KR20140134738A

KR20140134738A - 글리코프로테인을 함유하는 탈모 방지 및 발모 증진용 조성물

Info

Publication number: KR20140134738A
Application number: KR20130048194A
Authority: KR
Inventors: 이성현; 이찬우; 진세은; 김민지
Original assignee: 주식회사 두래
Priority date: 2013-04-30
Filing date: 2013-04-30
Publication date: 2014-11-25

Abstract

본 발명은 글리코프로테인을 함유하는 화장품 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 글리코프로테인을 함유함으로써 우수한 항산화, 항노화, 피부 미백, 피부 재생 및 항염 효과를 제공할 수 있는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

Description

글리코프로테인을 함유하는 탈모 방지 및 발모 증진용 조성물{Composition for preventing baldness and promoting hair growth comprising glycoprotein}

본 발명은 식물성 글리코프로테인을 함유하는 탈모 방지 및 발모 개선용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 상기 식물성 글리코프로테인을 함유함으로써 모유두 세포 배양과 성장 관련 인자들의 발현을 증가시켜 우수한 탈모 방지 효과와 발모 증진 효과를 제공하는 조성물에 관한 것이다.

최근 외모를 중시하는 현상이 늘어가면서, 외모를 결정하는 중요한 요인 중 하나인 탈모에 대한 관심이 증가하고 있다. 탈모의 원인으로는 혈액순환 불량설, 남성호르몬 작용 과잉설, 과산화물, 세균 등에 의한 두피 기능 저하설, 유전적 요인, 노화, 스트레스(Paus et al., Allergo. J., 9, pp611-620, 2000; Botchkarev et al., Am J. Pathol., 162, pp709-712, 2003; Aoki et al., Exp. Dermatol., 12, pp371-377, 2003) 등이 논의되어 왔었다. 그러나 현재까지 탈모에 관한 명확한 원인은 밝혀져 있지 않으며, 최근 들어 식생활의 변화, 사회환경 등에 의한 스트레스의 증가 등으로 탈모로 고민하는 인구가 늘어나고 있는 추세이고 그 연령 또한 낮아지고 있으며, 여성의 탈모 인구도 늘어나고 있는 실정이다.

모낭(Hair follicle)은 매우 복잡한 기관으로 내모근초(Inner root sheath, IRS), 외모근초(Outer root sheath, ORS), 모간(Hair shaft)과 모기질(Hair matrix) 세포 등으로 구성된다(Paus et al., J. Invest. Dermatol., 113, pp523-532, 1999). 모낭을 형성하는 세포들 중 모유두(Dermalpapilla) 세포는 모낭의 형태형성 및 성장주기 조절과 같은 모발 성장에서 중요한 역할을 한다(Oliver RF, J. Embryol. Exp. Morphol., 15, pp331-347,1966; Ferraris et al., Exp.cell Res., 10, pp37-46, 1997; Jahoda et al., Nat.prod.rep., 311, pp560-562, 1984).

모낭은 배아가 형성(Embryogenesis)되는 동안에 간엽-상피성(Mesenchymal-Epithelial) 사이의 상호작용을 통해서 발달한다. 정상적인 모발의 성장은 성장기(Anagen), 퇴행기(Catagen) 그리고 휴지기(Telogen)의 주기에 따라서 이루어진다(Chase et al., Physiol. Rev., 124(4), pp686-694, 1954; Kligman et al., J. Invest. Dermatol., 33, pp307-316, 1959; Paus et al., N. Engl. J. Med., 341, pp491-497, 1999). 성장기에는 모유두를 둘러싸고 있는 기질의 각질세포를 포함한 모낭을 구성하는 세포들이 증식하여 모발이 성장하고, 퇴행기의 모낭은 세포사멸(Apoptosis)(Soma et al., J.Invest. Dermatol., 6, pp948-954, 1998), 모유두의 응축(Condensation) 및 세포외기질(Extracellular matrix)의 재구성이 일어나(Paus et al., J. Invest. Dermatol., 113, pp523-532, 1999) 세포분열이 정지하며 모발의 성장이 느려져 천천히 성장한다. 휴지기의 모낭은 새로운 성장기로 되돌아가기 위해 성장이 정지된 상태로 모낭의 융기 부위(Bulge region)를 포함하여 영구적으로 지속되는 부분만 남고 빠지게 된다(Hardy MH., Trends in Genet., 8, pp55-61, 1992). 즉, 휴지기를 지나는 성장기 초반에 모낭으로부터 새로운 모발이 성장되고 새 모발은 휴지기에 들어간 오래된 모발을 위로 밀어 올려서 자연 탈모시키는 과정을 통해 머리가 빠지고 새 머리가 나게 된다.

