KR20140147919A

KR20140147919A - 비알코올성 지방간염 감별용 바이오마커 ｍｉＲ-451

Info

Publication number: KR20140147919A
Application number: KR20130070347A
Authority: KR
Inventors: 윤승규; 허원희; 김성우; 최정은; 홍성우
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2013-06-19
Filing date: 2013-06-19
Publication date: 2014-12-31
Also published as: KR101570269B1

Abstract

본 발명은 단순 지방간 및 비알코올성 지방간염을 감별하기 위한 바이오마커 및 이의 이용에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 특정 miRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 단순 지방간으로부터 비알코올성 지방간염의 감별용 조성물 및 키트에 관한 것이다. 또한, 단순 지방간으로부터 비알코올성 지방간염의 감별에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 특정 miRNA 를 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

비알코올성 지방간염 감별용 바이오마커 ｍｉＲ-451 {Biomaker miR-451 for distinguishing non-alcoholic steatohepatitis}

비알코올성 지방간질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 음주와 관계없이 간 내에 중성지방이 축적되는 질환을 의미한다. 비알코올성 지방간질환의 위험인자로는 비만, 당뇨병, 고지혈증이 대표적이고, 단백질-칼로리 결핍, 몸무게를 갑자기 감량하는 경우나 정맥주사로 전체영양을 취하는 경우에도 발병할 수 있다고 알려져 있다.

비알코올성 지방간질환은 단순 지방간(steatosis)과 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)으로 나눌 수 있는데, 단순 지방간은 임상적으로 예후가 양호한 양성 질환임에 반하여, 비알코올성 지방간염은 지방간과 함께 염증 또는 섬유화를 동반하는 것을 특징으로 하는 진행성 간질환으로 간경변이나 간암으로 진행될 수 있기 때문에 점차 심각한 간질환으로 인식되고 있다.

이와 같이, 비알코올성 지방간질환 환자들 중에서도, 단순 지방간인지 아니면 비알코올성 지방간염인지에 따라 질환의 예후와 치료 요법의 적용 등이 달라지게 되므로, 단순 지방간과 비알코올성 지방간염을 구분하여 진단하는 것이 매우 중요하다.

그러나, 비알코올성 지방간염의 경우 그 증상이 대부분 없거나 경미하여, 비알코올성 지방간염을 발견하는 것은 매우 어렵다. 일반적으로 간기능(ALT/AST)수치가 상승하고 영상학적으로 지방간 소견을 보일 경우, 다른 질환들을 배제한 후 비알코올성 지방간염을 진단하고는 있으나, 비알코올성 지방간염에서 간기능(ALT/AST) 수치가 증가되더라도 변동적으로 나타나고 정상 상한치의 4배는 넘지 않기 때문에 확진이 어렵고, 초음파, CT 및 MRI 등의 영상학적 도구로 단순 지방간과 비알코올성 지방간염을 감별하는데 한계가 있는 실정이다. 또한, 감마 GTP(gamma-glutamyl transferase)나 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase)도 증가될 수 있으나, 이러한 검사소견들로 비알코올성 지방간염을 진단하기에는 예민도나 특이도가 너무 낮은 문제점이 있다.

결국, 이와 같은 임상적 특성을 가진 비알코올성 지방간염의 확진을 위해서는 간조직 생검(Liver biopsy)이 요구되는 데 언제 조직검사를 해야 하는가에 대해서 아직 논란의 여지가 많다. 일반적으로는 간기능(ALT/AST) 수치가 정상의 2배 이상 올라갈 때 조직검사가 필요하다고 인정하고 있는 실정이다. 그러나, 현재 임상에서 점차 증가되고 있는 비알코올성 지방간염 환자들을 모두 조직검사를 하는 것은 한계가 있어, 향후 비알코올성 지방간염을 비침습적으로 진단할 수 있는 도구 혹은 방법의 개발이 시급한 실정이다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 비알코올성 단순 지방간 마우스와 비알코올성 지방간염 마우스에서의 마이크로RNA의 발현정도를 비교 조사하여, miR-34a, miR-494-3p 및 miR-451가 비침습적으로 비알코올성 단순 지방간으로부터 비알코올성 지방간염을 감별하기 위한 바이오마커로 사용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 단순 지방간 및 비알코올성 지방간염을 비침습적으로 감별하기 위한 바이오마커를 제공하는 것이다.

