KR20140135948A - 점막 침투 강화 및 염증 감소를 나타내는 나노 입자 - Google Patents

점막 침투 강화 및 염증 감소를 나타내는 나노 입자 Download PDF

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KR20140135948A
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저스틴 하네스
친쿠오 쉬
니콜라스 보이랜
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더 존스 홉킨스 유니버시티
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Abstract

하나 또는 하나 이상의 코어 고분자, 하나 또는 하나 이상의 표면 개질 물질, 및 하나 또는 하나 이상의 저분자량의 유화제의 유화에 의해 형성된 나노 입자가 개발되었다. 하나 또는 하나 이상의 코어 고분자를 유기 용매에 용해시키는 단계, 하나 또는 하나 이상의 코어 고분자의 용액을 유화제의 수성 용액 또는 현탁액에 첨가하여 유화액을 형성하는 단계, 그리고 그 다음으로, 유화액을 유화제의 제2의 용액 또는 현탁액에 첨가하여 나노 입자의 형성을 가져오는 단계에 의해 입자를 제조한다. 바람직한 실시예에서, 유화제의 분자량은 1500, 1300, 1200, 1000, 800, 600, 또는 500amu 미만이다. 바람직한 유화제로는 콜산 나트륨염, 디옥틸 설포석신산염 나트륨, 헥사데실트리메틸 암모늄 브롬화물, 사포닌, 트윈(TWEEN®) 20, 트윈 80, 및 당 에스테르를 포함한다. 표면 개질 물질은 입자의 표면 전하를 중성으로 또는 하나 또는 하나 이상의 유화제가 전하를 띨 때 필수적으로 중성으로 되게 하기에 효과적인 양으로 존재한다. 유화제는 적어도 약 50%, 바람직하게는 약 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 95%의 유화 용량을 나타낸다.

Description

점막 침투 강화 및 염증 감소를 나타내는 나노 입자{NANOPARTICLES WITH ENHANCED MUCOSAL PENETRATION OR DECREASED INFLAMMATION}
본 발명은 나노 입자 분야, 특히 인간 점액과 같은 점액을 신속하게 침투하는 나노 입자 및 이의 제조 및 이용 방법에 관한 것이다.
생분해성 나노 입자를 통한 치료제의 국부 전달은 종종 전신성 약물 투여보다 전신성 부작용 감소와 표적 부위에서의 약물 수준 제어를 포함하는 장점을 제공한다. 그러나 점막 표면에서의 약물 전달 제어는 보호성 점액층의 존재로 제한을 받았다.
점액은 호흡 기관, 위장관, 비인두 및 여성 생식관과 같은, 피부로 덮이지 않은 모든 노출된 상피 표면, 그리고 눈의 표면을 코팅하는 점탄성 겔이다. 점액은 입체 및/또는 부착성 상호 작용을 통해 종래의 입자성 약물 전달 체계를 효율적으로 끌어 모은다. 점액 교체 결과, 점막 표면으로 국부적으로 전달된 대부분의 치료제는 불량한 보유 및 분포를 겪으며, 이는 치료제의 효능을 제한한다. 점액 장벽 안으로 깊이 침투하는 생분해성 나노 입자는 점막 표면에서 향상된 약물 분포, 보유 및 효능을 제공할 수 있다.
저 분자량의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 고밀도 코팅은 나노 입자가 높은 점탄성을 나타내는 인간 점액 분비를 통해 신속하게 침투할 수 있게 한다. 친수성이며 생물학적으로 불활성인 PEG 코팅은 나노 입자와 점액 성분들 사이의 부착성 상호 작용을 효과적으로 최소화한다. 생분해성 점액 침투 입자(MPP)는 사전 제작된 점막 부착성 나노 입자 상으로 F127과 같은 특정 플루로닉을 물리적으로 흡착시켜 제조되었다. 또한, MPP는 폴리(세바신산)과 PEG의 2블록 공중합체를 이용하여 나노 침전법으로 제조되었다.
그러나 나노 침전법에 의해 제조된 생분해성 MPP는 수 혼화성 용매에 약물과 고분자를 용해시킬 필요가 있기 때문에 그 범위가 제한된다. 여러 소수성 약물은 심각한 전신성 부작용 때문에 MPP에 의한 국소 전달이 이로울 수 있지만, 소수성 약물의 수 혼화성 유기 용매에 대한 낮은 가용성은 나노 침전법에 의한 MPP로의 효율적인 캡슐화를 제한한다.
핵산, 펩티드 및 단백질을 포함하는 다른 부류의 새로운 약물들은 점막 부위에서 질병을 치료하는 막대한 잠재력을 보유하고 있다. 그러나 이러한 친수성 약물들은 나노 침전법으로 MPP에 용이하게 제형화될 수 없다. 친수성 약물(수중 유중수적 이중 유화액)과 소수성 약물(수중유적 단일 유화액) 양자 모두를 생분해성 나노 입자 내로 효율적으로 캡슐화하는 데 유화액 용매 증발이 널리 이용되지만, 그에 따른 입자들은 종래의 유화제인 폴리비닐알코올(PVA)이 이용될 때 점막 부착성을 나타낸다.
위에 기술된 바와 같이 점액 침투성의 감소 없이, 광범위한 약물들을 나노 입자 내로 캡슐화할 수 있는 점액 침투 입자를 제조하는 새로운 방법에 대한 필요성이 존재한다. 주사를 통해 투여되는 제형에 대한 유사한 요구도 있다. 점막 침투를 강화하는 것들에 대한 유사한 코팅제 또한 약물 입자에 의해 유발된 염증을 감소시키는 것으로 확인되었다.
따라서, 입자의 제조 방법, 및 이에 따른, 점액 침투성의 감소 또는 위에 기술된 입자에 의해 유발된 염증 증가 없이 생분해성 나노 입자 내로 광범위한 약물들을 캡슐화할 수 있는 입자를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
다양한 투여 경로를 통해 효과적인 약물 전달을 제공하기 위하여 높은 약물 부하 및 표면 개질 물질(surface-altering material)의 고밀도 코팅을 구비한 나노 입자 및 마이크로 입자와 같은 입자들을 제공하는 것이 본 발명의 또 다른 목적이다.
하나 또는 하나 이상의 코어 고분자, 하나 또는 하나 이상의 표면 개질 물질, 및 하나 또는 하나 이상의 저분자량 유화제의 유화에 의해 형성된 나노 입자가 개발되고 있다. 이러한 입자들은 유기 용매에 하나 또는 하나 이상의 코어 고분자를 용해시키고, 하나 또는 하나 이상의 코어 고분자 용액을 수성 용액 또는 유화제 현탁액에 첨가하여 유화액을 형성한 다음, 나노 입자의 형성을 가져오기 위하여 이러한 유화액을 제2 용액 또는 유화제 현탁액에 첨가함으로써 제조된다. 코어와 유화제는 독립되거나, 서로 콘쥬게이트되거나, 표면 개질 물질의 하나 또는 하나 이상의 블록을 함유하는 블록 공중합체의 형태일 수 있다. 바람직한 실시예에서, 표면 개질 물질은 분자량이 약 1kD 내지 약 10kD, 바람직하게는 약 1kD 내지 약 5kD, 더욱 바람직하게는 약 5kD인 폴리에틸렌 글리콜이다. 이러한 실시예에서, 폴리에틸렌 글리콜의 밀도는 1H NMR로 측정 시, 약 1 내지 약 100개 사슬/nm2, 바람직하게는 약 1 내지 약 50개 사슬/nm2, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 50개 사슬/nm2, 가장 바람직하게는 약 5 내지 약 25개 사슬/nm2이다.
유화제의 분자량의 중요성은 예에 의해 증명된다. 바람직한 실시예에서, 하나 또는 하나 이상의 유화제의 분자량은 1500, 1300, 1200, 1000, 800, 600, 또는 500amu 미만이다. 바람직한 유화제로는 콜산 나트륨염, 디옥틸 설포석신산염 나트륨, 헥사데실트리메틸 암모늄 브롬화물, 사포닌, 트윈(TWEEN®) 20, 트윈 80, 및 당 에스테르를 포함한다. 표면 개질 물질은 하나 또는 하나 이상의 유화제가 하전되었을 때 입자들의 표면 전하를 중성 또는 필수적으로 중성이 되게 하는 데 효과적인 양으로 존재한다. 유화제는 적어도 약 50%, 바람직하게는 적어도 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 95%의 유화 용량을 나타낸다.
나노 입자는 치료제, 예방제, 기능성 식품 또는 진단제의 전달에 특히 유용하다. 나도 입자는 장내, 비경구, 또는 국소적으로, 바람직하게는 점막 표면에 투여될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 입자는 정맥 내, 피하, 근육 내, 복강 내 주사, 또는 결막 하(subjunctivally)로 투여된다. 일 실시예에서 입자들은 폐관으로, 비강 내, 질 내, 직장 내, 또는 협측으로 투여된다.
도 1a 및 도 1b는 유화법에 의해 제조된 CHA와 PVA를 함유하는 PLA-PEG 및 PCL-PEG 나노 입자의 궤적을 나타낸 것이다. 도 1c와 도 1d는 전체 평균을 낸 기하 평균 제곱 변위를 시간의 함수(시간 척도/s)로 나타내는 그래프이다. 도 1e와 도 1f는 1s의 시간 척도에서 개별적인 입자의 유효 확산도(Deff)의 로그의 분포를 나타내는 그래프이다. 도 1g와 도 1h는 생리적인 30μm 두께의 점액층을 침투할 수 있는 입자의 시간의 경과에 따른 예상 분획을 나타내는 그래프이다. 데이터는 각 실험에서 추적된 ≥ 120개 나노 입자를 이용한 세 개의 독립적인 실험을 대표한다. 오차 바는 s.e.m으로 나타냈다.
도 2a와 도 2b는 인간 자궁 경부 점액에서 MPP의 수송 속도에 미치는 PEG MW의 영향을 나타낸다. 도 2a는 전체 평균을 낸 기하 평균 제곱 변위<MSD/μm2>를 시간 척도/s의 함수로 나타낸 그래프이다. 도 2b는 1s의 시간 척도에서 개별적인 입자의 유효 확산도(Deff)의 로그의 분포를 나타내는 그래프이다. PLGA-PEG(6wt% PEG)를 이용하는 유화법으로 입자를 제조하였다. 데이터는 각 실험에서 추적된 ≥ 120개 나노 입자를 이용한 세 개의 독립적인 실험을 대표한다. 오차 바는 s.e.m으로 나타냈다.
도 3a는 전체 평균을 낸 기하 평균 제곱 변위<MSD/μm2>를 시간 척도의 함수로 나타낸 그래프이다. 도 3b는 1s의 시간 척도에서 개별적인 입자의 유효 확산도(Deff)의 로그의 분포를 나타내는 그래프이다. 도 3c는 30μm 두께의 점액층을 침투할 수 있을 것으로 예상되는 입자의 시간의 경과에 따른 예상 분획을 나타내는 그래프이다. 데이터는 각 실험에서 추적된 ≥ 120개 나노 입자를 이용한 세 개의 독립적인 실험을 대표한다. 오차 바는 s.e.m으로 나타냈다.
도 4의 A 내지 도 4의 C는 나노 입자의 점액 침투에 미치는 표면 PEG 피복범위([Γ/Γ*])의 영향을 나타내는 개요도이다. 도 4의 A 내지 도 4의 C는 증가하는 피복범위에서 표면 PEG 코팅이 있는 PLGA-PEG 나노 입자의 침투를 나타낸다. 표면 PEG 피복범위가 증가함에 따라, PEG 변동 형태는 버섯형(이웃하는 PEG 사슬이 겹치지 않음, [Γ/Γ*]＜1, 도 4의 A)에서 브러시형(이웃하는 PEG 사슬이 겹침, 1＜[Γ/Γ*]＜3, 도 4의 B), 조밀한 브러시형([Γ/Γ*]＞3, 도 4의 C)으로 바뀐다. 낮은 PEG 피복범위([Γ/Γ*]＜1, 도 4의 A)에서, 뮤신 섬유는 나노 입자 코어에 강력하게 부착된다. 중간 PEG 피복범위(1＜[Γ/Γ*]＜3, 도 4의 B)에서, 뮤신 섬유는 아직도 나노 입자 코어에 부분적으로 흡수될 수 있다. 높은 ([Γ/Γ*]＞3, 도 4의 C) PEG 피복범위에서, 나노 입자 코어는 완전히 생물학적으로 비활성인 PEG 코로나로 차폐되어, 나노 입자로 뮤신이 전혀 흡수되지 않는다. 도 4의 C는 낮은 PEG 피복범위를 나타내는 나노 입자는 점액에 고정되고, 중간 PEG 피복범위를 나타내는 나노 입자는 저지당하거나 심지어 점액에 고정되고, 높은 그리고 매우 높은 PEG 피복범위를 나타내는 입자는 신속하게 점액을 침투할 수 있음을 보여준다.
I. 정의
본원에 사용된 "나노 입자"는 일반적으로 약 1nm부터 약 1미크론까지, 그러나 약 1미크론은 포함하지 않으며, 더욱 바람직하게는 약 5nm 내지 약 500nm, 가장 바람직하게는 약 5nm 내지 약 100nm의 직경을 나타내는 임의의 형상의 입자를 지칭한다. 구 형상을 나타내는 나노 입자는 일반적으로 "나노 스피어"라고 지칭된다.
본원에 사용된 "평균 입자 크기"는 일반적으로 입자 집단 내 입자들의 통계적인 평균 입자 크기(직경)를 지칭한다. 기본적으로 구 모양의 입자의 직경은 물리적 또는 수력학적 직경이라 지칭될 수 있다. 비 구형 입자의 직경은 바람직하게는 수력학적 직경이라 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 비 구형 입자의 직경은 입자 표면 상의 두 지점 사이의 최대 선형 거리를 지칭할 수 있다. 평균 입자 크기는 동적 광 산란과 같은, 당해 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 측정할 수 있다.
본원에 사용된 "중량 정중 공기역학 직경(Mass Median Aerodynamic Diameter(MMAD)"은 복수의 입자들의 정중위 공기역학 크기를 지칭한다. "공기역학 직경"은 분말로서, 일반적으로 공기 중에서, 동일한 침강 속도를 나타내는 단위 밀도 구의 직경으로, 따라서 침강 행위의 견지에서 에어로졸화된 분말 또는 기타 분산된 입자 또는 입자 제형을 특징짓는 유용한 방법이다. 공기역학 직경은 입자 또는 입자 형상, 밀도, 및 이러한 입자 또는 입자의 물리적 크기를 아우른다. MMAD는 캐스케이드 밀착(cascade impaction)에 의한 것과 같이, 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 실험적으로 결정할 수 있다.
본원에 사용된 "탭 밀도(tap density)"는 분말 밀도의 척도를 지칭한다. 탭 밀도는 USP Bulk Density and Tapped Density, United States Pharmacopia convention, Rockville, Md., 10th Supplement, 4950-4951, 1999의 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 낮은 탭 밀도의 원인이 될 수 있는 특징으로는 불규칙한 표면 질감과 다공성 구조를 포함한다.
"단순 분산"과 "균일한 크기 분포"는 본원에서 서로 교환 가능하게 사용되며, 복수의 나노 입자 또는 마이크로 입자로서, 이러한 입자들이 동일하거나 거의 동일한 직경 또는 공기역학 직경을 나타내는 복수의 나노 입자 또는 마이크로 입자를 말한다. 본원에 사용된 단순 분산 분포는 분산의 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 86, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95% 이상이 중량 중위 직경 또는 공기역학 직경의 5% 내에 놓이는 입자 분포를 지칭한다.
본원에 사용된 "폐 투여"는 활성제를 함유하는 약학적 제형을 흡입에 의해 폐로 투여하는 것을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "흡입"은 폐포로 공기를 흡입하는 것을 지칭한다. 공기 흡입은 입 또는 코를 통해 일어날 수 있다. 공기 흡입은 흡입하면서 제형을 자가 투여하여, 또는 인공호흡기로 환자에게 인공호흡기를 통하여 투여함으로써 일어날 수 있다.
본원에 사용된 "약학적으로 허용 가능한"은 타당한 의학적 판단 범위 내에서, 미국 식품의약국과 같은 기관의 지침에 따라, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 기타 문제 또는 타당한 수익성 대 위험성 비율에 비례하는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 이용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
본원에 사용된 "생체적합성" 및 "생물학적 적합성"은 임의의 대사물질 또는 분해 생성물과 함께, 일반적으로 수용체에 무독성이며, 수용체에 임의의 상당한 부작용을 유발하지 않는 물질을 일반적으로 지칭한다. 일반적으로 말하자면, 생체적합성 물질은 환자에 투여 시 상당한 염증 또는 면역 반응을 유발하지 않는 물질이다.
본원에 사용된 "분자량"은 달리 명시되지 않은 한, 일반적으로 벌크 고분자의 상대적인 평균 사슬 길이를 지칭한다. 실제로는, 겔 투과 크로마토그래피(GPC) 또는 모세관 점도 측정을 포함하는 다양한 방법을 이용하여 분자량을 예상하거나 특성화할 수 있다. GPC 분자량은 수 평균 분자량(Mn)과는 반대로, 중량 평균 분자량(Mw)으로 보고된다. 모세관 점도 측정은 특정한 농도, 온도 및 용매 조건 세트를 이용하여 희석한 고분자 용액으로부터 결정한 고유의 점도로 분자량의 추정치를 제공한다.
본원에 사용된 "친수성"은 물에 대한 친화도를 나타내는 특성을 지칭한다. 예를 들어, 친수성 고분자(또는 친수성 고분자 세그먼트)는 주로 수성 용액에 용해성이 있고/있거나 물을 흡수하는 경향이 있는 고분자(또는 고분자 세그먼트)이다. 일반적으로, 고분자가 친수성일수록 그러한 고분자는 물에 더 잘 용해되거나, 혼합되거나, 젖게 되는 경향을 나타낸다.
본원에 사용된 "소수성"은 물에 대한 친화도가 부족하거나, 심지어 물을 밀어내는 성질을 지칭한다. 예를 들어, 고분자(고분자 세그먼트)가 소수성일수록 그러한 고분자(또는 고분자 세그먼트)는 물에 더 잘 용해되지 않거나, 혼합되지 않거나, 젖지 않게 되는 경향을 나타낸다.
본원에 사용된 "점액"은 주로 뮤신 당단백질 및 기타 물질을 함유하는 점탄성의 천연 물질을 지칭하는데, 이는 호흡계, 코, 자궁 경부, 위장관, 직장, 시각 및 청각 체계를 포함하는 다양한 기관/조직의 상피 표면을 보호한다.
본원에 사용된 "가래"는 뮤신 당단백질 외에도 DNA, 액틴 및 기타 죽은 세포로부터 방출된 세포 잔해물과 같은 다양한 거대분자들로 이루어지는 고도의 점탄성 점액 분비물을 지칭한다. "가래"는 천식, COPD 및 CF를 포함하나 이에 한정되지 않는 폐쇄성 폐 질환으로 고통받는 환자들의 병원성 기도에 일반적으로 존재한다. 본원에 사용된 "CF 점액" 및 "CF 가래"는 각각 낭포성 섬유증을 앓는 환자의 점액과 가래를 지칭한다.
본원에 사용된 "점액 분해제"는 환자에 투여 시 점액 제거 속도를 증가시키는 물질을 지칭한다. 점액 분해제는 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Hanes, J. et al. Gene Delivery to the Lung, in Pharmaceutical Inhalation Aerosol Technology, Marcel Dekker, Inc., New York: 489-539 (2003) 참조. 점액 분해제의 예로는 뮤신에 존재하는 이황화 및 설프하이드릴 결합을 절단하는 N-아세틸시스테인(NAC)을 포함한다. 다른 점액 분해제로는 머그워트, 머그워트, 브로멜라인, 파파인, 클레로덴드럼, 아세틸시스테인, 브롬헥신, 카르보시스테인, 에프라지논, 메스나, 암브록솔, 소브레롤, 도미오돌, 데누포솔, 레토스테인, 스테프로닌, 티오프로닌, 젤솔린, 티모신 베타4, 넬테넥신, 에르도스테인 및 rhDNA 분해효소를 포함하는 다양한 DNA 분해효소를 포함한다.
본원에 사용된 "CF 점액 저항성/확산성 입자"는 CF 점액에서 감소되거나 낮은 점막 부착성을 나타내며, 따라서 다른 입자들보다 더 높은 속도로 CF 점액을 통과하는 입자를 지칭한다. 그러한 입자들은 CF 점액을 가로질러 높은 확산성을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다. 특정 실시예에서, CF 점액 저항성/확산성 입자들은 CF 점액에서 약 0.01μm2/s 초과, 더욱 바람직하게는 약 0.5μm2/s 초과, 가장 바람직하게는 약 1μm2/s 초과의 효과적인 확산성을 보유한다. 바람직한 실시예에서, 입자들의 집단은 입자 집단의 적어도 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 40%, 가장 바람직하게는 적어도 50%가 1시간 이내에 10μm 두께의 가래층을 가로질러 확산할 수 있다면 "CF 점액 저항성/확산성"으로 특징지을 수 있다.
본원에 사용된 "낭포성 섬유증(CF)"은 낭포성 섬유증 막관통 전도도 조절자(CFTR)를 암호화하는 유전자의 하나 또는 하나 이상의 돌연변이로부터 유발된 유전적 유전자 질병을 지칭한다. 낭포성 섬유증 환자에서, 호흡 상피에서 내생적으로 발현된 CFTR의 돌연변이는 이온 및 유체 수송의 불균형을 유발하는 정상의 음이온 분비 감소를 유발한다. 그에 따른 음이온 수송 감소는 폐에서의 점액 축적 강화 및 이에 수반되는 미생물 감염의 원인이 되며, 이는 궁극적으로 CF 환자의 사망을 초래한다. 호흡기 질병 외에도, CF 환자는 전형적으로, 치료되지 않을 경우 사망을 초래하는 위장관 문제와 췌장 부전증을 앓는다. CF 염색체의 CFTR 유전자 서열 분석 결과, 다양한 질병을 유발하는 돌연변이들이 밝혀졌다. 현재까지, CF 유전자에서 1000가지가 넘는 질병 유발 돌연변이가 밝혀졌다(http://www.genetsickMds.on.ca/cftr/). 가장 만연한 돌연변이는 CFTR 아미노산 서열의 508번 위치의 페닐알라닌의 결실로, 흔히 AF508-CFTR이라 지칭된다. 이러한 돌연변이는 낭포성 섬유증 사례의 대략 70퍼센트에서 발생하며, 심각한 질병과 관련이 있다. 낭포성 섬유증은 미국에서 2,500명 유아당 대략 1명 꼴로 영향을 미친다.
본원에 사용된 "낭포성 섬유증 막관통 전도도 조절자(CFTR)"은 호흡 및 소화 조직을 포함하는, 신체 전반에 걸친 전해질 수송 유지에 중요한 막관통 단백질을 지칭한다. CFTR은 각각이 여섯 개의 막관통 나선 및 뉴클레오티드 결합 도메인을 함유하는 막관통 도메인의 일렬 반복으로 이루어진 단백질을 암호화하는 대략 1480개의 아미노산으로 이루어져 있다. CFTR을 암호화하는 유전자는 확인되고 시퀀싱되었다. Gregory, R. J. et al Nature 347:382386 (1 90); Rich, D. P. et al. Nature 347:358-362 (1990), 및 Riordan, J. R. et al. Science 245:1066-1073 (1989) 참조.
본원에 사용된 "핵산"은 DNA, RNA 및 다양한 치료적 목적을 위해 안정성을 증가시키고자 변형시킨 핵산 분자를 지칭한다. 한 예는 적어도 부분적으로는 CF의 특이적인 증상 일부를 고치기 위하여 CF 개체에서 발현될 수 있는 낭포성 섬유증 막관통 전도도 조절자(CFTR) 단백질을 암호화하는 유전자, 이의 유사체 및 변이체이다. 이것은 또한 적어도 CF 환자의 유전자 일부에서 내인성 CF 유전자를 교정하는 데 이용될 수 있는, 삼중 나선 형성 DNA와 같은, 유전자 안으로 교정 또는 변경을 도입하기 위한 영역을 포함하는, DNA 단편과 같은 분자를 포함한다. 이러한 용어는 CFTR 유전자에 한정되지 않으며, 질병 치료, 진단 또는 치유에 이용될 수 있는 모든 유전자 물질에 적용된다는 점을 주목해야 한다.
문구 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여됨"은 당해 기술 분야에서 알려진 용어로서, 주사와 같은 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 포함하고, 정맥 내, 근육 내, 흉강 내, 혈관 내, 심막 내, 동맥 내, 경막 내, 관절낭 내, 안와 내, 심장 내, 피부 내, 복강 내, 경기관, 피하, 표피 하, 관절 내, 피막 하, 지주막 하, 척주 내, 결막 하, 및 흉골 내 주사 및 주입을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "계면활성제"는 액체의 표면장력을 낮추는 작용제를 지칭한다.
용어 "치료제"는 질병 또는 질환을 예방 또는 치료하고자 투여될 수 있는 작용제를 지칭한다. 치료제는 핵산, 핵산 유사체, 소분자, 펩티도미메틱, 단백질, 펩티드, 탄수화물 또는 당, 지질, 또는 계면활성제, 또는 이의 조합일 수 있다.
