KR102413469B1

KR102413469B1 - 트리코델마 하지아눔 곰팡이 효소를 이용한 키토산 나노 입자 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR102413469B1
Application number: KR1020200016780A
Authority: KR
Inventors: 왕명현; 칸다사미 사라바나구마; 김혜영
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2018-06-19
Filing date: 2020-02-12
Publication date: 2022-06-24
Also published as: KR20200018544A

Abstract

본 발명은 키토산 나노 입자의 제조기술에 관한 것으로 더 상세하게는 곰팡이 효소를 이용하여 합성하는 방식으로 제조함으로써, 생태학적으로 지속 가능하며 경제적으로 키토산 나노 입자를 제공할 수 있도록 하며, 곰팡이 효소를 이용하여 제조해 기존의 키토산 나노 입자보다 더 작은 크기를 갖는 키토산 나노 입자 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 트리코델마 하지아눔을 배양하는 배양단계(S10); 조 단백질을 배양 및 원심분리를 통해 분리시켜 '분리된 조 단백질 펠릿'을 얻는 분리 단계(S20); '분리된 조 단백질 펠릿'을 키토산 용액에 첨가한 후 반응시키는 합성 단계(S30); 원심분리하고 동결건조하는 단계(S40);를 포함하는 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 곰팡이 효소를 이용한 키토산 나노 입자 제조방법을 제공한다.

Description

트리코델마 하지아눔 곰팡이 효소를 이용한 키토산 나노 입자 및 그 제조방법 {synthesis of chitosan nanoparticle using the fungal enzyme of Trichoderma harzianum}

본 발명은 키토산 나노 입자의 제조기술에 관한 것으로 더 상세하게는 곰팡이 효소를 이용하여 합성하는 방식으로 제조함으로써, 생태학적으로 지속 가능하며 경제적으로 키토산 나노 입자를 제공할 수 있도록 하며, 곰팡이 효소를 이용하여 제조해 기존의 키토산 나노 입자보다 더 작은 크기를 갖는 키토산 나노 입자 및 그 제조방법에 관한 것이다.

다양한 이물질 및 항생제 내성 박테리아에 대한 항균 및 항산화 활성을 포함한 향상된 생체 활성을 갖는 다기능 중합체 나노 입자의 생성은 폴리머 기반 생체 재료의 형성에 결정적이다.

키토산(CS)은 갑각류 및 곤충의 외골격에서 유래된 고분자에서 탈아세틸화 과정을 거쳐 β-(1-4)-D-글루코사민과 N-아세틸-D-글루코사민으로 구성된다. 키토산은 의학산업과 생체적합성, 분해성, 무독성, 침투성에 있어 중요한 폴리머이다. 게다가 키토산의 생물 의학적 응용은 항균제, 상처치유, 약물 운반체, 바이오 센서, 수처리 등으로 주목할 만 하다.

그러나 결합된 형태의 키토산은 낮은 용해도, 작은 표면적, 기계적 및 열적인 특성 때문에 생물학적 기능의 단점을 가지고 있다. 따라서, 키토산은 분자 크기, 안정성 및 형태에 대한 적절한 수정을 필요로 한다. 즉, 키토산 나노 입자의 형성이 여러 분야에서 절실히 필요로 하게 되었다.

일반적으로 키토산 나노입자(chitosan nanoparticles, CSNP)는 유용한 항균기능 등이 알려져있고, 관련하여 매우 다양한 분야에서 사용되고 있다. 이러한 키토산 나노입자의 제조는, 종래에 알려진 화학적 또는 기계적인 방법으로 제조가 이루어 지고 있으며, 이는 키토산의 합성 및 변형에 이용가능 하지만 그 제조과정이 복잡하며, 고비용일 뿐만 아니라 친환경적이지도 못하다는 단점들이 있었다.

기존의 화학적 또는 기계적인 방법을 통해 키토산 나노 물질(1-1000 nm), 미세 다공성 물질(<2 nm) 및 메조 포러스 물질(2-50 nm)로 변형될 수 있다. 특히 생물학적 방법은 나노 스케일 수준, 즉 100nm 미만의 크기로 제조함으로써 유리하다.

약물 내성 세균성 병원체는 인간의 삶에 위협이 되며, 따라서, 이들 병원체에 대한 새로운 약물의 발견은 더 큰 관심을 받고 있다.

살모넬라 엔테리카 티피무리움(Salmonella enteric Typhimurium)은 막대모양의 그람 음성 병원균으로 24시간 내에 장염, 설사, 발열, 및 복부 경련을 비롯한 다양하고 위험한 질병을 인간에게 일으킬 수 있다. 살모넬라증의 수준은 내성에 따라 개인마다 다양했으며, 몇몇 경우에는 치료 없이 4 ~ 7일 내에 완치될 수 있지만, 일부 사례에서는 살모넬라가 혈류를 통해 내장 표피 세포에서 다른 신체부위로 침투하여 적절한 항생제 치료가 없다면 사망을 유발하기도 한다.

포도상구균(Staphylococcus aureus)은 또 다른 그람 음성균으로서 종기를 포함하여 농가진, 봉와직염, 뼈 및 관절 감염, 균혈증 및 의료용 임플란트 감염을 유발한다. 포도상구균은 페니실린(penicillin)이나 메티실린(methicillin)과 같은 흔히 사용되는 항생제에 대해 내성이 있다. 그러므로 감염자에 대한 적절한 진단과 치료는 세균 감염의 성공적인 치료에 필수적이다.

