KR20230173579A

KR20230173579A - 비자나무의 잎 및 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 미백 및 항균 활성을 갖는 조성물

Info

Publication number: KR20230173579A
Application number: KR1020230063161A
Authority: KR
Inventors: 신현재; 최문희; 양승화
Original assignee: 주식회사 섬섬바이오
Priority date: 2022-06-17
Filing date: 2023-05-16
Publication date: 2023-12-27

Abstract

본 발명은 비자나무의 잎 및 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 미백 및 항균 활성을 갖는 화장료 조성물; 식품 조성물; 및 건강기능식품에 관한 것이다. 본 발명의 비자나무의 잎 또는 가지 추출물은 DPPH 자유 라디칼 소거 활성 및 ABTS 라디칼 소거 활성이 우수할 뿐만 아니라, 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드의 함량이 높은 특성을 갖는바, 상기 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 항산화 활성이 우수한 효과를 가진다. 또한, 본 발명의 비자나무의 잎 또는 가지 추출물은 티로시나아제 저해 활성을 갖는바, 상기 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 미백 활성이 우수한 효과를 갖는다. 또한, 본 발명의 비자나무의 잎 또는 가지 추출물은 표피포도상구균 (Staphylococcus epidermidis), 큐티박테리움 아크네 (Cutibacterium acnes) 및 말라쎄지아 파키더마티스 (Malassezia pachydermatis)에 대한 항균 및 항진균 활성을 갖는바, 상기 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 항균 활성이 우수한 효과를 가진다.

Description

비자나무의 잎 및 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 미백 및 항균 활성을 갖는 조성물{Composition with antioxidant, whitening and antibacterial activity comprising extracts of Torreya nucifera leaves and branches as an active ingredient}

본 발명은 비자나무의 잎 및 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 미백 및 항균 활성을 갖는 화장료 조성물; 식품 조성물; 및 건강기능식품에 관한 것이다.

난대성 수종인 비자나무(Torreya nucifera)는 우리나라를 비롯하여 일본, 중국 등 아시아 남부에 자생한다. 비자나무(Torreya nucifera)는 주목과의 상록교목으로 곧고 높이 25 m, 지름 2 m 까지 자란다. 예전부터 비자나무의 씨앗, 잎, 줄기는 식용 및 허브 성분으로 사용되었다. 비자나무의 성숙된 씨앗에서 종피를 제거하고 건조한 것을 비자라 한다. 비자는 소화, 변비, 치질에 약리 작용이 있으며 구충제로도 사용되어 왔다. 비자에 함유된 lipid와 sterol, desmethylsterol 및 지질대사와 관련된 효소발현 등에 대하여 연구되어 왔다. 비자는 항산화, 항염증, 간 보호 및 신경 보호 특성을 포함한 약리 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 비자나무는 서식지, 건조방법, 추출 용매, 추출 방법에 따라 다양한 항산화 활성을 가지는 것으로 알려져 있다. 기존의 연구에서 비자 열매에 대한 연구는 많이 진행되고 있으며, 주로 열수 및 주정 추출물에 대한 생리활성이 보고되었다. 현재 비자 잎과 가지에 대한 연구는 아직 미미한 상황이며, 특히 소수성 물질에 대한 연구는 진행된 바가 없다.

이러한 배경 하에, 본 발명자는 비자나무 잎, 가지 추출물의 소수성 성분들이 추출되도록 유기용매를 사용하여 추출물을 제조하고 유기용매 추출물의 항산화(DPPH free radical, ABTS radical sacvenging activity) 활성, 총 폴리페놀 함량 측정 및 총 플라보노이드 함량을 측정하였다. 또한 비자나무 잎, 가지 유기용매 추출물에 함유되어 있는 소수성 물질을 분석하기 위하여 GC/MS 및 LC-MS/MS 분석을 진행하였으며, 바지나무 추출물의 미백 활성과 더불어 항균 활성을 측정하였다. 그 결과 비자나무 잎, 가지의 유기용매 추출물이 우수한 항산화 활성과 더불어 미백 활성 및 항균 활성을 가짐에 따라 기능성을 가진 화장품, 식품, 의약품 및 사료 소재로써 유용하게 활용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 제10-1117563호 한국등록특허 제10-0556187호

따라서 본 발명의 목적은 비자나무의 잎 또는 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 비자나무의 잎 또는 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 비자나무의 잎 또는 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 비자나무의 잎 또는 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 미백 및 항균 활성을 갖는 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 비자나무의 잎 또는 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 미백 및 항균 활성을 갖는 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,

본 발명은 비자나무의 잎 또는 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 비자나무의 잎 또는 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 비자나무의 잎 또는 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 클로로포름 및 메탄올 혼합용매로 추출될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 페루기놀 (ferruginol)을 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 티로시나아제 저해 활성을 통해 미백 효과를 가질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 표피포도상구균 (Staphylococcus epidermidis), 큐티박테리움 아크네 (Cutibacterium acnes) 및 말라쎄지아 파키더마티스 (Malassezia pachydermatis)에 대한 항균 활성을 가질 수 있다.

또한, 본 발명은 비자나무의 잎 또는 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 미백 및 항균 활성을 갖는 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 비자나무의 잎 또는 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 미백 및 항균 활성을 갖는 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 비자나무의 잎 또는 가지 추출물은 DPPH 자유 라디칼 소거 활성 및 ABTS 라디칼 소거 활성이 우수할 뿐만 아니라, 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드의 함량이 높은 특성을 갖는바, 상기 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 항산화 활성이 우수한 효과를 가진다. 또한, 본 발명의 비자나무의 잎 또는 가지 추출물은 티로시나아제 저해 활성을 갖는바, 상기 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 미백 활성이 우수한 효과를 갖는다. 또한, 본 발명의 비자나무의 잎 또는 가지 추출물은 표피포도상구균 (Staphylococcus epidermidis), 큐티박테리움 아크네 (Cutibacterium acnes) 및 말라쎄지아 파키더마티스 (Malassezia pachydermatis)에 대한 항균 및 항진균 활성을 갖는바, 상기 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 항균 활성이 우수한 효과를 가진다.

