KR20140029597A - 참까막살 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 인간 피부세포의 세포사멸 억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 참까막살(Polyopes affinis)의 추출물을 포함하는 자외선에 의한 인간 피부각질세포의 세포사멸 억제용 조성물에 관한 것으로, 참까막살의 추출물이 인간 HaCaT 피부각질세포에서 자외선으로 인한 세포 손상에 대해 광보호 효과, 자유라디칼 소거 활성, 자외선 흡수 활성, 지질 과산화 및 단백질 카르보닐 형성을 억제하고 DNA 손상을 저해하여 세포를 보호하는 활성을 나타냄으로써 자외선에 의해 유도된 세포 사멸을 감소시키고, 세포를 보호하여 세포 생존력을 회복시킬 수 있어 기능성 화장료 조성물 및 자외선에 의한 피부 치료 및 보호용 조성물의 용도로 활용할 수 있는 효과가 있다.

Description

참까막살 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 인간 피부세포의 세포사멸 억제용 조성물{UV-induced Apoptosis in Human Keratinocytes Suppressing Composition Containing Extract of Polyopes affinis}

본 발명은 참까막살 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 인간 피부세포의 세포사멸 억제용 조성물 및 자외선에 의한 피부손상 억제와 피부치료용 조성물에 관한 것이다.

피부는 기본적인 신진대사 과정을 통하여 우리 몸의 항상성을 저해하는 다양한 외부 요인으로부터 위해를 막아주는 일차적인 기능을 담당하고 있다. 즉, 피부는 신체 가장 바깥쪽에 위치함으로써 물리적, 화학적, 생물학적 장벽기능을 통한 보호작용, 체온조절작용, 감각작용, 분비 및 배설작용, 흡수작용, 저장작용, 재생작용 등의 다양한 역할을 수행하고 있지만, 지속적인 외부 스트레스가 가해지는 경우 가장 손상을 받기 쉽다. 이러한 외부 스트레스의 주요 원인으로는 자외선 노출, 배기가스, 황사, 환경오염물, 중금속, 온도변화, 미생물을 대표적인 예로 들 수 있다. 이들은 주로 산화적 스트레스(oxidative stress)를 통하여 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성함으로써, 항산화 방어체계를 붕괴시켜 세포 손상 및 사멸을 야기하게 된다. 특히, 자외선 B가 DNA 손상, 광노화 및 피부암을 일으키는 주요 요인으로 보고되었다(Fisher, G. J. New Engl. J. Med. 337 : 1419 (1997), Kang, S. et al., Arch. Dermatol. 133 : 1280 (1997)). 자외선 B는 히드록시 라디칼, superoxide anion 등과 같은 활성산소종의 생성을 유도하여 산화적 스트레스 및 항산화 방어기전의 불균형을 초래하여 염증반응, 광노화 및 피부암 등의 질병을 심화시킬 수 있다.

따라서, 외부 스트레스로부터 피부 세포를 보호하고 노화를 예방하기 위해서는 활성산소로 인한 산화적 스트레스를 억제하고, 활성산소를 효율적으로 제거할 수 있는 항산화 방어 강화가 중요하며, 최근에는 인체에 무해하고 보다 강력한 항산화력을 가진 천연 물질에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

현재 활성산소종을 제거하는 항산화 효소인 superoxide dismutase(SOD), catalase 및 항산화제인 비타민 C, 비타민 E 등이 피부노화, 피부암 발생을 억제한다고 보고되고 있다. 또한, 미용, 식품의 소재로 사용되고 있는 성분들은 히아루론산, 포도씨 추출물, 이소플라본, 콜라겐, 세라마이드, 코엔자임 Q10, 콘드로이틴, 리코펜, 알파 리포산 등이며, 이들의 피부미용효과는 주로 항산화 기능으로부터 기인하고 있다(박장서, 식품과학과 산업, 40, 19 (2007)).

그 외, 한국공개특허 제2010-0021341호는 귀룽나무 추출물을 천연 항산화 조성물로 제안하고, 한국공개특허 제2009-70455호는 초임계 자초 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 효과를 갖는 화장료 조성물에 관한 기술을 제시하고 있으며, 한국공개특허 제2009-92898호에서는 정향, 백단향, 감송향, 침향, 귤홍, 회향, 곽향, 백복령, 백급, 백작약, 백과, 백삼, 백질려 및 백렴으로 구성되는 생약 추출물과 칠향팔백산을 함유하는 것을 특징으로 하는 항산화 효과를 갖는 화장료 조성물에 관한 기술을 제시하고 있다. 한국특허등록 제899502호에서는 석류, 무화과, 은행, 오디로 구성된 혼합물의 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 항산화 효과가 있는 화장료 조성물에 관한 기술을 제시하고 있다. 또한, 한국특허등록 제898307호에서는 금은화, 백작약, 고삼, 황금, 오배자, 녹차, 도엽, 은행잎으로부터 추출된 한방식물 추출물을 함유하여 항산화 효과를 갖는 화장료 조성물에 관한 기술을 제시하고 있다. 한국공개특허 제2011-0115499호는 미역, 모자반, 다시마, 해마, 석결명, 청각, 모려 및 해룡 중 어느 1종 이상의 해양생물의 열수 추출물을 포함하는 항산화 조성물을 제안하고 있다.

그러나 아직까지 참까막살 추출물의 자외선 흡수효과에 관해서는 보고된 바 없다.

