KR20140117770A

KR20140117770A - 남조류의 유전자 증폭용 프라이머 및 이를 이용한 남조류의 탐지방법

Info

Publication number: KR20140117770A
Application number: KR1020130032337A
Authority: KR
Inventors: 김봉수
Original assignee: 주식회사 천랩
Priority date: 2013-03-26
Filing date: 2013-03-26
Publication date: 2014-10-08
Also published as: KR101484259B1

Abstract

본 발명은 다양한 종의 남조류를 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 남조류의 탐지방법에 관한 것이다.

Description

남조류의 유전자 증폭용 프라이머 및 이를 이용한 남조류의 탐지방법{PRIMERS FOR AMPLIFYING CYANOBACTERIA GENE, AND DETECTION METHOD OF CYANOBACTERIA GENE USING THE SAME}

본 발명은 남조류의 유전자 증폭용 프라이머 및 이를 이용한 남조류의 탐지방법에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 남조류의 16S rDNA의 단편을 증폭하기 위한 프라이머, 이를 이용한 남조류의 탐지방법 및 탐지키트에 관한 것이다.

최근 지구 온난화와 더불어 남조류 (Cytobacteria)의 확산이 여름과 가을철에 큰 문제가 되고 있다. 특히 우리나라의 경우 2012년 전국의 강과 특히 한강에서도 녹조 현상이 심각하게 발생하여 식수 사용에 위협을 가하기도 했었다. 하지만, 녹조를 일으키는 남조류에 대한 연구는 매우 부족하고 특히 우리나라에서는 아직도 형태적인 분류를 통한 분석이 대부분이다. 최근 발전하여 광범위한 생물학적 분야에 활용되고 있는 차세대 염기서열 분석장치를 이용하여 시기별, 지역별로 번창하는 남조류의 종과 독소를 생산하는 유해 남조류의 종류를 빠른 시간에 분석한다면 녹조 현상에 대한 대책을 강구하는 여러 방안을 마련할 수 있을 것이다.

남조류는 Microcystis aerugonosa 등의 마이크로시스티스 속(Microcystis sp.) 균주; A. circinalis, A. flos-aquae, A. lemmermanii, 및 A. solitaria 등의 아나배나 속(Anabaena sp.) 균주; Aphanizomenon 속 균주; O. agardhii, O. agardhii var. isothrix, 및 O. formosa 등의 오실라토리아 속(Osillatoria sp.) 균주를 포함한다.

남조류를 분석하는 유전적 방법은, 16S rRNA 유전자의 증폭용 프라이머를 이용하는 방법이 있다(Nubel et al., 1997, Appl Environ Microbiol. 63:3327-3332; Matsunaga et al., 2001, Jour Appl Phycol 13:389-394.) 그러나, 남조류의 경우 16S rRNA 유전자가 다른 박테리아와 매우 유사하여, 남조류 특이적 프라이머를 제조하기가 어렵다. 특히 기존에 알려져 있는 프라이머의 경우 (CYA106F, CYA359F, Nubel et al., 1997, Appl Environ Microbiol. 63:3327-3332) 남조류내에서도 서열이 다른 부분이 존재하여 특정 남조류 종들은 증폭산물을 얻을 수 없다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 종래에 알려진 남조류의 유전자 증폭용 프라이머인 Cya359F와 남조류 및 다른 박테리아의 유전자를 배열 후 서열을 비교하면, 남조류내에서도 다른 서열들이 존재한다. 특히 EF600565나 EU3855890의 경우 상이한 부분이 많이 존재한다. 또한, 남조류는 다른 박테리아 종들과 유전자가 유사하여 남조류가 아닌 다른 종의 유전자를 증폭 시킨다는 문제점이 있다.

따라서, 남조류의 존재 유무 및 동정을 신속하고도 효율적으로 확인하는 탐지 방법을 제공하기 위해서는, 많은 종류의 남조류를 가능한 다양한 종을 모두 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있을 뿐만 아니라 증폭 효율이 높아 남조류의 증폭산물 양을 비교적 많이 얻을 수 있고, 유사한 서열을 갖는 남조류 이외의 다른 종의 박테리아의 증폭산물을 최대한 배제할 수 있는 남조류 유전자 특이적 프라이머가 필요한 실정이다.

본 발명의 목적은 다양한 종의 남조류 유전자를 높은 증폭 비율로 증폭할 수 있으며, 남조류 이외의 다른 박테리아 유전자는 증폭되지 않거나 상대적으로 낮은 비율로 증폭되는, 남조류 유전자의 특이적인 프라이머용 핵산분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 남조류의 존재 유무 및 동정을 신속하고도 효율적으로 확인하는 탐지 방법을 제공하기 위해서, 다양한 종류의 남조류 유전자를 높은 증폭 비율로 증폭할 수 있는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함하는 남조류 유전자의 특이적인 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은, 남조류의 특정 유전자만을 선택적이고 높은 증폭율로 증폭하여 샘플내에 존재하는 남조류의 선택적 증폭을 가능하도록 하는 상기 남조류 특이적 프라이머를 이용하여, 남조류의 유전자를 증폭하고, 상기 증폭산물을 분석하여 남조류를 동정하는 방법 및 동정 키트를 제공하고자 한다.