도 1은 비자나무의 잎 또는 가지 추출물의 분리 공정을 보여주는 모식도이다.
도 2는 비자나무의 잎 또는 가지 추출물의 DPPH 자유 라디칼 소거 활성을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 비자나무의 잎 또는 가지 추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 비자나무의 잎 또는 가지 추출물의 GC/MS 크로마토그램을 나타낸 것이다((A) TNL1; (B) TNL2; (C) TNB1; (D) TNB2).
도 5는 비자나무의 잎 또는 가지 추출물의 티로시나아제 억제 활성을 측정한 결과이다.
도 6은 비자나무의 잎 또는 가지 추출물의 표피포도상구균 (Staphylococcus epidermidis)에 대한 항균 활성을 측정한 결과이다.
도 7은 비자나무의 잎 또는 가지 추출물의 큐티박테리움 아크네 (Cutibacterium acnes)에 대한 항균 활성을 측정한 결과이다.
도 8은 비자나무의 잎 또는 가지 추출물의 비듬균 (Malassezia furfur)에 대한 항균 활성을 측정한 결과이다.
도 9는 비자나무의 잎 또는 가지 추출물의 말라쎄지아 파키더마티스 (Malassezia pachydermatis)에 대한 항균 활성을 측정한 결과이다.
도 10은 비자나무의 잎 또는 가지 추출물의 농도별 세포독성을 측정한 결과이다.

본 발명은 비자나무의 잎 또는 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용, 미백용 또는 항균용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 비자나무의 잎 또는 가지 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된‘추출물’은 적절한 용매를 이용하여 비자나무의 잎 또는 가지로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 비자나무의 잎 또는 가지의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다.

상기 비자나무의 잎 또는 가지로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다.

추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 비자나무 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 비자나무 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다.

따라서 본 발명에 있어서 비자나무의 잎 또는 가지 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명의 일구체예에서, 비자나무의 잎 또는 가지 추출물은 유기용매로 헥산; 또는 클로로포름 및 메탄올 혼합용매로 추출될 수 있다.

본 발명의 하기 실시예에서, 비자나무 잎 또는 가지 추출물에 함유되어 있는 소수성 물질을 분석하기 위하여 GC/MS 및 LC-MS/MS 분석을 진행하였으며, 그 결과 GC/MS 분석 결과 총 21가지 성분이 분석되었고 클로로포름 및 메탄올 혼합용매 추출물에서 페루기놀 (ferruginol)이 가장 많이 함유된 것으로 확인되었고, 헥산 추출물에는 글리놀(gleenol), 큐베볼(cubebol), 알파-카디놀(alpha-Cadinol), 1-펩타트리아코타놀(1-heptatriacotanol) 성분들이 함유된 것으로 확인되었다.

페루기놀 (ferruginol) 성분은 약리학적 특성으로 항암, 항원생동물, 항바이러스, 항산화, 위보호, 신경보호, 심장보호, 항균, 항염증, 궤양(UC) 억제, 콜레스테롤 억제, 콜린에스테라아제(ChE) 억제, Epstein-Barr 바이러스 조기 항원 억제 등의 활성이 알려져 있는바, 상기 성분을 다량으로 함유하고 있는 비자나무 잎 또는 가지의 클로로포름 및 메탄올 혼합용매 추출물은 항암, 항원생동물, 항바이러스, 항산화, 위보호, 신경보호, 심장보호, 항균, 항염증, 궤양(UC) 억제, 콜레스테롤 억제, 콜린에스테라아제(ChE) 억제, Epstein-Barr 바이러스 조기 항원 억제 등의 활성을 가질 수 있다.

글리놀(gleenol), 큐베볼(cubebol), 알파-카디놀(alpha-Cadinol), 1-펩타트리아코타놀(1-heptatriacotanol) 성분들은 항균 및 항진균 활성이 우수한바, 상기 성분을 다량으로 함유하고 있는 비자나무 잎 또는 가지의 헥산 추출물은 우수한 항균 및 항진균 활성을 가질 수 있다.

본 발명의 비자나무의 잎 또는 가지 추출물은 DPPH 자유 라디칼 소거 활성 및 ABTS 라디칼 소거 활성이 우수할 뿐만 아니라, 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드의 함량이 높은 특성을 갖는바, 상기 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 항산화용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, ‘항산화용 조성물’이란 산소가 불안정한 상태에 있는 활성산소를 억제 또는 제거하는 작용을 통해 산화를 방지하는 물질을 의미한다.

본 발명의 상기 항산화용 조성물은 항산화 활성이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있으며, 구체적으로는 의약품, 화장품, 식품 및 동물 사료 등 다양한 산업분야에서 적용되는 물품에 항산화 활성을 부여할 수 있는 기능성 소재로 사용할 수 있으며, 또한 의약품 보존제, 화장품 보존제, 식품 보존제, 의약품 첨가제, 화장품 첨가제, 식품첨가제 및 사료첨가제 등의 소재로도 사용될 수 있다.

아래에서는 본 발명의 항산화용 조성물이 적용될 수 있는 의약품, 화장품, 식품, 동물사료 형태로 자세히 살펴보았다.

본 발명의 항산화용 조성물은 비자나무의 잎 또는 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 산화관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 비자나무의 잎 또는 가지 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.00001 ~ 50 중량%로 포함될 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에 있어서, 본 발명의 비자나무의 잎 또는 가지 추출물은 조성물에 대해 0.1 내지 10000Oμg/ml의 농도로 포함될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 치료효과를 나타낼 수 있는 산화관련 질환으로는, 비염, 천식, 급성통증, 만성통증, 치주염, 치은염, 염증성 장질환, 통풍, 심근경색, 동맥경화, 울혈성 심부전, 고혈압, 협심증, 위궤양, 알츠하이머병, 뇌경색, 다운증후군, 다발성 경화증, 비만, 당뇨, 치매, 우울증, 정신분열증, 결핵, 수면장애, 패혈증, 화상 또는 췌장염 등을 들 수 있되, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 비자나무의 잎 또는 가지 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 비자나무의 잎 또는 가지 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

이러한 본 발명의 유효성분인 비자나무의 잎 또는 가지 추출물은 천연물질로서 화학약품과 같은 부작용은 거의 없으므로 항산화 기능성 부여를 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 비자나무의 잎 또는 가지 추출물은 티로시나아제 저해 활성이 우수한바, 상기 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 미백용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, ‘미백용 조성물’이란 피부 미백을 위한 소재를 의미한다.

본 발명의 상기 미백용 조성물은 피부 미백 활성이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있으며, 구체적으로는 의약품, 화장품 및 식품 등 다양한 산업분야에서 적용되는 제품에 피부 미백 활성을 부여할 수 있는 기능성 소재로 사용할 수 있다.

아래에서는 본 발명의 미백용 조성물이 적용될 수 있는 화장료 조성물의 형태로 자세히 살펴보았다.