한국공개특허 제2011-0115499호 한국특허등록 제898307호

이에 본 발명자들은 천연물을 이용한 기능성 약제학적 소재를 연구하던 중, 참까막살 추출물이 자외선 조사로 인해 발생하는 세포 내 자유라디칼 소거활성에 따른 항산화효과 뿐만 아니라, 이러한 자외선 자체를 흡수하는 효과 및 자외선 조사에 의해 유발되는 세포자연사(apoptosis) 억제를 통한 세포보호 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 자외선 흡수 효과, 세포 내 자유라디칼 소거 효과 및 자외선 조사에 의해 유발되는 세포자연사(apoptosis) 억제 효과를 가지는 참까막살 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 참까막살 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선 흡수용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 UVB에 의해 인간 피부각질세포에서 발생하는 세포손상을 방지하고, 활성산소종의 소거능을 가지며 세포사멸을 감소시킬 수 있는 참까막살 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 세포사멸 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 참까막살(Polyopes affinis)의 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 인간 피부각질세포의 세포사멸 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 알코올(에탄올) 추출물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 참까막살 추출물을 25μg/ml 내지 200μg/ml의 농도로 함유하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 참까막살(Polyopes affinis)의 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부손상 억제 또는 피부치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 참까막살 추출물을 25μg/ml 내지 200μg/ml의 농도로 함유할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 알코올(에탄올) 추출물일 수 있다.

나아가 본 발명은 참까막살(Polyopes affinis)의 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선 흡수용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 알코올(에탄올) 추출물일 수 있다.

본 발명에 따른 참까막살 추출물은 자외선 조사에 따라 발생하는 세포 내 자유라디칼 소거활성을 통한 항산화 효과가 뛰어날 뿐만 아니라 자외선 자체를 직접적으로 흡수하는 작용 및 자외선에 의해 유도된 세포자연사(apoptosis)를 억제할 수 있는 효과가 우수하므로, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물은 피부세포를 자외선으로부터 효과적으로 보호할 수 있어 피부보호 및 피부치료에 유용하게 사용될 수 있다. 특히 이러한 추출물은 천연물질로서, 식용 가능한 물질에 해당하므로, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 장기적 사용에도 안전한 이점을 가진다.

도 1a는 참까막살 추출물의 H₂O₂ 및 UVB로 유발된 DPPH의 소거능을 DCF-DA 염색 후 분광형광계로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다(PAE:참까막살 추출물; 이하 같다).
도 1b는 참까막살 추출물을 농도별로 처리하였을 때 세포의 생존율을 MTT 분석을 통해 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 1c는 잔틴(xanthine)과 잔틴산화효소(xanthine oxidase)가 DMPO와 반응해서 생산된 초산화 음이온(superoxide anion)과 DMPO/^.OOH 부산물을 ESR spectrometry로 분석해 결과를 피크 및 그래프로 나타낸 도면이다.
도 1d는 Fenton 반응(H₂O₂+FeSO₄)에 의해 생성된 하이드록시 라디칼을 DMPO와 반응시키고, 생성물인 DMPO/·OH 부산물을 ESR spectrometry로 분석해 결과를 피크 및 그래프로 나타낸 도면이다.
도 2는 자외선/가시광선 분광분석(spectroscopic measurement)으로 200-500nm에서 분석한 참까막살 추출물의 UVB 흡수능을 나타낸 도면으로서, 피크 1과 2는 각각 261nm와 336nm에서의 위치를 나타낸 것이다.
도 3a는 참까막살 추출물을 처리했을 때 세포내 산화 스트레스에 대한 효과를 분석하기 위해 8-isoprostane의 수치를 측정해 지질 과산화를 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 여기서 *는 대조군과 현저하게 다르다는 것을 의미하고(p<0.05), **는 UVB를 조사한 세포와 현저하게 다르다는 것을 의미한다(p<0.05).
도 3b는 참까막살 추출물을 처리했을 때 세포내 산화 스트레스에 대한 효과를 분석하기 위해 카르보닐 형성의 양을 측정하여 단백질 산화를 분석한 결과이다. 여기서 *는 대조군과 현저하게 다르다는 것을 의미하고(p<0.05), **는 UVB를 조사한 세포와 현저하게 다르다는 것을 의미한다(p<0.05).
도 3c는 comet assay를 수행하여 세포 내 DNA 손상의 비율과 이미지를 나타낸 도면이다. 여기서 *는 대조군과 현저하게 다르다는 것을 의미하고(p<0.05), **는 UVB를 조사한 세포와 현저하게 다르다는 것을 의미한다(p<0.05).
도 4a는 Hoechst 33342 염료로 염색한 세포에서 형광현미경을 통해 아폽토시스 소체(apoptotic body,화살표) 관찰하고 정량화한 결과를 나타낸 도면이다. 여기서 *는 대조군과 현저하게 다르다는 것을 의미하고(p<0.05), **는 UVB를 조사한 세포와 현저하게 다르다는 것을 의미한다(p<0.05).
도 4b는 키트를 이용해 세포질의 히스톤 결합된 DNA 단편화를 정량화한 결과를 나타낸 도면이다. 여기서 *는 대조군과 현저하게 다르다는 것을 의미하고(p<0.05), **는 UVB를 조사한 세포와 현저하게 다르다는 것을 의미한다(p<0.05).

