0%
	MTP0.5%	100%	0.12%	0.06%	0.02%	0.01%
Pseudomonasaeroginosa	0%	100%	0.30%	0.60%	0.02%	0.02%
	MeOH	100%	7.30%	0.80%	0.03%	0.02%
	R10.5%	100%	7.30%	0.60%	0.006%	0%
	MTP0.5%	100%	0%	0%	0%	0%
Candida albicans	0%	100%	37.50%	1%	0.5%	0.5%
	MeOH	100%	27.50%	1.80%	0.4%	0.3%
	R10.5%	100%	16.30%	0.10%	0%	0%
	MTP0.5%	100%	0%	0%	0%	0%

3. 추출한 생물 계면활성제를 함유하는 제품의 여드름 관련 트러블 개선효과

미생물(P. aeruginosa) 배양액으로부터 추출된 생물 계면활성제 R1을 함유하는 천연화장품을 제조하여 여드름 관련 트러블 증상을 갖고 있는 피험자들에게 적용한 결과 R1을 함유하지 않은 제품보다 R1을 함유한 제품을 사용한 피험자들에게서 여드름 관련 트러블 개선율이 월등히 증가하였고 모든 피험자에게서 피부 이상반응(가려움, 화끈거림, 붉은반점, 부어오름, 부스럼, 따가움 등)은 관찰되지 않았다.

여드름 관련 트러블 개선율

피험자 번호	성별	추출물 함유량 및 제품 제형	개선율
1	여	0.5% / 밤	57%
2	남	0.1% / 밤	57%
3	남	0.02% / 크림	75%
4	남	0.02% / 밤	75%
5	남	0% / 크림	60%
6	여	0% / 밤	47%
7	여	0.1% / 밤	43%
8	여	0.5% / 밤	50%
9	여	0% / 크림	20%
10	여	0.1% / 밤	100%
11	여	0.02% / 밤	50%
12	여	0% / 크림	38%
13	남	0.1% / 크림	54%
14	남	0.02% / 밤	100%
15	남	0.1% / 크림	80%
16	여	0.02% / 크림	88%
17	여	0% / 크림	31%
18	여	0.02% / 밤	50%
19	남	0.1% / 밤	64%
20	남	0.1% / 밤	60%
21	남	0.02% / 크림	63%
22	남	0.02% / 밤	57%
23	남	0.1% / 밤	60%
24	남	0.5% / 밤	60%
25	남	0.5% / 밤	65%
26	남	0.5% / 밤	100%
27	남	0.02% / 크림	100%

임상시험 시작 0일이 되는 시점에서 제품을 도포하기 전 시험자가 정해준 병변부위에 존재하는 진행상태의 여드름 개수를 시작점으로 정해두고 이 부위에 서 시험경과 2주후 눈으로 개선된 정도를 수치화 한 것으로 미생물 배양액 추출물을 함유하지 않은 제품과 비교했을 때 미생물 배양액 추출물을 함유한 제품을 사용한 피험자들에게서 더 높은 개선율이 확인되었다. 특히 미생물 배양액 추출물 0.02%를 함유한 크림형태의 제품을 사용한 피험자들에게서 가장 높은 개선율이 확인 되었고 다음으로는 미생물 배양액 추출물 0.1%를 함유한 크림형태의 제품을 사용한 피험자들에게서 높은 개선율이 확인되었다(도 4). 이를 근거로 본 발명자들이 제조한 미생물 배양액 추출물을 함유한 천연화장품은 여드름 개선에 도움을 준다고 판단할 수 있다. 피험자들의 이미지 촬영 결과는 도 5a-5i와 같다.

총괄적 유효성 평가

피험자 번호	평가	피험자 번호	평가
1	4	15	4
2	3	16	4
3	4	17	3
4	5	18	4
5	4	19	4
6	3	20	4
7	3	21	3
8	3	22	3
9	3	23	4
10	5	24	4
11	3	25	4
12	3	26	5
13	4	27	4
14	4	평균	3.7

5: 증상이 없어졌음, 4: 전반적으로 증상이 뚜렷이 좋아짐

3: 전반적으로 증상이 약간 좋아짐, 2: 시험전과 증상의 변화가 없음

1: 시험전보다 증상이 나빠짐

사용 후 제품에 대한 만족도 평가 결과

피험자 번호	평가	피험자 번호	평가
1	3	15	5
2	4	16	3
3	4	17	4
4	5	18	5
5	4	19	4
6	4	20	4
7	4	21	4
8	3	22	4
9	3	23	4
10	5	24	4
11	2	25	3
12	4.5	26	5
13	4	27	4
14	4	평균	3.9