본 발명의 추가 목적은 남조류 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머를 이용하여 시료내 존재하는 유전자를 증폭하고, 상기 증폭산물을 분석함으로써 시료내 남조류 군집을 구성하는 남조류 종(species)의 종류와 함량을 분석하는, 남조류 군집의 분석방법 (Cyanobacteria population analysis) 및 분석키트에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 자세히 설명하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일구현예는 남조류의 특정 유전자만을 선택적이고 높은 증폭율로 증폭하여 샘플내에 존재하는 남조류의 선택적 증폭을 가능하도록 하는 상기 남조류 특이적 프라이머 핵산분자, 상기 프라이머를 포함하는 남조류 유전자의 증폭용 프라이머 세트에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 구현예는, 상기 프라이머 또는 프라이머 세트를 이용하는 남조류를 동정하는 방법 및 동정 키트, 그리고 시료내 남조류 군집을 구성하는 남조류 종(species)의 종류와 함량을 분석하는, 남조류 군집의 분석방법 (Cyanobacter population analysis) 및 분석키트에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 종래에 비해 상기 남조류의 존재 유무를 더욱 높은 민감도로 용이하게 확인할 수 있고 더 향상된 탐지 한계를 갖추고 있는 탐지 방법을 획득할 수 있다.

본 발명의 명세서에서 용어 "프라이머(primer)" 는 핵산의 증폭 반응시에 증폭되는 표적 핵산 부위의 5'-말단 서열 및 3'-말단 서열에 각각 상보적이며 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응효소 하에서 주형-지시 핵산의 중합효소반응의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥의 올리고 뉴클레오타이드를 의미하며, 예컨대 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15 내지 40개 염기를 포함하는 올리고 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다.

본 발명의 일구현예는 남조류 탐지를 위한 DNA 증폭용 프라이머 핵산분자는 하기 서열번호 1으로 표시되는 염기서열 (CTA_imF로 명명)을 연속적으로 함유하는 24개 염기 내지 28개의 염기를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 남조류의 16S rDNA 증폭용 정방향 프라이머이다.

서열번호 1: 5′-YDCAATGGGCGAAAGCCTGACGSA-3′

상기 식에서 S는 G 또는 C, Y는 C 또는 T, D는 A, G 또는 T이고, 바람직하게는 S는 G 또는 C, Y는 C, D는 G이다.

본 발명의 증폭용 프라이머 핵산분자는 남조류 16S rRNA region중 variable region 3과 4번을 표적 부분으로 하여 남조류의 16S rDNA 증폭용 프라이머를 설계한다.

본 발명의 남조류 탐지를 위한 증폭용 프라이머 핵산분자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가지는 핵산분자, 또는 서열번호 1로 표시되는 핵산분자를 포함하고, 상기 핵산분자의 5′-말단 및 3′말단으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 말단에, 1개 또는 2개의 염기가 결합된 최대 26개의 염기를 포함하는 핵산분자일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 핵산분자의 3′말단에 1개 또는 2개의 염기가 결합된 핵산분자일 수 있다. 바람직한 핵산분자의 예는 하기 표 1에 나타낸 서열번호 2 내지 8중 어느 하나의 염기서열을 갖는 핵산분자일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 2을 갖는 핵산분자(CTA_imF1)일 수 있다.

Primer	sequence (5'-> 3')	서열번호
CTA_imF	YDCAATGGGCGAAAGCCTGACGSA	1
CTA_imF1	CGCAATGGGCGAAAGCCTGACGSA	2
CTA_imF2	CGCAATGGGCGAAAGCCTGACGSAG	3
CTA_imF3	CGCAATGGGCGAAAGCCTGACGSAGC	4
CTA_imF4	YGCAATGGGCGAAAGCCTGACGSA	5
CTA_imF5	YGCAATGGGCGAAAGCCTGACGSAGC	6
CTA_imF6	CDCAATGGGCGAAAGCCTGACGSA	7
CTA_imF7	CDCAATGGGCGAAAGCCTGACGSAGC	8

상기 표 1의 염기서열에서, S는 G 또는 C, Y는 C 또는 T, D는 A, G 또는 T 이다.

본 발명에 따른 남조류 DNA 증폭용 프라이머 세트는 남조류의 16S rDNA 증폭을 위한 프라이머로서, 서열번호 1의 염기서열을 함유하는 정방향 프라이머 핵산분자와, 남조류의 16S rDNA 증폭을 위한 역방향 프라이머 핵산분자를 포함하는 프라이머 세트일 수 있다. 상기 역방향 프라이머 핵산분자는 남조류의 16S rDNA 증폭을 위한 역방향 프라이머로서 본 기술분야에서 사용하는 종래에 알려진 역방향 프라이머를 사용할 수 있으며, 예를 들면, CYA781R (Nubel et al., 1997) 등이 있으나 이에 한정되지 않는다.