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

용어 "약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 자외선에 노출된 인간 HaCaT 케라티노사이트(keratinocyte)가 세포사멸 과정을 거치는데, 참까막살의 추출물을 세포에 처리하게 되면 자외선에 의해 유발되는 활성 산소종의 생성을 억제하여 세포의 산화 스트레스를 억제하는 활성이 있어 세포(인체 각질형성세포)의 생존율을 향상시켜, 궁극적으로 자외선에 의한 세포자연사를 억제하여 세포를 보호하는 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

UV-B는 활성산소종을 생성하여 산화적 스트레스를 유발함으로써 다양한 피부 구성 세포에 손상을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 이는 궁극적으로 광노화 과정을 가속화시킨다. 한편, 본 발명에서는 참까막살 추출물을 이용하여 자유라디칼 소거능, UV-B 조사로 인한 세포독성 및 산화적 사멸 억제능, 세포내 항산화능을 비교실험을 통하여 본 발명의 참까막살 추출물이 항산화 효과를 갖는 조성물로서 적절하다는 사실을 최초로 확인하였다.

참까막살(Polyopes affinis)은 북태평양 서안에 분포하며, 홍조식물문의 지누이과에 속하는 해조류로서, 식물체는 연골질로 적갈색 또는 부분적으로 황갈색을 띠고 줄기는 원기둥 모양이며 위로 갈수록 납작해지면서 두 갈래로 가지를 내고 넓어지며 끝은 조금 부푼 형태를 지닌다. 또한 줄기는 피층이 두꺼워지면서 굵어지는 형태를 가지고 있으며, 피층은 작은 구슬모양의 세포가 식물체의 표면에 수직으로 줄을 지어 이루어졌고 수조직은 조금 꾸불꾸불한 실 모양의 세포로 이루어졌으며, 조간대에서 자라는 것으로 알려져 있으나, 이러한 참까막살에 대한 효능 연구는 거의 연구되어진 것이 없다.

이에 본 발명에서는 참까막살이 자외선으로부터 세포를 보호하는 활성이 우수하다는 사실을 확인하였는데, 구체적으로 참까막살 추출물, 바람직하게는 참까막살의 에탄올 추출물이 인간 HaCaT 피부각질세포에서 자외선 유발 세포 손상에 대한 광보호 효과를 가지며, 특히 자외선 유발로 인한 활성산소종의 생성을 억제하고 산화 스트레스를 억제하며 UVB로 인한 세포 사멸을 억제해 세포의 생존율을 농도 의존적으로 높인다는 사실을 알 수 있었다.

UVB 빛은 활성산소정의 생성을 촉진시키고, 산화 스트레스를 유도하는 것으로 알려져 있다(Heck, et al., 2003; Jin et al., 2007). 따라서 본 발명의 참까막살 추출물을 처리하는 것은 피부 각질세포를 UVB에 의해 유도되는 산화 스트레스를 막는데 효과적이며, UVB 조사된 세포에서 참까막살 추출물이 활성산소종을 제거하여 이의 생성을 억제시켰다. 이러한 결과는 본 발명의 일실시예를 통해 참까막살 추출물이 세포 내 DPPH 라디칼, 초산화 음이온(superoxide anion), 하이드록시 라디칼을 제거하는 활성이 있음을 입증하였다.

또한, 참까막살 추출물의 자외선에 의한 세포보호 효과는 흡수 스펙트럼 분석결과에서 볼 수 있듯이 UV를 흡수하는 능력과 관련이 있다. 따라서 참까막살 추출물은 세포를 공격하는 광자의 수를 줄일 수 있다. 많은 광 protector 중에, 천연 항산화제는 효과적인 UVB로 인한 산화적 피부 손상을 줄일 수 있는 방법이다. 따라서 본 발명에서는 참까막살 추출물이 UVB를 직접적으로 흡수함으로써 피부 세포를 보호할 수 있음을 알 수 있었다.

한편, 지질 세포막은 UVB에 의해 손상을 쉽게 받을 수 있으며, UVB 방사선은 DNA 가닥이 절편화되도록 하여 궁극적으로 세포 사멸을 초래하게 된다. 또한, 단백질 카르보닐화는 산화 스트레스로 유도된 단백질 손상에서 바이오마커 역할을 한다(Pirinccioglu et al., 2010). 그리고 단백질 카르보닐기가 변형된 것이 축적된 것은 세포 기능을 저해한다.

본 발명에 따른 참까막살 추출물은 본 발명의 일실시예를 통해 UVB에 의한 지질 과산화와 단백질의 변형을 억제하며, 세포 내 DNA가 손상되는 것으로부터 보호할 수 있는 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다.

또한 본 발명의 참까막살 추출물은 UVB로 유도되는 세포자연사의 강한 유도제인 활성산소종의 생성 억제와 세포 내에서의 아폽토시스소체(apoptotic body) 수의 감소 및 DNA 단편화(fragmentation) 억제를 통해 궁극적으로 UVB 방사선에 의해 초래된 세포 자연사에 의한 세포 사멸을 억제할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

그러므로 상기와 같은 특징을 갖는 본 발명의 참까막살 추출물은 자외선에 의한 피부손상을 억제하고 자외선으로부터 피부를 보호하는데 유용하게 사용될 수 있어, 참까막살 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부 손상 억제 및 피부치료용 약제학적 조성물로 사용될 수 있으며, 또한 자외선 흡수용 조성물로도 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 참까막살은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된 ‘추출물’은 적절한 용매를 이용하여 참까막살로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 참까막살의 열수추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함할 수 있다.

참까막살로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 당업계에서 허용되는 용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있다. 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있으나, 바람직하게는 에탄올을 사용할 수 있다.