본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 유연 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 밀크로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 수중유 형 에멀젼, 유중수 형 에멀젼, 페이스크성 무수 생성물, 고체 무수 생성물, 소구체를 사용한 수성 상에서의 오일 분산물, 이온성 지질 소포체, 비이온성 지질 소포체, 연고, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 보디오일, 수중유 형 메이크업베이스, 유중수 형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이섀도우, 마스카라, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종의 제형을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유효성분(비자나무의 잎 또는 가지 추출물)의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 0.00001-50중량%이며, 바람직하게는 0.0005-40%이며, 보다 바람직하게는 0.0005-20중량%이다. 상기 유효성분의 함량이 0.00001중량% 미만이면 피부 미백 효과가 크게 감소되고, 20중량%를 초과하는 경우에는 피부 자극을 초래할 수 있으며, 제형상의 문제점이 발생할 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 상기 화장료 조성물은 유효성분을 나노리포좀 내부에 함유시켜 안정화하여 제형화할 수도 있다. 상기 유효성분을 나노리포좀 내부에 함유시키면, 유효성분이 안정화되어 제형화시 침전형성, 변색, 변취 등의 문제점을 해결할 수 있으며, 성분의 용해도 및 경피흡수율을 높일 수 있어 상기 추출물로부터 기대되는 효능을 최대로 발현시킬 수 있다.

본 발명에서 나노리포좀은 통상적인 리포좀의 형태를 갖는 것으로서 평균 입자 지름이 10~500nm인 리포좀을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 나노리포좀의 평균 입자 지름은 50~300nm이며, 더욱 바람직하게는 100~200nm이다. 나노리포좀의 평균 입자 지름이 500nm를 초과하는 경우에는 본 발명에서 달성하고자 하는 기술적 효과 중 피부침투의 개선 및 제형 안정성의 개선이 매우 미약하다.

본 발명에 따라 상기 비자나무의 잎 또는 가지 추출물을 안정화하는데 사용되는 나노리포좀은 폴리올, 유성성분, 계면활성제, 인지질, 지방산 및 물을 포함하는 혼합물에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 나노리포좀에 이용되는 폴리올은 특히 제한되지 않으며, 바람직하게는 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 메틸프로판디올, 이소프로필렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 에리스리톨, 자일리톨, 솔비톨 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 10~80중량%, 바람직하게는 30~70중량%이다.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 유성(oil) 성분은 당업계에 공지된 다양한 오일이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 헥사데칸 및 파라핀 오일과 같은 하이드로카본계 오일, 에스테르계의 합성오일, 디메치콘 및 사이크로메치콘계와 같은 실리콘 오일, 해바라기유, 옥수수유, 대두유, 아보카도유, 참깨유 및 어유와 같은 동식물성 오일, 에톡시레이티드 알킬에테르계오일, 프로폭시레이티드 알킬에테르계오일, 피토스핑고신, 스핑고신 및 스핑가닌과 같은 스핑고노이드 지질, 세레브로사이드 콜레스테롤, 시토스테롤 콜레스테릴설페이트, 시토스테릴설페이트, C₁₀-₄₀ 지방알콜 및 이의 혼합물이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여1.0~30.0중량%일 수 있으며, 바람직하게는 3.0~20.0중량%이다.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 계면활성제는 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용할 수 있다. 예를 들어, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용될 수 있다. 바람직하게는 음이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제이다. 음이온성 계면활성제의 구체적인 예는 알킬아실글루타메이트, 알킬포스페이트, 알킬락틸레이트, 디알킬포스페이트 및 트리알킬포스페이트를 포함한다. 비이온성 계면활성제의 구체적인 예는 알콕시레이티드 알킬에테르, 알콕시레이티드 알킬에스테르, 알킬폴리글리코사이드, 폴리글리세릴에스테르 및 슈가에스테르를 포함한다. 특히 바람직한 계면활성제는 비이온성 계면활성제에 속하는 폴리솔베이트류이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.1~10중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.5~5.0중량%이다.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 또 다른 성분인 인지질은 양쪽친화성 지질이 이용되며, 천연 인지질(예를 들어, 난황 레시틴 또는 대두 레시틴, 스핑고마이엘린) 및 합성 인지질(예를 들어, 디팔미토일포스파티딜콜린 또는 수첨 레시틴)을 포함하며, 바람직하게는 레시틴이다. 특히, 대두 또는 난황에서 추출한 천연 유래의 불포화 레시틴 또는 포화 레시틴이 바람직하다. 통상적으로 천연 유래의 레시틴은 포스파티딜콜린의 양이 23~95%, 그리고 포스파디딜에탄올아민의 양이 20% 이하이다. 본 발명의 나노리포좀의 제조에 있어서, 인지질의 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.5~20.0중량%이며, 바람직하게는 2.0~8.0중량%이다.

본 발명의 나노리포좀 제조에 이용되는 지방산은 고급 지방산으로서, 바람직하게는 C₁₂-₂₂ 알킬 체인의 포화 또는 불포화 지방산으로서, 예컨대, 라우린산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아린산, 올레산 및 리놀레산을 포함한다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.05~3.0중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.1~1.0중량%이다.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 물은 일반적으로 탈이온화된 증류수이며, 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 5.0~40중량%일 수 있다.

나노리포좀의 제조는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있으나, 가장 바람직하게는 상기 성분들을 포함하는 혼합물을 고압 호모게나이저에 적용하여 제조된다. 고압 호모게나이저에 의한 나노리포좀의 제조는 소망하는 입자 크기에 따라 다양한 조건(예: 압력, 횟수 등)으로 실시할 수 있으며, 바람직하게는 600~1200bar의 압력 하에서 1~5회 고압 호모게나아저를 통과하도록 하여 나노리포좀을 제조할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물을 단독 또는 중복 도포하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복 도포하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 항산화 및 미백 효과가 우수한 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용 횟수를 달리할 수 있다.

본 발명의 비자나무의 잎 또는 가지 추출물은 표피포도상구균 (Staphylococcus epidermidis), 큐티박테리움 아크네 (Cutibacterium acnes) 및 말라쎄지아 파키더마티스 (Malassezia pachydermatis)에 대한 항균 활성을 갖는바, 상기 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 항균용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, ‘항균용 조성물’이란 박테리아 및 진균에 대한 항균 및 항진균 활성을 갖는 소재를 의미한다.

본 발명의 상기 항균용 조성물은 항균 및 항진균 활성이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있으며, 구체적으로는 의약품, 화장품 및 식품 등 다양한 산업분야에서 적용되는 제품에 항균 활성을 부여할 수 있는 기능성 소재로 사용할 수 있다.

표피포도상구균 (Staphylococcus epidermidis)은 포도상구균속의 세균으로 코아귤라제(coagulase)생산, 만니톨(mannitol)을 분해하지 못하는 특성이 있으며 이들 성상이 병원성 황색포도상구균(S. aureus)과 다르며 인축의 피부, 점막, 대기, 하수 등의 자연계에 농을 유발하거나 저항성이 저하된 동물에 심내막염이나 패혈증을 일으키는 수도 있다. 큐티박테리움 아크네 (Cutibacterium acnes)는 혐기성 세균으로 피부 모낭 내에서 상주하는 여드름 유발균으로 지방분해 효소를 분비하여 이 효소가 피지 중의 중성지방을 분해하여 유리 지방산을 형성하고 모낭을 자극하며, 면역반응을 일으켜 여드름의 염증 반응에 기여하는 것으로 알려져 있다. 말라쎄지아 파키더마티스 (Malassezia pachydermatis)는 비듬, 어루러기 등 곰팡이성 피부병 원인균이다.

