CN113413341A

CN113413341A - 一种植物源复配抑菌剂

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Publication number: CN113413341A
Application number: CN202110702620.XA
Authority: CN
Inventors: 涂禄清; 邓建科
Original assignee: Guangzhou Cuipu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Cuipu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-06-24
Filing date: 2021-06-24
Publication date: 2021-09-21
Anticipated expiration: 2041-06-24
Also published as: CN113413341B

Abstract

本发明公开了一种植物源复配抑菌剂，所述抑菌剂由牡丹花提取物和花椒果提取物按质量百分比复配而成，其中牡丹花提取物含量为20％‑50％，花椒果提取物含量为50％‑80％。本发明的植物源复配抑菌剂，抗菌谱广、抑菌作用强，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌以及霉菌，具有较宽的抑菌谱，且充分体现复配物协同增效的作用，克服单一植物提取物在抑菌效力上的局限性。该植物源复配抑菌剂的防腐能力与化学抑菌剂尼泊金丙酯的作用基本相当，可替代传统的化学防腐剂的使用。通过实验初步表明该植物源复配抑菌剂通过作用于细菌的细胞壁、细胞膜、核酸以及酶蛋白等不同部位，协同作用，提高组合物的抑菌能力。

Description

一种植物源复配抑菌剂

技术领域

本发明涉及化妆品天然防腐技术领域，尤其涉及一种具有强效、广谱抑菌活性植物源复配抑菌剂。

背景技术

防止化妆品的微生物污染，保障化妆品的品质安全，当前最有效的办法就是添加防腐剂。然而，目前允许使用的绝大多数化妆品防腐剂都是化学合成产品，如尼泊金酯类、甲基异噻唑啉酮、苯氧乙醇等，但不同程度的存在刺激性和生物毒性，其潜在的安全风险已引起业界的广泛关注，防腐替代已成为研究的热点课题，越来越多的学者研究天然来源的防腐剂，其中植物提取物的防腐功能倍受关注。而我国对化妆品中的天然防腐剂的研究尚处于起步阶段，同时也面临着许多问题，例如天然防腐剂抑菌效果稍弱，成本高，抑菌普较窄，复配防腐剂的研究还处于起步阶段。

花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim)为芸香科(Rutaceae)花椒属(ZanthoxylumL)植物，主要分布于东亚与北美，广泛分布于我国。花椒作为传统中药材，收录于《中国药典》，其药用历史悠久，有温中止痛，杀虫止痒。用于脘腹冷痛，呕吐泄泻，虫积腹痛；外治湿疹，阴痒。随着对花椒的研究不断深入，从花椒中分离得到的化合物主要有生物碱类、苯丙素类、黄酮及糖苷类、花椒挥发油等化合物。花椒果实生物活性成分有抗肿瘤、镇痛、降肠炎、上呼吸道感染等功效。

牡丹为毛茛科植物，是我国重要的观赏植物，有“花中之王”的美称。目前的研究显示，牡丹花的主要成分是挥发性物质、花色苷、糖苷、酚酸、黄酮类等。

目前，发明人在对大量天然植物进行抑菌活性筛选的过程中发现，已有部分文献报告花椒和牡丹提取物的抑菌活性，但当单独使用花椒或是牡丹时其抑菌活性仍低于市面经常使用的化学抑菌及尼泊金类，因此，发明人进一步对花椒和牡丹的提取工艺进行了优化，研究了花椒和牡丹的合理复配比例，并与常用的化学化妆品防腐剂防腐效果进行了比较，并初步研究其防腐协同作用的机理。

发明内容

本发明的目的就是要提供一种抗菌谱广、抑菌作用强的天然防腐复配体系，克服单一植物提取物在抑菌效力上的局限性。

一种植物源复配抑菌剂，所述抑菌剂由牡丹花提取物和花椒果提取物按质量比复配而成，其中牡丹花提取物含量为20％-80％，花椒果提取物含量为20％-80％。更进一步的，牡丹花提取物含量为20％-50％，花椒果提取物含量为50％-80％。