또한, 추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 참까막살 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 참까막살 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다.

따라서 본 발명에 있어서 참까막살 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.

약제학적 조성물

이러한 참까막살 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 참까막살 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.00001 ~ 30 중량%로 포함될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 피부 외용제 조성물일 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 자외선 흡수 효과를 가지고 있는바, 피부에 바를 수 있는 피부 외용제나 자외선 흡수용 화장료 조성물로서 자외선 차단제 등으로 활용할 수도 있다.

본 발명의 피부외용 약제학적 조성물은 자외선으로부터 피부보호 및 치료 효과를 갖는 피부외용제로서 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

화장료 조성물

또한, 본 발명의 조성물은 참까막살 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부 보호용 화장료 조성물일 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 조성물은 상술한 참까막살 추출물뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 상술한 참까막살 추출물 이외에, 참까막살 추출물과 반응하여 피부보호 효과를 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용되어오던 유기 자외선 차단제를 혼합하여 사용할 수도 있다.

상기 유기 자외선 차단제로는 글리세릴파바, 드로메트리졸트리실록산, 드로메트리졸, 디갈로일트리올리에이트, 디소듐페닐디벤즈이미다졸테트라설포네이트, 디에칠헥실부타미도트리아존, 디에칠아미노하이드록시벤조일헥실벤조에이트, 디이에이-메톡시신나메이트, 로우손과 디하이드록시아세톤의 혼합물, 메칠렌비스-벤조트리아졸릴테트라메칠부틸페놀, 4-메칠벤질리덴캠퍼, 멘틸안트라닐레이트, 벤조페논-3(옥시벤존),벤조페논-4, 벤조페논-8(디옥시페벤존), 부틸메톡시디벤조일메탄, 비스에칠헥실옥시페놀메톡시페닐트리아진, 시녹세이트, 에칠디하이드록시프로필파바, 옥토크릴렌, 에칠헥실디메칠파바, 에칠헥실메톡시신나메이트, 에칠헥실살리실레이트, 에칠헥실트리아존, 이소아밀-p-메톡시신나메이트, 폴리실리콘-15(디메치코디에칠벤잘말로네이트), 테레프탈릴리덴디캠퍼설포닉애씨드 및 그 염류, 티이에이-살리실레이트 및 아미노벤조익애씨드(파바)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 참까막살 추출물의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 0.00001-30중량%이며, 바람직하게는 0.5-20%이며, 보다 바람직하게는 1.0-10중량%이다. 상기 참까막살 추출물의 함량이 0.00001중량% 미만이면 참까막살 추출물에 의한 자외선 흡수 효과가 크게 감소되고, 30중량%를 초과하는 경우에는 피부 자극을 초래할 수 있으며, 제형상의 문제점이 발생할 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 상기 화장료 조성물은 참까막살 추출물을 나노리포좀 내부에 함유시켜 안정화하여 제형화할 수도 있다. 상기 추출물을 나노리포좀 내부에 함유시키면, 추출물의 성분이 안정화되어 제형화시 침전형성, 변색, 변취 등의 문제점을 해결할 수 있으며, 성분의 용해도 및 경피흡수율을 높일 수 있어 상기 추출물로부터 기대되는 효능을 최대로 발현시킬 수 있다.

본 발명에서 나노리포좀은 통상적인 리포좀의 형태를 갖는 것으로서 평균 입자 지름이 10~500nm인 리포좀을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 나노리포좀의 평균 입자 지름은 50~300nm이다. 나노리포좀의 평균 입자 지름이 300nm를 초과하는 경우에는 본 발명에서 달성하고자 하는 기술적 효과 중 피부침투의 개선 및 제형 안정성의 개선이 매우 미약하다. 본 발명에 따라 상기 추출물을 안정화하는데 사용되는 나노리포좀은 폴리올, 유성성분, 계면활성제, 인지질, 지방산 및 물을 포함하는 혼합물에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 나노리포좀에 이용되는 폴리올은 특히 제한되지 않으며, 바람직하게는 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 메틸프로판디올, 이소프로필렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 에리스리톨, 자일리톨, 솔비톨 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 10~80중량%, 바람직하게는 30~70중량%이다.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 유성(oil) 성분은 당업계에 공지된 다양한 오일이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 헥사데칸 및 파라핀 오일과 같은 하이드로카본계 오일, 에스테르계의 합성오일, 디메치콘 및 사이크로메치콘계와 같은 실리콘 오일, 해바라기유, 옥수수유, 대두유, 아보카도유, 참깨유 및 어유와 같은 동식물성 오일, 에톡시레이티드 알킬에테르계오일, 프로폭시레이티드 알킬에테르계오일, 피토스핑고신, 스핑고신 및 스핑가닌과 같은 스핑고노이드 지질, 세레브로사이드 콜레스테롤, 시토스테롤 콜레스테릴설페이트, 시토스테릴설페이트, C₁₀-₄₀지방알콜 및 이의 혼합물이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여1.0~30.0중량%일 수 있으며, 바람직하게는 3.0~20.0중량%이다.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 계면활성제는 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용할 수 있다. 예를 들어, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용될 수 있다. 바람직하게는 음이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제이다. 음이온성 계면활성제의 구체적인 예는 알킬아실글루타메이트, 알킬포스페이트, 알킬락틸레이트, 디알킬포스페이트 및 트리알킬포스페이트를 포함한다. 비이온성 계면활성제의 구체적인 예는 알콕시레이티드 알킬에테르, 알콕시레이티드 알킬에스테르, 알킬폴리글리코사이드, 폴리글리세릴에스테르 및 슈가에스테르를 포함한다. 특히 바람직한 계면활성제는 비이온성 계면활성제에 속하는 폴리솔베이트류이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.1~10중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.5~5.0중량%이다.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 또 다른 성분인 인지질은 양쪽친화성 지질이 이용되며, 천연 인지질(예를 들어, 난황 레시틴 또는 대두 레시틴, 스핑고마이엘린) 및 합성 인지질(예를 들어, 디팔미토일포스파티딜콜린 또는 수첨 레시틴)을 포함하며, 바람직하게는 레시틴이다. 특히, 대두 또는 난황에서 추출한 천연 유래의 불포화 레시틴 또는 포화 레시틴이 바람직하다. 통상적으로 천연 유래의 레시틴은 포스파티딜콜린의 양이 23~95%, 그리고 포스파디딜에탄올아민의 양이 20% 이하이다. 본 발명의 나노리포좀의 제조에 있어서, 인지질의 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.5~20.0중량%이며, 바람직하게는 2.0~8.0중량%이다.