몇몇 산화제와 자유 라디칼은 음식이나 소모품을 통해 심각한 세포손상과 병리학적 감염을 일으키므로 항산화 물질은 외부 입자에 대한 인간의 영양에 중요한 역할을 한다. 산화방지제를 측정하기 위해 여러 항산화제 분석법이 일반적으로 사용되며, 여기에는 총 산화방지제, DPPH 라디칼 소거능, 과산화수소 소거능, 총 환원력 등이 사용된다.

키토산 나노 물질에 관한 연구는 인간 병원균에 대한 억제 증가와 항산화 기능으로 알려져있지만, 대부분의 연구에서는 트리폴리인산염(TPP)을 사용하여 250nm ~ 400nm 크기의 CSNP를 생성한다. 이는 나노입자이기는 하지만 입자의 크기가 크며, 제조비용이 고비용이고 친환경적이지 못하다는 단점이 있었다. 따라서, 더 작은 크기의 입자를 갖는 키토산 나노 입자의 필요성이 절실해졌고, 더불어, 제조비용이 저렴하고 친환경적인 나노입자 제조방법의 필요성이 절실해졌다.

본 발명은 생태학적으로 지속 가능하며, 더 작은 크기를 갖는 나노입자의 제조방법을 찾던 중, 특히 트리코델마 하지아눔(Trichoderma harzianum) 유래의 곰팡이 효소가 고품질의 키토산 나노 입자를 경제적으로 제조할 수 있다는 것을 밝혀내어 이에 착안한 것이다.

본 발명은 트리코델마 하지아눔 유래의 곰팡이 효소를 이용한 키토산 나노 입자를 제조하는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 트리코델마 하지아눔 유래의 곰팡이 효소를 이용한 합성을 통해 제조된 키토산 나노 입자(T-CSNP) 및 이를 함유하는 항산화제, 항균제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 트리코델마 하지아눔 곰팡이 효소를 이용한 키토산 나노 입자를 제공한다.

본 발명은 트리코델마 하지아눔을 배양하는 배양단계(S10); 조 단백질을 배양 및 원심분리를 통해 분리시켜 '분리된 조 단백질 펠릿'을 얻는 분리 단계(S20); '분리된 조 단백질 펠릿'을 키토산 용액에 첨가한 후 반응시키는 합성 단계(S30); 원심분리하고 동결건조하는 단계(S40);를 포함하는 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 곰팡이 효소를 이용한 키토산 나노 입자 제조방법을 제공한다.

상기 트리코델마 하지아눔을 배양하는 배양단계(S10)에서는 밀기울과 NH₄NO₃가 6:5 내지 8:3으로 함유된 100 ~ 300ml의 밀기울 배지에 20 ~ 40℃에서 48 ~ 96시간 동안 100 ~ 250rpm의 진동으로 트리코델마 하지아눔의 2x 10⁶포자를 배양한 다음, Whatman no.1 여과지를 사용하여 여과하여 배양 상등액을 분리하는 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 곰팡이 효소를 이용한 키토산 나노 입자 제조방법을 제공한다.

상기 조 단백질을 배양 및 원심분리를 통해 분리시켜 '분리된 조 단백질 펠릿'을 얻는 분리 단계(S20)에서는 조 단백질을 20 ~ 30%의 황산암모늄으로 2 ~ 8℃에서 침전시킨 후 8,000 ~ 12,000rpm에서 30 ~ 60분간 원심 분리를 통해 분리시켜 '분리된 조 단백질'을 얻고, 상기 '분리된 조 단백질'을 황산 암모늄으로 침전시키고 2 ~ 8℃에서 8 ~ 16시간 동안 배양하여 '배양된 조 단백질'을 얻되, 상기 '배양된 조 단백질'을 '조 단백질 펠릿'이라 부르며, 상기 '조 단백질 펠릿'을 8,000 ~ 12,000rpm에서 20 ~ 50분 동안 원심분리시켜 '분리된 조 단백질 펠릿'을 얻는 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 곰팡이 효소를 이용한 키토산 나노 입자 제조방법을 제공한다.

상기 '분리된 조 단백질 펠릿'을 키토산 용액에 첨가한 후 반응시키는 합성 단계(S30)에서는 0.3 ~ 0.7%(w/v)의 저 분자량 키토산을 0.8 ~ 1.2%(v/v)의 아세트산에 용해 시키고 pH를 4.5 ~ 5.0으로 조정하여 '키토산 용액'을 얻으며, 상기 '분리된 조 단백질 펠릿'(180μg.ml^- ¹)을 20 ~ 50분 동안 자기 교반 하에 상기 '키토산 용액' 10 ~ 20㎖에 서서히 첨가하여 '조 단백질 키토산 용액'을 만들고, 상기 '조 단백질 키토산 용액'을 실온에서 밤새 보존하는 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 곰팡이 효소를 이용한 키토산 나노 입자 제조방법을 제공한다.

상기 원심분리하고 동결건조하는 단계(S40)에서는 상기 '조 단백질 키토산 용액'을 8,000 ~ 12,000rpm에서 5 ~ 15분간 원심 분리하고 동결 건조시켜 '키토산 나노입자'를 제조하는 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 곰팡이 효소를 이용한 키토산 나노 입자 제조방법을 제공한다.

