KR102582150B1 - 신규한 석류-산화아연 나노복합입자 및 이의 용도 - Google Patents

신규한 석류-산화아연 나노복합입자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 석류-산화아연 나노복합입자 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO Nanoparticles, PE-ZnO NPs)는 석류추출물 내 존재하는 폴리페놀 또는 플라보노이드와 산화아연(Zinc oxide, ZnO)이 결합된 신규한 산화아연의 나노복합체로서, 이는 석류추출물과 산화아연보다 인간피부세포에 독성이 없으며 항산화 기능성이 월등히 증가하고 자외선 차단효과 미생물의 생육을 억제하는 항균 효과를 갖는다.
따라서, 본 발명에 따른 신규한 석류-산화아연 나노복합입자는 생체이용이 가능한 식품의 방부제, 화장품의 보존제, 건강기능식품의 보조제, 화장품의 자외선 차단제, 두피건강 증진용 샴푸 등의 식품 또는 화장료 조성물에 널리 사용될 수 있다. 또한 작물이나 화훼용 농약에 포함하여 식물병을 유발하는 미생물 방제에 사용할 수 있다.

Description

신규한 석류-산화아연 나노복합입자 및 이의 용도{Novel Punica granatum Extracts-Zinc oxide Nanoparticles and its use}
본 발명은 신규한 석류-산화아연 나노복합입자 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO Nanoparticles, PE-ZnO NPs)는 석류추출물 내 존재하는 폴리페놀 또는 플라보노이드와 산화아연(Zinc oxide, ZnO)이 결합된 신규한 산화아연의 나노복합체로서, 이는 석류추출물과 산화아연보다 인간피부세포에 독성이 없으며 항산화 기능성이 월등히 증가하고 자외선 차단효과 미생물의 생육을 억제하는 항균 효과를 갖는다.
따라서, 본 발명에 따른 신규한 석류-산화아연 나노복합입자는 생체이용이 가능한 식품의 방부제, 화장품의 보존제, 건강기능식품의 보조제, 화장품의 자외선 차단제, 두피건강 증진용 샴푸 등의 식품 또는 화장료 조성물에 널리 사용될 수 있다. 또한 작물이나 화훼용 농약에 포함하여 세균방제을 유발하는 미생물 방제에 사용할 수 있다.
석류(Punica granatum L.)는 갱년기장애 예방 및 건강 증진용 기능성식품으로 많이 음용되고 있다. 그러나 석류 열매로서 종자와 과피를 포함한 소재를 활용한 기능성 화장품 등 생리활성 신소재에 관한 연구는 다소 미흡한 상태이다. 석류열매와 과피 내 폴리페놀, 플라보노이드 및 프로안토시아니딘이 들어 있으며 매우 높은 항산화 기능이 매우 높다. 따라서 석류를 사용한 천연 바이오소재의 발명은 그 용도가 건강기능이 증진과 산업용으로 유익할 것이다. 석류의 일반명은‘pomogranate’이며 이란·아프가니스탄이 원산지이고 한국에는 약 500년 전에 도입되었다. 종자에는 비타민 C, 비타민 K, 엽산 등이 매우 풍부하여 폴리페놀과 엘라지탄닌(ellagitannins), 안토시아닌(anthocyanins)류로서 델피니딘(delphinidin), 시아니딘(cyanidin), 및 펠라르고니딘(pelargonidin) 등이 풍부하여 전 세계에서 건강기능식품으로 소비되고 있다. 또한 석류는 항암기능이 있으며 또한 전립선암에 대체요법으로 사용되었다.
특히, 석류 과피(pericarp)는 떫어서 먹지 않고 폐기하는 부위이다. 종자보다 폴리페놀(polyphenols), 탄닌(tannins), 아테킨(atechins), 갈로카테킨(gallocatechins), 프로델피니딘(prodelphinidins)이 많이 함유되어 있다. 특히 석류과피의 폴리페놀의 기본 물질은 갈릭산(gallic acid)으로 불리는 트리하이드록시벤조익산(3,4,5-trihydroxybenzoic acid)이다. 이러한 EGCG, 케르세틴(quercetin), 시프로플록사신(ciprofloxacin) 벤조익산은 대장균(Escherichia coli), 폐렴막대균(Klebsiella pneumoniae) 및 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에 대한 항균작용이 있다. 석류 과피의 폴리페놀 물질은 갈릭산(gallic acid) 복합체인 갈로탄닌(gallo tannins)이 주요성분이며 약 25 ~ 28% 정도 존재한다. 이러한 갈로탄닌은 엘라지탄닌(ellagitannins)류로서 푸니칼린(granatine D), 푸니칼라긴(granatine C), 그라나틴 A(granatine A)와 그라나틴 B(granatine B) 물질들로 조성되어 있다. 특히 푸니칼라긴은 탄산 탈수 효소 억제제(carbonic anhydrase inhibitor)로 알려져 있다. 그리고 아토피 유사 피부염에 치료효과가 있으며 녹내장의 치료제로 사용되고 있다.
한약재 석류피(石榴皮)는 석류나무의 껍질로서 구충, 지혈, 지사에 처방을 한다. 또한 한약재 석류피는 대장균(Escherichia coli), 페렴간균(Klebsiella pneumoniae) 등에 항균작용이 있다고 알려져 있다. 석류나무 껍질에는 피페리딘(piperidin)이 약 0.4 ~ 0.8% 정도 함유되어 있다. 약효 성분은 이소펠티에린(isopelletierine), N-메틸이소펠티에린(N-methylisopelletierine)과 유사펠레티에린(pseudopelletierine)로서 신경독성이 있으며 촌충을 포함한 구충제로 사용된다.