본 발명의 나노리포좀 제조에 이용되는 지방산은 고급 지방산으로서, 바람직하게는 C₁₂-₂₂알킬 체인의 포화 또는 불포화 지방산으로서, 예컨대, 라우린산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아린산, 올레산 및 리놀레산을 포함한다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.05~3.0중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.1~1.0중량%이다.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 물은 일반적으로 탈이온화된 증류수이며, 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 5.0~40중량%일 수 있다.

나노리포좀의 제조는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있으나, 가장 바람직하게는 상기 성분들을 포함하는 혼합물을 고압 호모게나이저에 적용하여 제조된다. 고압 호모게나이저에 의한 나노리포좀의 제조는 소망하는 입자 크기에 따라 다양한 조건(예: 압력, 횟수 등)으로 실시할 수 있으며, 바람직하게는 600~1200bar의 압력 하에서 1~5회 고압 호모게나아저를 통과하도록 하여 나노리포좀을 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 피부보호용 화장료 조성물은 상기 참까막살 추출물을 나노리포좀 충 중량 기준으로 0.1~20.0중량%, 제형 안정화를 위하여 보다 바람직하게 1.0~10.0중량%로 함유할 수 있다.

식품 조성물

본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 참까막살 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 참까막살 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 유효성분인 참까막살 추출물은 천연물질로서 독성 및 부작용은 거의 없으므로 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부 보호용 피부보호를 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부 보호를 위한 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 참까막살 추출물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 참까막살 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 참까막살 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 참까막살 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 참까막살 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 추가적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

통계처리

실험결과는 평균±표준편차로 표기하였고, 그 결과들은 차이를 분석하기 위하여 Tokey's test를 이용한 variance(ANOVA)로 분석하였다. p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.

시약

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼, N-acetyl cysteine(NAC), 5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide(DMPO), 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCF-DA), [3-(4,5-dimehtylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium] bromide(MTT) 및 Hoechst 33342 염료는 Sigma chemical company(St. Louis, Mo, USA)에서 구입하였다. 모든 다른 화합물 및 시약은 분석용 등급을 사용하였다.

< 실시예 1>

참까막살 추출물의 제조

참까막살 시료는 제주도에서 채집하였으며, 증거표본은 제주생물종다양성연구소(Jeju Biodiversity Research Institute: JBRI)에 기탁하여 JBRI-10532를 부여받았다. 본 발명의 참까막살 추출물은 제주도에서 채집한 참까막살을 80% 에탄올로 실온에서 24시간 추출한 뒤 회전농축기로 감압 농축하여 에탄올 가용성 성분을 수득하였다.

< 실험예 1>

참까막살 추출물의 자유라디칼 소거능 활성 분석

실시예 1을 통해 제조된 본 발명에 따른 추출물의 자유라디칼 소거능을 확인하기 위하여, DPPH 라디칼 소거활성, 세포 내 활성산소종(ROS) 소거활성을 측정하였다.

DPPH 라디칼 소거활성 측정

DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 분석은 항산화 물질의 전자공여능으로 인해 방향족 화합물 및 방향족 아민류에 의해 환원되어 자색이 탈색되는 정도를 지표로 하여 항산화 능력을 측정하는 방법이다. 이 실험에서 양성대조군으로는 항산화 효능이 잘 알려진 NAC(N-acetyl cysteine)을 사용하였다.

먼저 상기 실시예 1을 통해 제조된 본 발명의 참까막살 추출물을 각 농도별로 메탄올 내 1×10^-4M DPPH 용액에 첨가한 후 격렬히 혼합한 다음, 3시간 후에 DPPH 잔여 농도를 분광광도계를 이용하여 520nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포 내 활성산소종 ( ROS ) 소거활성 측정

활성산소종(ROS)을 소거하는 활성이 있는지 확인하기 위하여, 인간 HaCaT 세포에 본 발명의 추출물을 처리한 후, H₂O₂처리 또는 UVB를 조사하여 HaCaT 세포내 ROS 수준을 측정하였으며, 이때 세포 내 활성산소종 측정은 DCF-DA(dichlorodihydrofluorescein diacetate) 방법을 이용하였다. DCF-DA는 세포 내 활성산소종과 반응하여 형광물질(dichlorodihydrofluorescein: DCF)을 만들어 내는 것으로 세포 내에서 발생하는 형광 측정을 통해 세포 내 활성산소종을 측정할 수 있다. 이 실험에서 양성대조군으로는 항산화 효능이 잘 알려진 NAC(N-acetyl cysteine)을 사용하였다.