1: 잘모름, 2: 불만족, 3: 보통, 4: 만족, 5: 매우만족

임상 시험 2주 후 피험자들의 여드름 관련 트러블의 개선 효과에 대한 전체적인 만족도는 높게 평가되었다. 설문평가와 육안평가에서 가장 두드러진 변화를 보였던 부분은 화농성 여드름과 일시적으로 발생하는 뾰루지와 같은 피부트러블이었다. 반면 좁쌀여드름과 여드름 흉터 개선에 대해서는 상대적으로 변화가 적었다. 또한 밤제형 보다는 크림 제형의 제품을 사용한 피험자의 개선효과와 만족도가 더 높은 것으로 확인 되었다.

2주 동안의 임상시험결과 육안평가 및 설문평가, 이미지 촬영을 통해서 본 발명자들이 제작한 미생물 배양액 추출물을 함유한 천연화장품은 여드름 관련 트러블 개선에 도움을 주는 제품임을 알 수 있었다.

4. NMR 분석

일반적 관측

모든 샘플은 4가지의 주요 성분(두 가지 유형의 다이-람노리피드와 두 가지 유형의 모노-람노리피드)으로 구성된 비슷한 람노리피드 세트를 포함하고 있었다. 각 샘플들 안에서 다이-람노리피드의 A 분획의 함유율은 모두 달랐다(샘플 90의 경우 35% 까지 함유하고 있었고 샘플 2 와 3 은 65% 이상을 함유함)(표 17). 또한 샘플 0, 1, 2, 3은 항균활성에 영향을 줄 것으로 예상되는 방향족 성분을 함유하고 있었다.

1D-NMR 분석

샘플 1에 대한 1D 1H-NMR 스펙트럼에서 람노리피드에 해당하는 부분은 도 7에서 보여진다. 신호강도(integrals)는 스펙트럼 아래에서 보여진다. 모든 신호강도는 0.82 ppm에서의 메틸 피크에 따라 표준화 되었으며, 그 피크들은 6개의 양성자(proton)에 해당한다(2 메틸 그룹). 따라서 단일양성자(proton) 피크는 대략 100 유닛 정도의 신호강도를 가질 것으로 보인다. 예를 들어, 1.4-1.5 ppm과 2.4-2.6 ppm에서 나타나는 두 그룹의 피크들은 ~400 정도의 신호강도를 나타내고 각각 C₂H₂/ C₅H₂ 및 C₇H₂ / C₁₀H₂ 그룹에서 나타나는 4개의 양성자 신호와 일치한다. 모노 및 다이-람노리피드의 질량비는 지질과 람노오스 그룹들로부터 얻은 신호들의 강도를 비교함으로써 측정될 수 있다.

만약에 샘플이 모노-람노리피드만을 포함 한다면, 람노오스로부터 온 하나의 양성자 만이 지질 부분에 있는 하나의 양성자와 일치할 것이다. 또한, 샘플이 오직 다이-람노리피드만을 포함한다면, "2 -to -1" 과 일치될 것이다. 도 8에서 증명되었던 것처럼, H1과 H4 지질 양성자들(어두운 오렌지색 박스)은 동일한 타입의 신호들을 나타내는데 그 강도의 합은 대략 100 정도이며, 그것은 혼합물 속에 있는 각 람노리피드 분자들이 정확하게 이 타입의 양성자를 한 개 갖는다는 것을 의미한다.

결과적으로, H1'/1", H2'/2", H3'/3", H5'/5" 람노오스 양성자들(도 8의 파란색 박스)로부터 얻은 신호강도의 합은 모노-람노리피드 혼합물에서 예상했던 것보다 더 높다. 모노-람노리피드 혼합물 속에 있는 분자 당 하나의 H1' 양성자는 100 값을 지니는 신호가 나와야한다. 세 개의 H2' H3', H5'의 양성자들은 300 값을 지니는 신호가 나와야한다. 그런데 샘플 1 에서의 이러한 신호강도들은 대략 150-480 정도로 측정되었다. 이러한 신호강도 수치로부터 샘플 1에 다이-람노리피드가 대략 60% 정도 존재한다고 추정할 수 있다. 비슷한 분석으로 샘플 0, 2, 3 그리고 90을 1D 1H-NMR 스펙트라를 통해 수행하였다.