용어 "치료" 또는 질병, 장애 및/또는 병태에 걸리기 쉬울 수 있으나, 아직 이에 걸렸다고 진단을 받지 않은 동물에서 질병, 장애 또는 병태가 발생하는 것의 예방은 질병, 장애 또는 병태의 억제, 예컨대, 그 진행의 지연, 및 질병, 장애 또는 병태의 완화, 예컨대, 질병, 장애 및/또는 병태의 퇴보 유발을 지칭한다. 질병 또는 병태의 치료는 특정 질병 또는 병태의 적어도 하나의 증상을 개선시킴을 포함하며, 심지어 근본적인 병리생리학이 영향받지 않은 경우라도, 예컨대, 진통제 투여에 의해, 그러한 작용제가 통증의 원인을 치료하지 않는다 하더라도, 대상자의 통증을 치료하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 "표적 모이어티"는 특정 장소로, 또는 특정 장소로부터 멀리 편재화하는 모이어티를 지칭한다. 이러한 모이어티는 예를 들어, 단백질, 핵산, 핵산 유사체, 탄수화물, 또는 소분자일 수 있다. 본체는 예를 들어, 소분자와 같은 치료적 화합물, 또는 검출 가능한 표지와 같은 진단적 본체일 수 있다. 장소는 조직, 특정한 세포 유형, 또는 세포 이하의 구획일 수 있다. 일 실시예에서, 표적 모이어티는 활성 본체의 편재화를 유도한다. 활성 본체는 소분자, 단백질, 고분자 또는 금속일 수 있다. 활성 본체는 치료적, 예방적 또는 진단적 목적에 유용할 수 있다.
용어 "치료적으로 유효한 양"은 본원에 기술된 입자 내 및/또는 입자 위로 도입될 때, 임의의 의학적 치료에 적용할 수 있는 타당한 수익성 대 위험성 비율로 어떠한 원하는 효과를 산출하는 치료제의 양을 지칭한다. 유효량은 치료되는 질병 또는 병태, 투여되는 특정 표적 구성체, 대상자의 크기, 또는 질병 또는 병태의 중증도와 같은 인자들에 따라 달라질 수 있다. 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 과도한 실험을 필요로 하지 않고 특정 화합물의 유효량을 경험적으로 결정할 수 있다.
용어 "도입된" 및 "캡슐화된"은 원하는 적용에서 활성제의 지연 방출과 같은 방출을 허용하는 조성물 내 및/또는 상으로, 그러한 활성제를 도입, 제형화, 또는 그렇지 않으면 포함시키는 것을 지칭한다. 이 용어는 치료제 또는 기타 물질이 고분자 매트릭스로 도입되는 임의의 방식을 고려하며, 예를 들어, 그러한 고분자의 단량체로의 (공유적, 이온성, 또는 기타 결합 상호 작용에 의한) 부착, 물리적 혼합, 고분자의 코팅층으로 작용제 봉합, 고분자성 매트릭스 전반에 걸친 분산, (공유적 또는 기타 결합 상호 작용에 의한) 고분자성 매트릭스 표면에 덧붙임, 고분자성 매트릭스 내부로의 캡슐화 등을 포함한다. 용어 "공동 도입" 또는 "공동 캡슐화"는 대상 조성물 내에 치료제 또는 기타 물질과 적어도 하나의 다른 치료제 또는 다른 물질을 도입하는 것을 지칭한다.
II. 점액 침투성 나노 입자(MPP)
A. 코어 고분자
임의의 수의 생체적합성 고분자가 나노 입자를 제조하는 데 이용될 수 있다. 일 실시예에서, 생체적합성 고분자(들)는 생분해성이다. 또 다른 실시예에서, 이러한 입자는 비 분해성이다. 다른 실시예에서, 입자는 분해성 및 비 분해성 입자의 혼합물이다.
예시적인 고분자로는 시클로덱스트린 함유 고분자, 특히 미국 특허번호 6,509,323호에 기술된 것들과 같은 양이온성 시클로덱스트린 함유 고분자,
폴리(카프로락톤)(PCL)과 같은 락톤으로부터 제조된 고분자,
폴리(락트산)(PLA), 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(락트산-코-글리콜산)(PGLA), 폴리(L-락트산-코-글리콜산)(PLLGA), 폴리(D,L-락티드)(PDLA), 폴리(D,L-락티드-코-카프로락톤), 폴리(D-락티드-코-카프로락톤-코-글리콜라이드), 폴리(D,L-락티드-코-PEO-코-D,L-락티드), 폴리(D,L-락티드-코-PPO-코-D,L-락티드), 및 이의 혼합물과 같은 폴리하이드록시산 및 이의 공중합체,
폴리알킬 시아노아크랄레이트,
폴리에탄,
폴리-L-리신(PLL), 폴리(발레르산), 및 폴리-L-글루탐산과 같은 폴리아미노산,
하이드록시프로필 메타크릴레이트(HPMA),
폴리무수물,
폴리에스테르,
폴리오르토에스테르,
폴리(에스테르 아미드),
폴리아미드,
폴리(에스테르 에테르),
폴리카보네이트,
폴리에틸렌 및 폴리프로필렌과 같은 폴리알킬렌,
폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)과 같은 폴리알킬렌 글리콜, 폴리알킬렌 산화물(PEO),
폴리(에틸렌 테레프탈레이트)와 같은 폴리알킬렌 테레프탈레이트, 에틸렌 비닐 아세테이트 고분자(EVA),
폴리비닐 알코올(PVA),
폴리비닐 에테르,
폴리(비닐 아세테이트)와 같은 폴리비닐 에스테르,
폴리(비닐 염화물)(PVC)과 같은 폴리할로겐화물, 폴리비닐피롤리돈, 폴리실록산,
폴리스티렌(PS),
알킬 셀룰로오스, 하이드록시알킬 셀룰로오스, 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스 에스테르, 니트로셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스 및 카르복시메틸셀룰로오스와 같은 유도체화 셀룰로오스를 포함하는 셀룰로오스,
폴리(메틸(메트)아크릴레이트)(PMMA), 폴리(에틸(메트)아크릴레이트), 폴리(부틸(메트)아크릴레이트), 폴리(이소부틸(메트)아크릴레이트), 폴리(헥실 (메트)아크릴레이트), 폴리(이소데실(메트)아크릴레이트), 폴리(라우릴(메트)아크릴레이트), 폴리(페닐(메트)아크릴레이트), 폴리(메틸아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트, 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 폴리(옥타데실 아크릴레이트)와 같은 아크릴산의 고분자(본원에서는 합하여 "폴리아크릴산"이라 함),
폴리디옥사논 및 이의 공중합체,
폴리하이드록시알카노에이트,
폴리프로필렌 푸마르산염,
폴리옥시메틸렌,
폴록사머,
폴리(부티르산),
탄산 트리메틸렌 및
폴리포스파진을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
랜덤 공중합체, 블록 공중합체 또는 그래프트 공중합체와 같이, 위의 공중합체 또는 위에 열거된 고분자의 혼합물도 이용될 수 있다.
고분자 성질을 변경하기 위하여 및/또는 기능기의 반응성을 수정(예컨대, 감소 또는 증가)하기 위하여 고분자 상의 기능기를 캡핑(capping)할 수 있다. 예를 들어, 락티드 함유 고분자 또는 글리콜라이드 함유 고분자와 같은 카르복시산 함유 고분자의 카르복실 말단은 선택적으로 예컨대, 에스테르화로 캡핑할 수 있고, 하이드록실 말단은 선택적으로 예컨대, 에테르화 또는 에스테르화로 캡핑할 수 있다.
PEG 또는 이의 유도체와 위에 기술된 임의의 고분자의 공중합체를 고분자 입자를 제조하는 데 이용할 수 있다. 특정 실시예에서, PEG 또는 유도체는 공중합체의 내부 위치에 위치시킬 수 있다. 대안적으로, PEG 또는 유도체는 공중합체의 말단 위치 근처 또는 말단 위치에 위치할 수 있다. 예를 들어, 위의 하나 또는 하나 이상의 고분자는 폴리에틸렌 글리콜 블록으로 끝낼 수 있다. 일부 실시예에서, 코어 고분자는 페길화 고분자와 비 페길화 고분자의 혼합물로, 이때, 기초 고분자는 동일하거나(예컨대, PLGA 및 PLGA-PEG) 다르다(예컨대, PLGA-PEG 및 PLA). 특정 실시예에서, 마이크로 입자 또는 나노 입자는 PEG의 영역들이 별도로 상분리되거나 그렇지 않으면 입자들의 표면으로 위치할 수 있도록 하는 조건 하에서 형성된다. 표면에 위치된 PEG 영역들은 단독으로 표면 개질제의 기능을 수행할 수 있거나, 표면 개질제를 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 입자들은 표면 개질 물질로서 폴리에틸렌 글리콜의 블록들로 종결된 하나 또는 하나 이상의 고분자들로부터 제조된다.
종량 평균 분자량은 주어진 고분자에 따라 다를 수 있지만, 일반적으로는 약 1000달톤 내지 1,000,000달톤, 1000달톤 내지 500,000달톤, 1000달톤 내지 250,000달톤, 1000달톤 내지 100,000달톤, 5,000달톤 내지 100,000달톤, 5,000달톤 내지 75,000달톤, 5,000달톤 내지 50,000달톤, 또는 5,000달톤 내지 25,000달톤이다.
바람직한 천연 고분자의 예로는 알부민, 콜라겐, 젤라틴과 같은 단백질, 및 프롤라민, 예를 들어, 제인, 및 알긴산염과 같은 다당류를 포함한다.
일부 실시예에서, 입자들은 나노 입자 유전자 전달체로서 이용될 수 있다. 이러한 실시예에서, 입자들은 음으로 하전된 하나 또는 하나 이상의 핵산과 복합체를 이루는 하나 또는 하나 이상의 다중 양이온성 고분자로 이루어질 수 있다.
양이온성 고분자는 생리적 조건(즉, 신체 내 또는 세포 내에서 접하는 pH 및 염 농도) 하에서 분자당 적어도 두 개의 양전하를 보유하고, 핵산과 결합하기에 충분한 전하 밀도와 분자 크기를 나타내는 임의의 합성 또는 천연 고분자일 수 있다. 특정 실시예에서, 양이온성 고분자는 하나 또는 하나 이상의 아민 잔기를 함유한다.
적절한 양이온성 고분자는 예를 들어, 폴리에틸렌 이민(PEI), 폴리알릴아민, 폴리비닐아민, 폴리비닐피리딘, 아미노아세탈화 폴리(비닐 알코올), 하나 또는 하나 이상의 아민 잔기를 보유하는 아크릴릭 또는 메타크릴릭 고분자(예를 들어, 폴리(N,N-디메틸아미노에틸메타크릴레이트)), 폴리오르니틴, 폴리아르기닌, 및 폴리리신과 같은 폴리아미노산, 프로타민, 키토산, DEAE-셀룰로오스 및 DEAE-덱스트란과 같은 다당류, 및 폴리아미도아민 덴드리머(양이온성 덴드리머) 뿐만 아니라, 이의 공중합체와 혼합물을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 다중 양이온성 고분자는 PEI이다.
양이온성 고분자는 선형 또는 가지형일 수 있고, 단독중합체 또는 공중합체일 수 있으며, 아미노산을 함유할 때 L 또는 D형 입체배치를 나타낼 수 있고, 임의의 이러한 속성들을 혼합한 성질을 나타낼 수 있다.
바람직하게는, 양이온성 고분자는 하나 또는 하나 이상의 핵산 분자와 조밀한 복합체를 형성할 수 있도록 충분히 유연성이 있다.
일부 실시예에서, 다중 양이온성 고분자는 약 5,000달톤 내지 약 100,000달톤, 더욱 바람직하게는 약 5,000 내지 약 50,000달톤, 가장 바람직하게는 약 10,000 내지 약 35,000달톤 사이의 분자량을 나타낸다.
B. 점액을 통한 확산을 촉진하는 물질
나노 입자는 바람직하게는 하나 또는 하나 이상의 표면 개질제 또는 표면 개질 물질로 코팅되거나 이를 함유한다. 본원에 사용된 "표면 개질제"는 표면에 대해 입자의 (예컨대, 입자를 다소 친수성이 되도록 하는) 친수성, (예컨대, 표면을 중성 또는 중성에 가깝게 또는 더욱 음성 또는 양성이 되게 하는) 표면 전하를 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 또는 하나 이상의 성질을 개질하고/개질하거나, 체액 및/또는 조직에서의, 예를 들어, 점액에서의 수송, 또는 체액 및/또는 조직을 통한, 예를 들어, 점액을 통한 수송을 증진시키는 작용제 또는 물질을 지칭한다. 일부 실시예에서, 표면 개질 물질은 염증 감소와 같은 직접적인 치료 효과를 제공한다.
표면 개질제의 예로는 음이온성 단백질(예컨대, 알부민)을 포함하는 단백질, 계면활성제, 당 또는 당 유도체(예컨대, 시클로덱스트린), 치료제 및 고분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 고분자로는 헤파린, 폴리에틸렌 글리콜("PEG") 및 폴록사머(폴리에틸렌 산화물 블록 공중합체)를 포함한다. 가장 바람직한 물질은 PEG이다.
계면활성제의 예로는 L-α-포스파티딜콜린(PC), 1,2-디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 올레산, 소르비탄 트리올레산염, 소르비탄 모노올레산염, 소르비탄 모노라우린산염, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우린산염, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레산염, 천연 레시틴, 올레일 폴리옥시에틸렌 (2) 에테르, 스테아릴 폴리옥시에틸렌 (2) 에테르, 라우릴 폴리옥시에틸렌 (4) 에테르, 옥시에틸렌과 옥시프로필렌의 블록 공중합체, 합성 레시틴, 디에틸렌 글리콜 디올레산염, 테트라하이드로퍼퓨릴 올레산염, 에틸 올레산염, 이소프로필 미리스트산염, 글리세릴 모노올레산염, 글리세릴 모노스테아르산염, 글리세릴 모노리시놀레산염, 세틸 알코올, 스테아릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 400, 세틸 피리디늄 염화물, 벤잘코늄 염화물, 올리브유, 글리세릴 모노라우린산염, 옥수수유, 면실유 및 해바라기씨유, 레시틴, 올레산, 및 소르비탄 트리올레산염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일 실시예에서, 입자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 코팅되거나 폴리에틸렌 글리콜을 함유한다. PEG는 입자 표면 위의 코팅으로 적용될 수 있다. 대안적으로, PEG는 입자를 형성하는 데 이용되는 코어 고분자에 공유적으로 결합된(예컨대, 내부에 또는 하나의 말단 또는 양 말단에) 블록 형태일 수 있다. 특정 실시예에서, 입자는 PEG를 함유하는 블록 공중합체로부터 형성된다. 더욱 구체적인 실시예에서, 입자는 PEG를 함유하는 블록 공중합체로부터 형성되는데, 이때, PEG는 기초 고분자의 말단에 공유적으로 결합된다.
대표적인 PEG 분자량으로는 300Da, 600Da, 1kDa, 2kDa, 3kDa, 4kDa, 6kDa, 8kDa, 10kDa, 15kDa, 20kDa, 30kDa, 50kDa, 100kDa, 200kDa, 500kDa, 및 1MDa, 그리고 300달톤 내지 1MDa 범위 내의 모든 값을 포함한다. 바람직한 실시예에서, PEG는 약 5kD의 분자량을 나타낸다. 임의의 주어진 분자량의 PEG는 길이, 밀도 및 분지 등과 같은 다른 특징들이 다를 수 있다.
i. 표면 밀도 평가
나노 입자 위의 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)의 표면 밀도는 그것들의 성공적인 생체 내 적용을 결정하는 데 있어서 주요한 매개변수이다. 점막 표면으로의 약물 제어 전달은 보호성의 점액층 존재 때문에 도전적인 일이며, 점액 침투성 입자는 점막 표면에서의 향상된 약물 분포, 보유 및 효능면에서 가능성을 보여준다. 생분해성 나노 입자 위의 PEG의 고밀도 코팅은 점액 성분과 나노 입자 사이의 크게 감소된 부착성 상호 작용 때문에 점액을 통한 빠른 침투를 허용할 수 있다. 그러나, 표면 PEG 밀도를 최적으로 조절하는 방법 및 생체 내 적용을 위한 생분해성 점액 침투성 나노 입자의 제조 방법은 여전히 불분명하다.
표면 전하 및 수력학적 직경과 같은, 나노 입자의 물리화학적 성질 변화를 직접적으로 측정하는 방법들을 포함하는 상이한 방법들이 나노 입자 위의 표면 PEG 밀도를 평가하는 데 이용되고 있다. 그러나, 이러한 방법들은 입자 표면 nm2당 PEG 사슬의 수에 대한 정량적인 정보를 제공할 수 없다.
표면 PEG 밀도를 직접적으로 정량하기 위하여, 다양한 기법들이 적용되었다. PEG 함량을 계산하는 데 열중량 분석(TGA)이 이용될 수 있으나, 이 분석법은 무기 물질에 한정되고, 상대적으로 많은 양의 시료를 이용할 필요가 있다.
기능성 PEG에 대한 (형광 염료와 같은) 염료 및 시약의 반응이 PEG 정량에 널리 이용되었다. 이러한 방법에서, (-SH, -NH2 등과 같은) 기능기와 반응하지 않은 PEG 분자들은 특정 시약과의 반응 후에 형광 분석법 또는 비색 정량법으로 정량하였고, 표면 PEG 밀도는 상층액에서 반응하지 않은 PEG 부분을 감하여 얻었다. 그러나, 이러한 방법은 표면 페길화 및 기능성 PEG에 한정된다. 상층액에서 반응하지 않은 플루오레세인-PEG의 신호를 측정함으로써 프린트(PRINT) 나노 입자 상의 표면 PEG 밀도를 정량하는 데 이용되는 비슷한 방법은 PEG를 이용한 나노 입자의 표면 개질에 한정된다. 따라서 이러한 정량적인 분석법은 널리 이용되는 폴리(락틱-코-글리콜산)-폴리(에틸렌 글리콜)(PLGA-PEG) 및 폴리(락트산)-폴리(에틸렌 글리콜)(PLA-PEG)과 같은, PEG를 함유하는 블록 공중합체로부터 제조된 생분해성 나노 입자 상의 PEG 밀도를 결정하는 데 적합하지 않다.
핵 자기 공명(NMR)은 본원에 기술된 PEG를 함유하는 고분자성 나노 입자 상의 표면 PEG 밀도를 정성적으로 및 정량적으로 평가하는 데 이용할 수 있다(PEG 피크는 전형적으로 약 3.65ppm에서 관찰됨). 나노 입자가 NMR 용매 D20 내로 분산될 때, 코어 내에 내장된 PEG가 아니라 표면 PEG만을 NMR에 의해 직접적으로 검출할 수 있다. 따라서, NMR은 PEG의 표면 밀도를 직접적으로 측정하는 수단을 제공한다.
일부 실시예에서, 페길화 및 비 페길화 입자의 혼합물로부터 입자를 제조함으로써 PEG 표면 밀도를 조절할 수 있다. 예를 들어, PLGA 나노 입자 상의 PEG의 표면 밀도는 폴리(락틱-코-글리콜산) 및 폴리(에틸렌 글리콜)의 혼합물(PLGA-PEG)로부터 입자를 제조함으로써 정확하게 조절할 수 있다. 나노 입자 위의 표면 PEG 밀도를 측정하는 데 정량적인 1H 핵 자기 공명(NMR)을 이용할 수 있다. 인간 점액에서 다중 입자 추적과 마우스 질에서의 뮤신 결합 및 조직 분포 연구 결과, PLGA-PEG 나노 입자가 점액을 침투하는 데 효과적인 PEG 밀도 역치가 존재하며, 이는 대략 10~16 PEG 사슬/100nm2이다. 이러한 밀도 역치는 입자 제조에 이용되는 코어 고분자, 입자 크기 및/또는 PEG의 분자량을 포함하는 다양한 인자들에 따라 달라질 수 있다.
코팅 밀도는 표면 개질 물질 및 입자의 조성을 포함한 다양한 인자들을 기초로 하여 달라질 수 있다. 일 실시예에서, 1H NMR에 의해 측정한, PEG와 같은, 표면 개질 물질의 밀도는 nm2당 적어도 0.1, 0.2, 0.5, 0.8, 1, 2, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 40, 50, 60, 75, 80, 90, 또는 100개 사슬이다. 위의 범위는 nm2당 0.1 내지 100단위의 모든 값을 포함한다.
특정 실시예에서, PEG와 같은 표면 개질 물질의 밀도는 약 1 내지 약 25개 사슬/nm2, 약 1 내지 약 20개 사슬/nm2, 약 5 내지 약 20개 사슬/nm2, 약 5 내지 약 18개 사슬/nm2, 약 5 내지 약 15개 사슬/nm2, 또는 약 10 내지 약 15개 사슬/nm2이다. PEG와 같은 표면 개질 물질의 농도 또한 달라질 수 있다. 일부 실시예에서, PEG와 같은 표면 개질 물질의 표적 농도는 적어도 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25% 이상이다. 위의 범위는 0.5% 내지 25%의 모든 값을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 입자 내의 PEG와 같은 표면 개질 물질의 농도는 적어도 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25%이다. 위의 범위는 0.5% 내지 25%의 모든 값을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 입자 표면 위의 표면 개질 물질 함량(예컨대, PEG)은 적어도 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25%이다. 위의 범위는 0.5% 내지 25%의 모든 값을 포함한다.
특정 실시예에서, 표면 개질 물질(예컨대, PEG)의 밀도는 표면 개질 물질(예컨대, PEG)이 확장된 브러시의 입체배치를 취했던 정도이다.
다른 실시예에서, 표면 개질 모이어티의 질량은 입자 질량의 적어도 1/10,000, 1/7500, 1/5000, 1/4000, 1/3400, 1/2500, 1/2000, 1/1500, 1/1000, 1/750, 1/500, 1/250, 1/200, 1/150, 1/100, 1/75, 1/50, 1/25, 1/20, 1/5, 1/2, 또는 9/10이다. 위의 범위를 1/10,000 내지 9/10의 모든 값을 포함한다.
C. 유화제
본원에 기술된 입자는 유화제, 특히 저분자량의 유화제를 함유한다. 이러한 유화제는 입자 형성 도중 입자 내로 도입되며, 따라서 완성된 입자의 구성성분이다. 유화제는 입자 내에 캡슐화될 수 있고, 고분자 매트릭스 내에 전체로서 또는 부분적으로 분산될 수 있고(예컨대, 유화제 일부가 고분자 매트릭스로부터 펼쳐지고/펼쳐지거나, 입자 표면과 (예컨대, 공유적으로 또는 비 공유적으로) 회합된다.
본원에 사용된 "저분자량"은 일반적으로 1500, 1400, 1300, 1200, 1100, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 또는 300amu 미만의 분자량을 나타내는 유화제를 지칭한다. 일부 실시예에서, 분자량은 1300amu 미만이다. 일부 실시예에서, 분자량은 약 300amu 내지 약 1200amu이다.
유화제는 양으로 하전되거나, 음으로 하전되거나, 또는 중성일 수 있다. 음으로 하전된 유화제의 예로는 콜산 나트륨염(CHA, MW = 430) 및 디옥틸 설포석시네이트 나트륨(DSS, MW = 455)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 양으로 하전된 유화제의 예로는 헥사데실트리메틸 암모늄 브롬화물(CTAB, MW = 364)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 중성 유화제의 예로는 비누(MW = 1191), 트윈 20(MW = 1,225), 트윈 80(MW = 1310), 및 당 에스테르 D1216(수크로오스 라우린산염, SE, MW = 524)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
저분자량을 나타내는 것 이외에도, 유화제는 입자 응집을 방지하기 위하여 입자 형성 중에 유화액적을 적절하게 안정시킬 수 있어야 한다. 특정 유화제의 유화 능력은 아래 식을 이용하여 계산할 수 있고 퍼센트로 표현된다.
유화 능력 = 나노 입자의 중량/(나노 입자의 중량 + 응집된 입자의 중량) x 100%
일부 실시예에서, 유화 능력은 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 또는 95%이다. 이러한 범위는 50 내지 95 사이의 모든 값을 포함한다.
응집체 형성을 방지하기 위하여 유화액적을 적절하게 안정화시키는 것 이외에도, 안정제는 중성 또는 중성에 가까운 표면 전하를 제공하는 표면 개질 물질 코로나(예컨대, PEG)에 의해 완전히 차폐되기에 충분히 작아야 한다. 하전된 입자의 수송은 생체 내에서 반대로 하전된 입자 종과 하전된 입자의 상호 작용 때문에 방해를 받을 수 있다. 예를 들어, 점액을 신속하게 침투하는 입자의 능력은 적어도 부분적으로는, 입자의 표면 전하에 의존적이다. 따라서, 유화제(들)은 유화제가 전하를 띨 경우(예컨대, 양으로 또는 음으로), 전하가 표면 개질 물질(예컨대, PEG)의 코로나에 의해 차폐되어 표면 전하가 0 또는 필수적으로 0이 될 정도로, 예컨대, -10 내지 10ev, -5 내지 5ev, -3 내지 3ev, -2 내지 2ev, 또는 -1 또는 1 ev가 되도록, 충분히 작아야 한다.
D. 치료제, 예방제, 기능성 식품 및/또는 진단제
1. 치료제
일부 실시예에서, 입자는 하나 또는 하나 이상의 치료제를 내부에 캡슐화하고, 분산시키고/분산시키거나 공유적으로 또는 비 공유적으로 하나 또는 하나 이상의 치료제의 표면과 회합시켰다. 치료제는 소분자, 단백질, 다당류 또는 당류, 핵산 분자 및/또는 지질일 수 있다.
i. 소분자 치료제
예시적인 부류의 소분자 치료제로는 진통제, 항염증제, 해열제, 항우울제, 항간질제, 항정신병제, 신경보호제, 항암제와 같은 항증식제, 항균제 및 항진균제와 같은 항감염제, 항히스타민제, 항편두통제, 항무스카린제, 불안완화제, 진정제, 수면제, 항정신병제, 기관지 확장제, 항천식 약물, 심장혈관 약물, 코르티코스테로이드, 도파민제, 전해질, 위장관 약물, 근육이완제, 영양제, 비타민, 부교감신경흥분제 모방약, 자극제, 식욕감퇴제 및 항수면발작제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
ii. 핵산
일부 실시예에서, 이러한 작용제는 하나 또는 하나 이상의 핵산이다. 핵산은 내인성 핵산 서열을 변경, 교정 또는 교체할 수 있다. 핵산은 암 치료, 기타 폐 질병 및 폐 기능에 영향을 미치는 대사성 질병의 유전자와 유전자가 비강 전달을 통해 뇌에 도달하는 파킨슨병 및 ALS의 치료를 위한 유전자와 같은 유전자의 결함을 교정하는 데 이용된다.