상기와 같이 본 발명에 따른 트리코델마 하지아눔 곰팡이 효소를 이용한 키토산 나노 입자 및 그 제조방법은, 트리코델마 하지아눔 곰팡이로부터 얻은 조 단백질을 이용하여 키토산 나노 입자 원료를 합성하는 방식으로 제조함으로써 생태학적으로 지속가능하며 경제적으로 실행가능한 키토산 나노 입자 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명에 따라 제공되는 트리코델마 하지아눔 곰팡이 효소를 이용한 키토산 나노 입자(T-CSNPs)는 총 항산화 활성, DPPH 자유 라디칼 소거능, 과산화수소 자유 라디칼 소거능, 총 환원력, 그람 음성균에 대한 항균 활성 등의 다양한 기능들을 제공한다.

나아가 본 발명은 상술한 트리코델마 하지아눔 곰팡이 효소를 이용한 키토산 나노 입자를 함유하는 항산화제 조성물, 항균제 조성물을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 트리코델마 하지아눔 곰팡이 효소를 이용한 나노입자 제조방법의 플로우차트.
도 2는 트리코델마 하지아눔에서 T-CSNP 합성에 관여하는 조 단백질(CP-Th)의 분자량 측정도.
도 3은 트리코델마 하지아눔 곰팡이 효소를 이용한 키토산 나노 입자(TCSNP)의 특성분석에 따른 UV-vis 스펙트럼 분석 그래프(a), 입자 크기 분석 그래프(b), 투과 전자 현미경 사진(c,d) 및 EDS 스펙트럼 분석 그래프(e).
도 4는 T-CSNP의 푸리에 변환 적외분광법 그래프(a) 및 X-선 회절분석 그래프(b).
도 5는 트리코델마 하지아눔 곰팡이 효소를 이용한 키토산 나노 입자의 수용성 그래프.
도 6은 T-CSNP의 총 항산화 그래프(a), DPPH 라디칼 소거 그래프(b), 총 환원력 그래프(c) 및 과산화수소 소거 그래프(d).
도 7은 세균성 병원균인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 T-CSNP 치료 효과 그래프(a), 살모넬라 엔테리카 티피무리움(Salmonella enterica Typhimurium)에 대한 T-CSNP 치료 효과 그래프(b).
도 8은 T-CSNP에 의해 처리되지 않은 살모넬라 엔테리카 티피무리움(Salmonella enterica Typhimurium)의 투과 전자 현미경 사진(a), T-CSNP에 처리 된 살모넬라 엔테리카 티피무리움(Salmonella enterica Typhimurium)의 투과 전자 현미경 사진(b), T-CSNP에 의해 처리되지 않은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 투과 전자 현미경 사진(c), T-CSNP에 처리 된 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 투과 전자 현미경 사진(d).
도 9는 WST 방법을 사용하여 세포 독성 분석을 통해 NIH3T3 세포에 대해 시험한 T-CSNP의 생체 적합성 그래프.
도 10은 T-CSNP를 처리하지 않은 NIH3T3 세포의 AO/EB 염색 사진(a), T-CSNP를 100μg.ml^-1처리한 NIH3T3 세포의 AO/EB 염색 사진(b), T-CSNP를 200μg.ml^-1 처리한 NIH3T3 세포의 AO/EB 염색 사진(c), T-CSNP를 400μg.ml^-1 처리한 NIH3T3 세포의 AO/EB 염색 사진(d).

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 생태학적으로 지속 가능한 생물학적 환원방법을 통해 키토산 나노 입자를 제조하는 방법을 제공한다. 트리코델마 하지아눔으로부터 얻은 단백질 효소를 이용하여 고품질의 키토산 나노 입자를 경제적으로 제조할 수 있는 방법과, 이 방법에 의해 얻어진 키토산 나노 입자, 및 이 키토산 나노 입자의 다양한 생물의학적 및 항균활성, 항산화활성 등을 확인하였다.

1. 재료 및 시험 방법

1.1. 화학 제품, 미생물 및 세포주

dulbecco's modified eagle medium(DMEM, Gibco), 우태아혈청(Gibco), 항생제 페니실린(Gibco), 스트렙토 마이신(Gibco)을 준비한다. 저 분자량 키토산(폴리(D-글루코사민)Cata log No.448869, 75-85% 탈아세틸화), 아세트산, DPPH(1,2-디페닐-1-피크릴히드라질), EB(에티듐 브로마이드), AO(Acridine orange)는 한국의 MB cell에서 구입하였으며 다른 모든 화학 약품 및 분석 등급 시약은 춘천의 SUNtek scientific utillity network 에서 구입했다.

포도상구균(Staphylococcus aureus(ATCC13150)), 살모넬라 엔테리카 티피무리움균(Salmonella enteric Typhimurium(ATCC14028))과 같은 세균성 병원균의 ATCC 균주는 한국의 KCTC(Korea Collection for Type Culture)에서 구입했다. T. harzianum이 연구에 사용되었다. 모든 박테리아와 곰팡이 균주는 추가 실험적 사용을 위해 -80℃의 냉동 보관실에서 20% 글리세롤로 유지되었다. 쥐 배아 섬유아세포 NIH-3T3 세포주는 한국 세포주 은행(KLCB,Seoul,Korea)에서 얻었고, Dulbecco's modified eagle medium(DMEM, Gibco)에서 5% CO₂와 37℃의 습도 환경에서 24시간 배양하여 70-80% confluent에 도달한 다음, 이후 실험용 극저온 유리병에서 액체 질소 중의 세포 동결 배지(Cell Freezing Media, DMSO, BCS)에 보존하였다.