모낭의 형태형성과 성장에는 종양괴사인자(Tumour Necrosis Factor-α, TNF-α), 인터류킨-1α(Interleukin-1α, IL-1α), 인터류킨-1β(Interleukin-1β, IL-1β), 인터페론-γ(Interferon-γ, IFN-γ), 섬유아세포 성장인자(Fibroblast Growth Factor-5, FGF5), 간세포 성장인자(Hepatocyte Growth Factor, HGF), 혈관내피 성장인자(Vascular Epitherial Growth Factor, VEGF), 인슐린유사성장인자-I(Insulin like Growth Factor-I, IGF-I), 인슐린유사성장인자-II(Insulin-like Growth Factor-II, IGF-II) 및 표피성장인자 수용체(Epithelial Grwoth Factor Receptor, EGFR)와 같은 많은 종류의 사이토카인(Cytokine) 및 성장인자들이 관여한다(Stenn et al., Physiol. Rev., 81, pp449-494, 2001). TNF-α는 기질세포에서 세포 사멸을 증가시키고 모간의 연장(Elongation)을 억제하며(Petho Schramm et al., Arch. Dermatol. Res., 288 pp264-266, 1996; Soma et. al., J. Invest. Dermatol., 111, pp948-954, 1998), IL-1α와 IL-1β 역시 모낭의 성장을 억제한다(Harmon et al., Lymphokine Cytokine Res., 12, pp197-203, 1993; Mahe et al., Skin Pharmacol., 9(6), pp366-375, 1996; Philpott et al., Br. J. Dermatol., 135, pp942-948, 1996; Xiong et al., J. Interferon Cytokine Res., 17, pp151-157, 1997). IFN-γ는 과발현 시 탈모를 유발하고(Carroll et al., J. Invest. Dermatol., 708(4), pp412-422, 1997), FGF5는 래트(rat)의 모낭에서 퇴행기를 유도(Hebert et al., Cell, 78, pp1017-1025, 1994)하는 반면, HGF(Jindo et al., J. Invest. Dermatol., 103, pp306-309, 1994; Jindo et al., J. Invest. Dermatol., 110, pp338-342, 1998)와 VEGF(Yano et al., Cell Technol., 20, pp852-853, 2001; Yano et al., J. Clin. Invest., 107, pp409-417, 2001)는 모낭 성장을 촉진한다. 또한 IGF-I과 IGF-II는 인슐린 없이 모낭을 배양할 때 농도 의존적으로 모낭의 성장을 촉진하며(Pilpott et al., J. Invest. Dermatol., 102, pp857-861, 1994), EGF-수용체(EGF-receptor)가 제거된 유전자이식(Transgenic) 마우스의 경우 세포 괴사(Necrosis)가 일어나 모낭이 사라진다고 보고된 바 있다(Murillas et al., EMBO J., 1;1(21), pp5216-5223, 1995).

TGF-β는 성장, 분화 및 형태형성과 같은 다양한 과정을 조절하는 사이토카인(Cytokines)으로 잘 알려져 있다(Massague et al., Cancer Surv., 12, pp81-103, 1992). TGF-β는 포유류에서 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3의 3 가지 형태로 나뉘는데(Roberts et al., Heidelberg, Springer-Verlag., pp419-472, 1990), 최근에 성장기 및 퇴행기 모낭에서 세 가지 TGF-β의 발현 위치가 보고 된 바 있다. TGF-β1은 사람의 성장기 모낭의 모소피(Hair cuticle)와 결합조직초(Connective tissue sheath)에서, TGF-β2는 성장기 후기에 외모근초의 가장 바깥쪽의 세포층에서, TGF-β3는 각화된 기질세포에서 발견되었다(Soma et al., J. Invest. Dermatol., 118, pp993-997, 2002). 이 중 TGF-β2에 대한 연구가 가장 활발하며 모낭에 TGF-β2를 처리하여 배양할 경우, 외모근초 세포 및 발아의 기질(Germinative matrix) 세포 하단에서 세포사멸을 유도하는 카스파아제-3(Caspase-3) 및 카스파아제-9(Caspase-9)가 활성화 된다고 보고된 바 있다(Kumar et al., Cell Death Differ., 6, pp1060-1066, 1999; Tsuji et al., JID Symposium. Proceedings., 8, pp 65-68, 2003). 또한 위와 동일하게 TGF-β2를 처리한 모낭을 배양하였을 때, 티미딘의 핵 내 유입(Thymidine incorporation)이 억제되었고 TGF-β2 농도에 의존적으로 모낭의 길이 증가가 억제되었다(Soma et al., J. Invest. Dermatol., 111, pp948-954, 1998). 반면 TGF-β 길항제(TGF-β antagonist)인 페튜인(Fetuin)은 모낭의 길이를 증가시킨다고 보고된다. 따라서, TGF-β2는 모낭의 퇴행기를 유도하고 모낭 성장을 억제하는 중요한 역할을 한다고 생각되고 있다(Soma et al., J. Invest Dermatol., 118, pp993-997, 2002).