CYA781R (서열번호 9): 5′-GACTACWGGGGTATCTAATCCCWTT-3′

상기 서열에서 W는 A 또는 T 이다.

본 발명에 따른 프라이머는 (CYA_imF)의 5′-말단과 3′말단에 증폭 특이도(specificity)를 높일 수 있는 서열을 포함시켜 남조류의 대상 유전자 또는 이의 특정부위를 높은 증폭율로 증폭할 수 있게 하고, 다양한 남조류 들이 동시에 증폭될 수 있도록 할 수 있다. 예를 들면, 차세대 염기서열 분석장치인 Roche사의 454 GS FLX Titanium/Junior machine을 이용하고자 하는 경우에는, 본 발명의 프라이머 핵산분자의 5′-말단 또는 3′말단에 어댑터 서열, 키 서열, 및 링커 서열을 연결하여 사용할 수 있으며, 또는 상기 키서열과 링크서열 사이에 바코드 서열을 추가로 포함할 수 있으며 이러한 서열은 Hur et al., 2011 Appl. Environ. Microbiol. 77; 7611-7619에 기재되어 있다.

본 발명의 또 다른 일구현예는, 상기 프라이머를 이용하여 시료내에 존재하는 남조류를 탐지하거나 동정하는 방법 또는 탐지 또는 동정 키트에 관한 것이다.

구체적으로, 상기 시료내에 존재하는 남조류를 탐지하거나 동정하는 방법은 시료내 존재하는 박테리아의 게놈 DNA를 얻고, 상기 게놈 DNA를 주형으로 하여 본 발명에 따른 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응으로 증폭하고, 상기 증폭 산물의 염기서열을 분석하여 시료내에 존재하는 남조류를 탐지하는 단계를 포함한다.

명세서에서 사용되는 용어 "중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)"은 핵산 중합효소의 연쇄적 반응에 의해 핵산 분자의 증폭, 특히 특정 DNA 부위를 선별적으로 증폭하는 방법으로서 이에 대한 내용은 Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al. (EP 329,822))에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다. 중합효소연쇄반응은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다.

예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 PCR에 이용될 수 있으며, 예컨대 E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우(Klenow) 단편", 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

본 발명에서 중합효소 연쇄 반응액에는 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR 완충액(buffer) 및 DNA 중합 효소 보조인자를 포함할 수 있으며, 이러한 완충액 및 보조인자 등은 본 기술분야에서 알려진 성분들을 사용할 수 있으며 특별히 한정되지 않는다.

중합효소연쇄 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 중합효소연쇄 반응에 의한 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭 반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg² ⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명의 프라이머 세트를 사용한 PCR을 수행한 결과 얻어진, 증폭된 DNA 폴리뉴클레오타이드 서열의 산물은 적합한 방법으로 분석된다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 증폭된 DNA 산물을 분석할 수 있다. 또는 상기 증폭산물의 염기서열을 분석하여 유전자 데이터베이스를 활용함으로써 시료내 존재하는 남조류를 구체적인 종으로도 동정할 수도 있다. 또한 시료내 포함된 다양한 종의 남조류를 각각 구체적 종으로 동정하여 시료내 포함된 남조류 군집의 구성 종(species)의 종류와 함량을 분석할 수 있다. 상기 염기서열의 분석은 당 기술분야의 통상의 전문가에게 알려진 방법으로 수행할 수 있으며 특별히 한정되지 아니한다. 상기 유전자 증폭 산물을 전기영동 등의 방법으로 특정 크기를 갖는 밴드의 유무를 고려하여 시료내 대상 균주가 존재하는지 여부를 확인할 수 있다.

본 발명에 따라 다양한 종류의 남조류 유전자를 높은 증폭 비율로 증폭할 수 있는, 남조류 유전자 특이적 프라이머용 핵산분자, 프라이머 세트, 및 이들을 이용한 남조류 탐지방법과 탐지키트를 제공하여, 수중에 존재하는 남조류가 미량일지라도 탐지 가능하며, 특히, 남조류의 대량 발생은 수중 생태계에 큰 악영향을 끼치며 상수원이 오염될 경우 국민의 건강을 위협할 수 있으므로, 본 발명은 이러한 남조류의 대량 발생을 초기에 감지하고 예측하여 수질의 적절한 관리를 할 수 있는 유용한 도구를 제공한다.