① 세포 배양

인간 HaCaT 세포는 5% CO₂및 37℃에서 95% 이상의 습도를 유지한 배양기에서 10% heat-inactivated fetal calf serum, 100μg/ml 스트렙토마이신 및 100unit/ml 페니실린을 포함하는 DMEM(Dulbeccos modified Eagle's medium) 배지에서 배양하였다.

② 세포 내 활성산소종 측정

상기 배양된 인간 HaCaT 세포를 플레이트에 1.5×10⁵cells/well밀도로 분주하고 16시간 동안 배양 한 다음, 본 발명의 참까막살 추출물을 처리하였으며, 30분 후에 H₂O₂(1mM) 또는 UVB를 조사하여 플레이트에 첨가하고 37℃에서 추가로 인큐베이션하였다. 마지막으로 DCF-DA 용액 25μM을 첨가 후 10분이 경과한 다음, 2',7'-dichlorofluorescein의 형광을 PerkinElmer LS-5B 분광형광계(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 이용하여 검출하였다.

③ 과산화물음이온 ( superoxide anion : O2 ^- ㆍ) 소거활성 측정

xanthine/xanthine oxidase 시스템을 통해 생산된 과산화물음이온은 spin trapping agent인 DMPO(5,5 dimethyl-1-pyrroline-N-oxide)에 의해 DMPO/ㆍOOH adduct을 형성시킨 후, DMPO/ㆍOOH adduct 양을 ESR(electron spin resonance) spectrometer를 이용하여 측정하였다. 간략하게, xanthine oxidase(0.25U/mL) 20μl에 xanthine(5mM) 20μl, DMPO(1.5M) 20μl 및 참까막살 추출물(100μg/mL) 20μl를 첨가하여 혼합한 후 5분 뒤에 ESR 시그널을 기록하였다. ESR spectrum의 조건은 하기 표 1에서 나타내었다.

매개변수	조건
magnetic field	336mT
power	1.00mW
frequency	9.4380GHz
modulation amplitude	0.2mT
gain	500
scan time	0.5 min
scan width	10mT
time constant	0.03sec
temperature	25

④ 히드록실 라디칼 ( hydroxyl radical : ㆍ OH ) 소거활성 측정

펜톤 반응(H₂O₂+FeSO₄)으로 생성된 히드록실 라디칼은 spin trapping agent인 DMPO(5,5 dimethyl-1-pyrroline-N-oxide)에 의해 DMPO/ㆍOH adduct을 형성시킨 후, DMPO/ㆍOH adduct 양은 JES-FA ESR spectrometer(JEOL, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. 0.3M의 DMPO, 10mM FeSO4, 10mM H₂O₂을 포함하는 pH 7.4의 인산버퍼용액에 100μg/ml 참까막살 추출물을 혼합한 후 2.5분 뒤에 ESR 시그널을 기록하였다. ESR spectrum의 조건은 하기 표 2에서 나타내었다.

매개변수	조건
magnetic field	336mT
power	1.00mW
frequency	9.4380GHz
modulation amplitude	0.2mT
gain	200
scan time	0.5 min
scan width	10mT
time constant	0.03sec
temperature	25

앞서 기술한 실험 방법에 따른 분석 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 양성 대조군으로서 ROS 소거제로 잘 알려져 있는 NAC에 비해 본 발명의 추출물이 보다 우수한 라디칼 소거능을 갖는다는 사실을 확인할 수 있었는데, 구체적으로 2mM의 NAC시 처리 시 89%의 라디칼을 소거한 데 비해, 본 발명의 추출물은 50μg/ml에서 4%, 100μg/ml에서 12%, 200μg/ml에서 14%의 라디칼을 소거하였다(도 1a 참조).

또한, 이때 본 발명의 추출물 처리에 따른 세포 내 독성 유발 정도를 측정하기 위해 세포 사멸 정도를 분석한 결과, 본 발명의 추출물을 처리하지 않은 대조군과 본 발명의 추출물을 처리한 군들 모두 세포들의 생존율에 큰 영향이 가하지 않는 것을 확인할 수 있었다(도 1b 참조). 한편, 추출물 농도별에 따른 세포생존율 분석에서 추출물을 200μg/ml의 농도로 처리한 경우, 약 10% 정도의 세포 사멸이 유도되긴 하였으나, 전반적으로 본 발명의 추출물은 세포에 유해하지 않고 안정하다는 것을 알 수 있었다. 또한, 이후 진행되는 실험에서는 세포 독성이 유발되지 않는 농도인 100μg /ml로 진행하였다.

또한, ESR spectrometer 데이터는 과산화물음이온 시그널이 xanthine/xanthine oxidase 시스템에서 2420의 값을 증가하는 것으로 나타났으나, 본 발명의 참까막살 추출물을 처리한 경우 과산화물음이온 시스널이 2053 값으로 감소되었다. 이를 통해 본 발명의 추출물이 O₂ ^-ㆍ를 제거함으로서 시그널 형성이 저해되는 것을 확인할 수 있었다(도 1c 참조).

나아가 ESR spectrometer 데이터는 히드록실 라디칼 시그널이 펜톤반응 시스템 하에 3793 값까지 증가되었으며, 본 발명의 참까막살 추출물을 처리한 경우 히드록실 라디칼 시스널이 2513 값으로 감소되는 것으로 나타났다. 이를 통해 본 발명의 추출물이 ㆍOH를 제거함으로서 시그널 형성이 저해되는 것을 확인할 수 있었다(도 1d 참조).