한편, 나노입자(nanoparticles)는 약 100 nm 정도의 크기로서 천만분의 1 미터 이하인 입자를 말한다. 이러한 나노입자는 외형치수가 적어도 1개 이상이 나노 크기(1 - 100 nm)인 입자로서 고분자계, 탄소계, 금속 및 산화금속계, 및 기타 무기물 4가지로 분류되고 있다. 나노입자는 대부분 크기가 작아 일반적으로 세포막을 통과할 수 있으며 생물학적 적용이 가능하다. 또한 생체적용 나노입자는 혈액-뇌 장벽, 개별 세포 및 핵으로 이동이 가능하다. 산화금속계의 산화아연(Zinc Oxide, ZnO) 나노입자의 구조는 표면적의 확장, 생체적합성, 전자이동이 매우 우수하여 화학센서, 가스센서, 자외선센서, pH센서, 그리고 암치료와 질병의 진단에 사용하는 바이오센서 등에 응용되고 있다. 특히 약물 전달에는 이방성 나노입자 사용이 가능하다. 또한 산화아연 나노입자의 물리적 특성과 표면 선택성 때문에 산화아연은 바이오센서 용도로 사용되고 있다. 산화아연 나노 바이오센서는 암의 초기 단계를 진단하는 바이오 이미징에 사용하고 있다. 산화아연 나노입자는 자외선 차단 물질로 사용되기도 하며 또한 유해 세균을 죽이는 항균 기능이 있다. 이러한 산화아연 나노입자는 유기물 또는 생체유래 물질과 결합시켜 고유의 물리적 성질이 변형된 물질에 응용할 수 있다.
산화아연은 자외선 차단의 효과가 있다. 그러므로 자외선 차단용 크림으로 사용되고 있다. 산업용으로 산화아연 나노입자는 화장품의 크림과 자외선 차단용 선크림 등 화장품에 사용하고 있다. 현재 산화아연 나노입자는 자외선 차단물질과 씻어 내는 용도의 화장품에 사용이 되고 있다. 그러므로 산화아연 나노입자는 고기능성 나노 화장품의 제조에 활용성이 매우 높다. 나노 화장품이란 100 nm 정도의 나노바이오 입자 또는 구조체가 원료를 사용한 제형의 화장품이다. 최근 리포좀 또는 무기이온입자 등의 나노바이오 입자에 생리활성물질을 포집하여 약물전달 기술이 사용되고 있다. 그러므로 치료용 의약품이나 생리활성 물질을 나노 바이오 화장품에 함유시켜 효과적으로 피부장벽을 통과시켜 피부 재생 및 기능을 향상시킬 수 있다. 또한 나노물질은 미세먼지, 자외선, 적외선과 외부의 유해 광선이나 화학물질을 차단하여 피부 건강증진 효능을 높이는 고부가 가치 화장품 개발에 활용되고 있다.
식품과 화장품은 영양분이 풍부하므로 병원균 등의 미생물이 자라는 좋은 조간이 된다. 그러므로 대부분 방부제의 사용이 필수적이다. 폴리헥사메틸렌 구아니딘(Polyhexamethylene guanidine, PHMG), 메칠클로로이소치아졸리논(Methylchloroisothiazolinone, CMIT), 및 메칠이소티아졸리논(methyisothiazolinone, MIT)은 살균력이 매우 좋으나 인체의 부적용으로 식품과 화장품 등에는 그 사용이 제한적이다. 또한 국내외의 식품과 화장품에 사용되는 방부제의 원료와 한도는 제도적으로 엄격히 지정되어 관리하고 있다. 화학 방부제의 사용한계를 극복하기 하고 인체에 안전성이 확인된 천연 방부제가 개발되어 사용되고 있다. 천연방부제는 항산화 및 항균 효과가 있는 식물의 추출물을 주로 사용하고 있으나 그 효과는 약하다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 석류추출물과 산화아연을 이용하여 항산화, 항균 또는 자외선 차단용 효과를 나타내어 식품 및 화장품 분야에 널리 사용할 수 있는 신규한 나노복합입자를 개발하고자 하였다.
대한민국특허 제10-1024525호(2011.03.17. 등록)
본 발명자들은 석류추출물에서 얻은 폴리페놀 또는 플라보노이드가 융합된 석류-산화아연 나노복합입자(Punica granatum Extracts-Zinc oxide Nanoparticles, PE-ZnO Nanoparticles, PE-ZnO NPs)의 경우 평균직경이 100 nm 정도로서 인간피부세포에 독성이 없으며 항산화 기능성이 월등히 증가하고 우수한 자외선 차단효과와 미생물의 생육을 억제하는 항균 효과를 갖음을 확인하였다. 상세하게 본 발명자들은 석류가 갖고 있는 폴리페놀과 안토시아닌 등의 생리활성 기능성을 활용하기 위해 석류를 에탄올 용매로 추출하고, 이를 산화아연 나노입자와 융합시켰으며, 이렇게 수득한 나노복합입자는 석류추출물의 생리활성 기능성과 산화아연 나노입자의 물리적 기능성이 동시에 부여되어 생체에 사용될 수 있는 신규한 바이오 소재이다.
따라서, 본 발명의 목적은 (a) 석류추출물 내 폴리페놀 또는 플라보노이드; 및 (b) 산화아연이 결합된 석류-산화아연 나노복합입자를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 (ⅰ) 석류의 열매, 종자, 과피, 잎, 목피, 및 근피로 이루어진 군으로부터 선택된 부위를 물 또는 C1 내지 C4 알코올 용액 또는 이의 혼합물로 추출하여 석류추출물을 수득하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 석류추출물을 수소화붕소나트륨 촉매 하에서 산화아연과 혼합하고 반응하여 석류-산화아연 나노복합입자를 제조하는 단계를 포함하는 석류-산화아연 나노복합입자의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 석류-산화아연 나노복합입자를 포함하는 항산화, 항균 또는 자외선 차단용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 석류-산화아연 나노복합입자를 포함하는 항산화, 항균 또는 자외선 차단용 건강식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 석류-산화아연 나노복합입자를 포함하는 식품 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 또 다른 목적은 석류-산화아연 나노복합입자를 포함하는 식물용 미생물 방제제를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 석류추출물 내 폴리페놀 또는 플라보노이드; 및 (b) 산화아연이 결합된 석류-산화아연 나노복합입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 (ⅰ) 석류의 열매, 종자, 과피, 잎, 목피, 및 근피로 이루어진 군으로부터 선택된 부위를 물 또는 C1 내지 C4 알코올 용액 또는 이의 혼합물로 추출하여 석류추출물을 수득하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 석류추출물을 수소화붕소나트륨 촉매 하에서 산화아연과 혼합하고 반응하여 석류-산화아연 나노복합입자를 제조하는 단계를 포함하는 석류-산화아연 나노복합입자의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 석류-산화아연 나노복합입자를 포함하는 항산화, 항균 또는 자외선 차단용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 석류-산화아연 나노복합입자를 포함하는 항산화 또는 항균용 건강식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 석류-산화아연 나노복합입자를 포함하는 식품 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 석류-산화아연 나노복합입자를 포함하는 식물용 미생물 방제제를 제공한다.