모낭의 성장을 저해하는 인자를 억제하기 위해 생약성분의 추출물을 이용하여 두피에 바르거나 복용함으로써 보다 부작용이 적게 발모를 촉진시키려는 시도 또한 많이 있었다. 난초과 식물의 추출물을 이용하는 경우(대한민국특허 제0157667호), 웅지와 만형자를 이용하는 경우(대한민국 특허 제0161338호), 만병초 엑기스를 유효성분으로 사용하는 경우(한국특허공개 제91-106호) 및 소나무잎 추출물을 이용한 발모촉진제(한국특허공개 제96-40346호) 등이 공개된 바 있다. 그러나 그 효과가 일시적이거나 또는 단편적인 약리학적 기작만을 사용하는 등 그 작용 원리가 명확하지 않아, 효과가 뚜렷하고 비교적 부작용이 적은 탈모 방지제의 개발이 꾸준히 요구되고 있는 실정이다. 특히 효능 및 부작용 측면에서 볼 때, 고래로부터 임상적 경험이 풍부하고 안전성 측면에서 탁월한 평가를 받고 있는 천연물 제제의 경우, 탈모 치료제로의 개발 가능성은 한층 더 풍부할 것으로 사료된다.

상기와 같이 탈모방지 및 모발생성에 도움을 주는 식물성 추출물의 개발은 많이 있었으나, 식물성 글리코프로테인을 이용한 탈모방지 및 발모개선 관련 개발은 시도한 적이 없었다.

이에 본 발명자들은 고삼, 녹차, 단삼, 샨카푸쉬피, 에리카철쭉, 차가, 폭죽초, 한련초 및 홍경천으로 이루어진 군에서 선택되는 원재료로부터 추출한 글리코프로테인을 유효성분으로 사용할 경우 탈모 방지와 발모 개선 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 고삼, 녹차, 단삼, 샨카푸쉬피, 에리카철쭉, 차가, 폭죽초, 한련초 및 홍경천으로 이루어진 군에서 선택되는 원재료로부터 추출한 글리코프로테인을 유효성분으로 함유하여 피부에 흡수가 빠르고 부작용이 없으며, 우수한 탈모 방지 및 육모 증진 효과 나타내는 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고삼, 녹차, 단삼, 샨카푸쉬피, 에리카철쭉, 차가, 폭죽초, 한련초 및 홍경천으로 이루어진 군에서 선택되는 원재료로부터 추출한 글리코프로테인을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 고삼, 녹차, 단삼, 샨카푸쉬피, 에리카철쭉, 차가, 폭죽초, 한련초 및 홍경천으로 이루어진 군에서 선택되는 원재료로부터 추출한 글리코프로테인을 유효성분으로 함유하는 육모 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 고삼, 녹차, 단삼, 샨카푸쉬피, 에리카철쭉, 차가, 폭죽초, 한련초 및 홍경천으로 이루어진 군에서 선택되는 원재료로부터 추출한 글리코프로테인을 유효성분으로 함유함으로써 독성이 없어 부작용이 적으며 모유두 세포 증식 효능이 우수하고 모낭 퇴행기 이행을 촉진하는 TGF-β2 유전자 발현을 억제하여 TGF-?2 단백질 발현을 억제하기 때문에 우수한 육모 증진효과와 탈모 방지 효과를 제공할 수 있다. 단백질 및 우수한 항산화력을 통하여 피부 노화 방지 효과를 나타내며, 또한 뛰어난 피부 재생, 미백, 항염의 피부 상태 개선 효과를 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 원재료로부터 일반 추출물과 글리코프로테인의 추출 방법을 나타낸 흐름도이다.
도 2은 글리코프로테인이 TGF-β2 단백질 발현에 미치는 효과를 나타낸 결과이다.