유전자 치료법은 질병 발달의 원인이 되는 결함 있는 유전자를 교정하는 기법이다. 연구자는 결함이 있는 유전자를 교정하기 위한 여러 가지 접근법 중 하나를 이용할 수 있다:
- 비 기능적인 유전자를 교체하기 위하여 정상적인 유전자를 게놈 내의 비 특이적인 위치에 삽입할 수 있다. 이러한 접근법이 가장 일반적이다.
- 상동 재조합을 통해 비정상적인 유전자를 정상적인 유전자로 바꿀 수 있다.
- 선택적인 역돌연변이를 통해 비정상적인 유전자를 수복시킬 수 있으며, 이는 비정상적인 유전자를 정상적인 기능으로 되돌린다.
- 특정 유전자의 조절(유전자를 발현시키거나 유전자 발현을 억제시키는 정도)은 변경될 수 있다.
핵산은 DNA, RNA, 화학적으로 개질된 핵산, 또는 이의 조합일 수 있다. 예를 들어, 핵산 반감기의 안정성 및 효소 절단에 대한 저항성을 증가시키는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있고, 핵염기, 당에 대한 하나 또는 하나 이상의 수정 또는 치환, 또는 폴리뉴클레오티드의 연결을 포함할 수 있다. 핵산은 원하는 용도에 맞도록 만들어진 성질을 함유하기 위하여 주문 합성할 수 있다. 일반적인 수정은 잠금 핵산(LNA), 비 잠금 핵산(UNA), 모르폴리노, 펩티드 핵산(PNA), 포스포로티오에이트 연결, 포스포노아세테이트 연결, 프로핀 유사체, 2'-0-메틸 RNA, 5-Me-dC, 2 -5' 연결 포스포디에스테르 일직선, 키메라 연결(혼합 포스포로티오에이트 및 포스포디에스테르 연결 및 수정), 지질 및 펩티드의 콘쥬게이션, 및 이의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 실시예에서, 핵산은 아키랄 및 하전되지 않은 서브 단위간 연결을 보유하는 인산염 유사체(예컨대, Sterchak, E. P. et al., Organic Chem. , 52:4202, (1 87)), 또는 아키랄 서브 단위간 연결을 보유하는 하전되지 않은 모르폴리노 기반의 고분자(예컨대, 미국 특허번호 5,034,506호 참조)과 같은 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 뉴클레오티드간 연결 유사체로는 모폴리데이트, 아세탈 및 폴리아미드 연결 헤테로고리를 포함한다. 기타 백본 및 연결 수정으로는 포스포로티오에이트, 펩티드 핵산, 트리시클로-DNA, 유인 올리고뉴클레오티드, 리보자임, (L 핵산, 높은 결합 친화도를 나타내는 앱타머를 함유하는) 스피에겔머, 또는 CpG 올리고머를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
포스포로티오에이트(또는 S-올리고)는 정상적인 DNA의 변이체로, 비 가교 산소 중 하나가 황으로 교체된 것이다. 뉴클레오티드간 결합의 황화는 5'에서 3'으로, 그리고 3'에서 5'으로의 DNA POL 1 핵산말단 가수분해효소, 핵산가수분해효소 SI 및 PI, RNA 분해효소, 혈청 핵산가수분해효소 및 뱀독 포스포디에스터라아제를 포함하는 핵산내부 가수분해효소 및 핵산말단 가수분해효소의 작용을 극적으로 감소시킨다. 또한, 지질 이중층을 가로지를 가능성은 증가한다. 이러한 중요한 개선점 덕분에, 포스포로티오에이트는 세포 조절에서의 적용 범위가 증가하는 것으로 나타났다. 포스포로티오에이트는 이황화탄소 내의 원소 황 용액의 하이드로겐 포스포네이트에서의 작용에 의해, 또는 테트라에틸티우람 이황화물(TETD) 또는 3H-1,2-벤소디티올-3-온 1, 1-디옥사이드(BDTD)로 포스파이트 트리에스테르를 황화시키는 더욱 최근의 방법에 의한, 두 가지 주요 경로로 제조된다. 후자의 방법은 대부분의 유기 용매에서의 원소 황의 불용성 문제와 이황화탄소의 독성을 방지한다. 또한, TETD 및 BDTD 방법은 더 높은 순도의 포스포로티오에이트를 산출한다.
펩티드 핵산(PNA)은 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위를 반복함으로써 올리고뉴클레오티드의 인산염 백본이 전체로서 교체되고, 포스포디에스테르 결합은 펩티드 결합으로 교체된 분자이다. 다양한 헤테로고리의 염기가 메틸렌 카르보닐 결합에 의해 이러한 백본에 연결된다. PNA는 올리고뉴클레오티드와 비슷한 헤테로고리의 염기의 간격을 유지하지만, 아키랄이고 중성 전하의 분자이다. 펩티드 핵산은 전형적으로 펩티드 핵산 단량체로 구성된다. 헤테로고리의 염기는 임의의 표준 염기(우라실, 티민, 시토신, 아데닌 및 구아닌) 또는 아래에 기술된 임의의 개질된 헤테로고리의 염기일 수 있다. PNA는 또한 하나 또는 하나 이상의 펩티드 또는 아미노산 변경 및 수정을 보유할 수 있다. 따라서, PNA의 백본 구성요소는 펩티드 연결일 수 있거나, 대안적으로는, 비 펩티드 연결일 수 있다. 예로는 아세틸 캡, 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산(본원에서는 O-링커라 함)과 같은 아미노 스페이서 등을 포함한다. PNA의 화학적 조립 방법은 잘 알려져 있다.
일부 실시예에서, 핵산은 이노신, S-(1-프로피닐) 우라실(pU), 5-(1-프로피닐) 시토신(pC), 5-메틸시토신, 8-옥소-아데닌, 슈도시토신(슈도시토신), 슈도이소시토신, 5 및 2-아미노-5-(2'-데옥시-p-D-리보퓨라노실)피리딘 (2-아미노피리딘), 및 다양한 피롤로- 및 피라졸로피리미딘 유도체, 4-아세틸시토신, 8-하이드록시-N-6-메틸아데노신, 아지리디닐시토신, 5-(카르복시하이드록실메틸) 우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, l-메틸슈도우라실, 1 -메틸 구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸 구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3 -메틸시토신 , N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시-아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘우오신, 5'-메톡시카르보닐메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부톡소신, 슈도우라실, 퀘우오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 2,6-디아미노퓨린, 그리고 O-메틸, 아미노-, 및 플루오로-개질 유사체와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 2'-개질 유사체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 또는 하나 이상의 화학적으로 개질된 헤테로고리 염기를 포함한다. 2'-플루오로(2'-F) 피리미딘으로 개질된 억제성 RNA는 시험관 내에서 유리한 성질을 나타내는 것으로 보인다. 나아가, 한 보고서는 최근 2'-F 개질 siRNA가 2'-OH 함유 siRNA와 비교하여 세포 배양에서 증진된 활성을 나타낸다고 시사하였다. 2'-F 개질 siRNA는 마우스에서는 기능적이나, 반드시 2'-OH siRNA보다 증진된 세포 간 활성을 나타내지는 않는다.
일부 실시예에서, 이러한 핵산은 2'-O-아미노에톡시, 2'-O-아미노에틸(2'-OAE), 2'-O-메톡시, 2'-O-메틸, 2'-구아니도에틸(2'-OGE), 2'-O,4'-C-메틸렌(LNA), 2'-0-(메톡시에틸)(2'-OME) 및 2'-0-(N-(메틸)아세트아미도)(2'-OMA)를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 하나 또는 하나 이상의 당 모이어티 개질을 포함한다.
유전자 치료 방법은 전형적으로 세포의 유전자형을 변경시키는 핵산 분자의 세포 내로의 도입에 의존한다.
핵산 분자의 도입은 유전자 재조합을 통해 내인성 유전자를 교정, 교체, 또는 그렇지 않으면 변경시킬 수 있다. 방법들은 결합이 있는 유전자, 외래 유전자, 또는 올리고뉴클레오티드와 같은 작은 핵산 분자의 전체 교체 카피의 도입을 포함할 수 있다. 예를 들어, 교정 유전자를 숙주 게놈 내의 비 특이적인 위치 안으로 도입할 수 있다. 이러한 접근법은 전형적으로 유전자 조작된 바이러스 벡터와 같은, 세포 내로 교체 유전자를 도입하기 위한 전달 체계를 필요로 한다.
유전자 서열 및 적당한 전사 및 번역 조절 요소를 함유하는 발현 벡터를 구축하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 이러한 방법들로는 시험관 내 재조합 DNA 기법, 합성 기법, 및 생체 내 유전자 재조합을 포함한다.
발현 벡터는 일반적으로 삽입된 부호화 서열의 번역 및/또는 전사를 위해 필수적인 요소인 조절 서열을 함유한다. 예를 들어, 부호화 서열은 바람직하게는 원하는 유전자 산물의 발현 조절을 돕기 위하여 프로모터 및/또는 인핸서에 작동 가능하게 연결된다. 생명공학에 이용되는 프로모터는 의도하는 유전자 발현 조절의 유형에 따라 다른 유형이다. 그것들은 일반적으로 구성 프로모터, 조직 특이적인 또는 발달 단계 특이적인 프로모터, 유도성 프로모터 및 합성 프로모터로 나눌 수 있다.
바이러스 벡터로는 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 우두 바이러스, 폴리오 바이러스, AIDS 바이러스, 신경 트로픽 바이러스, 신드비스 및 기타 HIV 백본이 있는 이러한 바이러스를 포함하는 RNA 바이러스를 포함한다. 또한, 벡터로 이용하기에 적합하게 만드는 이러한 바이러스들의 속성을 공유하는 임의의 바이러스 패밀리도 유용하다. 전형적으로, 바이러스 벡터는 비구조적인 초기 유전자, 구조적인 후기 유전자, RNA 중합효소 III 전사체, 복제 및 캡시드화에 필수적인 역전된 말단 반복, 및 바이러스 게놈의 전사와 복제를 조절하는 프로모터를 함유한다. 벡터로서 유전자 조작될 때, 바이러스는 전형적으로 초기 유전자 중 하나 또는 하나 이상을 제거하고, 제거된 바이러스 DNA 대신에 유전자 또는 유전자/프로모터 카세트를 바이러스 게놈 내로 삽입한다.
상동 재조합(HR)과 같은, 표적 재조합을 통한 유전자 표적화는 유전자 교정의 또 다른 전략이다. 표적 유전자좌에서의 유전자 교정은 표적 유전자에 상응하는 공여체 DNA 단편에 의해 매개될 수 있다(Hu, et al, Mol. Biotech., 29:197-210 (2005); Olsen, et al., J. Gene Med., 7:1534-1544 (2005)). 표적화 재조합의 한 방법은 서열 특이적인 방식으로 이중 DNA 내의 호모퓨린/호모피리미딘 자리에 대해 제3의 가닥으로서 결합하는 삼중체 형성 올리고뉴클레오티드(TFO)의 이용을 포함한다. 삼중체 형성 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산과 상호 작용할 수 있다. 삼중체 분자들이 표적 영역과 상호 작용할 때, 삼중체라는 구조가 형성되고, 이때, 왓슨-크릭 및 후그스틴형 염기쌍에 의존적인 복합체를 형성하는 세 가닥의 DNA가 존재한다. 삼중체 분자는 높은 친화도와 특이성으로 표적 영역에 결합할 수 있으므로 바람직하다. 삼중체 형성 분자들이 10-6, 10-8, 10-10, 또는 10-12 미만의 Kd로 표적 분자와 결합하는 편이 바람직하다.
삼중체 형성 올리고뉴클레오티드(TFO) 및 펩티드 핵산(PNA)을 이용하는 표적화된 유전자 치료 방법은 미국 공개출원 번호 20070219122호에 기술되어 있고, HIV와 같은 감염성 질병을 치료하기 위한 이의 용도는 미국 공개출원 번호 2008050920호에 기술되어 있다. 또한, 삼중체 형성 분자는 미국 공개출원 번호 2011/0262406호에 기술된 것들과 같은 테일 클램프 펩티드 핵산(tcPNA)일 수 있다. 매우 안정적인 PNA:DNA:PNA 삼중체 구조는 이중 DNA와 두 개의 PNA 가닥의 가닥 침투로부터 형성될 수 있다. 이러한 복합체에서, PNA/DNA/PNA 삼중 나선 부분과 PNA/DNA 이중 부분은 모두 피리미딘이 풍부한 삼중 나선의 전치를 낳아, 뉴클레오티드 제거 수복 경로를 강하게 유발하고 공여체 올리고뉴클레오티드와의 재조합 부위를 활성화시키는 것으로 밝혀진 변경된 구조를 생성한다. 또한, 두 개의 PNA 가닥은 서로 연결되어 비스 PNA 분자를 형성할 수 있다. 삼중체 형성 분자는 교정된 서열을 제공하는 하나 또는 하나 이상의 공여체 올리고뉴클레오티드와 조합하여 이용될 때, 포유류 세포에서 부위 특이적인 상동 재조합을 유발하는 데 유용하다. 공여체 올리고뉴클레오티드는 삼중체 형성 분자에 묶을 수 있거나, 삼중체 형성 분자로부터 분리될 수 있다. 공여체 올리고뉴클레오티드는 표적 이중 DNA에 대해 적어도 하나의 뉴클레오티드 돌연변이, 삽입 또는 결실을 함유할 수 있다.
또한, 한 쌍의 유사 상보성(pseudocomplementary) 올리고뉴클레오티드와 같은, 이중의 이중체 형성 분자는 염색체 부위에서 공여체 올리고뉴클레오티드와의 재조합을 유도할 수 있다. 표적 유전자 치료에서 유사 상보성 올리고뉴클레오티드 사용은 미국 공개출원번호 2011/0262406호에 기술되어 있다. 유사 상보성 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 입체 장애 때문에 서로를 인식하지 못하거나 서로 혼성화하지 않지만, 각각은 표적 부위에서 상보적인 핵산 가닥을 인식하고 혼성화할 수 있도록, 하나 또는 하나 이상의 개질을 함유하는 상보적인 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시예에서, 유사 상보성 올리고뉴클레오티드는 유사 상보성 펩티드 핵산(pcPNA)이다.
유사 상보성 올리고뉴클레오티드는 삼중 나선형 올리고뉴클레오티드와 표적 이중 가닥 DNA에 폴리퓨린 서열을 필요로 하는 비스 펩티드 핵산과 같은, 유도된 재조합 방법에 비해 더욱 효율적일 수 있으며, 증가된 유연성을 제공할 수 있다.
2. 진단제
예시적인 진단 물질로는 상자성 분자, 형광 화합물, 자성 분자 및 방사성 핵종을 포함한다. 적합한 진단제로는 x선 영상화 작용제 및 조영제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 방사성 핵종은 영상화 작용제로서 이용될 수 있다.
다른 적합한 조영제의 예로는 방사성 비투과성인 기체 또는 기체 방출 화합물을 포함한다. 나노 입자는 투여된 입자의 위치를 결정하는 데 유용한 작용제를 더 포함할 수 있다. 이러한 목적에 유용한 작용제로는 형광 태그, 방사성 핵종 및 조영제를 포함한다.
하나 또는 하나 이상의 치료제, 예방제 및/또는 진단제가 고분자성 나노 입자 내에 캡슐화되고/캡슐화되거나 나노 입자의 표면과 회합되는 실시예의 경우, 약물 부하 퍼센트는 약 1% 내지 약 80%, 약 1% 내지 약 50%, 바람직하게는 중량 기준 약 1% 내지 약 40%, 더욱 바람직하게는 중량 기준 약 1% 내지 약 20%, 가장 바람직하게는 중량 기준 약 1% 내지 약 10%이다. 위의 범위는 1% 내지 80%의 모든 값을 포함한다. 작용제가 입자의 표면과 회합되는 실시예Dml 경우, 부하 퍼센트는 더 높을 수 있는데, 약물의 양이 캡슐화 방법에 의해 제한되지 않기 때문이다. 일부 실시예에서, 전달되는 작용제는 나노 입자 내에 캡슐화되고, 입자 표면과 회합될 수 있다. 또한, 기능성 식품이 혼입될 수 있다. 기능성 식품은 비타민, 칼슘 또는 비오틴과 같은 보충제, 또는 식물 추출물 또는 식물 호르몬과 같은 천연 성분일 수 있다.
E. 입자의 성질
1. 표면 전하 및 입자 크기
점액을 통한 확산을 촉진하기 위하여, 본원에 기술된 나노 입자는 전형적으로 중성에 가까운 표면 전하를 보유한다. 특정 실시예에서, 나노 입자는 약 10mV 내지 약 -10mV, 바람직하게는 약 5mV 내지 약 -5mV, 바람직하게는 약 3mV 내지 약 -3mV, 더욱 바람직하게는 약 2mV 내지 약 -2mV의 ζ전위를 보유한다. 위에 기술된 바와 같이, 본원에 기술된 입자는 하나 또는 하나 이상의 저분자량의 유화제를 함유한다. 이러한 유화제는 중성일 수 있으며, 이 경우에 유화제는 입자의 표면 전하에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는다. 그러나, 일부 사례에서, 유화제는 양으로 또는 음으로 하전된다. 이러한 실시예에서, 표면 개질 물질(예컨대, PEG)는 양으로 또는 음으로 하전된 유화제를 차폐하는 코로나를 형성하기에 충분한 밀도로 존재해서, 효과적으로 중성인 표면을 초래해야 한다.
본원에 기술된 입자는 나노 입자라 지칭되며, 따라서 전형적으로는 1nm에서 최대 약 1미크론 미만, 더욱 바람직하게는 약 5nm 내지 약 500nm, 가장 바람직하게는 약 5nm 내지 약 100nm 범위의 평균 직경을 나타낸다. 특정 실시예에서, 입자의 평균 직경은 약 100nm 내지 약 150nm이다. 그러나, 크기가 미크론 범위인 입자가 제조될 수 있다. 입자의 크기를 다양하게 하기 위하여 이러한 입자들을 제조하는 데 이용되는 조건 및/또는 물질은 달라질 수 있다.
특정 실시예에서, 나노 입자는 분무화 또는 4℃에서 적어도 1개월, 더욱 바람직하게는 적어도 2개월, 가장 바람직하게는 적어도 3개월 동안의 보관 후에 그들의 입자 크기와 ζ전위를 유지한다.
2. 수송 능력에 미치는 유화제의 영향
일부 실시예에서, 입자는 투여되어 점막으로의 약물 전달을 위해 점액으로 침투한다. 본원에 기술된 입자는 점액을 통한 수송을 증진시킬 수 있는 표면 개질 물질을 함유한다. 예를 들어, PEG를 함유하는 블록 공중합체는 자가 조립하여 유화 방법에 의해 형성된 유화액적의 표면 위에 고밀도의 점액 비활성 PEG 코팅을 형성할 수 있지만, 저분자량(MW)의 유화제가 PVA와 같은 종래의 더 높은 중량 또는 고중량 유화제 대신 이용되는 경우에만 그러하다. 고분자량의 유화제로 제조된 나노 입자에 비해, 저분자량의 유화제는 1초의 시간 척도에서 평균적으로, CVM에서 나노 입자의 평균 제곱 변위(<MSD>)의 7000배 증가를 가져왔다.
나아가, 본원에 기술된 입자는 물에서 동일한 입자보다 10배 미만으로 더 느린 효과적인 속도로 CVM을 침투하였다. 예를 들어, PEG를 함유하는 디블록 공중합체인 폴리(락트산)-b-PEG5k(PLA-PEG5k, Mn ~95kDa)와 폴리(ε-카프로락톤)-b-PEG5k (PCL-PEG5k, Mn ~78kDa) 또한 평가하였다. 이러한 두 고분자와 PVA로부터 제조된 나노 입자들을 CVM에 고정시켰는데, 저분자량의 유화제인 CHA를 이용하여 제조한 나노 입자에 대해서는 빠른 점액 침투가 관찰되었고, PLGA-PEG5k 나노 입자에 대해 측정된 것들과 비슷한 효과적인 확산성이 관찰되었다.
일부 실시예에서, (저분자량의 유화제로 제조된) 본원에 기술된 입자는 PVA로 제조된 입자들보다 적어도 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 7000, 8000, 9000, 또는 10000배 더 큰 수송 속도를 나타냈고/나타냈거나, 물 내의 동일한 입자보다 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 또는 3배 미만으로 느린 유효 속도를 나타냈다.
PEG의 부재 하에, PLGA/CHA 나노 입자는 매우 음이온성의 표면 전하를 나타냈고, 점막부착성을 나타냈다. 대조적으로, 점액 침투성 PLGA-PEG5k/CHA 나노 입자의 표면 전하는 중성에 가까워, PLGA와 CHA의 음전하를 가리는 고밀도 PEG 코팅의 형성을 시사했다. 저분자량의 유화제의 농도는 나노 입자의 표면 전하와 점액 침투성에 아무런 실질적인 영향을 미치지 않았는데, 아마도 PEG 코로나가 입자 표면 위의 이들 분자들을 완벽하게 가리기 때문이다.
게다가, 유화제와 관련된 고유한 전하(DSS와 CHA는 음으로 하전되고, CTAB는 양으로 하전되며, 사포닌, 비타민 E TPGS, 트윈 20, 트윈 80 및 SE는 중성으로 하전됨)는 표면 전하와 점액 침투성에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않아, 입자 표면 위의 이들 저분자량의 유화제 분자를 보호하는 PEG 코로나의 역할을 더 시사했다.
유화제의 선택 또한 유화 과정 중의 PEG 브러시 형성 정도에 영향을 미쳤다. 예를 들어, PLGA-PEG5k/PVA 나노 입자와 PLGA-PEG5k/CHA 나노 입자는 모두 중성에 가까운 표면 전하를 나타내지만, CHA 제형만이 점액 침투성이다. PVA와 PEMA는 친수성 측기로 장식된 선형의 소수성 백본을 함유하므로 나머지 유화제와는 상이하다. PVA 또는 PEMA가 오일/물 경계면을 안정시킬 때, 소수성 고분자 백본이 오일/물 경계면에서 다가로 부착될 수 있으며, 여기서 그것들은 돌출된 PEG 브러시와 친밀하게 접촉할 가능성이 있다. 따라서, PVA와 PEMA는 입자 표면 위의 PEG 분자의 구조를 방해할 수 있고, 그에 의해 입자들을 점막부착성이 되게 한다. PLGA-PEG5k/PEMA 나노 입자의 경우, 음의 표면 전하(-42mV)는 표면 위에서 노출된 PEMA 분자들로부터 유래할 가능성이 높으므로 PEG 코팅의 파괴를 시사한다.
그러나, 모든 저분자량의 유화제가 MPP를 제조하는 데 적합한 것은 아니다. 예를 들어, 크레모포르 EL, 트윈 80, 비타민 E TPGS, 플루로닉 F127 및 F68은 입자 제조 중에 유화액적을 완전히 안정화시킬 수 없어, 다양한 정도의 대형 응집체를 형성하였다. 제조된 비 응집 나노 입자는 점액 침투성이었지만, 나노 입자의 수율은 30% 정도로 낮았다. 따라서, 유화법에 의해 PEG를 함유하는 블록 공중합체로부터 MPP를 생산하는 능력은 유화제의 분자량과 유화 능력 모두에 매우 의존적이다. 유화제의 유화 능력은 1% 유화제를 함유하는 수상에서 제조된 비 응집 PLGA-PEG 나노 입자의 퍼센트에 의해 추정된다. 유화제는 유화액적을 안정화시키기에 충분히 강력해야 하지만, PEG 코로나에 의해 입자 표면에서 완벽하게 보호되기에는 충분히 작아야 한다.
유화법에 의해 제조된, 광범위한 PEG 분자량(1, 2, 5 및 10kDa)을 나타내는 PLGA-PEG/CHA 나노 입자는 모두 신속하게 점액을 침투했다. 나노 입자의 표면 전하는 PEG 분자량에 반비례하며, -18mV(1kDa) 내지 -2.3mV(10kDa)으로 다양했다. 1H NMR에 의해 측정한 표면 PEG 밀도 [Γ](100nm2당 PEG 수)는 PEG 분자량이 증가함에 따라 감소했다. 그러나, 브러시 같은 PEG 코팅의 형성에 필요한 이론적인 PEG 밀도 [Γ*]에 대한 표면 PEG 밀도의 비율은 PEG 분자량에 관계없이 2를 초과하여, PLGA-PEG(1~10kDa)/CHA 나노 입자의 표면 위에 고밀도의 브러시 같은 PEG 코팅이 존재함을 나타냈다. 입자 표면 위의 고밀도 PEG 브러시의 형성은 점액 침투에 필수적인 것으로 보인다.
소수성 약물 및 친수성 약물 모두 PLGA-PEG MPP 내로 효율적으로 캡슐화될 수 있음을 확인하였다. 두 가지 모델 화합물, 소수성 약물인 커큐민(MW=368Da)과 친수성 단백질인 BSA(MW=66kDa)를 o/w 단일 유화액을 이용하여 PLGA-PEG5k/CHA 나노 입자 내에, 그리고 w/o/w 이중 유화액을 이용하여 PLGA-PEG5k/사포닌 나노 입자 내에 각각 캡슐화하였다. 저분자량의 유화제를 이용한 소수성 커큐민과 친수성 BSA를 MPP 내로 캡슐화하는 효율은 PVA를 이용한 유화법에 의한 종래의 입자(CP)로 달성했던 캡슐화 효율과 비슷하였다.
