KR20150125662A - 차나무과 식물로부터 유래된 생활성 조성물 및 이의 음료, 기능성 식품, 건강보조제, 보충제 등으로서의 용도 - Google Patents

차나무과 식물로부터 유래된 생활성 조성물 및 이의 음료, 기능성 식품, 건강보조제, 보충제 등으로서의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 차나무과 식물로부터 유래된 생활성 분획을 포함하는 분리된 생활성 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 생활성 조성물을 포함하는 생활성 국소 제형에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 예를 들어, 포유류 피부 조직에서 염증 활성을 저해하는 방법, 포유류 피부 조직을 자외선 유발성 손상으로부터 보호하는 방법 및 포유류의 피부 조직에서 피부 장애를 치료하는 방법을 비롯하여, 본 발명의 조성물의 이용 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 차나무과 식물의 세포즙 또는 세포벽 성분으로부터 유래된 생활성 분획을 분리하는 방법에 관한 것이다. 생활성 조성물은 특히 음료, 기능성 식품, 건강보조제, 첨가제 등에 사용하기 적합하다.

Description

차나무과 식물로부터 유래된 생활성 조성물 및 이의 음료, 기능성 식품, 건강보조제, 보충제 등으로서의 용도 {BIOACTIVE COMPOSITIONS FROM THEACEA PLANTS AND USE THEREOF IN BEVERAGES, FUNCTIONAL FOODS, NUTRICEUTICALS, SUPPLEMENTS AND THE LIKE}
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2013년 2월 8일자 미국 가출원번호 61/762,545에 대한 우선권을 주장하며, 이 문헌의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 차나무과 식물(Theacea plant)로부터 유래된 생활성 (bioactive) 조성물, 이의 제조 방법 및 이 조성물의 용도에 관한 것이다. 생활성 조성물은 특히 음료, 기능성 식물, 건강보조제, 보충제로 사용하기 적합하다.
차나무과 (Theacea, 차나무) 식물은 약 40가지의 속과 600가지의 종으로 구성된 나무 또는 관목을 포괄한다. 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)가 차나무과에서 독보적인 위치를 차지하고 있는데, 그 이유는 이러한 특정 종의 식물이 기본적인 3가지 타입의 차, 즉 녹차, 우롱차 및 홍차 (black tea)를 제조하는 유일한 원료 소스로 주로 사용되기 때문이다 (총괄하여 본원에서는 "차나무"라 함). 몇몇 출처에 따르면, 4번째 타입의 차, 즉, 소위 "백차"도 있으며, 이는 차나무의 어린 잎 또는 끝부분 (tip)만을 사용해 제조된다.
차의 3가지 기본 형태는 동일한 여린 어린 차잎을 이용한 가공 정도에 따라 결정된다. 잎을 따서, 분류, 세척 및 다양하게 산화시킨 후 증기 처리하거나 또는 건조시킨다. 차의 가공을 설명하는데 "발효"라는 용어가 흔히 사용되지만, 용어 "산화"가 가공시 발생되는 화학적 변형을 보다 정확하게 설명하는 용어이다.
가공에는 몇가지 변형이 있지만, 녹차가 가장 산화 정도가 낮고, 홍차가 가장 산화 정도가 높다는 것이 일반적인 통념이다. 우롱차는 부분 산화된 것으로 간주되어, 녹차와 홍차 사이에 위치한다. 가공에 있어서, 녹차와 백차 (white tea) 간의 차이는 거의 없다 (또는 전혀 없다).
녹차는 생잎을 살청 (steaming) 및 위조 (wilting) 후 즉시 건조시켜 제조된다. 홍차는 잎을 위조 및 롤러로 유념 (crushing)한 후 수시간 산화한 다음 건조시켜 제조된다. 우롱차는 잎을 부분 산화 후 건조시켜 제조된다.
전세계적으로 차는 (물 다음으로) 2번째로 가장 많이 소비되는 액체로서, 미국에서만도 (물, 청량 음료, 커피, 맥주 및 우유 다음으로) 6번째로 가장 많이 소비되는 액체이다. 차의 소비는 특히 이 액체가 건강에 유익하다는 대중적인 인식이 확산됨으로써 세계적으로 계속 증가하고 있다. 차 및 이의 성분의 항-혈관형성, 항-세균성, 항-암성, 항-염증성, 항-돌연변이성, 항-산화성, 항-균성 및 해독 특성을 시사하는 간행물들이 점점 많아지고 있다. 차의 효용 목록으로는 류마티스 관절염의 위험성 감소, 콜레스테롤 수치 저하 및 항-당뇨병 특성을 포함한다. 이러한 유용성들이 모두 통계학적으로 유의한 것으로 입증된 것은 아니다. 그럼에도 불구하고, 차의 광범위한 효용은 생잎에 존재하며 전통적인 차 가공 과정을 거친 후에도 잔류하는 가장 강력한 생물학적 활성 물질들로 된 유일한 조성물이라는 사실을 반영하고 있다.
특히, 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)의 생잎은 폴리페놀 22.2%, 단백질 17.2%, 카페인 4.3%, 조섬유 (crude fiber) 27.0%, 전분 0.5%, 환원당 (reducing sugar) 3.5%, 펙틴 6.5%, 에테르 추출물 2.0% 및 회분 5.6%를 함유하는 것으로 보고되어 있다 (Duke, J. A., Handbook of Energy Crops (1983), see www.hort.purdue.edu/newcrop/duke_energy/Camellia - sinensis.html). 잎은, 100 g 당, 8.0 g의 H2O, 24.5 g의 단백질, 2.8 g의 지방, 58.8 g의 총 탄수화물, 8.7 g의 섬유질, 5.9 g의 회분, 327 mg의 Ca, 313 mg의 P, 24.3 mg의 Fe, 50 mg의 Na, 2700 ㎍의 베타-카로텐 등가체, 0.07 mg의 티아민, 0.8 mg의 리보플라빈, 7.6 mg의 니아신 및 9 mg의 아스코르브산을 함유하는 것으로 보고되어 있다. 다른 보고에 따르면, H2O 8.0 g, 단백질 28.3 g, 총 탄수화물 53.6 g, 섬유질 9.6 g, 회분 2.6 g, Ca 245 mg, P 415 mg, Fe 18.9 mg, Na 60 mg, 베타-카로텐 등가체 8400 ㎍, 티아민 0.38 mg, 리보플라빈 1.24 mg, 니아신 4.6 mg 및 아스코르브산 230 mg을 함유하는 것으로 계산된다. 또 다른 보고에 따르면, H2O 8.1 g, 단백질 24.1 g, 지방 3.5 g, 총 탄수화물 59.0 g, 섬유질 9.7 g, 회분 5.3 g, Ca 320 mg, P 185 mg, Fe 31.6 mg, 베타-카로텐 등가체 8400 ㎍, 티아민 0.07 mg, 리보플라빈 0.79 mg, 니아신 7.3 mg 및 아스코르브산 85 mg이 함유되어 있다 (J. A. Duke and A. A. Atchley, "Proximate Analysis," In: Christie, B. R. (ed.), The Handbook of Plant Science in Agriculture, CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla. (1984)).
또한, 잎에는 카로텐, 리보플라빈, 니코틴산, 판토텐산 및 아스코르브산이 포함되어 있다. 카페인과 탄닌은 그 중에서도 활성이 높은 구성 성분이다 (Council for Scientific and Industrial Research, 1948-1976). 생잎에 존재하는 아스코르브산은 홍차 제조시에는 파괴된다. 말산과 옥살산은, 캠프페롤, 퀘르시트린, 테오필린, 테오브롬, 크산틴, 하이포크산틴, 아데닌, 검류, 덱스트린 및 이노시톨과 더불어 형성된다. 휘발성 오일 (잎의 0.007-0.014 생중량%)의 주 성분은 헥세날, 헥세놀 및 저급 알데하이드류, 부티르알데하이드, 이소부티르알데하이드, 이소발레르알데하이드 뿐 아니라 n-헥실, 벤질 및 페닐에틸 알코올, 페놀, 크레솔, 헥사노익산, n-옥틸 알코올, 게라니올, 리날로올, 아세토페논, 벤질 알코올 및 시트랄이다.
차 생잎은 보통 폴리페놀류 (카테킨)의 플라바놀 타입들을 다량 함유하며, 그 함량은 잎의 건조 중량의 최대 30%에 이를 수 있는 것으로 확인되었다. 카테킨으로는 주로 (-)-에피카테킨, (-)-에피카테킨 갈레이트, (-)-에피갈로카테킨 및 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트를 포함한다. 부가적으로, 차의 3-갈로일퀸산 (테오갈린)과 고유 아미노산인 테아닌 (5-N-에틸글루타민)도 존재한다 (Duke, J. A., Handbook of Energy Crops (1983), see www.hort.purdue.edu/newcrop/duke_energy/Camellia - sinensis.html).
차 잎에는 폴리페놀-옥시다제와 퍼옥시다제가 다량 함유되어 있다. 첫번째 효소는 카테킨의 호기적인 산화를 촉매하는데, 이 과정은 잎의 세포 구조의 온전성이 파괴될 때 개시된다. 페놀-옥시다제는 비스플라바놀 (bisflavanol), 테아플라빈 (theaflavin), 에피테아플라브산 (epitheaflavic acid) 및 테아루비겐 (thearubigen)을 형성시키는데, 이들 화합물들은 홍차에서 추출가능한 내용물에서 가장 큰 부분을 차지한다. 이들 화합물 대부분은 생잎에 상당한 수준 (건조 중량의 2-4%)으로 존재하는 카페인과 복합체를 쉽게 형성한다. 퍼옥시다제는 프로안토시아니딘과의 상기한 복합체를 형성시키는데 중요한 역할을 한다. 또한, 카테킨 퀴논은 홍차 아로마 분획에서 발견되는 수백종의 휘발성 화합물들 중 수많은 화합물들의 형성을 개시한다. 아울러, 상대적으로 용해성인 글리코시드를 용해성이 낮은 아글리콘으로 변환시키는 반응도 이루어진다.
전술한 복잡한 모든 케스케이드 과정은 잎 세포의 구조 파괴에 의해 시작되며, 산화 시간에 따라 심화된다. 그 결과, 일반적으로 강도높은 롤링 또는 컷팅 및 상대적으로 긴 시간의 산화를 통해 가공된 홍차의 조성은, 생잎의 조성과는 아주 많은 차이를 보인다. 녹차 (및 백차)는 산화를 최소화하여 가공되기 때문에 그 조성이 생잎과 더 유사하지만, 수확 후 매우 빠르게 진행되는 비-효소적으로 및 효소적으로 촉매화된 변화가 이루어지며, 건조 단계 동안에 형성되는 새로운 휘발성 물질이 존재하게 된다. 따라서, 상대적으로 온화한 녹차 가공 과정에서도 본래의 살아있는 식물 조성과는 차이가 생기게 되며, 차나무의 생잎에서 오는 치료학적 가치와 기타 잠재적인 이점이 줄어들 수 있다.
최근 여러가지 연구들을 통해, 차의 치료학적 유용성이 백차 > 녹차 > 우롱차 > 홍차 순으로 낮아진다는 것이 명확하게 확인되었다. 즉, 신선한 차나무를 이용함으로써, 기존의 차 가공의 결과로서 관찰되는 특이적인 활성의 분해를 방지할 수 있다. 신선한, 여린 동백나무속 식물의 잎에는 물이 대략 80% 함유되어 있다. 세포의 단단한 세포벽에 의해 세포의 팽창과 탈수가 방지된다. 세포벽 구조의 파괴는 신선한 식물 조직의 탈수를 촉발시키고, 후속적으로 원치않은 생리-화학적 과정 및 생화학적 과정을 연속적으로 발생시킨다: 삼투압 충격, 효소의 탈구획화 및 파괴, 가수분해 및 산화, 페놀의 중합, 글리코시드의 아글리콘으로의 변환, 메일라드 반응 (Maillard reaction)의 생성물 형성, 이성질체화 및 미생물 오염. 따라서, 신선한 동백나무속 식물은 매우 광범위한 생물학적 활성 성분을 함유하고 있지만, 전통적인 추출 과정에서 이들 성분들 중 일부만 이용가능해진다. 즉, 차 음료를 제조하기 위한 끓인 물을 이용해서는 세포벽, 대사산물 및 안정적인 대사산물만 추출할 수 있거나, 또는 여러가지 용매를 이용하여 추출하는 경우에는 생물학적으로 활성인 성분들 중 제한적인 일부 (주로 폴리페놀과 플라보노이드)만 수득할 수 있다.
유용한 치료학적 조성물 및 그외 잠재적으로 유익한 생활성 조성물의 원천으로서 차 생잎의 가능성에 비추어, 치료학적 및 그외 잠재적으로 유익한 생활성 특성을 최대화하는 방법을 찾기 위해서는 신선한 차나무를 이용할 필요가 있다.
본 발명은 생활성 조성물에 관한 것이다. 일 구현예에서, 생활성 조성물은 차나무과 식물로부터 유래되는 분리된 생활성 분획을 포함한다. 적합한 생활성 분획으로는, 비제한적인 예로, 세포벽 분획, 세포벽 분획 추출물, 막 분획, 막 분획 추출물, 세포질 분획, 세포질 분획의 추출물 (cytoplasm fraction extract), 세포즙 세럼 (cell juice serum), 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 포유류에게 국소 적용하기 적합한 생활성 국소 제형에 관한 것이다. 일 구현예에서, 생활성 국소 제형은 본 발명의 생활성 조성물을 국소적으로 유효한 양으로 포함한다. 생활성 국소 제형은 국소적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 포유류 피부 조직에서 염증 활성을 저해하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 본 발명에 따른 생활성 조성물을 제공하는 단계를 포함한다. 본 방법은 추가적으로 피부 조직에서 염증 활성을 저해하는데 유효한 양으로 생활성 조성물을 피부 조직에 적용하는 단계를 더 포함한다.
또한, 본 발명은 자외선으로 인한 손상으로부터 포유류 피부 조직을 보호하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 본 발명에 따른 생활성 조성물을 제공하는 단계를 포함한다. 본 방법은 추가적으로 피부 조직에서 산화적 손상을 예방하고 피부 조직의 자외선으로 인한 손상을 완화하는데 유효한 양으로 생활성 조성물을 피부 조직에 적용하는 단계를 더 포함한다.
또한, 본 발명은 포유류의 피부 조직에서 피부 장애를 정상화하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 본 발명에 따른 생활성 조성물을 제공하는 단계를 포함한다. 본 방법은 추가적으로 피부 조직에서 세포 장애를 정상화하는데 유효한 양으로 생활성 조성물을 피부 조직에 적용하는 단계를 더 포함한다.
또한, 본 발명은 차나무과 식물의 세포즙으로부터 유래된 생활성 분획을 분리하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 차나무과 식물을 제공하는 단계를 포함한다. 차나무과 식물은 이후 세포즙과 세포벽 성분으로 분리한다. 이후, 세포즙은 생활성 분획을 수득하는데 효과적인 조건 하에 가공 처리한다. 적정 생활성 분획으로는 비제한적인 예로, 막 분획, 막 분획 추출물, 세포질 분획, 세포질 분획의 추출물, 및/또는 세포즙 세럼을 포함한다. 이후, 생활성 분획을 가공된 세포즙으로부터 분리한다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 의해 제조되는 분리된 생활성 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 차나무과 식물의 세포벽 성분으로부터 유래된 생활성 분획을 분리하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 차나무과 식물을 제공하는 단계를 포함한다. 차나무과 식물을 이후 세포즙과 세포벽 성분으로 분리한다. 그후, 세포벽 성분은, 생활성 분획을 수득하는데 효과적인 조건 하에 가공 처리한다. 이 후, 가공 처리한 세포즘으로부터 생활성 분획을 분리한다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 의해 제조되는 분리된 생활성 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 기존의 차 가공 방법의 문제점, 특히 기존의 차 가공으로 인한 광의의 강력한 생활성 조성물을 보존하지 못하는 문제점을 해결하는데 유용하다. 본 발명에 의해 제공되는 바와 같이, 동백나무속의 신선한 생물 자원을 발효 및 과다 열 처리하지 않고 가공함으로써, 기존의 차 가공 산물 보다 더 강력하고 다양한 생활성 조성물들을 만들 수 있다.
또한, 본 발명은, 본 발명에 따른 1종 이상의 생활성 조성물을 포함하는, 음료, 치료학적 음료, 기능성 음료 등에 관한 것이다. 일 구현예에서, 상기 음료, 치료학적 음료, 기능성 음료 등은 액체 중에 분산된 1종 이상의 생활성 조성물을 포함한다. 특정 구현예에서, 액체는 물, 숏 드링크 (shot drink), 기능성 음료, 녹차, 우롱차, 홍차, 백차, 가향차 (flavored tea), 청량 음료, 커피, 우유, 셰이크, 알코올 음료, 무-알코올 음료, 스포츠 음료, 과일 주스, 야채 주스, 인공 감미료 첨가 주스, 탄산수, 펀치, 사이다 및 영양 보충 음료로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 1종 이상의 생활성 조성물을 포함하는 건강보조제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 1종 이상의 생활성 조성물을 포함하는 기능성 식품에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 반투과성 막을 포함하는 여과용 파우치 또는 백(bag)과 상기 여과용 파우치 또는 백에 담긴 본 발명에 따른 1종 이상의 생활성 조성물을 포함하는, 차나무과 식물로부터 유래되는 1종 이상의 생활성 조성물을 액체에 분산시켜 음료를 제조하기 위한 디바이스에 관한 것이다. 일 구현예에서, 액체는 물, 숏 드링크 (shot drink), 기능성 음료, 녹차, 우롱차, 홍차, 백차, 가향차 (flavored tea), 청량 음료, 커피, 우유, 셰이크, 알코올 음료, 무-알코올 음료, 스포츠 음료, 과일 주스, 야채 주스, 인공 감미료 첨가 주스, 탄산수, 펀치, 사이다 및 영양 보충 음료로 이루어진 군으로부터 선택된다. 구체적인 구현예에서, 음료는 치료학적 음료이다.
또한, 본 발명은, 본 발명에 따른 디바이스를 제공하는 단계; 상기 디바이스의 1종 이상의 생활성 조성물을 액체로 분산시키기 효과적인 조건에서, 상기 디바이스를 액체와 접촉시켜, 1종 이상의 생활성 조성물을 포함하는 음료를 제조하는 단계를 포함하는, 음료 제조 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 상기 디바이스는 1종 이상의 생활성 조성물의 저분자량의 환원된, 비-산화된 성분을 액체에 분산시키기에 효과적인 조건 하에 액체와 접촉된다. 다양한 구현예들에서, 액체는 물, 숏 드링크 (shot drink), 기능성 음료, 녹차, 우롱차, 홍차, 백차, 가향차 (flavored tea), 청량 음료, 커피, 우유, 셰이크, 알코올 음료, 무-알코올 음료, 스포츠 음료, 과일 주스, 야채 주스, 인공 감미료 첨가 주스, 탄산수, 펀치, 사이다 및 영양 보충 음료로 이루어진 군으로부터 선택된다. 구체적이 구현예에서, 음료는 치료학적 음료이다.
또한, 본 발명은, 본 발명에 따른 1종 이상의 생활성 조성물을 포함하는 용액, 현탁액, 분산물, 페이스트 또는 건조 분말을 포함하는, 차나무과 식물로부터 유래되는 1종 이상의 생활성 조성물을 전신 또는 국소 투여하기 위한 제형에 관한 것이다. 일 구현에에서, 제형은, 액체와 혼합하여 기능성 음료를 제조하는데 사용하기 위한 건조 분말을 포함한다. 다른 구현에에서, 제형은 액체와 혼합하여 기능성 음료를 제조하는데 사용하기 위한 1종 이상의 생활성 조성물의 농축액을 포함한다.
본 발명의 여러가지 측면에서, 본원에 제공되는 생활성 조성물은 개체 (비제한적인 예로, 인간 및 동물이 포함됨)가 임의의 경구, 전신 또는 국소 적용 용도로 사용하기 위한, 임의의 액체, 겔, 로션, 식품 등 중의 구성 성분으로서 분말, 농축물 및/또는 액체 형태로 사용될 수 있다. 구체적인 구현예에서, 생활성 분획은 임의의 뜨겁거나 차가운 음료, 예컨대 알코올성 칵테일, 무-알코올 음료 및 본원에 기술되거나 고려되는 바와 같은 임의의 다른 액체 등과 조합하여 사용될 수 있다. 나아가, 다양한 구현예들에서, 본 발명의 생활성 조성물은 비제한적인 예로, 차 음료, 차를 기재로 하지 않는 음료, 탄산 음료, 카페인성 음료, 미용 음료 (beauty drink), 숏 드링크, 스포츠 음료 및 본원에 기술되거나 고려되는 임의의 기타 액체 등을 비롯하여, 임의의 통상적으로 이용가능한 음료와 조합될 수 있다. 본 발명의 생활성 분획은 개체 (비제한적인 예로, 인간 및 포유류)의 피부, 체모 및 네일을 개선시키는데 사용하기 위한 보충제로서 사용될 수 있다. 본 발명의 생활성 분획은 또한 건강 보조제 또는 기타 식이성 첨가제로서 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 생활성 조성물의 제조 공정에 대한 일 구현예를 나타낸 개략도이다.
도 2는 세포벽 분획의 추출물과 기존 차 (1:1000 희석)의 UV/VIS 스펙트럼을 보여주는 그래프이다.
도 3은 동백나무속 생활성 조성물 (1:4000 희석)의 UV/VIS 스펙트럼을 보여주는 그래프이다.
도 4는 Vitro-Skin® 시험 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.)에 도포된 세포벽 분획의 추출물과 기존 차의 흡광 스펙트럼을 보여주는 그래프이다. 건조 무게는 동일하다.
도 5는 Vitro-Skin® 시험 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.)에 도포된 동백나무속 생활성 조성물의 흡광 스펙트럼을 보여주는 그래프이다. 건조 무게는 동일하다.
도 6은 Vitro-Skin® 시험 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.)에 도포된 동백나무속 생활성 조성물과 백차 추출물의 흡광 스펙트럼을 보여주는 그래프이다.
도 7A는 Vitro-Skin® 시험 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.)에 도포된 동백나무속 막 분획 추출물의 희석 용액 (1:200)의 흡광 스펙트럼을 보여주는 그래프이다. 도 7B는 Vitro-Skin® 시험 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.)에 도포된 동백나무속 세포즙 세럼의 희석 용액 (1:200)의 흡광 스펙트럼을 보여주는 그래프이다.
도 8A는 Vitro-Skin® 시험 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.)에 도포된 보리 (Hordeum vulgare) 세포즙 세럼의 희석 용액 (1:200)의 흡광 스펙트럼을 보여주는 그래프이다. 도 8B는 Vitro-Skin® 시험 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.)에 도포된 세이지 (Salvia officinalis) 세포즙 세럼의 희석 용액 (1:200)의 흡광 스펙트럼을 보여주는 그래프이다.
도 9는 Vitro-Skin® 시험 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.)에 대한 광역 스펙트럼 UV 조사 효과를 보여주는 그래프이다.
도 10은 Vitro-Skin® 시험 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.)에 도포된 백차 추출물에 대한 광역 스펙트럼 UV 조사 효과를 보여주는 그래프이다.
도 11은 Vitro-Skin® 시험 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.)에 도포된 세포벽 분획 추출물에 대한 광역 스펙트럼 UV 조사 효과를 보여주는 그래프이다.
도 12는 Vitro-Skin® 시험 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.)에 도포된 동백나무속 막 분획 추출물에 대한 광역 스펙트럼 UV 조사 효과를 보여주는 그래프이다.
도 13은 Vitro-Skin® 시험 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.)에 도포된 동백나무속 세포즙 세럼에 대한 광역 스펙트럼 UV 조사 효과를 보여주는 그래프이다.
도 14는 24시간 및 48시간 배양한 MDA-MB-435S 세포에 대한 백차 추출물의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 15는 5 ng/ml TGF-β의 존재하에 24시간 및 48시간, 그리고 (대조군) 24시간 배양한 MCF-7 세포에 대한 백차 추출물의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 16은 24시간 및 48시간 배양한 MDA-MB-435S 세포에 대한 세포벽 분획 추출물의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 17은 5 ng/ml TGF-β의 존재하에 24시간 및 48시간, 그리고 (대조군) 24시간 배양한 MCF-7 세포에 대한 세포벽 분획 추출물의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 18은 24시간 및 48시간 배양한 MDA-MB-435S 세포에 대한 막 분획 추출물의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 19는 5 ng/ml TGF-β의 존재하에 24시간 및 48시간, 그리고 (대조군) 24시간 배양한 MCF-7 세포에 대한 막 분획 추출물의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 20은 24시간 및 48시간 배양한 MDA-MB-435S 세포에 대한 세포즙 세럼의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 21은 5 ng/ml TGF-β의 존재하에 24시간 및 48시간, 그리고 (대조군) 24시간 배양한 MCF-7 세포에 대한 세포즙 세럼의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 22는 24시간 및 48시간 배양한 Mono Mac 6 세포에 대한 백차 추출물의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 23은 10 nM PMA의 존재하에 24시간 및 48시간 배양한 Mono Mac 6 세포에 대한 백차 추출물의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 24는 24시간 및 48시간 배양한 Mono Mac 6 세포에 대한 세포벽 분획 추출물의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 25는 10 nM PMA의 존재하에 24시간 및 48시간 배양한 Mono Mac 6 세포에 대한 세포벽 분획 추출물의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 26은 24시간 및 48시간 배양한 Mono Mac 6 세포에 대한 막 분획 추출물의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 27은 10 nM PMA의 존재하에 24시간 및 48시간 배양한 Mono Mac 6 세포에 대한 막 분획 추출물의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 28은 24시간 및 48시간 배양한 Mono Mac 6 세포에 대한 세포즙 세럼의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 29는 10 nM PMA의 존재하에 24시간 및 48시간 배양한 Mono Mac 6 세포에 대한 세포즙 세럼의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 30은 PMA 자극된 Mono Mac 6 세포에 의해 분비되는 MMP 수준에 대한 백차 추출물의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 31은 PMA 자극된 Mono Mac 6 세포에 의해 분비되는 MMP 수준에 대한 세포벽 분획 추출물의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 32는 PMA 자극된 Mono Mac 6 세포에 의해 분비되는 MMP 수준에 대한 막 분획 추출물의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 33은 PMA 자극된 Mono Mac 6 세포에 의해 분비되는 MMP 수준에 대한 세포즙 세럼의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 34는 Mono Mac 6 세포를, 10 nM PMA 부재 (U) 또는 존재 (S) 하에, 그러나 동백나무속 조성물이 존재하지 않는 조건 하에 배양한 세포로부터 수집한 배양 배지와 더불어, 백차 추출물에 48시간 노출시킨 후 수집한 배양 배지의 젤라틴 자이모그램이다.