본 발명에 따른 조성물은 고삼, 녹차, 단삼, 샨카푸쉬피, 에리카철쭉, 차가, 폭죽초, 한련초 및 홍경천으로 이루어진 군에서 선택되는 원료부터 추출한 식물성 글리코프로테인을 유효성분으로 함유한다.

본 발명에서 사용하는 고삼(Sophora flavescens Aiton)은 콩과 초본으로 너삼 또는 도둑놈의지팡이라고도 한다. 본 발명에서는 상기 고삼의 잎, 줄기, 뿌리, 열매, 꽃 등 식물 전체 또는 일부를 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 녹차는 차나무(Camellia sinensis)를 의미하여 본 발명에서는 상기 차나무의 잎, 줄기, 뿌리, 열매, 꽃 등 전체 또는 일부를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 상기 차나무의 잎을 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge)은 꿀풀과에 속하는 다년생 초본으로 본 발명에서는 상기 단삼의 잎, 줄기, 뿌리, 열매, 꽃 등 전체 또는 일부를 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 샨카푸쉬피(Convolvulus pluricaulis)는 우울증 치료제로 사용되는 식물로서 본 발명에서는 상기 샨카푸쉬피의 잎, 줄기, 뿌리, 열매, 꽃 등 전체 또는 일부를 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 에리카철쭉(Erica multiflora)은 진달래과의 식물로 본 발명에서는 상기 에리카철쭉의 잎, 줄기, 뿌리, 열매, 꽃 등 전체 또는 일부를 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 차가(Inonotus Obliquus)는 자작나무에 기생하는 버섯으로, 주로 북위 45도 이상인 시베리아, 북아메리카, 북유럽 등의 지방에서 발견된다.

본 발명에서 사용하는 폭죽초(Russelia equisetiformis)는 현삼과 소관목으로서, 본 발명에서는 상기 폭죽초의 잎, 줄기, 뿌리, 열매, 꽃 등 전체 또는 일부를 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 한련초(Eclipta prostrata L.)는 국화과 1년생 초본으로, 본 발명에서는 상기 한련초의 잎, 줄기, 뿌리, 열매, 꽃 등 전체 또는 일부를 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 홍경천(Rhodiola rosea)은 북유럽, 아시아의 산간지역에 자생하는 돌나물과의 여러해살이풀로서, 바위돌꽃이라고도 한다. 본 발명에서는 상기 홍경천의 잎, 줄기, 뿌리, 열매, 꽃 등 전체 또는 일부를 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 식물성 글리코프로테인이란 식물 세포에서 1차 세포벽에 존재하면서 식물이 성장하거나 세포벽이 손상되는 경우 세포벽을 보호하는 당단백질을 의미한다. 이러한 식물성 글리코프로테인은 중요한 천연 보습 인자로서 작용하며, 동물성 콜라겐보다 더 많은 양의 당을 함유하고 있어 사용성이 편리하고, 저분자량이므로 피부에 잘 흡수된다. 또한, 생물학적 물질인 아미노산으로 구성되어 있어 피부에 안전하게 흡수되면서 직접 아미노산을 제공할 수 있다. 이러한 식물성 글리코프로테인은 추출하는 원료(식물 등의 종류)에 따라 상이한 효능을 가지는 특징이 있다.

본 발명에 따른 식물성 글리코프로테인의 제조 방법은 공지의 방법을 사용하는 것이 가능하다. 예를 들면, 상기 원료를 자연건조 또는 강제건조 등 임의의 방법으로 건조하여 잘게 분쇄 한 후 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 아세톤 등의 극성용매; 에테르, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 등의 비극성 용매; 상기 비극성용매와 극성용매의 혼합용매; 알칼리수 등의 용매, 또는 콩기름, 참기름 등의 식물유 등을 사용하여 냉침, 페르콜레이션(percolation), 온침, 열수추출 등의 임의의 방법에 의해서 침출 처리하여 유효성분을 함유한 침출물을 얻을 수 있다. 상기 침출 처리는 냉침과 페르콜레이션(percolation)의 경우 12~96시간 정도, 온침의 경우는 사용하는 용매 등의 종류와 온도에 상이하나, 적합하게는 용매의 환류 온도에 가까운 온도로 0.5~24시간 정도 수행하는 것이 바람직하다. 그 다음, 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 여액을 효소 처리하여 가수분해 함으로써 저분자량화한 후, 이를 감압 농축하여 글리코프로테인을 얻을 수 있다. 이와 같이 용매를 이용하여 추출물을 얻은 이후 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 상온에서 냉침, 가열 및 여과하여 액상물을 얻을 수 있으며, 또는 추가로 용매를 증발, 분무 건조 또는 동결 건조할 수 있다.