본 발명에 따른 신규한 석류-산화아연 나노복합입자는 석류추출물과 산화아연보다 인간피부세포에 독성이 없으며 항산화 기능성이 월등히 증가하고 우수한 자외선 차단효과와 미생물의 생육을 억제하는 항균 효과를 갖는다.
따라서, 본 발명에 따른 신규한 석류-산화아연 나노복합입자는 생체이용이 가능한 식품의 방부제, 화장품의 보존제, 건강기능식품의 보조제, 화장품의 자외선 차단제, 두피건강 증진용 샴푸 등의 식품 또는 화장품 조성물에 널리 사용될 수 있다. 또한 작물이나 화훼용 농약에 포함하여 세균방제에 사용할 수 있다.
도 1은 (A) 석류추출물의 폴리페놀 물질인 푸니칼린(punicalin)을 포함한 엘라지탄닌들과 산화아연이 나노입자로 응축되어 둥근 구형의 석류-산화아연 나노입자(PE-ZnO NPs)가 형성되는 모식도를 나타낸 것이고, (B) 주사전자현미경(SEM)을 통해 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)의 형태를 촬영한 사진이며, (C) 석류추출물(PE), 산화아연 나노입자(ZnO NPs), 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)의 UV 흡수스펙트럼의 변화를 측정한 결과이다.
도 2는 석류추출물(PE), 산화아연나노입자(ZnO NPs), 및 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)의 DPPH 자유라디칼의 소거 능력을 통해 항산화 능력을 측정한 결과이다. 아스코르빅산(AA)를 대조물질로 사용하였고 결과는 평균 ± SD로 나타냈다. * p <0.05, #p <0.005 (아스코르브산(AA)과 비교)
도 3은 석류추출물(PE), 산화아연 나노입자(ZnO NPs), 및 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)의 ABTS를 사용한 자유라디칼의 소거 능력을 확인한 결과이다. 아스코르빅산(AA)을 대조물질로 사용하였고 결과는 평균 ± SD로 나타냈다. * p <0.05, #p <0.005 (아스코르브산(AA)과 비교)
도 4는 석류추출물(PE), 산화아연 나노입자(ZnO NPs), 및 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)의 UV 흡수파장을 비교 조사한 결과이다.
도 5는 산화아연 나노입자(ZnO NPs)와 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)를 주사전자현미경(SEM)을 통해 측정한 사진이다.
도 6은 발명의 실시에서 제조한 물질들의 적외선 흡수 스펙트럼(FT-IR spectra)분석의 결과이다. (a) 석류추출물(PE), (b) 산화아연 나노입자(ZnO NPs) 및 (c) 석류-아연 나노복합입자(PE-ZnNP)의 적외선 흡수 스펙트럼이다.
도 7은 석류추출물(PE), 산화아연 나노입자(ZnO NPs), 및 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)의 인간 피부상피 각질세포(HaCaT)의 세포증식 정도를 측정한 그래프이다.
도 8은 (A) 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)의 항균 효과를 확인한 결과이고, (B) 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)의 집락형성단위(CFU/mL) 그래프이다.
도 9는 (A) 바실러스 리체니포르미스(Bacillus lichenformis)에 대한 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)의 항균 효과를 확인한 결과이고, (B) 바실러스 리체니포르미스(Bacillus lichenformis)에 대한 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)의 집락형성단위(CFU/mL) 그래프이다.
도 10은 (A) 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)의 UVA 분당 흡수량(J/m2)을 나타낸 것이고, (B) 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)의 UVA 차단정도(%)를 나타낸 그래프이다.
본 발명자들은 석류가 갖고 있는 폴리페놀 또는 플라보노이드의 생리활성 기능성을 활용하기 위하여 석류를 에탄올 용매로 추출하고, 산화아연 나노입자와 석류추출물 내 폴리페놀 또는 플라보이드가 결합한 신규한 석류-산화아연 나노복합입자를 제조하였고, 이의 항산화 효과, 항균 효과, 자외선 차단효과를 실험적으로 확인하였다.
따라서, 본 발명은 (a) 석류추출물(Punica granatum Extracts, PE) 내 폴리페놀 또는 플라보노이드; 및 (b) 산화아연(Zinc Oxide, ZnO)이 결합된 석류-산화아연 나노복합입자(Punica granatum Extracts-Zinc oxide Nanoparticles, PE-ZnO NPs)를 제공한다. 본 발명에서, 상기 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)는‘석류추출물-산화아연 나노복합입자’라고 명명할 수도 있다.
상기 폴리페놀 또는 플라보노이드는 엘라지탄닌(Ellagitannin), 푸니칼린(punicalin), 페둔쿨라진(pedunculagin), 푸니칼라진(punicalagin), 시아니딘-3-O-글루코시드(Cyanidin-3-O-glucoside), 펠라고니딘-3-O-글루코시드(Pelargonidin-3-O-glucoside), 및 델피니딘-3-O-글루코시드(Delphindin-3-O-glucoside)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종일 수 있다. 바람직하게는 엘라지탄닌(Ellagitannin) 일 수 있다.
상기 석류-산화아연 나노복합입자는 평균직경이 10 내지 200 nm인 구형입자일 수 있다, 바람직하게는 50 내지 150 nm이며, 더욱 바람직하게는 100 nm이다.
상기 석류추출물은 열매, 종자, 과피, 잎, 목피, 및 근피로 이루어진 군으로부터 선택된 부위를 물 또는 C1 내지 C4 알코올 용액 또는 이의 혼합물을 사용하여 추출한 추출물, 또는 이의 발효물일 수 있으나, 반드시 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 (ⅰ) 석류의 열매, 종자, 과피, 잎, 목피, 및 근피로 이루어진 군으로부터 선택된 부위를 물 또는 C1 내지 C4 알코올 용액 또는 이의 혼합물로 추출하여 석류추출물(Punica granatum Extracts, PE)을 수득하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 석류추출물을 수소화붕소나트륨 촉매 하에서 산화아연(Zinc Oxide, ZnO)과 혼합하고 반응하여 석류-산화아연 나노복합입자(Punica granatum Extracts-Zinc oxide Nanoparticles, PE-ZnO NPs)를 제조하는 단계를 포함하는 석류-산화아연 나노복합입자의 제조방법을 제공한다.