< 실험예 2>

참까막살 추출물의 UV -B 흡수 효과

UV-B의 흡수에 대한 참까막살 추출물의 효과를 UV/Vis spectrophotometer로 측정하였다. UV/가시광 분광 광도 측정은 200500 nm의 스펙트럼 범위에서 수행하였다.

분석 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 참까막살 추출물은 UV-B 범위내인 280-320nm 피크 위치에서 높은 흡수능을 보이는 것으로 확인되었다.

< 실험예 3>

UV -B에 의한 지질 과산화 저해 효능 분석

세포에 UVB 노출 후 24시간 후에 UVB 조사된 (UVB-irradiated) 세포의 세포막 지질 과산화(peroxidation), 단백질 변형, 세포 DNA 손상을 억제하는 참까막살 추출물의 효능을 관찰하였다. 지질 과산화는 배양 배지에서 8-이소프로스탄(8-isoprostane)의 (Beauchamp et al., 2002) 레벨로 평가하였다. Commercial enzyme immunoassay (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)를 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 지질 과산화는 형광 탐침(probe)인 DPPP (Okimoto et al.,2000)를 사용하여 분석하였다. 세포를 5mM DPPP와 함께 15분 동안 암조건에서 배양하였고, UVB에 노출시켰다. Zeiss Axiovert 200 도립 현미경을 사용하여 여기 파장 351nm, 방출 파장 380nm로 하여 DPPP 형광 사진을 담아냈고, 정량화 하였다.

그 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이, UVB에 노출된 세포는 8-이소프로스탄 수치가 증가(301 pg/mg)한 것으로 나타났으며, 본 발명의 참까막살 추출물을 처리한 군의 경우 8-이소프로스탄의 증가 정도가 저해되는 것으로 나타났다(228 pg/mg).

< 실험예 4>

UV -B 조사로 유발된 단백질 카르보닐 형성 저해 효과 분석

단백질에서 카르보닐 형성의 양은 Cell Biolabs (SanDiego, CA, USA)에서 구입한 Oxiselect^TM protein carbonyl ELISA kit로 제조사의 지시에 따라 분석하였다.

분석 결과, 도 3b에 나타난 바와 같이 단백질 카르보닐 레벨은 UVB가 조사된 세포에서 증가한 반면에 본 발명의 참까막살 추출물 처리 시 UVB에 의해 유도되는 카르보닐 형성은 저해되는 것으로 나타났다.

< 실험예 5>

DNA 손상으로부터 보호 효과

산화적 DNA 손상 정도는 comet assay (Singh, 2000; Rajagopalan et al.2003)로 측정되었다. 세포 현탁액은 39℃에서 0.5% low melting agarose (LMA)와 혼합하였고, 혼합물은 1%의 normal melting agarose(NMA) 200mL로 프리코트(pre-coat)한 현미경 슬라이드에 도포했다. 아가로스를 응고시킨 후, 다른 0.5% LMA 75mL로 슬라이드를 커버하고, lysis solution (2.5 M NaCl, 100 mM Na-EDTA, 10 mM Tris, 1% Trion X-100, 10% DMSO, pH 10)에 1시간 동안 4℃에서 담갔다. 슬라이드는 40분 동안 300 mM NaOH와 10 mM Na-EDTA (pH 13)가 있는 겔 전기영동(gel-electrophoresis) 장치에 두어 DNA가 풀리고, 알칼리에 불안정한 손상이 일어나도록 하였다. 전기장(300 mA, 25 V)을 20분 동안 4℃에서 걸어, 음이온인 DNA를 양극으로 이동시켰다. 슬라이드를 중화 완충액(neutralizing buffer) (0.4 M Tris, pH 7.5)으로 4℃에서 5분 동안 세 번 세척하고, 75 mL의 propidium iodide (20 mg/mL)로 염색하고, 형광현미경과 image analyzer (Kinetic Imaging, Komet 5.5, UK)으로 관찰하였다. DNA 꼬리에서 총 형광 퍼센트와 슬라이드 당 50개 세포의 DNA 꼬리 길이를 기록했다.

그 결과, 세포의 UVB에 대한 노출은 세포의 tail에서 DNA의 tail 길이와 비율을 증가시켰다. 세포가 UVB에 노출되었을 때, tail 에 있는 DNA의 비율은 37%로 증가하였으나, 본 발명의 참까막살 추출물을 처리한 군의 경우 도 3c에 나타난 바와 같이 31%로 감소한 것으로 나타났다. 이러한 결과로부터 참까막살 추출이 세포 내 구성 성분을 UVB에 의한 산화적 손상으로부터 보호한다는 것을 알 수 있다.

< 실험예 6>

참까막살 추출물의 UV -B에 의한 세포자연사( apoptosis ) 억제 효과 분석

본 발명자들은 UVB에 의해 유발된 세포사멸(apoptosis)에 대한 직접적인 관련성을 조사하였고, 참까막살 추출물의 UVB 유발된 세포사멸의 저지능을 조사하였다.