도 35는 Mono Mac 6 세포를, 10 nM PMA 부재 (U) 또는 존재 (S) 하에, 그러나 동백나무속 조성물이 존재하지 않는 조건 하에 배양한 세포로부터 수집한 배양 배지와 더불어, 세포벽 분획 추출물에 48시간 노출시킨 후 수집한 배양 배지의 젤라틴 자이모그램이다.
도 36은 Mono Mac 6 세포를, 10 nM PMA 부재 (U) 또는 존재 (S) 하에, 그러나 동백나무속 조성물이 존재하지 않는 조건 하에 배양한 세포로부터 수집한 배양 배지와 더불어, 막 분획 추출물에 48시간 노출시킨 후 수집한 배양 배지의 젤라틴 자이모그램이다.
도 37은 Mono Mac 6 세포를, 10 nM PMA 부재 (U) 또는 존재 (S) 하에, 그러나 동백나무속 조성물이 존재하지 않는 조건 하에 배양한 세포로부터 수집한 배양 배지와 더불어, 세포즙 세럼에 48시간 노출시킨 후 수집한 배양 배지의 젤라틴 자이모그램이다.
도 38은 백차 추출물 ("WTE")과, 본 발명의 세포벽 분획 추출물 ("CWFE"), 막 분획 추출물 ("MFE") 및 세포즙 세럼 ("CJS")에서의 다양한 카테킨 함량을 비교한 막대 그래프이다.
도 39는 Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis), 전통적인 홍차 및 녹차 조제물의 체류 시간 대비 절대적인 ELSA 신호 세기를 나타낸 그래프이다.
도 40은 Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis), 전통적인 홍차 및 녹차 조제물의 체류 시간 대비 상대적인 ELSA 신호 세기를 나타낸 그래프이다.
도 41은 Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)의 LC-DAD 3차원 크로마토그램이다. X 축: 체류 시간 0~15분; Y 축: 파장 200~420nm; Z 축: 세기 0~3400.
도 42는 전통적인 홍차 조제물의 LC-DAD 3차원 크로마토그램이다. X 축: 체류 시간 0~15분; Y 축: 파장 200~420nm; Z 축: 세기 0~580.
도 43은 전통적인 녹차 조제물의 LC-DAD 3차원 크로마토그램이다. X 축: 체류 시간 0~15분; Y 축: 파장 200~420nm; Z 축: 세기 0~480.
도 44는 Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis), 홍차 및 녹차 전통 제조물 대 시판 차 음료의 상대적인 ORAC 활성을 보여주는 그래프이다. X 축은 상대적인 ORAC 활성, 배수이며, 최저 활성 검사 품목 (음료 D)은 1로 둔다.
도 45는 ORAC 분석으로 평가한, 0.5% Recentia® CS가 첨가된 세럼 젤과 Recentia® CS가 첨가되지 않은 세럼 젤 베이스의 항산화 활성을 보여주는 막대 그래프이다. 이들 제형은 평가하기 전에 2달 동안 RT 및 45℃에 두었다. 이들 검사 품목들의 상대적인 ORAC 활성 %가 표시된다.
본 발명은 생활성 조성물에 관한 것이다. 일 구현예에서, 생활성 조성물은 차나무과 식물로부터 유래되는 분리된 생활성 분획을 포함한다. 본원에서, 용어 "분리된 생활성 분획"은 임의의 통상적인 차 가공 (예, 열 처리, 산화, 발효, 건조)을 거치지 않은 차나무과 식물 (예, 차나무과 식물의 신선한 바이오매스)로부터 분리되는 분획을 포함하는 것을 의미한다. 적합한 분리된 생활성 분획으로는, 비제한적인 예로, 세포벽 분획, 세포벽 분획 추출물, 막 분획, 막 분획 추출물, 세포질 분획, 세포질 분획의 추출물, 세포즙 세럼, 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 생활성 조성물 및 생활성 분획은, 후술한 바와 같이 그리고 당해 기술 분야에 잘 알려진 통상적인 카테킨 진단 방법을 이용하여 측정되는 바에 따라, 다양한 카테킨 프로파일과 카테킨 총 함량을 가질 수 있다. 본원에서, 용어 "카테킨"은, 일반적으로, 모든 카테킨을 지칭하며, 비제한적인 예로, 하기 특정한 타입의 카테킨을 포함한다: (i) (-)-에피갈로카테킨 (CAS No. 970-74-1을 참조함, 이는 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨); (ii) (+)-카테킨 (CAS No. 7295-85-4를 참조함, 이는 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨); (iii) (-)-에피카테킨 (CAS No. 490-46-0을 참조함, 이는 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨); (iv) (-)-에피갈로카테킨 갈레이트 (CAS No. 989-51-5를 참조함, 이는 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨); (v) (-)-갈로카테킨 갈레이트 (CAS No. 4233-96-9를 참조함, 이는 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨); 및 (vi) (-)-에피카테킨 갈레이트 (CAS No. 1257-08-5를 참조함, 이는 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨). "카테킨 총 함량" (본원에서)은 본 발명의 특정 생활성 조성물 또는 생활성 분획에 함유된 모든 카테킨의 함량을 합친 수준을 지칭하며, 본원에서 전술한 특정 타입의 카테킨의 함유 수준으로 제한되는 것을 의미하지 않는다. 본원에서, 용어 "카테킨 함량 프로파일"은 본 발명의 특정 생활성 조성물 또는 생활성 분획에 함유된 선택된 카테킨의 양을 설명하는데 사용된다.
본 발명의 생활성 조성물에 대한 일 구현예에 있어서, 생활성 분획은 세포벽 분획일 수 있다.
본 발명의 생활성 조성물에 대한 일 구현예에 있어서, 생활성 분획은 세포벽 분획 추출물일 수 있다. 본 발명의 구체적인 구현예에서, 세포벽 분획 추출물은 카테킨 총 함량이 건조물 (dry matter) g 당 약 2.1 내지 약 4.5 mg, 구체적으로 건조물 g 당 약 2.6 내지 약 4.0 mg, 보다 구체적으로 건조물 g 당 약 3.0 내지 약 3.6 mg일 수 있다. 다른 구체적인 구현예에서, 세포벽 분획 추출물은 다음과 같은 카테킨 함량 프로파일을 가질 수 있다: (i) 세포벽 분획 추출물의 건조물 1 g 당 (+)-카테킨 약 2.0 내지 약 3.0 mg; (ii) 세포벽 분획 추출물의 건조물 1 g 당 (-)-에피카테킨 약 0.005 내지 약 0.02 mg; (iii) 세포벽 분획 추출물의 건조물 1 g 당 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트 약 0.005 내지 약 0.02 mg; 및 (iv) 세포벽 분획 추출물의 건조물 1 g 당 (-)-에피카테킨 갈레이트 약 0.003 내지 약 0.01 mg. 보다 구체적으로, 세포벽 분획 추출물은 다음과 같은 카테킨 함량 프로파일을 가질 수 있다: (i) 세포벽 분획 추출물의 건조물 1 g 당 (+)-카테킨 약 2.2 내지 약 2.7 mg; (ii) 세포벽 분획 추출물의 건조물 1 g 당 (-)-에피카테킨 약 0.01 내지 약 0.015 mg; (iii) 세포벽 분획 추출물의 건조물 1 g 당 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트 약 0.01 내지 약 0.015 mg; 및 (iv) 세포벽 분획 추출물의 건조물 1 g 당 (-)-에피카테킨 갈레이트 약 0.005 내지 약 0.007 mg.
본 발명의 생활성 조성물에 대한 일 구현예에 있어서, 생활성 분획은 막 분획일 수 있다.
본 발명의 생활성 조성물에 대한 일 구현예에 있어서, 생활성 분획은 막 분획 추출물일 수 있다. 본 발명의 구체적인 구현예에서, 막 분획 추출물은 카테킨 총 함량이 건조물 1 g 당 약 15.0 내지 약 30.5 mg, 구체적으로 건조물 1 g 당 약 18.0 내지 약 27.5 mg, 보다 구체적으로 건조물 1 g 당 약 21.0 내지 약 24.5 mg일 수 있다. 다른 구체적인 구현예에서, 막 분획 추출물은 다음과 같은 카테킨 함량 프로파일을 가질 수 있다: (i) 막 분획 추출물 건조물 1 g 당 (-)-에피갈로카테킨 약 1.7 내지 약 3.3 mg; (ii) 막 분획 추출물 건조물 1 g 당 (+)-카테킨 약 6.1 내지 약 10.2 mg; (iii) 막 분획 추출물 건조물 1 g 당 (-)-에피카테킨 약 0.3 내지 약 1.1 mg; (iv) 막 분획 추출물 건조물 1 g 당 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트 약 6.2 내지 약 12.5 mg; (v) 막 분획 추출물 건조물 1 g 당 (-)-갈로카테킨 갈레이트 약 0.007 내지 약 0.03 mg; 및 (vi) 막 분획 추출물 건조물 1 g 당 (-)-에피카테킨 갈레이트 약 1.3 내지 약 3.3 mg. 보다 구체적으로, 막 분획 추출물은 다음과 같은 카테킨 함량 프로파일을 가질 수 있다: (i) 막 분획 추출물 건조물 1 g 당 (-)-에피갈로카테킨 약 2.0 내지 약 3.0 mg; (ii) 막 분획 추출물 건조물 1 g 당 (+)-카테킨 건조 중량 약 7.0 내지 약 9.0 mg; (iii) 막 분획 추출물 건조물 1 g 당 (-)-에피카테킨 약 0.5 내지 약 0.9 mg; (iv) 막 분획 추출물 건조물 1 g 당 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트 약 8.0 내지 약 10.0 mg; (v) 막 분획 추출물 건조물 1 g 당 (-)-갈로카테킨 갈레이트 약 0.01 내지 약 0.02 mg; 및 (vi) 막 분획 추출물 건조물 1 g 당 (-)-에피카테킨 갈레이트 약 1.8 내지 약 2.8 mg.
본 발명의 생활성 조성물에 대한 일 구현예에 있어서, 생활성 분획은 세포질 분획일 수 있다.
본 발명의 생활성 조성물에 대한 일 구현예에 있어서, 생활성 분획은 세포질 분획의 추출물일 수 있다.
본 발명의 생활성 조성물에 대한 일 구현예에 있어서, 생활성 분획은 세포즙 세럼일 수 있다. 구체적인 구현예에서, 세포즙 세럼은 카테킨 총 함량이 건조물 1 g 당 약 8.0 내지 약 20.0 mg, 구체적으로 건조물 1 g 당 약 10.0 내지 약 18.0 mg, 보다 구체적으로 건조물 1 g 당 약 12.0 내지 약 16.0 mg일 수 있다. 다른 구체적인 구현예에서, 세포즙 세럼은 다음과 같은 카테킨 함량 프로파일을 가질 수 있다: (i) 세포즙 세럼의 건조물 1 g 당 (-)-에피갈로카테킨 약 2.1 내지 약 4.4 mg; (ii) 세포즙 세럼의 건조물 1 g 당 (+)-카테킨 약 4.2 내지 약 8.6 mg; (iii) 세포즙 세럼의 건조물 1 g 당 (-)-에피카테킨 약 0.2 내지 약 2.0 mg; (iv) 세포즙 세럼의 건조물 1 g 당 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트 약 1.2 내지 약 3.2 mg; (v) 세포즙 세럼의 건조물 1 g 당 (-)-갈로카테킨 갈레이트 약 0.01 내지 약 0.1 mg; 및 (vi) 세포즙 세럼의 건조물 1 g 당 (-)-에피카테킨 갈레이트 약 0.2 내지 약 1.3 mg. 보다 구체적으로, 세포즙 세럼은 다음과 같은 카테킨 함량 프로파일을 가질 수 있다: (i) 세포즙 세럼의 건조물 1 g 당 (-)-에피갈로카테킨 약 3.0 내지 약 3.5 mg; (ii) 세포즙 세럼의 건조물 1 g 당 (+)-카테킨 약 5.0 내지 약 7.0 mg; (iii) 세포즙 세럼의 건조물 1 g 당 (-)-에피카테킨 약 0.7 내지 약 1.5 mg; (iv) 세포즙 세럼의 건조물 1 g 당 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트 약 1.7 내지 약 2.7 mg; (v) 세포즙 세럼의 건조물 1 g 당 (-)-갈로카테킨 갈레이트 약 0.03 내지 약 0.07 mg; 및 (vi) 세포즙 세럼의 건조물 1 g 당 (-)-에피카테킨 갈레이트 약 0.5 내지 약 1.0 mg.
일 구현예에서, 차나무과 식물의 프레쉬 바이오매스 (fresh biomass)를 이용하여 본 발명의 생활성 조성물을 분리할 수 있다. 프레쉬 바이오매스는 동백나무속 및/또는 사스레피나무 속의 차나무과 식물로부터 취할 수 있다. 본 발명에 사용하기 적합한 동백나무 속의 종들로는, 비제한적인 예로, 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis), 카멜리아 자포니카(Camellia japonica), 카멜리아 레티쿨레이트(Camellia reticulate) 및 카멜리아 사산쿠아(Camellia sasanqua)를 포함할 수 있다. 본 발명에 사용하기 적합한 사스레피나무 속의 종들로는, 비제한적인 예로, 유리아 샌드위센시스(Eurya sandwicensis)를 포함할 수 있다.
본 발명의 생활성 조성물은 추가적으로 안정화제를 포함할 수 있다. 적절한 안정화제는 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 것이다. 구체적으로 적합한 안정화제로는, 비제한적인 예로, 유화제, 보존제, 항산화제, 폴리머 매트릭스 및/또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 생활성 분획은 한가지 이상의 포유류 세포 기능에 대해 조절 활성을 가질 수 있다. 이러한 조절 활성은, 예를 들어, 세포 생장 저해 활성, 세포 생장 자극 활성, 효소 분비 활성, 효소 저해 활성, 항산화 활성, UV-차단 활성, 항염증 활성, 상처 치유 활성 및/또는 이들 활성의 조합을 포함할 수 있다. 세포 생장 저해 활성과 관련하여, 이러한 활성은 암 세포의 생장 저해를 수반할 수 있다. 본 발명의 생활성 분획에 의해 생장을 저해시킬 수 있는 적합한 암 세포는, 비제한적인 예로, 유방암 세포 및/또는 대장암 세포를 포함할 수 있다. 또한, 언급된 세포 생장 저해 활성은 백혈병 세포의 생장 저해를 포함할 수 있다. 본 발명의 생활성 분획에 의해 생장을 저해시킬 수 있는 적합한 백혈병 세포는, 비제한적인 예로, 단핵구성 백혈병 세포를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 생활성 조성물은 피부 세포의 원치않은 과다-증식 또는 과소-증식을 저해하거나, 및/또는 피부 세포에서의 원치않은 비-통합적인 (uncoordinated) 효소 활성들 또는 효소 분비 과정들을 저해하는데, 효과적일 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 생활성 조성물은 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 전신 또는 국소 투여용 전달 시스템을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 포유류에 국소 적용하는데 적합한 생활성 국소 제형에 관한 것이다. 일 구현예에서, 생활성 국소 제형은 본 발명의 생활성 조성물을 국소적인 유효량으로 포함한다. 생활성 국소 제형은 국소적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 국소적으로 허용가능한 적정 담체로는, 비제한적인 예로, 친수성 크림 베이스, 친수성 로션 베이스, 친수성 계면활성제 베이스, 친수성 젤 베이스, 친수성 용액 베이스, 소수성 크림 베이스, 소수성 로션 베이스, 소수성 계면활성제 베이스, 소수성 젤 베이스 및/또는 소수성 용액 베이스를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 생활성 조성물은 생활성 국소 제형의 총량에 대해 약 0.001% 내지 약 90% 범위의 양으로 존재할 수 있다.
또한, 본 발명은 포유류의 피부 조직에서 염증 활성을 저해하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 본 발명에 따른 생활성 조성물을 제공하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 피부 조직에 생활성 조성물을 피부 조직에서의 염증 활성을 저해하는데 효과적인 양으로 적용하는 단계를 더 포함한다. 이 방법의 일 구현예에서, 생활성 조성물은 안정화제 (본원에 기술된 바와 같은 적정 예들)를 더 포함할 수 있다. 이 방법에 대한 다른 구현예에서, 생활성 조성물은 국소적으로 허용가능한 담체 (본원에 기술된 바와 같은 적정 예들)를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 자외선-유발성 손상으로부터 포유류의 피부 조직을 보호하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 본 발명의 생활성 조성물을 제공하는 단계를 포함한다. 이 방법은, 피부 조직의 산화적 손상을 방지하고 피부 조직의 자외선-유발성 손상을 완화하는데 효과적인 양으로, 생활성 조성물을 피부 조직에 적용하는 단계를 더 포함한다. 일 구현예에서, 이 방법은 약 320 내지 약 400 nm 범위의 자외선에 의해 유발되는 자외선-유발성 손상으로부터 피부 조직을 보호하는데 유용하다. 이 방법에 대한 다른 구현예에서, 생활성 조성물은 안정화제 (본원에 기술된 바와 같은 적정 예들)를 더 포함할 수 있다. 이 방법에 대한 다른 구현예에서, 생활성 조성물은 국소적으로 허용가능한 담체 (본원에 기술된 바와 같은 적정 예들)를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 포유류의 피부 조직에서 피부 장애를 정상화하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 본 발명의 생활성 조성물을 제공하는 단계를 포함한다. 이 방법은 또한 피부 조직에서 세포 장애를 정상화하는데 효과적인 양으로 생활성 조성물을 피부 조직에 적용하는 단계를 포함한다. 이 방법에 대한 일 구현예에서, 생활성 조성물은 안정화제 (본원에 기술된 바와 같은 적정 예들)를 더 포함할 수 있다. 이 방법에 대한 다른 구현예에서, 생활성 조성물은 국소적으로 허용가능한 담체 (본원에 기술된 바와 같은 적정 예들)를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 차나무과 식물의 세포즙으로부터 유래된 생활성 분획을 분리하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 차나무과 식물을 (예로, 프레쉬 바이오매스의 형태로) 제공하는 단계를 포함한다. 이러한 방법에 사용하기 적합한 차나무과 식물은 본원에서 전술한 바와 같다. 차나무과 식물 (예로, 프레쉬 바이오매스)을 이후 세포즙과 세포벽 성분으로 분리한다. 그런 후, 생활성 분획을 수득하는데 유효한 조건 하에 세포즙을 가공 처리한다. 적합한 생활성 분획은, 비제한적인 예로, 막 분획, 막 분획 추출물, 세포질 분획, 세포질 분획의 추출물 및/또는 세포즙 세럼을 포함한다. 그런 후, 생활성 분획을 처리된 세포즙으로부터 분리한다. 일 구현예에서, 이러한 방법에 의해 제조되는 다양한 적합한 생활성 분획은 본원에 기술된 바와 같다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 의해 제조되는 분리된 생활성 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 차나무과 식물의 세포벽 성분으로부터 유래된 생활성 분획을 분리하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 차나무과 식물을 (예로, 프레쉬 바이오매스의 형태로) 제공하는 단계를 포함한다. 차나무과 식물 (예로, 프레쉬 바이오매스)을 이후 세포즙과 세포벽 성분으로 분리한다. 생활성 분획을 수득하는데 유효한 조건 하에 세포벽 성분을 가공 처리한다. 그런 후, 생활성 분획을 처리된 세포벽 성분으로부터 분리한다. 일 구현예에서, 이러한 방법에 의해 제조되는 다양한 적합한 생활성 분획은 본원에 기술된 바와 같다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 의해 제조되는 분리된 생활성 조성물에 관한 것이다.
예를 들어, (본원에 전술된 바와 같은) 본 발명의 생활성 분획을 제조하는 전체 과정은 도 1에 개략적으로 도시된다. 처리 단계들에 대한 상세한 내용은 (아래) 실시예들에 추가로 기술된다. 도 1에 도시된 바와 같이, 차나무과 식물의 프레쉬 바이오매스 10 (예로, 프레쉬 식물 바이오매스)를, 견고한 세포벽을 파괴하는데 효과적인 조건에서 분쇄, 연화 (maceration) 및 압착하여, 식물 세포즙 30과 세포벽 32을 수득한다. 또한, 프레쉬 바이오매스 10를 통상적인 차 가공 22에 사용하여, 비교 검사 및 평가를 위한 양성 대조군 150을 제조한다. 세포즙 30에 응집 (coagulation) 40 (예, 마이크로웨이브 처리) 처리하여, 프레쉬 식물 바이오매스 10의 막 분획 성분들의 정량적인 응집을 달성한다. 응집 40은 응집된 막 분획을 세포즙 30의 다른 비-응집성 성분들로부터 이후 분리할 수 있을 만큼 충분하다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 이러한 분리의 일 구현예는 냉각 및 원심분리 42에 의해 달성되어, 막 분획 (석출물) 50과 엽록소 및 인지질 등의 특이적인 엽록체 막 성분이 없는 상층액 60을 수득할 수 있다.
세포벽 분획 추출물 (즉, 조성물 110)을 제조하기 위해, 세포벽 32을 건조 34 (예로, 몇가지 추속적인 마이크로웨이브 처리)한 다음 통상적인 차 제조에 일반적으로 사용되는 조건 하에 건조된 물질을 물 36과 혼합 (예, 85℃에서 수중 혼합)한다.
막 분획 추출물 (즉, 조성물 B 120)을 제조하기 위해, 막 분획 50을 용매 52와 혼합한 다음 원심분리 54하여, 상층액 56과 조성물 B 120를 수득한다.
세포질 분획의 추출물 (즉, 조성물 C 130)을 제조하기 위해, 상층액 60을 응집 62 (예로, 등전위 석출)시켜 원심분리 64하여, 대부분의 용해성 세포질 단백질이 함유된 세포질 분획 (침전물) 70을 수득한다. 그런 후, 세포질 분획 (침전물) 70을 용매 72와 혼합한 다음 원심분리 74하여 상층액 76과 이후 조성물 C 130를 수득한다.
세포즙 세럼 (즉, 조성물 D 140)을 제조하기 위해, 상층액 60을 응집 62 (예로, 등전위 석출)시켜 원심분리 64하여, 세포즙 세럼 (상층액) 66과 이후 조성물 D 140을 수득한다.
프레쉬 바이오매스 10에 대해 통례적인 차 가공법 22을 적용하여, 예를 들어 (예를 들어 백차, 녹차, 우롱차 및 홍차 등의 다양한 차의) 양성 대조군 150을 제조한다.
조성물 110, 조성물 B 120, 조성물 C 130, 조성물 D 140 및 양성 대조건 150은 이후 여과 및 테스트 80에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 생활성 조성물의 저분자량의 환원된, 비-산화된 성분들을 액체로 선택적으로 분산시키는 디바이스에 관한 것이다. 일 구현예에서, 이 디바이스는 본 발명의 생활성 조성물을 포함한다. 생활성 조성물은 여과용 파우치 안에 들어있을 수 있다. 적합한 여과용 파우치는 생활성 조성물의 저분자량의 환원된 비-산화된 성분을 액체로 선택적으로 분산시키는데 효과적인 것일 수 있다. 일 구현예에서, 파우치는 파우치 안에 든 생활성 조성물의 저분자량의 환원된, 비-산화된 성분들을 액체로 분산시킬 수 있는 선택 막을 포함하나, 막은 파우치 안의 고분자량의 산화된 성분이 액체로 분산되지 않게 한다. 본원에서, 용어 "저분자량의 환원된, 비-산화된 성분"은 약 5,000 달톤 이하인, 본 발명의 생활성 조성물의 성분들이다. 이 방법에 대한 일 구현예에서, 생활성 조성물은 안정화제 (본원에 기술된 바와 같은 적정 예들)를 더 포함할 수 있다. 이 방법에 대한 다른 구현예에서, 생활성 조성물은 국소적으로 허용가능한 담체 (본원에 기술된 바와 같은 적정 예들)를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 저분자량의 환원된, 비-산화된 생활성 조성물을 포함하는 치료학적 음료의 제조 방법에 관한 것이다. 이 방법은 본 발명에 따라 제조되는 디바이스를 제공하는 단계를 포함한다. 이 디바이스는 생활성 조성물의 저분자량의 환원된, 비-산화된 성분이 액체로 분산되게 하는 유효한 조건 하에 액체와 접촉된다. 이 방법에 대한 일 구현예에서, 생활성 조성물은 안정화제 (본원에 기술된 바와 같은 적정 예들)를 더 포함할 수 있다. 이 방법에 대한 다른 구현예에서, 생활성 조성물은 국소적으로 허용가능한 담체 (본원에 기술된 바와 같은 적정 예들)를 더 포함할 수 있다. 이 방법에 사용하기 적합한 액체로는 비제한적인 예로 물을 포함할 수 있다. 물은 뜨겁거나 차가울 수 있다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 따라 제조되는 치료학적 음료에 관한 것이다.
실시예
실시예 1
카멜리아 시넨시스( Camellia sinensis ) 식물로부터 유래된 생활성 조성물의 제조.
본 발명의 생활성 조성물을 제조하는 방법에 대한 일 구현예는 개략적으로 도 1에 도시된다. 이하 본 발명의 방법에 대한 일 구현예의 관련 측면들을 기술한다.