상기 (ⅰ) 단계는 석류의 열매, 종자, 과피, 잎, 목피, 및 근피로 이루어진 군으로부터 선택된 부위를 물 또는 C1 내지 C4 알코올 용매 또는 이의 혼합물일 수 있다. 상세하게 메탄올 또는 에탄올일 수 있다.
상기 (ⅱ) 단계는 상기 (ⅰ) 단계에서 수득한 석류추출물을 수소화붕소나트륨 촉매 하에서 산화아연과 혼합하고 반응하여 석류-산화아연 나노복합입자로 제조하는 단계이다. 이렇게 제조된 석류-산화아연 나노복합입자는 평균직경이 10 내지 200 nm인 구형 입자일 수 있다, 바람직하게는 50 내지 150 nm이며, 더욱 바람직하게는 100 nm이다.
또한, 본 발명은 상기 석류-산화아연 나노복합입자를 포함하는 항산화, 항균 또는 자외선 차단용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 화장료 조성물은, 화장수, 크림, 자외선차단제, 에센스, 팩, 샴푸, 크린징, 손소독제, 에어로졸 또는 패치로서 구성되는 제형으로 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 석류-산화아연 나노복합입자 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 조성물은 비타민, 아미노산, 단백질, 계면활성제, 유화제, 안정제, 증점제, 방부제, 보습제, 항산화제, 향료, 색소, 안정화제 및 방부제로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합할 수도 있다.
또한, 본 발명은 상기 석류-산화아연 나노복합입자를 포함하는 항산화 또는 항균용 건강식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 건강식품 조성물이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.
본 발명에 따른 건강식품 조성물로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 나아가 본 발명은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분들은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강식품 조성물에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
상기 건강식품 조성물은 분말, 타블렛, 액상 또는 젤리로서 구성되는 제형으로 이용될 수 있다. 또한, 작물보호를 위하여 세균 등 식물 병균에 대한 방제용 농약에 포함 할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 석류-산화아연 나노복합입자를 포함하는 식품 보존제를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 석류-산화아연 나노복합입자를 포함하는 식물용 미생물 방제제를 제공할 수 있다. 석류-산화아연 나노복합입자를 식물체에 살포함으로써 병을 방제할 수 있다.
이하 하나 이상의 구체 예를 실시 예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시 예는 하나 이상의 구체적 예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
실험예 1: 석류의 에탄올 추출물
석류 열매의 과피(pericarp) 무게의 2 배량의 70% 주정 에탄올을 첨가한 후 24 시간 이상 실온에서 에탄올 추출 후 원심분리기를 사용하여 8,000 x g로 15 분 동안 원심분리 후 석류추출물을 회수하였다. 석류 에탄올 추출물을 감압농축하여 석류에탄올 조 추출물을 회수 후 건조하여 실험에 사용하였다.
실험예 2: 총 폴리페놀 함량 측정
총 페놀의 함량 측정은 Folin-Ciocalteu 방법(Khaleghnezhad et al. 2019)을 변형하여 측정하였다. 시료 1 g을 정제수 10 ml에 용해시킨 후, 240 g에서 10 분 동안 1차 원심분리하였다. 상층액을 Advantech No. 2 filter paper(Toyo Roshi, Tokyo, Japan)를 이용하여 필터한 후 18,510 g에서 10 분 동안 2차 원심분리하여 상층액을 사용하였다. 추출 시료 용액 200 μL, 정제수 670 μL, 2% sodium carbonate(Na2CO3)(Daejung Co., Siheung, Korea) 600 μL와 50% Folin-Ciocalteu(Sigma Aldrich CO., USA) 30 μL을 혼합하였다. 상온에서 30 분 동안 정치하여, UV/VIS 분광광도계(Optizen 2120UV, Mecasys, Daejeon, Korea)를 이용하여 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질은 갈릭산(Sigma Aldrich CO., St. Louis, USA)을 사용하여 검량선(y = 0.0003x + 0.1094, R2 = 0.9989)을 작성하였으며, 함량은 갈릭산 당량(gallic acid equivalents, mg GAE/g extract)로 나타내었다.
실험예 3: 총 플라보노이드 함량 측정
총 플라보노이드(flavonoid)의 함량 측정은 Folin-Ciocalteu 방법(Khaleghnezhad et al. 2019)을 변형하여 측정하였다. 시료 각 1 g을 정제수 10 ml에 용해시킨 후, 240 g에서 10 분 동안 1차 원심분리하였다. 상층액을 Advantech No. 2 filter paper(Toyo Roshi, Tokyo, Japan)를 이용하여 필터한 후 18,510 g에서 10 분 동안 2차 원심분리하여 상층액을 사용하였다. 추출 시료 용액 200 μL, 정제수 790 μL, 10% 염화알루미늄6수화물(aluminum chloride hexahydrate, AlCl3)(Daejung Co., Siheung, Korea) 30 μL, 1M 아세트산칼륨(potassium acetate, CH3COOK)(Daejung Co., Siheung, Korea)와 95% 에탄올 450 μL을 혼합하였다. 상온에서 40 분 동안 정치하여, UV/VIS 분광광도계(Optizen 2120UV, Mecasys, Daejeon, Korea)를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질은 케르세틴(quercetin) (Sigma Aldrich CO., St. Louis, USA)을 사용하여 검량선(y = 0.0024x + 0.0055, R2 = 0.9976)을 작성하였으며, 함량은 케르세틴 등가물(quercetin equivalents, mg QE/g extract)로 나타냈다.
실험예 4: DPPH 라디칼 소거활성 측정
1,1-디페닐-2-피크릴히드라질(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) 라디칼 소거활성 측정은 기존에 알려진 방법을 이용하여 측정하였다. 상세하게, 각 농도별로 희석된 시료 200 μL에 에탄올로 용해시킨 0.2 mM DPPH(Sigma Aldrich, USA) 용액 100 μL를 혼합하여 실온에서 30 분 동안 반응시킨 후 ELISA 리더기(Infinite™ F200, TECAN, Switzerland)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구로서 DPPH 대신 에탄올을 처리하였다. 또한 양성 대조구는 아스코르브산(ascorbic acid)을 사용하였다. DPPH 라디칼 소거 활성은 다음의 수학식 1에 따라 계산하였다.