보다 상세하게, 본 발명의 하나의 목적은 miR-34a, miR-494-3p 및 miR-451 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 마이크로RNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 단순 지방간으로부터 비알코올성 지방간염의 감별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 본 발명의 조성물을 포함하는, 단순 지방간으로부터 비알코올성 지방간염의 감별용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 단순 지방간으로부터 비알코올성 지방간염의 감별에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 miR-34a, miR-494-3p 및 miR-451 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 마이크로RNA를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은, miR-34a, miR-494-3p 및 miR-451 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 마이크로RNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 단순 지방간으로부터 비알코올성 지방간염의 감별용 조성물에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 miR-34a는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

바람직하게, 상기 miR-494-3p는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

바람직하게, 상기 miR-451는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다..

또한 바람직하게, 상기 발현수준을 측정할 수 있는 제제는 miR-34a, miR-494-3p 및 miR-451 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 마이크로RNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브일 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 단순 지방간으로부터 비알코올성 지방간염의 감별용 키트에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 단순 지방간으로부터 비알코올성 지방간염의 감별에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 miR-34a, miR-494-3p 및 miR-451 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 마이크로RNA를 검출하는 방법에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 시료는 환자의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 방법은, 단순 지방간 시료에 비하여 환자의 시료에서 miR-34a 또는 miR-494-3p가 상대적으로 과발현된 것으로 검출되는 경우, 상기 환자가 비알코올성 지방간염인 것으로 감별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 발명은, 단순 지방간 시료에 비하여 환자의 시료에서 miR-451가 상대적으로 저발현된 것으로 검출되는 경우, 상기 환자가 비알코올성 지방간염인 것으로 감별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 miR-34a, miR-494-3p 및 miR-451 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 마이크로RNA의 검출은 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 수행될 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 단순 지방간 환자에 비하여 비알코올성 지방간염 환자에서 miR-34a 또는 miR-494-3p은 과발현되고, miR-451은 저발현되는 것을 기초로, 환자 시료로부터 miR-34a, miR-494-3p 및 miR-451 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 마이크로RNA를 검출함으로써, 단순 지방간으로부터 비알코올성 지방간염을 감별하기 위한 조성물, 키트 및 방법을 제공한다.

본원에서 용어, "감별"이란, 특정 질환 상태를 진단, 판단 또는 판별하는 것을 말하며, 특히 임상적으로 유사한 특징을 일부 공유하는 질환들 가운데 어떤 질환인지를 정확하게 구별해낸다는 의미에서, 본 발명에서는 "질환을 감별한다"는 용어를 사용하였다. 그러나, 특정 질환을 확인한다는 측면에서, 상기 용어는 진단, 판단, 판별, 식별 등의 용어로 대체될 수도 있다.

본 발명의 목적상, 본 발명에서 감별은 비알코올성 지방간질환 중에서 단순 지방간인지 비알코올성 지방간염인지를 구분하는 것을 의미할 수 있다. 단순 지방간은 간 내에 중성지방이 축적되는 단순 양성 질환을 의미하나, 비알코올성 지방간염은 지방간과 함께 염증 또는 섬유화를 동반하는 것을 특징으로 하는 진행성 간질환을 말하는 것으로, 양 질환의 예후와 치료 요법의 적용 등이 상이하기 때문에, 단순 지방간인지 비알코올성 지방간염인지를 구분하는 것이 중요하다.

보다 바람직하게, 본 발명에서 감별이란, 단순 지방간 환자를 대상으로 하여 단순 지방간 상태에 머물러 있는지 아니면 비알코올성 지방간염으로 발전했는지를 확인하는 것, 즉, 단순 지방간으로부터 비알코올성 지방간염을 구별하는 것을 의미할 수 있다.