2.2. 키토산 나노 입자(T-CSNP)의 병합

본 발명의 일 실시예에 따라 제공되는 트리코델마 하지아눔 곰팡이 효소를 이용한 키토산 나노 입자 제조방법은, 트리코델마 하지아눔을 배양하는 배양단계(S10); 조 단백질을 배양 및 원심분리를 통해 분리시켜 '분리된 조 단백질 펠릿'을 얻는 분리 단계(S20); '분리된 조 단백질 펠릿'을 키토산 용액에 첨가한 후 반응시키는 합성 단계(S30); 원심분리하고 동결건조하는 단계(S40);를 포함한다..

트리코델마 하지아눔을 배양하는 배양단계(S10)에서는 밀기울과 NH₄NO₃가 6:5 내지 8:3으로 함유된 100 ~ 300ml의 밀기울 배지에 20 ~ 40℃에서 48 ~ 96시간 동안 100 ~ 250rpm의 진동으로 트리코델마 하지아눔의 2x 10⁶포자를 배양한 다음, Whatman no.1 여과지를 사용하여 여과하여 배양 상등액을 분리한다.

조 단백질을 배양 및 원심분리를 통해 분리시켜 '분리된 조 단백질 펠릿'을 얻는 분리 단계(S20)에서는 조 단백질을 20 ~ 30%의 황산암모늄으로 2 ~ 8℃에서 침전시킨 후 8,000 ~ 12,000rpm에서 30 ~ 60분간 원심 분리를 통해 분리시켜 '분리된 조 단백질'을 얻고, 상기 '분리된 조 단백질'을 황산 암모늄으로 침전시키고 2 ~ 8℃에서 8 ~ 16시간 동안 배양하여 '배양된 조 단백질'을 얻되, 상기 '배양된 조 단백질'을 '조 단백질 펠릿'이라 부르며, 상기 '조 단백질 펠릿'을 8,000 ~ 12,000rpm에서 20 ~ 50분 동안 원심분리시켜 '분리된 조 단백질 펠릿'을 얻는다. 상기 '분리된 조 단백질 펠릿'을 칼럼크로마토그래피를 이용하여 40 ~ 60mM 인산나트륨 완충액(pH4 ~ 6)으로 조효소를 용출시킨다. 단백질 함량은 제조사 지침에 따라 BCA 방법으로 측정한다.

다음으로 '분리된 조 단백질 펠릿'의 측정을 위해 전기영동으로 분리하는 단계를 거친다. '분리된 조 단백질 펠릿'을 분자량 측정을 위해 5 ~ 9% SDS-PAGE 전기영동으로 분리한다. 본 단계는 본 발명의 키토산 나노입자의 제조방법 과정의 단계는 아니며 단지 조 단백질 측정을 위한 단계임을 밝혀둔다. 용출은 Tris-HCl 완충액(20 ~ 30mmol/l, pH 7.5 ~ 8.0)을 사용하여 수행한다. '분리된 조 단백질 펠릿'의 조 단백질의 분자량을 비교하기 위해 표준 단백질마커(Clontech, TaKaRA premixed protein Marker, Shanghai, China)를 사용하였다. 이 '분리된 조 단백질 펠릿'은 T-CSNP의 합성에 사용된다.

'분리된 조 단백질 펠릿'을 키토산 용액에 첨가한 후 반응시키는 합성 단계(S30)에서는 0.3 ~ 0.7%(w/v)의 저 분자량 키토산을 0.8 ~ 1.2%(v/v)의 아세트산에 용해 시키고 pH를 4.5 ~ 5.0으로 조정하여 '키토산 용액'을 얻으며, 상기 '분리된 조 단백질 펠릿'(180μg.ml^- ¹)을 20 ~ 50분 동안 자기 교반 하에 상기 '키토산 용액' 10 ~ 20㎖에 서서히 첨가하여 '조 단백질 키토산 용액'을 만들고, 상기 '조 단백질 키토산 용액'을 실온에서 밤새 보존한다.

원심분리하고 동결건조하는 단계(S40)에서는 상기 '조 단백질 키토산 용액'을 8,000 ~ 12,000rpm에서 5 ~ 15분간 원심 분리하고 동결 건조시켜 '키토산 나노입자'를 제조한다.

상기에 기재한 제조방법에 따른 상세한 실시예는 다음과 같다.

실시예 1. 곰팜이 효소 처리

첫째, 밀기울(70.0g.l^-1)과 NH₄NO₃(40.0g.l^-1)가 함유된 200ml의 밀기울 배지에 28℃에서 72시간 동안 180rpm의 진동으로 트리코델마 하지아눔의 2x 10⁶포자를 배양하였다. Whatman no.1 여과지를 사용하여 여과하여 배양 상등액을 분리하였다.

둘째, 조 단백질을 25%의 황산암모늄으로 4℃에서 침전시킨 후 10,000rpm에서 40분간 원심 분리를 통해 분리시켜 '분리된 조 단백질'을 얻었다. 상기 '분리된 조 단백질'을 황산 암모늄으로 침전시키고 4℃에서 12시간 동안 배양하여 '배양된 조 단백질'을 얻었다. 상기 '배양된 조 단백질'을 '조 단백질 펠릿'이라 부르며, 상기 '조 단백질 펠릿'을 10,000rpm에서 30분 동안 원심분리시켜 '분리된 조 단백질 펠릿'을 얻었다.

마지막으로, '분리된 조 단백질 펠릿'을 분자량 측정을 위해 7% SDS-PAGE 전기영동으로 분리하였다. 용출은 Tris-HCl 완충액(25mmol/l, pH 7.8)을 사용하여 수행하였다. '분리된 조 단백질 펠릿'의 분자량을 비교하기 위해 표준 단백질마커(Clontech, TaKaRA premixed protein Marker, Shanghai, China)를 사용하였다. 이 '분리된 조 단백질 펠릿'은 T-CSNP의 합성에 사용되었다.