바이오매스의 준비. 신선한 동백나무속 (카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)) 식물 바이오매스를 충분한 양으로 수확하여, 건조 중량으로 약 100 kg을 수득하였다. 프레쉬 바이오매스의 건조물 (dry matter) 수준은 21.70%인 것으로 계산되었으며, 이는 건조물 100 kg을 수득하기 위해서는 신선한 식물 바이오매스를 약 461 kg 수확하여야 한다. 식물 바이오매스의 고유한 함습량을 유지하고, 수분 소실로 인한 시듦을 방지하기 위해, 주의를 기울였다. 수확은, 페놀-옥시다제와 퍼옥시다제에 의해 촉매화되는 내인성 효소 반응을 촉발시키는 잎 세포의 구조 파괴를 피하기 위해, 채집되는 바이오매스의 세절 (chopping), 짓이김 (mashing) 및 파손 (crushing)을 방지하거나 최소화하는 방식으로 수행하였다. 이러한 반응들은 산화 시 강해지기 때문에, 모든 단계들은 가능한 단시간 내에 완료하여야 한다. 예를 들어, 수확한 바이오매스는 자른 후 10분 이내에 가공을 위해 이송되었다. 이는 태양, 고온 및 그외 부정적인 환경 인자에 식물 바이오매스가 노출되는 것으로 최소화하기 위해 행하였다. 세척 단계를 수행하여, 추가로 가공하기 전에, 흙 입자와 기타 찌꺼기들을 식물로부터 제거하였다. 세척은 ≤1 kg/cm2 수압 하에 ≤5분 동안 채집한 식물을 세척함으로써, 달성되었다. 세척한 잔류수에는 임의의 녹색 또는 갈색 색소가 함유되어 있지 않았으며, 이는 수압과 세척 시간이 적절하다는 것을 의미한다. 세척한 식물 바이오매스로부터 과잉의 물을 제거하였다.
식물 바이오매스의 분쇄, 연화 및 압착. 식물 바이오매스를 수확, 채집 및 세척한 후, 식물은 분쇄, 연화 및 압착 과정을 거쳐, 세포내 내용물 (즉, 식물 세포즙)을 추출하고, 섬유질-농화된 세포벽 분획 (세포벽 분획)으로부터 이를 분리하였다. 10 HP 엔진을 구비한 해머 밀 (Model VS 35, Vincent Corporation, Fla.)과 스크린 세트를 사용하여, 바이오매스를 분쇄하여, 바이오매스의 온도를 현저하게 증가시키지 않으면서 최단 시간에 적절하게 작은 크기의 식물 조직 입자를 제조하였다. 해머 밀은, 처리 ≤10초 동안 연화된 식물 입자가 최대 크기 ≤0.5가 되도록 설정되었다. 바이오매스 온도는 단지 ≤5℃ 상승하였다. 수평 연속 나선형 프레스 (Compact Press "CP-6", Vincent Corporation, Fla.)를 즉각적으로 사용하여, 식물로부터 식물 세포즙을 추출하였다. 나선형 프레스의 콘에 가해지는 압력은 24 kg/cm2의 수준으로 유지하였으며, 스크류 속도는 12 rpm이며, 온도 증가는 ≤5℃에 불과하였다. 이러한 처리를 통해, 건조물 비율이 41.39%인 세포벽 분획 185 kg과, 건조물 비율이 8.49%인 식물 세포즙 276 kg을 수득하였다.
세포벽 분획 추출물 (조성물 A)의 제조. 초기 건조물 수준이 41.39%인 세포벽 분획의 분액을 마이크로웨이브 후드 컴비네이션 (Model GH9115XE, Whirlpool)에서 30초간 건조한 후, 30초간 냉각시켰다. 이러한 처리는, 세포벽 분획의 건조물 수준이 96.52%가 될 때까지 수차례 반복하였다. 85℃의 탈이온수 66.01을 세포벽 분획 건조물 4.0 kg에 첨가하여, 5분간 고속 혼합하면서 교반하였다. 이 조건은 D'Amelio, F. S., Botanicals. Phytocosmetic Desk Reference, Boca Raton, London, New York, Washington, D.C.: CRC Press, p. 361 (1999)에 기술된, 차 제조 절차와 일치되며, 상기 문헌은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다 (또한, www.leaftea.com; www.divinitea.com; www.equatorcoffee.com에서 고찰을 참조하며, 이들은 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 혼합물을 나일론 패브릭 4겹을 통해 여과한 다음, 0.8 ㎛의 다공성 필터를 통해 여과하였다. 수득되는 세포벽 추출물의 pH는 5.24였으며, 건조물 수준은 0.84%였다. 이 추출물은 이후 활성 검사에 사용되었다.
세포즙으로부터 막 분획 분리. 소형 섬유질 입자가 함유된 건조물 수준이 8.49%인 초기 식물 세포즙을, 4겹의 나일론 패브릭을 통해 여과하거나, 또는 저속 원심분리 바이오매스를 이용하여 여과하였다. 여과된 식물 세포즙을 온도 프로브 컨트롤을 이용하여 마이크로웨이브 처리에 노출시켰다. 이 처리는 세포즙의 온도가 60℃에 도달할 때까지 계속하였다. 일단 응집이 유도되면, 처리된 세포즙을 즉시 40℃로 냉각시켰다. 응집된 세포즙으로부터 막 분획의 분리는 20분 이상 동안 3,000 g 이상에서 원심분리를 이용하여 달성하였다. 이로써, 막 분획 (침전물)과, 세포질 분획화 세포 세럼 분획 (즉, 저분자량의 용해성 성분)이 함유된 세포즙 상층액을 수득하였다. 건조물 수준이 32.89%인 막 분획은 막-유래 생활성 조성물의 추출물 제조에 사용하였다. 세포즙 상층액은 추가로 가공하여, 세포질 분획과 세포즙 세럼을 수득하였다.
막 분획 추출물 (조성물 B)의 제조. 막 분획 (10.0 kg)과 다이메틸 설폭사이드-(20.0 kg)를 1:2로 1시간 동안 실온에서 계속 교반하면서 혼합하였다. 그런 후, 물질을 45분 이상 동안 4,000 g 이상으로 원심분리하였다. 침전물은 버리고, 상층액을 0.8 ㎛ 다공성 필터를 통해 여과하였다. 건조물 수준이 6.83%인 여과물 - 막 분획 추출물 (조성물 B)은 추가적인 활성 검사에 사용하였다.
세포즙 상층액으로부터 세포질 분획 분리. 세포질 분획을 분리해내기 위해, 세포즙 상층액에 대해 등전위 석출을 수행하였다. 세포질 분획의 석출은 세포즙 상층액의 pH를 4.0으로 만들기 위해 5.0 N 염산 (HCl)을 이용한 타이트레이션 방법을 사용해, 유도하였다. 건조물 수준이 14.5%인 석출된 세포질 분획의 상층액으로부터의 분리는 20분 이상 동안의 3,000 g 이상에서의 원심분리에 의해 달성하였다.
세포질 분획 (조성물 C)의 추출물 제조. 세포질 분획 (10.0 kg)과 다이메틸 설폭사이드-(20.0 kg)를 1:2로 1시간 동안 실온에서 계속 교반하면서 혼합하였다. 그런 후, 물질을 45분 이상 동안 4,000 g 이상으로 원심분리하였다. 침전물은 버리고, 상층액을 0.8 ㎛ 다공성 필터를 통해 여과하였다. 건조물 수준이 3.50%인 여과물 - 세포질 분획의 추출물 (조성물 C)은 추가적인 활성 검사에 사용할 수 있다.
세포즙 세럼 (조성물 D)의 제조. 세포질 분획을 분리한 후, 상층액에는 현탁된 입자들이 함유되어 있었다. 이들 입자를 분리하기 위해, 상층액을 30분 이상 7,500 g 이상에서 원심분리하였다. 투명한 상층액 - 세포즙 세럼을 0.8 ㎛ 다공성 필터로 여과하였다. 건조물 수준이 5.69%인 이 여과물 (조성물 D)은 이의 활성에 대한 추가적인 검사에 사용하였다.
통상적인 차 추출물-대조군의 제조. 조성물, A, B, C 및 D의 제조에 사용된 동일 lot의 프레쉬 동백나무속 식물의 잎을 사용하여, 통상적인 백차와 홍차를 만들었다.
하기 절차를 이용하여 백차를 제조하였다. 건조물이 21.70%인 프레쉬 바이오매스를 20초간 끓는 물에 넣어, 내인성 효소-페놀-옥시다제와 퍼옥시다제를 불활화하였다. 이러는 동안, 잎은 나일론 스크린 백 안에 두었다. 그런 후, 처리된 잎을 30초간 마이크로웨이브로 건조시키고, 30초간 냉각시켰다. 이러한 처리는 바이오매스의 건조물 수준이 93.74%에 도달할 때까지 수차례 반복하였다. 그런 다음, 85℃의 탈이온수 66.01을 건조 잎 4.0 kg에 첨가하고, 5분간 고속 혼합하면서 교반하였다. 이 조건은 D'Amelio, F. S., Botanicals. Phytocosmetic Desk Reference, Boca Raton, London, New York, Washington, D.C.: CRC Press, p. 361 (1999)에 기술된 차 제조 공정과 일치하며, 이 문헌은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다 (www.leaftea.com; www.divinitea.com; 및 www.equatorcoffee.com에서 고찰을 참조하며, 이들 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 혼합물을 4겹의 나일론 패브릭을 통해 여과한 다음 0.8 ㎛ 다공성 필터를 통해 여과하였다. 수득되는 세포벽 분획 추출물의 pH는 5.52였으며, 건조물 수준은 1.10%였다. 이 추출물은 활성 검사에 이후 사용하였다.
하기 절차를 이용하여 홍차를 제조하였다. 건조물 21.70%를 포함하는 프레쉬 바이오매스를, 건조물 수준이 35%에 도달할 때까지 주기적인 (1시간 "진행" 및 1시간 "중단") 통기를 수행하면서, 25℃에서 유지시켰다. 그런 후, 잎을 2-3 mm 크기의 입자로 분쇄 (파쇄)하였다. 이 과정은 바이오매스의 온도를 약 30℃까지 상승시킨다. 분쇄된 바이오매스는 25℃에서 90분간 발효 (산화)시키기 위해 플라스틱 컨베이어 벨트 상에서 층 (2 high) 형태로 두었다. 발효된 바이오매스는 후천적으로 갈색이 되었으며, 이를 130℃에서 30분간 건조시켜, 건조물 수준 97.5%에 도달하였다. 그런 후, 85℃의 탈이온수 66.01을 건조 잎 4.0 kg에 첨가하고, 5분간 고속 혼합하면서 교반하였다. 이 조건은 D'Amelio, F. S., Botanicals. Phytocosmetic Desk Reference, Boca Raton, London, New York, Washington, D.C.: CRC Press, p. 361 (1999)에 기술된 차 제조 공정과 일치하며, 이 문헌은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다 (www.leaftea.com; www.divinitea.com; 및 www.equatorcoffee.com에서 고찰을 참조하며, 이들 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 혼합물을 4겹의 나일론 패브릭을 통해 여과한 다음 0.8 ㎛ 다공성 필터를 통해 여과하였다. 수득되는 세포벽 분획 추출물의 pH는 4.96이었으며, 건조물 수준은 1.38%였다. 이 추출물은 활성 검사에 이후 사용하였다.
실시예 2
카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) , 카멜리아 자포니카(Camellia japonica) , 카멜리아 레티쿨레이트(Camellia reticulate) , 카멜리아 사산쿠아(Camellia sasanqua) 및 유리아 샌드위센시스(Eurya sandwicensis)로부터 생활성 조성물 제조에 있어, 건조물의 분포
생활성 조성물의 제조 과정에서 수집되는 다양한 분획들을 건조물 분포에 대해 분석 및 비교하였다. 표 1은 차 식물들의 분획화 생성물들에서 100 kg 건조물의 분포를 보여준다. 본 발명의 방법은 초기 바이오매스 건조물의 약 20 - 30 kg의 범위로 식물 세포즙으로의 추출되는 산물의 전환 (extracted yield conversion)을 허용할 수 있는 것으로 확인되었다. 막 분획의 건조물 수율은 초기 바이오매스 건조물의 5% - 10% 범위였으며, 세포즙 건조물의 25% - 35% 범위였다. 표 1은, 세포질 분획의 건조물 수율이 초기 바이오매스 건조물의 1.0%를 넘지 않으며, 세포즙 상층액 건조물의 2.5%이라는 것을 보여준다. 세포즙 상층액의 건조물 대부분은 세포즙 세럼에 농축되었다. 세포벽 분획, 막 분획 및 세포질 분획은 생활성 조성물로서 분류되는, 이의 추출물 제조용 소스로서 사용되었다. 세포즙 세럼은 외인성 용매가 포함되지 않은 이후의 생활성 조성물로서 "그대로" 바로 사용하였다.
표 1 - 프레쉬 바이오매스의 분획 산물들에서의 100 kg 건조물 분포
산물
 식물 소스
카멜리아 시넨시스
초기 바이오매스 100.0
세포벽 분획 76.6
세포즙 23.4
막 분획 6.5
세포질 분획 0.6
세포즙 세럼 16.3
선택된 3종의 물질이, 프레쉬 식물 조직에 존재하는, 모든 기능성 구조물들 중에서 가장 다변화된 것을 나타낸다는 점에 주목하여야 한다. 용해성 세포즙 세럼만 물리-화학적 특성들을 가지고 있어, 통상적으로 사용되는 시험관내 검사 시스템에 직접 투여가 가능하다. 세포벽 분획, 막 분획 및 세포질 분획은 용매로 추출하기 위한 원료로서 사용하였다. 세포벽 분획은 구조적으로는 통상적인 차 식물 생성물과 비슷하기 때문에, 이 분획은 물로 추출하여, 통상적인 차와 최선으로 비교할 수 있도록 하였다. 막 분획은, 엽록체와 미토콘드리아 구조체에 병합되어 있는 소수성 물질과 친수성 물질 둘다를 효과적으로 용해시키는 것을 촉진하는, 다이메틸 설폭사이드로 추출하였다. 세포질 분획은 물로 추출하였다. 세포즙 세럼은 "그대로" 사용하였다.
표 2는 검사한 4종의 생활성 조성물들의 수율을 보여준다: 초기 바이오매스 건조물 100 kg으로부터 추출된, 세포벽 분획 추출물 (조성물 A), 막 분획 추출물 (조성물 B), 세포질 분획의 추출물 (조성물 C), 세포즙 세럼 (조성물 D) 및 대조군들 - 백차 추출물 또는 홍차 추출물.
표 2 - 초기 바이오매스 100 kg으로부터의 생활성 조성물들의 수율
생성물 식물 소스
카멜리아 시넨시스
초기 바이오매스 100.0
조성물 A (세포벽 분획 추출물) 14.35
조성물 B (막 분획 추출물) 2.37
조성물 C (세포질 분획의 추출물) 0.2
조성물 D (세포즙 세럼) 16.3
대조군 (백차 추출물 또는 홍차 추출물) 15.14...19.36
표 2는 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) 건조물 100 kg으로부터 유래된 생활성 조성물들 A, B, C 및 D의 총 수율이 33.3%이며, 이는 통상적인 차가공 수율인 15.14 . . . 19.36% 보다 현저하게 높다는 것을 보여준다.
실시예 3
조성물 A (세포벽 분획 추출물)와 통상적인 차 추출물의 비교
프레쉬 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)의 동일 배치로부터 수득한, 생활성 조성물과 통상적인 백차 및 홍차 추출물들의 다양한 파라미터를 측정하였으며, 그 결과를 표 3에 나타낸다 (사용된 실험 방법은 실시예 9 및 10과, 미국 특허 공개번호 2003/0175235에 기술되어 있으며, 상기 미국 특허는 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨).
표 3 - 생활성 조성물 A와 백차 및 홍차 추출물의 다양한 파라미터들
파라미터 세포벽 분획의 추출물(조성물 A) 대조군
백차 추출물 홍차 추출물
건조물, % 0.84 1.10 1.38
pH 5.24 5.52 4.96
전도성, mS/cm 1.57 2.23 5.32
총 가용 고형분, g/L 0.78 1.23 2.71
산화환원 전위, mV 123 159 188
스펙트럼 곡선 하 면적 (ASC) 200-450 nm, Abs·nm 5.727 6.604 4.616
ASC: 건조물 6.818 6.004 3.345
슈퍼옥사이드 포획 활성 (ICR50), ㎍ DM/ml 26.3 114.5 227.1
색상 (1...10 범위) 9.6 4.7 7.5
향 (1...10 범위) 9.3 6.1 6.6
입에 닿는 느낌 (1...10 범위) 9.4 6.5 5.3
표 3은, 세포벽 분획 추출물이 건조물, 전해질 및 가용 고형분의 수준이 통상적인 백차 및 홍차 추출물에 비해 낮다는 것을 보여준다. UV/VIS 스펙트럼 데이타는, 세포벽 분획 추출물이 최대 특정 치의 스펙트럼 곡선 하 면적을 가지며, 즉, 이러한 특정 동백나무속 산물 (조성물 A)가 건조물 단위 당 최고치의 광학 활성 성분을 가진다는 것을 보여준다. 아울러, 세포벽 분획 추출물은 산화환원 전위 수준이 낮았는데, 이는 이 조성물은 통상적인 백차 및 홍차 추출물에 비해 산화가 덜 되었다는 것을 의미한다. 세포벽 분획 추출물은 슈퍼옥사이드 포획 활성을 나타내었으며, 사이토크롬 C 환원의 50% 저해 (ICR50)는 백차 및 홍차 추출물 보다 훨씬 낮은 농도를 나타내었다. 정성적인 분석 ("QDA", Qualitative Descriptive Analysis) 검사법을 선택하여, 색, 향 및 입에 닿는 느낌을 토대로 차를 체계적으로 특정화하고 수치화함으로써, 차 음료의 허용성을 결정하였다. QDA 방법은 규정된 기준 표준과 비교하여 차 음료의 상기한 특성을 판단하기 위해 전문 맛 감정인들로 구성된 훈련된 패널을 이용한다. 차의 색, 향 및 입에 닿는 느낌에 대한 비교 평가에 따르면, 세포벽 분획 추출물은 통상적인 차들에 비해 동일한 특징에 대해 현저히 우수한 것으로 나타났다.
따라서, 어떠한 발효 (산화) 및 열처리없이 프레쉬 동백나무속 바이오매스로부터 수득한, 세포벽 분획은, 다른 모든 차들과는 구별된다 (Wilson et al., eds., Tea: Cultivation to Consumption, London: Chapman Hall (1992), 이는 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨). 아울러, 동백나무속 식물의 주 효소 (페놀-옥시다제와 퍼옥시다제)는 늘 통상적인 차에 잔류한다. 그 대신, 본 발명은 동백나무속 생잎을 세포벽 분획과 이들 효소가 농화되는 세포즙으로 분리하는 것을 포함하므로, 따라서 세포벽 분획은 내인성 페놀-옥시다제와 퍼옥시다제를 함유하지 않는다. 따라서, 세포벽 분획은 백차, 녹차, 우롱차 및 백차와 비교해 기본적인 차이가 있는 새로운 차 카테고리로 분류되어야 한다. 이러한 새로운 세포벽 분획 차는 자유로운 형태 (loose form) 또는 백 형태나, 또는 다른 형태로 사용되어, 광범위한 드링크, 음료 및 건강보조제 및 기능성 식품에 대한 첨가제로 제조할 수 있다.
실시예 4
여러가지 용도를 위한 생활성 조성물의 제조
모든 생활성 조성물들은 전신 또는 국소 투여용의 다양한 제형으로 병합되는 용액제, 현탁제, 분산제, 경고제 또는 산제로서 사용될 수 있다. 조성물의 용해된 형태는 0.2 ㎛ 다공성의 필터를 통해 여과하여, 완전히 용해되지 않은 작은 입자와 내인성 미생물을 완전히 제거할 수 있다. 멸균 여과 전과 후의 생활성 조성물의 건조물 수준을 표 4에 나타낸다.
표 4 - 멸균 여과 전 (분자) 및 여과 후 (분모) 생활성 조성물내 건조물 수준
생성물 식물 소스
카멜리아 시넨시스
조성물 A
(세포벽 분획 추출물)		 0.84
0.72
조성물 B
(막 분획 추출물)		 6.83
6.12
조성물 D
(세포즙 세럼)		 5.69
5.59
대조군
(백차 추출물)		 1.10
1.03
표 4는, 모든 생활성 조성물들에서 건조물 수준이 멸균 여과 후 감소됨을 보여준다. 그러나, 이러한 감소는 이들의 생활성의 소실 또는 현저한 감소를 유발하진 않았으며, 2-14% 범위였다. 따라서, 조성물의 대부분은 용해성 생활성 성분들이다.
동백나무속 식물의 생잎에는 상대적으로 저분자량 (환원됨, 비-산회된) 성분들이 함유되어 있다. 통상적인 차 제조 공정에서의 산화 및 중합 공정의 결과로서, 전술한 유효 성분들은 상대적으로 활성이 낮은 고분자량 물질의 일부분으로 변환된다.
본 발명의 생활성 조성물은 발효 (산화)와 과도한 열 처리 없이 수득된다. 그래서, 프레쉬 식물의 활성의 비가역적인 감소가 방지되며, 따라서 예를 들어 새로운 티백 또는 유사 전달 시스템을 이용하여 최대 효능을 전달할 수 있다. 큰 구멍을 통해 수용성 차 성분들이 모두 주변 물로 이동할 수 있는 통상적인 페이퍼 티백 대신에, 새로운 티백은 반-투과성 막으로 제조된다. 이 티백은 안에 생활성 조성물을 담고 있으며, 특정 막 컷오프 (예, 5,000 달톤) 미만의 분자량을 가진 성분만 주변 수 상으로 통과시킬 수 있다. 고분자량의 성분들은 백 안에 남게 되어, 음료에 포함되지 않는다.
따라서, 생활성 조성물에서 특정 수치 보다 분자량이 높은 산화된 성분들은 모두 백 안에 남게 되므로, 특정 수치 보다 높은 분자량을 가진 성분의 컷 오프로 산화된 성분이 없는 음료를 제조할 수 있다. 새로운 티백 디자인은 투석 막 튜브를 이용하는 피라미드형 티백 구조를 기본으로 할 수 있다. 또한, 새로운 티백 디자인은 내부에 생활성 조성물이 든 얇은 플라스틱 프레임과 반투과성 막으로 제조된 2개의 투명 표면을 포함할 수 있다. 구체적인 막 컷 오프 값의 선택은 생활성 조성물의 타입에 의해 결정되지만, 일반적으로 산화환원 전위가 낮은 조성물의 건조물을 더 높은 %로 주변 수상으로 방출 시킬 수 있는 더 높은 컷 오프가 바람직하다.
실시예 5
세포즙 세럼으로부터 유래되는 국소 성분 SF의 제조
세포즙 세럼 (조성물 D)은 안정성 부족 및 색과 냄새 퇴화로 인해 국소 생성물의 활성 성분으로서 사용할 수 없다. 기술된 절차로 세포즙 세럼 분획을 정제하여, 안정하고 활성인 국소 성분 SF를 수득할 수 있다 (이러한 절차는 미국 특허 2003/0175235에 기술된 바와 유사함, 이는 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨). 세포즙 세럼의 정제는 다음과 같은 단계를 수반한다: 열 처리, 냉각, 여과 및 안정화. 정제는 실시예 1에 기술된 바와 같이 세포질 분획으로부터 세포즙 세럼을 분리한 직후 수행하였다. 세포즙 세럼을 온도 프로브 컨트롤을 이용하여 마이크로웨이브 처리에 노출시켰다. 이런 처리는, 세포즙 세럼의 온도가 99℃에 도달할 때까지 계속하였다. (미국 특허 공개번호 2003/0175235에 언급된 바와 같이 90℃가 필요하였음, 이는 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨). 응집이 유발되면, 처리된 세포즙 세럼을 즉시 10℃로 냉각시켰다. 응집된 세포즙 세럼을 0.8 ㎛ 다공성 필터를 통해 여과하였다 (미국 특허출원 공개번호 2003/0175235에서는 Whatman No. 2의 이중 층 필터가 사용되었음, 이는 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨). 석출물은 버리고, 수득되는 세포즙 세럼 여과물은 이후 공정 (즉, 안정화)에 사용하였다. 세포즙 세럼 여과물의 안정화는 보존제 (미국 특허출원 공개번호 2003/0175235에 언급된 바와 같이, 외인성 항산화제는 필요없었음, 이는 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨)를 첨가하여, 완전히 용해될 때까지 인큐베이션함으로써, 달성하였다. 사용된 보존제는 다음과 같다: 0.1% 포타슘 소르베이트, 0.1% 소듐 벤조에이트, 0.1% 소듐 메틸 파라벤 및 0.1% 시트르산. 이러한 제조를 통해, 국소 성분 SF의 건조물 수율 16.3 kg (또는 약 286 L)이 달성되었으며, 이는 물리화학적 특성과 생활성 특성 파악에 사용하였다. 국소 성분 SF의 권고되는 보관 조건은 15℃ - 25℃의 온도에서 광 차단된 밀폐된 용기에서의 보관이다.
실시예 6
세포즙 세럼 분획으로부터 유래되는 국소 성분 SF의 제품 사양
국소 성분 SF는 실시예 5에 전술한 공정에 따라 제조하였다. 이의 다양한 물리-화학적 특성, 미생물 특서, 세포독성 및 생활성 특징을 측정하기 위해, 후술한 바와 같이, 국소 성분 SF의 분석을 수행하였다. 국소 성분 SF는 투명 액체로서, 밝은 노란-갈색을 띄며, 광-특유 냄새를 가진다. 담체 매질에 용매 (즉, 글리콜, 오일 또는 물)를 첨가하지 않았다. 표 5는 국소 성분 SH의 물리 및 화학적 데이타를 요약 개시한다.