본 발명의 비자나무의 잎 또는 가지 추출물은 상기와 같이 피부 및 두피 염증과 비듬, 어루러기 등 곰팡이성 피부병을 일으키는 균주에 대하여 우수한 항균 활성을 가지므로 여드름성 피부염, 지루성 피부염, 비듬증 및 기타 피부(또는 두피) 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 화장료 조성물이나 피부 외용제 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 항균용 조성물이 화장료 또는 피부 외용제 소재로 사용되는 경우, 비자나무의 잎 또는 가지 추출물은 조성물에 1μg/ml 내지 100000μg/ml의 농도로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 모발 및/또는 두피에 적용하는 모발개선용 화장료 조성물일 수 있다.

본 발명에 있어서, 모발은 체모와 두발의 총칭으로 사람의 털을 의미하나, 바람직하게는 모발을 의미하며, 머리의 모근, 모낭, 머리카락 및 모낭 근처의 두피를 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, 두피는 머리 부위를 덮고 있는 피부를 말하며, 보통 모발(머리털)이 나 있는 부위이다.

모발개선용 화장료 조성물의 경우, 상술한 비자나무의 잎 또는 가지 추출물 뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 헤어 컨디셔너, 헤어 토닉, 헤어 크림, 헤어 로션, 헤어 오일, 헤어 샴푸, 헤어 린스, 헤어 트리트먼트, 헤어 크림, 헤어 팩, 헤어 스프레이, 헤어 에센스, 헤어 무스 또는 헤어 겔, 헤어 마사지, 헤어 리퀴드, 비에어로졸 무스, 비에어로졸 스프레이, 에어로졸 무스, 에어로졸 스프레이, 파마제, 탈색제, 수 분산액, 파우더 또는 오일의 제형으로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 항균용 조성물은 상기와 같은 화장품 및 의약품(피부 외용제) 이외에 피부 세정제, 모발 세정제, 질 세정제, 구강 세정제, 욕실용 세정제, 주방용 세정제, 화장품 보존제, 화장품 방부제, 식품 보존제, 식품 방부제, 식품첨가제 및 사료첨가제 소재로 사용될 수 있다.

본 발명의 항균용 조성물이 세정제 소재로 사용되는 경우, 상기 항균 조성물이 적용될 수 있는 물품에 있어서 특별히 한정되지 않으며, 구체적으로는 핸드워시, 바디워시, 샴푸, 린스, 클렌징폼, 클렌징젤, 비누, 가글, 치약, 욕실용 세정제, 주방용 세정제 등을 예시할 수 있다. 본 발명의 비자나무의 잎 또는 가지 추출물은 세정제 조성물 총 중량에 대하여 0.00001 내지 50.0중량%로 포함될 수 있으며, 조성물에 1μg/ml 내지 100000μg/ml의 농도로 포함될 수 있다. 또한, 상기 세정제는 본 발명의 비자나무의 잎 또는 가지 추출물 이 외에, 항균활성을 가지는 다른 공지 항균 물질을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 항균용 조성물이 첨가제 소재로 사용되는 경우, 상기 항균용 조성물이 적용될 수 있는 물품에 있어서 특별히 한정되지 않으며, 구체적으로는 식품 및 동물사료 등을 예시할 수 있다. 본 발명의 비자나무의 잎 또는 가지 추출물은 세정제 조성물 총 중량에 대하여 0.00001 내지 50.0중량%로 포함될 수 있으며, 조성물에 1μg/ml 내지 100000μg/ml의 농도로 포함될 수 있다. 또한, 상기 식품첨가제 또는 사료첨가제는 본 발명의 비자나무의 잎 또는 가지 추출물 이 외에, 항균활성을 가지는 다른 공지 항균 물질이나 기타 기능성을 부여할 수 있는 물질을 더 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 비자나무의 잎 또는 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 미백 및 항균 활성을 갖는 건강기능식품일 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 항산화, 미백 및 항균을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 비자나무의 잎 또는 가지 추출물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 비자나무의 잎 또는 가지 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 상기 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 비자나무의 잎 또는 가지 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 비자나무의 잎 또는 가지 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 비자나무의 잎 또는 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품은 하기 실시예에서도 확인한 바와 같이 우수한 항산화 효과, 미백 효과 및 항균 효과를 실험적으로 입증하였는바, 산화관련 질환이나 여드름성 피부염 및 지루성 피부염 등의 예방 또는 개선에 효과적이다.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

또한 본 발명은 비자나무의 잎 또는 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 미백 및 항균 활성을 갖는 사료용 조성물 또는 사료첨가제일 수 있다.

본 발명에 따른 사료 조성물은 상기 비자나무의 잎 또는 가지 추출물을 조성물 충 중량 기준으로 0.1~50중량%, 보다 바람직하게는 1~20중량%로 포함할 수 있으나, 특별히 이러한 범위를 한정하는 것은 아니다. 한편, 사료첨가제로 사용되는 경우 비자나무의 잎 또는 가지 추출물을 사료 조성물에 배합하여 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

1. 실험방법

<1-1> 추출방법

본 실험에서는 비자나무의 오일성분을 추출하기 위하여 전라남도 산림자원연구소에서 수급받은 비자나무 잎, 가지를 건조하여 분쇄 후 사용하여 추출하였다. 비자나무 잎, 가지 분쇄물 30 g을 헥산 (hexane)과 클로로포름:메탄올 (2:1, v/v) 용액 300mL에 각각 침지시켰다. 72시간 침지 후 필터하고 필터된 여과물을 다시 각각의 용매에 넣어 72시간 동안 침지하였다. 총 3회 반복 추출을 진행하였고 추출된 추출물은 감압농축기와 동결건조기를 사용하여 농축하였다. 추출된 추출물들은 하기 표 1과 같이 명명하였다.

비자나무 추출물

추출 부위	추출 용매	추출물
잎	헥산	TNL1
잎	클로로포름:메탄올 (2:1, v/v)	TNL2
가지	헥산	TNB1
가지	클로로포름:메탄올 (2:1, v/v)	TNB2

<1-2> 항산화 활성 분석

[DPPH 자유 라디칼 소거능 측정]

DPPH 자유 라디칼 소거능은 Blois의 방법을 변형하여 실험을 진행하였다. 비자나무 추출물 (TNL1, TNL2, TNB1, TNM2)을 100-5,000 μg/mL의 농도로 제조하였다. 농도별로 제조된 각 추출물 샘플 200 μL에 0.25 mM DPPH 시약을 800 μL를 혼합하였다. 혼합된 혼합물은 암실에서 15분 동안 반응하였다. 반응 후 남아있는 라디칼의 농도를 Biotek Synergy HT multi-detection microplate reader 장비를 활용하여 517 nm 파장에서 측정하였다. 양성 대조군으로 부틸하이드록시아니솔 (butylated hydroxyanisole)(BHA, Sigma, USA)를 사용하였고, 추출물의 DPPH에 대한 소거능 (IC₅₀)은 용매만을 사용한 대조군의 흡광도를 50% 감소시키는데 필요한 농도로 나타내었다.