[수학식 1]
실험예 5: ABTS·+ 라디칼 소거활성 측정
ABTS(2,2’-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) 라디칼 소거활성 측정은 기존에 알려진 방법을 이용하여 측정하였다. 상세하게, ABTS(Sigma Aldrich, USA)를 7 mM 농도로 증류수에 용해한 다음 2.45 mM 과 황산칼륨(potassium persulfate)을 가하여 1:1의 비율로 혼합하여 실온인 암실에서 18 시간 동안 반응시킨 후 ABTS 라디칼을 형성시킨 후 사용하였다. 라디칼이 형성된 ABTS 용액을 에탄올로 희석하여 734 nm에서 측정한 흡광도가 0.706 ± 0.002가 되도록 조정하였다. 소거능은 ABTS 용액 150 μL과 시료 150 μL를 혼합하여 6 분 동안 반응 후 ELISA 리더기(Infinite™ F200, TECAN, Switzerland)를 이용하여 734 nm에서 각 농도별 시료와 혼합하여 사용하였다. 또한 양성 대조구로서 아스코르브산(ascorbic acid)을 사용하였다. ABTS 소거활성은 다음의 수학식 2에 따라 계산하였다.
[수학식 2]
실험예 6: 나노입자의 제조
최근 몇 년 동안 나노입자는 기존 치료법에 대한 생물학적 호환성 때문에 건강과 의학에서 많은 연구가 진행되고 있다. 산화아연은 항산화 기능성을 포함한 다양한 분야에서 활용할 수 있는 유망한 나노입자 중 한 종류이다. 또한 석류의 생물 활성 화합물은 뛰어난 약리학적 특성과 건강상 유익한 효과가 있으므로 생리활성 기능성물질도 사용될 수 있다. 70% 에탄올을 이용하여 추출한 석류추출물(Pomegranate Extracts, PE)을 사용하여 생리활성 기능성을 조사하였다. 나노입자의 제조는 석류추출물을 산화아연 나노입자(ZnO NPs)와 수소화 붕소 나트륨(NaBH4)를 촉매 하에서 반응하여 석류-산화아연 나노복합입자(ZnO NPs)를 제조하였다. 이렇게 합성 나노복합입자를 5000 rpm에서 원심분리로 침전시킨 후 상층액을 제거하였다. 이후 수세과정으로서 나노입자에 탈이온 멸균수를 충분한 양을 부가하고 5000 rpm에서 원심 분리하여 나노입자를 침전시킨 후 상층액을 제거하였다. 이러한 수세를 3회 반복한 나노입자는 실온에 건조하여 실험에 사용하였다. 나노입자의 물리적 특성 및 크기의 확인은 UV-Vis 분광광도계, 적외선 분광기(FT-IR), 및 스캐닝 전자 현미경(SEM)을 사용하였다.
실험예 7: 세포배양
인간세포(HaCaT, keratinocytes)(ATCC, USA) 세포를 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)(HyClone, USA) 배지에 10% 태아소혈청(fetal bovine serum, FBS)(HyClone, USA)과 페니실린(100 units/mL)/스트렙토마이신(100 μg/mL)(HyClone, USA)을 첨가하여 CO2 세포배양기(NU-4750G, NuAire, USA)에서 5% CO2 공급 하에서 배양하였으며, 2 ~ 3일 간격으로 계대 배양을 시행하였다.
실험예 8: 세포독성 및 증식 시험
세포독성 및 증식을 측정하기 위해 배양된 인간세포(HaCaT)를 96 웰 플레이트에 1 × 104 cell/well로 균일하게 분주한 다음 24 시간 후 각 추출물을 10, 100, 250, 500, 1000 μg/mL 농도로 처리하여 48 시간 동안 배양하였다. 농도별 처리에 의한 세포의 증식에 미치는 효과는 Cell Titer 96ⓡAQueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit (Promega, USA)를 사용하였다. 배양 후 배지를 모두 제거하고 DMEM 배지 100 μL와 MTS 용액(3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2 -(4-sulfophenyl)- 2H-tetrazolium inner salt) 20 μL를 첨가하여 5% CO2, 37℃ 암상태 조건에서 3 시간 동안 반응시킨 후 ELISA 리더기(Infinite™ F200, TECAN, Switzerland)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 처리하지 않은 배양액을 대조군으로 사용하였다. 세포생존율은 다음의 수학식 3에 따라 계산하였다.
[수학식 3]
실험예 9: 항균성 조사
나노입자의 항균 시험에 사용한 균은 KCC 바실러스 리헨니포르미스(Bacillus licheniformis ATCC 1458)와 바실러스 세레우스(Bacillus cereus ATCC 14579)를 ATCC로부터 구입하여 사용하였다. 시험균의 배양은 LB 액체배지에 10-4 수의 세포를 준비하고 각각의 물질을 투여한 후 32℃에서 12 시간 진탕 배양하였다. 배양 세포를 10-5, 10-6, 10-7 으로 희석하여 LB 고체배지에 도말한 후 32℃에서 12 시간 동안 배양하였다. 각각 처리구에 형성된 코로니(colony)의 수를 계산하여 CFU/mL를 결정하였다.
실험예 10: 지외선 차단측정
제공하는 시료를 정제수에 1 mg/mL의 농도로 희석한 후 UVA 366 nm 파장의 UVA 물질을 조사한 후 그 투과량을 HD102.2 UV 광량측정기기(DELTA OHM, ITALY)로 측정하였다.
실험예 11: 자료 분석 및 통계처리
실시예의 결과처리에 필요시 통계처리는 평균 ± 표준 오류(Mean ± Standard error)로 표기하였고, 실험 자료의 통계 분석은 대조군에 대한 실험군의 유의성을 Student’s t-test로 하였으며 p-value가 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다.
실시예 1: 석류 과피 추출물의 총 폴리페놀 함량(Total Polyphenolic contents) 측정
석류의 항산화 활성을 나타내는 화합물은 주로 엘라지탄닌류의 폴리페놀 물질이며, 천연 항산화제로 잘 알려져 있다. 석류 과피의 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 양을 갈릭산의 양으로 환산하여 정량한 결과 363.04±0.10mg GAE/g 함량을 나타냈다. 그러므로 많은 양의 갈릭산(Gallic acid)으로 조성이 되어 있는 석류추출물(PE) 원료를 준비하였다.