실시예 2. 곰팡이 효소 기반 T-CSNP

0.5 %(w/v)의 저 분자량 키토산을 1%(v/v)의 아세트산에 용해 시키고 pH를 4.8로 조정하여 '키토산 용액'을 얻었으며, 상기 '분리된 조 단백질 펠릿'(180μg.ml^-1)을 30분 동안 자기 교반 하에 상기 '키토산 용액' 15㎖에 서서히 첨가하여 '조 단백질 키토산 용액'을 만들고 상기 '조 단백질 키토산 용액'을 실온에서 밤새 보존하였다. '조 단백질 키토산 용액'을 10,000rpm에서 10분간 원심 분리하고 동결 건조시켜 분말을 제조하였다.

2.2.1. T-CSNP의 특성

UV 분광 광도계(2120UV, Optizen, Korea)를 이용하여 나노 입자 형성을 확인하였다. 동결 건조된 T-CSNP는 EDS(Energy dispersive X-ray spectroscopy)를 이용한 투과 전자 현미경(1200EX, JEOL-JSM, Japan)에 의해 특성화되었으며 입자 크기는 입자 크기 분석기(Mastersizer 2000, Malvern, Britain)로 측정되었다. 결정성 및 순도는 Cu κα방사 θ-2θ로 40 keV에서 작동하는 X선회절계(X'pert-pro MPD-PANalytical, Netherland)로 측정했다. T-CSNP로부터 얻어진 기능성 분자는 푸리에 변환 적외선 분광법(Paragon 500, PerkinElmer, USA)을 사용하여 측정되었다. pH의존성 수용성도 시험되었다.

2.3. 항산화 분석

실시예 3. 총 항산화 분석

T-CSNP의 총 항산화제 활성은 이전에 기술된 방법에 따라 측정되었다. 0.6 M의 황산, 28mM의 Na₂CO₃ 및 4mM의 몰리브데넘산암모늄이 함유된 시약 용액을 준비하였다. 각각 다른 농도의 T-CSNP를 1ml의 메탄올 및 600㎕의 시약 용액과 혼합한 후 95℃에서 90분 동안 배양하였다. 용액의 흡광도는 실온에서 냉각시킨 후 UV 분광 광도계(Optizen 2120UV, Korea)를 사용하여 695nm에서 측정하였다. 백분율은 아스코르브산을 양성 대조군으로 사용하여 계산되었다.

실시예 4. DPPH 자유 라디칼 소거능 시험

DPPH 자유 라디칼 소거능 시험이 수행되었다. 서로 다른 농도(25-500 μg.ml^-1)의 T-CSNP를 2ml의 0.1mM DPPH 메탄올 용액과 혼합하고 실온에서 30분 동안 암실에서 배양하였다. UV 분광광도계(Optizen 2120UV, 한국)를 사용하여 515nm에서 흡광도를 기록하였다. 아스코르브산을 양성대조군으로 사용하였으며 DPPH의 백분율을 계산하였다.

실시예 5. 총 환원력

T-CSNP의 총 환원력은 이전에 보고된 방법에 따라 약간 수정하여 측정되었다. 서로 다른 농도의 T-CSNP를 1ml의 증류수에 녹인 다음 인산염 완충액(0.2M, pH 6.6) 2.5ml와 1% 페리시안화칼륨(K₃Fe(CN)₆) 2.5ml와 혼합하였다. 혼합물은 50℃에서 20분 동안 배양되었다. 부분표본 2.5ml의 10% 트리클로로아세트산을 혼합물에 첨가하였다. 상층액을 취하여 2.5ml의 증류수와 0.5ml의 0.1% FeCl₃와 혼합하고 UV 분광 광도계(Optizen 2120UV, Korea)를 사용하여 흡광도를 700nm에서 기록했다.

실시예 6. 과산화수소 자유 라디칼 소거 활성

T-CSNP의 H₂O₂ 소거 능력은 다른 곳에서 보고된 방법에 따라 측정되었다. 간략하게, 10mM의 H₂O₂가 인산염 완충액(pH 7.4)에서 준비되었다. 각각 다른 농도의 T-CSNP와 또는 아스코르브산을 H₂O₂ in PBS 2ml와 혼합하고 37℃에서 10분간 배양한 후, 흡광도를 230nm에서 기록하였다. H₂O₂ 소거의 백분율은 공식을 사용하여 계산되었다.

2.4. 살균 분석

실시예 7. 살균 분석

T-CSNP의 항균 효과는 황색포도상구균(ATCC13150) 및 살모넬라 엔테릭 티피무리움(ATCC14028)과 같은 2개의 세균성 병원체에 대해 Rogosa and Sharpe agar 또는 액체배지를 사용한 미량희석법에 따라 디스크확산법으로 밝혀졌다. T-CSNP로 유도된 세균 세포 손상은 투과 전자 현미경을 사용하여 관찰되었다. 세균 세포를 처리하기 위해 T-CSNP의 최소억제농도(minimal inhibitory concenteration)를 사용하였고, 세포를 37℃에서 24시간 동안 성장시켰다. 배양기간을 거친 후 박테리아 세포를 원심분리법에 의해 수집 한 다음 4%(v/v) 글루타르알데하이드로 2시간 동안 고정시켰다. 세포를 70%의 아세톤으로 탈수시킨 다음 FETEM(1200EX, JEOL-JSM, Japan)을 사용하여 세포손상을 관찰하였다.