본 발명에서는 단순 지방간으로부터 비알코올성 지방간염을 감별하기 위하여, 비침습적인 도구로, 마이크로RNA 바이오마커를 사용함을 특징으로 한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 시료 내 존재하는 miR-34a, miR-494-3p 및/또는 miR-451의 발현수준을 측정함으로써, miR-34a 또는 miR-494-3p 이 단순 지방간에 비하여 과발현되거나 miR-451 이 단순 지방간에 비하여 저발현된 것으로 나타나는 경우, 해당 시료의 환자가 비알코올성 지방간염인 것으로 감별하는 기술을 제공한다.

본 발명의 바이오마커, miR-34a, miR-494-3p 및 miR-451 의 염기서열 정보는 miRBASE (http://www.mirbase.org/) 등의 공지된 유전자데이터베이스에서 확인할 수 있다. 보다 상세하게, miR-34a 의 염기서열은 유전자 등록번호 MIMAT0000255로 등록되어 있으며, 본원의 서열번호 1로 기재하였다. miR-494-3p 의 염기서열은 유전자 등록번호 MIMAT0002816로 등록되어 있으며, 본원의 서열번호 2에 기재하였다. miR-451 의 염기서열은 유전자 등록번호 MIMAT0001631로 등록되어 있으며, 본원의 서열번호 3에 기재하였다.

서열번호 1: 5'uggcagugucuuagcugguugu 3'

서열번호 2: 5'ugaaacauacacgggaaaccuc 3'

서열번호 3: 5'aaaccguuaccauuacugaguu 3'

시료 내 존재하는 miR-34a, miR-494-3p 및/또는 miR-451의 발현수준의 측정하기 위해서는, 이들 마이크로RNA 를 검출할 수 있는 각종 제제들을 사용할 수 있다.

본원에서 용어, "발현수준을 측정할 수 있는 제제"란, 환자의 시료 내에서 miR-34a, miR-494-3p 및 miR-451 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 마이크로RNA의 존재를 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 예를 들어, miR-34a, miR-494-3p 및/또는 miR-451 에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드 등이 될 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 miR-34a, miR-494-3p 및 miR-451 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 마이크로RNA에 염기 서열에 특이적으로 결합하고 다른 핵산물질의 염기 서열에는 특이적 결합을 하지 않는 것이 바람직하다.

이 때, 상보적으로 결합한다는 것은, 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 마이크로RNA 타겟에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포함하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

일예로, 본원의 마이크로RNA 바이오마커를 검출하는 데 사용되는 제제는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 용어, "안티센스 올리고뉴클레오타이드" 는 타겟으로 하는 miRNA, 특히 miRNA의 씨드 서열에 대한 상보적인 서열을 가지고 있어 miRNA와 이합체를 형성할 수 있는 핵산 기반의 분자를 의미하며, 본원의 마이크로RNA 바이오마커를 검출하는 데 사용될 수 있다.

다른 일예로, 본원의 마이크로RNA 바이오마커를 검출하는 데 사용되는 제제는, 프라이머일 수 있다. 용어, "프라이머"란, 주형 가닥에 상보적인 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 7개 내지 50개의 핵산서열을 의미한다. 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 핵산에서 이용할 수도 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 혼입할 수 있는 추가의 특징의 예로 메틸화, 캡화, 하나 이상의 핵산을 동족체로의 치환 및 핵산 간의 변형 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 본 발명의 프라이머는 miR-34a, miR-494-3p 및 miR-451 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 마이크로RNA를 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.

다른 일예로, 본원의 마이크로RNA 바이오마커를 검출하는 데 사용되는 제제는, 프로브일 수 있다. 용어, "프로브"란 타겟 마이크로RNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미한다. 바람직하게, 프로브는 표지(Labelling)되어 있어서 특정 마이크로RNA의 존재 유무를 쉽게 확인 할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 miR-34a, miR-494-3p 및 miR-451 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 마이크로RNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 단순 지방간으로부터 비알코올성 지방간염의 감별용 조성물은, 키트의 형태로 구현되어 제공될 수 있다.