[표 1] 석류추출물의 총 폴리페놀 함량
실시예 2: 석류 과피 추출물의 총 프라보노이드 함량(Total Flavonoid contents) 측정
플라보노이드는 화학적인 구조에 따라 크게 플라보놀(flavonol), 플라본(flavone), 플라바놀(flavanol), 플라바논(flavanone), 이소플라본(isoflavone), 안토시아니딘(anthocyanidin)으로 분류된다. 그 중에서 플라보노이드는 항염증작용, 항균작용, 항암작용, 항진균 바이러스작용, 혈관계 조절작용 등 다양한 생리활성이 연구된 바 있다. 시료에 함유된 플라보노이드양을 케르세틴(Quercetin) 양으로 환산하여 정량한 결과 20.17±0.01 mg QE/g 함량 정도를 농축하였음을 확인할 수 있었다.
[표 2] 석류 추출물의 총 플라보노이드 함량
실시예 3: DPPH 라디칼 소거활성 측정
생체 내에서 산화스트레스로 인해 생성되는 자유라디칼은 세포손상을 발생시키며 그에 따른 노화와 질병을 유발시킨다. 자유라디칼 화합물로서 DPPH는 자유라디칼 소거능 측정에 이용된다. 아민류인 토코페롤(tocopherol), 방향족 화합물, 아스코르브산(ascorbic acid) 등의 환원능을 이용하여 항산화능 측정에 사용된다. 연구시료를 이용하여 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과는 다음과 같다.
DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과, 석류추출물(PE), 석류-산화아연 나노복합입자(ZnO-PE NPs)는 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거활성 증가하는 것이 보였다. 반면에 산화아연 나노입자(ZnO NPs)의 경우 DPPH 자유라디칼 소거능이 10% 이하로 미미하게 나타났다. 각 시료의 가장 높은 농도인 1,000 μg/mL에서 석류추출물(PE)은 95.1%, 산화아연 나노입자(ZnO NPs) 4.7%, 석류-산화아연 나노복합입자(ZnO-PE NPs) 95.2%의 결과를 나타냈다(도 2).
실시예 4: ABTS·+ 라디칼 소거활성 측정
본 발명에서는 ABTS를 이용하여 라디칼 소거 활성을 측정하였다(도 3). ABTS 라디칼 소거활성측정 방법은 DPPH 방법보다 더 민감하게 항산화 능력을 확인하는 방법이다. ABTS 라디칼 소거활성을 측정한 결과 석류추출물(PE)은 모든 농도에서 대조군인 아스코르브산(ascorbic acid)과 동일한 정도의 높은 라디칼 제거능을 보였다. 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)의 경우 50 μg/mL에서 101.1%를 나타냈고 100 μg/mL 이상의 농도에서는 대조군인 아스코르브산(ascorbic acid) 보다 더욱 높은 항산화능을 나타냈다. 가장 높은 농도인 1,000 μg/mL에서는 116.5%의 농도를 나타냈다. 그러나 산화아연 나노입자는 모든 농도에서 항산화능이 50% 이하였다. 그러므로 산화아연 나노입자는 항산화 기능성은 매우 낮은 것으로 판명되었다(도 3).
실시예 5: 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)의 제조
나노입자(Nanoparticles)는 약 100nm 정도의 크기로서 천만분의 1 미터 이하인 입자를 말한다. 본 발명에서는 산화아연을 나노입자로 제조한 것(ZnO NPs)과 석류추출물(PE) 내 폴리페놀이 융합된 석류-산화아연 나노복합입자(Punica granatum Extracts-Zinc oxide Nanoparticles, PE-ZnO NPs)를 개발하였다(도 1 및 도 5).
본 발명에서 산화아연 나노입자(ZnO NPs)는 그 직경이 100 nm 미만으로 구성이 되었다. 이는 납작한 조각형태로 크기는 작아도 표면적이 넓어 촉매 활성이 높을 것으로 여겨진다. 본 발명에서는 석류추출물을 산화아연과 반응시켜 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)를 제조하였는데, 이렇게 제조한 나노복합입자의 크기는 약 100 nm 이하 이였다.
도 1A 및 도 1B를 통해, 석류추출물 내 폴리페놀성 화합물(polypehenolic compounds), 예를 들면 석류의 껍질에 풍부한 엘라지탄닌들(punicalin)과 산화아연이 응축되어 둥근 구형의 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)가 형성됨을 확인할 수 있다. 아울러, 도 1C를 통해, 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)는 석류추출물(PE)과 산화아연 나노입자(ZnO NPs)의 흡수스펙트럼과 달리 전파장의 UV를 흡수함을 확인할 수 있었다. 이와 같이 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)가 각각의 원료물질보다 UV 차단효과가 높은 것은 신규 물질은 UV를 흡수와 반사 및 산란의 기능을 동시에 획득하였기 때문일 것으로 추측된다.
아울러, 도 5의 SEM 사진 결과를 미루어 볼 때, 푸니칼린(punicalin)을 포함한 엘라지탄닌의 둥근 형태의 물리적 특성과 아연분자의 결합에 의하여 등근 구형의 나노입자가 형성되었다고 추론된다. 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)는 석류추출물(PE)와 산화아연 나노입자(ZnO NPs)의 물리적 특성을 조사한 결과와 UV흡수 파장에 차이가 있었다. 석류추출물(PE)은 UV 파장흡수는 각각 310 nm와 380 nm에서 높게 흡수를 하였으나 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)에서는 흡수점이 형성되지 않고 250 nm에서부터 480 nm에 이르기까지 전반적인 UV 파장 흡수형태를 보였다. 그러므로 본 발명에 따른 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)는 성공적으로 제조되었다고 판단할 수 있었다(도 4).