2.5. 세포생존력 분석

실시예 8. 세포 생존력 분석

T-CSNP의 세포 생존력은 WST-1 분석키트(EZ-CyTox, Daeil Lab Service, 한국)를 사용하여 측정하였다. WST 분석을 위해 마우스 섬유아세포 NIH-3T3 세포(5x10⁴cells)를 10% FBS 및 항생제 용액과 DMEM을 포함한 96 웰 세포 배양 플레이트(coster)에 접종한 후, 가습된 5% CO₂ 배양기에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 또한, 세포를 T-CSNP의 상이한 농도(0 내지 400㎍/ml)로 처리하고 24 시간 동안 배양하였다. 세포 생존력은 제조 프로토콜에 따라 WST 분석법을 사용하여 평가하였다. 세포 사멸 단계는 공 초점 현미경(SR-CLSM; LSM880 with Airyscan, ZEISS, Oberkochen, Germany)을 사용한 AO/EB의 이중 염색법을 사용하여 관찰되었다.

3. 결과

3.1. T-CSNP의 곰팡이 단백질 분자 기반 합성

키토산은 생체의학 나노기술에서 생체 적합성 고분자 도구로서 항생제 개발과 암 치료에 많은 관심을 받고 있다. 저 분자량의 나노 사이즈 키토산은 향상된 생물 활성 및 약물 운반 효율로 높은 가용성을 갖는다. 화학적 및 기계적 방법은 CSNP로서 키토산의 합성 및 변형에 이용 가능하지만 합성 또는 해중합을 위한 미생물 유래 단백질 또는 효소의 이용에 관한 연구는 많지 않다. 우리가 아는 한, 진균류가 셀룰라아제(Cellulase), β글루코시다아제(β-glucosidase), endoglucanase, exoglucanase, 자일라나아제(xylanase), 펙티나아제(pectinase), 아밀라아제(amylase), 글루코아밀라아제(glucoamylase), 글루코이성화효소(glucose isomerase), 프로테아제(protease), β글루카나아제(βglucanase), 피타아제(phytase), 리파아제(lipase), 포스포리파아제(phospholipase), 리소포스포리파아제(lysophospholipase) 등과 같은 다양한 효소를 생성하는 것으로 알려져 있지만, CSNP 합성을 위한 트리코델마 종의 이용에 대한 보고는 없다. 따라서, 본 발명에서는 T. harzianum의 조 단백질 및 효소 추출물을 키토산 나노 입자(T-CSNP)의 합성을 위해 시도하였다. 조 단백질을 정량하고 도 2에서와 같이 SDS-PAGE 전기영동을 사용하여 분자량을 측정하였다.

3.2. T-CSNP의 특성

T-CSNP는 280nm에서 최대 플라즈마 공명 피크에 의해 확인되었다(도 3a). 이는 이전의 발견에 부합된다. 입자 크기 분석기(PSA)는 T-CSNP의 크기를 0.01-0.314μm의 범위에서 나타내었으며 평균 크기는 0.046μm로 46nm와 동일하다(도 3b). 투과 전자 현미경 이미지는 25.81 ~ 30.35nm 범위의 단 분산 구형 T-CSNP를 나타냈으며(도 3c & d), 이는 PSA 분석과 일치한다. CSNPs의 mycosynthesis가 기계적 또는 다른 화학기반 합성보다 훨씬 작은 크기를 가지고있음을 언급하는 것은 가치가 있다. TEM-EDS 분석은 T-CSNP의 합성을 확인한 C, O(도 3e)의 존재를 보여주었으며, CSNP의 EDS 분석에 대한 이전의 보고서와 일치한다.

키토산의 기능적 분자 변형은 FTIR 스펙트럼 분석을 통해 측정되었다. 키토산을 표시한 피크의 존재는 3278.32 cm^-1(C-H stretching alkyne), 2875.73 cm^-1(C-H stretching, alkane), 1647.55 cm^-1(C=N stretching, imine/oxime), 1560.14 cm^-1(C=C, weak aromatic), 1419.64 cm^-1(O-H bending, carboxylic acid), 1375.22 cm^-1(O-H bending, phenol), 1312.17 cm^-1(S=O stretching, sulfone), 1199.24 cm^-1(S=O, stretching, sulfate), 1149.96 cm^-1(C-O stretching, aliphatic ether), 1059.55 cm^-1(S=O stretching, sulfoxide), 1024.89 cm^-1(C-O stretching, tertiary alcohal), 894.99 cm^-1(C=C bending, alkene), 554.2 cm^-1(C-I stretching, halo compounds), 515.75 cm^-1(C-Br starching, halo compounds), 3391.24 cm^-1(N-H stretching, aliphatic primary amine), 2929.40 cm^-1(C-H, stretching, alkane), 2125.43cm^-1(N=N=N stretching, azide), 1639.72 cm^-1(C=C stretching, conjugated alkane), 1555.43 cm^-1(C=O, amide), 1410.20 cm^-1(O-H bending, carboxylic acid), 1382.26 cm^-1(O-H, stretching, Phenol), 1317.94 cm^-1(C-N stretching, aromatic amine), 1216.64 cm^-1(C-O stretching, alkyl aryl ether), 1152.02 cm^-1(C-N, stretching, amide), 1078.82 cm^-1(C-O strong stretching, primary alcohol), 893.34 cm^-1(C=C bending alkene), 702.96 cm^-1(C-H, bending alkene, 1,2-disubstituted), 653.81 cm^-1(C-Br stretching, halo compounds), 549.64 cm^-1(C-I stretching halo compounds)(도 4a)에서 관찰되었다. 따라서 FTIR 결과는 T-CSNP에서 특히 아미드, 아미노 및 카르복실산 그룹에서 트리코델마의 조 단백질의 변형과 결합을 밝혀냈다.