2D-NMR 분석

샘플들 속 다이-람노리피드의 존재는 2D 1H-13C-HSQC 실험에 의해 확인이 되었다. β-L-Rhap (1′′→2′)-β-L-Rhap 결합의 형성은 산소를 통해 연결되어 있는 다이-람노오스의 C2'과 C1' 원자의 강한 NMR 신호 이동을 일으켰다(도 6의 구조). HSQC 스펙트럼의 C^1’/1”H 및 C^2’/2”H 구역은 도 9에서 보여진다. 102 ppm에서 나타나는 크로스-피크들(¹³C 스케일, 적색 박스)은 다이-람노리피드에서의 H1"/ C1" 의 상관계수와 일치한다. 반면에 95-96 ppm에서 나타나는 크로스-피크들은 모노-람노리피드의 H1' /C1'의 상관계수와 일치한다(도 6의 구조). ~79 ppm에서 나타나는 두 개의 크로스-피크들(도 9 청색 박스)은 다이-람노리피드 부분의 두 개의 C2' 원자와 일치한다.

스핀 시스템 할당

샘플 속의 다른 람노리피드의 상대적인 밀도와 수를 측정하기 위해, 2D NMR 스펙트라(HSQC, TOCSY,COSY-DQF)를 이용해서 스핀 시스템을 분리했고 이것들은 람노리피드 분자의 람노오스 고리구조, 지방산 꼬리구조와 일치하였다. 또한 람노오스 부분(시스템 1-6)의 6개의 알려지지 않은 시스템들과 지방산 꼬리의 8개의 시스템(시스템 7-14)들을 증명할 수 있었다. 그 시스템들은 람노오스 부분의 타입으로 미리 할당되어졌고(다이-람노오스의 첫 번째 (‘) 또는 두 번째 (“) 단일 링 구조) 하이드록실 지방산의 위치(직접적으로 또는 간접적으로 람노오스와 연결됨, 도 6)는 알려진 화학적 이동(파트 3, 2D-NMR 분석, 도 9의 예시)에 기초하고 있다. 시스템 1과 2는 다이-람노오스의 두 번째 람노오스 링구조에 할당되어졌고, 시스템 3와 4는 다이-람노오스의 첫 번째 람노오스 고리 구조에 할당되어졌다. 시스템 5와 6은 모노-람노리피드 속 람노오스 고리구조와 일치한다. 그들의 최소 성분 9와 10 뿐만 아니라 시스템 7과 8은 지질 속의 두 번째 지방산에 할당되었다(람노오스 부분에 직접적으로 연결되지 않음). 결과적으로 시스템 11-14 첫 번째 지방산 사슬에 할당되어졌고, 직접적으로 람노오스 부분에 연결되었다.

스핀 시스템 연결

람노리피드 분자의 구조적인 부분을 위한 스핀 시스템의 할당 후에 그것들을 람노리피드 속으로 연결시키는 몇 가지 가능한 방법들을 수행했다. 람노오스 고리구조에 존재하는 양성자들과 지방산의 양성자들의 표면을 통한 쌍극자-쌍극자 상호작용을 감지하기 위해 2D NMR ROESY 실험을 이용했다. 예상했던 것처럼, 람노오스 시스템 3-6의 H1 양성자와 지방산 시스템 11-14 의 H1 양성자들의 크로스-피크들이 감지되었다(도 10). 이 실험은 람노스 첫 번째 고리구조 혹은 단일구조에 할당된 스핀 시스템을 지방산에 할당된 스핀 시스템과 연결하는 것을 가능하게 한다.

다이-람노오스 안의 두 번째 고리구조와 지방산 양성자에 할당된 시스템1과 2의 H1 양성자 사이에서 어떠한 크로스-피크도 관찰되지 않았다. 마침내, 스핀 시스템은 4개의 람노리피드 분자 I-IV로 정리되었다(표 16).

NMR 샘플속 I-IV 분자들의 상대적인 밀도

1D 1H-NMR 스펙트라의 예비 분석은 샘플들 속 람노오스의 상대적인 밀도를 명확하게 보여준다(도 11). 지방산 시스템에서도 동일한 결과가 관찰되었다. I-IV 분자들의 상대적인 밀도를 신호강도를 이용하여 추정하였는데, 신호강도는 H1/H1”와 H2/H2”람노오스 양성자, H1 과 H4 지방산 양성자들에게 할당되어진 잘 분리된 신호를 얻기 위해 1D 1HNMR 스펙트라로 측정되었다. 분석의 요약은 표 16에 제시되었다.