상기 가수분해에 사용하는 효소는 예를 들어 α-아밀라아제, β-아밀라아제, 글루코-아밀라아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 펙티나아제 또는 이들의 혼합 효소를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 식물성 글리코프로테인은 가수분해를 통해 저분자량화 하기 때문에 때문에 피부에 용이하게 흡수된다.

본 발명에 따른 조성물은 상기 식물성 글리코프로테인을 조성물 총 중량에 대하여 0.01~5중량%, 바람직하게는 0.01~3중량%의 양으로 함유할 수 있다. 상기 글리코프로테인의 함량이 0.01중량% 미만이면 추출물의 사용에 따른 효과가 미미하고, 5중량%를 초과하면 피부 안정성 또는 제형상의 문제점이 생기게 된다.

본 발명에 따른 식물성 글리코프로테인은 모유두 세포 분화와 탈모방지 및 발모개선과 관련된 연구를 수행하는 과정에서 식물성 글리코프로테인이 모유두 세포 분화를 촉진하는 기능이 있음을 최초로 발견하였다. 상기 식물성 글리코프로테인이 모유두 세포 사멸과 밀접하게 관련 되어있는 TGF-β2 인자의 유전자 발현과 단백질 발현을 억제함을 확인하였고, 이를 통해 상기 식물성 글리코프로테인을 유효성분으로 함유하여 탈모방지 및 육모 증진 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 탈모 및 육모 증진용 조성물로서 사용될 수 있는데, 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없다. 예를 들면, 염모제, 샴푸, 린스, 등의 화장품 조성물 또는 연고, 겔 등의 약학 조성물로 제형화 될 수 있다.

이하, 실시예 및 시험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 시험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.

[제조예 1] 일반 고삼 추출물의 제조

건조된 고삼 전체 1 kg를 분쇄하여 증류수 10 kg 가한 후 80~90 ℃에서 20시간 동안 열수 추출한다. 얻어진 추출물을 원심분리 후, 상등액을 분리하여 이를 감압농축하고, 용매를 증류 제거하여 약 86 g의 고형분을 얻었다.

[제조예 2] 일반 녹차 추출물의 제조

건조된 차잎 1kg을 사용하여 제조예 1과 동일한 방법으로 녹차를 추출하여 약 79 g의 고형분을 얻었다.

[제조예 3] 일반 단삼 추출물의 제조

건조된 단삼 전체 1kg을 사용하여 제조예 1과 동일한 방법으로 단삼을 추출하여 약 74 g의 고형분을 얻었다.

[제조예 4] 일반 샨카푸쉬피 추출물의 제조

건조된 샨카푸쉬피 전체 1kg을 사용하여 제조예 1과 동일한 방법으로 샨카푸쉬피를 추출하여 약 71 g의 고형분을 얻었다.

[제조예 5] 일반 에리카철쭉 추출물의 제조

건조된 에리카철쭉 전체 1kg을 사용하여 제조예 1과 동일한 방법으로 에리카철쭉을 추출하여 약 80 g의 고형분을 얻었다.

[제조예 6] 일반 차가 추출물의 제조

건조된 차가 1kg을 사용하여 제조예 1과 동일한 방법으로 차가를 추출하여 약 82 g의 고형분을 얻었다.

[제조예 7] 일반 폭죽초 추출물의 제조

건조된 폭죽초 전체 1kg을 사용하여 제조예 1과 동일한 방법으로 폭죽초를 추출하여 약 79g의 고형분을 얻었다.

[제조예 8] 일반 한련초 추출물의 제조

건조된 한련초 전체 1kg을 사용하여 제조예 1과 동일한 방법으로 한련초를 추출하여 약 82 g의 고형분을 얻었다.

[제조예 9] 일반 홍경천 추출물의 제조

건조된 홍경천 전체 1kg을 사용하여 제조예 1과 동일한 방법으로 홍경천을 추출하여 약 84 g의 고형분을 얻었다.

[제조예 10] 고삼 글리코프로테인의 제조

건조된 고삼 전체 1kg를 분쇄하여 증류수를 10 kg 가한 후 80~90 ℃에서 5시간 동안 열수 추출하였다. 3㎛ 메쉬를 이용하여 잔사를 제거하고, α-아밀라아제를 20~70 ℃에서 20시간 처리하여 추출된 고분자를 저분자 형태로 만든다. 효소를 처리한 추출액을 80~90 ℃로 20시간 동안 가열하여 효소를 불활성화 시킨 후, 원심분리하여 상등액을 감압농축하여 농축액을 얻는다. 농축액에 90% 에탄올을 농축액 부피의 10배를 첨가하여 남아있는 고분자를 침전시킨다. 침전물 제거후, 감압농축한 농축물을 동결건조시킴으로써 약 63 g의 고삼 글리코프로테인 고형분을 얻었다.