[ABTS 라디칼 소거능 측정]

ABTS 라디칼 소거능은 Lee의 방법을 사용하여 진행하였다[Lee, S. O., H. J. Lee, M. H. Yu, H. G. Im, and I. S. Lee. Korean J. Food Sci. Technol. 37: 233-24 (2005]. 7 mM ABTS 시약과 2.45 mM 포타슘 프리설페이트 (potassium presulfate) 시약을 각각 제조한 뒤 1:1 비율로 혼합하고, 암실에서 15시간 동안 반응시켰다. ABTS 라디칼 스톡 용액의 흡광도가 1.00 ± 0.02가 되도록 PBS (pH 7.4)용액으로 희석하여 ABTS 라디칼 시약을 준비하였다. 100-5,000 μg/mL의 농도로 제조된 비자나무 추출물 시료 200 μL와 ABTS 라디칼 시약을 1,000 μL를 혼합하였다. 혼합된 혼합물은 암실에서 15분 동안 반응하였다. 반응 후 흡광도를 Biotek Synergy HT multi-detection microplate reader 장비를 활용하여 720 nm 파장에서 측정하였다.

<1-3> 총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀 함량 (Total polyphenol contents; TPC) 측정은 Folin-Ciocalteu 방법을 사용하여 진행하였다. 1000 μg/mL 농도로 제조된 비자나무 추출물 (TNL1, TNL2, TNB1, TNM2) 500 μL에 0.2 M Folin-Ciocalteu phenol solution 500 μL, 2% sodium carbonate solution (w/v) 500 μL를 혼합하고 30분 동안 암실에서 반응을 시켰다. 반응 후 혼합물의 흡광도를 Biotek Synergy HT multi-detection microplate reader 장비를 활용하여 750 nm 파장에서 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 검정곡선에 기초하여 갈산 당량 (GAE) mg/g 으로 표현하였다.

<1-4> 총 플라보노이드 함량 측정

총 플라보노이드 함량 (Total flavonoid contents; TFC) 측정은 Park 등의 방법을 응용하여 실험을 진행하였다. 농도별로 제조된 비자나무 추출물 (TNL1, TNL2, TNB1, TNM2) 500 μL에 메탄올 1.5 mL, 10% 염화알루미늄 100 μL, 1 M 포타슘 아세테이트 100 μL, 증류수 2.8 mL를 순서대로 혼합을 하고 상온에서 40분간 반응을 하였다. 반응 후 혼합물의 흡광도를 microplate reader (Biotek Synergy HT multi-detection)를 활용하여 415 nm 파장에서 측정하였다. 총 플라보노이드 함량은 검량곡선에 기초하여 퀘르세틴 당량 (QUE) mg/g 으로 표현하였다.

<1-5> 기체 크로마토그래피 질량 분석

GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry)을 사용하여 비자나무 추출물(TNL1, TNL2, TNB1, TNM2)의 활성 성분을 분석하고자 이전에 보고된 방법을 변형하여 분석했다. GCMS-QP2010 Ultra Gas Chromatograph Mass Spectrometer (Shimadzu Europa GmbH, Japan)을 사용하여 비자나무 추출물의 활성 성분을 분석하였다. Agilent HP-5MS 실리카 모세관 column (30 mm l. x 0.25 mm i.d., 0.25 μm)을 사용하였고, 전자 이온화(EI) 조건에서 이온화하였다. GC oven은 캐리어 가스로 헬륨(He)을 사용하였으며, 60-200℃에서 2℃/min의 조건으로 1 mL/min의 flow로 분석하였다. 스캔된 모든 질량 스펙트럼은 데이터 시스템 라이브러리(NIST 2017)와 비교되었다.

<1-6> 액체 크로마토그래피 질량 분석

LC-MS/MS 분석기기는 AB SCIEX 4000 Q Trap LC/MS/MS System (Shimadzu LC 20A System)를 이용하였으며, 이동상으로는 물 (in 0.1% fomic acid, solvent A), 아세토니트릴 (in 0.1% fomic acid, solvent B)을 사용하여 분석하였다. 분석조건은 아래 표 2의 조건으로 진행하였다.

LC-MS/MS 분석 조건

MS condition	Negative: Turbo Ion Spray, temperature 450℃, MRM scan type spray voltage -4500V, CG 30, GS1 50, GS2 50.	Positive: Turbo Ion Spray, temperature 450℃, MRM scan type spray voltage 5000V, CG 30, GS1 50, GS2 50.
Column	Gemini 3 μm, C18 110A 50 mm*2.0 mm, Gemini C18(4.0 mm × 2.0 mm) guard cartridge	Gemini 3 μm, C18 110A 50 mm*2.0 mm, Gemini C18(4.0 mm × 2.0 mm) guard cartridge
Column oven	40℃	40℃
Autosampler	15℃	15℃
Mobile phase	10% B start, 0.5min-10% B, 1.0min-60% B, 1.5min-80%, 2.9min-80% B, 3.0min-10% B, 4min stop	10% B start, 0.5min-10% B, 1.0min-60% B, 1.5min-80%, 2.9min-80% B, 3.0min-10% B, 4min stop
Flow rate	0.3 mL/min	0.3 mL/min

<1-7> 티로시나아제 저해 활성 측정

[0.1 M 인산 완충액 제조]

136 g KH2PO4를 증류수 1 L에 녹여 1 M KH2PO4를 제조하였다. 174.2 g K2HPO4를 증류수 1 L에 녹여 1 M K2HPO4를 제조하였다. 제조된 1 M KH2PO4와 1 M K2HPO4를 각각 61 mL, 39 mL를 섞고 증류수 900 mL를 넣어 0.1 M 인산 완충액을 제조하였다.

[1.5 mM L-티로신 제조]

0.271 g L-티로신을 0.1 M 인산 완충액 10 mL에 녹여 150 mM L-티로신을 제조한 뒤 이를 100배 희석하여 1.5 mM L-티로신을 제조하였다.

[1700 unit 티로시나아제 제조]

머쉬룸 티로시나아제에 0.1 M 인산 완충액 10 mL에 녹여 25,000 unit 범위의 티로시나아제를 제조하였다.