미생물(P. aeruginosa) 배양액으로부터 추출된 생물 계면활성제 R1과 같은 P. aeruginosa에 대하여 배양 및 추출방식을 변경하여 얻어진 R2, R3 그리고 람노리피드를 90% 함유하고 있는 SIGMA-ALDRICH로부터 구입한 R90을 NMR 분석한 결과 각 추출물과 구입한 R90은 모두 람노리피드를 함유하고 있는 것으로 밝혀졌다. 이것으로 미생물(P. aeruginosa) 배양액으로부터 추출된 R1은 람노리피드 계열 생물 계면활성제를 함유하고 있다는 것을 증명할 수 있다(도 11)(표 16). 또한, NMR 분석을 통해 5개의 샘플은 람노리피드를 함유하고 있고, 그 함유율은 다름을 알 수 있었다. 그리고 람노리피드는 아마도 다른 생물학적 연구에 연관되어질 수 있을 것이다.

5. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 배양액 추출물의 항산화 효과

녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 배양액 추출물 R1의 항산화 효과를 조사하기 위하여 DPPH 소거활성 시험을 진행한 결과 R1은 0.5%이상의 농도에서 항산화 효과를 갖는 대표성분인 아스코르브산(AA) 와 같은 수준의 항산화 효과를 보였다. 반면 메틸 파라벤(MTP)은 R1과 비교 했을 때 같은 농도에서 현저히 낮은 항산화 효과를 보였다. 이런 결과를 바탕으로 항산화 효과를 갖는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 배양액 추출물 R1은 방부제로서의 적용이 가능하다고 여겨진다(도 12).

6. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 배양액 추출물의 항균효과를 야기하는 유효성분의 탐색

미생물(P. aeruginosa) 배양액으로부터 추출된 혼합물 상태의 R1을 분리하여 분획 1, 분획 2, 분획 3, 분획 4, 분획 5, 분획 6을 얻었다. 얻어진 각 시료들에 대하여 S. aureus에 대한 항균활성을 시험한 결과 분획 1, 분획 2, 분획 3은 R1과 상응하는 항균활성을 보였고, 분획 4, 분획 5는 R1보다 비교적 약한 항균활성을 보였으며 분획 6는 항균활성을 보이지 않았다(도 13). 모든 시료들에 대하여 LC 분석을 진행하였고 그 결과 항균활성을 보였던 분획 1, 분획 2, 분획 3에서 높게 존재하면서 분획 4, 분획 5에서는 점차적으로 감소한 공통적인 2개의 피크를 발견하게 되었고 피크 1, 피크 2라 명명하였다(도 14). 항균활성 시험과 연결 지어 볼 때 피크 1, 피크 2의 존재 여부가 항균활성을 결정짓는 것으로 판단되며 피크 1, 피크 2의 MS 및 MS/MS 시험 진행 결과, 피크 1은 650의 분자량, Rha-Rha-C10-C10의 구조를 갖는 디-람노리피드(Di-rhamnolipid)로 분석되었고, 피크 2는 504의 분자량, Rha-C10-C10의 구조를 갖는 모노-람노리피드(Mono-rhamnolipid)로 분석되었다(도 15a-d). R1에는 다양한 구조를 갖는 람노리피드가 존재하며(도 16, 표 18) 그 중에서도 Rha-Rha-C10-C10, Rha-C10-C10의 구조를 갖는 람노리피드가 항균활성을 갖는 유효성분임을 확인하였다. 또한, 시그마 알드리치 코리아로부터 구입한 P. aeruginosa 배양액으로부터 추출한 람노리피드(R90, R95)의 S. aureus에 대한 항균활성은 R1과 비교했을 때 현저히 낮았다(도 17).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 배양액 추출물을 유효성분으로 포함하는 방부용 조성물.
녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 배양액 추출물을 유효성분으로 포함하는 항생(antibiotic) 조성물.
녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 배양액 추출물을 유효성분으로 포함하는 여드름 예방 또는 치료용 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 녹농균 배양액 추출물은 녹농균 배양액에 염산용액을 첨가하여 침전시킨 후 상기 침전물에 에틸 에테르를 첨가하여 수득한 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 녹농균 배양액 추출물은 람노리피드(Rhamnolipid)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 람노리피드는 다음의 화학식 1로 표시되는 디-람노리피드 또는 화학식 2로 표시되는 모노-람노리피드인 것을 특징으로 하는 조성물:
화학식 1

화학식 2
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 조성물 총 100 중량부에 대하여 0.005-1.0 중량부의 녹농균 배양액 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 스타필로코커스(Staphylococcus) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 칸디다(Candida) 속, 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 프로테우스(Proteus) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 클렙시엘라(Klebsiella) 속 및 대장균(Escherichia coli)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 미생물에 대하여 항균 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 조성물은 피부 외용제 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11 항에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 중에서 선택되는 어느 하나의 제형으로 제형화된 것을 특징으로 하는 조성물.