T-CSNP의 비정질 구조는 페니실리움 옥살리쿰의 조 단백질을 이용한 CSNP의 조기 발견에 따른 XRD 분석을 통해 패턴의 피크가 없는 것으로 확인되었다(도 4b). T-CSNP의 수용해도는 키토산과 비교하여 상이한 pH(1 내지 10)에서 추가로 시험하였다. 결과는 키토산이 pH 1 - 3의 범위에서 가용성인 반면 T-CSNP는 동일한 pH 범위에서 100% 가용성이지만 pH가 증가함에 따라 감소함을 나타냈다(도 5). 이 높은 수용성은 T-CSNP의 비정질 구조에서 기인될 수 있다.

3.3. 항산화 성질

Mycosynthesis 된 T-CSNP의 항산화 효능은 총 항산화 분석에서 28.27±5.6% - 60.61±5.8%, DPPH 라디칼 소거능은 35.21±5.2% - 75.21±2.5%, 총 환원력의 경우 37.41±5.3% - 78.3±5.6%, H₂O₂ 라디칼 소거 활성은 33.15±8.5% - 64.18±4.5%였다. 결과는 T-CSNP의 항산화 잠재력이 네 가지 항산화 분석에서 농도에서 유의미하게 증가했으며, 양성 표준 아스코르브산보다 낮음을 나타냈다(도 6a-d). 자유 라디칼과 활성 산소종(ROS)은 다양한 만성 질환과 관련이 있다. 이와 관련하여 항산화제는 지질 과산화를 억제하여 자유 라디칼 축적을 감소시킨다. 총 항산화 활성 및 회귀 분석 결과, T-CSNP 40μg.ml^- ¹는 아스코르브산 60μg.ml^- ¹와 동등한 것으로 나타났다. T-CSNP의 높은 항산화 활성은 C-2 질소의 존재에 기인한 것일 수도 있다. T-CSNP는 아민과 아미노기가 존재하기 때문에 DPPH 라디칼 소거에 있어서 CSNP의 TPP기반 합성보다 높은 항산화 활성을 보여주었으며, 이는 FTIR분석에서도 분명했다.

3.4. 항균 활성

T-CSNP의 항균 효율은 T-CSNP의 농도에 따라 황색포도상구균(S. aureus)의 경우 0.9±1.7에서 1.7±0.2cm, 살모넬라 엔테리카(S.enterica)의 경우 0.7±0.1에서 1.8±0.2 로 억제 영역이 증가하는 것으로 나타났고, 이 값은 양성 대조군인 테트라사이클린보다 낮았다(표 1). 살균 농도는 황색포도상구균(S. aureus)과 살모넬라 엔테리카(S.entrica)에 대해 각각 100mg.ml^- ¹로 기록되었지만(도 7a & b), 정균 농도는 시험 균에 비해 75와 50mg.ml^-1로 나타났다. 또한, 100mg.ml^-1의 T-CSNP는 FETEM 분석에서 흰 화살표로 표시된 것처럼 단단한 세균 세포벽의 처리되지 않은 세포와 비교하여 후방 및 전방 끝과 세포막의 구조적 변화 모두에서 박테리아 세포 벽 손상에 대한 적색 화살표와 같이 박테리아 세포 손상을 일으켰다(도 8b & d). 나노-메조포러스 사이즈의 T-CSNP(<50nm)는 200nm 이상의 크기를 갖는 CSNP보다 많은 표면적을 가졌다. 이 특성은 T-CSNP가 박테리아 세포벽으로 쉽게 침투할 수 있게 하고 막 분자의 파괴를 통해 손상 또는 사망을 일으킨다. 또한, CSNP와 박테리아의 음이온 및 양이온 상호 작용은 세포 용해 및 구조 변화를 유도한다.

T-CSNP (mg.ml-1)	억제 영역(cm)
T-CSNP (mg.ml-1)	Staphylococcus aureus (ATCC 13150)	Salmonella entrica Typhimurium(ATCC14028)
50	0.9±0.1	0.7±0.1
75	0.9±0.2	0.8±0.1
100	1.6±0.1	1.5±0.2
150	1.7±0.2	1.8±0.2
테트라사이클린 (30 mcg/mL)	3.0±0.3	3.5±0.4

3.5. T-CSNP의 생체 적합성

T-CSNP의 생체 적합성을 WST-1키트를 사용하여 세포 생존능 분석에 의해 쥐의 섬유아세포 NIH-3T3 세포에서 시험하였다. 결과는 도 9에서 나타난 바와 같이 0 ~ 100μg.ml^-1의 농도에서 T-CSNP의 유의미한 독성이 나타나지 않았지만, 400 μg.ml^-1의 고농도에서는 핵 손상과 세포자멸 괴사를 통해 45%의 세포사멸이 관찰됐다(도 10). 이것은 HepG2 인간 자궁 경부암 세포와 L929 섬유아세포에 대한 CSNP의 세포 독성의 이전 연구와 유사하다.