한편, 산화아연 나노입자(ZnO NPs)는 평균직경 10 nm와 평균길이 100 ~ 150 nm의 막대 형태로 조성이 되었으며 이들이 뭉친 경우 절편의 구조를 갖고 있다. 반면 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)는 평균직경 약 100 nm의 구형 입자로서 뭉쳐져 있다(도 5A 및 도 5B). 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)는 입방형의 작은 구조물질을 이루며 뭉쳐진 형태의 판상 플래이크(flake)를 형성하였다(도 5C 및 도 5D). 이는 석류추출물에 다량 함유 되어 있는 폴리페놀들과 산화아연이 나노입자로 전환되어 물리적 특성이 달라졌으며 또한 기능적 성질도 달라졌음을 예측할 수 있다. SEM 전자현미경으로 관찰한바와 같이, 본 발명에 따른 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)가 성공적으로 제조되었음을 확인할 수 있었다(도 5).
실시예 6: 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)의 구조분석
6-1. 나노입자의 FT-IR 스펙트럼 분석
본 발명에서 제조한 각각의 나노 입자들이 갖고 있는 기능성 화학기와 성분을 특정하기 위하여 적외선 스펙트럼(FT-IR)을 분석하였다(도 6). 그 결과 도 6에 도식된 바 석류추출물(PE, 산화아연 나노입자(ZnO NPs) 그리고 석류추출물과 아연이 결합된 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)의 적외선 FT-IR 스펙트럼은 각각 고유한 화학적 특성을 나타내었다. 각 스펙트럼의 영역 3600-3000 cm-1에서 나타난 파장흡수는 세가지 시료 모두 하이드록실(-OH) 그룹을 갖고 있기 때문이다. 특히, 유기화합물인 석류 추출물(PE)는 흡수파장(cm-1)은 3305(카르복실산 O-H 스트레칭), 2089(아로마틱 C-H 접힘), 1636(아로마틱 고리 진동), 1049(1차 알코올 C-O 스트레칭)에서 특징적인 적외선 파장대의 흡수하는 분자의 특성을 보였다. 금속성인 산화아연 나노입자(ZnO NPs)는 적외선 흡수스펙트럼(cm-1)은 파장 3424, 1733, 1552, 1502, 911 과 1280 에서 다수의 흡수대가 나타났다. 반면, 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)의 적외선 흡수스펙트럼(cm-1)은 3299, 2095, 1632, 1558, 1440, 1322, 1184, 1070, 584와 457 파장을 흡수하였다. 흥미롭게도, 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)의 적외선 스펙트럼은 석류(PE)의 특징적인 흡수파장 3299, 2095, 1632들이 존재하며 산화아연 나노입자(ZnO NPs)의 적외선 흡수파장과 근접한 1558, 1440, 1322, 1184, 1070, 584와 457 파장을 갖고 있다. 또한 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)는 석류추출물(PE)에는 존재하지 않는 585-450 cm-1의 자외선 흡수파장 영역을 갖고 있다. 적외선 흡수대 477 cm-1는 Zn-O의 산화아연 결합의 적외선 흡수파장이다. 그러므로 적외선 스펙트럼(FT-IR) 분석결과 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)는 산화아연 분자들과 석류추출물의 유기물 분자들로 형성된 신규한 물질임이 증명된다(도 6).
6-2. 나노입자의 구조해석
또한 투과전자현미경(SEM)에서 확인한 바 산화아연(ZnO) 나노입자는 막대형의 단위체가 뭉쳐진 판상(flack)의 형태를 나타낸다. 그러나 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)는 둥근 형태가 특징이다(도 5). 신규한 유기-금속 나노입자가 둥근 이유는 FT-IR의 분석 결과 다음과 같이 설명된다. 즉, 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)는 산화아연(ZnO) 나노입자를 중심으로 석류의 유기물 분자들이 결합하며 이들 단위체가 연속적으로 결합하여 사방으로 확장됨으로써 입방형의 나노입자가 형성되었다. 요약하면 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)는 신규한 물질이다.
실시예 7: 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)의 세포독성 및 증식률
인간 피부에서 유래한 인간세포(HaCaT, keratinocytes)에 세포독성 및 증식에 대한 영향을 조사하기 위해 세포 배양액에 다양한 농도의 시료를 첨가하여 24 시간 배양한 후 세포 독성 및 증식시험을 실시하고 그 결과를 나타냈다(도 7). 시료를 세포에 처리한 결과 석류추출물(PE)과 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)는 무처리 대조군과 유사하게 독성이 없었다. 각 시료의 가장 높은 처리 농도인 100 μg/mL세포 독성 및 증식률은 다음과 같다. 석류추출물(PE)은 91.3%, 산화아연 나노입자(ZnO NPs)는 27.2%, 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)는 96.3%를 나타냈다. 그리고 세포 독성이 없으며 증식률이 가장 높은 결과를 나타낸 시료는 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)이다. 그러므로 산화아연 나노입자(ZnO NPs)는 세포 증식을 방해하였으나, 이를 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)로 전환한 결과 산화아연 나노입자의 독성이 제거되었다(도 7).
실시예 8: 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)의 항균성
나노입자의 항균능력을 조사하기 위하여 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 집락형성단위(Colony-forming unit, CFU)를 측정한 항균조사를 수행하였다(표 3 및 도 8). CFU 측정 결과, 무처리 대조군은 24.5 X 105 CFU/mL가 증식하였다. 이에 비하여 석류추출물(PE) 0,01% 처리 시 3 X 105 CFU의 세균이 증식하였다. 석류추출물(PE) 0,1% 처리 시 0 CFU로서 세균은 증식하지 못하였다. 산화아연 나노입자(ZnO NPs) 0.01% 처리 시 1.5 X 105 CFU의 세균이 증식하였다. 산화아연 나노입자(ZnO NPs) 0.1% 처리 시 0 CFU로서 세균이 증식하지 않았다. 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs) 0.01% 처리 시 1.5 X 105 CFU의 세균이 증식하였다. 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs) 0.1% 처리 시 0 CFU로서 세균이 증식은 관찰되지 않았다. 그러므로 석류추출물(PE) 0,1%, 산화아연 나노입자(ZnO NPs) 0.1%, 그리고 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs) 0.1% 처리 시 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)는 증식하지 못했다. 이는 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)는 농도 0.1% 정도에서 항균작용이 있음을 보여준다(도 8).