도 1은 종래 남조류의 유전자 증폭용 프라이머인 Cya359F와 남조류 및 다른 박테리아의 유전자를 배열후 서열을 비교한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 종래 남조류의 유전자 증폭용 프라이머인 Cya359F과 본 발명에 따른 프라이머를 사용하여 남조류 16S rDNA를 PCR 증폭 결과를 비교한 결과이다.
도 3a 내지 도 3c는 본 발명의 일실시예에 따른 프라이머쌍을 이용하여 시료 DNA 증폭하고 염기서열을 분석하여 얻은 이중 파이 챠트이다.
도 4a 내지 도 4c는 본 발명의 일실시예에 따른 프라이머쌍, 종래 프라이머쌍, 및 박테리아 유니버설 프라이머쌍을 사용하여 시료 DNA 증폭하고 염기서열을 분석하여 얻은, 시료내 전체 세균중 남조류가 차지하는 비율을 비교한 결과를 나타낸다.
도 5a 내지 도 5d는 본 발명의 일실시예에 따른 프라이머쌍, 종래 프라이머쌍, 및 박테리아 유니버설 프라이머쌍을 사용하여 이용하여 시료 DNA 증폭하고 염기서열을 분석하여 얻은, 시료내 전체 세균중 균주의 종(species)의 구성 비율을 비교한 결과를 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명하면 다음과 같다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 남조류 프라이머 설계 및 제작

본 발명에 따른 프라이머 제조를 위하여 남조류의 16S rRNA gene 중 그 길이가 온전한 염기서열을 NCBI database를 기반으로 제공 받아 이들 염기서열을 정렬하였다. 염기서열 정렬은 jPhydit 프로그램 (Jeon et al., 2005)을 사용하여 분석을 하였다. (Jeon et al., 2005, jPHYDIT: a JAVA-based integrated environment for molecular phylogeny of ribosomal RNA sequences. Bioinformatics 21:3171-3173.) 남조류의 유전자를 정렬한 후, 이 외의 다양한 문의 세균 16S rRNA gene를 가져와 같이 정렬한다. 염기서열을 정렬한 후 기존 primer부분을 남조류와 다른 문의 세균과 어느 정도 일치성을 가지는지 확인하였다.

확인한 결과 도 1과 같이 기존 프라이머의 경우 남조류 외에 다른 문의 세균 중 일치하는 것들도 존재하고 (Bacillus edaphicus가 가장 유사), 남조류 내에서도 유사하지 않은 종들이 존재하는 것을(EF600565_s E5-10, EU385890_s MD2902-B72) 확인할 수 있었다. 이들로 인한 잘못된 증폭과 특이적 증폭이 불가능해질 수 있다. 이 문제를 해결하고 남조류 특이적 증폭성을 높이기 위해 프라이머 서열 앞부분과 뒷부분에 C와 G가 많이 포함된 부분을 찾아 이를 프라이머로 제작을 하였다. 본 발명에서 제작한 프라이머는 상기 표 1의 서열번호 2 내지 8의 염기서열을 갖는 프라이머들이다.

본 실시예에서 구체적으로 제작한 프라이머는 하기 표 2의 염기서열을 갖는 프라이머이다. 정방향 프라이머는 서열번호 2를 갖는 CTA_imF1이고 구체적인 염기서열을 하기 표 2의 서열번호 11 (CTA_imF1-1) 및 서열번호 12(CTA_imF1-2)이며, 역방향 프라이머는 상기 서열번호 9을 갖는 서열(CYA781R)로서, 구체적인 염기서열은 하기 표 3의 서열번호 13 내지 16을 갖는 서열(CYA781R-1, CYA781R-2, CYA781R-3, CYA781R-4)이다. 따라서, 구체적으로 정방향 프라이머인 CTA_imF1-1 및 CTA_imF1-2와, 역방향 프라이머인 CYA781R-1, CYA781R-2, CYA781R-3 및 CYA781R-4의 조합으로 총 8개의 프라이머쌍을 제조하여, 증폭실험을 진행하였다.

Primer	sequence (5'-> 3')	서열번호
CTA_imF1	CGCAATGGGCGAAAGCCTGACGSA	2
CTA_imF1-1	CGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGA	11
CTA_imF1-2	CGCAATGGGCGAAAGCCTGACGCA	12
CYA781R	5′-GACTACWGGGGTATCTAATCCCWTT-3′	9
CYA781R-1	5′-GACTACAGGGGTATCTAATCCCATT-3′	13
CYA781R-2	5′-GACTACAGGGGTATCTAATCCCTTT-3′	14
CYA781R-3	5′-GACTACTGGGGTATCTAATCCCTTT-3′	15
CYA781R-4	5′-GACTACTGGGGTATCTAATCCCATT-3′	16

상기 표 2에서, S는 G 또는 C이고, W는 A 또는 T이다.