표 5 - 국소 성분 SF의 물리 및 화학적 파라미터
파라미터 방법 결과
고형분 함량, % 실시예 20 참조, "방법 1" 5.04
비중, g/cm3 USP<841> 1.015
색 Gardner scale 5 - 6
굴절 지수 USP<831> 1.312
pH USP<791> 4.0
산화환원 전위, mV 참조[1] 75
전도성, S/m 참조[2] 1.02
참조: [1] Handbook of Chemistry and Physics, 80th Edition, CRC Press, 1999-2000, 5-90; [2] Handbook of Chemistry and Physics, 80th Edition, CRC Press, 1999-2000, 8-21, 이들 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨.
표 6은 국소 성분 SF에 대한 UV-스펙트럼 데이타를 표시한다.
표 6 - 국소 성분 SF (1:500 희석)의 UV 스펙트럼
피크 파라미터 방법 결과
#1 출발, nm USP<197> 450
정점, nm -"- 266.5
종료, nm -"- 247
높이, Abs -"- 0.231
면적, Abs x nm -"- 13.676
#2 출발, nm USP<197> 247
정점, nm -"- 204
종료, nm -"- 200
높이, Abs -"- 1.396
면적, Abs x nm -"- 32.413
하기 절차 (USP<61>에 따라 수행된 미생물 분석에서, 국소 성분 SF는 샘플 g 당 콜로니 형성 단위가 100 미만이며, 병원체 (에셰리키아 콜라이 (E. coli), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 슈도모나스 sp. (Pseudomonas sp.) 및 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus))가 없는 것으로 확인되었다. 이 데이타에 따르면, 국소 성분 SF는 국소 제품의 상업적인 성분 요건을 충족시킨다.
국소 성분 SF는 광 차단된 밀폐된 용기에서 15 - 25℃에서 보관하는 동안 적어도 12-18개월간 안정적인 것으로 (즉, 물리적 및 화학적 완전성 유지) 확인되었다. 국소 성분 SF는 생분해성 산물이다. 통제된 임상 평가에서, 국소 성분은 생물 활성을 나타내었으며, 이를 표 7에 요약 기술한다.
표 7 - 국소 성분 SF의 생물 활성
활성 방법 ㎍ DM/ml
슈퍼옥사이드 포획 활성 (ICR50) 실시예 20 참조, "방법 7" 69.5
엘라스타제 저해 (IC50) 실시예 20 참조, "방법 5" 32.3
MMP-9 저해 (IC50) 실시예 20 참조, "방법 6" 14.6
트립신 저해 (IC50) 참조 [1] 7.8
참조: [1] Cannel et al., Planta Medica 54:10-14 (1988), 이 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨.
표 7은, 국소 성분 SF가 슈퍼옥사이드 포착 활성을 나타냄을 보여준다. 통제된 임상 평가에서, 국소 성분 SF는 ml 당 건조물 69.5 ㎍의 농도에서 사이토크롬 C 환원을 50% 저해 (ICR50)하는 것으로 나타났다. 양성 대조군 (로즈마린산)의 ICR50은 26.5 ㎍/ml이다. 국소 성분 SF는, 항산화성 외에도, 펩타이드 하이드롤라네, 예컨대 엘라스타제, 젤라티나제 B 또는 소위 매트릭스 메탈로프로테나제 9 (MMP-9) 및 트립신에 대해 항-단백질 분해 활성을 나타내었다. 이들 효소 중에서도, 독특한 포지션은 엘라스타제와 MMP-9에 속하며, 상승적으로 작용하여 피부 염증에 대해 매우 중요한 역할을 수행한다. MMP-9와 엘라스타제 둘다 백색 혈액 세포 (호중구)에 의해 분비되며, 이들 효소는 염증을 유발하는 최종 경로의 주요 효소임에 주목하여야 한다. 일반적으로, 조제물이 효소 (엘라스타제 및 MMP-9) 둘다를 저해할 수 있다면, 이 조제물은 염증성 프로세스에 매우 효과적인 것으로 간주되는 것이 일반 통념이다.
피부 노화 과정, 일광화상, 상처 및 흉터는 MMP-9와 엘라스타제가 관여하는 매우 유사한 염증 기전을 가지고 있음에 주목하여야 한다. 즉, 이들 효소를 모두 저해할 수 있는 국소 성분 SF는 특히 다음과 같은 이유로 염증성 상해에 매우 넓은 용도를 가진다:
a. 이들 2가지 효소는 상승적으로 작용하여, 인간 조직의 세포외 기질의 성분들을 모두 분해할 수 있음;
b. 엘라스타제는 MMP-9에 대한 신체 자신의 저해 방어 기전을 불활성화할 수 있음;
c. MMP-9은 엘라스타제에 대한 신체 자신의 저해 방어 기전을 불활성화할 수 있음.
국소 성분 SF의 항염증 특성과 항산화 특성의 겸비는, 생활성 조성물 D를 기재로 한 친수성 조제물이 매우 근원적인 피부 장애 문제에 전신적으로 작용할 수 있다는 것을 시사해준다.
실시예 7
막 분회으로부터 유래되는 국소 성분 MF의 제조
갓 수득한 막 분획은 강한 색상과 특이한 향을 가진 페이스트이다. 이 분획에는 주로 엽록체가 존재하며, 이의 조성은 대개 인지질, 막 단백질, 엽록소 및 카로테노이드를 포함한다. 막 분획을 건조시키면, 국소 성분으로서 막 분획을 이용하는데 필요한 다수의 유용한 특징들이 비가역적으로 상실된다. 건조하지 않은 경우, 불안정한 막 분획은, 강하지만 특유의 냄새가 없는, 진한 색상의 비-분산성의 불용성 덩어리로 빠르게 변환된다. 그 결과, 이들 물질은 국소 성분으로서 사용할 수 없다. 후술한 공정은 갓 수득한 막 분획을 안정적이고 활성인 국소 성분으로 변환시킬 수 있다 (이 공정은 미국 특허출원 공개번호 2003/0175235에 기술된 방법과 유사함, 이는 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨).
실시예 1의 전술한 공정에 따라 세포즙으로부터 막 분획을 분리한 직후, 막 분획은 안정화되었으며, 폴리머 매트릭스로 통합되었다. 국소 성분 MF 약 100 g을 제조하기 위해, 세포 막 분획에 비-이온성 유화제인 폴리소르베이트 80 (Tween 80)와 항산화제 (Tenox 4)를 혼합하여, 안정화시켰다. 구체적으로, 신선한 막 분획 20 g을 트윈 90 3.5 g 및 Tenox 4 0.1 g과, 균질해질 때까지, 산소 노출을 방지하면서 왕성하게 혼합하였다.
일단 안정화되면, 막 분획은 폴리머 매트릭스 (즉, 폴리머 유화제, 아크릴레이트/C10-C30 아크릴레이트 가교폴리머의 분산물)로 통합되었다. 폴리머 매트릭스는, 따뜻한 탈이온수 69.2 g에 Pemulen TR-2 0.9 g을 분산시킨 후, 균일해질 때까지 산소 노출은 피하면서 보통 수준으로 교반하여 혼합함으로써, 제조하였다. 이와 병행하여, 글리세린 5 g과 Phenonip (페녹시에탄올 + 메틸파라벤 + 부틸파라벤 + 에틸파라벤 + 프로필파라벤 혼합물) 1.0 g을 다른 용기에 넣은 다음, 균일해질 때가지 혼합하였다. 보통 수준으로 교반하면서, Pemulen 함유 상과 글리세린 + Phenonip 함유 상을 합쳐, 균일해질 때까지 혼합하였다. 막 분획을 폴리머 매트릭스로 통합하기 위해, 막 분획, Tween 80 및 Tenox 4 함유 상을, Pemulen, 글리세린 및 Phenonip 함유 상에 첨가한 다음 산소 노출을 피하면서 왕성하게 교반하여 혼합하였다. 막 분획 혼합물에 18% 소듐 하이드록사이드 (NaOH) 수용액을 첨가하여 중화하고 이를 왕성하게 혼합하여 pH 5.0±0.4의 균일한 시스템을 제조함으로써, 막 분획 혼합물의 안정화를 달성하였다. 프레쉬한 동백나무속 바이오매스 100 kg (생잎 약 461 kg, 건조물 21.7%)에서 시작한, 이러한 제조로, 국소 성분은 건조물 수율 11.85 kg (또는 약 172 L)으로 제조되었으며, 이를 물리-화학적 및 생활성 특성을 규명하는데 사용하였다. 국소 성분 MF의 권고되는 보관 조건은, 광 차단된 밀폐된 용기에서 2-8℃의 온도에서 보관하는 것이다.
실시예 8
막 분획으로부터 유래되는 국소 성분 MF의 제품 사양
국소 성분 MF는 실시예 7의 전술한 공정에 따라 제조하였다. 국소 성분 MF에 대한 분석을 수행하여, 이의 다양한 물리-화학적 특성, 미생물 특성, 세포독성 및 생활성 특징들을 후술한 바와 같이 측정하였다. 국소 성분 MF는 불투명 겔이며, 녹-갈색을 띄며, 약한 특유한 냄새를 가진다. 국소 성분 MF 는 최고 수준의 순도 균일성, 상용성, 안정성, 안전성 및 효능을 확인하기 위해, 폴리머로 겔화된 천연 세포즙 성분들을 이용하여 제형화하였다.
표 8은 국소 성분 MF의 물리 화학적 데이타를 나타낸다.
표 8 - 국소 성분 MF의 물리 및 화학적 파라미터
파라미터 방법 결과
비-휘발성 잔사 (NVR), % 실시예 20 참조, "방법 2" 6.9
비중, g/cm3 USP<841> 1.035
점성, cps USP<911> 18,700
pH USP<791> 4.6
총 카테로이드, % NVR 실시예 20 참조, "방법 4" 0.36
루테인, % NVR 실시예 20 참조, "방법 4" 0.34
표 9는 국소 성분 MF에 대한 L*a*b* 값들을 요약 개시한다.
표 9 - 국소 성분 MF의 L* a* b* 값
파라미터 방법 결과
L* 실시예 20 참조, "방법 3" 30.27
a* -"- 27.36
b* -"- 42.56
미생물 분석 결과, 국소 성분 MF는 병원체의 CFU 및 부재와 관련하여 국소 성분에 대한 상업적인 요건들을 충족시키는 것으로 확인되었다 (USP <61>).
국소 성분 MF는 2-8℃의 온도에서 광 차단된 용기에 보관시 적어도 12-18개월간 안정적인 (즉, 물리 및 화학적 온전성을 유지함) 것으로 확인되었다. 국소 성분 MF는 생분해성 산물이다. 통제된 임상 평가에서, 국소 성분 MF는 엘라스타제 저해 활성과 트립신 저해 활성을 나타내었다. 표 10은 국소 성분 MF에 대한 특정 생활성 결과를 요약 개시한다.
표 10 - 국소 성분 MF의 생활성 결과
활성 방법 ㎍ DM/ml
엘라스타제 저해 (IC50) 실시예 20 참조, "방법 5" 12.3
MMP-9 저해 (IC50) 실시예 20 참조, "방법 6" 5.6
트립신 저해 (IC50) 참조 [1] 3.8
참조: [1] Cannel et al., Planta Medica 54:10-14 (1988), 이 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨.
표 10은, 국소 성분 MF가 국소 성분 SF (실시예 6 참조)와 유사한 특징을 가짐을 보여주었다. 국소 성분 MF는 슈퍼옥사이드 포착 활성은 없지만, 국소 성분 SF 보다 더 높은 수준의 특정 효소 저해 활성을 가진다. 따라서, 생활성 조성물 B에 기초한 국소 성분 MF는 피부 장애 치료를 위한 광의의 용도를 가지는 강력하고 다중적인 항염증성 성분으로서 간주되어야 한다.
실시예 9
카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) 식물로부터 유래된 생활성 조성물의 스펙트럼 분석.
스펙트럼 분석 돌입. 자외선 (UV)은 인간 피부를 손상시키는 효과를 가진다. 단기간의 작용으로는 태닝과 일광화상이 있지만, 누적된 UV 노출로 인한 장기간의 작용으로는 피부의 광노화와 피부암 위험성 증가가 있다. 피부의 자외선으로 인한 상해는 산화적 손상에 의해 매개되며, 항산화 활성을 가진 다수의 식물 추출물들이 예방제로서 유력한 것으로 나타나고 있다: 포도씨 추출물 (Carini et al., "Protective Effect of Procyanidines from Vitis vinifera Seeds on UV-Induced Photodamage: In vitro and In vivo Studies," Proceedings of the 19th IFSCC Congress 3:55-63 (1996), 이는 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨), 라이코펜 (Di Mascio et al., "Lycopene as the Most Efficient Biological Carotenoid Singlet Oxygen Quencher," Archives of Biochemistry and Biophysics 274:532-8 (1989); 및 Ribaya-Mercado et al., "Skin Lycopene is Destroyed Preferentially Over beta-Carotene During Ultraviolet Irradiation in Humans," Journal of Nutrition 125:1854-9 (1995), 이 문헌은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨), 실리마린 (silymarin) (Morazzoni et al., "Silybum marianum (Carduus marianus)," Fitoterapia 66:3-42 (1995); Katiyar et al., "Protective Effects of Silymarin Against Photocarcinogenesis in Mouse Skin Model," Journal of the National Cancer Institute 89:556-66 (1997), 이 문헌은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨), 및 특히 다른 식물원으로부터 제조된 추출물에 비해 높은 효능을 가진 녹차 추출물 (Katiyar et al., "Protection Against Ultraviolet-B Radiation-Induced Local and Systemic Suppression of Contact Hypersensitivity and Edema Responses in C3H/HeN Mice by Green Tea Polyphenols," Photochemistry and Photobiology 62:855-61 (1995); Ruch et al., "Prevention of Cytotoxicity and Inhibition of Intercellular Communication by Antioxidant Catechins Isolated from Chinese Green Tea," Carcinogenesis 10:1003-8 (1989); Wang et al., "Protection Against Ultraviolet B Radiation-Induced Photocarcinogenesis in Hairless Mice by Green Tea Polyphenols" Carcinogenesis 12:1527-30 (1991), 이는 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨).
차 식물 (카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis))의 잎에는 (-)-에피카테킨, (-)-에피카테킨-3-갈레이트, (-)-에피갈로카테킨 및 (-) 에피갈로카테킨-3-갈레이트를 비롯하여 황산화 활성을 가진 폴리페놀이 다량 함유된 것으로 밝혀졌다. 녹차 추출물은 하이드로겐 퍼옥사이드와 슈퍼옥사이드 라디칼들에 대한 항산화 활성 및 산화적 세포독성 예방이 입증되었다. 또한, 이 추출물은 종양 촉진 기전일 수 있는 세포내 커뮤니케이션의 저해도 방지할 수 있다. UV-유발성 면역 억제와 피부암 발병 간에 밀접한 연관성이 존재하는데, 녹차 추출물이 UV-B 조사에 의해 유발되는 면역 억제와 염증으로부터 보호하는 것으로 확인되고 있다. 음용수내로 국소 제공되거나 또는 국소적으로 적용되는 녹차 추출물은 동물 모델에서 UV-B 유발성 피부 발암을 예방한다. 이러한 결과들은, 경구 복용되는 녹차 추출물이 피부암 예방에 일조할 수 있다는 것을 의미한다.
동백나무속 생성물의 UV 보호 특징들은 확립되었지만, 태양 손상으로부터 피부를 효과적으로 방어하기 위한 소스로서의 차 식물의 높아진 잠재성은, 상대적으로 좁은 활성 성분 범위, 주로 카테킨으로 제한하여 집중시키는 기존 기술적 한계로 인해 충분히 조사되지 못하였다.
본원에 기술된 "새로운" 동백나무속 생성물과 "기존의" 동백나무속 생성물 간의 상대적인 UV 보호 특징은, 이제, "프레쉬 동백나무속 분획화" 기법이 보다 강력한 생성물을 수득할 수 있다는 것을 보여준다. 비교는 통상적으로 사용되는 방법들을 이용하여 용액의 스펙트럼 특징과 시험관내 자외선 차단 지수 (SPF)를 측정함으로써, 행하였다.
방법 A: UV/VIS 스펙트럼. 동백나무속 생성물의 200-450 nm에서의 UV/VIS 스펙트럼은 약전에 따른 Spectrophotometer Ultrospec 4300 Pro (Amersham Biosciences Ltd., Buckinghamshire, England)을 이용하여 입수하였다. 증류수에 희석시킨 동백나무속 생성물의 스펙트럼 파라미터들을 USP <197>에 기술된 공정에 따라 측정하였다.
방법 B: 흡광 스펙트럼. 동백나무속 생성물의 250-450 nm에서의 흡광 스펙트럼은 UV-1000S 투과도 분석기 (Labsphere, Inc., North Sutton, N.H.)와, 인간 피부의 표면 특징들을 모방한 Vitro-Skin® 검사 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.)을 이용하여 입수하였다. 이것은 최적화된 단백질 지질 성분들을 모두 함유하고 있으며, 인간 피부와 유사한 형태, pH, 임계 표면 장력 및 이온 세기를 가지도록 설계되어 있다.
동백나무속 샘플들은 예비-수화된 기판의 표면에 균일하게 발랐다 (도포 용량 = 2.0 ㎕/sq. cm). 도포한 지 15분 후, 초기 흡광 스펙트럼을 다섯번 (5) 반복하여 입수하였다. 그런 후, 생성물이 도포된 기판을 300-Watt 크세논 램프가 장착된 광범위 태양광 시뮬레이터 (Model 16S-300 Single Port, Solar Light Company, Inc., Philadelphia, Pa.)를 사용하여 조사하였다. 용량 제어 시스템 PMA 2100-DCS으로 샘플에 전달되는 용량을 정확하게 제어할 수 있었다.
조사 (조사 광량 = 60 Joules/sq. cm) 직후, 동일 스팟에 대한 흡광 스펙트럼을 다섯번 (5) 반복하여 입수하였다. 조사 전과 조사 이후의 샘플 흡광 스펙트럼은 통계 분석에 사용하였다.
샘플. 실시예 1에서 전술한 공정에 따라 제조된 아래 생활성 조성물들을 평가하였다: 조성물 A (건조물 0.84%인 세포벽 분획 추출물), 조성물 B (건조물이 6.83%인 막 분획 추출물), 조성물 D (건조물이 5.695인 세포즙 세럼). 건조물이 1.10%인 기존 백차 추출물과 건조물이 1.38%인 기존 홍차 추출물은 대조군으로 사용하였다. 샘플들 모두 Charleston Tea Plantation, SC에서 채집된 동일 배치의 프레쉬 동백나무속으로부터 수득하였다. 이들 샘플은 어떠한 첨가제도 포함하지 않았다.
분석. 동백나무속 샘플들은 모두 UV 흡광값이 높아, 증류수로 희석하였다. 희석된 동백나무속 생성물의 UV-VIS 스펙트럼은 도 2와 3에 나타낸다.
모든 액체 샘플들의 스펙트럼은 특정한 유사성을 가지고 있다. 예를 들어, 피크들의 위치가 상대적으로 좁은 범위 즉 λmax1 = 269 - 274 nm 및 λmax2 = 205 - 208 nm에서 다양하게 존재하는데, 이는 검사 샘플들 모두에서 방향족 고리와 σ-π 결합의 공액 시스템이 존재한다는 것을 의미한다. 그러나, 피크의 정점 값, 각 피크의 면적 및 전체 스펙트럼 곡선 하 전체 면적에는 차이가 있어 (표 11), 검사 샘플들이 광학 활성 성분들에는 차별적인 조성을 가지는 것으로 시사되었다.
표 11 - 동백나무속 생성물의 UV/VIS 스펙트럼의 파라미터
피크 #1 피크 #2 스펙트럼 곡선 하 면적*, ABS·nm
시작, nm λmax1, nm 종료, nm 높이, Abs 면적 % 시작, nm λmax1, nm 종료, nm 높이, Abs 면적 %
백차 추출물 450 269 250 0.114 28.1 250 205 200 0.816 71.9 6.604
홍차 추추물 450 272 250 0.094 37.3 250 205 200 0.452 62.7 4.616
세포벽 분획 추출물 450 272 248 0.134 35.8 248 205 200 0.614 64.2 5.727
막 분획 추출물 450 274 251 0.944 16.2 251 208 200 11.98 83.8 80.133
세포즙 세럼 450 271 249 0.692 26.3 249 205 200 5.228 73.7 39.599
* 스펙트럼 곡선 하 면적 값은 샘플의 희석을 기준으로 표준화하였음.
200 nm - 450 nm에서 입수된 전체 스펙트럼 곡선 하 면적 비교를 통해, 막 분획 추출물 (조성물 B)과 세포즙 세럼 (조성물 D)이 흡광 값이 더 높은 것으로 명확하게 나타났다 (표 11). "스펙트럼 하 면적: 건조물"의 비는, 샘플의 구체적인 흡광 값이 홍차 추출물 > 백차 추출물 > 세포벽 분획 추출물 > 세포즙 세럼 > 막 분획 추출물 (표 12) 순서로 증가됨을 나타낸다.
표 12 - 동백나무속 생성물의 선택된 스펙트럼 특징
건조물 % 스펙트럼 곡선 하 면적, Abs·nm 비:
스펙트럼 곡선 하 면적(200-450nm) 건조물		 스펙트럼 곡선 하 면적(290-400nm)
Abs·nm		 비:
스펙트럼 곡선 하 면적(290-400nm) 건조물
백차 추출물 1.10 6.604 6.004 0.812 0.738
홍차 추추물 1.38 4.616 3.345 0.854 0.619
세포벽 분획 추출물 0.84 5.727 6.818 0.776 0.924
막 분획 추출물 6.83 80.133 11.733 4.304 0.630
세포즙 세럼 5.69 39.599 6.959 4.320 0.759
흡광 결과에 대한 비교를 토대로, 새로운 생활성 조성물들은 통상적인 백차 및 홍차 추출물들 보다 피부를 태양 손상으로부터 보다 효과적으로 보호하는 것으로 보인다. 동백나무속 생성물의 UN 보호 특성들은, 스펙트럼의 290 nm - 400 nm가 UV 유발성 피부 손상을 야기하기 때문에, 290 nm - 400 nm 영역에 대한 흡광 데이타를 이용하여 더 잘 예상할 수 있음에 유념하여야 한다 (Sayre et al., "A Method for the Determination of UVA Protection for Normal Skin," Journal of American Academy of Dermatology 23: 429-40 (1990), 이는 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨). 290-400 nm 영역에서 검사한 액체 샘플들의 흡광은 전체 UV/VIS 흡광의 ~10%에 불과하므로, 새로운 동백나무속 조성물들은 이 보다 높은 스펙트럼 영역에서도 물론 보다 높은 흡광도를 가진다.
이에, 동백나무속 샘플의 희석 용액에 대한 데이타는 검사 제품들의 UV 보호 효능에 대한 최초의 추측을 제공하였으며, Vitro-Skin® 검사용 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.)을 이용하여 더욱 평가하였다. 그 결과는 도 4-13에 나타낸다. 새로운 동백나무속 조성물과, 기존의 백차 및 홍차 추출물은, 기판 상에, 건조물 수준에 맞춘 농도로 도포한 후에도, 상이한 스펙트럼 결과들을 나타내는 것으로 확인되었다 (도 4 및 5).
Vitro-Skin® 검사용 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.)에 도포된 동백나무속 샘플들의 스펙트럼은, 정점 값이 다른 4-2개의 특징적인 피크들을 가지고 있었다 (표 13).
표 13 - 시험관내-피부 ® 테스트 기판 상에 도포된 동백나무속 산물의 흡광 스펙트럼의 파라미터
피크 #1 피크 #2 피크 #3 피크 #4
λmax4 높이, Abs λmax3 높이, Abs λmax2 높이, Abs λmax1 높이, Abs
백차 추출물 260 0.389 286 0.461 330 0.163 392 0.076
홍차 추추물 260 0.399 286 0.373 330 0.175 390 0.105
세포벽 분획 추출물 260 0.555 286 0.569 330 0.203 389 0.118
막 분획 추출물 260 0.394 286 0.549 - - 394 0.059
세포즙 세럼 260 0.431 286 0.517 - - - -
동백나무속 생성물 용액의 특징적인 피크 파라미터 (도 11)는, Vitro-Skin® 검사용 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.)에 도포된 동백나무속 생성물의 특징 (표 13)과 상당한 차이가 있다는 것에 유념하여야 한다. 대조군 실험에서 나타난 바와 같이, Vitro-Skin® 표면의 낮은 pH (~5.5)는 이러한 차이의 원인일 수 없으며, 아마도 Vitro-Skin® 검사용 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.) 제조시 사용되는 성분과 동백나무속 생성물 간에 화학적인 상호작용의 결과로 보인다. 즉, Vitro-Skin® 검사용 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.)은 동백나무속 페놀 성분들과 화학적으로 상호작용할 수 있는 단백질과 지질 성분들을 함유하고 있다. 검사 제품의 스펙트럼 특성 쉬프트는 모든 생활성 조성물 뿐만 아니라 기존 차 추출물에서도 관찰됨을 주목하여야 한다.
검사 샘플들의 건조물 함량 차이를 감안하여, 새로운 동백나무속 조성물과 기존의 동백나무속 생성물의 추출물을 있는 그대로 분석한 스펙트럼을 비교하였다. Vitro-Skin® 검사용 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.)에 동일 부피로 도포시킨 동백나무속 생성물들의 흡광 스펙트럼을 도 6에 나타낸다.
세포벽 분획 추출물과 백차 추출물 간의 일부 스펙트럼 유사성이 존재하지만, 1차 산물이 250-280 nm 영역과 거의 UV 영역에서 높은 흡광도를 가진다. 높은 흡광도는, 세포벽 분획 추출물 (0.84%) 보다 백차 추출물 (1.10%)에서 높은 건조물 수준과 일치되지 않은 점에 주목하여야 한다. 이들 2종의 샘플들은 조성이 동일하지 않으며, 세포벽 분획 추출물이 전도성이 더 낮고, 고 흡광성을 야기하는 더 많은 비-해리성 광학 활성 성분들로 구성되어 있음을 시사한다 (표 3에 제시된 데이타 참조).