커큐민과 BSA가 로딩된 나노 입자는 τ=1s에서의 물에서보다 각각 겨우 6배 및 36배 더 느린 속도로 점액에 빠르게 확산되었다. 반면, PVA로 제조된 나노 입자는 CVM에 고정화되었고, 수송 속도는 물에서보다 2,000배 더 느렸다. 각각 커큐민-MPP와 BSA-MPP의 최대 40%와 30%에 이르는 상당한 분획이 60분 이내에 두꺼운 점액층을 생리학적으로 침투하는 것으로 예상되지만, PVA 코팅된 나노 입자는 < 1%가 그러할 것으로 예상된다.
III. 약학적 조성물
본원에 기술된 제형은 점막 표면으로 투여하기에 적당한 약학적 담체 내에 유효량의 나노 입자를 함유한다. 이러한 제형은 비경구적으로(예컨대, 주사 또는 주입에 의해), 국소적으로(예컨대, 눈에), 또는 폐 투여를 통해 투여될 수 있다.
A. 폐 제형
약학적 제형 및 환자에 활성제를 폐 투여하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
호흡기관은 대기와 혈류 사이의 기체 교환과 관련된 구조이다. 호흡기관은 입인두와 후두를 포함하는 상기도, 뒤이어 기관지와 세기관지로의 분기로 이어지는 기관을 포함하는 하기도를 아우른다. 상기도와 하기도는 전도성 기도라 한다. 말단 세기관은 호흡세기관지로 나뉘며, 이는 궁극적인 호흡 영역인 폐포 또는 깊은 폐로 이어지고, 여기서 기체 교환이 일어난다.
제형은 건조 분말 제형과 액체 제형으로 나눌 수 있다. 건조 분말 및 액체 제형 모두 에어로졸 제형을 형성하는 데 이용할 수 있다. 본원에 이용된 용어 에어로졸은 입자의 미세한 미스트로 이루어지는 임의의 제제를 지칭하며, 추진체를 이용하여 생산되든 그렇지 않든 용액 또는 현탁액 내에 있을 수 있다.
1. 건조 분말 제형
건조 분말 제형은 나노 입자 담체를 함유하는 미세하게 분할된 고체 제형으로 폐 투여에 적합하다. 건조 분말 제형은 최소한으로, 폐 투여에 적합한 하나 또는 하나 이상의 나노 입자 담체를 포함한다. 그러한 건조 분말 제형은 공기 또는 적절한 추진체 이외의, 임의의 담체의 혜택 없이, 폐 흡입을 통해 환자에 투여될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 건조 분말 제형은 약학적으로 허용 가능한 담체와 조합된 하나 또는 하나 이상의 나노 입자 유전자 전달체를 함유한다. 이들 실시예에서, 나노 입자 유전자 전달체와 약학적 담체는 폐로 전달하기 위한 나노 또는 마이크로 입자로 형성될 수 있다.
약학적 담체는 증량제 또는 지질 또는 계면활성제를 포함할 수 있다. 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC)과 같은 천연 계면활성제가 가장 바람직하다. 합성 및 동물 유래의 폐 계면활성제로는 다음을 포함한다:
합성 폐 계면활성제
엑소서프 - 헥사데카놀 및 확산제로서 첨가된 티록사폴과 DPPC의 혼합물
퓨맥턴트(인공 폐 확장 화합물 또는 ALEC) - DPPC와 PG의 혼합물
KL-4 - DPPC, 팔미토일-올레일 포스파티딜글리세롤 및 팔미트산으로 구성됨. SP-B의 구조적 특징을 모방하는 21개의 아미노산 합성 펩티드와 결합됨.
벤티큐트 - DPPC, PG, 팔미트산 및 재조합 SP-C
동물 유래 계면활성제
알베오팩트 - 소의 폐 세척액으로부터 추출됨.
큐로서프 - 분쇄된 돼지 폐로부터 유래한 물질로부터 추출됨.
인파서프 - 송아지 폐 세척액으로부터 추출됨.
서반타 - 추가적인 DPPC, 팔미트산 및 트리팔미틴과 함께, 분쇄된 소 폐로부터 추출됨.
엑소서프, 큐로서프, 인파서프 및 서반타는 현재 미국에서 사용이 FDA 승인된 계면활성제이다.
또한, 약학적 담체는 하나 또는 하나 이상의 안정화제 또는 분산제를 포함할 수 있다. 또한, 약학적 담체는 하나 또는 하나 이상의 pH 조절제 또는 완충액을 포함할 수 있다. 적절한 완충액은 시트르산 나트륨염 또는 아스코르브산 나트륨염과 같은, 유기산과 염기로부터 제조된 유기 염을 포함한다. 또한, 약학적 담체는 염화나트륨 또는 염화칼륨과 같은, 하나 또는 하나 이상의 염을 포함할 수 있다.
건조 분말 제형은 전형적으로 하나 또는 하나 이상의 나노 입자 담체를 하나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하여 제조된다. 선택적으로, 추가적인 활성제가 아래에 논의된 바와 같이 혼합물에 혼입될 수 있다. 그런 다음, 혼합물은 동결 건조, 분무 건조, 응집, 분무 코팅, 코아세르베이션, 저온 주조, 밀링(예컨대, 공기 마찰 밀링(제트 밀링), 볼 밀링), 고압 균질화, 및/또는 초임계 유체 결정화와 같은, 당해 기술 분야에 공지된 기법을 이용하여 폐 투여에 적합한 입자로 형성된다.
입자 형성의 적절한 방법은 원하는 입자 크기, 입자 크기 분포, 및 제형에 바람직한 입자 형태학을 기초로 하여 선택할 수 있다. 일부 사례에서, 입자 형성 방법은 폐 투여를 위한 원하는 입자 크기, 입자 크기 분포를 나타내는 입자 집단을 생성하도록 선택된다. 대안적으로, 입자 형성 방법은 폐 투여를 위한 원하는 입자 크기, 입자 크기 분포를 나타내는 입자 집단으로부터 예를 들어, 사별법에 의해 분리되는 입자 집단을 생성할 수 있다.
입자 형태학이 입자가 폐로 침투하는 깊이에 영향을 미친다는 점은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 따라서, 건조 분말 제형은 적당한 중량 정중 공기역학 직경(MMAD), 탭 밀도, 및 하나 또는 하나 이상의 활성제를 폐의 원하는 영역(들)로 전달할 수 있는 표면 거칠기를 나타내는 입자로 가공된다. 예를 들어, 폐 깊숙이 전달하기에 바람직한 입자 형태학은 당해 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, Vanbever 등의 미국 특허번호 7,052,678호에 기술되어 있다.
약 5미크론을 초과하는 중량 중위 공기역학 직경(MMAD)의 입자는 일반적으로 폐에 도달하지 못한다. 대신에, 그것들은 목 뒤쪽에 충돌하는 경향이 있어 삼켜진다. 약 3 내지 약 5미크론의 직경을 나타내는 입자는 상부 내지 중간 폐 영역(전도성 기도)에 이르기에 충분할 정도로 작지만, 폐포에 도달하기에는 너무 클 수 있다. 더 작은 입자(즉, 약 0.5 내지 약 3미크론)가 폐포 영역에 충분히 도달할 수 있다. 약 0.5미크론보다 작은 직경의 입자 또한 침강에 의해 폐포 영역에 침적될 수 있다.
폐포 영역으로 전달하기에 효과적인 정확한 입자 크기 범위는 전달되는 입자의 탭 밀도를 포함하는 몇 가지 인자에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 탭 밀도가 감소합에 따라, 폐의 폐포 영역에 효율적으로 도달할 수 있는 입자의 MMAD는 증가한다. 따라서, 낮은 탭 밀도를 나타내는 입자의 경우, 약 3 내지 약 5미크론, 약 5 내지 약 7미크론, 또는 약 7 내지 약 9.5미크론의 직경을 나타내는 입자는 효율적으로 폐에 전달될 수 있다. 폐 내에 최대한 침적되기에 바람직한 공기역학 직경은 계산할 수 있다. 예를 들어, Vanbever 등의 미국 특허번호 7,052,678호 참조.
마이크로 입자는 그것들의 표면이 점액 저항성이라 하더라도 점액을 통과하여 확산될 수 없다. 그러나, 점액 침투성 입자는 마이크로 입자 내에 캡슐화될 수 있어 상부 폐에 충돌하여 이후에 나노 입자를 방출한다. 일부 실시예에서, 건조 분말 제형은 약 0.05 내지 약 10미크론, 더욱 바람직하게는 약 0.05미크론 내지 약 7미크론, 가장 바람직하게는 약 0.05 내지 약 5미크론의 정중 중량 공기역학 직경을 나타내는 복수의 입자들로 구성된다. 일부 실시예에서, 건조 분말 제형은 약 0.05 내지 약 3미크론, 더욱 바람직하게는 약 0.05미크론 내지 약 1미크론, 더욱 바람직하게는 약 0.05 내지 약 0.7미크론의 정중 중량 공기역학 직경을 나타내는 복수의 입자들로 구성된다. 일부 실시예에서, 건조 분말 제형은 약 3 내지 약 5미크론의 정중 중량 공기역학 직경을 나타내는 복수의 입자들로 구성된다. 일부 실시예에서, 건조 분말 제형은 약 5 내지 약 7미크론의 정중 중량 공기역학 직경을 나타내는 복수의 입자들로 구성된다. 일부 실시예에서, 건조 분말 제형은 약 7 내지 약 9.5미크론의 정중 중량 공기역학 직경을 나타내는 복수의 입자들로 구성된다.
일부 사례에서, 직경이 약 3미크론보다 더 큰 입자들을 전달하는 것에 장점이 있을 수 있다. 입자 직경이 약 3미크론을 초과하여 증가함에 따라 폐포 대식세포에 의한 입자의 식세포 작용은 급격히 감소한다. Kawaguchi, H., etal, Biomaterials 7: 61-66 (1986); renis, L. J. and Strauss, B., Proc. Soc. Exp. Med., 107: 748-750 (1961); 및 Rudt, S. and Muller, R. R, J. Contr. Rel, 22: 263-272 (1992). 3미크론보다 더 큰 공기역학 부피를 나타내는 입자를 투여함으로써, 폐포 대식세포에 의한 식세포의 빨아들임 및 폐로부터의 제거가 최소화될 수 있다.
일부 실시예에서, 건조 분말 제형 내 입자의 적어도 약 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%는 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5미크론 미만의 공기역학 직경을 나타낸다. 일부 실시예에서, 건조 분말 제형 내 입자의 적어도 약 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%는 약 0.03미크론을 초과하는 공기역학 직경을 나타낸다.
일부 실시예에서, 건조 분말 제형 내 입자의 적어도 약 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%는 약 0.03미크론 초과 및 약 10미크론 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.03미크론 초과 및 약 7미크론 미만, 가장 바람직하게는 약 0.03미크론 초과 및 약 5미크론 미만의 공기역학 직경을 나타낸다. 일부 실시예에서, 건조 분말 제형 내 입자의 적어도 약 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%는 약 0.03미크론 초과 및 약 3미크론 미만의 공기역학 직경을 나타낸다. 일부 실시예에서, 건조 분말 제형 내 입자의 적어도 약 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%는 약 0.03미크론 초과 및 약 5미크론 미만의 공기역학 직경을 나타낸다. 일부 실시예에서, 건조 분말 제형 내 입자의 적어도 약 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%는 약 0.03미크론 초과 및 약 7미크론 미만의 공기역학 직경을 나타낸다. 일부 실시예에서, 건조 분말 제형 내 입자의 적어도 약 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%는 약 0.03미크론 초과 및 약 9.5미크론 미만의 공기역학 직경을 나타낸다.
일부 실시예에서, 입자는 약 0.4g/cm3 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.25 g/cm3 미만, 가장 바람직하게는 약 0.1 g/cm3 미만의 탭 밀도를 나타낸다. 낮은 탭 밀도의 원인이 될 수 있는 특징들로는 불규칙한 표면 질감 및 다공성 구조를 포함한다.
일부 사례에서, 입자는 구형 또는 난형의 형상이다. 입자는 부드럽거나 거친 표면 질감을 나타낼 수 있다. 또한, 입자는 고분자 또는 폐에서 하나 또는 하나 이상의 활성제의 방출을 조절하기 위한 기타 적절한 물질로 코팅될 수 있다.
건조 분말 제형은 당해 기술 분야에 공지된 적절한 방법을 이용하여 건조 분말로 투여될 수 있다. 대안적으로, 건조 분말 제형은 아래 기술된 액체 제형 내에 현탁될 수 있으며, 액체 제형의 전달을 위해 당해 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 폐로 투여된다.
2. 액체 제형
액체 제형은 액체 약학적 담체 내에 현탁시킨 하나 또는 하나 이상의 나노 입자 담체를 함유한다.
적합한 액체 담체로는 증류수, 탈이온수, 순수 또는 초순수, 식염수, 및 또는 기타 염을 함유하는 생리학적으로 허용 가능한 수성 용액 및/또는 인산염 완충 식염수(PBS)와 같은 완충액, 링거액, 및 등장성 염화나트륨, 또는 동물 또는 인간에 투여하기에 허용 가능한 임의의 기타 수성 용액을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직하게는, 액체 제형은 생리학적 유체에 대해 등장성이며, 약 pH 4.0 내지 약 pH 7.4, 더욱 바람직하게는 약 pH 6.0 내지 pH 7.0의 범위의, 대략 동일한 pH를 나타낸다. 액체 약학적 담체는 인산염 완충액과 같은, 하나 또는 하나 이상의 생리학적으로 양립 가능한 완충액을 포함할 수 있다. 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 폐 투여를 위한 수성 용액에 대해 적합한 식염수 함량 및 pH를 용이하게 결정할 수 있다.
액체 제형은 셀룰로오스 유도체, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검, 또는 레시틴과 같은 하나 또는 하나 이상의 현탁제를 포함할 수 있다. 또한, 액체 제형은 에틸 또는 n-프로필 p-하이드록시벤조산과 같은 하나 또는 하나 이상의 보존제를 포함할 수 있다.
일부 사례에서, 액체 제형은 에탄올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 테트라하이드로퓨란, 에틸 에테르 및 프로판올과 같은 저독성 유기(즉, 비 수성) 분류 3 잔류 용매인 하나 또는 하나 이상의 용매를 함유할 수 있다. 이러한 용매들은 제형을 용이하게 에어로졸화하는 능력을 기초로 하여 선택할 수 있다. 액체 제형 내에 포함된 임의의 그러한 용매는 액체 제형 내에 존재하는 하나 또는 하나 이상의 활성제와 불리하게 반응하지 않아야 한다. 용매는 용액 또는 현탁액의 에어로졸의 형성을 가능하게 할 정도로 충분히 휘발성이 있어야 한다. 또한, 프레온, 알코올, 글리콜, 폴리글리콜, 또는 지방산과 같은 추가적인 용매 또는 에어로졸화제는 용액 또는 현탁액의 휘발성을 증가시키기 위하여 및/또는 에어로졸화 거동을 변경하기 위하여 원하는 대로 액체 제형 내에 포함시킬 수 있다.
또한, 액체 제형은 소량의 고분자, 계면활성제, 또는 기타 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있는 부형제를 함유할 수 있다. 이러한 맥락에서, "소량"은 폐에서 하나 또는 하나 이상의 활성제의 흡수에 부정적으로 영향을 미칠 수 있는 어떠한 부형제도 존재하지 않음을 의미한다.
3. 에어로졸 제형
위에 기술된 건조 분말 및 액체 제형을 폐 투여를 위한 에어로졸 제형을 형성하는 데 이용할 수 있다. 호흡기관으로 치료제를 전달하기 위한 에어로졸은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 본원에 이용된 용어 에어로졸은 기체 내에 현탁시킨 고체 또는 액체 입자의 미세한 미스트로 이루어진 임의의 제제를 지칭한다. 일부 사례에서, 기체는 추진체일 수 있다. 그러나, 이것이 요구되지는 않는다. 에어로졸은 초음파 또는 고압 처리를 포함하는 여러 가지 표준 기법을 이용하여 생산할 수 있다.
바람직하게는, 위에 기술된 건조 분말 또는 액체 제형은 하나 또는 하나 이상의 추진체를 이용하여 에어로졸 제형으로 제형화한다. 적절한 추진체로는 공기, 탄화수소, 예컨대, 펜탄, 이소펜탄, 부탄, 이소부탄, 프로판 및 에탄, 이산화탄소, 염화불화탄소, 불화탄소, 및 이의 조합을 포함한다. 적절한 불화탄소로는 1~6개의 수소를 함유하는 불화탄소, 예컨대, CHF2CHF2, CF3CH2F, CH2F2CH3, 및 CF3CHFCF3 뿐만 아니라, 불소화 에테르, 예컨대, CF3-O-CF3, CF2H-O-CHF2, 및 CF3-CF2-O-CF2-CH3를 포함한다. 또한, 적절한 불화탄소로는 CF3CF3, CF3CF2CF3, 및 CF3CF2CF2CF3를 포함하는 1~4개 탄소 과불화탄소와 같은 과불화탄소를 포함한다.
바람직하게는, 추진체로는 하나 또는 하나 이상의 하이드로플루오로알칸(HFA)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 적절한 FIFA 추진체로는 1,1,1,2,3,3,-헵타플루오로-n-프로판(HFA 227), 1,1,1,2-테트라플루오로에탄(HFA 134) 1,1,1,2, 25 3,3,3-헵타플루오로프로판(추진체 227), 또는 이러한 추진체들의 임의의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직하게는, 하나 또는 하나 이상의 추진체는 그것이 추진체로서 효과를 나타내기에 충분한 증기압을 나타낸다. 바람직하게는, 하나 또는 하나 이상의 추진체는 에어로졸 제형에서 입자들의 침전 또는 크리밍을 최소화하기 위하여 혼합물의 밀도가 에어로졸 제형 내의 입자 밀도와 서로 부합하도록 선택된다. 추진체는 바람직하게는 에어로졸 통으로부터 복수의 선택된 용량의 에어로졸 제형을 나아가게 하기에 충분한 양으로 존재한다.
4. 폐 투여를 위한 장치
일부 사례에서, 폐에 제형을 투여하기 위하여 장치가 이용된다. 적절한 장치로는 건조 분말 흡입기, 가압 정량 흡입기, 분무기 및 전기수력학적 에어로졸 장치를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
흡입은 환자의 코 및/또는 입을 통해 일어날 수 있다. 흡입하면서 제형을 자가 투여하여, 또는 인공호흡기로 환자에게 인공호흡기를 통하여 투여함으로써 투여가 일어날 수 있다.
건조 분말 흡입기
위에 기술된 건조 분말 제형은 건조 분말 흡입기(DPI)를 이용하여 환자의 폐에 투여될 수 있다. DPI 장치는 전형적으로 용기 내부에 자욱한 건조 분말을 생성하기 위한 기체 발사와 같은 메커니즘을 이용하며, 그런 다음, 환자에 의해 흡입될 수 있다.
건조 분말 흡입기에서, 투여되는 용량은 비 가압 건조 분말의 형태로 저장되며, 흡입기 작동 시, 분말 입자가 대상체에 의해 흡입된다. 일부 사례에서, 가압 정량 흡입기(pMDI)와 비슷하게, 분말을 분배하는 데 압축 기체(즉, 추진체)가 이용될 수 있다. 일부 사례에서, DPI는 호흡으로 작동될 수 있는데, 이는 흡식에 대한 정확한 반응으로 에어로졸이 생성됨을 의미한다. 전형적으로 건조 분말 흡입기는 기침 유발을 방지하기 위하여 흡입당 수십 밀리그램 미만의 용량을 투여한다.
DPI는 폐로 제형을 투여하기 위하여 다양한 기계적인 수단을 통해 작용한다. 일부 DPI에서는, 독터 블레이드 또는 셔터가 저장소 내에 함유된 건조 분말 제형을 가로질러 미끄러져 이러한 제형을 유로로 모으며, 그에 의해 환자는 단일 호흡으로 분말을 흡입할 수 있다. 다른 DPI에서, 건조 분말 제형은 블리스터, 태뷸(tabule), 정제 또는 젤라틴 캡슐과 같은 사전에 형성된 투여 형태로 포장되어, 찢거나, 분쇄하거나, 그렇지 않으면 개봉하여 건조 분말 제형을 나중에 흡입하기 위하여 유로로 방출한다. 또 다른 DPI는 건조 분말 제형을 챔버 또는 캡슐로 방출하고, 기계적 또는 전기적인 교반장치를 이용해 환자가 흡입할 때까지 건조 분말 제형이 공기 중에 현탁되도록 유지시킨다.
건조 분말 제형은 가루분, 케이크, 또는 DPI의 저장소로 삽입하기 위한 압축된 형태와 같은 다양한 형태로 포장될 수 있다.
위에 기술된 제형의 투여를 위한 적합한 DPI의 예로는 터보헤일러(Turbohaler®) 흡입기(Astrazeneca, 미국 델라웨어 주 윌밍턴), 클릭헤일러(Clickhaler®) 흡입기(Innovata, Ruddington, 영국 노팅엄), 디스커스(Diskus®) 흡입기(Glaxo, Greenford, 영국 미들섹스), 이지헤일러(EasyHaler®)(Orion, Expoo, FI), 엑수베라(Exubera®) 흡입기(Pfizer, 미국 뉴욕 주 뉴욕), 큐도스(Qdose®) 흡입기(Microdose, Monmouth Junction, 미국 뉴저지 주) 및 스피로스(Spiros®) 흡입기(Dura, 미국 캘리포니아 주 산디에고)를 포함한다.
가압 정량 흡입기
위에 기술된 액체 제형은 가압 정량 흡입기(pMDI)를 이용하여 환자의 폐에 투여할 수 있다.
가압 정량 흡입기(pMDI)는 일반적으로 하나 또는 하나 이상의 추진체와 조합되어, 압력 하에서 액체 제형이 보유되는 통, 및 이러한 통을 붙잡고 작동시키는 데 이용되는 용기의 적어도 두 가지 구성요소를 포함한다. 통은 단일 또는 다중 용량의 제형을 함유할 수 있다. 통은 밸브, 전형적으로는 미터링 밸브를 포함할 수 있으며, 이로부터 통의 내용물이 방출될 수 있다. 에어로졸화된 약물은 통에 힘을 가하여 pMDI로부터 나와서 용기 내로 밀려가며, 그에 의해 밸브가 열려 약물 입자가 밸브로부터 용기 배출구로 이동된다. 통으로부터 방출 시, 액체 제형은 미립화되어 에어로졸을 형성한다.
pMDI는 전형적으로 하나 또는 하나 이상의 추진체를 이용하여 통의 내용물에 압력을 가하고, 액체 제형을 용기 배출구 밖으로 나아가게 하여, 에어로졸을 형성한다. 위에서 논의된 것들을 포함한 임의의 적절한 추진체가 이용될 수 있다. 이러한 추진체는 다양한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 추진체는 압축 기체 또는 액화 기체일 수 있다. 염화불화탄소(CFC)는 한때 액체 추진체로 흔히 이용되었지만, 현재는 금지되었다. 염화불화탄소는 현재는 널리 받아들여지는 하이드로플루오로알칸(HFA) 추진체로 교체되었다.
pMDI는 3M 코포레이션, 아벤티스, 베링거 인겔하임, 포레스트 래버러토리즈(Forest Laboratories), 글락소 웰컴, 쉐링 플라우 및 벡츄라(Vectura)를 포함하는 여러 공급업체로부터 구입할 수 있다. 일부 사례에서, 환자는 숨 들이마시기와 함께, pMDI로부터 에어로졸화된 제형을 수동으로 방출하여 에어로졸화된 제형을 투여한다. 이러한 방식으로, 에어로졸화된 제형은 흡기의 공기 흐름 내에 혼입되어 폐로 전달된다.
다른 사례에서, 흡입을 감지하자마자 동시에 제형 용량을 방출하는, 템포(Tempo®) 흡입기(MAP Pharmaceuticals, Mountain View, 미국 캘리포니아 주)에 포함된 것과 같은, 호흡으로 작동되는 트리거를 이용할 수 있다. 사용자가 흡입하기 시작할 때, 에어로졸 제형을 방출하는 이들 장치는 호흡으로 작동하는 가압 정량 흡입기(baMDI)라고 알려져 있다.
분무기
또한, 위에 기술된 액체 제형은 분무기를 이용하여 투여될 수 있다. 분무기는 위에 기술된 액체 제형, 대개는 수성 기반의 조성물을 바람직하게는 5미크론의 중량 중위 공기역학 직경을 나타내는 미스트 또는 자욱한 작은 액적으로 전환시키는 액체 에어로졸 발생기로서, 미스트 또는 작은 액적은 하부 호흡기관으로 흡입될 수 있다. 이러한 공정을 미립화라 한다. 자욱한 에어로졸을 흡입할 때, 액적은 하나 또는 하나 이상의 활성제를 코, 상기도, 또는 폐 깊숙이 전달한다. 공기식 (제트) 분무기 및 전기 기계식 분무기를 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 유형의 분무기가 제형을 환자에 투여하는 데 이용될 수 있다.
공기식 (제트) 분무기는 액체 제형의 미립화를 위한 추진력으로 가압 기체 공급을 이용한다. 압축 기체는 노즐 또는 제트를 통해 전달되어 낮은 압력의 장을 생성하며, 이는 주변의 액체 제형을 연행하여 얇은 필름 또는 필라멘트로 나아간다. 필름 또는 필라멘트는 불안정하여, 흡기 호흡으로 압축 기체 흐름에 의해 전달되는 작은 액적으로 분산된다. 액적 플룸 내로 삽입된 배플은 더 큰 액적을 걸러내어, 그것들을 벌크 액체 저장소로 돌려보낸다. 공기식 분무기의 예로는 PARI LC 플러스(PARI LC Plus®), PARI LC 스프린트(PARI LC SPRINT®), 데빌비스 풀모에이드(Devilbiss PulmoAide®), 및 베링거 잉겔하임 레스피마(Boehringer Ingelheim Respima®)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
전기 기계식 분무기는 전기적으로 발생된 기계적 힘을 이용하여 액체 제형을 미립화한다. 예를 들어, 초음파 주파수로 액체 제형을 진동시키거나, 벌크 액체를 얇은 필름 내의 작은 구멍으로 밀어넣음으로써, 전기 기계식 추진력을 적용할 수 있다. 이러한 힘은 작은 액적으로 분산되는 얇은 액체 필름 또는 필라멘트 흐름을 발생시켜, 흡기 흐름으로 연행될 수 있는 느리게 움직이는 에어로졸 흐름을 형성한다.