<실시예 2> 프라이머를 이용한 DNA의 증폭

2-1. 비교예의 증폭용 프라이머 세트 제조

남조류 16s rDNA 증폭용 프라이머로서 알려진 하기 프라이머쌍을 제조하였다(Nubel et al, 1997. PCR primers to amplify 16S rRNA genes from Cyanobacteria. Appl. Environ. Microbiol. 63;3327-3332). 구체적으로 비교예의 정방향 프라이머는 서열번호 10을 갖는 CYA359F이고 구체적인 염기서열을 하기 표 3의 서열번호 17 및 18이며, 비교예의 역방향 프라이머는 상기 서열번호 9을 갖는 서열(CYA781R)로서, 구체적인 염기서열은 하기 표 3의 서열번호 13 내지 16을 갖는 서열이다. 따라서, 구체적으로 정방향 프라이머인 CYA359F-1 및 CYA359F-2와, 역방향 프라이머인 CYA781R-1, CYA781R-2, CYA781R-3 및 CYA781R-4의 조합으로 총 8개의 프라이머쌍을 제조하여, 증폭실험을 진행하였다.

Primer	sequence (5'-> 3')	서열번호
CYA359F	5′-GGGGAATYTTCCGCAATGGG-3′	10
CYA359F-1	5′-GGGGAATCTTCCGCAATGGG-3′	17
CYA359F-2	5′-GGGGAATTTTCCGCAATGGG-3′	18
CYA781R	5′-GACTACWGGGGTATCTAATCCCWTT-3′	9
CYA781R-1	5′-GACTACAGGGGTATCTAATCCCATT-3′	13
CYA781R-2	5′-GACTACAGGGGTATCTAATCCCTTT-3′	14
CYA781R-3	5′-GACTACTGGGGTATCTAATCCCTTT-3′	15
CYA781R-4	5′-GACTACTGGGGTATCTAATCCCATT-3′	16

상기 표 3에서, Y는 C 또는 T이고, W는 A 또는 T이다.

2-2. 특정 증폭기를 사용하기 위한 융합 프라이머 제조

실시예 1에서 얻은 본 발명에 따른 정방향 프라이머 (서열번호 2)와 상기 역방향 프라이머 (서열번호 9)으로 이루어진 프라이머 세트와, 종래 정방향 프라이머 (서열번호 10)과 역방향 프라이머(서열번호 9)로 이루어지는 프라이머쌍을 비교예로 사용하여 빠른 시간에 남조류군 동정 분석을 위한 차세대 염기서열 분석장치에 활용하고자 fusion 프라이머를 제작하여 이를 이용하였다. 융합 프라이머의 제작법과 자세한 정보는 http://oklbb.ezbiocloud.net/content/1001 (Hur et al., 2011) 에 상세히 나와 있다. 구체적으로,

본 발명에 따른 서열번호 2의 정방향 프라이머 서열에 대한 융합 프라이머의 서열은, 정방향 프라이머의 부착서열로서 서열번호 19의 폴리뉴클레오타이드(5′-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGAC-3′)을 서열번호 2 (구체적으로는 CTA_imF1-1 및 CTA_imF1-2)의 염기서열의 5′-말단에 부착하여 융합 프라이머를 제조하였다. 또한 상기 서열번호 9을 갖는 역방향 프라이머 서열에 대한 융합 프라이머의 서열은, 역방향 프라이머의 부착서열로서 서열번호 20의 폴리뉴클레오타이드(5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAC-3′)을 서열번호 9 (구체적으로, 서열번호 13 내지 16을 갖는 CYA781R-1, CYA781R-2, CYA781R-3 및 CYA781R-4)의 5′-말단에 부착하여 융합 프라이머를 제조하였다. 상기 정방향 프라이머의 부착서열로서 서열번호 19의 폴리뉴클레오타이드 및 역방향 프라이머의 부착서열로서 서열번호 20의 폴리뉴클레오타이드은 5′-말단부터 30번째 염기와 31번째 염기사이에 바코드를 삽입하면, 즉. 서열번호 19는 5′-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTC-TCAG-X-AC-3′로 표시할 수 있고, 서열번호 20은 5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-X-AC-3′로 표시할 수 있으며, 상기 X는 바코드를 삽입하는 부위이다.

서열번호 19: 5′-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGAC-3′

서열번호 20: 5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAC-3′

상기 비교예의 알려진 프라이머쌍은, 융합 정방향 프라이머 서열로서 서열번호 10 (구체적으로 서열번호 17을 갖는 CYA359F-1 및 서열번호 18을 갖는 CYA359F-2)에 대해서, 상기 서열번호 19의 폴리뉴클레오타이드를 서열번호 10의 염기서열의 5′-말단에 부착하여 융합 프라이머를 제조하였다. 상기 서열번호 9을 갖는 역방향 프라이머 서열에 대한 융합 프라이머의 서열은, 역방향 프라이머의 부착서열로서 서열번호 20을 서열번호 9의 5′-말단에 부착하여 융합 프라이머를 제조하였다.

2-3. 시료 DNA 의 증폭

상기 실시예 2-2항목에서 얻은 융합 프라이머 세트와, 비교예 융합 프라이머 세트를 같은 DNA 샘플을 이용하여 그 증폭 효율과 증폭 결과를 비교하여 분석을 하였다.