세포자연사 억제 효과를 위해 먼저 세포들의 핵 염색을 통해 apoptotic bodies를 관찰하였는데, 인간 케라틴세포(HaCaT cells)에 참까막살 추출물을 100μg/ml 농도로 처리하고, 1시간 후 세포들을 UVB에 노출시켰다. 세포들은 추가적으로 37℃에서 48시간 동안 배양시킨 후, DNA 특이적 형광염료인 Hoechst 33342(stock 10mg/ml) 1.5μl를 각각의 웰(well)에 첨가하여 37℃에서 10분간 배양시켰다. 염색된 세포들은 핵 응축의 정도를 검사하기 위해 CoolSNAP-Pro 컬러 디지털 카메라가 장착된 형광현미경 하에서 가시화시켰고 이를 정량화하였다.

그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, UV-B가 조사된 실험군에서 세포자연사를 나타내는 apoptotic bodies의 핵의 단편들이 두드러지게 관찰되는 반면, 본 발명의 추출물을 처리한 후 UVB를 조사한 실험군에서는 apoptotic bodies의 핵 단편이 급격히 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명의 참까막살 추출물의 세포자연사 억제 효과를 측정하기 위하여 세포들의 DNA 단편화(fragmentation)를 관찰하였다. 세포의 DNA 단편화는 제조자의 지시에 따라 Roche Diagnostic(Portland, OR, USA)로부터 구입한 키트를 사용하여 분석되는 세포질의 히스톤-관련된 DNA 단편으로써 평가되었다.

그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, UV-B 조사된 세포에서는 DNA의 단편화가 높게 나타난 반면, 본 발명의 추출물 처리 후 UV-B를 조사한 실험군에서는 DNA의 단편화가 두드러지게 감소되는 것으로 나타났다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 참까막살 추출물이 UV-B 조사에 의한 세포자연사(apoptosis)의 억제를 핵 응축의 정도 및 DNA 단편화 실험을 통해 효과적으로 억제한다는 사실을 알 수 있었고, 궁극적으로 참까막살 추출물이 UVB 조사로부터 세포를 보호하는 효과가 우수하다는 것을 알 수 있었다.

한편, 본 발명의 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예를 들어, 의약적 제형, 화장료 제형 또는 식품 첨가제일 수 있다.

<제제예 1> 정제의 제조

참까막살 추출물 300 g

유청단백 540 g

결정셀룰로오스 140 g

스테아르산 마그네슘 10 g

하이드록시프로필메칠셀룰로오스 10 g

총량: 1000 g

<제제예: 2> 분말제의 제조

참까막살 추출물 10 g

대두분리단백 50 g

카르복시 셀룰로오스 40 g

총량: 100 g

상기에서 나열된 성분들을 잘게 부순 후 혼합하여 분말을 제조하였다. 젤라틴으로 이루어진 경질 캡슐에 분말 500 ㎎을 넣어 캡슐제를 제조하였다.

<제제예 3> 우유에의 적용

우유 99.9%

참까막살 추출물 0.1%

<제제예 4> 오렌지쥬스에의 적용

액상과당 5%

폴리덱스트로스 1%

구연산 5%

비타민C 0.02%

참까막살 추출물 0.1%

오렌지과즙농축액 25%

자당지방산에스테르 0.2%

물 63%

<제제예 5> 음료의 제조

참까막살 추출물 10 ㎎

젖산칼슘 50 ㎎

구연산 5 ㎎

니코틴산아미드 10 ㎎

염산리보플라빈나트륨 3 ㎎

염산피리독신 2 ㎎

아르기닌 10 ㎎

자당지방산에스테르 10 ㎎

물 200 ㎖

<제제예 6> 화장품 로션의 적용

참까막살 추출물 1%

1,3-부틸렌 글리콜 5%

글리세린 5%

EDTA-2Na 0.02%

트리메틸렌글리신 2.0%

에탄올 1.0%

글리세릴모노스테아레이트 유화제 1.0%

폴리솔베이트 60 1.2%

소르비탄 세스퀴올레이트 0.3%

세틸 2-에틸-헥사노에이트 4.0%

스쿠알란 5.0%

디메치콘 0.3%

글리세릴 스테아레이트 0.5%

카보머 0.15%

트리에탄올아민 0.5%

이미다졸리디닐우레아 0.2%

정제수 71.8%

<제제예 7> 화장품 스킨의 적용

참까막살 추출물 0.1%

1,3-부틸렌 글리콜 4.0%

디프로필렌 글리콜 5.0%

EDTA-2Na 0.02%

옥틸도데세스-16 0.3%

PEG60 hydrogenate 피마자 오일0.2%

정제수 90%

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (8)

1. 참까막살(Polyopes affinis)의 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 인간 피부각질세포의 세포사멸 억제용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 추출물은 알코올(에탄올) 추출물인 것을 특징으로 하는 세포사멸 억제용 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 참까막살 추출물을 25μg/ml 내지 200μg/ml의 농도로 함유하는 것을 특징으로 하는 세포사멸 억제용 조성물.
4. 참까막살(Polyopes affinis)의 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부손상 억제 또는 피부치료용 조성물.
5. 제4항에 있어서,
   상기 조성물은 참까막살 추출물을 25μg/ml 내지 200μg/ml의 농도로 함유하는 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부손상 억제 또는 피부치료용 조성물.
6. 제4항에 있어서,
   상기 추출물은 알코올(에탄올) 추출물인 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부손상 억제 또는 피부치료용 조성물.
7. 참까막살(Polyopes affinis)의 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선 흡수용 조성물.
8. 제7항에 있어서,
   상기 추출물은 알코올(에탄올) 추출물인 것을 특징으로 하는 자외선 흡수용 조성물.

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