부가적으로, 막 분획 추출물 (조성물 B)과 세포즙 세럼 (조성물 D)의 스펙트럼은 세포벽 분획 추출물 (조성물 A)과 백차 추출물의 스펙트럼과 차이가 있는 것으로 확인되었다. 즉, 막 분획 추출물과 세포즙 세럼의 스펙트럼은, 이들 생성물이 백차 추출물 및 세포벽 분획 추출물과 다른 조성을 가진다는 것을 보여준다. 동시에, 스펙트럼 데이타는, 막 분획 추출물과 세포즙 세럼의 조성이 동일하지 않다는 것을 시사해준다. 예를 들어, 막 분획 추출물은 260 nm, 286 nm 및 394 nm에서 특징적인 3개의 피크를 가지고 있다. 세포즙 세럼의 스펙트럼은 260 nm와 286 nm에서 2개의 피크를 가진다.
이들 2개의 스펙트럼을 비교한 결과, 건조물 수준의 차이가 ~1%에 불과하지만, 막 분획 추출물이 세포즙 세럼 보다 약 2배 높은 여기를 가지는 것으로 확인된다. 즉, 검사한 동백나무속 생성물 4종은 250-450 nm 영역에서 광학적으로 활성인 구성 성분들을 현저하게 다른 조성으로 가진다.
동백나무속 생성물에 대한 정량적인 비교 데이타는 표 14에 나타낸다.
표 14 - 시험관내-피부 ® 테스트 기판 상에 도포된 동백나무속 산물의 선택 특징
스펙트럼 곡선 하 면적(250-450nm)
Abs·nm 		스펙트럼 곡선 하 면적(290-400nm)
Abs·nm		 스펙트럼 곡선 하 면적(290-400nm)
스펙트럼 곡선 하 면적(250-450nm)
%
백차 추출물 15.577 9.312 59.78
세포벽 분획 추출물 18.571 10.422 56.12
막 분획 추출물 89.148 53.803 60.35
세포즙 세럼 60.861 35.161 57.77
표 14는 250-450 nm 영역과 290-400 nm 영역에서 샘플의 흡광도가, 백차 추출물 > 세포벽 분획 추출물 > 세포즙 세럼 > 막 분획 추출물의 순서로 증가됨을 보여준다. 이 순서는 희석 용매로 검사한 동백나무속 생성물의 특이 흡광 값의 순서와 완전히 일치한다 (표 12). 검사 샘플을 Vitro-Skin® 검사용 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.)에 도포하였을 때, 250 nm - 450 nm에서 수득한 스펙트럼의 흡광도에 대한 250-400 nm 영역에서 흡광도의 기여는 ~55 - 60%에 달하였다.
새로운 동백나무속 조성물의 스펙트럼은 희석 용액 상태와 Vitro-Skin® 검사용 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.)에 도포한 이후의 스펙트럼과 현저하게 차이가 있다는 점에 주목하여야 한다. 이러한 차이는 막 분획 추출물과 세포즙 세럼에서 정량적 및 정성적 측면에서 모두 그렇다. 따라서, 250 nm - 450 nm 범위에서, 용액 중의 막 분획 추출물은 274 nm에서 피크였다. 동일 막 분획 추출물을 Vitro-Skin® 검사용 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.)에 도포한 경우, 상기 파장에서 어떠한 특징적인 피크도 나타나지 않고, 대신 260 nm 및 286 nm에서 2개의 특징적인 피크가 나타났다 (도 7A).
스펙트럼 특징에서 비슷한 양상은 세포즙 세럼에서도 관찰되었지만, ~360 nm에서의 추가적인 흡광은 Vitro-Skin® 검사용 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.)에 도포된 샘플에서와 동일하였으며, 이러한 현상은 동일 조성물의 용액의 UV/VIS 스펙트럼에서는 기록되지 않았다 (도 7B).
전술한 스펙트럼 차이는 새로운 동백나무속 조성물과 단백질 및 지질 성분을 가진 인간 피부를 모방한 Vitro-Skin® 검사용 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.) 표면 간의 화학적 상호작용의 결과일 수 있음을 유념하여야 한다. 이러한 상호작용은 UV 조사의 손상 효과를 야기하는 스펙트럼 영역의 흡광도를 급격하게 증가시키며, 즉, 새로운 동백나무속 조성물은 유의한 UV 보호 효능을 가진다. 보리 (호르듐 불가리 (Hordeum vulgare)) (도 8A) 및 세이지 (살비아 오피시날리스 (Salvia officinalis)) (도 8B)의 세포즙 세럼을 이용한 대조군 실험들에서, 동일 샘플의 용액 상태와 Vitro-Skin® 검사용 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.) 도포 이후의 스펙트럼 차이는 동백나무속을 제외한 다른 식물 소스들에서는 관찰되지 않는 것으로 나타났다. 따라서, 비트로콘 도포 후 동백나무속 생성물에서의 스펙트럼 쉬프트는, 특이적인 상호작용이 새로운 동백나무속 생성물과 인간 피부를 모방하는 기판 사이에서만 이루어진다는 것을 시사해준다.
예비-수화된 기판을 이용한 대조군 실험에서, 조사 후 Vitro-Skin® 검사용 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.)의 흡광도가 특히 260-330 nm에서 현저하게 감소된 것으로 나타났다 (도 9). 이러한 효과는 광범위 태양광이 고선량으로 조사된 비-보호된 기판의 상대적으로 낮은 광-안정성을 반영한다.
백차 추출물이 도포된 기판에 조사시, 비-보호된 Vitro-Skin® 검사용 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.)의 스펙트럼 변화와 유사하게, 흡광 스펙트럼 (10)에 변화가 나타났다. 기판의 기여를 없애면, 비-조사된 샘플과 조사된 샘플의 스펙트럼은 일부 유사성을 나타내지만, 전체적으로 동일한 거동을 나타내진 않았다. 예를 들어, 290-310 nm 범위에서의 흡광도는 감소하였으며, 360 nm에서 와이드 피크가 형성되기 시작하였다.
세포벽 분획 추출물에 조사하면 (도 11), 특히 기판 기여를 없앤 (공제) 후 수득되는 곡선에서 흡광 스펙트럼에 비슷한 변화가 유발되었다.
백차 추출물 및 세포벽 분획 추출물의 조성은 동일하지 않지만, 스펙트럼에서의 조사-유도성 변형 패턴은 꽤 비슷하다. 백차 추출물과 세포벽 분획 추출물 둘다 기판을 조사의 파괴 작용으로부터 완전히 보호할 수 없으며, 그 결과 Vitro-Skin® 검사용 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.)의 흡광이 기판이 전혀 보호되지 않는 조건에서의 수준 만큼 거의 감소된다는 점에 유념하여야 한다 (도 9). 가장 긴 파장에서 흡광도의 일부 상승이 관찰되지만, 특히 250 nm-330 nm 영역에서 명확하게 나타난다.
막 분획 추출물에 조사하면 이의 흡광 스펙트럼에 매우 차별적인 효과가 발생하였다 (도 12). 예를 들어, 조사는 250-285 nm 영역의 스펙트럼에는 어떠한 변화도 유발하지 않았다. 논의된 바와 같이, 이러한 특정 스펙트럼 범위는 조사된 Vitro-Skin® 검사용 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.)의 파괴에 의해 매우 상당히 영향을 받았으며, 따라서, 스펙트럼을 비교한 결과 기판의 파괴는 표면에 막 분획 추출물의 존재에 의해 완전히 방지되는 것으로 시사된다.
그러나, 막 분획 추출물의 스펙트럼에 소정의 변화가 기록되었다. 예를 들어, 흡광도는 290-320 nm 범위에서 약간 감소하였고, 이는 더 긴 파장에서 흡광도의 소폭 상승을 동반하였다. 특히, 막 분획 추출물은, 핵산 및 방향족 아미노산이 각각 260 nm 및 280 nm에서 특징적인 피크를 가지는 스펙트럼 범위에서, 매우 효과적인 것으로 입증되었음에 유념하여야 한다. 따라서, 막 분획 추출물의 효과는 국소 적용을 위한 잠재적인 UV 보호 성분으로서 이 생성물을 이용가능하게 한다.
조사 후, 세럼 분획은 흡광 스펙트럼에 소정의 변화를 나타내었다 (도 13).
일반적으로, 이러한 변화는 250-340 nm에서 소폭 흡광도 감소와 340-450 nm에서의 소폭 흡광도 증가로 설명될 수 있다. Vitro-Skin® 검사용 기판 (IMS Testing Group, Milford, Conn.)의 광-파괴에 의해 부가되는 가능한 기여의 소거 (비-조사된 세럼 분획의 초기 스펙트럼 위에 존재하는 스펙트럼의 레드 곡선)는, 기판이 표면 상의 세럼 분획의 적용에 의해 효과적으로 보존될 수 있다는 것을 명확하게 보여준다는 사실에 유념하여야 한다.
관찰 결과 및 결론. 상기 결과는, 가장 뛰어난 기존의 동백나무속 생성물 - 백차 추출물 - 이 UV 조사로 인한 파괴 작용으로부터의 보호 효과가 상대적으로 낮다는 것을 명확하게 보여준다. 세포벽 분획 추출물은 백차 추출물과 유사한 특성을 나타내었지만, 막 분획 추출물과 세포즙 세럼은 훨씬 강력한 UV 보호 특성을 가진다.
동백나무속 생성물의 UV 보호 특성은 백차 추출물 = 세포벽 분획 추출물 > 세포즙 세럼 > 막 분획 추출물 순서로 증가되는 것으로 확인되었다.
동백나무속 생성물의 스펙트럼 특성 및 UV 조사 후 이들 특성의 변화 양상은, 백차 추출물 (대조군), 세포벽 분획 추출물, 막 분획 추출물 및 세포즙 세럼의 구성성분들의 조성이 모두 다르며, 고유한 활성을 나타냄다는 강력한 증거를 제공함에 유념하여야 한다. 이는, 전술한 UV 활성이 백차 추출물에서와 같이 폴리페놀에 기인한 것일 수 없는, 새로운 동백나무속 조성물에서 특히 흥미롭다.
실시예 10
동백나무속 생성물의 비교 평가: 개괄
실시예 10 - 19는 본 발명의 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)로부터 유래된 생활성 조성물들에 의한 세포 기능 조절과 관련있는 다양한 생물 활성을 평가하기 위해 수행된 실험에 대한 방법, 결과 및 분석 결과를 기술한다. 1차 목적은 본 발명의 방법으로 수득되는 생성물의 다양한 생물 활성을 평가하여, 이를 양성 대조군으로 사용되며 본 발명의 하기 생활성 조성물과 비교하기 위한 기존 (전통적인) 차 기법에 의해 제조된 최상의 생성물 - 백차 추출물의 활성과 비교하는 것이었다: (1) 생잎의 세포벽 분획 추출물 (조성물 A, 본원에 언급된 바와 같음); (2) 막 분획 추출물 (조성물 B, 본원에 언급된 바와 같음); 및 (3) 세포즙 세럼 (조성물 D, 본원에 언급된 바와 같음).
이들 동백나무속 생활성 조성물이 3종의 인간 세포주 생장 양상에 대한 미치는 효과를 평가하기 위해 검사를 수행하였다: 단핵구성 백혈병 세포 (Mono Mac 6) 특징을 가진 골수 세포주, 생체내 악성의 초기 단계 특징을 가진 2종의 유방암 세포주 (MCF-7) 및 진행형 암의 특징을 가진 보다 고도로 침습적인, 전이성의 에스트로겐 불응성 세포주 (MDA-MB-435S).
기존의 백차 추출물은 일부 종양 세포들의 대사 활성에 소정의 저해 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 그러나, 이러한 저해 수준은 검사한 세포 타입들 모두에서 유의하지 않았으며, 심지어 이러한 저해를 검출하였을 때, 일반적으로 완전하지 않고, 최소 또는 소폭이었다. 세포벽 분획 추출물은 백차 추출물의 특성과 유사한 특성을 나타내었다.
주목할만하게도, 세포즙 유래 물질 둘다, 즉 막 분획 추출물과 세포즙 세럼은, 여러가지 자극의 존재 및 부재 하에 배양된 테스트한 모든 세포주들의 대사 작용에 대해 훨씬 더 강력한 저해제였다. 예를 들어, 막 분획 추출물은 보다 우수한 저해 효능을 명확하게 나타내었으며, 이의 효능은 0.001% 농도에서 확실히 측정할 수 있었다. 세포즙 세럼은 복잡한 반응을 나타내었다: 저 농도에서 자극 및 고 농도에서 저해.
막 분획 추출물 및 세포즙 세럼은, 괴사성 세포 용해를 유발하기 보다는, 종양 세포에서 프로그래밍화된 또는 세포자살성 세포 사멸의 경로를 개시하는 것으로 보인다는 점에 유념하여야 한다. 실험 데이타는, 이 경로가 미토콘리아의 기능 상실에 기인한 것이며, 검출되기 위해서는 24 - 48시간의 노출이 필요할 수 있다는 것을, 시사한다.
생활성 조성물에 노출된 결과로서, 테스트한 종양 세포주들, 즉 초기 단계 인간 유방암 모델인 MCF-7, 진행형 유방암 모델인 MDA-MB-435S 및 단핵구성 백혈병 모델인 Mono Mac 6 모두 대사 기능이 저해되었으며, 막 분획 추출물이 가장 효과적이었고, 세포즙 세럼이 효과가 약하고 보다 선택적이었다. 특히, 백차 추출물과 세포벽 분획 추출물은 상기 조성물 B 및 D 보다 불활성이거나 효능이 훨씬 약한 것으로 입증되었다. 이런 경향은 다른 조건에서 검사한 세포들에서도 명확하게 입증되었다: 형질변성 성장 인자의 부재 및 존재 하의 MCF-7 세포, MDA-MB-435S 세포 및 자극 및 비-자극된 단핵구성 Mono Mac 6 세포.
이들 결과는, 동백나무속 식물의 효능을 급격하게 증가시키고, 심지어 최상의 기존 차 제조 기법의 생성물에서는 동정되지 않았던 활성을 보이는 매우 인상적인 새로운 생성물을 제조하는, 본 발명의 방법의 역량에 대해 강력한 증거를 제공해준다.
세포-매개 단백질분해 활성에 대한 본 발명의 동백나무속 분획들의 효능은 염증성 조직의 손상 뿐만 아니라 종양 침습 및 전이에 영향을 미친다. 따라서, 유방암 세포와 백혈병 세포는 본 발명의 생활성 조성물, 특히 막 분획 추출물의 유력한 타겟으로서 제시될 수 있다. 이전에, 대장암 유래 세포주 COLO 205가 MMP-2를 상당 수준으로 방출하며, 이후 이 세포에 의해 또한 방출되는 트립신-유사 효소에 의해 활성화된다는 것이 입증되었는데, 이 점에 주목하여야 한다. 또한, 이 세포는 Mono Mac 6 세포에 대한 결과를 근거로, 본 발명의 동백나무속 분획들의 가능한 타겟들 중 하나이다.
이러한 연구들로부터, 본 발명의 프레쉬 동백나무속 식물로부터 분리된 생활성 조성물들이 주요 세포 기능을 상당히 조절한다는 결론을 내리게 되었다. 관찰되는 효과는 퍼스널 케어 제품에서 건강보조제 및 잠재적인 약제에 이르는 유용한 활용성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 매우 강력한 생활성 조성물들은 정제된 단일 성분이 아니며, 구성 성분들로 된 분리된 복합물이라는 점에 유념하여야 한다. 나아가, 막 분획 추출물 (조성물 B)과 세포즙 세럼 (조성물 D)을 추가적으로 분획화함으로써 커지고 있는 천연 약제 시장의 매우 유력한 성분을 수득할 수 있다.
실시예 11
동백나무속 생성물의 비교 평가: 검사한 조성물들.
아래 생활성 조성물들을 실시예 10 - 19에 기술된 실험들에 사용하였다:
(1) 양성 대조군: 실시예 1 및 4에 기술된 공정에 따라 제조된 백차 추출물.
(2) 조성물 A: 실시예 1 및 4에 기술된 공정에 따라 제조된, 동백나무속 식물의 생잎으로부터 유래된 세포벽 분획 추출물.
(3) 조성물 B: 실시예 1 및 4에 기술된 공정에 따라 제조된 동백나무속 식물의 신선하게 가공한 잎으로부터 유래된 막 분획 추출물.
(4) 조성물 D: 실시예 1 및 4에 기술된 공정에 따라 제조된 동백나무속 식물의 신선하게 가공한 잎으로부터 유래된 세포즙 세럼.
상기 생성물들은 동일 lot의 프레쉬 동백나무속 식물로부터 수득하여, 통상적인 백차 추출물과 3종의 본 발명의 "유사" 생성물 (조성물 A, B 및 D)을 제조하였다.
동백나무속 잎의 추출물이 주로 치유 과정 중에 형성되는 상당량의 폴리페놀 탄닌에 기인한 다양한 생물 활성을 가지고 있음을 시사하는 보고는 문헌들에 다수 존재하고 있다. 3종의 폴리페놀 뿐만 아니라 에피갈로카테킨-3-O-갈레이트 (EGCG)와 같은 폴리머성 탄닌에 대한 저분자량 전구체들이 강력한 항산화 활성을 나타낸다고 보고되어 있다. 동백나무속 식물의 건잎으로부터 제조되는 차의, 항산화 특성 뿐만 아니라, 항-혈관신생, 항균, 항암, 항염증, 항-돌연변이, 항-패혈성 및 해독 특성을 시사하는 간행물들도 많아지고 있다. 전술한 특징들 모두 통계학적으로 유의한 이점을 부여한다고 입증된 것은 아니다. 오직 일부만 다중 검사 시스템을 이용한 포괄적인 실험들에서 검증되었다.
과거 문헌에서와 같이, 본 발명의 기법을 이용하여 동백나무속을 제외한 다수의 프레쉬 식물 소스로부터 분리되는 생활성 조성물들을 이용한 과거 경험들로부터, 이들 조성물이 미국 특허출원 공개번호 2003/0175235 (이는 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨)에 이미 기술된 바와 같이, 다수의 파라미터를 이용하여 동일한 건조 식물로부터 분리된 통상적인 생성물들 보다 훨씬 효과가 강한 것으로 입증되었다는 것에 유념하여야 한다. 예를 들어, 다른 타입의 식물 (메디카고 사티바 (Medicago sativa), 호르듐 불가리 (Hordeum vulgare), 라반듈라 안구스티폴리아 (Lavandula angustifolia), 카렌듈라 오피시날리스 (Calendula officinalis) 및 살비아 오피시날리스 (Salvia officinalis))들에서, 본 발명의 방법을 이용하여 제조된 조성물들의 몇가지 강력한 생물학적 활성들이 동정 및 평가되었으며, 그 예로는 높은 항-엘라스타제 및 항-젤라티나제 B (MMP-9) 활성, 새로운 호중구 호흡 파열 (neutrophil respiratory burst) 조절 및 반응성 산소 종에 대한 유의한 슈퍼옥사이드 포착 활성을 포함한다. 포착 활성을 제외한 활성들은 폴리페놀계 화합물의 단독 혼합물에 기인한 것으로 보이지 않는다.
따라서, 본 발명의 동백나무속 조성물에서 검출될 수 있는 다양한 활성들을, 기존의 (전통적인) 동백나무속 기법을 이용하여 동일한 건조 식물로부터 수득되는 추출물에 존재하는 활성과 비교하기 위해, 보다 포괄적인 접근법을 이용하는 것은 특히 흥미로운 일이다. 이에, 동백나무속 식물에서 신선하게 채집한 잎으로부터 제조된 세포벽 분획 추출물 (조성물 A), 막 분획 추출물 (조성물 B) 및 세포즙 세럼 (조성물 D)에 의한, 살아있는 포유류 세포에서의 기능 조절을 분석하였다. 이들 조성물은 동백나무속 식물의 건잎으로부터 제조된 기존의 백차 추출물과 비교하였다.
기존의 동백나무속 생성물에 대한 다층적인 연구들에 따르면, 백차 추출물은 보다 우수한 특이 활성을 나타내므로, 이러한 종류의 조제물을 본 발명의 새로운 동백나무속 생성물과 비교하기 위한 대표적인 양성 기준 대조군으로 선택하였음에 주목하여야 한다.
실시예 12
동백나무속 생성물의 비교 평가: 세포주의 선택 이유
세포 기능 조절을 위한 검사 시스템으로서, 2종의 인간 유방암-유래 세포주를 암 세포 모델 (MCF-7 및 MDA-MB-435S)로 사용하였고, 인간 단핵구 세포주 (Mono Mac 6)를 염증 세포 모델로서 사용하였다. 이들 세포주는 실시예 21에서 언급된다.
MCF-7은 초기 또는 탈-분화 수준이 낮은 유방암 모델로 간주된다. 이 세포주는 여전히 에스트로겐 민감성을 유지하고 있으며, 상대적으로 낮은 침습적인 표현형을 가지고 있으며; 면역결핍 동물 모델에서의 이의 전이력은 꽤 온건하다. 이전 실험들에서, MCF-7 세포주는 형질변환 성장인자-β (TGF-β)에 대한 특징적인 반응을 나타내는 것으로 입증된 바 있는데, TGF-β의 존재 하에 24시간 배양하면, 세포는 매트릭스 메탈로프로테나제 (MMP) 계통의 단백질분해 효소와 전-혈관신생 인자인 혈관 내피 성장인자 (VEGF)를 증가된 수준으로 방출하며, 이 2종은 강화된 침습성과 전이 가능성을 표시하는 마커이다. TGF-β에 대한 이런 반응은 생장 정지와는 반대로, 종양 및 일부 종양 세포주의 마커이며, 성장인자에 의해 정상 세포에서 유도된다. 본 발명의 생활성 조성물을 평가하기 위해, TGF-β의 존재 및 부재하에 배양한 MCF-7 세포를 타겟으로 사용하였다.
MDA-MB-435S 세포주는 보다 고도로 침습적이고, 전이성이며, 에스트로겐 불응성이다. 이 인간 암종-유래 세포주 역시 TGF-β에 약간의 민감성을 나타내지만, 성장 인자의 부재시에도 MCF-7 보다 MMP와 VEGF를 자발적으로 다량 방출하므로, 이는 보다 진행된 암의 모델로서 사용하는데 적합하다. 본 평가에서, TGF-β의 존재 하에서만 배양한 MDA-MB-435S 세포에 대한 생활성 조성물들의 효과를 조사하였다.
인간 단핵구성 세포주인 Mono Mac 6는 휴지기 단핵세포 또는 대식세포와 동일한 바이오마커를 다수 발현하며, 인간 단핵세포 및 대식세포와 마찬가지로 포르볼 미리스테이트 아세테이트 (PMA) 등의 전-염증 활성화 자극에 반응한다. 휴지기 및 활성화된 단핵세포/대식세포의 모델로서 활용하기 위해, PMA 존재 및 부재 하에 배양한 Mono Mac 6 세포에 대한 생활성 조성물들의 효과를 조사하였다.
즉, 전술한 세포주들의 선택 조합은 동백나무속 생활성 조성물들의 항암 및 항염증 표능을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 토대를 제공해준다. 다수의 기능성 증거를 이용한 병렬 방식의 선택된 세포주에 대한 검사는 특정 자극에 유사한 민감성 또는 유사한 반응성을 가진 단일 검사 타겟 또는 타겟들의 반응 조사하기 보다는, 생성물의 활성과 이의 작용 기전에 대한 보다 유용한 결론을 도출하는 기회를 제공해준다.
실시예 13
동백나무속 생활성 조성물에 대한 비교 평가: 분석의 선택 이유
초기 평가는 2가지의 생활성 분석과 세포 기능의 증거를 기초로 한다 (실시예 20 참조, "방법 8").
1차 분석은, 세포가 용혈되었을 때만 세포외 배양 배지로 방출되는 시토졸 효소인 락틱 데하이드로게나제의 수준을 측정한다. 이와 같은 세포막의 온전성 상실은 전통적으로 괴사성 세포 사멸의 신호로 간주되며, 세포독성 패턴을 반영한다.
2차 분석은 테트라졸륨 염의 유색 포르마잔으로의 환원에 의해 확인되는 미토콘드리아의 데하이드로게나제 활성을 측정한다. MTS 시약 (테트라졸륨 염)이 살아있는 세포에 적용되면, 이것은 진한 색상의 화합물 (포르마잔)로 변환된다. 또한, 미토콘드리아의 데하이드로게나제 활성 상실은 세포 사멸과 연관될 수 있지만, 전형적으로는 핵이 응축되고 미토콘드리아가 기능을 중단한 후에도 세포막 온전성이 일반적으로 잘 유지되는, 프로그래밍된 세포 사멸 또는 세포자살 경로의 초기 단계를 나타내는 마커이다.
락틱 데하이드로게나제의 누출은 세포 용해와 관련된 생활성의 완전한 상실을 의미하며, 테트라졸륨 염의 환원 감소는 미토콘드리아 활성 상실을 의미하지만, 반드시 돌이킬 수 없는 세포막 온전성 또는 생활성 상실을 나타내는 것은 아니다.
세포 기능의 추가적인 증거로서, Mono Mac 6 세포주에 의해 분비되는 프로테나제 수준에 대한 동백나무속 생활성 조성물들의 효과를 조사하였다 (실시예 20, "방법 9"). 이 세포주를 이용한 기존 실험들에서, PMA와 인큐베이션한 후, Mono Mac 6 세포가 소위 젤라틴 분해성 매트릭스 메탈로프로테나제 2종, 즉, MMP-2 (젤라티나제 A)와 MMP-9 (젤라티나제 B)을 분비하는 것이 관찰되었다. 이들 MMP는 또한 다수의 종양과 이를 둘러싼 기질에서 분비되며, 염증성 조직 손상 뿐만 아니라 종양 침습 및 전이와 연루되어 있다. 또한, 항염증제와 항종양제로서 개발 중인 일부 제제들은 (조사한 제제들은 종양 세포주의 침습 및 전이 뿐만 아니라 염증성 조직 파괴를 완화시키는 것으로 알려져 있음) MMP 단백질분해 활성을 직접 저해할 뿐만 아니라, 세포에 의해 생성되는 MMP의 수준을 떨어뜨리는 것으로 나타난 것으로, 이미 확인되었다. 이들 연구의 목적은 본 발명의 동백나무속 생활성 조성물이 활성화된 MoNo Mac 6 세포에 의해 분비되는 MMP 수준을 떨어뜨리는 유사 능력을 가질지도 모르는 가능성을 조사하기 위한 것이었다.