本发明中牡丹花提取物的主要成分为酚酸、类黄酮、槲皮素、单帖糖苷和没食子酰单宁，花椒果提取物主要成分为挥发油、生物碱、黄酮类、香豆素等。

以下是本发明中植物原料的来源：

(1)牡丹花：本品为毛茛科植物牡丹Paeonia Suffruticosa Andr.的干燥花。购买自广州药材批发市场。

(2)花椒果：本品为芸香科植物青椒Zanthoxylum schinifolium Sieb.Et Zucc.或花椒Zantho-xylum bungeanum Maxim.的干燥成熟果实。购买自广州药材批发市场。

(3)供试细菌：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)。供试真菌：白色假丝酵母(Canidia albicans)，黑曲霉菌(Aspergillus niger)。均购买自广东省微生物菌种保藏中心。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色假丝酵母和黑曲霉菌均为化妆品中不允许检出的四类代表性菌群，因此，以该四类菌群作为抑菌效果监测对象。

(4)本发明所用其他试剂、材料无特殊说明外，均为可以从市场直接购买的常规试剂、材料。乙醇为食品级乙醇，不同浓度的乙醇溶液均为体积百分浓度。胰蛋白胨、牛肉浸膏、琼脂均为BR规格，购自国药集团化学试剂有限公司。

本发明中的牡丹花提取物和花椒果提取物的制备方法如下：

所述牡丹花提取物的提取方法为：将干燥的牡丹花粉碎，用乙醇加热回流提取，乙醇浓度60％-90％，乙醇溶剂比为1:15-1:25，合并滤液，并于40-60℃浓缩，静置，取上清液冷冻干燥得牡丹花提取物冻干粉。

所述花椒果提取物的提取方法为：(a)将干燥的花椒果粉碎，用75～95％乙醇溶液热回流提取，合并滤液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液；(b)将步骤(a)所得乙醇提取浓缩液用水稀释，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取萃取，减压浓缩；(c)正丁醇萃取物用甲醇、乙醇、水混合溶解，过滤，挥至粘稠，经大孔树脂柱层析，富集活性成分，先用乙醇水梯度洗脱，再用甲醇水梯度洗脱液洗脱，减压浓缩，喷雾干燥即得。

将按照上述方法制得的牡丹花提取物和花椒果提取物按照牡丹花提取物含量为20％-80％，花椒果提取物含量为20％-80％的质量比进行混合溶解得复配物。所述植物源复配抑菌剂具有抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色假丝酵母菌、以及黑曲霉菌的作用。该植物源复配抑菌剂可用于面膜、膏霜、乳液、香波、洗面奶、沐浴乳等化妆品防腐体系中。

本发明的有益效果在于，与现有技术相比，(1)本发明的植物源复配抑菌剂，抗菌谱广、抑菌作用强，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌以及霉菌，具有较宽的抑菌谱，且充分体现复配物协同增效的作用，克服单一植物提取物在抑菌效力上的局限性。(2)该植物源复配抑菌剂的防腐能力与化学抑菌剂尼泊金丙酯的作用基本相当，可替代传统的化学防腐剂的使用。(3)通过实验初步表明该植物源复配抑菌剂通过作用于细菌的细胞壁、细胞膜、核酸以及酶蛋白等不同部位，协同作用，提高组合物的抑菌能力。

附图说明

图1是本发明植物提取物对大肠杆菌的生长曲线，其中系列1为空白对照，系列2为复配物，系列3为牡丹花提取物，系列4为花椒果提取物。

图2是本发明植物提取物对金黄色葡萄球菌的生长曲线。

图3是本发明植物提取物作用于菌悬液后的相对电导率。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：牡丹花提取物的制备方法：

取40g牡丹花干燥，研磨细粉于1000mL圆底烧瓶中，加入20倍体积的70％的乙醇为提取溶剂，使用配备冷流回流装置的电加热套，在60℃下，回流抽提2h，真空过滤收集滤液，重复2次。滤液在40℃下真空旋转蒸发浓缩，静置，取上清液冷冻干燥得牡丹花提取物冻干粉。