일부 사례에서, 전기 기계식 분무기는 초음파 분무기로, 이때, 액체 제형은 초음파 범위의 주파수에서 동요하는 진동기와 결합된다. 이러한 결합은 액체를 홀딩 컵 내의 플레이트 또는 고리와 같은 진동기와 직접적으로 접촉하도록 위치시키거나, 고체 진동 프로젝터(혼 horn) 위에 큰 액적을 위치시킴으로써 이루어진다. 진동은 순환식의 스탠딩 필름을 생성하며, 이는 가장자리에서 액적을 분산시켜 액체 제형을 미립화한다. 초음파 분무기의 예로는 듀로미스트(DuroMist®), 드라이브 메디컬 비틀 넵(Drive Medical Beetle Neb®), 옥티브 테크 덴실로직(Octive Tech Densylogic®), 및 존 번 나노 소닉(John Bunn Nano-Sonic®)을 포함한다.
일부 사례에서, 전기 기계식 분무기는 메시 분무기로서, 이때, 액체 제형은 직경이 2 내지 8미크론인 작은 구멍이 있는 메시 또는 막을 통과하여 추진되어, 작은 액적으로 분산되는 얇은 필라멘트를 생성한다. 특정 설계에서, 액체 제형은 솔레노이드 피스톤 드라이버(예를 들어, AERx® 분무기)로 압력을 가하거나, 액체를 압전기적으로 진동되는 플레이트와 메시 사이에 샌드위치시킴으로써, 메시 사이로 밀리고, 이는 요동하는 펌핑 동작을 유발한다(예를 들어, 이플로우(EFlow®), 에어로벡트Rx(AerovectRx®), 또는 터치스프레이(TouchSpray® 분무기). 다른 사례에서, 메시는 액체의 스탠딩 컬럼 사이를 앞뒤로 진동하여, 그것을 구멍을 통해 퍼올린다. 그러한 분무기의 예로는 에어로넵 고(AeroNeb Go®), 에어로넵 프로(AeroNeb Pro®), PARI 이플로우(EFlow®), 옴론(Omron) 22UE®; 및 아라다임(Aradigm) AERx®를 포함한다.
전기수력학적 에어로졸 장치
또한, 위에 기술된 액체 제형은 전기수력학적(EHD) 에어로졸 장치를 이용하여 투여될 수 있다. EHD 에어로졸 장치는 전기 에너지를 이용하여 액체 약물 용액 또는 현탁액을 에어로졸화한다. EHD 에어로졸 장치의 예는 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Noakes 등의 미국 특허번호 4,765,539호 및 Coffee, R.A.의 미국 특허번호 4,962,885호 참조.
제형의 전기 화학적 성질은 액체 제형을 EHD 에어로졸 장치로 폐에 전달할 때 최적화할 중요한 매개변수일 수 있으며, 그러한 최적화는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일상적으로 이루어진다.
C. 비경구 제형
일부 실시예에서, 나노 입자는 주사 또는 주입과 같은 비경구 전달을 위해 용액 또는 현탁액의 형태로 제형화된다. 이러한 제형은 임의의 경로를 통해, 예컨대, 혈류 또는 치료되는 기관 또는 조직으로 직접적으로, 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 나노 입자는 눈에 대한 비경구 제형으로 제형화된다.
본원에 사용된 "비경구 투여"는 소화관 또는 비침습적인 국소적 또는 지역적 경로를 통한 것 이외의 임의의 방법에 의한 투여를 의미한다. 예를 들어, 비경구 투여는 주사에 의해, 그리고 주입에 의해, 환자에 정맥 내, 피부 내, 복강 내, 흉강 내, 기관 내, 근육 내, 피하, 결막 하 투여를 포함할 수 있다.
비경구 제형은 당해 기술 분야에 공지된 기법을 이용하여 수성 조성물로서 제조될 수 있다. 전형적으로, 그러한 조성물은 주사 가능한 제형, 예를 들어, 용액 또는 현탁액; 주사 전에 재구성 매체를 첨가할 때, 용액 또는 현탁액을 제조하는 데 이용하기에 적합한 고체 형태; 유중수적(w/o) 유화액, 수중유적(o/w) 유화액과 같은 유화액, 및 이의 마이크로유화액, 리포좀, 또는 에멀좀으로 제조될 수 있다.
담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 하나 또는 하나 이상의 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 오일, 예컨대, 식물성 오일(예컨대, 땅콩유, 옥수수유, 참기름 등), 및 이의 조합을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적당한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅을 이용하여, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및/또는 계면활성제 이용에 의해 유지할 수 있다. 여러 사례에서, 등장성 작용제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다.
유리 산 또는 염기 또는 이의 약리학적으로 허용 가능한 염으로서 활성 화합물의 용액 및 분산액은 계면활성제, 분산제, 유화제, pH 조절제 및 이의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제와 적절히 혼합된, 물 또는 다른 용매 또는 분산매에 제조될 수 있다.
적절한 계면활성제는 음이온성, 양이온성, 양쪽성 또는 비 이온성 표면 활성제일 수 있다. 적절한 음이온성 계면활성제로는 카르복시산염, 설폰산염 및 황산염 이온을 함유하는 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 음이온성 계면활성제의 예로는 도데실벤젠 설폰산염 나트륨과 같은, 긴 사슬 알킬 설폰산 및 알킬 아릴 설폰산의 나트륨, 칼륨, 암모늄염; 도데실벤젠 설폰산염 나트륨과 같은, 디알킬 나트륨 설포석신산염; 나트륨 비스-(2-에틸티옥실)-설포석신산염과 같은 디알킬 나트륨 설포석신산염; 및 라우릴 황산 나트륨염과 같은 알킬 황산염을 포함한다. 양이온성 계면활성제로는 염화 벤잘코늄, 염화 벤제토늄, 브롬화 세트리모늄, 스테아릴 디메틸벤질 암모늄 염화물, 폴리옥시에틸렌 및 코코넛 아민과 같은 4차 암모늄 화합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 비 이온성 계면활성제의 예로는 에틸렌 글리콜 모노스테아르산염, 프로필렌 글리콜 미리스트산염, 글리세릴 모노스테아르산염, 글리세릴 스테아르산염, 폴리글리세릴-4-올레산염, 소르비탄 아크릴산염, 수크로오스 아실레이트, PEG-150 라우린산염, PEG-400 모노라우린산염, 폴리옥시에틸렌 모노라우린산염, 폴리소르브산, 폴리옥시에틸렌 옥틸페닐에테르, PEG-1000 세틸 에테르, 폴리옥시에틸렌 트리데실 에테르, 폴리프로필렌 글리콜 부틸 에테르, 폴록사머(Poloxamer®) 401, 스테아로일 모노이소프로파놀아미드 및 폴리옥시에틸렌 수소화 수지 아미드를 포함한다. 양쪽성 계면활성제의 예로는 나트륨 N-도데실-D-알라닌, 나트륨 N-라우릴-D-이미노디프로피온산염, 미리스토암포아세트산염, 라우릴 베타인 및 라우릴 설포베타인을 포함한다.
이러한 제형은 보존제를 함유하여 미생물의 성장을 방지할 수 있다. 적절한 보존제로는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 및 티메로살을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 이러한 제형은 활성제(들)의 분해를 방지하기 위하여 항산화제를 함유할 수 있다.
이러한 제형은 전형적으로 재구성 시 비경구 투여를 위해 pH 3~8로 완충된다. 적절한 완충액으로는 인산염 완충액, 아세트산염 완충액 및 시트르산염 완충액을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
수용성 고분자는 종종 비경구 투여를 위한 제형에 이용된다. 적절한 수용성 고분자로는 폴리비닐피롤리돈, 덱스트란, 카르복시메틸셀룰로오스 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
멸균 주사 가능한 용액은 위에 열거된 하나 또는 하나 이상의 부형제와 함께 적당한 용매 또는 분산매에 필요한 양으로 활성 화합물을 도입함으로써 제조되며, 필요에 따라, 여과 살균이 이어진다. 일반적으로, 염기성 분산매와 위에 열거된 것들로부터 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 용제 내에 다양한 멸균 활성 성분들을 혼입함으로써 분산액을 제조한다. 멸균 주사 가능한 용액 제조를 위한 멸균 분말의 경우에는, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 더하기 이전에 살균 여과한 용액으로부터의 임의의 추가적인 원하는 성분을 산출하는 진공 건조 및 동결 건조 기법이다. 분말은 입자들이 자연계에서 다공성인 방식으로 제조될 수 있으며, 이는 입자의 용해를 증가시킬 수 있다. 다공성 입자의 제조 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
안구 투여를 위한 약학적 제형은 바람직하게는 하나 또는 하나 이상의 고분자-약물 콘쥬게이트로부터 형성된 입자의 멸균 수성 용액 또는 현탁액의 형태이다. 허용 가능한 용매로는 예를 들어, 물, 링거 용액, 인산염 완충 식염수(PBS) 및 등장성 염화나트륨 용액을 포함한다. 또한, 이러한 제형은 1,3-부탄디올과 같은, 무독성의 비경구적으로 허용 가능한 희석제 또는 용매 내의 멸균 용액, 현탁액 또는 유화액일 수 있다.
일부의 경우에는, 이러한 제형은 액체 형태로 배포되거나 포장된다. 대안적으로, 안구 투여를 위한 제형은 예를 들어, 적합한 액체 제형의 동결 건조에 의해 얻어진 고체로서 포장될 수 있다. 이러한 고체는 투여 전에 적당한 담체 또는 희석제로 재구성될 수 있다.
안구 투여를 위한 용액, 현탁액, 또는 유화액은 안구 투여에 적합한 pH를 유지하는 데 필요한 유효량의 완충액으로 완충될 수 있다. 적절한 완충액은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있고, 유용한 완충액의 일부 예는 아세트산염, 붕산염, 탄산염, 시트르산염 및 인산염 완충액이다.
또한, 안구 투여를 위한 용액, 현탁액, 또는 유화액은 제형의 등장성 범위를 조정하기 위하여 하나 또는 하나 이상의 긴장성 작용제를 함유할 수 있다. 적절한 긴장성 작용제는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 일부 예로는 글리세린, 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨, 및 기타 전해질을 포함한다.
또한, 안구 투여를 위한 용액, 현탁액, 또는 유화액은 안과용 제제의 박테리아 오염을 방지하기 위하여 하나 또는 하나 이상의 보존제를 함유할 수 있다. 적절한 보존제는 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 폴리헥사메틸렌비구아니딘(PHMB), 염화 벤잘코늄(BAK), 멸균 옥시클로로 복합체(달리 퓨라이트(Purite®)로 알려져 있음), 페닐머큐릭 아세트산염, 클로로부탄올, 소르브산, 클로로헥시딘, 벤질 알코올, 파라벤, 티메로살 및 이의 혼합물을 포함한다.
또한, 안구 투여를 위한 용액, 현탁액, 또는 유화액은 분산제, 습윤제 및 현탁제와 같은 당해 기술 분야에 공지된 하나 또는 하나 이상의 부형제를 함유할 수 있다.
D. 국소 제형
또 다른 실시예에서, 나노 입자는 점막에 대한 국소 투여를 위해 제형화된다. 국소 투여를 위한 적절한 투여 형태로는 크림, 연고(ointment, salve), 스프레이, 겔, 로션, 유화액, 액체 및 경피 패치를 포함한다. 이러한 제형은 경점막, 경상피, 내피, 또는 경피 투여를 위해 제형화될 수 있다. 이러한 조성물은 하나 또는 하나 이상의 화학적인 침투 증진제, 막 투과성 작용제, 막 수송제, 연화제, 계면활성제, 안정제, 및 이의 조합을 함유한다.
일부 실시예에서, 나노 입자는 용액 또는 현탁액과 같은 액체 제형, 로션 또는 연고와 같은 반고체 제형, 또는 고체 제형으로 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 나노 입자는 안약과 같은 용액 또는 현탁액을 포함하는 액체로, 또는 눈과 같은 점막에 또는 질 내 또는 직장 내와 같은, 국소 적용을 위한 연고 또는 로션과 같은 반고체 제형으로 제형화된다.
이러한 제형은 연화제, 계면활성제, 유화제, 침투 증진제 등과 같은 하나 또는 하나 이상의 부형제를 함유할 수 있다. "연화제"는 피부를 부드럽게 하거나 진정시키는 외부적으로 적용되는 작용제로, 일반적으로 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 4th　Ed., Pharmaceutical Press, 2003과 같은 개요서에 열거되어 있다. 이들은 제한 없이 아몬드유, 피마자유, 세라토니아 추출물, 세토스테아로일 알코올, 세틸 알코올, 세틸 에스테르 왁스, 콜레스테롤, 면실유, 시클로메티콘, 에틸렌 글리콜 팔미토스테아르산염, 글리세린, 글리세린 모노스테아르산염, 글리세릴 모노올레산염, 이소프로필 미리스트산염, 이소프로필 팔미트산염, 라놀린, 레시틴, 경광유, 중간 사슬 트리글리세라이드, 광유 및 라놀린 알코올, 바셀린, 바셀린 및 라놀린 알코올, 대두유, 전분, 스테아릴 알코올, 해바라기유, 자일리톨 및 이의 조합을 포함한다. 일 실시예에서, 연화제는 에틸헥실스테아르산염 및 에틸헥실 팔미트산염이다.
"계면활성제"는 계면 긴장을 낮추어 생성물의 유화성, 발포성, 분산성, 확산성 및 습윤성을 증가시키는 표면 활성 작용제이다. 적절한 비 이온성 계면활성제로는 유화 왁스, 글리세릴 모노올레산염, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체, 폴리소르브산염, 소르비탄 에스테르, 벤질 알코올, 벤질 ㅂ베벤조산염, 시클로덱스트린, 글리세린 모노스테아르산염, 폴록사머, 포비돈 및 이의 조합을 포함한다. 일 실시예에서, 비 이온성 계면활성제는 스테아릴 알코올이다.
"유화제"는 다른 액체 내에서 하나의 액체의 현탁을 촉진시키고, 오일 및 물의 안정적인 혼합물, 또는 유화액의 형성을 촉진하는 표면 활성 물질이다. 일반적인 유화제는 금속 비누, 특정 동물성 및 식물성 기름, 및 다양한 극성 화합물이다. 적절한 유화제로는 아카시아, 음이온성 유화 왁스, 칼슘 스테아르산염, 카보머, 세토스테아릴 알코올, 세틸 알코올, 콜레스테롤, 디에탄올아민, 에틸렌 글리콜 팔미토스테아르산염, 글리세린 모노스테아르산염, 글리세릴 모노올레산염, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이프로멜로스, 라놀린, 함수의 라놀린 알코올, 레시틴, 중간 사슬의 트리글리세라이드, 메틸셀룰로오스, 광유 및 라놀린 알코올, 인산이수소나트륨, 모노에탄올아민, 비 이온성 유화 왁스, 올레산, 폴록사머, 폴록사머, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 스테아르산염, 프로필렌 글리콜 알긴산염, 자기 유화 글리세릴 모노스테아르산염, 건조 시트르산 나트륨염, 라우릴 황산염 나트륨, 소르비탄 에스테르, 스테아르산, 해바라기유, 트라가칸트, 트리에탄올아민, 잔탄검및 이의 조합을 포함한다. 일 실시예에서, 유화제는 글리세롤 스테아르산염이다.
적합한 부류의 침투 증진제는 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 지방 알코올, 지방산 에스테르, 지방산, 지방 알코올 에테르, 아미노산, 인지질, 레시틴, 콜산염, 효소, 아민 및 아미드, 착화제(리포좀, 시클로덱스트린, 변성 셀룰로오스 및 디이미드), 거대 고리, 예컨대, 거대 고리 락톤, 케톤, 및 무수물 및 고리형 우레아, 계면활성제, N-메틸 피롤리돈 및 이의 유도체, DMSO 및 관련된 화합물, 이온성 화합물, 아존 및 관련된 화합물, 및 용매, 예컨대, 알코올, 케톤, 아미드, 폴리올(예컨대, 글리콜)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 부류의 예는 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
i. 로션, 크림, 겔, 연고, 유화액, 및 폼
본원에 사용된 "친수성"은 물과 용이하게 상호 작용하는 강한 극성 기를 보유하는 물질을 지칭한다.
"친유성"은 지질에 대한 친화도를 나타내는 화합물을 지칭한다.
"양친매성"은 친수성 및 친유성(소수성) 성질을 겸비하는 분자를 지칭한다.
"소수성"은 물에 대한 친화도가 결여되고, 물을 밀어내고 흡수하지 않으려는 경향이 있을 뿐만 아니라, 물에 용해되거나 물과 혼합되지 않는 경향이 있는 물질을 지칭한다.
"겔"은 분산된 상이 연속상과 결합하여 젤리 같은 반고체 물질을 생성하는 콜로이드이다.
"오일"은 친유성 물질의 적어도 95% wt을 함유하는 조성물이다. 친유성 물질의 예로는 자연 발생적인 오일 및 합성 오일, 지방, 지방산, 레시틴, 트리글리세라이드 및 이의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"연속상"은 고체가 현탁되거나 따른 액체의 액적이 분산된 액체를 지칭하며, 가끔 외상이라고도 한다. 이것은 또한 고체 또는 유체 입자가 분산된 콜로이드의 유체상을 지칭한다. 연속상이 물 (또는 친수성 용매)인 경우, 수용성 또는 친수성 약물은 (분산되는 것과는 반대로) 연속상에 용해될 것이다. 다상 제형(예컨대, 유화액)에서, 이산상은 연속상에 현탁되거나 분산된다.
"유화액"은 함께 균일하게 섞인 비 혼화성 성분의 혼합물을 함유하는 조성물이다. 특정 실시예에서, 비 혼화성 성분들은 친유성 성분과 수성 성분을 포함한다. 유화액은 제2의 액체라는 본체 전체에 걸쳐 소구체에 분포된 하나의 액체 제제이다. 분산된 액체는 불연속상이고, 분산매는 연속상이다. 오일이 분산된 액체이고 수성 용액이 연속상일 때 수중유적 유화액으로 알려져 있고, 물 또는 수성 용액이 분산상이고, 오일 또는 유성 물질이 연속상일 때 유중수적 유화액으로 알려져 있다. 오일상과 수상 중 어느 하나 또는 양자는 하나 또는 하나 이상의 계면활성제, 유화제, 유화액 안정제, 완충액, 및 기타 부형제를 함유할 수 있다. 바람직한 부형제로는 계면활성제, 특히 비온성 계면활성제; 유화제, 특히 유화 왁스; 및 액체 비 휘발성 비 수성 물질, 특히 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜을 포함한다. 유상은 다른 오일성의 약학적으로 승인된 부형제를 함유할 수 있다. 예를 들어, 하이드록실화 피마자유 또는 참기름과 같은 물질은 계면활성제 또는 유화제로서 오일상에 이용될 수 있다.
유화액은 제2의 액체라는 본체 전체에 걸쳐 소구체에 분포된 하나의 액체 제제이다. 분산된 액체는 불연속상이고, 분산매는 연속상이다. 오일이 분산된 액체이고 수성 용액이 연속상일 때 수중유적 유화액으로 알려져 있고, 물 또는 수성 용액이 분산상이고, 오일 또는 유성 물질이 연속상일 때 유중수적 유화액으로 알려져 있다. 오일상은 적어도 부분적으로는 HFA 추진체와 같은 추진체로 이루어질 수 있다. 오일상과 수상 중 어느 하나 또는 양자는 하나 또는 하나 이상의 계면활성제, 유화제, 유화액 안정제, 완충액, 및 기타 부형제를 함유할 수 있다. 바람직한 부형제로는 계면활성제, 특히 비온성 계면활성제; 유화제, 특히 유화 왁스; 및 액체 비 휘발성 비 수성 물질, 특히 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜을 포함한다. 유상은 다른 오일성의 약학적으로 승인된 부형제를 함유할 수 있다. 예를 들어, 하이드록실화 피마자유 또는 참기름과 같은 물질은 계면활성제 또는 유화제로서 오일상에 이용될 수 있다.
유화액의 부분 집합은 자기 유화 시스템이다. 이러한 약물 전달 체계는 전형적으로, 오일 또는 다른 수 혼화성 액체와 같은 친유성 액체와 계면활성제(들)의 혼합물에 분산되거나 용해된 약물로 이루어진 캡슐제(경질 쉐 또는 연질 쉘)이다. 이러한 캡슐제가 수성 환경에 노출되고, 외부 젤라틴 쉘이 용해될 때, 수성 매질과 캡슐 내용물의 접촉은 즉각적으로 매우 작은 유화액적을 생성한다. 이들은 전형적으로 미셀 또는 나노 입자의 크기 범위이다. 전형적으로 유화액 제형 공정에서 그렇듯이, 유화액을 생성하는 데 어떠한 혼합하는 힘도 필요하지 않다.
"로션"은 낮은 점도 내지 중간 점도의 액체 제형이다. 로션은 현탁제 및 분산제를 이용하여 분산매에 불용성인 미세하게 분말화된 물질을 함유할 수 있다. 대안적으로, 로션은 분산상으로 용제와 혼화될 수 없으며 보통 유화제 또는 다른 적합한 안정제에 의해 분산되는 액체 물질을 보유할 수 있다. 일 실시예에서, 로션은 100 내지 1000센티스토크 사이의 점도를 나타내는 유화액 형태이다. 로션의 유동성은 넓은 표면적 위로 빠르고 균일하게 도포할 수 있게 한다. 로션은 전형적으로 피부 위에서 건조되어 피부 표면 위에 의학적 성분으로 된 얇은 막을 남기기 위한 것이다.
"크림"은 점성 있는 액체 또는 "수중유적" 또는 "유중수적 유형"의 반고체 유화액이다. 크림은 유호제 및/또는 기타 안정제를 함유할 수 있다. 일 실시예에서, 제형은 1000센티스토크를 초과하는, 전형적으로는 20,000~50,000센티스토크 범위의 점도를 나타내는 크림의 형태이다. 크림은 일반적으로 펴기가 더 용이하고 제거하기가 더 용이하므로 종종 연고보다 선호된다.
크림과 로션의 차이는 점도로서, 이것은 다양한 오일의 양/이용 및 제형을 제조하는 데 이용된 물의 퍼센트에 달려 있다. 크림은 전형적으로 로션보다 걸쭉하고, 다양한 용도를 나타낼 수 있으며, 종종 피부에 원하는 효과에 따라, 더 다양한 오일/버터를 이용한다. 크림 제형에서, 물 베이스 퍼센트는 전체의 약 60~75%이고, 오일 베이스는 약 20~30%이며, 전체 100%에 대해 나머지 퍼센트는 유화제, 보존제 및 첨가제이다.
"연고"는 연고 베이스와 선택적으로 하나 또는 하나 이상의 활성제를 함유하는 반고체 제제이다. 적절한 연고 베이스의 예로는 탄화수소 베이스(예컨대, 바셀린, 백색 바셀린, 황색 연고, 및 광유); 흡수 베이스(친수성 바셀린, 무수 라놀린, 라놀린, 및 콜드 크림); 물로 제거 가능한 베이스(예컨대, 친수성 연고), 및 수용성 베이스(예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 연고)를 포함한다. 페이스트는 전형적으로 더 많은 퍼센트의 고체를 함유한다는 점에서 연고와 상이하다. 페이스트는 전형적으로 동일한 성분으로 제조된 연고보다 더 흡수성을 나타내고 지성을 덜 나타낸다.
"gel"은 액체 용제 내에 용해되거나 현탁된 농조화제 또는 고분자성 물질의 작용에 의해 반고체로 된 액체 용제 내의 작거나 큰 분자들의 분산액을 함유하는 반고체 시스템이다. 이러한 액체는 친유성 성분, 수성 성분 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 일부 유화액은 겔일 수 있고, 또는 그렇지 않으면 겔 성분을 포함할 수 있다. 그러나 일부 겔은 혼화될 수 없는 성분들의 균질화된 혼합물을 함유하지 않으므로 유화액이 아니다. 적절한 겔화제로는 하이드록시프로필 셀룰로오스 및 하이드록시에틸 셀룰로오스와 같은 변성 셀룰로오스; 카보폴 단독중합체 및 공중합체; 및 이의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 액체 용제 내의 적합한 용매로는 디글리콜 모노에틸 에테르; 프로필렌 글리콜과 같은 알킬렌 글리콜; 디메틸 이소소르바이드; 이소프로필 알코올 및 에탄올과 같은 알코올을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 용매는 전형적으로 약물을 용해시키는 능력에 대해 선택한다. 피부 감촉 및/또는 제형의 연화도를 개선하는 기타 첨가제 또한 혼입될 수 있다.
그러한 첨가제의 예로는 이소프로필 미리스트산염, 에틸 아세트산염, C12~C15 알킬 벤조산염, 광유, 스쿠알렌, 시클로메티콘, 카프릭/카프릴릭 트리글리세라이드, 및 이의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
폼은 기체 추진체와 조합된 유화액으로 이루어진다. 기체 추진체는 주로 하이드로플루오로알칸(HFA)로 구성된다. 적절한 추진체로는 1,1,1,2-테트라플루오로에탄(HFA 134a) 및 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판(HFA 227)과 같은 HFA를 포함하지만, 이것들과, 의학용으로 현재 승인되거나 승인될 수 있는 기타 HFA의 혼합물 및 혼화물이 적합하다. 추진체는 바람직하게는 분사 시 가연성 또는 폭발성 증기를 생산할 수 있는 탄화수소 추진체 기체가 아니다. 또한, 조성물은 바람직하게는 사용 중 가연성 또는 폭발성 증기를 생산할 수 있는 휘발성 알코올을 함유하지 않는다.