[제조예 11] 녹차 글리코프로테인의 제조

건조된 차잎 1kg을 사용하여 제조예 10과 동일한 방법으로 제조하여 약 60g의 녹차 글리코프로테인 고형분을 얻었다.

[제조예 12] 단삼 글리코프로테인의 제조

건조된 단삼 전체 1kg을 사용하여 제조예 10과 동일한 방법으로 제조하여 약 64g의 단삼 글리코프로테인 고형분을 얻었다.

[제조예 13] 샨카푸쉬피 글리코프로테인의 제조

건조된 샨카푸쉬피 전체 1kg을 사용하여 제조예 10과 동일한 방법으로 제조하여 약 62g의 샨카푸쉬피 고형분을 얻었다.

[제조예 14] 에리카철쭉 글리코프로테인의 제조

건조된 에리카철쭉 전체 1kg을 사용하여 제조예 10과 동일한 방법으로 제조하여 약 68g의 에리카철쭉 고형분을 얻었다.

[제조예 15] 차가 글리코프로테인의 제조

건조된 차가 전체 1kg을 사용하여 제조예 10과 동일한 방법으로 제조하여 약 64g의 차가 글리코프로테인 고형분을 얻었다.

[제조예 16] 폭죽초 글리코프로테인의 제조

건조된 폭죽초 전체 1kg을 사용하여 제조예 10과 동일한 방법으로 제조하여 약 64g의 폭죽초 글리코프로테인 고형분을 얻었다.

[제조예 17] 한련초 글리코프로테인의 제조

건조된 한련초 전체 1kg을 사용하여 제조예 10과 동일한 방법으로 제조하여 약 61g의 한련초 글리코프로테인 고형분을 얻었다.

[제조예 18] 홍경천 글리코프로테인의 제조

건조된 홍경천 전체 1kg을 사용하여 제조예 9과 동일한 방법으로 제조하여 약 69g의 홍경천 글리코프로테인 고형분을 얻었다.

[참고예 1] 모유두세포의 배양

생후 1일 된 C57BL/6 mice의 등 피부조직에서 모유두세포(dermal papilla cell; DP cell)를 분리하였으며, 이를 10% 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS)이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에 5% CO₂, 37 ℃ 조건하에서 배양하여 실험에 이용하였다.

[시험예 1] 글리코프로테인의 세포 독성 실험

본 발명에 따른 글리코프로테인의 독성을 확인하기 위해 상기 참고예 1에서 분리 배양된 모유두세포를 이용하여 세포독성을 측정하였다. 상기 참고예 1에서 배양된 모유두세포를 96 웰 플레이트에 6X10³ cell을 웰 당 분주한 후 5% CO₂, 37 ℃ 에서 24시간 배양하였다. 배양 후, 일반 추출물(제조예 1~9)과 글리코프로테인(제조예 10~19)을 400 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖로 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에 희석하여 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 세포의 생존율을 측정하기 위해 WST-1 반응액을 FBS를 포함하지 않는 DMEM 배지에 1/10배로 희석하여 각 웰당 100㎕씩 처리하여 1시간 동안 반응시킨 후, ELISA 흡광분석기(Multiskan Go, Thermo scientific)로 450nm에서 흡광도를 측정하여 결과를 표 1에 나타내었다.

	세포 독성 실험 (% of CTL)
CTL(대조군 1)	100
추출 원료명	일반 추출물(제조예 1~9)		글리코프로테인(제조예 10~19)
추출 원료명	400 ㎍/㎖	200 ㎍/㎖	400 ㎍/㎖	200 ㎍/㎖
고삼	62	90	64	92
녹차	56	89	55	91
단삼	78	94	79	95
샨카푸쉬피	48	85	50	84
에리카철쭉	52	93	51	88
차가	55	85	54	91
폭죽초	49	87	53	90
한련초	64	89	62	92
홍경천	51	88	55	89

상기 표 1의 결과에서, 일반추출물과 글리코프로테인 모두 200㎍/㎖에서 세포 독성이 없음을 확인하였다. 이후 실험에서 200㎍/㎖를 고농도로 정하여 실험을 진행하였다.