实施例2：花椒果提取物的制备方法：

取花椒果25kg，60℃烘干粉粹，用95％乙醇加热回流提取3次，每次2h，过滤后合并滤液，将滤液减压浓缩得浸膏600g，加水混悬后依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，减压浓缩，得正丁醇萃取物340g；将正丁醇萃取物用甲醇、乙醇、水混合溶解，过滤，挥发干燥成粘稠状液体，上样到已用蒸馏水洗脱好的大孔树脂上，富集活性成分，先用乙醇-水系统(0:100～15:85～30:70～50:50～75:25～95:0)进行梯度洗脱，再用水-甲醇系统(100:0～90:10～60:40～40:60～0:100)梯度洗脱，合并洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥即得。

实施例3：抑菌效果的测定(纸片扩散法)：

纸片扩散法的原理：将含有定量抑菌物质的纸片贴在已经接种测定菌的琼脂平板上，纸片中所含的抑菌物质便不断的向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。通过测定抑菌圈的直径大小，可以判断抑菌物质的强弱，抑菌圈的直径越大表示药物抑菌作用越强。

首先，根据试验菌所需营养物质配制相应的固体培养基，将融化并冷却到45—50℃的培养基倾入12—15mL于培养皿上，摇匀，冷凝，然后吸取1×10⁶CFU/mL的菌悬液(孢子悬液)100μL于相应的培养基上，然后涂布均匀备用。其次，滤纸片的制备：取直径6mm的滤纸片，160℃干热，灭菌0.5h，用无菌镊子将滤纸片贴于培养基表面，再从纸片中心缓慢滴加10μL 200mg/mL的植物提取液。在接种后15min内完成以上操作，每皿2—3张纸片(以抑菌圈明显，且无重叠为准)，重复3皿。再次，将培养皿倒置于生化培养箱中，细菌在37℃下孵育24h，酵母菌和霉菌在28℃下孵育48h，用游标卡尺十字交叉法量取抑菌圈直径。以相应溶剂作为空白，100mg/mL的尼泊金丙酯为阳性对照。测试其抑菌圈直径如表1(mm)。

表1不同植物提取物抑菌圈直径

从表1中可以看出，100mg/mL的尼泊金丙酯具有很强的抑菌活性，而且通过比较尼泊金丙酯和植物提取物的抑菌圈直径，虽然牡丹花提取物对细菌和酵母菌具有较强的抗菌作用，其抗菌范围较广，但植物提取物的抑菌效果与化学防腐剂相比较弱，且植物提取物不具有广谱的抗菌活性，这些不足也是限制植物提取物作为抑菌剂的重要因素。因此，为了进一步提高天然产物的抑菌活性，扩大抑菌谱，发明人尝试将两种植物提取物按照不同浓度进行复配。

实施例4：植物提取物复配后的抑菌圈直径

将植物提取物按不同浓度复配为200mg/mL，从纸片中心缓慢滴加10μL200mg/mL的植物提取液复配物。按实施例3中的纸片扩散法测试不同比例复配后测试其抑菌效果。结果如表2(mm)。

表2植物提取物不同浓度复配后抑菌能力

由表2中可以看出，总含量为200mg/mL的植物提取物，以20％-80％比例进行复配时，其抑菌活性与100mg/mL的尼泊金丙酯的抑菌活性相比(见表1)，基本相同。牡丹花提取物和花椒果提取物按不同比例复配后表现出不同的抑菌活性，当牡丹花提取物的浓度由33.3mg/mL增加到166.7mg/mL，也就是由17％增加到83％时，复配后植物提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色假丝酵母菌的抑制作用明显增强，但并不是随着牡丹花提取物的浓度增加抑制作用会一直增加，当百分比为44％：56％时(实际含量为88.9mg/mL，111.1mg/mL)时，对该三种菌的抑制作用基本稳定，牡丹花提取物的浓度继续增加反而会使其抑菌作用下降。当花椒果提取物的浓度增加时，其复配物对黑曲霉菌的抑制作用明显增加，当其含量大于40％时，其对黑曲霉的抑菌作用基本与尼泊金丙酯相同。综合上述实验结果，当牡丹花提取物含量为20％-50％，花椒果提取物含量为50％-80％时其复配效果较好。