4. 결론

본 발명은 트리코델마 하지아눔(T. harzianum)의 조효소를 이용하여 CSNP를 합성하였다. T-CSNP는 나노 크기이고 구형으로 <100 nm 크기였다. 그것은 저 분자량이고 수용성이었다. T-CSNP는 유의미한 항산화 및 항균 활성을 용량 의존적으로 나타냈다. 또한, 세포 독성을 이용한 생체 적합성 시험은 100μg.ml^-1까지의 T-CSNP 농도가 쥐 섬유아세포인 NIH-3T3에서 세포 사멸 및 손상을 유발하는 독성이 없음을 나타냈다. 그러므로 mycosynthesis 된 T-CSNP는 다른 방법으로부터 유래된 CSNP보다 더 큰 표면적을 갖는 더 작은 크기로 인해 생의학적 응용에서 유망하다.

(S10): 배양단계
(S20): 분리 단계
(S30): 합성 단계
(S40): 원심분리하고 동결건조하는 단계

Claims

트리코델마 하지아눔을 배양하는 배양단계(S10);
조 단백질을 배양 및 원심분리를 통해 분리시켜 '분리된 조 단백질 펠릿'을 얻는 분리 단계(S20);
'분리된 조 단백질 펠릿'을 키토산 용액에 첨가한 후 반응시키는 합성 단계(S30);
원심분리하고 동결건조하는 단계(S40);를 포함하는 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 곰팡이 효소를 이용한 키토산 나노 입자 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 트리코델마 하지아눔을 배양하는 배양단계(S10)에서는 밀기울과 NH₄NO₃ 가 함유된 밀기울 배지에 트리코델마 하지아눔 포자를 배양한 다음, 여과지를 사용하여 여과하여 배양 상등액을 분리하는 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 곰팡이 효소를 이용한 키토산 나노 입자 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 조 단백질을 배양 및 원심분리를 통해 분리시켜 '분리된 조 단백질 펠릿'을 얻는 분리 단계(S20)에서는 조 단백질을 황산암모늄으로 침전시킨 후, 원심 분리를 통해 분리시켜 '분리된 조 단백질'을 얻고, 상기 '분리된 조 단백질'을 황산 암모늄으로 침전시키고 배양하여 '배양된 조 단백질'을 얻되, 상기 '배양된 조 단백질'을 '조 단백질 펠릿'이라 부르며, 상기 '조 단백질 펠릿'을 원심분리시켜 '분리된 조 단백질 펠릿'을 얻는 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 곰팡이 효소를 이용한 키토산 나노 입자 제조방법.
제3항에 있어서,
상기 조 단백질을 배양 및 원심분리를 통해 분리시켜 '분리된 조 단백질 펠릿'을 얻는 분리 단계(S20)에서는 조 단백질을 20 ~ 30%의 황산암모늄으로 2 ~ 8℃에서 침전시킨 후 8,000 ~ 12,000rpm에서 30 ~ 60분간 원심 분리를 통해 분리시켜 '분리된 조 단백질'을 얻고, 상기 '분리된 조 단백질'을 황산 암모늄으로 침전시키고 2 ~ 8℃에서 8 ~ 16시간 동안 배양하여 '배양된 조 단백질'을 얻되, 상기 '배양된 조 단백질'을 '조 단백질 펠릿'이라 부르며, 상기 '조 단백질 펠릿'을 8,000 ~ 12,000rpm에서 20 ~ 50분 동안 원심분리시켜 '분리된 조 단백질 펠릿'을 얻는 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 곰팡이 효소를 이용한 키토산 나노 입자 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 '분리된 조 단백질 펠릿'을 키토산 용액에 첨가한 후 반응시키는 합성 단계(S30)에서는 저 분자량 키토산을 아세트산에 용해 시키고 pH를 조정하여 '키토산 용액'을 얻으며, 상기 '분리된 조 단백질 펠릿'을 자기 교반 하에 상기 '키토산 용액'에 서서히 첨가하여 '조 단백질 키토산 용액'을 만들고, 상기 '조 단백질 키토산 용액'을 실온에서 보존하는 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 곰팡이 효소를 이용한 키토산 나노 입자 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 '분리된 조 단백질 펠릿'을 키토산 용액에 첨가한 후 반응시키는 합성 단계(S30)에서는 0.3 ~ 0.7%(w/v)의 저 분자량 키토산을 0.8 ~ 1.2%(v/v)의 아세트산에 용해 시키고 pH를 4.5 ~ 5.0으로 조정하여 '키토산 용액'을 얻으며, 상기 '분리된 조 단백질 펠릿'(180μg.ml^- ¹)을 20 ~ 50분 동안 자기 교반 하에 상기 '키토산 용액' 10 ~ 20㎖에 서서히 첨가하여 '조 단백질 키토산 용액'을 만들고, 상기 '조 단백질 키토산 용액'을 실온에서 밤새 보존하는 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 곰팡이 효소를 이용한 키토산 나노 입자 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 원심분리하고 동결건조하는 단계(S40)에서는 '조 단백질 키토산 용액'을 원심 분리하고 동결 건조시켜 '키토산 나노입자'를 제조하는 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 곰팡이 효소를 이용한 키토산 나노 입자 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 원심분리하고 동결건조하는 단계(S40)에서는 상기 '조 단백질 키토산 용액'을 8,000 ~ 12,000rpm에서 5 ~ 15분간 원심 분리하고 동결 건조시켜 '키토산 나노입자'를 제조하는 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 곰팡이 효소를 이용한 키토산 나노 입자 제조방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 의해 제조된 트리코델마 하지아눔 곰팡이 효소를 이용한 키토산 나노입자.