[표 3] 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 군집형성과 미생물 증식 저해정도
아울러, 바실러스 리체니포르미스(Bacillus lichenformis) 항균 조사를 수행 한 결과, 무처리 대조군은 60 X 105 CFU (colony forming unite)가 증식하였다(표 4 및 도 9). 석류추출물(PE) 0,01% 처리 시 35 X 105 CFU의 세균이 증식하였다. 석류추출물(PE) 0,1% 처리 시 0 CFU로서 세균은 증식이 관찰되지 않았다. 산화아연 나노입자(ZnO NPs) 0.01%를 처리 시 1 X 105 CFU 세균이 증식하였으나 무처리 대조구에 비하면 현저히 세균의 증식을 억제하였다. 산화아연 나노입자(ZnO NPs) 0.1% 처리 시 0 CFU로서 세균이 증식하지 않았다. 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs) 0.01%와 0.1%를 처리 시 0 CFU로서 세균이 증식은 관찰되지 않았다. 그러므로 석류추출물(PE), 산화아연 나노입자(ZnO NPs), 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)는 농도 0.1%에서 바실러스 리체니포르미스(Bacillus lichenformis)를 효과적으로 사멸시켰다.
[표 4] 바실러스 리체니포르미스(Bacillus lichenformis)의 군집형성과 미생물 증식 저해정도
실시예 9: 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)의 UVA 차단효과
석류추출물(PE), 산화아연 나노입자(ZnO NPs), 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)와 대조구로서 정제수와 모과추출물(QE)의 자외선 차단 정도를 측정하였다(표 5, 표 6, 및 도 10). 각 시료는 정제수에 1 mg/mL의 농도로서 0.1% 용액으로 희석한 후 UVA 366 nm파장의 UVA 물질을 조사한 후 그 투과량을 HD102.2 UV광량측정기기(DELTA OHM, ITALY)로 측정하였다. 그 결과 용매인 물은 1분당 평균 593 J/m2의 UVA가 투과 되었으며 석류추출물은 570 J/m2의 UVA가 투과 되었다. 석류추출물(PE)은 360 J/m2 산화아연 나노입자(ZnO NPs)는 419 J/m2의 UVA가 투과되었다. 그러나 상대적으로 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)는 20.6 J/m2의 UVA가 투과되었다. 그러므로 석류추출물(PE)과 산화아연 나노입자(ZnO NPs)는 물과 모과추출물에 비하여 UVA를 흡수하거나 산란하였음을 시사한다. 그러나 이들 시료와 상대적으로 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)는 매우 효과적으로 UVA를 흡수 및 산란을 시켰으므로 UVA의 투과량이 낮아졌다. UVA 차단효과를 용매인 물에 비교하여 환산한 결과, 모과추출물은 평균 4.4% 정도의 UVA 차단정도가 있었으므로 UVA 차단효과가 거의 없다. 그러나 석류추출물(PE)과 산화아연 나노입자(ZnO NPs)는 물에 비하여 각각 39.5% 그리고 29.7%의 UVA 차단효과가 있었다. 특히 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)는 96.5% 정도의 UVA를 차단하였는바, UVA를 흡수 및 산란을 통하여 매우 효과적으로 UVA를 차단하였음을 확인할 수 있었다. 그러므로 본 발명에서는 매우 우수한 자외선 차단 효과가 있는 신규한 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs) 바이오소재를 개발한 것이다.
[표 5]
[표 6]
따라서, 본 발명에 따른 신규한 석류-산화아연 나노복합입자(PE-ZnO NPs)는 석류추출물과 산화아연보다 인간피부세포에 독성이 없으며 항산화 기능성이 월등히 증가하고 자외선 차단효과와 미생물의 생육을 억제하는 항균 효과를 갖음을 확인하였는바, 생체이용이 가능한 식품의 방부제, 화장품의 보존제, 건강기능식품의 보조제, 화장품의 자외선 차단제, 두피건강 증진용 샴푸 등의 식품 또는 화장품 분야, 식물용 미생물 방제제에 널리 사용될 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (11)

  1. (a) 에탄올 수용액으로 추출한 석류추출물 내 폴리페놀; 및 (b) 산화아연 나노입자;가 수소화붕소나트륨 촉매 하에서 반응하여 합성된 석류추출물 내 폴리페놀-산화아연 나노복합입자.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 폴리페놀은 엘라지탄닌(Ellagitannin)인 것을 특징으로 하는 석류추출물 내 폴리페놀-산화아연 나노복합입자.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 석류추출물 내 폴리페놀-산화아연 나노복합입자는 평균직경이 10 내지 200 nm의 구형 입자인 것을 특징으로 하는 석류추출물 내 폴리페놀-산화아연 나노복합입자.
  4. 삭제
  5. (ⅰ) 석류의 열매, 종자, 과피, 잎, 목피, 및 근피로 이루어진 군으로부터 선택된 부위를 에탄올 수용액으로 추출하여 석류추출물 내 폴리페놀을 수득하는 단계; 및
    (ⅱ) 상기 석류추출물 내 폴리페놀을 수소화붕소나트륨 촉매 하에서 산화아연 나노입자와 혼합하고 반응시켜 석류추출물 내 폴리페놀-산화아연 나노복합입자를 제조하는 단계;
    를 포함하는 석류추출물 내 폴리페놀-산화아연 나노복합입자의 제조방법.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중에서 선택된 어느 한 항의 석류추출물 내 폴리페놀-산화아연 나노복합입자를 포함하는 항산화, 항균 또는 자외선 차단용 화장료 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은, 화장수, 크림, 자외선차단제, 에센스, 팩, 샴푸, 크린징, 손소독제, 에어로졸 또는 패치로서 구성되는 제형으로 이용되는 것을 특징으로 하는 항산화, 항균 또는 자외선 차단용 화장료 조성물.
  8. 제 1 항 내지 제 3 항 중에서 선택된 어느 한 항의 석류추출물 내 폴리페놀-산화아연 나노복합입자를 포함하는 항산화 또는 항균용 건강식품 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 건강식품 조성물은 분말, 타블렛, 액상 또는 젤리로서 구성되는 제형으로 이용되는 것을 특징으로 하는 항산화 또는 항균용 건강식품 조성물.
  10. 제 1 항 내지 제 3 항 중에서 선택된 어느 한 항의 석류추출물 내 폴리페놀-산화아연 나노복합입자를 포함하는 식품 보존제.
  11. 제 1 항 내지 제 3 항 중에서 선택된 어느 한 항의 석류추출물 내 폴리페놀-산화아연 나노복합입자를 포함하는 식물용 미생물 방제제.
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