구체적으로, 시료는 낙동강에서 5월에 표본지(5개의 둑으로부터 500m 떨어진 상방지 및 한 군데의 하방지)에서 채취한 표층수를 0.22㎛ 공극크기의 필터(pore size filter: Millipore, MA, 미국)로 여과한 다음, 얇게 자른 상기 필터를 DNeasy plant mini kit (상표명, Qiagen, CA, 미국)로 박테리아 DNA를 추출하여 전체 DNA로 사용한다. 실시예 2에서 빠른 시간에 남조류군 분석을 위한 차세대 염기서열 분석장치에 활용하고자 제작한 프라이머로서, 본 발명의 일실시예에 따른 프라이머쌍 (서열번호 11 및 12)와 종래 프라이머쌍(서열번호 13 및 12)를 미생물 군집 분석을 위한 암플리콘 라이브러리(amplicon library)를 만들기 위해 PCR 증폭을 시행하였다. 각 표본에 대한 특정 바코드를 (상기 프라이머의) 역방향에 부착한다(Hur et al. 2011). PCR 수행조건은 일반적으로 사용되는 조건을 사용하여 같은 DNA로부터 다른 프라이머 쌍을 이용하여 동시에 증폭을 진행하였다. 표 4는 PCR에 사용되는 Master mix의 조성, 표 5는 PCR 증폭조건을 나타낸다.

Reagent시약		1 Tube (ml)
Molecular Biology Grade Water		40.7
Buffer 10X + MgCl₂	10X	5
dNTPs	10 mM	1
프라이머s (Forward/Reverse)	20 pmole/ul	2
Taq Polymerase	5U/ml	0.25
DNA (~100 ng)		1
Total		50

단계	온도(℃)	시간(분)	사이클수
Initial denaturation	94	5:00
Denaturation	94	0:30	30
Annealing	55	0:30
Extension	72	0:30
Final extension	72	5:00
Hold	4	Oo

2-4. 증폭 산물의 전기영동 분석

상기 증폭 결과물을 전기영동으로 분석하였으며, 그 결과를 도 2에 나타냈다. 본 발명에 따른 프라이머쌍과 달리, 비교예 프라이머쌍은 표 4 및 5에 나타낸 통상적인 PCR 조건에서 증폭이 잘 되지 않았다.

비교 예에 따른 프라이머 세트의 경우 군집 분석을 위해 가장 많이 이용하고 있는 ExTaq polymerase (Takara) 를 사용하여 일반적인 증폭 조건으로는 증폭이 잘 되지 않는다는 것을 확인하였다. 이에 반해 본 발명의 프라이머의 경우 일반적인 증폭 조건에서도 증폭이 잘 된다는 것을 확인하였다. 이를 통해 종래 프라이머의 경우 차세대 염기서열 분석 장치를 효율적으로 이용하기 위한 융합 프라이머로 사용시 PCR증폭 효율이 떨어진다는 것을 알 수 있다.

2-5. 시료의 군집 양상 분석

증폭 산물들은 차세대 염기서열 분석장치인 Roche사의 454 Junior machine을 이용하여 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석을 위한 라이브러리 제작은 Roche사에서 제공하는 방법을 사용하였다. 상기 실시예 2-2의 동일한 샘플 DNA를 비교예 프라이머쌍과 본 발명에 따른 프라이머쌍을 사용한 증폭 산물에서 판독된 염기서열을 특정 바코드에 의해 분리하고, 추가 분석 과정에서 저 품질의 판독결과(평균 품질지수가 25 미만 또는 판독된 길이가 300bp 미만)는 제거한다. 상기 얻어진 증폭산물의 염기서열의 동정은 각 염기서열을 EzTaxon-e 데이터베이스 (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net)(Kim et al. 2012)를 사용하여 블라스트(BLAST) 조사를 수행하고, 이를 정리하여 상기 미생물 군집 분석결과를 비교하여 도 3에 나타냈다.

도 3a 내지 도 3c는 시료내 남조류 군집에 대한 이중 파이 차트(double pie chart)로서, 내부 파이는 군집내 문의 조성(composition of phylum)을 나타내는 것이고, 외부 파이는 군집내 속 (Genus)의 조성을 나타내는 것으로서, 각각의 색깔에 해당하는 균주명은 이중 파이 챠트 아래에 기재하였다. 상기 차트에 기재된 각 비율은 각각의 primer를 이용하여 차세대 염기서열 분석 장비를 통해 얻은 염기서열 중 특정 종이 차지하는 비율을 나타낸다.

도 3a 내지 도 3c에 나타낸 바와 같이, 동일한 DNA 샘플에 두 가지 프라이머쌍을 이용하여 분석한 결과, 비교예 프라이머쌍의 경우 전체 박테리아중 85.5%가 남조류로 검출된 반면, 본 발명의 실시예 2의 프라이머의 경우 94.05%가 남조류로 검출되었다. 검출된 남조류의 종류도 기존 프라이머의 경우 12속 (genus), 24종 (species)의 남조류가 검출되었고, 개선한 프라이머의 경우 32속, 45종의 남조류가 검출되었다. 따라서, 본 발명에 따른 프라이머쌍을 사용할 경우, 기존의 프라이머로 탐지할 수 없었던 다양한 남조류를 추가로 검출할 수 있다. 20개의 추가 발견 속과 21개의 추가 발견 종이 분석되었다.