이에, 선택한 분석은 광범위의 대사 프로세스를 신뢰할 수 있는 수준으로 평가하고, 중요 데이타를 효과적으로 수득할 수 있게 하여, 특정 동백나무속 생활성 조성물에 의해 촉발되는 작용 기전을 밝혀낼 수 있다.
실시예 14
동백나무속 생성물에 대한 비교 평가: 동백나무속 생활성 조성물의 유방 종양 세포주에 대한 효과
이들 실험들을 통해, 미토콘드리아 기능은 테트라졸륨 염 MTS의 포르마잔으로의 환원에 대한 분석을 통해서만 측정하였다. 본 발명의 동백나무속 조성물들은 고 농도에서 일부 고유한 역량으로 임의의 생활성 세포가 없는 조건에서 직접 MTS를 환원시키는 것으로 관찰되었으며, 본원에 기록된 모든 결과들에서, 이러한 세포의 부재시의 포르마잔 백그라운드 형성은 세포 존재시 관찰되는 리덕타제 활성 수준에서 제하여야 한다.
도 14-21은, 4종의 동백나무속 조성물을 각각 0.01% 또는 0.02% (w/v, 동백나무속 조성물의 고형분의 건조물을 기준으로, 배양 배지내 최종 농도) 내지 0.0001%의 범위로 다양한 용량으로 첨가한 후, 24시간 및 48시간, 5 ng/ml TGF-β의 존재 및 부재 조건에서 배양된 MCF-7 세포, TGF-β 부재 조건에서만 배양된 MDA-MB-435S 세포의 리덕타제 활성 규모를 예시한다.
실시예 15
동백나무속 생활성 조성물에 대한 비교 평가: MCF-7 세포
TGF-β 부재시, 조성물과 백차 추출물 (양성 대조군)은 검사한 최고 농도 (0.01%)에서 MCF-7에 의한 MTS 환원에 상당한 효과를 나타내었다. 이 농도에서, 동백나무속 조성물 A에 24시간 노출시킨 후, 리덕타제 활성은 유의하게 저해되었지만 완전히 저해되진 않았다 (~50-70% 저해). 비슷한 리덕타제 활성 저해는 백차 추출물에 24시간 노출 후에 검출되었다.
이와는 대조적으로, 동백나무속 세포즙으로부터 제조된 2종의 동백나무속 생활성 조성물 (막 분획 추출물 및 세포즙 세럼)은 TGF-β 부재 조건에서 MCF-7 세포의 리덕타제 활성에 대해 훨씬 강력한 저해제였다. 막 분획 추출물 (조성물 B)은, 용량 의존적으로 백차 추출물과 비슷한 양상을 나타내었는데, 단 효능이 약간 더 강하고, 검사한 최고 농도인 0.01%에서 실제 완전한 저해를 나타내었다. 또한, 세포즙 세럼 (조성물 D)도 0.01%에서 실제 완전한 저해를 나타내었지만, 0.0025%의 낮은 농도에서도는 리덕타제 활성을 자극하는 일부 증거가 나타났다. 조성물 D는 더 낮은 농도에서는 유의한 효과가 없었다.
MCF-7 세포를 성장인자 TGF-β의 존재하에 배양하면, 동백나무속 조성물에 대한 이 세포의 민감성이 현저하게 변형된다. 세포벽 분획 추출물 및 백차 추출물에 24 또는 48시간 노출시켰을 때, 어떠한 농도에서도 리덕타제 활성에 대한 자극 또는 저해 효과에 대한 증거는 없었지만, 백차 추출물의 경우 최고 농도 (0.01%)에서 20% 미만의 약간의 저해가 있었다.
반면, TGF-β-처리된 MCF-7 세포를 0.02%의 막 분획 추출물에 24시간 노출시키면, 리덕타제 활성이 70% 저해되었고, 48시간 이후에는 리덕타제 활성이 거의 완전히 없어졌다. 보다 약한 저해는 막 분획 추출물의 저 농도에서 24시간 후에 검출할 수 있었지만, 48시간 후에는 리덕타제 활성의 현저한 활성화가 검출되었다. 세포즙 세럼을 저 농도로 사용하였을 때 리덕타제 활성의 동일한 활성화와 최고 농도 (0.02%)에서의 현저한 저해는 노출 48시간 후에 검출되었지만, 이 조성물은 농도에 상관없이 24시간으로 훨씬 더 제한적인 노출 후에는 TGF-β-처리된 MCF-7 세포에서 리덕타제 활성에 겨우 최소한의 효과를 나타내었다.
평가 결과, 임의의 동백나무속 조성물들의 최고 농도에 24시간 노출시킨 경우, MCF-7 세포의 배양 배지로의 락틱 데하이드로게나제의 상당한 배출은 검출되지 않았다. 이는, 이들 세포에서의 미토콘드리아 기능 상실이 세포의 괴사성 세포용혈에 의해 수반되는 것이 아님을 나타낸다. 만일 세포가 노출한지 처음 48시간 동안 사멸 중이라면, 이는 프로그래밍된 세포 사멸 또는 세포자살 경로가 개시되었을 가능성이 높다. 이같은 결론은, 세포의 일부 만곡이 있지만, 노출되는 동안 파편 또는 막 단편들이 형성되지 않는 것으로 드러난, 광현미경 검경 결과로도 뒷받침된다.
따라서, 미토콘드리아의 기능 저해가 검사한 모든 동백나무속 생성물의 주된 작용 방식인 것으로 보이며, 분비된 락틱 데하이드로게나제의 농도에 의해 나타나는 바와 같이 세포독성 또는 괴사는 나타나지 않았다.
실시예 16
동백나무속 생활성 조성물의 비교 평가: MDA-MB-435S 세포.
동백나무속 조성물에 대한 MDA-MB-435S 세포의 반응 패턴은 MCF-7 세포에서와 비슷하였는데, 가장 효과적인 조성물은 조성물 B와 D였으며, 막 분획 추출물 (조성물 B)이 세포즙 세럼 (조성물 D) 보다 약간 더 효과적이었다. 막 분획 추출물은 불과 24시간의 노출로도 리덕타제 활성을 상당히 감소시켰다. 최고 농도 0.01%에서 대조군 리덕타제의 -70% 저해에 도달하였고, 매우 낮은 농도는 최소 농도 0.0001%에서도 -10%의 약간의 저해가 확실히 검출되었다. 다른 검사 조성물들은 24시간 노출 시 테스트한 최고 농도에서만 약간의 저해 효과만 나타내었다.
48시간 노출 후, 리덕타제 활성은 각 조성물의 존재 시 농도-의존적인 양상으로 저해되었지만, 조성물의 최고 농도에서의 효능은 막 분획 추출물을 제외하고는 100% 저해 근처에도 도달하지 못하였다. 이 조성물은 48시간 후 0.001%에서 -50%까지 리덕타제 활성을 저해하였다. 또한, 백차 추출물 및 세포벽 분획 추출물은 48시간 노출 후 MDA-MB-435S 세포에 대해 유의한 저해 활성을 나타내었으며, 이는 세포즙 세럼 보다 실제 우수하였다. 임의의 조제물들은 어떠한 농도에서도 노출 기간에 상관없이 이 세포주에 대해 리덕타제 활성의 활성화를 유발하진 않았다.
고도로 침습적이고, 전이성이며, 에스트로겐 불응성 세포주인 MDA-MB-435S에 대한 임의의 효과는 불과 24시간 후에는 관찰하기 어렵다는 것에 유념하여야 한다. 즉, 조성물 B의 24시간 및 48시간 이후의 효과는 매우 주목할만한 것이며, 이 조성물이 상당한 활성을 가진다는 것을 시사한다.
실시예 17
동백나무속 생활성 조성물에 대한 비교 평가: 단핵구성 세포에 대한 동백나무속 조성물의 효과
미토콘드리아 데하이드로게나제 활성: 유방 종양 세포주에 대한 예비 실험에서 드러난 경향들 중 어떤 것은 4종의 검사하는 동백나무속 조성물에 대한 Mono Mac 6 세포의 반응과 일치하는 것으로 입증되었다. 막 분획 추출물 (조성물 B)과 세포즙 세럼 (조성물 D)은 세포벽 분획 추출물 (조성물 A)과 백차 추출물 (양성 대조군) 보다 이 염증성 세포주에서 MTS 리덕타제 활성에 대한 보다 강력한 저해제였으며, 막 분획 추출물 (조성물 B)이 가장 강한 저해 효능을 명확하게 나타내었다. 10 nM PMA로 자극된 것과 무자극한 세포에서 MTS 리덕타제에 대한 효과를 조사하였으며, 동백나무속 조성물에 24시간 및 48시간 노출시킨 이후의 리덕타제 활성을 평가하였다. 이들 조성물이 Mono Mac 6 세포에서 MTS 리덕타제 활성에 미치는 효과는 도 22-33에 나타낸다.
백차 추출물은 PMA-자극된 세포에 48시간 노출 후 약하지만 농도 의존적인 리덕타제 저해 활성을 나타내었으며; PMA 부재시 농도 또는 노출 기간에 상관없이 리덕타제 활성의 상당한 소실은 나타나지 않았으며, PMA-처리 세포에 24시간 노출 후 어떠한 농도에서도 어떠한 효과가 없었다. 세포벽 분획 추출물은 세포가 PMA로의 자극 여부와 무관하게, 그리고 농도 및 노출 시간과 무관하게, Mono Mac 6 세포에 효과가 없었다.
동백나무속 생잎의 세포즙 세럼은 노출 24시간 또는 48시간 후 농도 의존적인 양상으로 무자극된 Mono Mac 6 세포에서 리덕타제 활성을 약간 저해하였다. 최고 농도 0.01% (w/v, 출발 조제물내 고형분의 건조물을 기준으로 배양 배지내 최종 농도)에서의 최대 저해는 대조군 활성의 ~20-30%에 불과하였다. PMA-자극된 세포의 저해는 대조군 활성의 50%였지만, 조성물 D의 최고 농도 (0.01%)에서만 그리고 48시간 노출 후에만 그러하였다.
신선하게 수확한 동백나무속의 막 분획 추출물 (조성물 B)은 유방 종양 세포주에 대해 그런 것처럼, Mono Mac 6 세포에서 리덕타제 활성을 저해하는데 있어 검사한 조제물들 중 가장 효과가 높은 것으로 입증되었다. 조성물에 대한 노출 기간 또는 PMA 자극 효과는 저해에 거의 영향이 없었으며, 이는 PMA 존재 또는 부재시 농도-의존적이며, 24시가 또는 48시간 노출 후에도 거의 동일하였다. 리덕타제 활성은 최고 농도 0.025에서 PMA 존재시 -70%까지, PMA 부재시 -80 - 90%까지 저해되었으며, 0.001%의 농도에서 보다 낮은 수준의 저해 (-15%)를 확실히 측정할 수 있었다. 리덕타제 활성 소실이 괴사성 세포용해와 관련없다는 것을 확인하기 위해 사이토졸 효소 분비 측정은 착수하지 않았으며, 막의 분획화 증거는 48시간 동안 임의의 생활성 조성물 0.02%에 노출된 Mono Mac 6 세포에 대한 광현미경 검경에서 볼 수 없었다. 아울러, 후술한 바와 같이, 세포는 MTS의 환원이 현저하게 감소된 조건에서 1종 이상의 MMP를 여전히 분비할 수 있는 것으로 보인다.
이들 결과는, 이들 세포에서 뿐만 아니라 유방 종양 세포주에서, 리덕타제 활성의 소실은 미토콘드리아 기능의 상대적으로 선택적인 소실과 연관있으며, 프로그래밍된 세포 사멸 또는 세포자살 경로의 개시를 반영할 수 있는 것으로 시사된다.
MMP 분비. 2가지 다른 분석을 이용하여, Mono Mac 6 세포에 의해 분비되는 2종의 젤라티나제, 즉 MMP-2 (젤라티나제 A) 및 MMP-9 (젤라티나제 B)의 수준을 측정하였다. 이들 MMP는 염증성 조직 손상 뿐만 아니라 종양의 침습 및 전이와 관련되어 있다. MMP-9 및 MMP-2에 대해 사용된 효소-연결된 면역흡착 분석 (ELISA)을 먼저 이용하여, 10 nM PMA과 여러가지 농도의 3종의 동백나무속 생활성 조성물 및 양성 대조군의 존재 하에 48시간 배양한 Mono Mac 6 세포의 배양 배지에서 효소 2종의 전체 농도를 추산하였다.
이 세포주는 자극받지 않았을 때에는 MMP-2만 분비하며, 활성화되면 MMP-9와 MMP-2 둘다를 분비한다 (MMP들이 24시간 후 분비되는 수준은 통상 매우 낮아 확실히 검출할 수 없음).
ELISA 측정 결과는 도 34-37에 나타낸다. Mono Mac 6 세포에 의한 MTS 환원에 대한 세포벽 분획 추출물과 백차 추출물의 효과에서 관찰된 바와 같이, 이들 추출물은 어떠한 농도에서도 MMP-2 또는 MMP-9의 분비 수준에 유의한 변화를 야기하지 않았다. 막 분획 추출물과 세포즙 세럼은, 최고 농도 (0.01% w/v)에서, MMP-2의 수준을 감소시키는 것으로 관찰되었으며, 막 분획 추출물은 이 농도에서 가장 강력한 효능을 나타내었다. MMP-2 분비에 대한 명백한 일부 자극이 조성물 B (0.001%) 및 조성물 D (0.002%)의 2번째 최고 농도에서 관찰되었다는 것에 주목하여야 한다. 이런 자극은 이들 조성물의 유사 농도에서 TGF-β 처리된 MCF-7 세포의 MTS 리덕타제 활성 자극을 연상시킨다.
ELISA에 의해 검출되는 MMP-2 수준의 농도-의존적인 저하는, 막 분획 추출물과 세포즙 세럼의 MMP-9 수준에 대한 효능과 비슷하지 않았다. 이들 수준은 최고 농도에서 증가되었고 (세포즙 세럼의 경우 명백하게 현저함), 이보다 낮은 검사 농도에서는 변화가 없었다. 불과 24시간 후 MTS 리덕타제 활성의 현저한 저해를 유도하는 농도의 동백나무속 조성물에 48시간 노출시킨 Mono Mac 6 세포에서 분비되는 MMP-9 수준에 대한 무변화 또는 증가 검출은, 동백나무속 막 분획 추출물 또는 세포즙 세럼에 노출된 Mono Mac 6 세포에서의 미토콘드리아 기능 상실이 MMP 분비가 갑자기 정지되는 괴사성 세포용해를 반영하는 것은 아니라는 추가적인 증거가 된다.
Mono Mac 6 세포에 의한 MMP 분비에 대한 동백나무속 조성물의 효능을 나타내는 추가적인 증거로서, 젤라틴 자이모그라피 기법을 사용하여, ELISA 측정을 위해 전술한 바와 같이 수집한 배양 배지를 검사하였다. 본 방법에서는, 배양 배지를 먼저 소듐 도데실 설페이트 (SDS-PAGE)이 첨가된 젤라틴-함침 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하여, 분자량을 기준으로 단백질을 분리하였다. 그런 후, SDS는 겔에서 세척 제거하여, 임의의 효소가 적어도 일부는 재생되게 하였고, 겔을 배지 중에 배양하여 MMP 활성을 최대화하였다. MMP는 존재할 수 있는 어떤 조건에서라도 젤라틴을 용해시킨다. 단백질 염색된 겔 벌크에서 분해되지 않는 젤라틴을 가시화한 후, 젤을 스캐닝하였으며, MMP는 염색된 백그라운드에서 투명한 구역으로서 나타났다. 여기에 네거티브 이미지도 나타내어, MMP를 밝은 백그라운드에 대비되는 어두운 구역으로서 표시한다.
MMP는 대부분의 세포에서 불활성 전구체로서 분비된 다음 세포외에서 활성화된다는 점에 주목하여야 한다. 그러나, 자이모그라피에 사용되는 서열의 변성 및 재생으로 인해, MMP의 이른바 불활성 프로-형태 (pro-form)도 젤라티나제 분해 활성을 획득하게 되어, 투명한 구역을 형성하게 된다. 도 34-37은, 동백나무속 조성물은 존재하지 않고, 10 nM PMA는 부재 (U) 또는 존재 (S)하는 조건에서 배양된 세포로부터 수집된 배양 배지와 더불어, 여러가지 동백나무속 생활성 조성물들에 Mono Mac 6 세포를 48시간 노출시킨 후 수집한 배양 배지에 대한 젤라틴 자이모그람 네거티브 이미지를 예시한다.
조성물 A와 양성 대조군의 효능은 조제물의 최저 농도 (0.0001%, "lo") 및 최고 농도 (0.01%, "hi")에서만 평가하였고, 조성물 B와 D의 효능은 중간 농도 0.001% ("med")에서도 평가하였다. 4가지 패널로부터, Mono Mac 6 세포는 PMA 부재시에는 MMP2 (~67 kD)만 분비하며, 이 효소는 프로-형태로 주로 발견되는 것으로 나타났다. 10 nM PMA 처리시 MMP-9 분비 (~92 kD)와 추가적인 단백질분해 활성이 유도되며, 추가적인 단백질분해 활성은 2종의 MMP를 일부 분자량이 낮은 활성 형태로 상당 수준 전환시킨다.
ELISA 결과와 일관되게, PMA-자극된 Mono Mac 6 세포를 세포벽 분획 추출물과 백차 추출물에 노출시켰을 때, 젤라틴 자이모그라피에 의해 가시화되는 2종의 MMP의 프로-형태 또는 활성 형태의 수준에는 검출가능한 수준의 효과는 없었다. 반면, 조성물 B와 D를 최고 농도로 사용하여 노출시키면, 젤라틴 자이모그라피에 의해 가시화되는 MMP-2의 수준의 현저한 저하가 나타났으며, MMP-9 수준에는 명확한 변화는 없었다.
MMP-9의 프로-형태 및 활성 형태의 출현과, 조성물 B 및 D를 최고 농도로 처리한 세포에서 수집된 배지에서 관찰되는 MMP-2의 활성 형태에 해당되는 연하지만 식별가능한 밴드 출현은, 이들 조성물의 효능이 주로 MMP-2의 분비 조절이며, 이들 배양 세포에서 MMP 활성화 기전에 대한 부가적인 작용에는 참여하지 않는다는 것을 시사해준다.
실시예 18
동백나무속 생활성 조성물에 대한 비교 평가: 결과 요약
실험 데이타는, 동백나무속 생활성 조성물들이 일반적으로 미토콘드리아 기능 소실에 기인한 MTS 리덕타제 활성의 농도-의존적인 감소를 촉발시킴을 나타낸다. 이런 저해는 검출하기 위해서는 48시간으로 긴 노출이 필요하며, 적어도 처음 24시간 동안에는 사이토졸 효소가 측정가능한 수준으로 방출되지 않는데, 이는 생활성 조성물이 괴사성 세포용해를 유발하기 보다는, 프로그래밍된 또는 세포자살성 세포 사멸 경로를 종양 세포에서 개시시킨다는 것을 시사해준다.
MCF-7 세포와 MDA-MB-435S 세포의 시간- 및 농도-의존성에 있어 차이와, MCF-7 세포의 TFG-β 처리 효과는, 노출한 지 처음 24시간이내에 리덕타제 활성의 상대적으로 약한 감소에 의해 입증되는 바와 같이, 이들 모두는, 백차 추출물과 세포벽 분획 추출물에 대해서는 보다 침습적이며 전이성 표현형의 다소 증가된 내성을 보이며, 세포즙 세럼에 대해서는 약간의 내성을 보임을 나타낸다. 그러나, 막 분획 추출물이 더 높은 효과를 가지는 경향은 TGF-β-처리된 MCF-7 세포 뿐만 아니라 MDA-MB-435S 세포에서 24시간 이내에 MTS 리덕타제 활성을 저해하는 저해력에 의해 입증된다.
인간 단핵세포/대식세포 모델인 Mono Mac 6 세포주에 대한 검사한 동백나무속 생활성 조성물의 효과는 유방 종양 세포주에서 관찰되는 효과와 특정 유사성을 가진다. 유방 종양 세포주의 배양 모델에서 락틱 데하이드로게나제의 부재 및 Mono Mac 6 세포주의 배양 배지에서 분비된 MMP-9의 정상 내지 증가된 수준의 존재를 토대로, 검사한 최고 농도 (0.01% w/v)에서도 이들 조성물들은 괴사성 세포용해를 유도하지 않는 것으로 결론내렸다.
그러나, 2종의 생활성 조성물들 (막 분획 추출물 및 세포즙 세럼)은 미토콘드리아 리덕타제 활성의 농도-의존적인 저해를 유도하는데, 이는 Mono Mac 6 세포에서 프로그래밍된 세포 사멸의 세포자살 경로의 개시를 반영한다. 아울러, 이들 염증성 세포들이 막 분획 추출물 및 세포즙 세럼에 노출되면, 젤라틴분해 효소 MMP-2 (젤라티나제 A)의 수준에 선택적인 감소가 발생된다. 젤라틴 자이모그라피는, "프로-형태" 또는 자이모겐 활성화 기전들은 동백나무속 생활성 조성물들에 의해 영향을 받지 않는 것으로 나타나, 배지내 MMP-2의 감소된 수준이 강화된 단백질 분해성 파괴를 반영할 가능성은 낮다.
따라서, 검사한 모든 세포주 (즉, 초기 단계의 인간 유방암 모델, 진행형 유방암 세포 모델 및 단핵구성 백혈병 모델)의 대사 활성은 막 분획 추출물 (조성물 B)에 의해 효과적으로 저해되었으며, 대부분의 경우 세포즙 세럼 (조성물 D)에 의해 효과적으로 저해되었다. 특히, 세포벽 분획 추출물 (조성물 A) 및 백차 추출물 (양성 대조군)은 조성물 B 및 D 보다 비활성이거나 또는 훨씬 효과가 낮은 것으로 입증되었다.
이러한 경향은 형질변환 성장 인자의 부재 및 존재 조건에서 검사한 MCF-7 인간 암 세포, MDA-MB-435S 진행형 인간 유방암 세포 및 자극 및 비-자극된 단핵구성 Mono Mac 6 세포들 모두에서 명확하게 나타났다. 생활성 동백나무속 조성물들의 검사 및 평가 결론에 대한 데이타는 표 15에 나타낸다.
표 15 - 생활성 동백나무속 조성물의 검사 및 평가 결과
세포주 및 모델 자극 배양 시간 백차 추출물
(양성 대조군)		 세포벽 분획 추출물 (조성물 A) 막 분획 추출물 (조성물 B) 세포즙 세럼 (조성물 D)
인간 암 세포 MDA-MB-435S
진행형 유방암		 24시간 약간의 저해 약간의 저해 강력 저해 약간의 저해
48시간 유의하나 불완전 저해 유의하나 불완전 저해 완전 저해 유의하나 불완전 저해
인간 암 세포 MCF-7
초기 유방암		 24시간 유의하나 불완전 저해 유의하나 불완전 저해 완전 저해 완전 저해
TGF-β 24시간 약간의 저해 효과 없음 유의하나 불완전 저해 완전 저해
48시간 약간의 저해 효과 없음 저용량에서 자극 및 고용량에서의 완전 저해 저용량에서 자극 및 고용량에서의 유의하나 불완전 저해
인간 백혈병 세포 Mono Mac 6
염증		 24시간 약간의 저해 약간의 저해 완전 저해 상당한 저해
48시간 효과 없음 효과 없음 유의하나 불완전 저해 상당한 저해
PMA 24시간 효과 없음 약간의 저해 유의하나 불완전 저해 유의하나 불완전 저해
48시간 약간의 저해 효과 없음 유의하나 불완전 저해 유의하나 불완전 저해
표 15는, 농도-의존적인 방식으로 세포 기능을 조절하는 동백나무속 조제물의 능력이 백차 추출물 = 세포벽 분획 추출물 > 세포즙 세럼 > 막 분획 추출의 순서로 높음을 보여준다. 실험 데이타에 따르면, 프레쉬 식물 조직을 세포즙 유래 막 분획 추출물 (조성물 B) 및 세포즙 세럼 (조성물 D)으로 가공함으로써 제조된 새로운 생활성 동백나무속 조성물은, 세포에 대해 어떠한 명확한 괴사성 독성을 촉발하지 않는 것으로 시사된다.
따라서, 본 발명의 기술은, 동백나무속 생활성 조성물들의 효능을 크게 증가시키며 기존의 동백나무속 기술에 의해 제조된 최상의 생성물 (예, 백차 추출물)에서 입증될 수 없는 생활성 인간 세포에 대한 활성을 나타내는 매우 인상적인 새로운 생성물을 제조하는 능력을 보여준다.
실시예 19
동백나무속 생활성 조성물에 대한 비교 평가: 향후 연구에 대한 암시
동백나무속 생활성 조성물의 세포-매개 단백질분해 활성에 미치는 효과는 염증성 조직 손상과 종양 침습 및 전이와 연루되어 있다. 따라서, 유방암 세포 및 단핵구성 백혈병 세포는 본 발명의 동백나무속 생활성 조성물에 대한, 주로 조성물 B (막 분획 추출물)에 대한 잠재적인 타겟으로서 분명히 제안될 수 있다. 대장암-유래 세포주 COLO 205는 MMP-2를 현저한 수준으로 분비하며, 이것은 이 세포에 의해 또한 분비되는 트립신-유사 효소에 의해 활성화되는 것으로 기존에 확인되었다. 이러한 타입의 종양 세포는 Mono Mac 6 세포를 이용한 결과에 따르면 본 발명의 동백나무속 생활성 조성물에 대한 다수의 잠재적인 타겟들 중 하나이다.