완충액은 조성물의 pH를 조절하기 위하여 이용된다. 바람직하게는, 완충액은 조성물을 약 4 내지 약 7.5의 pH, 더욱 바람직하게는 약 4 내지 약 7의 pH, 그리고 가장 바람직하게는 약 5 내지 약 7의 pH로 완충한다. 바람직한 실시예에서, 완충액은 트리에탄올아민이다.
보존제는 진균 및 미생물의 성장을 방지하기 위하여 이용될 수 있다. 적절한 항진균제와 항미생물제로는 벤조산, 부틸파라벤, 에틸 파라벤, 메틸 파라벤, 프로필파라벤, 벤조산 나트륨, 프로피온산 나트륨, 염화 벤잘코늄, 염화 벤제토늄, 벤질 알코올, 염화 세틸피리디늄, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알코올, 및 티메로살을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
특정 실시예에서, 필요로 하는 환자에 하나 또는 하나 이상의 노스파킨 유사체의 연속적인 전달을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 국소적 적용을 위해, 반복적인 적용이 이루어질 수 있거나, 장기간에 걸친 노스카핀 유사체의 연속적인 투여를 제공하는 데 패치가 이용될 수 있다.
E. 경장 제형
적절한 경구 투여 형태로는 정제, 캡슐제, 용액, 현탁액, 시럽 및 로젠지를 포함한다. 정제는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 압축 또는 성형 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 젤라틴 또는 비 젤라틴 캡슐제는 경질 또는 연질 캡슐 쉘로 제조될 수 있으며, 이는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 기법을 이용하여 액체, 고체, 및 반고체 충전 물질을 캡슐화할 수 있다.
희석제, 보존제, 결합제, 윤활제, 붕해제, 팽창제, 충전제, 안정제 및 이의 조합을 포함하는 하나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 이용하여 제형을 제조할 수 있다.
가소제, 색소, 착색제, 안정제 및 활주제를 포함하는 부형제는 경장 투여를 위한 코팅된 조성물을 형성하는 데에도 이용될 수 있다. 지연 방출 제형은 "Pharmaceutical dosage form tablets", eds. Liberman et. al. (New York, Marcel Dekker, Inc., 1989), "Remington - The science and practice of pharmacy", 20th ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2000, 및 "Pharmaceutical dosage forms and drag delivery systems", 6th Edition, Ansel et al, (Media, PA: Williams and Wilkins, 1995)과 같은 일반적인 참조문헌에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다. 이러한 참조문헌은 부형제, 정제 및 캡슐제 그리고 정제, 캡슐제, 및 과립제의 지연 방출 제형을 제조하기 위한 재료, 장비 및 공정에 대한 정보를 제공한다.
나노 입자는 예를 들어, 일단 입자가 위의 산성 환경을 통과하면 방출을 지연시키고자, 코팅시킬 수 있다. 적절한 코팅 물질의 예로는 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 하이드록시 프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스 프탈레이트 및 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 아세테이트 석시네이트와 같은 셀룰로오스 고분자; 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트, 아크릴산 고분자 및 공중합체, 및 상표명 유드라짓(EUDRAGIT®)(Roth Pharma, Westerstadt, 독일)으로 시판되고 있는 메타크릴릭 수지, 제인, 쉘락 및 다당류를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"충전제"라고도 지칭되는 희석제는 전형적으로 고체 제형의 부피를 증가시키는 데 필수적이며, 그 결과 정제의 압축 또는 비즈 및 과립제의 형성에 대해 실제 크기가 제공된다. 적절한 희석제로는 디칼슘 인산 2수화물, 황산칼슘, 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로오스, 미세결정 셀룰로오스, 카올린, 염화나트륨, 건조 전분, 가수분해된 전분, 전호화 전분, 이산화규소, 산화 티타늄, 마그네슘 알루미늄 실리케이트 및 가루 설탕을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
결합제는 고체 제형에 점착 특성을 부여하여, 정제 또는 비드 또는 과립제가 제형 형성 후에 그대로 유지되도록 하는 데 이용된다. 적절한 결합제 물질로는 전분, 전호화 전분, 젤라틴, (수크로오스, 글루코오스, 덱스트로스, 락토오스 및 소르비톨을 포함하는) 당류, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스, 아카시아, 트라가칸트, 알긴산 나트륨과 같은 천연 및 합성 검류, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 에틸셀룰로오스를 포함하는 셀룰로오스, 및 비검(veegum), 및 아크릴산 및 메타크릴산 공중합체, 메타크릴산 공중합체, 메틸 메타크릴산 공중합체, 아미노 알킬 메타크릴산 공중합체, 폴리아크릴산/폴리메타크릴산 및 폴리비닐피롤리돈과 같은 합성 고분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
윤활제는 정제 제조를 촉진하기 위하여 이용된다. 적절한 윤활제의 예로는 마그네슘 스테아르산염, 칼슘 스테아르산염, 스테아르산, 글리세롤 베헨산염, 폴리에틸렌 글리콜, 탈크 및 광유를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
붕해제는 투여 후 제형 붕해 또는 "분해"를 촉진하기 위하여 이용되며, 일반적으로 전분, 전분 글리콜산 나트륨, 카르복시메틸 전분 나트륨, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 전호화 전분, 점토, 셀룰로오스, 알지닌, 검류 또는 가교 결합된 PVP(폴리플라스돈(Polyplasdone® XL, GAF Chemical Corp)와 같은 가교 결합 고분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
안정제는 예를 들어, 산화 반응을 포함하는, 약물 분해 반응을 억제하거나 지연시키기 위해 이용된다. 적절한 안정제로는 항산화제, 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT); 아스코르브산, 그의 염 및 에스테르; 비타민 E, 토코페롤 및 그의 염; 메타중아황산나트륨과 같은 아황산염; 시스테인 및 그의 유도체; 시트르산; 프로필 갈산, 및 부틸화 하이드록시아니솔(BHA)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
IV. MPP 제조방법
나노 입자를 제조하는 기법은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 용매 증발법, 용매 제거법, 분무 건조법, 상 전환법, 저온 주조법, 및 나노 침전법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
입자 형성의 적절한 방법을 아래에 간략하게 기술한다.
입자 형성 중에 pH 개질제, 붕해제, 보존제, 및 항산화제를 포함하는 약학적으로 허용 가능한 부형제가 선택적으로 입자 내로 도입될 수 있다. 위에 기술된 바와 같이, 하나 또는 하나 이상의 추가적인 활성제 또한 입자 형성 도중에 나노 입자 내로 도입될 수 있다.
1. 용매 증발법
본 방법에서, 나노 입자 유전자 전달체의 고분자 구성요소들을 염화 메틸렌과 같은 휘발성 유기 용매에 용해시킨다. 그런 다음, 고분자-약물 콘쥬게이트를 함유하는 유기 용액을 폴리비닐 알코올과 같은 표면 활성 작용제를 함유하는 수성 용액에 현탁시킨다. 그에 따른 유화액을 대부분의 유기 용매가 증발되어, 고체의 나노 입자를 남길 때까지 교반한다. 결과로 얻어지는 나노 입자를 물로 세척하고, 동결건조기로 밤새 건조시킨다. 상이한 크기와 형태의 나노 입자가 본 방벙으로 얻어질 수 있다.
2. 용매 제거법
본 방법에서는, 나노 입자 유전자 전달체의 구성요소들을 적절한 용매에 분산시키거나 용해시킨다. 그런 다음, 이러한 혼합물을 (실리콘 오일과 같은) 유기 오일에 교반하여 현탁시켜 유화액을 형성한다. 고체 입자가 유화액으로부터 형성되며, 이는 이후에 상층액으로부터 분리할 수 있다.
3. 분무 건조법
본 방법에서는, 나노 입자 유전자 전달체의 구성요소들을 적절한 용매에 분산시키거나 용해시킨다. 압축 기체의 흐름으로 추진되는 마이크로나이징 노즐을 통해 펌핑하고, 그에 따른 에어로졸을 가열된 공기 사이클론에 현탁시켜, 용매가 마이크로액적으로부터 증발되어 입자가 형성되게 한다.
4. 상 전환법
본 방법에서는, 나노 입자 유전자 전달체의 구성요소들을 "좋은" 용매에 분산시키거나 용해시키고, 용액을 강한 비용매에 부어 나노 입자 유전자 전달체의 고분자성 구성요소들이 유리한 조건 하에서 자발적으로 나노 입자를 생산한다.
5. 저온 주조법
나노 입자의 매우 낮은 온도에서의 주조 방법은 Gombotz 등의 미국 특허번호 5,019,400호에 기술되어 있다. 본 방법에서는, 나노 입자 유전자 전달체의 구성요소들을 용매에 분산시키거나 용해시킨다. 그런 다음, 혼합물을 나노 입자 유전자 전달체의 구성요소들을 작은 액적으로 동결시키는 용액의 어는점 밑의 온도에서 액체 비용매를 함유하는 용기로 분무한다. 액적과 구성요소들에 대한 비용매가 가온됨에 따라, 액적 내의 용매가 해동되고, 비용매로 추출되어, 나노 입자를 경화시킨다.
6. 나노 침전법
본 방법에서는, 하나 또는 하나 이상의 핵산을 함유하는 용액을 나노 입자 유전자 전달체의 고분자성 구성요소들을 함유하는 용액에 점적 첨가한다. 핵산이 양이온성 고분자에 의해 복합체를 형성함에 따라, 나노 입자가 용액으로부터 침전된다. 그에 따른 나노 입자를 예를 들어, 여과 또는 원심분리에 의해 용액으로부터 분리하고, 세척하고, 동결건조기를 이용하여 건조시킨다.
특정 실시예에서, 방법에서 유화를 이용하여 나노 입자를 제조한다. 일반적으로, 나노 입자는 R. C. Mundargi et al, J Control. Release 125, 193 (2008), M. Li et al., Int. J. Pharm. 363, 26 (2008), C. E. Astete and C. M. Sabliov, J. Biomater. Set Polymer Ed. 17, 247 (2006), and R. A. Jain, Biomaterials, 21, 2475 (2000)에 기술된 바와 같이, o/w 단일 유화액 또는 w/o/w 이중 유화액 방법으로 제조된다. 이러한 공정에서, 고분자를 디클로로메탄과 같은 유기 용매에 용해시켜 유상을 형성한다. 유상을 전형적으로 프로브 초음파 처리 하에 일정 시간 동안(예컨대, 2분) 유화제의 수성 용액에 첨가하여 유화액을 형성한다. 유화액을 또 다른 많은 부피의 유화제에 첨가하여 자석 교반과 함께, 유기 용매를 증발시킨다.
나노 입자를 1μm 크기의 막 여과지로 여과한 후 원심분리(예컨대, 20,000g, 25분)에 의해 수집하고, 물로 철저히 세척한다. 형광 현미경법을 위한 나노 입자를 준비하기 위하여, 특정한 양의 AF555가 표지된 고분자를 유화 공정 전에 혼합한다. 나노 침전법의 대조군 실험에서, 25mg/ml 농도의 아세토니트릴 내 PLGA45k-PEG5k 용액을 자석 교반(700rpm) 하에서 DI 물에 서서히 주사하였다. 유기 용매의 완전한 제거 후, 위에 기술된 것과 동일한 절차에 의해 나노 입자를 수집하였다.
제타사이저 나노(Zetasizer Nano) ZS90(Malvern Instruments, 미국 매사추세츠 주 사우스버러) 상에서 동적 광산란에 의한 3회 반복 측정치로부터 직경(nm), 다분산도 지수(PDI) 및 표면 전하(ζ전위, mV)를 얻었다. 나노 입자를 10mM NaCl 용액(pH 7)에 분산시켰다. H7600 TEM(Hitachi, 일본) 상에서 투과 전자 현미경법(TEM)으로 나노 입자의 형태학의 특징을 분석하였다.
V. MPP 이용 방법
본원에 기술된 데이터는 점막 약물 전달 적용을 위한 유화 방법에 의해 제조된 점액 침투성 나노 입자의 여러 가지 가능성 있는 장점을 강조한다. 첫째, 유화법에 의한 비슷한 약물 캡슐화로 생분해성 나노 입자를 제조하기 위하여 우세하게 사용되던 유화제 PVA를 저분자량 유화제로 대체할 수 있다. 나노 입자는 커큐민과 같은 소수성 약물에 대해 5% 초과, 그리고 생체 분자에 대해서는 10% 초과와 같이,높은 약물 부하를 나타낸다. 표면 개질 물질(예컨대, PEG)는 생체 내에서 유체 및 물질을 통한 수송을 증진시킬 수 있는 중성 또는 중성에 가까운 표면 전하를 생성하므로, 관심 있는 부위로 나노 입자의 전달을 증진시킬 수 있다.
예를 들어, 본원에 기술된 나노 입자는 신속하게 인간 점액 장벽을 침투하지만, PVA 코팅 나노 입자는 고정된다. 따라서, 제어 방출 입자에 대해 가장 널리 이용되는 산업적인 생산 방법이 약물 전달 적용을 위한 MPP 제조에 적용될 수 있다.
둘째, 유화법에 의해 제조된 MPP는 눈, 코, 폐, 위장관, 그 이상과 같은 기타 점막 표면에서 신속하게 침투할 수 있으리라고 예상된다. CVM은 다른 점액 유체와 화학적 함량 및 레올로지 특성에서 유사점을 공유한다. 실제로, 유화법에 의해 제조된 MPP는 수술 도중 수집된 정상적인 기도 점액과 낭포성 섬유증(CF)환자가 뱉은 가래를 신속하게 침투할 수 있음이 관찰되었다.
셋째, 단백질, 펩티드 및 핵산을 포함하는 도전적인 친수성 약물을 유화법에 의해 나노 입자 내로 캡슐화할 수 있다. 예를 들어, (오브알부민 및 파상풍 변성 독소와 같은) 백신 항원을 점막 예방접종을 위한 MPP와 같이, 예방접종을 위한 생분해성 나노 입자로 제형화할 수 있다.
넷째, 수혼화성 유기 용매에 용해시키기 어려운 소수성 약물을 유화법에 의해 MPP와 같은 생분해성 나노 입자로 성공적으로 제형화할 수 있다. MPP의 점막 약물 전달과 같은, 나노 입자의 전달을 통해, 소수성 약물의 향상된 약물동력학 및 치료 효능을 기대할 수 있다.
본 발명은 다음과 같은 비 제한적인 실시예에 의해 더 이해될 것이다.
실시예
재료 및 방법
콜산 나트륨염, 트윈 20, 트윈 80, 헥사데실트리메틸암모늄 브롬화물(CTAB), 디옥틸 설포석신산 나트륨(DSS), 폴리옥실 35 수소첨가 피마자유(Cremophore EL) 및 D-α-토코페롤 폴리에틸렌 글리콜 1000(비타민 E-TPGS)을 시그마(Sigma, 미국 미주리 주 세인트루이스)로부터 구입하였다.
폴리(비닐 알코올)(88% 가수분해시 Mw = 25kDa, 80% 가수분해시 6kDa), 및 Mw 약 400kDa의 폴리(에틸렌-말레익 무수물, 1:1 몰 비)은 폴리사이언스(PolySciences, Warrington, PA)에서 구입하였다.
당 에스테르 D1216(SE)는 Mitsubishi-Kagaku Foods Co.(일본 도쿄)로부터 기증받았다.
알렉사플루오르(Alexa Fluor) 555 카다베린은 인비트로겐(Grand Island, NY)에서 구입하였다.
0.15~0.25dL/g의 고유 점도(MW 대략 15kDa)의 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA; LA:GA 50:50)은 레이크쇼어 바이오매터리얼즈(Lakeshore Biomaterials, 미국 앨라배마 주 버밍햄)에서 구입하였다. PEG MW가 10, 5, 2 및 1kDa인 PLGA(LA:GA 50:50)-PEG 공중합체, PLA-PEG5k 및 PCL-PEGSk는 Jinan Daigang Biomaterial Co., Ltd,(Jinan, 중국)에 의해 맞춤 합성되어, 1H NMR 및 겔 투과 크로마토그래피(GPC)로 특징을 분석하였다. 굴절률 검출기를 구비한 시마즈(Shimadzu) 장치와 두 개의 워터스 스티라겔(Waters Styragel®) HR4와 HR5 컬럼을 이용하였다. 용리액으로 테트라하이드로퓨란(THF)을 이용하여 유속 0.5ml/분으로 35℃에서 분석을 수행하였다. 폴리스티렌 표준물질(시그마, 미국 미주리 주 세인트루이스)로 GPC를 보정하였다
PLGA-PEG 공중합체의 화학적 조성 및 분자량(MW)을 1H NMR로 분석하였다. 고분자를 CDC13에 용해시키고, 1H NMR 스펙트럼을 400MHz에서 브루커(Bruker) 400 REM 기기를 이용하여 기록하였다. CDC13 내의 공중합체에 대한 1H NMR 스펙트럼을 도 3에 나타내었다. LA 단위로부터 CH(5.22ppm), GA 단위로부터 CH2(4.83 ppm), 및 에틸렌 산화물 단위로부터 CH2CH2(3.65ppm)의 피크를 적분하였고, 여기서 I5 .22, I4 .83, I3.65는 각각 5.22, 4.83, 및 3.65ppm에서의 피크의 적분 강도이다. LA:GA 비율을 I5.22:(I4.83/2)로 추정하였다.
PLGA-PEG의 MW를 다음과 같이 추정하였다:
(I3 .65/4)/(I4 .83/2)=(MWPEG/44)/(MWGA/58)
(I3 .65/4)/(I5 .22/1)=(MWPEG/44)/(MWLA/72)
MWPLGA -PEG=MWPEG+(MWGA+MWLA), 여기서 MWPEG는 1, 2, 5 및 10kDa이다.
마찬가지로, PLA-PEG와 PCL-PEG의 분자량을 다음과 같이 추정하였다:
(I3 .65/4)/(I5 .22/1)=(MWPEG/44)/(MWLA/72)
MWPLA -PEG=MWPEG+MWLA;
(I3 .65/4)/((I4 .06+I2 .31)/4)=(MWPEG/44)/(MWCL/114)
MWPCL -PEG=MWPEG+MWCL;
여기서 MWPEG는 5kDa이고, I4 .06과 I2 .31은 각각 4.06 및 2.31ppm에서 PCL로부터 피크의 적분 강도이다.
다양한 PEG를 함유하는 블록 공중합체의 특징을 표 1에 나타내었다.
PEG를 함유하는 블록 공중합체의 특징
블록 고분자 PEG
[kDa]		 LA:GA[a] PEG 함량
[b][%]		 Mn[c]
[kDa]		 Mn[d]
[kDa]		 Mw[d]
[kDa]		 PDI[d]
PLGA-PEG10k 10 54:46 21.6[e] 46.3 23.6 38.3 1.62
PLGA-PEG5k 5 51:49 6.0 83.0 39.2 57.8 1.48
PLGA-PEG2k 2 52:48 6.3 31.8 19.0 27.7 1.46
PLGA-PEG1k 1 61:39 5.7 17.7 19.3 27.6 1.43
PLA-PEG5k 5 100:0 5.3 94.9 64.7 87.4 1.35
PCL-PEG5k 5 6.4 77.9 54.6 73.6 1.35
[a]　5.22ppm(락티드의 -CH-), 1.59ppm(락티드의 -CH3) 및 4.83ppm(글리콜라이드의 -CH2-)에서의 1H NMR 적분 강도를 비교하여 LG:GA의 몰 비를 측정하였다.
[b] 블록 공중합체 내의 PEG 함량을 1H NMR으로 결정하였다.
[c] 5.22ppm(락티드의 -CH-), 1.59ppm(락티드의 -CH3), 4.83ppm(글리콜라이드의 -CH2-) 및 3.65ppm(PEG의 -CH2CH2-)에서의 적분을 비교하고, PEG에 대한 공지된 Mn을 고려하여, 1H NMR로 PLGA-PEG 분자량(Mn)을 결정하였다. PCL-PEG의 경우, 4.06ppm(-O-CH2-)과 2.31ppm(-CH2-CO-)에서의 적분을 분석하였다.
[d] Mn, Mw 및 다분산도(PDI)를 GPC로 측정하였다.
[e] PLGA15kDa를 PLGA-PEG10kDa(21.6% PEG 함량)과의 혼합에 의해 PLGA-PEG10kDa 나노 입자를 제조하였으며, 나노 입자 내의 전체 PEG 함량은 6wt%였다.
나노 입자 내의 전체 PEG 함량을 400mHz에서 브루커 400 REM 기기를 이용하여 1H NMR로 결정하였다. 동결 건조된 나노 입자를 정확하게 칭량하여 내부 표준물질로 1wt% 헥사듀테로디메틸 설폭사이드(TMS)를 함유하는 CDCl3에 용해시켰다. 내부 표준물질로 TMS를 이용한 1H NMR 스펙트럼으로부터 달성된 PEG 5kDa 보정 곡선과 비교하여 PEG 함량을 결정하였다.
신선한 인간의 자궁경질 점액(CVM)에서 형광으로 표지된 나노 입자를 39~40에 게재된 바와 같이 추적하였다. 간략하게, 적절히 희석한 0.6㎕의 나노 입자를 20㎕의 점액과 혼합하여 현미경 관찰 전 1시간 동안 인큐베이션하였다. 100x 유침용 대물렌즈가 구비된 도립 형광 현미경 위에 마운트된 SIT(silicon-intensified target) 카메라(VE-1000, Dage-MTI)를 이용하여 66.7ms의 시간 해상도로 동영상을 캡쳐하였다. 메타모프(MetaMorph) 소프트웨어(유니버셜 이미징(Universal Imaging))를 이용하여 실험당 n>150개 입자에 대한 궤적을 추출하였다. 메타모프 소프트웨어(유니버셜 이미징, 미국 위스콘신 주 글렌데일)를 이용하여 추적 동영상(20s)을 분석하였다. 각 입자에 대한 시간 평균화 평균 제곱 변위(MSD)와 유효 확산도를 시간 척도의 함수로 계산하였다. 각 조건에 대해 3회 실험을 수행하였다. 한쪽 꼬리, 불균등 분산 스튜던트의 t 검정법을 유의도를 평가하는 데 이용하였다(P<0.05)
VP-ITC 마이크로칼로리미터(MicroCal Inc., USA)를 이용하여 25℃에서 ITC 실험을 수행하였다. 물 내의 1mg/ml의 농도에서 상이한 PEG 표면 밀도를 나타내는 나노 입자를 함유하는 2mL 샘플 세포에 DI 물 내의 뮤신 2mg/ml 용액을 481rpm의 교반 속도로 주입하여 실험을 수행하였다. s의 간격 및 μcal/s의 기준 전력으로 총 28회의 주입을 수행하였다. 2㎕ 뮤신 용액의 최초 주입에 이어, 10㎕ 뮤신 용액을 27회 주입하였다. 결합 등온선을 그리고, 오리진(Origin) 소프트웨어를 이용하여 분석하였는데, 여기서 ITC 측정을 한 자리 결합 모델에 맞추었다. 화학량론을 적용하여 나노 입자 표면 상의 뮤신의 결합 함량을 계산하고, m2당 뮤신 mg으로 나타내었다.
실시예 1. 나노 입자의 제조
재료 및 방법
R. C. Mundargi et al, J Control. Release 125, 193 (2008), M. Li et al, Int. J. Pharm. 363, 26 (2008), C. E. Astete and C. M. Sabliov, J. Biomater. Sci. Polymer Ed. 17, 247 (2006), 및 R. A. Jain, Biomater Ms, 21, 2475 (2000)에 기술된 바와 같이, o/w 단일 유화액 또는 w/o/w 이중 유화액 방법에 의해 생분해성 나노 입자를 제조하였다.
크기, 표면 특성 및 (약물 캡슐화 나노 입자에 대한) 약물 부하에 대해 나노 입자의 특성을 분석하였다. 다중 입자 추적을 이용하여 신선한, 희석되지 않은 인간 CVM에서 나노 입자의 이동을 추적하였다.
상이한 양의 PEG로 제조된 나노 입자
유화를 이용하여 다양한 목표 PEG 함량(0, 2, 3, 5, 8, 10 및 25wt%, PLGA, PLGA-PEG2%, PLGA-PEG3%, PLGA-PEG5%, PLGA-PEG8%, PLGA-PEG10% 및 PLGA-PEG25%라 함)으로 PLGA-PEG 나노 입자를 제조하였다. PEG 분자량 5kDa를 선택하였는데, 동일한 PEG 함량에서, 1kDa 내지 10kDa 범위의 PEG가 있는 6wt% PLGA-PEG 나노 입자 모두가 빠르게 점액을 침투할 수 있기 때문이다. 나노 입자를 제조하는 동안 PLGA와 PLGA-PEG 비율을 다르게 하여 목표 PEG 함량을 조절하였다. 고분자 농도와 유화 절차를 조율함으로써 나노 입자의 입자 크기를 약 100nm로 조절하였고, 모든 나노 입자는 동적 광산란 하에서 작은 다분산도 지수(0.1 미만)와 함께 단분산 직경을 나타냈다. 나노 입자는 TEM 연구를 기초로 할 때 구 형상이었고, 최고의 목표 PEG 함량을 나타내
GA-PEG25% 나노 입자는 입자 경계에서 더 적은 대조를 보였는데, 이는 아마도 표면에 위치한 더 낮은 전자 밀도의 PEG의 높은 함량에서 기인한 것이다.
결과
표 2는 위에 기술된 바와 같이 제조된 입자의 특징을 나타낸다.
나노 입자 특성
표적 PEG
함량(wt%)		 직경[nm]
[a] 		PDI[a] ζ-전위
[mV]		 α[b] Dw /Dm [c]
25 91±5 0.094 -2.7±0.7 0.89 6.0
10 117±57 0.097 -2.4±0.6 0.80 8.7
8 116±8 0.068 -4.3±0.9 0.81 7.7
5 106±6 0.085 -7.0±0.7 0.78 17
3 101±6 0.078 -10±0.1 0.53 142
2 91±6 0.075 -20±1.4 0.31 4,000
0 144±6 0.056 -72±2.2 0.13 38,000
[a] 나노 입자의 직경 및 다분산도 지수(PDI)를 동적 레이저 산란으로 측정하였다.