[시험예 2] 글리코프로테인의 모유두세포 증식능 실험

상기 참고예 1에서 배양된 모유두세포를 96 월 플레이트에 2X10³ 세포를 웰 당 분주한 후 5% CO₂, 37 ℃ 에서 24시간 배양하였다. 배양 후, 배지를 FBS를 포함하지 않는 DMEM 배지로 바꾸어 기아상태로 유지하여 12시간 동안 배양하였다. FBS를 포함하지 않는 DMEM 배지에 상기 제조예 1~ 18에서 제조된 추출물 및 글리코프로테인을 각각 100 ㎍/㎖, 200㎍/㎖씩으로 희석하여 상기에서 12시간 동안 기아상태로 유지된 모유두세포에 처리한 후, 48시간 동안 5% CO₂, 37 ℃ 에서 배양하였다. 상기 48시간 배양 후 WST-1 FBS가 포함되지 않은 DMEM 배지에 1/10배로 희석하여 각 웰당 100㎕씩 처리하여 1시간 동안 반응시킨 후, ELISA 흡광분석기(Multiskan Go, Thermo scientific)로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 FBS가 포함되지 않은 배지에 글리코프로테인을 처리하지 않은 대조군 1과 10% FBS가 포함된 배지에 글리코프로테인을 처리하지 않은 대조군 2를 사용하였으며, 상기 대조군 1의 흡광도를 100으로 보았을 때 각 실험군의 흡광도를 %로 계산하여 모유두 세포 증식 효과를 산출하여 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

	모유두 세포 증식 효과 (% of CTL)
CTL(대조군 1)	100
10% FBS(대조군 2)	160
추출 원료명	일반 추출물(제조예 1~9)		글리코프로테인(제조예 10~19)
추출 원료명	100 ㎍/㎖	200 ㎍/㎖	100 ㎍/㎖	200 ㎍/㎖
고삼	104	106	134	145
녹차	99	101	113	129
단삼	98	100	109	121
샨카푸쉬피	101	102	116	118
에리카철쭉	103	105	131	132
차가	100	102	110	122
폭죽초	99	102	108	121
한련초	101	101	130	139
홍경천	102	102	107	128

상기 표 2의 결과에서, 각 원료에서 추출한 글리코프로테인을 처리한 경우, 일반 추출물을 처리한 경우에 비해 모유두 세포 증식 효과가 현저히 우수한 것을 알 수 있으며, 특히 9 종의 원료 중 고삼에서 추출한 글리코프로테인의 경우 가장 우수한 모유두 세포 증식 효과를 나타냈다.

[시험예 3] TGF-β2 유전자 발현 억제 효과 평가

모유두 세포 사멸과 밀접하게 관련 되어 모낭 퇴행기 이행을 촉진하는 것으로 알려져 있는 TGF-β2 유전자 발현에 대한 본 발명에 따른 글리코프로테인의 영향을 확인하기 위하여 RT-PCR(Real Time-Polymerase Chain Reaction)을 진행하였다.

상기 참고예 1에서 배양된 모유두 세포를 6 웰 플레이트에 2X10⁶ 세포를 웰당 분주하고, 5% CO₂, 37 ℃ 에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, DMEM(media supplement 제외한) 배지에 상기 제조예 1~ 18에서 제조된 추출물 및 글리코프로테인을 각각 100 ㎍/㎖, 200㎍/㎖씩으로 희석하여 각 세포에 처리한 후 다시 5% CO₂, 37 ℃ 에서 24시간 배양하였다. 대조군으로 시험 물질 처리를 하지 않은 무처리군을 사용하였다. 배양된 세포에서 RNA를 분리하고, RT-PCR을 이용하여 TGF-β2 유전자를 증폭시켜 발현율을 관찰하였다. 측정된 결과값을 대조군 값을 100으로 보았을 때 % 값으로 계산하여 하기 표 3에 나타내었다.

	TGF-β2 유전자 발현 (% of CTL)
CTL(대조군)	100
추출 원료명	일반 추출물(제조예 1~9)		글리코프로테인(제조예 10~19)
	100 ㎍/㎖	200 ㎍/㎖	100 ㎍/㎖	200 ㎍/㎖
고삼	94	93	81	72
녹차	97	95	87	81
단삼	98	97	97	95
샨카푸쉬피	97	96	93	92
에리카철쭉	95	94	84	76
차가	98	96	89	84
폭죽초	96	95	91	87
한련초	95	92	82	74
홍경천	96	95	88	82

상기 표 3의 결과에서, 각 원료의 일반 추출물을 처리한 경우보다 글리코프로테인을 처리한 경우, TGF-β2 유전자 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있다. TGF-β2 유전자 발현은 고삼에서 추출한 글리코프로테인을 처리했을 때, 가장 많이 억제되는 것을 확인할 수 있다.