이들 연구들로부터, 본 발명의 프레쉬 동백나무속 식물로부터 분리된 생활성 조성물이 현저한 활성을 가지고 있어, 주요 세포 기능에 상당한 조절을 발휘한다고 확신할 수 있다. 관찰되어진 효과들은 퍼스널 케어 제품에서 건강보조제와 잠재적으로는 약제에 이르는 유용한 활용성을 가진다.
실시예 20
생활성 조성물들의 특정한 특징들을 측정하는데 사용되는 프로토콜
하기 내용은 생활성 조성물의 특정한 특징들을 측정하는데 사용되는 다양한 방법들이다. 이들 방법은 상기 실시예들 전체에 언급되어 있다. "검사 산물" 또는 "검사 샘플"에 대한 하기 언급은 생활성 조성물을 지칭한다.
방법 1: 고형분 함량 측정 방법. 고형분 함량 측정 절차는 물이 완전히 증발될 때까지 100℃ 수조에서 검사 대상인 생활성 조성물을 증발시키고, 샘플을 105℃ 온도의 오븐에 3시간 둔 후 실온으로 냉각시키고, 고형 물질과 용기의 무게를 즉시 측정하는 단계를 포함한다.
방법 2: 비-휘발성 잔류물의 측정 방법. 비-휘발성 잔류물을 측정하는 절차는 검사할 생활성 조성물을 5시간 동안 105℃에서 오븐에 두는 단계, 냉각시키는 단계 및 고형 물질과 용기의 무게를 즉시 측정하는 단계를 포함한다.
방법 3: L*a*b* 값 측정 방법. L*a*b* 값을 측정하는 절차는 0°/45°의 기하학적 배열로 측정하는 Hunter Labscan 픽스드 지오미트리 컬러미터를 사용하였다. 표준광 D65와 윗쪽으로 향하게 설치된 관측용 윈도우가 사용되었다. 검사할 생활성 조성물이 든 용기를 관측용 윈도우 위에 놓고, 아래에서 측정하였다. 아래 CIELAB 등식을 사용하였다:
Figure pct00001
방법 4: 총 카로테노이드 함량 및 루테인 함량 측정 방법. 검사할 생활성 조성물들을 아세톤으로 추출하였다. 균질화 및 진공 여과 후, 추출물들 모두 메탄올 중의 30% 포타슘 하이드록사이드를 사용하여 사포닌화하였다. 카로테노이드는 페트롤륨 에테르를 사용하여 생활성 조성물들로부터 성공적으로 추출하였다. 에탄올 중에 추가로 처리 및 재-용해화한 후, 샘플들은 모두 446 nm에서 측정하였다.
루테인 함량을 측정하기 위해, 각 샘플 추출에서 수득한 부가적인 건조 샘플들은 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC") 분석에 이용하였다. 건조된 샘플을 MTBE 및 메탄올에 재-용해시켰다. (250 x 4.60 mm I.D.) 5 ㎛ C18 컬럼 ("Vydac")이 장착된 역상 HPLC 시스템을 사용하였다. 루테인 물질은 믿을 수 있는 표준물질을 함께-크로마토그래피로 분석함으로써 동정하였다. 에탄올 중의 루테인의 몰 흡광 계수는 144,800 cm-1 mol-1이다.
방법 5: 엘라스타제 저해 활성 측정 방법. 검사할 생활성 조성물들의 엘라스타제 저해 활성은, 호중구 엘라스타제 ("엘라스틴 프로덕츠"에서 제조한 정제된 효소 조제물)와 합성 펩타이드 용해성 기질인 "Sigma" 사의 메톡시숙시닐-Ala-Ala-Pro-Val-p-니트로아닐리드를 사용하는 분석을 이용하여 측정하였다. 기질의 효소적 분해로 시간 경과에 따라 노란색이 점점 진해졌으며 (405 nm); 발색율은 저해 활성을 가진 검사 생활성 조성물들의 농도 증가에 따라 저하된다. 저해의 농도 의존성을 분석하면, 50% 저해를 달성하는데 필요한 각 검사 생활성 조성물내 건조물의 농도 (IC50)로서 표시되는, 저해 활성의 효능을 정량화할 수 있으며, 또한, 저해 방식과 관련된 정보도 제공해준다.
IC50을 측정함에 있어, 엘라스타제의 농도는 2.5 ㎍/ml이었고, 기질의 농도는 150 μM이었다. Ki 측정시, 기질의 농도는 100 μM 및 200 μM이었다.
방법 6: 젤라티나제 B (MMP-9) 저해 활성 측정 방법. 다른 프로테나지를 세척 제거한 후, 면역 인지에 의해 멀티웰 마이크로플레이트 상에서 젤라티나제 B를 특이적으로 포획하는, 상업적으로 유통되는 분석 (MMP-9 활성 ELISA, 제조사 "Amersham Pharmacia")을 이용하였다. 효소 활성은 젤라티나제 B: APMA에 대한 저분자량의 합성 기질의 가수분해에 의해 405 nm에서 검출하였다. 저해의 농도 의존성 분석을 이용하여, 검사할 생활성 조성물의 건조물의 효능을 측정하였다.
방법 7: 슈퍼옥사이드 포착 활성 측정 방법. 크산틴 옥시다제 (정제된 효소 조제물, 제조사 "Sigma")를 이용하는 효소 시스템을 사용하여, 슈퍼옥사이드 음이온을 고수율로 그리고 조절된 양상으로 발생시켰다. 이 효소에 의한 크산틴의 하이드로크산틸으로의 변환은 다량의 슈퍼옥사이드 음이온을 발생시키며, 패리사이토크롬 C의 패로사이토크롬 C로의 환원을 슈퍼옥사이드 수준에 대한 민감한 척도 (sensitive measure)로서 사용하였다. 검사할 생활성 조성물을 반응 시스템에 투입하였을 때 패로사이토크롬 C 수준 측정 (550 nm)으로, 슈퍼옥사이드 포착 활성을 측정할 수 있다. 웰 당 최종 농도는 사이토크롬 c는 75 μM, 크산틴은 425 ㎛/L, 크산틴 옥시다제는 10 mU/ml이었다.
방법 8: 시험관내 독성 및 세포자살 측정 방법. CellTiter 96 AQueous 원 솔루션 세포 증식 분석 및 CytoTox 96 비-방사성 세포독성 분석 및 이하 프로토콜을 사용하였다 (이들 분석의 제조사: Promega Corporation, Madison, Wis.).
첫번째 분석은 테트라졸륨 화합물 (3-(4,5-다이메틸티아아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨, 내부 염(inner salt); MTS 및 전자 커플링 시약 (페나진 메토설페이트; PMS)을 이용하는 살아있는 세포의 수를 측정하는 비색법이다. MTS는 조직 배양 배지내 세포 용해에 의해, 490 nm에서 최대 흡광도를 가지는 포르마잔 산물로 생물학적으로 환원된다. MTS의 수용성 포르마잔으로의 변환은 대사적으로 활성인 세포에서 발견되는 데하이드로게나제 효소에 의해 달성되며, 포르마잔 산물의 양은 배양물내 살아있는 세포의 수와 정비례한다.
두번째 분석은 세포 용혈시 분비되는 안정적인 세포졸 효소인 락테이트 데하이드로게나제 (LDH)를 정량적으로 측정한다. 세포 배양 상층액 중의 분비된 LDH는 30분 결합형 효소 분석으로 측정하며, 그 결과로 테트라졸륨 염 (INT)는 적색 포르마잔 산물로 변환된다. 발색 정도는 세포용혈된 세포의 수와 비례한다.
방법 9: 자극된 세포에 의해 분비되는 효소의 수준 측정 방법. PMA와 인큐베이션한 후, Mono Mac 6 세포는 2종의 젤라틴분해성 매트릭스 메탈로프로테나제, MMP-2 (젤라티나제 A)와 MMP-9 (젤라티나제 B)를 분비한다. 검사할 생활성 조성물의 존재 조건에서의 이들 효소의 수준은 2차원 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정하였다.
실시예 21
동백나무속 생성물의 특정한 생활성 특징들을 검사하는데 사용된 세포주들
진행형 유방암 모델로 간주되는 세포주 MDA-MB-435S는 American Type Culture Collection (ATCC Number HTB-129)에서 입수하였다. 이 세포주는 다음과 같은 ATCC 배지에서 37℃에서 배양하였다: 레보비츠의 L-15 배지 + 2 mM L-글루타민 + 0.01 mg/ml 인슐린, 90%; 소 태아 혈청, 10%.
초기 또는 덜 탈-분화된 유방암 모델로 간주되는 세포주 MCF-7은 ATCC (Number HTB-22)에서 입수하여, 다음과 같은 ATCC 배지에서 37℃에서 배양하였다: 최소 필수 배지 (Eagle) + 2 mM L-글루타민 및 1.5 g/L 소듐 바이카보네이트, 0.1 mM 비-필수 아미노산 및 1 mM 소듐 피루베이트를 함유하며, 0.01 mg/ml 소 인슐린, 90%; 소 태아 혈청, 10%가 첨가된, 이글스의 BSS.
세포주 MonoMac6 (MM6, 독일 미생물 세포주 은행에서 입수함) (Ziegler-Heitbrock et al., "Establishement of Human Cell Line (Mono Mac 6) with Characteristics of Mature Monocytes," International Journal of Cancer 41:456-461 (1988), 이는 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨)는 분화된 인간 단핵세포와 매우 유사하다. 이 세포는 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 1 mM 소듐 피루베이트, 10% FCS, 비-필수 아미노산, 9 ㎍/ml 인슐린 및 1 mM 옥살아세트산이 첨가된 RPMI 1640 배지에서 유지시켰다. 분석 조건에서는 0.2% 글루코스도 첨가하였다.
실시예 22
동백나무속 생성물에 대한 카테킨 분석
본 발명의 세포벽 분획 추출물, 막 분획 추출물 및 세포즙 세럼에서 다양한 카테킨의 함량을 분석하였다. 백차 샘플을 대조군으로 사용하였다. 다음과 같은 카테킨들을 분석하였다: (-)-에피갈로카테킨; (+)-카테킨; (-)-에피카테킨; (-)-에피갈로카테킨 갈레이트; (-)-갈로카테킨 갈레이트; 및 (-)-에피카테킨 갈레이트.
샘플을 0.1% H3PO4를 이용하여 추출하고, 약 15분간 초음파처리하였다. 이를 원심분리한 후, 추출물을 HPLC에 주입하였다. C-18 역상 컬럼은 정지상으로서 사용하였다. 0.1% 인산 및 아세토니트릴은 이동상으로 사용하였다. 280 nm에서 검출하였다. 열거된 각 카테킨의 면적을 이의 순수한 표준물질과 비교한 결과를 토대로 계산한다. 그 결과는 도 38 및 표 16에 나타낸다 (하기 참조).
표 16 - 생활성 동백나무속 조성물의 카테킨 함량
샘플 분석 화합물 건조물 100% 기준 평균 mg/g 생성물 기준 평균 mg/g
백차 추출물 (-)에피갈로카테킨 0.3 0.0033
(+)-카테킨 1.33 0.0146
(-)-에피카테킨 0.15 0.0017
(-)-에피갈로카테킨 갈레이트 0.65 0.0071
(-)-갈로카테킨 갈레이트 0.003 0.0000
(-)-에피카테킨 갈레이트 0.212 0.0023
세포벽 분획 추출물 (-)에피갈로카테킨 0.00 0.0000
(+)-카테킨 2.39 0.0201
(-)-에피카테킨 0.01 0.0001
(-)-에피갈로카테킨 갈레이트 0.01 0.0001
(-)-갈로카테킨 갈레이트 0.00 0.0000
(-)-에피카테킨 갈레이트 0.006 0.0001
막 분획 추출물 (-)에피갈로카테킨 2.27 0.1552
(+)-카테킨 8.96 0.6121
(-)-에피카테킨 0.60 0.0409
(-)-에피갈로카테킨 갈레이트 9.28 0.6340
(-)-갈로카테킨 갈레이트 0.01 0.0006
(-)-에피카테킨 갈레이트 2.33 0.1589
세포즙 세럼 (-)에피갈로카테킨 3.01 0.1714
(+)-카테킨 6.09 0.3465
(-)-에피카테킨 0.95 0.0539
(-)-에피갈로카테킨 갈레이트 1.97 0.1120
(-)-갈로카테킨 갈레이트 0.04 0.0024
(-)-에피카테킨 갈레이트 0.57 0.0325
실시예 23
특정 동백나무속 생성물의 기능성 음료 및 퍼스널 케어 제품들
서론: 살아있는 차 식물의 분말 적용
피부는 신체에서 가장 크고, 다른 사람에게 가장 가시적인 장기이다. 이의 외양은 외측 손상과 국소 케어 뿐만 아니라 사람의 전체적인 건강 상태와 안녕을 반영한다. 최근 엡스타인의 리뷰에 따르면, 건강한 대사 유지, 구체적으로는 인슐린 민감성, 혈당 수준 및 아미노산의 적절한 섭취와 관련된 건강한 대사 유지는, 피부를 더 젊어보이게 유지하는데 중요하다. 동시에, 산화적 손상과 염증의 악순환을 제어하는 것도 중요하다 [1].
Lesley E. Rhodes 등의 최근 연구는, 녹차 화합물, 즉 녹차 카테킨의 경구 복용하였을 때, 잠재적인 건강상의 이점을 제시하고 있다. 녹차 카테킨 대사산물은 인간 피부에 통합되어, 전-염증성 에이코사노이드 12-하이드록시에이코사테트라에노익 산의 생산 감소와 관련하여 UV 조사-유발성 경피 염증을 보호하는 것으로 발견되었으며, 이는 일광화상 염증 보호 및 잠재적으로 보다 장기간의 UVR-매개 손상으로부터 보호하는데 기여할 수도 있다 [2].
따라서, 차 식물, 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)는 안으로부터, 그리고 외면으로부터 피부 건강에 기여하는데 일조할 수 있다.
구성 성분, Recentia® CS는, Zeta Fraction™ 기법을 통해 살아있는 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)로부터 유래되는 잠재적인 퍼스널 케어 용도로 개발되었으며, 이의 다중기능성 활성은 이전에 Koganov et al. in the November 2012 issue of Personal Care magazine [3]에 개시된 바 있다.
본 실시예 23은, 잠재적으로 "안에서 기인한 아름다움" 개념을 뒷받침할 수 있는 기능성 음료용; 및 항산화 특성을 가진 국소 퍼스날 케어 제형용 생차 식물의 적용성에 대한 지속적인 연구를 포괄한다. 아울러, 본 실시예 23은 전통적인 녹차 및 백차 제품과 시판 차-기재 음료 대비 이 성분을 기재로 하는 음료 조제물의 비교 평가 결과를 포함한다.
Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) - "안에서 기인한 아름다움" 개념을 뒷받침하는 기능성 음료 용도
Zeta Fraction™ 기술을 사용하여, 기능성 음료 제품 Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis), 및 국소 코스메틱 용품, Recentia® CS 식물 세럼 분획용 유용 성분으로서 개발하였다.
퍼스널 케어 Recentia® CS [3]를 위한 성분과, 기능성 음료 제품을 위한 잠재적인 성분으로서 개발된 Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) 간의 차이는 특정 용도에 적합한 제조 용법과 보존 시스템과 관련있다.
Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) 대 전통적인 홍차 및 녹차 조제물
Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis), 녹차 및 홍차의 전통적인 조제물들은 미국 사우스 캐롤리나 중심부 위드맬로 아일랜드에 위치한 찰스턴 차 농장에서 2014년 6월에 수확한 동일 차 품종으로부터 수득하였다. 동일 품종을 사용하는 것은 차 식물로부터 유래된 여러가지 조제물들을 정확하게 비교하는 데 중요하며; 품종 타입이 차 제품의 특성에 현저하게 영향을 미칠 수 있는 것으로 Karori 등에 의해 입증되었으며 [4]; 따라서, 동일 품종의 사용은 품종 타입과 관련된 가변성을 없애준다.
Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)의 제조: Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)는 Koganov US 7,473,435; 8,043,635 및 8,318,220에 기술된 공정에 따라 제조하였으며, 이 문헌들은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다 [5-7].
홍차의 전통적인 제조: 탈이온수를 가열 - 약 99℃로 가열하고; 깡통 형태의 루즈 티 (tin grade loose) 2.0 g을 비이커에 넣고; 물이 적정 온도에 도달하면 물을 차가 든 비이커에 붓고; 비이커를 엎고 4분간 자기 교반기 위헤 두었으며; 4분 경과 후, 비이커를 교반기에서 꺼내고, 홍차 조제물을 여과기를 통해 통과시키고, 실온으로 냉각시켰다.
녹차의 전통적인 제조: 탈이온수를 가열 - 약 85℃로 가열하고; 깡통 형태의 루즈 티 (tin grade loose) 2.0 g을 비이커에 넣고; 물이 타겟 온도에 도달하면 물을 차가 든 비이커에 붓고; 비이커를 엎고 2분간 자기 교반기 위헤 두었으며; 2분 경과 후, 비이커를 교반기에서 꺼내고, 녹차 조제물을 여과기를 통해 통과시키고, 실온으로 냉각시켰다.
분석 평가 결과
살아있는 차 식물로부터 유래된 Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)와 전통적인 홍차 및 녹차 조제물의 물리-화학적 파라미터를 아래 표 17에 나타낸다.
표 17 - Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)와 전통적인 홍차 및 녹차 조제물의 물리-화학적 파라미터*
파라미터 Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) 전통적인 홍차 조제물 전통적인 녹차 조제물
건조물 (% w/w) 6.40 0.20 0.12
굴절도 (nD) 1.34399 1.33311 1.33303
밀도 (g/cm3) 1.0264 0.9977 0.9974
삼투질 농도 (mOsm/kg) 569 13 10
*모든 분석 평가는 비-보존된 조제물을 평가하기 위해 신속하게 진행되었다.
LC (액체 크로마토그래피) - Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis), 전통적인 홍차 및 녹차 조제물들에 대한 ELSD (Evaporative Light Scattering Detector) 평가를 수행하였다.
ELSD 절대 신호 세기 대 체류 시간을 도 39에 나타내며; 상대적인 ELSD 신호 강도 대 체류 시간을 도 40에 나타낸다.
도 39에서 피크의 높이 차이는 검사 항목에서 각 성분들의 농도 차이를 나타낸다.
도 40에서, 동일 데이타는 피크들의 위치들과 그 크기 비율을 나타내기 위해 각 신호 세기의 최소 "0"에서 최대 "1"로 축척하여 나타낸다.
LC (액체 크로마토그래피) - DAD (Diode Array Detector) 평가도 수행하였다. 각 LC-DAD 3차원 크로마토그램들은 도 41-43에 나타낸다.
이들 특정화 및 핑거프린팅 방법에서 수득한 데이타는 전통적인 홍차 및 녹차 조제물들에 비해 Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) 조성물에 주목할만한 정성적인 차이가 있다는 것을 보여준다. Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)는 고형분 함량이 높고, 특정 피크들이 더욱 명확하게 표시되며, 화합물의 다양성이 더 높다. 전체적으로, Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)는 전통적인 홍차 및 녹차 조제물들 보다 농도가 훨씬 높고, 더 많은 성분들을 함유하며; 이의 특정화는 진행 중에 있다.
LC-MS (액체 크로마토그래피 - 질량 분광측정)에 의해 분석한 L-테아닌 농도
L-테아닌은 차 식물의 잎에서만 주로 발견되는 비-필수 아미노산으로서, 보충제로서 복용하였을 때 다양한 건강상의 이점을 제공해준다 [8]. 일부 회사에서 생산하는 피부 케어 제품들이 화장품에 L-테아닌을 함유시키기 시작하고 있다. 예를 들어, 더마스크립티브즈 (Dermascriptives) 사에서는 스트레스 받은 피부에 수분과 영양을 제공하기 위해 나이트 크림에 L-테아닌을 포함시킨다 [9].
3종의 샘플에서 L-테아닌의 함량을 아래 표 18에 나타낸다.
표 18 - 살아있는 차 식물로부터 유래된 Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) VS. 전통적인 홍차 및 녹차 조제물들에서의 L-테아닌 비교
Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) 전통적인 홍차 조제물 전통적인 녹차 조제물
L-테아닌 (㎍/ml) 1150 23 33
L-테아닌 (㎍/ml) 3000+ 23 33
액체 크로마토그래피 - 질량 분광측정 분석은 Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)이 전통적인 홍차 및 녹차 조제물들에 비해 L-테아닌을 훨씬 높은 농도로 포함하는 것으로 나타났다.
Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) VS. 전통적인 홍차 조제물, 전통적인 녹차 조제물 및 시판 차-기재의 음료의 항산화 활성
시판 차-기재 음료의 성분 (라벨 정보) 및 물리-화학적 파라미터는 아래 표 19에 나타낸다.
표 19 - 시판 차-기재 음료의 성분 및 물리-화학적 파라미터
시판 음료 라벨 정보 건조물 (%w/w) 밀도 (g/cm 3 ) 삼투질 농도 (mOsm/kg) RI (nD)
A 프리미엄 우린 녹차: 여과수, 고 프럭토스 옥수수 시럽 (글루코스-프럭토스 시럽), 꿀, 시트르산, 천연 향료, 인삼 추출물, 아스코르브산 (비타민 C) 6.99 1.0280 451 1.34342
B 프리미엄 우린 녹차: 여과수, 꿀, 시트르산, 비타민 C, 천연 향료, 슈크랄로스 (Splenda brand), 아세설팜, 포타슘, 인삼 추출물 0.42 1.0003 30 1.33349
C 여과수, 당, 녹차 농축물, 아세로라 열매 추출물, 시트르산, 녹차, 천연 향료 5.95 1.0022 323 1.34168
D 여과수, 녹차 농축물, 시트르산, 녹차, 아스코르브산 (비타민 C), 녹차 추출물, 슈크랄로스, 당, 천연 향료, 아세설팜 포타슘 0.09 0.9780 15 1.33304
E 물, 당, 천연 향료, 녹차, 아스코르브산 (색을 보호용), 인산 8.16 1.0300 302 1.34452
F 여과수, 당, 천연 향료, 시트르산, 아스코르브산 (비타민 C), 녹차 추출물, 카라멜 색소, 과라나 (paullinia cupana) 종자 추출물, 파낙스 인삼 뿌리 추출물 9.93 1.0400 632 1.34823
G 정제수, 유기농 설탕, 공정 무역 유기농 녹차 잎, 유기농 꿀, 천연 향료, 시트르산, 아스코르브산 (비타민 C) 3.88 1.0130 153 1.33859
H 우린 녹차, 당, 천연 향료, 시트르산, 아세로라 열매 추출물, 펙틴, 꿀 6.67 1.0240 284 1.34274
I 여과수, 유기농 설탕, 유기농 녹차, 천연 향료, 시트르산, 아스코르브산 (비타민 C) 7.21 1.0270 393 1.34368
J 프리미엄 우린 음료는 가장 세분된 차 잎을 사용하여, 간단히 w/여과수, 유기농 이눌린 (유기농 식물 섬유소), 유기농 레몬 주스, 천연 향료 및 유기농 녹차로 제조됨 1.01 1.0018 23 1.33425
K 프리미엄 우린 녹차: 여과수, 고 프럭토스 옥수수 시럽 (글루코스-프럭토스 시럽), 농축물 유래 레몬 주스, 천연 향료, 아스코르브산 (비타민 C), 슈크랄로스 (Splenda brand) 아세설팜 포타슘 5.6 1.0232 383 1.34206
Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis), 전통적인 홍차 및 녹차 조제물들 대 시판 차-기재의 음료의 상대적인 ORAC 활성을 도 44에 나타낸다.
ORAC 검사는 시판 제조물인 검사용 녹차 음료의 결과를 보여주며, ORAC 최고 결과는 최저 결과의 약 5배 이상이다. 검사한 전통 차 조제물들의 활성은 이 범위 안에 해당된다. 그러나, 음료들의 항산화 활성은 차 이외의 다른 소스로부터 일부 유래된 것이다 - 예를 들어, 시트르산 및 아스코르브산, 일부 경우에는 허브 추출물. Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)의 활성은 검사한 시판 녹차 음료의 최상의 결과 보다 20배 이상 높으며, 심지어 5% Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) 조제물도 검사한 시판 음료 보다 우수하였다. 이는, Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)가 기존 음료에 항산화 활성을 첨가하거나 또는 베이스 활성 성분으로서 이를 이용한 기능성 음료 제조에 효과적인 성분일 수 있다는 것을 시사한다.
항산화 특성을 가진 퍼스널 케어 제형
퍼스널 케어 제형을 대상으로 표 20에 나타낸 바와 같이 항산화 특성에 대해 조사하였다.
표 20 - 0.5% Recentia ® CS가 첨가된 세럼 젤*
INCI 명칭 상품명 % w/w 공급사
수상　
물 (Aqua) 탈이온수 86.75% 　
다이소듐 EDTA Dissolvine® NA2-S 킬레이트 0.15% AkzoNobel Functional Chemicals
소듐 메타바이설이트 소듐 메타바이설파이트 0.05% Sigma-Aldrich
하이드록시프로필 전분 포스페이트 STRUCTURE® XL 전분 6.00% AkzoNobel Global Personal Care
부틸렌 글리콜 부틸렌 글리콜 5.00% Univar, USA
카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) 꽃/잎/줄기 즙 Recentia® CS 0.50% AkzoNobel Global Personal Care
소듐 벤조에이트 (및) 포타슘 소르베이트 Euxyl® K 712 0.50% Schulke & Mayr GmbH
완충제 상　
시트르산 시트르산 0.23% Sigma-Aldrich
트리소듐 사이트레이트 이수화물 트리-소듐 사이트레이트 이수화물 0.82% Kraft Chemical
pH 조절 상
시트르산 (및) 물 25% 시트르산 용액 pH 5.0-5.5가 되게 첨가 　
총: 100.00%
* Recentia® CS가 첨가되지 않은 세럼 젤 베이스는 Recentia ® CS 대신 탈이온수를 포함함.