[티로시나아제 저해 활성 측정]

각 시료 200 μL, 1.5 mM L-티로신 600 μL, 완충액 400 μL, 티로시나아제 200 μL의 순서로 혼합하고 37℃에서 30분 동안 반응시켜 흡광도를 SCINCO UV-Vis spectrophotometer s-3100 (Seoul, Korea)을 이용하여 490 nm에서 측정하였다.

<1-8> 항균 및 항진균 활성 측정

비자나무 추출물 (TNL1, TNL2, TNB1, TNM2)의 피부염을 일으키는 균에 대한 항균 활성을 확인하기 위하여 표피포도상구균 (Staphylococcus epidermidis KCTC 3958), 큐티박테리움 아크네 (Cutibacterium acnes KCTC 3314), 비듬균 (Malassezia furfur KCTC 7743), 말라쎄지아 파키더마티스 (Malassezia pachydermatis KCTC 27587)를 사용하여 디스크확산법을 이용 항균 및 항진균 활성을 확인하였다.

모든 비자나무 추출물 (TNL1, TNL2, TNB1, TNM2)은 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO)에 100 mg/mL 농도로 제조하였으며, 121℃에서 15분간 멸균 후 건조시킨 8 mm 페이퍼 디스크에 1.25 mg/mL, 2.5 mg/mL, 5 mg/mL, 10 mg/mL 농도의 페이퍼 디스크를 제작하였다. 이후 TSA, SDA, mLNA를 제작 후 121℃에서 15분간 멸균하여 90 mm 페트리 디쉬에 굳혔으며, 액체배지에서 활성화된 4종의 균주를 고체배지에 골고루 도말하였다. 균이 도말된 페트리 디쉬에 각각 대조군(control)과 비자나무 추출물 샘플 디스크를 배치하였으며, 항균 활성의 유무는 페이퍼 디스크 주위로 생기는 저해환 (inhibition zone)의 지름을 측정하였으며, 모든 실험은 5회 반복하여 측정하였다. 양성대조군으로 암피실린 (AMP) 10 μg, 케토코나졸 (KTZ) 3 μg를 사용하였다.

<1-9> 세포독성 실험

비자나무 추출물 (TNL1, TNL2, TNB1, TNM2)의 세포독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 진행하였다. B16F10 세포를 각 1×10⁵ cells/well 으로 접종하고 24시간 동안 배양하였다. 농도별로 시료를 처리하고 24시간 배양 후 배양이 끝난 세포에 MTT stock용액 (2 mg/mL)을 500 uL씩 처리하고 1시간 후 배지를 제거하고 DMSO를 200 μL씩 첨가하여 세포에서 생성된 MTT-포르마잔 결정체를 용해시켰다. 용해된 용액을 96 well에 100 μL씩 취해서 ELISA reader로 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.

<1-10> 통계 처리

모든 결과는 은 세 번 반복실험 후 통계처리하였으며, 실험에 의해 얻어진 값들의 평균±표준편차로 표현하였다. 대조군과 실험군 사이의 통계학적 유의성 검증은 SPSS 26 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) software에서 Turkey의 방법으로 one-way ANOVA 분석을 통하여 통계분석하였고, p < 0.05 이내가 되는 값을 선별하여 군간 비교 분석을 실시하였다.

2. 결과

<2-1> 비자나무 추출물의 수율

비자나무의 잎, 가지를 2가지 용매(헥산, 클로로포름:메탄올)을 사용하여 각각 추출하고, 추출 결과는 표 3에 나타내었다. 비자나무 잎과 가지 추출물 중 가지 추출물의 수율이 더 높은 것으로 확인되었다. 비자나무 잎, 가지 추출물 모두 헥산(hexane)으로 추출한 추출물보다 클로로포름 및 메탄올(2:1, v/v) 혼합용매를 사용하여 추출물의 수율이 약 4배 이상 높을 것으로 확인되었다.

비자나무 추출물의 수율

시료	중량 (g)	수율 (%)
TNL1	0.19	0.63
TNL2	2.65	8.83
TNB1	0.51	1.70
TNB2	2.94	9.80

<2-2> 항산화 활성 측정 결과

[DPPH 자유 라디칼 소거능 측정 결과]

비자나무 추출물 (TNL1, TNL2, TNB1, TNM2)의 항산화 활성을 확인하기 위하여 DPPH 자유 라디칼 소거능을 측정하였다. 측정 결과 비자나무 잎, 가지 추출물 모두 농도 의존적으로 활성을 나타었으며, 비자나무 잎의 추출물보다 비자나무 가지의 추출물의 항산화 활성이 높은 것으로 확인되었다(도 2 참조). 추출 용매에 따라 활성이 다른 것으로 확인되었는데 헥산 추출물보다 클로로포름 및 메탄올(2:1, v/v) 혼합용매 추출물의 항산화 활성이 높은 것으로 확인되었다. 각 추출물의 IC₅₀ 확인 결과 577.11 - 4875.14 μg/mL로 확인되었다(표 3 참조). TNB2(비자나무 가지의 클로로포름 및 메탄올 혼합용매 추출물)의 항산화 활성이 가장 높은 것으로 확인되었다. 클로로포름 및 메탄올 혼합용매로 추출된 추출물의 경우 2000 μg/mL 농도에서 DPPH 자유 라디칼 소거 활성이 각각 83.70, 87.47%로 나타나 높은 항산화 활성을 보여주었다.

[ABTS 라디칼 소거능 측정 결과]

농도별로 제조된 비자나무 추출물 (TNL1, TNL2, TNB1, TNM2)의 ABTS 라디칼 소거능을 측정하였다. 측정결과 비자나무 잎, 가지 추출물 모두 농도 의존적으로 활성을 나타내었다 (도 3 및 표 4 참조). 각 추출물의 IC₅₀ 값은 387.44 - 2691.22 μg/mL로 나타났으며, TNB2(비자나무 가지의 클로로포름 및 메탄올 혼합용매 추출물)의 값이 387.44 μg/mL로 가장 낮은 것으로 확인 되었다. DPPH 자유 라디칼 소거능과 유사하게 비자나무 잎 추출물보다 비자나무 가지 추출물의 항산화 활성이 높았으며, 헥산 추출물보다 클로로포름 및 메탄올 혼합용매 추출물의 항산화 활성이 높았다.