본 발명의 키트는 miR-34a, miR-494-3p 및 miR-451 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 마이크로RNA를 검출하기 위한 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드 등의 검출 제제를 포함할 뿐만 아니라, 분석 방법에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다. 바람직하게, 상기 키트는 시료 내 마이크로RNA를 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 유전자 증폭 키트일 수 있다. 또한 바람직하게, 상기 키트는 고정기판의 표면에 마이크로RNA와 특이적으로 결합할 수 있는 프로브가 고정화되어 있는 마이크로어레이 키트일 수 있다.

또한, 본 발명은 환자의 시료로부터 miR-34a, miR-494-3p 및/또는 miR-451을 검출함으로써, 단순 지방간으로부터 비알코올성 지방간염의 감별하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 단순 지방간으로부터 비알코올성 지방간염의 감별에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 miR-34a, miR-494-3p 및/또는 miR-451를 검출하는 방법을 제공한다.

miR-34a, miR-494-3p 및/또는 miR-451의 검출에는 당업계에서 알려진 다양한 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들어, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 멀티플렉스 PCR, 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR, 부스터(booster) PCR, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 인버스(inverse) 중합효소 연쇄반응, 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR), 리가아제 연쇄 반응, 복구 연쇄 반응, 전사-중재 증폭, 자가 유지 염기서열 복제, 타깃 염기서열의 선택적 증폭 반응을 이용할 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 제한되지는 않는다.

바람직하게, 단순 지방간 시료에 비하여 환자의 시료에서 miR-34a 또는 miR-494-3p가 과다발현 되거나, miR-451가 저발현되는 경우, 상기 환자가 비알코올성 지방간염인 것으로 감별하는 단계를 추가로 포함하는 방법을 제공한다.

또한 바람직하게, 상기 시료는 환자의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군중에서 선택되는 시료일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명은 miR-34a, miR-494-3p 및/또는 miR-451 를 바이오마커로 사용함으로써 비침습적 방법으로 단순 지방간으로부터 비알코올성 지방간염을 감별하는 기술을 제공하며, 이를 이용하면, 보다 용이하고 신속, 정확하게 비알코올성 지방간염 환자의 감별이 가능하다.

도 1은 12개월간 정상식이와 고지방 식이를 섭취시킨 마우스 및 마우스의 간 조직 변화를 나타낸다.
도 2는 마우스의 간 조직 내 지방축적 및 섬유화 진행정도를 확인하기 위해, 간 조직에 대하여 H & E staining, Oil red O staining 및 Masson's trichrom staining을 시행한 결과를 나타낸다.
도 3은 단순 지방간과 비알코올성 지방간염에서의 miR-34a의 발현을 비교하여 나타낸 것이다.
도 4은 단순 지방간과 비알코올성 지방간염에서의 miR-494-3p의 발현을 비교하여 나타낸 것이다.
도 5는 단순 지방간과 비알코올성 지방간염에서의 miR-451의 발현을 비교하여 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 대상조직

고지방 식이 (#TD.88137, Harlan Teklad사) 사료를 C57BL/6J 마우스에 12개월동안 섭취시켜 비알코올성 단순 지방간(steatosis)에서 비알코올성 지방간염(NASH)으로의 진행을 확인 할 수 있는 마우스 in vivo모델을 확립하였다. 혈액내의 효소 활성 (aspartate Aminotransferase (AST), alanine Aminotransferase (ALT))이나 사이토카인(cytokine)들의 발현 측정을 통하여 혈액학적으로 확인하였다.

실시예 2. 간 조직의 면역조직화학 염색( immunohistochemistry )

10% 포르말린에 고정 시킨 간 조직을 파라핀(paraffin)으로 포매 한 후 4μm 두께로 잘라 헤마톡시린(Hematoxylin)과 에오신(Eosin)으로 염색하여 간조직의 병변을 확인하였다. 또한 간의 크기와 무게를 측정하고 간 조직 내 지방축적을 확인하기 위해 Oil red O staining(세포 내 지방의 축적을 알 수 있는 염색 방법)을 하고, 섬유화 진행 정도를 확인하기 위해 Masson's trichrome staining(간 조직 내 콜라겐 축적을 알 수 있는 염색 방법) 시행한 후, 광학현미경 상에서 관찰하였다.