[시험예 4] TGF-β2 단백질 발현 억제 효과

본 발명에 따른 글리코프로테인의 발모 관련 단백질 발현을 측정하여 육모 증진 효과에 미치는 영향을 평가하기 위하여 웨스턴블랏을 수행하였다.

상기 참고예 1에서 배양된 모유두 세포를 6 웰 플레이트에 2X10⁶ 세포를 웰당 분주하고, 5% CO₂, 37 ℃ 에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, DMEM(media supplement 제외한) 배지에 상기 제조예 10~ 18에서 제조된 글리코프로테인을 각각 200㎍/㎖씩으로 희석하여 각 세포에 처리한 후 다시 5% CO₂, 37 ℃ 에서 24시간 배양하였다. 대조군으로는 글리코프로테인이나 일반 추출물 어떤 것도 처리하지 않고 DMEM(media supplement 제외한) 배지만을 처리한 것을 사용하였다. 배양 후 세포에 단백질 용해액(protein lysis buffer)을 넣어 세포를 용해시킨 후, 12,000rpm으로 10분간 원심분리하고 상등액을 수확하여 Bradford assay를 통해 단백질을 정량하고, 상기 상등액을 SDS-PAGE loading dye와 혼합하여 웰 당 같은 양의 단백질이 되도록 로딩한 후, SDS-PAGE를 실시한다. 그 후, PAGE 겔의 단백질들을 니트로셀룰로오스막(nitro-cellulose membrane)으로 옮긴다. 상기 막을 5% 탈지유(skim milk)가 포함된 TBS-Tween 20 용액에 담가 1시간 동안 blocking 시킨 후 1차 항체 TGF-b2 antibody(Fitzgerald)를 2 ㎍/㎖ 농도로 24시간 동안 처리하고, 2차 항체 HRP conjugated Rabbit IgG를 0.5 ㎍/㎖로 희석하여 2시간 동안 처리한다. 그 후, EZ-Glow Solution A(Luminol + enhancer solution; DNR Bio-Imaging Systems사)와 EZ-Glow Solution B(Stable peroxide solution; DNR Bio-Imaging Systems사)를 섞은 용액을 상기 막에 2분간 처리하고, 암실에서 현상하여 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2의 결과에서, 글리코프로테인은 TGF-β2 단백질 발현을 억제하는 것을 알 수 있다. 특히 TGF-β2 단백질 발현은 유전자 발현 억제와 동일하게 고삼에서 추출한 글리코프로테인을 처리했을 때, 억제 효과가 가장 큰 것을 확인할 수 있다.

Claims

글리코프로테인을 유효성분으로 함유하는 모발 또는 두피용 조성물로서,
상기 글리코프로테인은 고삼, 녹차, 단삼, 샨카푸쉬피, 에리카철쭉, 차가, 폭죽초, 한련초 및 홍경천으로 이루어진 군에서 선택된 원료로부터 추출한 식물성 글리코프로테인인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 글리코프로테인은 조성물 총 중량에 대하여 0.01~5중량%의 양으로 함유됨을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 탈모 방지용 또는 모발 성장 촉진용인 것을 특징으로 하는 모발 또는 두피용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 조성물은 모유두 세포 분화 또는 증식을 촉진하는 것을 특징으로 하는 모발 또는 두피용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 조성물은 TGF-β2 유전자 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 모발 또는 두피용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 조성물은 TGF-β2 단백질 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 모발 또는 두피용 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 액상, 스프레이, 겔, 페이스트, 유제, 크림, 콘디셔너 및 샴푸로 이루어진 군에서 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 모발 또는 두피용 조성물.
글리코프로테인을 함유하는 모발 또는 두피용 조성물의 제조방법으로서,
a) 건조된 원료를 열수 추출하는 단계;
b) 상기 열수 추출된 추출물을 효소처리하여 가수분해하는 단계; 및
c) 상기 가수분해된 추출물을 감압 농축하는 단계를 포함하며,
상기 건조된 원료는 고삼, 녹차, 단삼, 샨카푸쉬피, 에리카철쭉, 차가, 폭죽초, 한련초 및 홍경천으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 모발 또는 두피용 조성물의 제조방법.