[b] 수송 속도는 또한 이중 로그의 MSD 대 시간 척도 그래피의 기울기에 의해 반영될 수 있다(α=1은 방해받지 않은 브라운 수송을 나타내며, 더 작은 α는 입자 운동에 대한 증가된 방해를 반영한다.).
[c] 나노 입자에 대한 물(D w )에서와 비교했을 때의 점액(D m )에서의 전체 평균 확산 계수의 비율 및 유효 확산도 값을 1s의 시간 척도에서 계산하였다.
데이터는 평균±SD이다.
목표 PEG 함량 증가는 나노 입자 표면 전하의 상당함 감소를 가져왔고(표 2), PEG 함량이 8wt% 이상에 도달했을 때, 거의 중성의 표면 전하(대략 4mV)가 달성되었다. 감소된 표면 전하는 증가된 표면 PEG 피복범위를 반영하는데, 고밀도 PEG 코팅은 나노 입자의 표면 전하를 효과적으로 가릴 수 있기 때문이다. 그러나, 표면 전하(제타 전위) 측정은 입자 표면 위의 PEG 사슬의 수와 관련하여, PEG 표면 밀도를 평가하기 위한 정량적인 정보를 제공할 수 없다. 또한, 표면 전하 측정은 코어 물질과 측정 매체에 의해 영향 받을 수 있다.
나노 입자 위의 PEG 표면 밀도를 직접적으로 정량하는데 1H NMR을 활용하였다. 표 3에 나타난 바와 같이, 나노 입자 위의 표면 PEG 함량은 목표 PEG 함량이 증가함에 따라 증가한다. 표 3은 상이한 PEG 함량을 나타내는 PLGA-PEG 나노 입자의 PEG 표면 밀도를 나타낸다. 표준 DSS(1wt%)와 비교하여 표면 PEG 수준을 D20에서 1H NMR로 검출하였다. 표준 TMS(1wt%)와 비교하여 나노 입자 내의 총 PEG 함량을 CDC13에서 1H NMR로 측정하였다. N/A, 해당 없음.
나노 입자 상의 표면 PEG 함량
목표 PEG 함량(wt%) 전체 NP 내의 총 PEG 함량(wt%) NP 표면 위의 PEG 함량(wt%) PEG 표면 밀도
[Γ]
(사슬/100nm2)[a] 		[Γ/Γ*][b]
25 13.0±0.3 12.9±1.0 29.7±2.9 6.7±0.7
10 7.4±0.1 7.2±0.2 19.4±1.3 4.4±0.3
8 6.0±0.3 6.0±0.3 16.4±1.6 3.7±0.4
5 3.7±0.1 3.7±0.2 10.4±0.2 2.4±0.04
3 2.5±0.1 2.6±0.1 6.5±0.2 1.5±0.05
2 1.4±0.4 1.4±0.02 3.2±0.1 0.76±0.02
0 N/A N/A N/A N/A
[a] PEG 밀도 [Γ]는 표면 위의 모든 PEG 사슬이 전체 길이의 PEG5kDa이라고 가정하여 계산한 100nm2당 PEG 분자의 수를 의미한다.
[b]　PEG 밀도/전체 표면 피복범위[Γ/Γ*]. 전체 버섯 피복범위[Γ*]는 100nm2당 구속받지 않는 PEG 분자의 수를 의미한다(>>1의 값이 매우 높은 PEG 밀도의 밀집한 브러시형을 나타낼 때, < 1의 값은 낮은 PEG 밀도의 버섯 피복범위를 나타내며, > 1 은 브러시형을 나타낸다.)
데이터(평균±SD)는 적어도 세 개의 상이한 배치의 샘플들의 평균값이다.
실시예 2: 상이한 유화제로 제조된 나노 입자
재료 및 방법
알렉사 플루오르 555 카다베린(AF555)을 고분자에 화학적으로 콘쥬게이트시켰다. 유화를 이용하여 나노 입자를 제조하였다. 전형적으로, PLGA-PEG5k와 AF555가 표지된 PLGA-PEG5k의 혼합물(총 50mg)을 1mL 디클로로메탄(DCM)에 용해시켰다. 얼음수조에서 2분 동안 30% 진폭의 초음파(VibraCell, Sonics & Materials Inc., Newtown, CT) 하에서 1% 유화제를 함유하는 5mL 수성 용액에 유상을 부어 수중유적 유화액을 형성하였다.
이러한 유화액을 적어도 3시간 동안 700rpm에서의 자석 교반 하에 또 다른 유화제 용액의 40mL 수상으로 부어 용매가 증발하도록 하였다. 용액을 진공 챔버에 30분 동안 위치시켜 용매를 더 증발시켰다. 최종적인 나노 입자 현탁액을 1μm 시린지 필터로 여과하고, 20,000g에서 25분 동안 원심분리하고, 물로 철저히 세척하였다.
콜산 나트륨염(CHA), 디옥틸 설포석신산 나트륨(DSS), 헥사데실트리메틸 암모늄 브롬화물(CTAB), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리(에틸렌-말레익 무수물)(PEMA), 사포닌, 트윈20, 트윈80 및 당 에스테르 D1216(SE)를 포함하는 유화제를 1% w/v의 농도로 시험하였다. 0.01%~0.5% w/v의 CHA 용액도 나노 입자를 성공적으로 제조할 수 있었다. 플루로닉 F127, F68 용액 및 크레모포어 EL과 비타민 E TPGS와 같은 기타 저분자량 유화제도 시험하였으나, 불안정한 유화액은 큰 응집 입자를 초래했다.
표 4는 PLGA-PEG(Mn 약 83kDa) 및 PLGA(Mn 약 15kDa) 및 다양한 유화제(1% w/v)를 이용하여 제조한 나노 입자의 특징을 나타낸다.
PLGA-PEG5k(Mn 약 83kDa) 및 PLGA(Mn 약 15kDa) 및 대표적인 유화제(1% w/v)를 이용하는 유화법에 의해 제조된 생분해성 나노 입자의 특징.
고분자 유화제 유화제 MW [Da] 직경
[nm]		 ζ-전위
[mV]		 Dw /Dm [a]





PLGA-PEG5k






 DSS 444 136±5 -5.5±0.5 3.9
CHA 430 115±11 -3.7±0.4 5.1
CTAB 364 77±3 -4.6±0.7 5.6
사포닌 1.8k 108±1 -7.0±0.7 10
SE 540 97±3 -4.2±0.3 6.8
트윈20 1.2k 156±7 -3.8±0.3 3.5
트윈80 1.3k 152±6 -4.2±0.3 6.8
F127 12.5k 169±8 -2.4±0.2 4.2
F68 8.4k 162±5 -3.3±0.3 4.2
TPGS 1.5k 204±7 -4.8±0.3 5.6
크레모포어 2.1k 232±4 -3.5±0.1 3.6
PVA 25k 156±8 -2.9±0.3 40,000
PEMA 400k 185±6 -42±1.6 23,000
PLGA
 PVA 25k 175±5 -2.6±1.0 19,000
CHA 430 144±6 -72±2.2 41,000
[a] 1s의 시간 척도에서 점액(D m )에서와 비교할 때의 물(D w )에서의 전체 평균 분산 계수의 비율.
유화에 의해 제조된 나노 입자의 점액 투과성에 미치는 폴리에틸렌 글리콜 분자량(PEG MW)의 영향을 평가하기 위하여, 대표적인 저분자량의 강한 유화제로 CHA를 선택하였다. 대략 6wt% PEG 함량의 상이한 PEG MW를 나타내는 PLGA-PEG 나노 입자를 0.5% CHA 용액에 제조하였다. PLGA-PEGlOk 나노 입자에 대한 전체 6wt% PEG 함량을 달성하기 위하여, PLGA-PEGlOk(21.6 wt%) 및 PLGA15k의 혼합물을 이용하였다.
결과
다양한 분자량(약 6wt% PEG 함량)의 PEG로부터 제조된 나노 입자의 성질을 표 5에 나타내었다.
유화법에 의한 다양한 MW(약 6wt% PEG 함량)의 PEG를 이용하여 제조한 생분해성 나노 입자의 특징
PEG MW
[kDa]		 직경
[nm]		 ζ-전위
[mV]		 PEG 밀도[Γ]
[a](#PEG/100nm2)		 [Γ/Γ*][b] Dw /Dm
10 124±6 -2.3±0.1 6.7 3.0 9.6
5 107±3 -4.2±0.3 13.9 3.3 4.4
2 128±1 -12±0.9 26.2 2.5 5.0
1 134±5 -18±1.2 45.0 2.3 7.7
[a] PED 밀도 [Γ]는 100nm2당 PEG 분자의 수를 나타낸다. D20 내의 나노 입자의 lH NMR로 표면 PEG 함량을 정량하였다.
[ bl　전체 표면 피복범위에 대한 PEG 밀도의 비율 [Γ/Γ*]. 전체 표면 피복범위 [Γ*]는 100nm2 표면을 완전히 코팅하는 데 필요한 구속되지 않은 PEG 분자의 이론적인 수를 의미한다. ([Γ/Γ*]<1은 낮은 표면 PEG 밀도를 나타내는 버섯형을 나타내고, >1은 높은 표면 PEG 밀도를 나타내는 브러시형을 나타낸다).
다양한 농도의 CHA 및 6wt% PEG를 함유하는 PLGA-PEG5k로부터 제조된 나노 입자의 성질을 표 6에 나타내었다.
유화법으로 제조한 상이한 농도의 유화제(CHA)를 이용한 생분해성 나노 입자의 특성 분석. 6wt% PEG를 함유하는 PLGA-PEG5k를 이용하였다.
유화제[w/v %] 직경 [nm] ζ-전위[mV] Dw /Dm
1 115±10 -3.7±0.4 5.1
0.5 107±3 -4.2±0.3 4.4
0.1 142±9 -3.5±0.6 4.1
0.01 125±6 -5.1±0.5 4.3
실시예 3: 약물 캡슐화 나노 입자의 제조
재료 및 방법
DCM에 고분자와 함께 용해시킨 소수성 약물 모델로서 커큐민을 선택하였다. 절차는 비 부하 나노 입자의 제조 절차와 비슷하였다. 제조된 커큐민-나노 입자는 커큐민의 고유한 형광색 때문에 점액에서 가시화할 수 있다.
BSA는 큰 분자 생물학을 대표하므로, 친수성 약물 모델로 이용하였다.BSA-FITC와 BSA(BSA-FITC의 10% 비율)를 37℃의 0.2mL 16% w/v 수성 용액에 용해시켰다. 이 용액을 얼음수조에서 프로브 초음파(30% 진폭, 1s 펄스로 1분) 하에서 DCM 용액 내의 100mg/ml PLGA-PEG5k 1mL에 첨가하였다. 그에 따른 W/O 1차 유화액을 즉시 초음파(20% 진폭, 2분) 하에서 제2의 수상(5mL 1% 사포닌 용액)에 첨가하였다. 이중 유화액을 또 다른 40mL의 1% 사포닌 용액으로 옮겨 3시간 동안 자석 교반하였다. 나노 입자를 1μm 시린지 필터로 여과하고, 세척하고, 원심분리에 의해 수집하였다. BSA-FITC는 점액에서 BSA가 부하된 나노 입자를 추적할 가능성을 허용하였다.
결과
커큐민 나노 입자 및 BSA 나노 입자에 대한 표적 약물 부하는 각각 9.1%와 16.7%였다.
실시예 4. 유화 능력의 추정
재료 및 방법
PLGA-PEG5k(MW 대략 83kDa)를 고분자 모델로 이용하였고, 50mg/mL의 DCM에 용해시켰다. DCM 내 PLGA-PEG5k의 0.5ml 용액을 30% 진폭의 초음파 하에서 1%(w/v) 유화제를 함유하는 5ml 수상에 첨가하여, 위에 기술된 동일한 방법을 이용하여 유화액을 제조하였다. 3시간 동안 700rpm에서 자석 교반하에서 형성된 유화액을 추가적인 20ml 1% 유화제 용액에 첨가하였다. 각 유화제의 유화 능력을 응집된 입자의 형성을 방지하는 능력으로 추정하였다. 응집된 입자를 500g에서 20분 동안 원심분리에 의해 수집하고, 상층액의 나머지 나노 입자를 30,000g에서 25분 동안 원심분리하여 수집하였다. 응집된 입자에 대한 나노 입자의 중량 비율을 계산하고, 유화제의 유화 능력을 추정하기 위하여 지수로 이용하였다.
직경 및 표면 전하
나노 입자의 직경 및 ζ-전위(표면 전하)를 제타사이저 나노 NS90을 이용하여 측정하였다. 나노 입자를 10mM NaCl 용액에 재현탁시켰다. TEM 그리드 상에 나노 입자의 희석 현탁액을 떨어뜨려서 TEM 샘플을 제조하고, 공기 중에서 건조되게 하였다. H7600 투과 전자 현미경(Hitachi, 일본)을 이용하여 입자 형태학의 특성을 분석하였다.
캡슐화 효율
동결 건조된 나노 입자를 DMSO 내에 용해시키고, 바이오텍 시너지(Biotek Synergy) MX 플레이트 판독기를 이용하여 430nm에서 흡광도를 측정함으로써 나노 입자 내의 커큐민의 캡슐화 효율을 측정하였다. 커큐민 보정 곡선(농도 범위 0~50μg/ml)을 비교함으로써, 약물 함량을 결정하였다. 동일한 고분자 농도에서의 DMSO 내의 블랭크 나노 입자의 흡광도를 제하였다. 알칼리 소화 후 BSA-FITC의 캡슐화 효율을 분석하였다. 알려져 있는 양의 동결 건조된 나노 입자를 1M 수산화나트륨에서 완전히 가수분해시켰다. 그에 따른 용액을 490nm 여기 파장과 525nm 방출 파장에서 바이오텍 시너지 MX 플레이트 판독기를 이용하여 분석하였다. 동일한 가공 조건에서 동일한 양의 고분자와 증가하는 양의 BSA-FITC를 함유하는 표준 용액을 제조하였다. BSA-FITC 보정 곡선과 비교하여 나노 입자 내의 BSA의 양을 결정하였다.
약물 부하(DL)와 캡슐화 효율(EE)을 다음과 같이 계산하였다:
DL(%) = 약물의 중량/나노 입자의 중량 ×100%
EE(%) = 실험적인 약물 부하/표적 약물 부하 ×100%
결과
다양한 유화제에 대한 결과를 표 7에 나타내었다.
PLGA-PEG5k(6wt% PEG)를 이용한 MPP(유화제로서 CHA와 사포닌) 및 CP(유화제로 PVA)에서 소수성 약물 모델(커큐민)과 친수성 약물 모델(BSA)의 캡슐화
제형 DL[%][a] EE[%][b] 직경
[nm]		 ζ전위
[mV]		 Dw/Dm
PLGA-PEG5k/CHA
(커큐민)		 4.5 49 156±12 -5.1±0.5 6
PLGA-PEG5k/PVA
(커큐민)		 4.3 47 151±11 -3.3±1.1 2400
PLGA-PEG5k/사포닌
(BSA)		 11.4 68 164±1 -4.5±0.4 36
PLGA-PEG5k/PVA
(BSA)		 11.5 69 218±22 -2.2±0.8 5100
[a] 약물 부하(DL%)는 나노 입자 내의 약물의 중량 함량을 나타낸다.
[b] 약물 캡슐화 효율(EE%)은 이론적인 약물 부하와 비교하여, 최종적인 약물 부하의 비율을 나타낸다.
표면 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 밀도의 정량
나노 입자 상의 표면 PEG 밀도를 400MHz에서 브루커 400 REM 기기를 이용하여 1H NMR로 결정하였다. 완화 시간을 10s로, ZG를 90°로 설정하였다. 상이한 PEG 함량을 나타내는 나노 입자를 0.5% CHA D20 용액에 직접적으로 제조하고, 1H NMR 분석을 위한 내부 표준물질로서 1wt% 3-(트리메틸실릴)-1-프로판설폰산, 나트륨염과 함께 D20 내에 현탁시켰다.
1% 3-(트리메틸실릴)-1-프로판설폰산, 나트륨염과 함께 D20 내의, 알려진 중량의 PEG5kDa(시그마, 미국 미주리 주 세인트루이스) 단독중합체를 상이한 농도까지 단계적으로 희석하여, 1H NMR에서 PEG 신호를 위한 보정 곡선을 설정하였으며, 이러한 보정 곡선을 나노 입자 위의 표면 PEG 함량을 계산하는 데 이용하였다.
D20 내의 나노 입자의 0.2ml 용액을 동결 건조시키고 중량을 측정하였다. 모든 표면 PEG 사슬이 전체 길이의 PEG 5kDa이라고 가정하여, 표면 PEG 밀도를 나노 입자 위의 100nm2당 PEG 분자의 수로 계산하였다. 동일한 방법에 의해 제조된 PLGA 나노 입자로 대조군 1H NMR 실험도 수행하였으며, PLGA 나노 입자에 대해서는 검출 가능한 CHA 피크가 없었다. PEG 밀도, [Γ]는 100nm2당 나노 입자 표면 위의 PEG 분자의 수이다. 1H NMR으로 검출된 전체 PEG 함량(MPEG, 몰)을 모든 나노 입자의 총 표면적으로 나눔으로써 PEG 밀도를 아래와 같이 계산할 수 있다:
Figure pct00001
여기서 WNP는 나노 입자의 총 질량이고, dNP는 나노 입자의 밀도이고(나노 입자의 밀도는 고분자의 밀도와 동일할 것으로 추정된다, PLGA의 경우 1.21g/ml), D는 동적 광산란에 의해 측정한 입자의 직경이다.
전체 표면 버섯 피복범위[Γ*]는 입자 표면적의 100nm2을 차지하는 구속되지 않은 PEG 분자의 수이다. [Γ*]를 결정하기 위하여, 단일 PEG 사슬이 차지하는 표면적을 추정하였다. 랜덤워크 통계학을 이용하여, 단일 PEG 사슬은 직경 ξ의 구에 의해 주어진 계면에서의 면적을 차지한다:
Figure pct00002
여기서 m은 PEG 사슬의 분자량이다. 하나의 PEG 분자에 의해 차지되는 표면적은 (ξ/2)2으로부터 결정할 수 있다. 따라서, PEG 5kDa은 5.4nm의 직경을 나타내는 구속되지 않은 분자 구를 가지고 있고, 22.7nm2의 표면적을 차지한다. 따라서, 100nm2 표면적을 완전히 덮는 PEG 분자의 수 [Γ*]는 4.4이다.
[Γ/Γ*]는 나노 입자 표면 상의 PEG 밀도를 측정하는 지수로서 이용될 수 있는데, 여기서 <1의 값은 낮은 PEG 밀도를 나타내고, 이때, PEG 분자는 버섯 형태이다; 반면, >1의 값은 높은 PEG 밀도를 나타내고, 이때, PEG 분자는 브러시와 같은 형태이다. 이와 비슷하게, PEG 10kDa, 2kDa 및 1kDa에 대한 [Γ*]은 각각 2.2, 11 및 22이다. 결과를 위의 표 2에 나타내었다.
표 8은 상이한 PEG 함량을 나타내는 PLGA-PEG 나노 입자의 PEG 표면 밀도를 보여준다. 표준 DSS(1wt%)와 비교하여 표면 PEG 수준을 D20에서 1H NMR로 검출하였다. 표준 TMS(1wt%)와 비교하여 나노 입자 내의 총 PEG 함량을 CDC13에서 1H NMR로 측정하였다. N/A, 해당 없음.
상이한 PEG 함량을 나타내는 PLGA-PEG 나노 입자의 PEG 표면 밀도
목표 PEG 함량(wt%) 전체 NP 내의 총 PEG 함량(wt%) NP 표면 위의 PEG 함량(wt%) PEG 표면 밀도
[Γ]
(사슬/100nm2)[a] 		[Γ/Γ*][b]
25 13.0±0.3 12.9±1.0 29.7±2.9 6.7±0.7
10 7.4±0.1 7.2±0.2 19.4±1.3 4.4±0.3
8 6.0±0.3 6.0±0.3 16.4±1.6 3.7±0.4
5 3.7±0.1 3.7±0.2 10.4±0.2 2.4±0.04
3 2.5±0.1 2.6±0.1 6.5±0.2 1.5±0.05
2 1.4±0.4 1.4±0.02 3.2±0.1 0.76±0.02
0 N/A N/A N/A N/A
[a] PEG 밀도 [Γ]는 표면 위의 모든 PEG 사슬이 전체 길이의 PEG5kDa이라고 가정하여 계산한 100nm2당 PEG 분자의 수를 의미한다.
[b]　PEG 밀도/전체 표면 피복범위[Γ/Γ*]. 전체 버섯 피복범위[Γ*]는 100nm2당 구속받지 않는 PEG 분자의 수를 의미한다(>>1의 값이 매우 높은 PEG 밀도의 밀집한 브러시형을 나타낼 때, < 1의 값은 낮은 PEG 밀도의 버섯 피복범위를 나타내며, > 1 은 브러시형을 나타낸다.)
데이터(평균±SD)는 적어도 세 개의 상이한 배치의 샘플들의 평균값이다.
표면 PEG 밀도([Γ], 100nm2당 PEG 사슬의 수)를 계산하여, 전체 표면 버섯 피복범위([Γ*], 100nm2당 구속받지 않는 PEG 분자의 수)와 비교하였다. PLGA-PEG3% 나노 입자는 [Γ]/[Γ*]=1.5와 동일한, 6.5PEG/1OOnm2의 밀도와 함께 2.6wt%의 표면 PEG 함량을 나타냈으며, 이는 PLGA-PEG3%에 브러시 형태의 표면 PEG 코팅을 준다. 높은 밀도의 브러시 형태의 PEG 코팅([Γ]/[Γ*]>3)은 10PEG/100nm2을 초과하는 PEG 표면 밀도에서 달성되었다(PLGA-PEG5%).
동결 건조된 PLGA-PEG 나노 입자를 NMR 용매 CDCl3에 용해시킴으로써, 1H NMR에 의해 나노 입자 내의 총 PEG 함량을 측정하였고, 나노 입자 내의 총 PEG 함량(표면 PEG 및 나노 입자 코어 내에 매립된 PEG 모두)은 표 5에 나타난 바와 같이 표면 PEG 함량에 매우 가까운 것으로 밝혀졌다. 유화법에 의해 제조된 PLGA-PEG 나노 입자 내의 거의 모든 PEG 사슬이 입자 표면 위에서 검출되었다. 유화법은 유화액적으로부터 유기 용매(디클로로메탄)의 증발 및 이어진 고분자 코어의 고체화를 수반했다. 유기 용매의 느린 증발은 친수성 PEG 사슬이 확산하여 나노 입자 표면에서 집합할 충분한 시간을 제공하며, 이는 표면에 대한 PEG의 높은 분배율을 가져왔다. 그러나, 유화법에 의해 나노 입자를 제조하는 동안 상당한 PEG의 손실이 있으며, PEG 손실 비율은 PLGA-PEG25% 나노 입자의 경우 50% 정도로 높을 수 있다.
이전의 보고와 비슷하게, PEG의 손실은 공중합체 내의, 더 높은 PEG 함량 및 더 높은 친수성을 나타내는 저분자량 부분의 PLGA-PEG에 의한 미셀 형성 때문일 수 있다. 더 높은 PEG 함량의 고분자를 함유하는 매우 작은 규모의 입자들로 이루어진 이러한 부분은 원심분리 및 세척 단계 후에는 수집할 수 없으며, 이는 겔 투과 크로마토그래피로 측정한, 원 고분자와 비교할 때의 나노 입자 형성 후의 고분자의 증가된 평균 분자량으로부터 확인할 수 있다. 대조군 실험에서 나노 침전법(용매 확산법)에 의해 제조된 PLGA-PEG10% 나노 입자(117nm)는 나노 입자에서 6.5wt%의 총 PEG 함량을 나타냈으며, PEG 사슬 중 89%만이 표면에서 검출되었다(5.8wt% 표면 PEG 함량과 동일).
실시예 5. 나노 입자의 점액 침투 추적
재료 및 방법
인간 자궁 경부의 질 점액(CVM)을 수집하였다. 간략하게는, 존스 홉킨스 대학교의 기관감사위원회가 승인한 프로토콜에 따라 자가 샘플링 생리 수집 장치를 이용하여 정상적인 질 세균총을 가지고 있는 여성으로부터 희석되지 않은 자궁 경부 질 분비물을 획득하였다. 장치를 60초 동안 질에 삽입하고, 제거하여, 50ml 원심분리 튜브에 위치시키고, 1000rpm에서 2분 동안 원심분리하여 분비물을 수집하였다.
신선한 인간 자궁 경부 질 점액(CVM) 내의 형광 표지된 나노 입자의 추적을 수행하였다. 간략하게는, 적절히 희석한 나노 입자 0.6㎕를 맞춤 제작된 챔버 슬라이드 내의 20㎕ 점액에 첨가하고, 현미경 관찰 전 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. CVM 내의 나노 입자의 궤적을 다중 입자 추적법(MPT)으로 기록하였다. 100x 유침용 대물렌즈(N.A., 1.3)가 구비된 도립 형광 현미경 위에 마운트된 SIT(silicon-intensified target) 카메라(VE-1000, Dage-MTI)를 이용하여 66.7ms의 시간 해상도로 20초 동영상을 캡쳐하였다. 메타모프 소프트웨어(유니버셜 이미징, 미국 위스콘신 주 글렌데일)를 이용하여 추적 동영상(20s)을 분석하였다.
각 입자에 대한 시간 평균화 평균 제곱 변위(MSD)와 유효 확산도를 시간 척도의 함수로 계산하였다:
Figure pct00003
여기서 x와 y는 시간의 함수로서 나노 입자 좌표를 나타내고, τ는 시간 지연이다.