도 2에서 본 발명에 따른 프라이머의 차세대 염기서열 분석 장치 이용이 가능한 증폭 효율성을 볼 수 있고, 도 3을 통해 본 발명의 프라이머 (전체 염기 서열의 94.05%)가 기존 프라이머 (85.5%)에 비해 남조류를 더 많이 증폭하여 프라이머의 남조류 특이성이 있음을 입증하는 것이다. 같은 샘플에 대해 증폭된 결과를 비교한 결과 종래 프라이머에 비해 본 발명의 프라이머가 훨씬 높은 비율로 남조류를 증폭하였고, 보다 다양한 남조류 종들을 증폭하였다는 것을 확인하였다.

< 실시예 3> Universal 프라이머와 비교분석

실시예 2-2에서 사용한, 본 발명의 프라이머쌍와 비교예 프라이머쌍와 함께, 서열번호 21의 정방향 프라이머 및 서열번호 22의 역방향 프라이머를 포함하는 universal 프라이머쌍을 이용하여 실시하였다 (Lopez, I., F. Ruiz-Larrea, L. Cocolin et al., 2003. Appl. Environ. Microbiol. 69;6801-6807.) 상기 유니버설 프라이머쌍은 특정 종의 구분없이 박테리아의 16s rDNA를 증폭가능 하도록 개발된 프라이머쌍이며, 구체적으로 서열번호 21의 정방향 프라이머에 해당하는 서열번호 23 (Universal-F1) 및 서열번호 24(Universal-F2)을 사용하고, 서열번호 22의 역방향 프라이머에 해당하는 서열번호 25 (Universal-R1) 및 서열번호 26(Universal-R2)을 사용하였다.

일반적으로 박테리아 군집 분석에 사용하는 유니버설 프라이머(universal primer)를 이용한 남조류 분포 양상을 비교 분석한 결과 남조류가 전체 박테리아 군집에서 차지하는 비율 양상이 기존 프라이머를 이용한 분석보다 개선한 프라이머를 이용한 분석에서 비슷한 양상을 나타낸다는 것을 볼 수 있다. 도 4는 서로 다른 프라이머를 사용하였을 때 전체 박테라아중 남조류가 차지하는 비율 비교한 결과를 나타낸다. 유니버셜 프라이머를 사용할 경우 543 샘플이 542와 545보다 많은 비율의 남조류가 존재하는데, 개선된 프라이머를 사용한 결과 비슷한 양상을 보이나, 기존 프라이머를 사용할 경우 542와 545의 남조류 분포 양상이 543과 유사하다는 결과를 얻게 된다. 이것은 기존 프라이머를 통한 잘못된 증폭의 결과물이라는 것을 알 수 있다.

Universal forward primer (서열번호 21) 5′-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′

Universal backward primer (서열번호 22) 5′-WTTACCGCGGCTGCTGG-3′

M은 A또는 C, W는 A또는 T를 나타낸다.

Primer	sequence (5'-> 3')	서열번호
Universal-F	5′-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′	21
Universal-F1	5′-GAGTTTGATCATGGCTCAG-3′	23
Universal-F2	5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′	24
Universal-R	5′-WTTACCGCGGCTGCTGG-3′	22
Universal-R1	5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′	25
Universal-R2	5′-TTTACCGCGGCTGCTGG-3′	26

각 속 (genus)에 대한 profile 역시 기존의 알려진 비교예 프라이머 (서열번호 10 및 9)를 이용한 증폭 결과보다 본 발명에 따른 프라이머 (서열번호 2 및 9)를 이용한 증폭결과가 일반적 유니버셜 프라이머(서열번호 21 및 22)를 이용한 산물과 보다 비슷한 양상을 보이고 비교예의 프라이며 (서열번호 10 및 9)를 이용할 경우 특정 속이 과도하게 증폭되어 다른 양상을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다. 도 5a 내지 도 5d는 서로 다른 프라이머를 사용하여 속의 구성 비율을 비교한 결과이다.

따라서, 개선된 프라이머를 이용한다면 보다 효율적이고 다양하며 정확한 남조류 군집 분석이 차세대 염기서열 분석장치를 활용하여 빠른 시간내에 분포 양상 동정이 가능하다.