实施例5：最小抑菌浓度(MIC)的测定

最小抑菌浓度采用常量肉汤稀释法。用无菌水将植物提取物溶解成1000mg/mL备用，在连续倍比稀释至一系列浓度100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781和0.391mg/mL。取对数生长期的菌悬液(孢子悬液)接种到培养基中(菌悬液浓度为1×10⁷CFU/mL)，分别加入0.1mL等量的不同质量浓度的抑菌物质，同时设置尼泊金丙酯为阳性对照，无菌水为空白对照。细菌在37℃的恒温水浴震荡器(120r/min)中孵育24h，酵母菌和霉菌在28℃下孵育48h，然后观察每支试管中是否有菌生长，以抑制菌体生长的最低浓度作为MIC。每个样品重复3次。以结果如表3(mg/mL)。

表3不同植物提取物与尼泊金丙酯的最小抑菌浓度

注：---表示未能在实验范围内检测到最小杀菌浓度

实施例6：生长抑制曲线

从实施例5中可以看出复配物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色假丝酵母菌和黑曲霉菌的最小抑菌浓度都有很大减小，实施例6重点探究不同的植物提取物对细菌生长周期的影响。取活化后的大肠杆菌/金黄色葡萄球菌菌种按2％(V/V)接种量接种于100mL营养肉汤培养基中，为了在不杀死细菌的情况下对细菌生长周期进行研究，其植物提取物的抑菌浓度选择MIC值的1/2为实验浓度，水空白对照组，于37℃、120r/min震荡培养，于不同时间取样测定光吸收值，绘制生长曲线。牡丹花提取物，花椒果提取物及复配物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的生长抑制曲线如图1、图2所示。其中系列1为空白对照，系列2为复配物，系列3为牡丹花提取物，系列4为花椒果提取物。

菌液的光密度值OD值，可以用来衡量菌液中细菌的多少，OD值越小说明植物提取物的抑菌作用越强。一般情况下，细菌的生长周期分为调整期、对数期、稳定期和衰亡期，从图1和图2可以看出，相对比空白对照单一植物提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有抑制作用，但复配物在调整期、对数期以及稳定期均比单一植物提取物的抑菌作用明显，这可能与多种植物提取物复配以后对菌体整个生长周期都有明显的抑制作用有关。

实施例7：细胞膜通透性分析，提取物对培养液导电率的影响

通过测定菌液中相对电导率的变化来表示牡丹花提取物，花椒果提取物及复配物对膜通透性的影响。菌种于NB培养基中37℃培养12h，4000r/min离心10min，弃上清液，用5％葡萄糖溶液洗至菌液的相对电导率与5％葡萄糖溶液的相对电导率相当，此菌液作为等渗菌。向5％葡萄糖溶液中分别加入1/2MIC的牡丹花提取物、花椒果提取物、复配物、尼泊金丙脂，混均，测其相对电导率记为L₁。37℃下培养3h，取出测定相对电导率，记为L₂。将悬于5％葡萄糖溶液的菌液沸水浴5min冷却后，测定相对电导率记为L₀。菌种膜通性的相对电导率根据如下公式计算：相对电导率(％)＝100×(L₂-L₁)/L₀，测定结果见图3。

1/2MIC浓度的植物提取物能使金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌悬液中的电导率有不同程度的升高，对菌体细胞膜的通透性的影响有所差异。花椒果提取物处理后金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌悬液的相对电导率分别升高58.14％和45.05％，相比于牡丹花提取物的作用更显著。而牡丹花提取物在细胞膜损伤较小的情况下仍具有明显的细菌抑制作用，这可能与其非膜作用机制有关。复配物处理后金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌悬液的电导率分别为升高88.02％和73.21％，明显高于单一的提取物，说明复配后的体系对细胞膜通透性增强。