비자나무 추출물의 DPPH 및 ABTS 라디칼 활성의 IC₅₀ 값 (Unit : μg/mL)

시료	DPPH	ABTS
TNL1	4875.14 ± 481.99	2691.22 ± 35.23
TNL2	687.12 ± 50.11	595.23 ± 9.60
TNB1	4047.81 ± 503.37	2246.45 ± 127.77
TNB2	577.11 ± 27.00	387.44 ± 2.13
BHA	95.88 ± 0.56	54.15 ± 0.24

<2-3> 총 폴리페놀 함량 측정 결과

비자나무 추출물 (TNL1, TNL2, TNB1, TNM2)의 총 폴리페놀 함량 측정결과 21.66-49.51 GAE mg/g 함유된 것으로 확인되었다 (표 5 참조). 비자나무 잎 추출물 보다 가지 추출물의 폴리페놀 함량이 높은 것으로 확인되었다.

비자나무 추출물의 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량

시료	TPC (GAE mg/g)	TFC (QUE mg/g)
TNL1	21.66 ± 0.87	12.44 ± 0.50
TNL2	41.53 ± 0.93	30.86 ± 1.64
TNB1	25.93 ± 0.64	14.84 ± 0.55
TNB2	49.51 ± 0.96	35.44 ± 2.15

<2-4> 총 플라보노이드 함량 측정 결과

비자나무 추출물 (TNL1, TNL2, TNB1, TNM2)의 총 플로보노이드 함량 측정결과 12.44-35.44 QUE mg/g 함유된 것으로 확인되었다 (표 5 참조). 총 폴리페놀 함량 측정 결과와 동일하게 총 플로보노이드 함량에서도 비자나무 가지 추출물의 함량이 더 높았으며, 헥산 추출물보다 클로로포름 및 메탄올 혼합용매 추출물에서 플라보노이드 함량이 더욱 높게 측정되었다.

<2-5> GC-MS 분석 결과

비자나무 추출물 (TNL1, TNL2, TNB1, TNM2)에 함유되어 있는 성분을 분석하기 위하여 GC-MS 분석을 진행하였다. 분석 결과 총 21가지 성분이 분석되었고 그 중 3가지 성분 (1,3-Di-tert-butylbenzene, 2,4-Di-tert-butylphenol, alpha-Cadinol)이 잎, 가지 유기용매 추출물에 모두 함유된 것으로 확인되었다. 클로로포름 및 메탄올 혼합용매 추출물에서 페루기놀 (ferruginol)이 가장 많이 함유된 것으로 확인되었는데, 페루기놀 (ferruginol)은 테르페노이드 구조를 가진 천연 페놀로써 항산화 및 항암에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 헥산 추출물에는 글리놀(gleenol), 큐베볼(cubebol), 알파-카디놀(alpha-Cadinol), 1-펩타트리아코타놀(1-heptatriacotanol) 성분들이 함유된 것으로 확인되었고, 상기 물질들은 항균 및 항진균 활성이 우수한 것으로 알려져 있다.

비자나무 추출물에 함유되어있는 성분 분석

No.	R. Time	Name	Composition (%)
No.	R. Time	Name	TN-L1	TN-L2	TN-B1	TN-B2
1	6.66	Undecane	-	1.62	-	-
2	8.77	5-Isobutylnonane	3.00	2.72	-	2.21
3	10.85	Undecane	-	4.11	-	2.93
4	11.01	Nonanal	3.11	-	-	-
5	15.39	Methyl salicylate	-	2.19	-	-
6	16.20	Dodecane	-	-	-	2.4
7	18.74	1,3-Di-tert-butylbenzene	6.09	4.71	2.29	4.77
8	20.58	2,6,11-Trimethyldodecane	4.05	-	-	-
9	28.25	Tetradecane	4.48	-	-	-
10	34.39	2,4-Di-tert-butylphenol	17.71	5.42	5.7	3.68
11	34.73	delta-Amorphene	-	3.85	-	-
12	38.60	gleenol	10.32	-	4.9	-
13	40.76	cubebol	11.99	-	7.31	2.67
14	41.86	alpha-Cadinol	31.66	8.95	14.91	7.65
15	43.77	4-O-Methylmannose	-	25.78	-	-
16	50.15	1-Heptatriacotanol	7.59	-	2.38	-
17	58.59	Ferruginol	-	40.65	-	60.86
18	58.60	1-S-Hexyl-1-thio-d-mannitol	-	-	31.64	-
19	62.64	Dehydroabietinol	-	-	4.72	12.83
20	68.65	(+)-Hinokione	-	-	21.07	-
21	69.79	Agathadiol	-	-	5.08	-

<2-6> LC-MS/MS 분석 결과

비자나무 추출물 (TNL1, TNL2, TNB1, TNM2)에 함유되어 있는 페놀성 화합물을 분석하기 위하여 LC-MS/MS 분석을 진행하였다. 분석결과 4-하이드록시 벤조산 (4-hydroxy benzoic acid), 카페인산 (Caffic acid), 갈산 (Gallic acid), 나린진 (Naringin) 등 16종 성분 정량 확인하였다. 헥산 추출물 대비 클로로포름 및 메탄올 혼합용매 추출물에서 나린진(Naringin)이 상대적으로 높게 함유된 것으로 확인되었는데, 나린진(Naringin)은 산화 방지 활성, 항암 활성, 혈액의 지방을 낮추는 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

비자나무 추출물에 함유되어 있는 페놀성 화합물 성분 분석

Sample	Calculated Concentration (μg/mL)
Sample	TNL1	TNL2	TNB1	TNB2
Protocatechuic acid ethyl ester	-	-	-	-
4-hydroxy benzoic acid	0.275	0.296	0.292	0.252
Caffic acid	0.189	0.072	0.063	0.086
Syringic acid	-	-	-	-
Vanillic acid	0.247	0.054	0.068	0.146
Coumaric acid	0.261	0.117	0.125	0.104
Rutin	0.082	0.112	0.052	0.045
Ferulic acid	0.130	0.313	0.255	0.355
Oxyresveratrol	-	-	-	-
Naringein	0.044	0.087	0.063	0.058
Resveratol	-	-	-	-
Benzoic acid	-	-	0.099	0.488
Nicotinic acid	0.045	0.038	0.050	0.047
Gallic acid	0.051	0.050	0.130	0.148
Protocatechuic acid	0.482	0.386	0.556	0.306
Verbadoside	-	-	-	-
Bergenin	-	-	-	-
Biochanin A	-	-	-	-
Naringin	-	1.386	0.736	1.270
Chlorogenic acid	-	-	-	-
Catechin	1.228	1.683	3.142	1.728
Kaempferol	0.032	0.018	0.015	0.020
Apigenin	0.011	0.034	0.030	0.054
Tannic acid	9.20	5.66	4.76	3.28
Total	12.277	10.306	10.436	8.387

<2-7> 티로시나아제 저해 활성

비자나무 추출물 (TNL1, TNL2, TNB1, TNM2)의 티로시나아제 저해 활성 측정 결과, 헥산 추출물 대비 클로로포름 및 메탄올 혼합용매 추출물에서 효과가 두드러지게 우수한 것으로 나타났다(도 5 및 표 8 참조).