Oil red O staining의 수행을 위해, 기간별로 적출된 간조직을 냉동절삭하여 OCT(optimal cutting temperature) compound (Tissue-Tek,Miles Inc, USA)위에 고정한 다음 6 μm두께로 잘라 슬라이드 글라스 위에 부착하여 건조시켰다. 동결절편은 증류수로 헹군 다음 60% isopropyl alcohol로 세척하였다. 조직은 Oil Red O 염색약으로 약 15분간 염색한 후 60% 아이소프로필 알코올(isopropyl alcohol)로 세척하였다. 세포핵은 Mayer's haematoxylin 용액으로 1~1분 30초간 염색하고, 증류수로 씻어낸 후 aqueous mountants(glycerin)로 슬라이드에 고정시켰다. 완성된 슬라이드는 형광현미경으로 염색 상태를 확인하고, 400배로 사진을 찍은 후 지방세포 생성 및 분포를 확인하였다.

Masson's trichrome staining의 수행을 위해, 기간별로 적출한 간조직을 4% 폼알데히드(formaldehyde)에 16시간 동안 고정시키고 수세 후 파라핀 블록(paraffin block)을 생성하였다. 간조직 파라핀 블록을 조직 절편기를 이용하여 3um의 두께로 잘라 슬라이드 글라스 위에 부착하여 건조시켰다. 이렇게 만들어진 슬라이드를 재수화(rehydration)시킨 후 Biebrich scarlet-acid fuchsin solution으로 5분동안 세포기질(cytosol)을 염색하고 aniline blue solution 으로 10분 동안 콜라겐을 염색하였다. 마지막으로 Mayer's haematoxylin 용액으로 30초간 염색하고, 증류수로 씻어낸 후 Mounting solution으로 고정시켜 보관하였다. 완성된 슬라이드는 3DHISTECH 슬라이드 스캐너(slide scanner)를 이용하여 고배율로 이미지를 획득하여 그룹간 간 조직내의 콜라겐 축적 정도를 비교하였다.

실시예 3. Total RNA 추출

동결 보관되어 있던 조직을 막자사발에서 파쇄 시킨 다음 trizol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 1 ㎖을 넣고 혼합하여 상온에서 5분간 방치하였다. 여기에 0.2 ㎖의 클로로폼(chloroform)을 첨가하여 잘 섞은 다음 상온에서 2-3분간 방치한 후, 4℃, 12,000 g에서 15분간 원심 분리하여 얻은 무색의 상층액을 새로운 튜브(tube)로 옮겼다. 이 상층액에 0.5㎖의 아이소프로판올(isopropanol)을 혼합하고 실온에서 10분간 방치한 다음 4℃, 12,000 g에서 10분간 원심 분리하여 RNA를 침전시키고 상층을 제거하였다. 침전된 RNA에 75% 에탄올 1㎖을 잘 혼합한 후 4℃, 12 000 g에서 10분간 원심 분리하여 상층을 제거 하고 실온에서 10분간 건조시켰다. 건조된 RNA에 100 ㎕의 증류수를 첨가하여 녹인 후, 그 중 1㎕를 취하여 분광기(spectrometer)로 흡광도를 측정하고, 1% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동을 수행하여 RNA의 순도를 확인하였다.