<110> CHUNLAB, INC. <120> Primers for amplifying cyanobacteria gene, and detection method of cyanobacteria gene using the same <130> DPP20120170KR <160> 26 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTA_imF primer <400> 1 ydcaatgggc gaaagcctga cgsa 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTA_imF1 primer <400> 2 cgcaatgggc gaaagcctga cgsa 24 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTA_imF2 primer <400> 3 cgcaatgggc gaaagcctga cgsag 25 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTA_imF3 primer <400> 4 cgcaatgggc gaaagcctga cgsagc 26 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTA_imF4 primer <400> 5 ygcaatgggc gaaagcctga cgsa 24 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTA_imF5 primer <400> 6 ygcaatgggc gaaagcctga cgsagc 26 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTA_imF6 primer <400> 7 cdcaatgggc gaaagcctga cgsa 24 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTA_imF7 primer <400> 8 cdcaatgggc gaaagcctga cgsagc 26 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYA781R primer <400> 9 gactacwggg gtatctaatc ccwtt 25 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYA359F primer <400> 10 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag ac 32 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTA_imF1-1 primer <400> 11 cgcaatgggc gaaagcctga cgga 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTA_imF1-2 primer <400> 12 cgcaatgggc gaaagcctga cgca 24 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYA781R-1 primer <400> 13 gactacaggg gtatctaatc ccatt 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYA781R-2 primer <400> 14 gactacaggg gtatctaatc ccttt 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYA781R-3 primer <400> 15 gactactggg gtatctaatc ccttt 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYA781R-4 primer <400> 16 gactactggg gtatctaatc ccatt 25 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYA359F-1 primer <400> 17 ggggaatctt ccgcaatggg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYA359F-2 primer <400> 18 ggggaatttt ccgcaatggg 20 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide for preparing the fusion primer of forward primer <400> 19 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag ac 32 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide for preparing the fusion primer of Reverse primer <400> 20 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag ac 32 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal-F primer <400> 21 gagtttgatc mtggctcag 19 <210> 22 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal-R primer <400> 22 wttaccgcgg ctgctgg 17 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal-F1 primer <400> 23 gagtttgatc atggctcag 19 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal-F2 primer <400> 24 gagtttgatc ctggctcag 19 <210> 25 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal-R1 primer <400> 25 attaccgcgg ctgctgg 17 <210> 26 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal-R2 primer <400> 26 tttaccgcgg ctgctgg 17

Claims

서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 핵산분자, 또는
서열번호 1로 표시되는 핵산분자를 포함하고, 상기 핵산분자의 5′-말단 및 3′-말단으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 말단에, 1개 또는 2개의 염기가 결합된 최대 26개의 염기를 포함하는 핵산분자인
남조류(Cyanobacter sp.)의 16S rDNA 증폭용 프라이머 핵산분자.
제 1 항에 있어서, 상기 프라이머 핵산분자는, 서열번호 1로 표시되는 핵산분자의 3′말단에 1개 또는 2개의 염기가 결합된 핵산분자인 남조류(Cyanobacter sp.)의 16S rDNA 증폭용 프라이머 핵산분자.
제 1 항에 있어서, 상기 핵산분자는 서열번호 2 내지 8의 염기서열로 이루어지는 군에서 선택된 염기서열을 포함하는 남조류(Cyanobacter sp.)의 16S rDNA 증폭용 프라이머 핵산분자.
제1항 내지 제3항중 어느 한항에 따른 남조류(Cyanobacter sp.)의 16S rDNA 증폭용 프라이머 핵산분자의 정방향 프라이머와,
남조류(Cyanobacter sp.)의 16S rDNA 증폭용 역방향 프라이머를 포함하는 남조류(Cyanobacter sp.)의 16S rDNA 증폭용 프라이머 세트.
제 4 항에 있어서, 상기 정방향 프라이머는 서열번호 2 내지 8의 염기서열로 이루어지는 군에서 선택된 염기서열을 포함하는 프라이머 세트.
제 4 항에 있어서, 상기 역방향 프라이머는 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프라이머인 프라이머 세트.
제1항 내지 제3항중 어느 한항에 따른 프라이머 그리고 제4항 내지 제6항중 어느 한항에 따른 프라이머 세트로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머를 포함하는 남조류(Cyanobacter sp.)의 16S rDNA 증폭용 중합효소연쇄반응(PCR)용 키트.
제 7 항에 있어서, 상기 키트는 dNTP 혼합물, PCR 완충액(buffer) 및 DNA 중합 효소 보조인자를 추가로 포함하는 것인 중합효소연쇄반응(PCR)용 키트.
시료내 존재하는 박테리아의 게놈 DNA를 얻고,
상기 게놈 DNA를 주형으로 하여 제4항 내지 제6항중 어느 한항에 따른 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응으로 증폭하고,
상기 증폭 산물을 분석하여 시료내에 존재하는 남조류를 탐지하는 단계를 포함하는 남조류의 탐지 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 증폭 산물의 분석은 전기영동법 또는 염기서열 분석법으로 수행하여 시료내 남조류를 탐지하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 증폭 산물의 염기서열을 분석하여 시료내 존재하는 남조류의 종을 동정하는 것인 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 시료내 2종 이상의 남조류가 존재하는 경우, 상기 증폭 산물의 염기서열을 분석하여 시료내 남조류의 종(species) 동정과 종이 비율을 분석하는 것인 방법.