实施例8：细胞膜完整性分析，提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌内容物的释放影响

菌体核酸、蛋白质等内溶物质的释放可表明牡丹花提取物、花椒果提取物、复配物、尼泊金丙脂对菌体膜完整性的影响，蛋白质的测定采用考马斯亮蓝法法，测定结果见表4。

表4不同抑菌剂对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌内容物的释放影响

细胞膜的完整性是菌体正常生长代谢的一个主要影响因素。核酸、蛋白质类的大分子物质贯穿于整个胞膜和胞质当中，是重要的单位结构物质，核酸、蛋白质的释放则表明细胞膜完整性遭到了破坏，本实验中，从此方面阐述提取物的抑菌机理。加入植物提取物后，菌悬液中蛋白质含量有不同程度的增加，其中，花椒果提取物比牡丹花提取物具有更好的蛋白质渗漏效果，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的蛋白质渗漏量分别为56.19μg/mL和32.78μg/mL。植物提取物复配体系比单一植物提取的作用效果更明显，其蛋白质渗漏量分别为90.56μg/mL和73.76μg/mL。但值得注意的是，在核酸渗漏实验中，而牡丹花提取物比花椒果提取物具有更强的核酸渗漏作用，这与实施例7结果相反，可能是因为牡丹花提取物能更好的裂解大分子核酸或者抑制核酸合成。复配物处理组的核酸渗漏量为0.57和0.72，与单一植物提取物相比，复配体系对细胞膜通透性要有所增强，这可能是因为不同植物提取物对细胞膜的瓦解存在协同作用。初步判定其机理可能为：花椒果提取物和牡丹花提取物均可以作用于细菌的细胞壁和细胞膜结构，让细胞膜失去选择透过性，甚至破坏细胞膜结构，让抑菌物质进入细胞内部，对遗传物质、酶以及蛋白质等亚结构发挥作用；由于细胞壁以及细胞膜的通路都遭到破坏，牡丹花提取物则很容易进入胞内，对遗传物质进行抑制和破坏。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种植物源复配抑菌剂，其特征在于，所述抑菌剂由牡丹花提取物和花椒果提取物按质量百分比复配而成，其中牡丹花提取物含量为20％-80％，花椒果提取物含量为20％-80％。

2.如权利要求1所述的植物源复配抑菌剂，其特征在于，所述抑菌剂由牡丹花提取物和花椒果提取物按质量百分比复配而成，其中牡丹花提取物含量为20％-50％，花椒果提取物含量为50％-80％。

3.如权利要求1所述的植物源复配抑菌剂，其特征在于，所述牡丹花提取物的制备方法为：将干燥的牡丹花粉碎，用乙醇加热回流提取，乙醇浓度为60％-90％，乙醇溶剂比为1:15-1:25，合并滤液，并于40-60℃浓缩，静置，取上清液冷冻干燥得牡丹花提取物冻干粉。

4.如权利要求1所述的植物源复配抑菌剂，其特征在于，所述花椒果提取物制备方法为：(a)将干燥的花椒果粉碎，用75～95％乙醇溶液热回流提取，合并滤液，浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液；(b)将步骤(a)所得乙醇提取浓缩液用水稀释，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取萃取，减压浓缩；(c)正丁醇萃取物用甲醇、乙醇、水混合物溶解，过滤，挥至粘稠，经大孔树脂柱层析，富集活性成分，先用乙醇水梯度洗脱，再用甲醇水梯度洗脱液洗脱，减压浓缩，喷雾干燥即得。

5.如权利要求4所述的植物源复配抑菌剂，其特征在于，乙醇-水梯度洗脱系统为0:100～15:85～30:70～50:50～75:25～95:0，水-甲醇梯度洗脱系统为100:0～90:10～60:40～40:60～0:100。

6.如权利要求1-5所述的植物源复配抑菌剂，其特征在于，所述植物源复配抑菌剂具有抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色假丝酵母菌、以及黑曲霉菌的作用。

7.如权利要求1-5所述的植物源复配抑菌剂，其特征在于，植物源复配抑菌剂在面膜、膏霜、乳液、香波、洗面奶、沐浴乳等化妆品防腐体系中的应用。