Recentia® CS가 첨가된 세럼 젤과 Recentia® CS이 첨가되지 않은 세럼 젤 베이스의 항산화 활성을 ORAC 분석에서 평가하였다. 이들 제형은 평가하기 전 2개월 간 RT 및 45℃에서 보관하였다. 이들 제품의 상대적인 ORAC 활성 %는 도 45에 나타낸다.
퍼스널 케어 프로토타입에 대한 데이타에서 나타나는 바와 같이, Recentia® CS의 항산화 효과는 베이스 세럼 젤 제형의 효과 보다 우수하다. 45℃에서 2개월간 수행된 가속화된 안정성 검사시에는, 제형의 항산화 효과가 세럼 젤 베이스의 경우 ~11%까지 감소된 반면, Recentia® CS이 첨가된 세럼 젤은 ~4%까지 감소하는 것에 불과하였다. 데이타에 따르면, Recentia® CS는 퍼스널 케어 젤 프로토타입에서 그 활성을 유지하며, 제형의 다른 성분들의 항산화 활성을 보존하는데 일조한다.
방법
삼투질 농도, 단위 매스 용액 (unit mass solution) 당 용질 입자의 수 (예, 밀리오스몰/kg)는 Advanced Instruments, Inc (Norwood, MA, USA) 사의 영점 감압 삼투압기 (Freezing point depression Osmometer) Model 3250를 설명 매뉴얼에 따른 절차에 따라 사용하여 측정하였다.
굴절률, nD, 진공에서의 빛 속도/다른 매질에서의 빛 속도의 비는, 빛이 하나의 매질에서 다른 매질로 통과할 때 광선이 굴절되는 정도를 측정하는 것으로, Reichert Technologies (Depew, NY, USA) 사의 Reichert Arias 500 굴절계를 설명 매뉴얼에 따른 절차에 따라 사용하여 측정하였다.
밀도, 단위 부피에 대한 질량 값 (예, g/cm3)으로, Mettler-Toledo LLC (Columbus, OH, USA) 사의 Densito 30 PX 밀도계를 설명 매뉴얼에 따른 절차에 따라 사용하여 측정하였다.
건조물은 24시간 동안 105℃에서 샘플로부터 휘발성 화합물과 물을 증발시키고 남은 물질의 %로서, Ohaus Corporation (Parsippany, NJ, USA) 사의 Ohaus Explorer E00640 Analytical Balance와 SPX Thermal Product Solutions (Rochester, NY, USA) 사의 Lindberg Blue M Gravity Oven을 일반 실험 실무에 따른 절차에 따라 사용하여 측정하였다.
LC (액체 크로마토그래피) - ELSD (Evaporative Light Scattering Detector) 또는 DAD (Diode Array Detector). 원료 4 ㎕를 각각 주입한 3종의 샘플을 역상 C18 컬럼 (Kinetex C18 Coreshell, 4.6 mm i.d. x 10 cm, 2.6 ㎛ 입자 크기, 및 100 Å 포어 크기, Phenomenex, USA)가 장착된 Agilent 1260 infinity LC system을 사용하여 40℃에서 분리시켰다. 용매 농도 구배는 용매 A (100% 물 + 0.1% 포름산)와 용매 B (100% 아세토니트릴 + 0.1% 포름산)를 유속 0.8 mL/min으로 혼합하여 형성하였다. 25분 LC 농도구배는 다음과 같이 구축하였다: 0 ~ 0.5분 동안 5% 용매 B (등용매); 0.5 ~ 6.5분 간5 %-30% 용매 B (선형; 6.5 ~ 13.5분 간 30 %-100 % 용매 B (선형); 13.5~18.5분 간 100 % 용매 B (등용매); 18.5 ~ 20분간 100 % ~ 5 % 용매 B (선형); 20 ~ 25분간 5 % 용매 B (등용매). 데이타는 ELSD (Model 300S, SofTA Corporation, Westminster, CO, USA)와 DAD (1040A, Hewlett-Packard)에 의해 여러 파장들 (UV=204nm, 254nm, 270nm, 280nm, 320nm, 350nm 및 410nm)에서 수집하였다.
L-테아닌 분석을 위한 LC-MS (액체 크로마토그래피-질량 분광측정). 샘플을 LC-MS 분석하기 전에 희석하였다: Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)는 100배 희석하고, 전통적인 홍차 및 녹차 조제물들은 10배 희석하였다. 정량 보정 곡선을 작성하기 위해, L-테아닌 표준물질을 다양한 농도로 준비하였다. Aqua C18 컬럼 (4.6 ㎛ i.d.x15 cm, 5 ㎛ 입자 크기 및 125 Å 포어 크기, USA)이 장착된 Agilent 1100 LC 시스템을 사용하여,샘플을 등용매 (80% 물 + 20% 아세토니트릴 + 0.1% 포름산) 용리로, 4분간 유속 0.8 mL/min으로 흘려주어 샘플을 분리하였다. LC 시스템은 전기분무 이온화 (ESI) 소스 (LCT Premier, Waters Corporation, Milford, MA, USA)를 통해 TOF (Time-of-Flight) 질량 분광측정기와 연결시켰으며, MS 스펙트럼을 스캔 범위 m/z 50-500 m/z (파지티브 모드)에서 획득하였다. L-테아닌은 체류시간 ~1.9분에 용출되었고, 이것의 특징적인 이온 175.2 m/z에 의해 정량되었다.
산소 라디칼 흡수력 (ORAC). (www.biotek.com/resources/docs/ORAC_Assay _Application_Note.pdf)에서 이용가능한 BioTek 사의 "Performing Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) Assays with Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader" 어플리케이션 노트에 기술되어 있으며 BioTek Instruments Inc (Winooski, VT) 사의 Synergy 2 마이크로플레이트 리더를 함께 이용하기 위해 변형된, 방법을 이용하여 ORAC 테스트에 의해 항산화 활성을 측정하였다. 이 분석에서, AAPH (2, 2'-아조비스 2-아미노-프로판)는 형광 프로브 (소듐 플루오레세인)에 손상을 입히는 반응성 산소 종을 발생시킨다. (R)-트롤록스 메틸 에테르와 같은 항산화제는 이런 손상을 방지 또는 서행시키며, 그 효과는 형광 측정법으로 정량할 수 있다. 형광 판독값을 37℃에서 2시간 동안 연속 수집하였으며, 이때 여기 파장 485 nm, 방출 파장 528 nm, 반응 부피 200 ㎕, AAPH 농도 55 mM, 소듐 플루오레세인 농도 1.33 μM, 및 (R)-Trolox 메틸 에테르 농도 80 μM - 2 μM로 설정되었다. 소듐 플루오레세인 (Fluka 46960), AAPH (Sigma 440914) 및 (R)-Trolox 메틸 에테르 (Fluka 93509)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 사에서 구입하였다. AUC (곡선 하 면적) 값은 비율의 합으로서 계산하였다 (웰의 현 형광 판독값을 웰의 1차 형광 판독값으로 나눔). 탈이온수가 든 웰의 AUV 평균값을, (R)-Trolox 메틸 에테르가 든 웰의 AUC 및 검사 샘플이 든 웰의 AUC에서 제하여, 항산화제에 의한 형광 보존에 해당되는 AUC를 구한다. 보정 그래프는 웰의 항산화제-관련 AUC의 함수로서 작성하며, 이는 (R)-Trolox 메틸 에테르 중량-상응성 (weight-equivalent) ORAC 활성을 보여준다. 샘플의 희석물은 Scientific Industries, Inc (Bohemia, NY) 사의 Vortex Genie 2를 이용하여 탈이온수로 제조하였다. 세럼 젤 샘플은 25% - 3.125%의 w/w 농도로 희석하고, 기존의 차 조제물들은 10% - 0.31%의 w/w 농도로 희석하고, Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)는 2% - 0.13%의 w/w 농도로 희석하였다. 검사 물품들에 대한 ORAC 활성은 (R)-Trolox 메틸 에테르 1 단위 중량에 의해 발생되는 1에 해당되는 항산화 효과를 달성하는데 필요한 검사 물품의 단위 중량으로서 계산하였으며, 값이 낮을 수록 ORAC 활성이 높다는 것을 의미한다.
결론
적용된 특정화 및 핑거프린팅 방법들을 통해 수득한 데이타는, 전통적인 홍차 및 녹차 조제물들과 비교하여, Zeta Fraction™ 기법을 이용하여 수득한 Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)의 조성물에 주목할만한 정성적인 차이가 있음을 보여준다. Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)는 고형분의 함량이 높고, 특정 피크가 더 명확하게 표시되며, 화합물의 다양성이 높으며; 아울러, 전통적인 홍차 및 녹차 조제물들 보다 L-테아닌의 농도가 훨씬 더 높다. 전체적으로, Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)는 전통적인 홍차 및 녹차 조제물들 보다 농도가 훨씬 높고, 더 많은 성분을 함유한다. Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)의 활성은 검사한 시판 녹차 음료의 최상의 성능 보다도 20배 이상 높고, 심지어 5% Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) 음료 프로토타입도 검사한 모든 시판 음료를 능가한다. 이는, Purecentia™ 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)가 기존 음료에 항산화 활성을 첨가하거나 베이스 활성 성분으로서 이를 이용한 기능성 음료 제조의 주요 성분일 수 있음을 시사한다. 화장품 성분 Recentia® CS는 퍼스널 케어 프로토타입에서 항산화 활성을 보유하며, 제형의 다른 성분의 항산화 활성을 유지시키는데 일조한다.
실시예 23에 대한 언급
실시예 23에서는 하기 문헌들이 참조된다:
[1] Howard A. Epstein. The challenges of formulating "beauty from within" products for skincare. Monographic supplement series: Anti-Aging&Beauty Inside. Household and Personal care Today n 1/2012 & AgroFOOD Industry hi-tech vol 23 n 1 January/February 2012, pp. 23-2;
[2] Lesley E. Rhodes, Gemma Darby, Karen A. Massey, Kayleigh A. Clarke, Tristan P. Dew, Mark D. Farrar, Susan Bennett, Rachel E. B. Watson, Gary Williamson and Anna Nicolaou. Oral green tea catechin metabolites are incorporated into human skin and protect against UV radiation-induced cutaneous inflammation in association with reduced production of pro-inflammatory eicosanoid 12-hydroxyeicosatetraenoic acid. British Journal of Nutrition, available on CJO2013. doi:10.1017/S0007114512006071;
[3] Michael Koganov, Olga Dueva-Koganov, Artyom Duev, Paul Recht, Steven Micceri. Managing the effects of photoaging of skin. Personal Care, November 2012, pp. 89-92;
[4] Karori, S. M., Wachira, F. N., Wanyoko, J. K. and Ngure, R. M. Antioxidant capacity of different types of tea products. African Journal of Biotechnology Vol. 6 (19), pp. 2287-2296, 4 October 2007;
[5] Koganov, M., U.S. Patent No. 7,473,435. Bioactive compositions form Theacea plants and processes for their production and use;
[6] Koganov, M., U.S. Patent No. 8,043,635. Bioactive compositions form Theacea plants and processes for their production and use;
[7] Koganov, M., U.S. Patent No. 8,318,220. Bioactive compositions form Theacea plants and processes for their production and use;
[8] www.bigelowtea.com/health/articles/l-theanine-how-a-unique-anxiety-reducer-and-mood-enhancer-increases-alpha-waves-and-alertness-.aspx;
[9] www.livestrong.com/article/103022-benefits-using-l-theanine/.
본원의 참조문헌에 대한 인용은 이러한 참조문헌이 본 발명에 대한 종래 기술임을 용인하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 참조문헌들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
바람직한 구현예들이 본원에 상세히 기술 및 설명되어 있지만, 해당 분야의 당업자라면 본 발명의 사상으로부터 이탈되지 않으면서 다양한 수정, 추가, 치환 등이 행해질 수 있다는 것이 자명할 것이므로, 이는 첨부된 청구항에 정의되는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 간주된다.

Claims (54)

  1. 차나무과 식물 (Theacea plant) 유래의 분리된 생활성 분획을 포함하며,
    상기 생활성 분획이 세포벽 분획, 세포벽 분획 추출물, 막 분획, 막 분획 추출물, 세포질 분획, 세포질 분획의 추출물, 세포즙 세럼 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것인,
    생활성 조성물 (bioactive composition).
  2. 제1항에 있어서, 상기 생활성 분획이 세포벽 분획인 것을 특징으로 하는 생활성 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 생활성 분획이 세포벽 분획 추출물인 것을 특징으로 하는 생활성 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 세포벽 분획 추출물은 건조물 (dry matter) 1 g 당 총 카테킨 함량이 약 2.1 내지 약 4.5 mg인 것을 특징으로 하는 생활성 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 세포벽 분획 추출물이,
    세포벽 분획 추출물의 건조물 1 g 당 (+)-카테킨 약 2.0 내지 약 3.0 mg;
    세포벽 분획 추출물의 건조물 1 g 당 (-)-에피카테킨 약 0.005 내지 약 0.02 mg;
    세포벽 분획 추출물의 건조물 1 g 당 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트 약 0.005 내지 약 0.02 mg; 및
    세포벽 분획 추출물의 건조물 1 g 당 (-)-에피카테킨 갈레이트 약 0.003 내지 약 0.01 mg인, 카테킨 함량 프로파일을 가지는 것을 특징으로 하는 생활성 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 생활성 분획이 막 분획인 것을 특징으로 하는 생활성 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 생활성 분획이 막 분획 추출물인 것을 특징으로 하는 생활성 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 막 분획 추출물은 건조물 1 g 당 총 카테킨 함량이 약 15.0 내지 약 30.5 mg인 것을 특징으로 하는 생활성 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 막 분획 추출물이,
    막 분획 추출물의 건조물 1 g 당 (-)-에피갈로카테킨 약 1.7 내지 약 3.3 mg;
    막 분획 추출물의 건조물 1 g 당 (+)-카테킨 약 6.1 내지 약 10.2 mg;
    막 분획 추출물의 건조물 1 g 당 (-)-에피카테킨 약 0.3 내지 약 1.1 mg;
    막 분획 추출물의 건조물 1 g 당 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트 약 6.2 내지 약 12.5 mg;
    막 분획 추출물의 건조물 1 g 당 (-)-갈로카테킨 갈레이트 약 0.007 내지 약 0.03 mg; 및
    막 분획 추출물의 건조물 1 g 당 (-)-에피카테킨 갈레이트 약 1.3 내지 약 3.3 mg인, 카테킨 함량 프로파일을 가지는 것을 특징으로 하는 생활성 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 생활성 분획이 세포질 분획인 것을 특징으로 하는 생활성 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 생활성 분획이 세포질 분획의 추출물인 것을 특징으로 하는 생활성 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 생활성 분획이 세포즙 세럼인 것을 특징으로 하는 생활성 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세포즙 세럼은 건조물 1 g 당 총 카테킨 함량이 약 8.0 내지 약 20.0 mg인 것을 특징으로 하는 생활성 조성물.
  14. 제7항에 있어서, 상기 세포즙 세럼이,
    세포즙 세럼의 건조물 1 g 당 (-)-에피갈로카테킨 약 2.1 내지 약 4.4 mg;
    세포즙 세럼의 건조물 1 g 당 (+)-카테킨 약 4.2 내지 약 8.6 mg;
    세포즙 세럼의 건조물 1 g 당 (-)-에피카테킨 약 0.2 내지 약 2.0 mg;
    세포즙 세럼의 건조물 1 g 당 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트 약 1.2 내지 약 3.2 mg;
    세포즙 세럼의 건조물 1 g 당 (-)-갈로카테킨 갈레이트 약 0.01 내지 약 0.1 mg; 및
    세포즙 세럼의 건조물 1 g 당 (-)-에피카테킨 갈레이트 약 0.2 내지 약 1.3 mg인, 카테킨 함량 프로파일을 가지는 것을 특징으로 하는 생활성 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 차나무과 식물이 동백나무속 식물 (Camellia plant) 또는 사스레피나무 속 식물 (Eurya plant)인 것을 특징으로 하는 생활성 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 동백나무속 식물은 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis), 카멜리아 자포니카(Camellia japonica), 카멜리아 레티쿨레이트(Camellia reticulate) 및 카멜리아 사산쿠아(Camellia sasanqua)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생활성 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 사스레피나무 속 식물은 유리아 샌드위센시스(Eurya sandwicensis)인 것을 특징으로 하는 생활성 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 안정화제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생활성 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 안정화제는 유화제, 보존제, 항산화제, 폴리머 매트릭스 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생활성 조성물.
  20. 포유류에게 국소 적용하기 위한 생활성 국소 제형으로서,
    상기 생활성 국소 제형은,
    국소적으로 유효한 함량의 제1항에 따른 생활성 조성물과
    국소적으로 허용가능한 담체를
    포함하는 것을 특징으로 하는 생활성 국소 제형.
  21. 제20항에 있어서, 상기 국소적으로 허용가능한 담체는 친수성 크림 베이스, 친수성 로션 베이스, 친수성 계면활성제 베이스, 친수성 젤 베이스, 친수성 용액 베이스, 소수성 크림 베이스, 소수성 로션 베이스, 소수성 계면활성제 베이스, 소수성 젤 베이스 및 소수성 용액 베이스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생활성 국소 제형.
  22. 제20항에 있어서, 상기 생활성 조성물은 상기 생활성 국소 제형의 총량에 대해 약 0.001% 내지 약 90% 범위의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 생활성 국소 제형.
  23. 제1항에 따른 생활성 조성물 1종 이상을 포함하는 음료.
  24. 제23항에 있어서, 상기 음료는 액체 중에 분산된 상기 생활성 조성물 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 음료.
  25. 제24항에 있어서, 상기 액체는 물, 숏 드링크 (shot drink), 기능성 음료, 녹차, 우롱차, 홍차, 백차, 가향차 (flavored tea), 청량 음료, 커피, 우유, 셰이크, 알코올 음료, 무-알코올 음료, 스포츠 음료, 과일 주스, 야채 주스, 인공 감미료 첨가 주스, 탄산수, 펀치, 사이다 및 영양 보충 음료로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 음료.
  26. 제23항에 있어서, 상기 차나무과 식물이 동백나무속 식물 (Camellia plant) 또는 사스레피나무 속 식물 (Eurya plant)인 것을 특징으로 하는 음료.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 동백나무속 식물은 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis), 카멜리아 자포니카(Camellia japonica), 카멜리아 레티쿨레이트(Camellia reticulate) 및 카멜리아 사산쿠아(Camellia sasanqua)로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 사스레피나무 속 식물은 유리아 샌드위센시스(Eurya sandwicensis)인 것을 특징으로 하는 음료.
  28. 제1항에 따른 하나 이상의 생활성 조성물을 포함하는 치료학적 음료 (therapeutic beverage).
  29. 제28항에 있어서, 상기 음료는 액체 중에 분산된 상기 생활성 조성물 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 치료학적 음료.
  30. 제29항에 있어서, 상기 액체는 물, 숏 드링크 (shot drink), 기능성 음료, 녹차, 우롱차, 홍차, 백차, 가향차 (flavored tea), 청량 음료, 커피, 우유, 셰이크, 알코올 음료, 무-알코올 음료, 스포츠 음료, 과일 주스, 야채 주스, 인공 감미료 첨가 주스, 탄산수, 펀치, 사이다 및 영양 보충 음료로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 치료학적 음료.
  31. 제28항에 있어서, 상기 차나무과 식물이 동백나무속 식물 (Camellia plant) 또는 사스레피나무 속 식물 (Eurya plant)인 것을 특징으로 하는 치료학적 음료.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 동백나무속 식물은 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis), 카멜리아 자포니카(Camellia japonica), 카멜리아 레티쿨레이트(Camellia reticulate) 및 카멜리아 사산쿠아(Camellia sasanqua)로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 사스레피나무 속 식물은 유리아 샌드위센시스(Eurya sandwicensis)인 것을 특징으로 하는 치료학적 음료.
  33. 제1항에 따른 하나 이상의 생활성 조성물을 포함하는 건강 보조제 (nutriceutical product).
  34. 제33항에 있어서, 상기 차나무과 식물이 동백나무속 식물 (Camellia plant) 또는 사스레피나무 속 식물 (Eurya plant)인 것을 특징으로 하는 건강 보조제.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 동백나무속 식물은 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis), 카멜리아 자포니카(Camellia japonica), 카멜리아 레티쿨레이트(Camellia reticulate) 및 카멜리아 사산쿠아(Camellia sasanqua)로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 사스레피나무 속 식물은 유리아 샌드위센시스(Eurya sandwicensis)인 것을 특징으로 하는 건강 보조제.
  36. 제1항에 따른 하나 이상의 생활성 조성물을 포함하는 기능성 식품.
  37. 제36항에 있어서, 상기 차나무과 식물이 동백나무속 식물 (Camellia plant) 또는 사스레피나무 속 식물 (Eurya plant)인 것을 특징으로 하는 기능성 식품.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 동백나무속 식물은 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis), 카멜리아 자포니카(Camellia japonica), 카멜리아 레티쿨레이트(Camellia reticulate) 및 카멜리아 사산쿠아(Camellia sasanqua)로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 사스레피나무 속 식물은 유리아 샌드위센시스(Eurya sandwicensis)인 것을 특징으로 하는 기능성 식품.
  39. 음료를 제조하기 위해, 차나무과 식물로부터 유래되는 1종 이상의 생활성 조성물을 액체에 분산하기 위한 디바이스로서,
    상기 디바이스는
    반-투과성 막을 구비한 여과용 파우치 또는 백; 및
    상기 여과용 파우치 또는 백 (bag)에 담긴 제1항에 따른 1종 이상의 생활성 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 디바이스.
  40. 제39항에 있어서, 상기 액체는 물, 숏 드링크 (shot drink), 기능성 음료, 녹차, 우롱차, 홍차, 백차, 가향차 (flavored tea), 청량 음료, 커피, 우유, 셰이크, 알코올 음료, 무-알코올 음료, 스포츠 음료, 과일 주스, 야채 주스, 인공 감미료 첨가 주스, 탄산수, 펀치, 사이다 및 영양 보충 음료로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 디바이스.
  41. 제39항에 있어서, 상기 음료는 치료학적 음료인 것을 특징으로 하는 디바이스.
  42. 제39항에 있어서, 상기 차나무과 식물이 동백나무속 식물 (Camellia plant) 또는 사스레피나무 속 식물 (Eurya plant)인 것을 특징으로 하는 디바이스.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 동백나무속 식물은 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis), 카멜리아 자포니카(Camellia japonica), 카멜리아 레티쿨레이트(Camellia reticulate) 및 카멜리아 사산쿠아(Camellia sasanqua)로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 사스레피나무 속 식물은 유리아 샌드위센시스(Eurya sandwicensis)인 것을 특징으로 하는 디바이스.
  44. 음료의 제조 방법으로서,
    제39항에 따른 디바이스를 제공하는 단계;
    상기 디바이스의 1종 이상의 생활성 조성물을 액체에 분산시키는데 효과적인 조건에서 상기 디바이스에 액체를 접촉시켜, 상기 1종 이상의 생활성 조성물을 포함하는 음료를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 디바이스는 상기 1종 이상의 생활성 조성물의 저분자량의 환원된 또는 비-산화된 성분들이 액체 중에 분산되게 하는데 효과적인 조건 하에 상기 액체와 접촉되는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제44항에 있어서, 상기 액체는 물, 숏 드링크 (shot drink), 기능성 음료, 녹차, 우롱차, 홍차, 백차, 가향차 (flavored tea), 청량 음료, 커피, 우유, 셰이크, 알코올 음료, 무-알코올 음료, 스포츠 음료, 과일 주스, 야채 주스, 인공 감미료 첨가 주스, 탄산수, 펀치, 사이다 및 영양 보충 음료로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제44항에 있어서, 상기 음료는 치료학적 음료인 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제44항에 있어서, 상기 차나무과 식물이 동백나무속 식물 (Camellia plant) 또는 사스레피나무 속 식물 (Eurya plant)인 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제48항에 있어서,
    상기 동백나무속 식물은 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis), 카멜리아 자포니카(Camellia japonica), 카멜리아 레티쿨레이트(Camellia reticulate) 및 카멜리아 사산쿠아(Camellia sasanqua)로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 사스레피나무 속 식물은 유리아 샌드위센시스(Eurya sandwicensis)인 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제1항에 따른 1종 이상의 생활성 조성물을 포함하는 용액, 현탁액, 분산액, 페이스트 (paste) 또는 건조 분말을 포함하는,
    차나무과 식물로부터 유래된 1종 이상의 생활성 조성물을 전신 또는 국소 투여하기 위한 제형.
  51. 제50항에 있어서, 상기 차나무과 식물이 동백나무속 식물 (Camellia plant) 또는 사스레피나무 속 식물 (Eurya plant)인 것을 특징으로 하는 제형.
  52. 제51항에 있어서,
    상기 동백나무속 식물은 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis), 카멜리아 자포니카(Camellia japonica), 카멜리아 레티쿨레이트(Camellia reticulate) 및 카멜리아 사산쿠아(Camellia sasanqua)로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 사스레피나무 속 식물은 유리아 샌드위센시스(Eurya sandwicensis)인 것을 특징으로 하는 제형.
  53. 제50항에 있어서, 상기 제형은 액체와 혼합하여 기능성 음료를 제조하는데 사용하기 위한 건조 분말을 포함하는 것을 특징으로 하는 제형.
  54. 제50항에 있어서, 상기 제형은 액체와 혼합하여 기능성 음료를 제조하는데 사용하기 위한 상기 1종 이상의 생활성 조성물의 농축액을 포함하는 것을 특징으로 하는 제형.
KR1020157024366A 2013-02-08 2014-02-10 차나무과 식물로부터 유래된 생활성 조성물 및 이의 음료, 기능성 식품, 건강보조제, 보충제 등으로서의 용도 KR20150125662A (ko)

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