커큐민 부하 나노 입자와 FITC-BSA 부하 나노 입자를 캡슐화된 커큐민 또는 BSA-FITC로부터의 형광을 이용하여 동일한 방식으로 인간 CVM에서 추적하였다. 점액층으로의 입자 침투를 픽의 제2 법칙 및 추적 실험으로부터 얻어진 확산 계수를 이용하여 모형화하였다.
결과
유화법에 의해 제조된 CHA와 PVA를 함유하는 PLA-PEG 및 PCL-PEG 나노 입자의 인간 CVM 수송 비교를 도 1a 내지 도 1h에 나타내었다. 도 1a와 도 1b는 CHA와 PVA를 함유하는 PLA-PEG 및 PCL-PEG 나노 입자의 대표적인 궤적을 나타낸다. 도 1c와 도 1d는 전체 평균을 낸 기하 평균 제곱 변위(<MSD>)를 시간 척도의 함수로 나타내는 그래프이다. 도 1e와 도 1f는 1s의 시간 척도에서 개별적인 입자의 유효 확산도(Deff)의 로그 분포를 나타내는 그래프이다. 도 1g와 도 1h는 생리적인 30μm 두께의 점액층을 침투할 수 있는 입자의 시간의 경과에 따른 예상 분획을 나타내는 그래프이다. 데이터는 각 실험에서 추적된 ≥ 120개 나노 입자를 이용한 세 개의 독립적인 실험을 대표한다. 오차 바는 s.e.m으로 나타냈다. 이러한 데이터는 PVA를 이용하여 제조된 나노 입자의 고정화와, PLGA-PEG5k 나노 입자에 대해 측정된 값과 비슷한 유효 확산도와 함께, 저분자량의 유화제인 CHA를 이용하여 제조된 나노 입자의 빠른 점액 침투를 보여준다.
CVM에서 MPP의 수송 속도에 미치는 PEG 분자량의 영향을 도 2a와 도 2b에 나타내었다. 도 2a와 도 2b는 인간 자궁 경부 점액에서 MPP의 수송 속도에 미치는 PEG MW의 영향을 나타낸다. 도 2a는 전체 평균을 낸 기하 평균 제곱 변위(<MSD>)를 시간 척도의 함수로 나타낸 그래프이다. 도 2b는 1s의 시간 척도에서 개별적인 입자의 유효 확산도(Deff)의 로그의 분포를 나타내는 그래프이다. PLGA-PEG(6wt% PEG)를 이용하는 유화법으로 입자를 제조하였다. 데이터는 각 실험에서 추적된 ≥ 120개 나노 입자를 이용한 세 개의 독립적인 실험을 대표한다. 오차 바는 s.e.m으로 나타냈다. 이들 입자들은 모두 신속하게 점액을 침투했다(표 5도 참조).
나노 입자 표면 전하는 PEG MW에 반비례하였고, -18mV(1kDa) 내지 -2.3mV(10kDa)으로 다양했다. PEG MW가 증가함에 따라 1H NMR로 측정한 표면 PEG 밀도 [Γ](100nm2당 PEG의 수)는 감소했다. 그러나, 브러시 같은 PEG 코팅[Γ*]을 형성하는 데 필요한 이론적인 PEG 밀도에 대한 표면 PEG 밀도의 비율 [Γ/Γ*]은 PEG MW와는 관계없이 2를 초과하여(표 5), PLGA-PEG(1~10kDa)/CHA 나노 입자의 표면 위에 PEG의 조밀한 브러시 같은 코팅이 존재함을 나타냈다.
도 3a 내지 도 3c는 커큐민과 BSA가 부하된 MPP 및 종래의 입자(CP)의 수송 속도를 나타낸다. 도 3a는 전체 평균을 낸 기하 평균 제곱 변위<MSD>를 시간 척도의 함수로 나타낸 그래프이다. 도 3b는 1s의 시간 척도에서 개별적인 입자의 유효 확산도(Deff)의 로그 분포를 나타내는 그래프이다. 도 3c는 30μm 두께의 점액층을 침투할 수 있을 것으로 예상되는 입자의 시간의 경과에 따른 예상 분획을 나타내는 그래프이다. 데이터는 각 실험에서 추적된 ≥ 120개 나노 입자를 이용한 세 개의 독립적인 실험을 대표한다. 오차 바는 s.e.m으로 나타냈다. 커큐민 및 BSA가 부하된 나노 입자는 τ=1s에서의 물에서보다 각각 겨우 6배 및 36배 더 느린 속도로 점액에 빠르게 확산되었다(도 3a). 이와 대조적으로, PVA로 제조된 나노 입자는 CVM에 고정화되었고(도 3b), 수송 속도는 물에서보다 2,000배 더 느렸다.
PEG 코팅이 없는 PLGA 나노 입자는 점액 내에 완전히 고정화되었고, 확산도는 물에서 동일한 크기의 나노 입자의 확산도보다 38,000배 더 느렸다. 나노 입자 위의 PEG 표면의 존재는 매우 점탄성의 점액을 통한 확산을 상당히 향상시켰고, 6.5PEG/lOOnm2의 표면 PEG 밀도를 나타내는 PLGA-PEG3%는 142까지 증가된 Dw/Dm 값을 나타냈다. 10.4PEG/lOOnm2까지 표면 PEG 밀도를 더 증가시키면, PLGA-PEG5% 나노 입자는 물에서의 확산보다는 겨우 17배 더 느렸다. 표면 PEG 밀도가 16.4PEG/lOOnm2(PLGA-PEG8%)를 초과할 때, 90%를 초과하는 나노 입자들이 확산성을 나타냈다. 표면 PEG 밀도의 추가적인 증가는 점액 내에서 입자 확산도를 상당히 향상시키지 않을 가능성이 높은데, 16.4 PEG/lOOnm2의 표면 밀도는 이미 점액 구성성분의 결합을 효과적으로 차폐할 수 있기 때문이다. PLGA-PEG8%, 10% 및 25%의 대략 50~70% 나노 입자는 60분 이내에 생리적인 30μm 두께의 점액층을 침투할 수 있었고, PLGA-PEG5%,　PLGA-PEG3%(조밀한 코팅), PLGA-PEG2%(낮은 코팅) 및 PLGA(무 코팅)보다 훨씬 더 빠른 속도를 나타낸다.
실시예 6: 점액에서의 나노 입자의 안정성
재료 및 방법
입자와 점액 구성요소 사이의 부착성 상호 작용을 최소화함으로써 달성되는 점액에서의 나노 입자의 안정성은 생체 내에서 점액 침투 약물 전달체로서의 적용에 있어서 중요한 기준이 된다. 뮤신 존재 시 상이한 PEG 표면 밀도를 나타내는 나노 입자들의 안정성을 결정하기 위하여, 뮤신 결합의 지표로 뮤신 존재 하의 나노 입자 크기의 변화를 연구하였다. 뮤신은 점액의 주요한 구성요소이고, 소의 턱밑샘의 뮤신은 인간 CVM과 구조 및 생리적인 성질에서 유사성을 공유하므로, 소의 턱밑샘으로부터 추출된 뮤신을 뮤신 모델로 선택하였다.
나노 입자를 뮤신 용액(10mg/ml)으로 인큐베이션시키고, 시간 경과에 따른 입자 크기의 변화를 모니터링하였다.
결과
>16.4PEG/1OOnm2　의 PEG 표면 밀도를 나타내는 PLGA-PEG 나노 입자는 전체 3시간의 인큐베이션 기간 동안 수력학적 직경을 보유하는 뮤신 용액에서 안정적이었고, 이러한 PEG 표면 밀도에서, PEG 코팅은 고밀도의 브러시 형태였다([Γ]/[Γ*]>3). 이와 대조적으로, 6.5PEG/1OOnm2의 표면 밀도를 나타내는 PLGA-PEG5% 나노 입자는 심지어 5분 동안 뮤신 용액과 인큐베이션시킨 후 입자 직경이 대략 5% 증가하는 것으로 나타났고, 이러한 PLGA-PEG5% 나노 입자 상의 PEG 표면 밀도는 벌써 브러시의 PEG 코팅을 초래하였다([Γ]/[Γ*]>1). 따라서, 브러시 PEG 코팅만으로는 뮤신 결합을 완벽하게 차단하기에 충분하지 않다. 브러시 형태로부터 버섯 형태로의 감소된 PEG 표면 밀도와 함께, 입자 크기의 점진적인 증가가 있었다. PEG 코팅 없이 PLGA 나노 입자는 뮤신에서 5분 이내의 인큐베이션 시 109±2nm 내지 207±9nm의 극적인 크기 증가를 나타냈다.
도 4의 A는 나노 입자의 점액 침투에 미치는 표면 PEG 피복범위([Γ/Γ*])의 영향을 나타내는 개요도이다. 위의 패널은 증가하는 피복범위에서 표면 PEG 코팅이 있는 PLGA-PEG 나노 입자의 침투를 나타낸다. 표면 PEG 피복범위가 증가함에 따라, PEG 형태는 버섯형(이웃하는 PEG 사슬이 겹치지 않음, [Γ/Γ*]＜1, 도 4의 A)에서 브러시형(이웃하는 PEG 사슬이 겹침, 1＜[Γ/Γ*]＜3, 도 4의 B), 조밀한 브러시형([Γ/Γ*]＞3, 도 4의 C)으로 바뀐다. 중간 패널은 PEG 피복범위가 어떻게 점액 노출 후의 점막 부착성 상호 작용을 결정하는지를 보여준다. 낮은 PEG 피복범위([Γ/Γ*]＜1)에서, 뮤신 섬유는 나노 입자 코어에 강력하게 부착된다. 중간 PEG 피복범위(1＜[Γ/Γ*]＜3)에서, 뮤신 섬유는 아직도 나노 입자 코어에 부분적으로 흡수될 수 있다. 높은 ([Γ/Γ*]＞3) PEG 피복범위에서, 나노 입자 코어는 완전히 생물학적으로 비활성인 PEG 코로나로 차폐되어, 나노 입자로 뮤신이 전혀 흡수되지 않는다. 하부 패널은 낮은 PEG 피복범위를 나타내는 나노 입자가 점액에 고정화되고, 중간 PEG 피복범위를 나타내는 나노 입자는 저지당하거나 심지어 점액에 고정화되고, 높은 그리고 매우 높은 PEG 피복범위를 나타내는 입자는 신속하게 점액을 침투할 수 있음을 보여준다.

Claims (29)

  1. 하나 또는 하나 이상의 코어 고분자, 하나 또는 하나 이상의 표면 개질 물질, 및 하나 또는 하나 이상의 저분자량의 유화제의 유화에 의해 형성된 나노 입자.
  2. 제1항에 있어서, 표면 개질 물질은 인 나노 입자.
  3. 제1항에 있어서, 코어 고분자 및 표면 개질 물질은 별개의 구성성분인 나노 입자.
  4. 제1항에 있어서, 표면 개질 물질은 코어 고분자에 공유적으로 결합되는 나노 입자.
  5. 제3항에 있어서, 코어 고분자는 표면 개질 물질의 하나 또는 하나 이상의 블록을 함유하는 블록 공중합체인 나노 입자.
  6. 제4항에 있어서, 코어 고분자는 코어 고분자의 일측에 공유적으로 결합된 표면 개질 물질의 단일 블록을 포함하는 나노 입자.
  7. 제1항, 제3항, 제4항, 또는 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 코어 고분자는 표면 개질 물질에 공유적으로 결합되지 않은 하나 또는 하나 이상의 고분자를 더 포함하는 나노 입자.
  8. 제6항에 있어서, 표면 개질 물질에 공유적으로 결합되지 않은 하나 또는 하나 이상의 고분자는 하나 또는 하나 이상의 코어 고분자와 동일한 화학적 조성을 나타내는 나노 입자.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 개질 물질은 폴리에틸렌 글리콜인 나노 입자.
  10. 제8항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 약 1kD 내지 약 10kD, 바람직하게는 약 1kD 내지 약 5kD, 더욱 바람직하게는 약 5kD인 나노 입자.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜의 밀도는 1H NMR로 측정시 약 1 내지 약 100개 사슬/nm2, 바람직하게는 약 1 내지 약 50개 사슬/nm2, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 50개 사슬/nm2, 가장 바람직하게는 약 5 내지 약 25개 사슬/nm2인 나노 입자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 하나 이상의 유화제의 분자량은 1500, 1300, 1200, 1000, 800, 600, 또는 500amu 미만인 나노 입자.
  13. 제12항에 있어서, 하나 또는 하나 이상의 유화제는 중성, 양전하성, 음전하성, 또는 이의 조합인 나노 입자.
  14. 제13항에 있어서, 하나 또는 하나 이상의 저분자량의 유화제는 콜산 나트륨염, 디옥틸 설포석신산염 나트륨, 헥사데실트리메틸 암모늄 브롬화물, 사포닌, 트윈(TWEEN) 20, 트윈 80, 및 당 에스테르로 이루어지는 군으로부터 선택된 나노 입자.
  15. 제13항에 있어서, 하나 또는 하나 이상의 표면 개질 물질은 하나 또는 하나 이상의 유화제가 전하를 띨 때 입자의 표면 전하를 중성 또는 필수적으로 중성이 되게 하는 데 효과적인 양으로 존재하는 나노 입자.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 하나 이상의 유화제는 적어도 약 50%, 바람직하게는 적어도 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 95%의 유화 용량을 나타내는 나노 입자.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 하나 이상의 치료제, 예방제, 또는 진단제를 더 포함하는 나노 입자.
  18. 제1항 내지 제17항 중 임의의 나노 입자 및 하나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  19. 하나 또는 하나 이상의 치료제, 예방제, 및/또는 진단제를 필요로 하는 환자에 투여하는 방법으로, 이때, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 입자를 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 입자는 장 내로, 비경구로, 또는 국소적으로 투여되는 방법.
  21. 하나 또는 하나 이상의 치료제, 예방제, 및/또는 진단제를 필요로 하는 환자에 투여하는 방법으로, 이때, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 입자를 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 입자는 비경구로 투여되는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 입자는 정맥 내, 피하, 근육 내, 또는 복강 내 주사로 투여되는 방법.
  24. 제22항에 있어서, 입자는 결막 하로 투여되는 방법.
  25. 제21항에 있어서, 입자는 국소적으로 투여되는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 입자는 안구에 또는 그의 구획에 국소적으로 적용되는 방법.
  27. 제25항에 있어서, 입자는 폐관, 비강 내, 질 내, 직장 내, 또는 협측으로 투여되는 방법.
  28. 제1항 내지 제17항 중 임의의 한 항의 입자의 제조 방법으로, 유기 용매에 하나 또는 하나 이상의 코어 고분자를 용해시키는 단계, 하나 또는 하나 이상의 코어 고분자의 용액을 유화제의 수성 용액 또는 현탁액에 첨가하여 유화액을 형성하는 단계, 및 유화액을 유화제의 제2의 용액 또는 현탁액에 첨가하여 나노 입자의 형성을 가져오는 단계를 포함하는 방법.
  29. 제28항의 방법으로부터 제조되는 나노 입자.
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Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011106702A2 (en) 2010-02-25 2011-09-01 The Johns Hopkins University Sustained delivery of therapeutic agents to an eye compartment
US10307372B2 (en) 2010-09-10 2019-06-04 The Johns Hopkins University Rapid diffusion of large polymeric nanoparticles in the mammalian brain
WO2012109363A2 (en) 2011-02-08 2012-08-16 The Johns Hopkins University Mucus penetrating gene carriers
RU2631599C2 (ru) * 2011-12-14 2017-09-25 Дзе Джонс Хопкинс Юниверсити Наночастицы, легче проникающие в слизистую оболочку или вызывающие меньше воспаления
WO2013138346A1 (en) 2012-03-16 2013-09-19 The Johns Hopkins University Non-linear multiblock copolymer-drug conjugates for the delivery of active agents
AU2013232297B2 (en) 2012-03-16 2016-01-14 The Johns Hopkins University Controlled release formulations for the delivery of HIF-1 inhibitors
WO2013166408A1 (en) 2012-05-03 2013-11-07 Kala Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical nanoparticles showing improved mucosal transport
US9827191B2 (en) 2012-05-03 2017-11-28 The Johns Hopkins University Compositions and methods for ophthalmic and/or other applications
US11596599B2 (en) 2012-05-03 2023-03-07 The Johns Hopkins University Compositions and methods for ophthalmic and/or other applications
EP4008355A1 (en) 2012-05-03 2022-06-08 Kala Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical nanoparticles showing improved mucosal transport
EP2849728A1 (en) 2012-05-04 2015-03-25 The Johns Hopkins University Lipid-based drug carriers for rapid penetration through mucus linings
US10568975B2 (en) 2013-02-05 2020-02-25 The Johns Hopkins University Nanoparticles for magnetic resonance imaging tracking and methods of making and using thereof
AU2014216178B2 (en) 2013-02-15 2018-06-28 KALA BIO, Inc. Therapeutic compounds and uses thereof
ES2831625T3 (es) 2013-02-20 2021-06-09 Kala Pharmaceuticals Inc Compuestos terapéuticos y sus usos
US9688688B2 (en) 2013-02-20 2017-06-27 Kala Pharmaceuticals, Inc. Crystalline forms of 4-((4-((4-fluoro-2-methyl-1H-indol-5-yl)oxy)-6-methoxyquinazolin-7-yl)oxy)-1-(2-oxa-7-azaspiro[3.5]nonan-7-yl)butan-1-one and uses thereof
BR112015032277B1 (pt) * 2013-06-24 2020-12-01 Neximmune complexo de apresentação de antígeno, seu uso, e composição
EP3027111A4 (en) * 2013-07-30 2017-08-23 Tarveda Therapeutics, Inc. Nanoparticle diagnostic and methods for treating disease
US9890173B2 (en) 2013-11-01 2018-02-13 Kala Pharmaceuticals, Inc. Crystalline forms of therapeutic compounds and uses thereof
JP6426194B2 (ja) 2013-11-01 2018-11-21 カラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 治療用化合物の結晶形態及びその使用
WO2015175545A1 (en) 2014-05-12 2015-11-19 The Johns Hopkins University Highly stable biodegradable gene vector platforms for overcoming biological barriers
CN107072962A (zh) * 2014-07-03 2017-08-18 辉瑞公司 靶向治疗性纳米颗粒以及其制备和使用方法
US10660861B2 (en) 2014-07-09 2020-05-26 The Johns Hopkins University Glutaminase inhibitor discovery and nanoparticle-enhanced delivery for cancer therapy
JP6882186B2 (ja) 2014-12-15 2021-06-02 ザ ジョーンズ ホプキンズ ユニバーシティＴｈｅ Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ スニチニブ製剤及び眼の障害の治療におけるその使用に対する方法
CN116869964A (zh) 2014-12-24 2023-10-13 耐克西缪恩有限公司 用于免疫疗法的纳米颗粒组合物和方法
EP3250184A1 (en) 2015-01-27 2017-12-06 The Johns Hopkins University Hypotonic hydrogel formulations for enhanced transport of active agents at mucosal surfaces
CN105412935B (zh) * 2015-02-04 2019-02-19 四川大学 一种基于n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺聚合物的纳米粒及其制备方法
CN104784116B (zh) * 2015-04-15 2017-05-24 武汉诺贝药业有限公司 一种n‑乙酰半胱氨酸口服制剂
EP3307324B1 (en) * 2015-06-15 2022-02-09 Innovitas Vitae S.r.l. Food supplement for use in a process of metabolic rebalancing
ES2908479T3 (es) 2015-08-26 2022-04-29 Achillion Pharmaceuticals Inc Compuestos para el tratamiento de trastornos inmunitarios e inflamatorios
AR106018A1 (es) 2015-08-26 2017-12-06 Achillion Pharmaceuticals Inc Compuestos de arilo, heteroarilo y heterocíclicos para el tratamiento de trastornos médicos
BR112018005589A2 (pt) 2015-09-22 2018-10-09 Graybug Vision Inc “composto, composição farmaceuticamente aceitável, e, uso de um composto”
WO2017075565A1 (en) * 2015-10-30 2017-05-04 The Johns Hopkins University Mucus penetrating particles with high molecular weight and dense coatings
BR112018009644A2 (pt) 2015-11-12 2018-11-06 Graybug Vision Inc micropartículas agregantes sólidas modificadas na superfície, material injetável, processo para preparação de micropartículas agregantes sólidas modificadas na superfície, método para tratamento de um distúrbio ocular, e, uso de micropartículas agregantes sólidas modificadas na superfície
RU2018145364A (ru) 2016-06-27 2020-07-28 Ачиллион Фармасьютикалс, Инк. Хиназолиновые и индольные соединения для лечения медицинских нарушений
US10392399B2 (en) 2016-09-08 2019-08-27 Kala Pharmaceuticals, Inc. Crystalline forms of therapeutic compounds and uses thereof
EP3509422A4 (en) 2016-09-08 2020-05-20 Kala Pharmaceuticals, Inc. CRYSTALLINE FORMS OF THERAPEUTIC COMPOUNDS AND USES THEREOF
BR112019004463A2 (pt) 2016-09-08 2019-05-28 Kala Pharmaceuticals Inc formas cristalinas de compostos terapêuticos, seus processos de obtenção e seus métodos de uso
EP3295937A1 (en) * 2016-09-20 2018-03-21 Centre National De La Recherche Scientifique Nanoparticulate prodrugs
WO2018169960A1 (en) 2017-03-17 2018-09-20 The Johns Hopkins University Nanoparticle formulations for enhanced drug delivery to the bladder
RU2019133337A (ru) 2017-03-23 2021-04-23 Грейбуг Вижн, Инк. Лекарственные средства и композиции для лечения глазных нарушений
AU2018265415A1 (en) 2017-05-10 2019-10-31 Graybug Vision, Inc. Extended release microparticles and suspensions thereof for medical therapy
JP2021535112A (ja) 2018-08-20 2021-12-16 アキリオン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド 補体ｄ因子の医学的障害の治療のための医薬化合物
EP3866773A4 (en) 2018-10-16 2022-10-26 Georgia State University Research Foundation, Inc. CARBON MONOXIDE PRODRUGS FOR THE TREATMENT OF MEDICAL CONDITIONS
US10420731B1 (en) * 2019-01-18 2019-09-24 King Saud University Method of synthesizing lignin-based nanocompositions
WO2021050568A1 (en) * 2019-09-09 2021-03-18 Yale University Nanoparticles for selective tissue or cellular uptake
WO2021158937A1 (en) * 2020-02-05 2021-08-12 The Johns Hopkins University Bortezomib-loaded nanoparticles
WO2022155261A1 (en) * 2021-01-12 2022-07-21 Loria Pharmaceutical, Llc Multiple viscosity oil-in-water composition useful as an injectable filler and a scaffold for collagen growth
CN112915916B (zh) * 2021-01-29 2022-05-24 江南大学 一种pH刺激响应型胆汁盐Pickering复合乳化剂
CN114983976B (zh) * 2022-06-23 2023-07-25 浙江工业大学 一种紫杉醇纳米制剂及其制备方法和应用

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU531759B2 (en) 1978-04-17 1983-09-08 Ici Ltd. Electrostatic spraying
GB8504253D0 (en) 1985-02-19 1985-03-20 Ici Plc Electrostatic spraying apparatus
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5019400A (en) 1989-05-01 1991-05-28 Enzytech, Inc. Very low temperature casting of controlled release microspheres
US7052678B2 (en) 1997-09-15 2006-05-30 Massachusetts Institute Of Technology Particles for inhalation having sustained release properties
US6509323B1 (en) 1998-07-01 2003-01-21 California Institute Of Technology Linear cyclodextrin copolymers
US20040253243A1 (en) * 2003-01-21 2004-12-16 David Epstein Aptamer therapeutics useful in ocular pharmacotherapy
JP2006528701A (ja) * 2003-05-20 2006-12-21 エリモス・ファーマスーティカルズ・エルエルシー 疾患の治療のためのカテコールブタンの投与のための方法と組成物
EP1713514B1 (en) * 2004-01-28 2021-11-24 Johns Hopkins University Drugs and gene carrier particles that rapidly move through mucous barriers
US8658608B2 (en) 2005-11-23 2014-02-25 Yale University Modified triple-helix forming oligonucleotides for targeted mutagenesis
JP5131971B2 (ja) * 2005-12-26 2013-01-30 株式会社Ｌｔｔバイオファーマ 水溶性非ペプチド性低分子薬物含有ナノ粒子
JP2008053276A (ja) 2006-08-22 2008-03-06 Nec Electronics Corp 半導体装置の製造方法
EP2061433B1 (en) * 2006-09-08 2011-02-16 Johns Hopkins University Compositions for enhancing transport through mucus
EP2156848A4 (en) * 2007-05-14 2012-11-28 Ltt Bio Pharma Co Ltd NANOPARTICLE CONTAINING A LOW MOLECULAR WEIGHT DRUG HAVING A NEGATIVELY PROLONGED RELEASE GROUP
EP2106806A1 (en) * 2008-03-31 2009-10-07 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der Angewandten Forschung e.V. Nanoparticles for targeted delivery of active agents to the lung
PT2774608T (pt) * 2008-06-16 2020-01-17 Pfizer Nanopartículas poliméricas carregadas com fármaco e métodos de produção e utilização das mesmas
WO2011133803A1 (en) 2010-04-21 2011-10-27 Helix Therapeutics, Inc. Compositions and methods for targeted inactivation of hiv cell surface receptors
CA3054532C (en) * 2010-11-05 2022-07-12 The Johns Hopkins University Compositions and methods relating to reduced mucoadhesion
RU2631599C2 (ru) * 2011-12-14 2017-09-25 Дзе Джонс Хопкинс Юниверсити Наночастицы, легче проникающие в слизистую оболочку или вызывающие меньше воспаления
CN104936620B (zh) * 2012-01-19 2019-08-09 约翰霍普金斯大学 增强粘膜渗透的纳米粒子调配物
WO2017075565A1 (en) * 2015-10-30 2017-05-04 The Johns Hopkins University Mucus penetrating particles with high molecular weight and dense coatings

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EP2790733A2 (en) 2014-10-22

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Wang et al. Materials Today Bio
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