비자나무 추출물의 티로시나아제 저해 활성

농도	비자나무 추출물
농도	TNL1	TNL2	TNB1	TNB2
500 μg/mL	13.40 ± 0.69	43.85 ± 0.43	15.52 ± 0.17	45.10 ± 0.15
1000 μg/mL	34.80 ± 0.35	65.88 ± 0.34	35.84 ± 0.35	66.19 ± 0.31
2000 μg/mL	44.84 ± 0.35	87.70 ± 0.09	46.13 ± 0.26	88.15 ± 0.40

<2-8> 항균 및 항진균 활성

비자나무 추출물 (TNL2, TNM2)의 항균 및 항진균 활성을 측정하였다.

비자나무 추출물의 표피포도상구균 (Staphylococcus epidermidis)에 대한 항균활성을 확인한 결과 TNL2 추출물은 3 mg에서 10.00 mm, 4 mg에서 11.67 mm, 5 mg에서 13.50 mm로 확인되었고, TNB2는 3 mg에서 9.83 mm, 4 mg에서 11.33 mm, 5 mg에서 13.50 mm로 항균 활성을 나타내는 것으로 확인되었다(도 6 참조).

비자나무 추출물의 큐티박테리움 아크네 (Cutibacterium acnes)에 대한 항균활성을 확인한 결과 TNL2 추출물은 3 mg에서 10.10 mm, 4 mg에서 11.20 mm, 5 mg에서 13.90 mm로 확인되었고, TNB2 추출물은 3 mg에서 11.30 mm, 4 mg에서 13.00 mm, 5 mg에서 15.40 mm로 항균 활성을 나타내는 것으로 확인되었다(도 7 참조).

비자나무 추출물의 비듬균 (Malassezia furfur)에 대한 항균활성을 확인한 결과 TNL2, TNB2 추출물은 모두 비듬균에 대해 항균 활성이 미미한 것으로 확인되었다(도 8 참조).

비자나무 추출물의 말라쎄지아 파키더마티스 (Malassezia pachydermatis)에 대한 항균활성을 확인한 결과 TNL2 추출물은 3 mg에서 10.30 mm, 4 mg에서 11.40 mm, 5 mg에서 13.50 mm, TNB2 추출물은 3 mg에서 10.20 mm, 4 mg에서 11.10 mm, 5 mg에서 13.20 mm로 항균 활성을 나타내는 것으로 확인되었다(도 9 참조).

<2-9> 세포독성 평가

비자나무 추출물 (TNL1, TNL2, TNB1, TNM2)을 25 μg/mL - 100 μg/mL 농도에서 세포독성을 확인하였으며, 그 결과 도 10에서 나타낸 바와 같이 추출물의 모든 농도에서 세포독성이 나타나지 않았다.

제형예 1: 유연화장수(스킨로션)

하기 표에 나타난 바와 같이 유연화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

본 발명의 유연화장수 제형예

배합성분	함량(중량%)
비자나무의 잎 또는 가지 추출물	1~5
1.3-부틸렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
DL-판테놀	0.3
알란토인	0.1
폴리솔베이트 20	0.5
에탄올	15.0
벤조페논-9	0.05
향,방부제	미량
정제수	to 100

제형예 2: 영양화장수(밀크로션)

하기 표에 나타난 바와 같이 영양화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

본 발명의 영양화장수 제형예

배합성분	함량(중량%)
비자나무의 잎 또는 가지 추출물	1~5
글리세릴 스테아레이트 SE	1.5
세테아릴알콜	1.5
라놀린	1.5
폴리솔베이트 60	1.3
솔비타스테아레이트	0.5
경화식물유	4.0
광물유	5.0
트리옥타노인	2.0
디메치콘	0.8
초산 토코페롤	0.5
카르복시비닐 폴리머	0.12
글리세린	5.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
소듐히아루로네이트	5.0
트리에탄올아민	0.12
유니사이드-유 13	0.02
향	미량
증류수	to 100

제형예 3: 영양크림

하기 표에 나타난 바와 같이 영양크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

본 발명의 영양크림 제형예

배합성분	함량(중량%)
비자나무의 잎 또는 가지 추출물	1~5
친유형 모노스테아린산 글리세린	1.5
세테아릴알콜	1.5
스테아린산	1.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비타스테아레이트	0.6
이소스테아릴 이소스테레이트	5.0
스쿠알란	5.0
광물유	35.0
디메치콘	0.5
히드록시에틸셀룰로오스	0.12
글리세린	6.0
트리에탄올아민	0.7
유니사이드-유13	0.02
향	미량
증류수	to 100

제형예 4: 마사지크림

하기 표에 나타난 바와 같이 마사지크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

본 발명의 마사지크림 제형예

배합성분	함량(중량%)
비자나무의 잎 또는 가지 추출물	1~5
프로필렌글리콜	6
글리세린	4.0
트리에탄올아민	0.5
밀납	2.0
토코페릴아세테이트	0.1
폴리솔베이트 60	3.0
솔비탄세스퀴올레이트	2.5
세테아릴알코올	2.0
유동파라핀	30.0
카르복시비닐폴리머	0.5
향	미량
증류수	to 100

제형예 5: 팩

하기 표에 나타난 바와 같이 팩을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

본 발명의 팩 제형예

배합성분	함량(중량%)
비자나무의 잎 또는 가지 추출물	1~5
글리세린	10.0
베타인	5.0
REG 1500	2.0
알란토인	0.1
DL-판테놀	0.3
EDTA-2Na	0.02
벤조페논-9	0.04
히드록시에틸 셀룰로오스	0.1
소듐 히아루로네이트	80.
카르복시비닐폴리머	0.2
트리에탄올아민	0.18
옥틸도데칸올	0.3
옥틸도데세스-16	0.4
에탄올	6.0
유니사이드-유13	0.01
향	미량
증류수	to 100

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

비자나무의 잎 또는 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 화장료 조성물.
비자나무의 잎 또는 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물.
비자나무의 잎 또는 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용 화장료 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 추출물은 클로로포름 및 메탄올 혼합용매로 추출된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 추출물은 페루기놀 (ferruginol)을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제2항에 있어서,
상기 추출물은 티로시나아제 저해 활성을 통해 미백 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제3항에 있어서,
상기 추출물은 표피포도상구균 (Staphylococcus epidermidis), 큐티박테리움 아크네 (Cutibacterium acnes) 및 말라쎄지아 파키더마티스 (Malassezia pachydermatis)에 대한 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
비자나무의 잎 또는 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 미백 및 항균 활성을 갖는 식품 조성물.
제8항에 있어서,
상기 추출물은 클로로포름 및 메탄올 혼합용매로 추출된 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
비자나무의 잎 또는 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 미백 및 항균 활성을 갖는 건강기능식품.