실시예 4. 후보 miRNA 의 실시간 중합효소연쇄반응

miRNA의 실시간 중합효소연쇄반응 반응액은 5mL의 cDNA(100ng의 RNA에 해당), 1×Taqman Universal PCR Master Mix (PE Applied Biosystems), 500nM의 프라이머(primer)로 구성하고, 증류수를 이용하여 25mL로 하였다. 중합효소연쇄반응은 50℃에서 2분간 반응시킨 다음 95℃에서 5분간 반응시키고 이후는 95℃에서 15초, 60℃에서 60초의 반응주기를 45회 반복하였다. 대조유전자로는 U6 small nuclear RNA(유전자 등록번호: NR_003027)를 사용하였고 U6 small nuclear RNA 유전자도 같은 방법으로 측정하였으며, 모든 검체는 각 microRNA와 U6 small nuclear RNA 유전자를 동시에 측정하였다. 최종적으로 후보 microRNA의 양은, 후보 microRNA의 CT 값을 U6 small nuclear RNA 의 CT 값으로 나눈 비율로 표현하였다. 사용한 프라이머 서열은 아래에 나타내었다(표 1).

서열번호	유전자 이름	염기서열(5'→3')
4	miR-34a Forward Primer	TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT
5	miR-494 Forward Primer	TGAAACATAC ACGGGAAACCTC
6	miR-451 Forward Primer	TGGGAATGGCAAGGAAACCG
7	The U6 small nuclear RNA Forward Primer	GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT

miR-451 의 염기서열은 유전자 등록번호 (MIMAT0001631)로 등록되어 있으며, 본원의 서열번호 3에 기재하였다.

실험결과

12개월간 정상식이와 고지방 식이를 섭취시킨 후 희생한 마우스의 간 조직 체중증가량과 간무게 등은 고지방 식이군에서 정상지방 식이군에 비하여 유의적으로 높아 고지방 식이로 인한 체지방 증가가 유의적으로 유도된 것을 확인할 수 있었다(도 1).

또한 조직학적 검사(Histological analysis) (H & E, Oil red O, Masson's trichrome 및 immunohistochemical staining)를 통해 3개월 이상 고지방식이를 섭취한 마우스 간 조직 내 지방축적을 확인하였으며, 6개월간 고지방 식이를 섭취한 마우스는 염증반응이 진행되기 시작하여 고지방식이 섭취 후 9개월 이상에서는 만성적인 염증상태가 지속되어 섬유화가 진행되는 비알코올성 지방간염임을 확인 할 수 있었다(도 2).

이러한 결과로 3개월간 고지방식이를 섭취한 마우스 모델은 단순 지방간 (steatosis), 9개월간 섭취한 모델은 비알코올성 지방간염 (NASH)의 모델임을 확인 하였고, 이들 샘플들을 이용해 각 후보 microRNA의 발현을 확인하였다.

microRNA 중 miR-34a와 miR-494-3p의 의 경우 비알코올성 지방간염 (NASH)에서 과발현 (upregulation) 됨을 확인 할 수 있었다(도 3 및 도 4).

또한 microRNA 중 miR-451의 경우 비알코올성 지방간염 (NASH)에서 저발현(downregulation) 됨을 확인 할 수 있었다(도 5).

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Biomaker miR-451 for distinguishing non-alcoholic steatohepatitis <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 uggcaguguc uuagcugguu gu 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 ugaaacauac acgggaaacc uc 22 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 aaaccguuac cauuacugag uu 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-34a Forward Primer <400> 4 tggcagtgtc ttagctggtt gt 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-494 Forward Primer <400> 5 tgaaacatac acgggaaacc tc 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-451 Forward Primer <400> 6 tgggaatggc aaggaaaccg 20 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The U6 small nuclear RNA Forward Primer <400> 7 gcttcggcag cacatatact aaaat 25

Claims

miR-451의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 단순 지방간으로부터 비알코올성 지방간염의 감별용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 miR-451는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 miR-451의 발현수준을 측정할 수 있는 제제는 miR-451에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브인 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 단순 지방간으로부터 비알코올성 지방간염의 감별용 키트.
단순 지방간으로부터 비알코올성 지방간염의 감별에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 miR-451를 검출하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 시료는 환자의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군에서 선택되는 시료인 방법.
제5항에 있어서, 단순 지방간 시료에 비하여 환자의 시료에서 miR-451 이 상대적으로 저발현된 것으로 검출되는 경우, 상기 환자가 비알코올성 지방간염인 것으로 감별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 miR-451의 검출은 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 통해 수행되는 것인 방법.