KR20140103985A

KR20140103985A - 인슐린 아미노산 서열을 포함하는 치료제

Info

Publication number: KR20140103985A
Application number: KR1020147017232A
Authority: KR
Inventors: 제임스 조엣; 크리스토퍼 우즈
Original assignee: 파세비오 파마수티컬스 인코포레이티드
Priority date: 2011-11-28
Filing date: 2012-11-28
Publication date: 2014-08-27
Also published as: US20130150291A1; SG11201402661TA; RU2014126244A; MX2014006391A; WO2013082116A1; EP2785367A4; CN104080473A; IL232781A0; CA2856967A1; EP2785367A1; AU2012346058A1; JP2014534265A; US20140364362A1; BR112014012789A2; HK1202067A1

Abstract

본 발명은 부분적으로 주사 부위로부터 느린 흡수를 제공하는 제제에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 약제학적 조성물은, 인슐린 아미노산 서열 및 주사 부위로부터 느린 흡수를 제공하는 아미노산 서열, 예를 들어, 프롤린 잔기들의 실질적 반복 패턴을 지니는 아미노산 서열을 포함한다.

Description

인슐린 아미노산 서열을 포함하는 치료제{THERAPEUTIC AGENTS COMPRISING INSULIN AMINO ACID SEQUENCES}

우선권

본 출원은 미국 특허 가출원 제61/563,985호(출원일: 2011년 11월 28일)로부터의 우선권을 주장하며, 이 기초 출원의 내용은 그의 전문이 참조로 포함된다.

본 발명은 부분적으로 지속적 생물학적 작용을 지니는 인슐린 및 그의 유도체의 형태에 관한 것이다.

전자적으로 제출된 텍스트 파일의 설명

본 명세서에 전자적으로 제출된 텍스트 파일의 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독가능한 형태 복사물(파일명: PHAS_025_01WO_SeqList_ST25.txt, 기록된 날짜: 2012년 11월 28일, 파일 크기: 38 킬로바이트).

펩타이드 및 소분자 약물의 효과는 순환 시 이러한 약물의 반감기뿐만 아니라 실질적으로 일정한 혈장 수준을 얻는데 있어서의 곤란성에 의해 종종 제한된다. 예를 들어, 인크레틴 GLP-1은 순환 시 그의 짧은 반감기에 대항하기 위하여 비교적 고용량으로 투여되어야만 하고, 이들 고용량은 특히 메스꺼움과 연관된다. (Murphy and Bloom, Nonpeptidic glucagon-like peptide 1 receptor agonists: A magic bullet for diabetes? PNAS 104 (3):689-690 (2007)). 또한, 펩타이드제 혈관활성 장내 펩타이드(VIP)는, 몇몇 추정치에서, 1분 미만의 반감기를 지녀, 이 제제를 약제학적 용도에 대해서 비실용적이 되게 만든다. (Domschke et al ., Vasoactive intestinal peptide in man: pharmacokinetics, metabolic and circulatory effects, Gut 19:1049-1053 (1978); Henning and Sawmiller, Vasoactive intestinal peptide: cardiovascular effects, Cardiovascular Research 49:27-37 (2001)). 펩타이드 약물에 대한 짧은 혈장 반감기는 전신 순환 동안 효소 분해로 인한 것뿐만 아니라 신속한 신장 청소율에 의한 것이다.

인슐린 또는 그의 유도체는 유사한 곤란성을 겪는다. 인슐린은 효소(예컨대 인슐린분해효소)에 의해 분해되기 전에 짧은 시간 동안만 활성이며, 따라서 단지 약 6분의 반감기를 지닌다. 또한, 인슐린은 대상체에 의해 신속하게 흡수될 수 있고, 따라서 이러한 대상체는 매일 2번 이상의 인슐린 주사를 필요로 할 수 있되, 그 용량은 혈당 수준의 자체 모니터링에 기초하여 조절된다. 게다가, 인슐린 수준에서의 최고점과 최저점은 대상체에 대한 상당한 합병증을 불러일으킨다. 순환에서 느린 흡수를 나타내고 정상 수준의 당 조절을 제공하는 인슐린 요법에 대한 요구는 남아있다.

본 발명의 과제는 상기 문제점을 해결하는 것이다.

본 발명은 지속 방출에 대한 인슐린-기반 약제학적 제형, 및 지속 방출 제형을 이용해서 치료 요법을 전달하는 방법을 제공한다. 이에 따라서, 본 발명은 인슐린-기반 약제학적 제형에 대한 개선된 약동학을 제공한다.

일 양상에 있어서, 본 발명은, 인슐린 아미노산 서열과 주사 부위로부터 지속 방출을 제공하는 아미노산 서열을 포함하는 유효량의 단백질, 및 지속 방출을 달성하기 위한 약제학적 부형제를 포함하는, 지속된 혈당조절을 제공하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.

다른 양상에 있어서, 본 발명은 지속된 혈당조절을 제공하기 위한 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 조성물은 인슐린 아미노산 서열과 주사 부위로부터 지속 방출을 제공하는 아미노산 서열을 포함하는 유효량의 단백질, 및 치료를 필요로 하는 환자에 대해서 지속 방출을 달성하기 위한 약제학적 부형제를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 환자는 제1형 당뇨병 또는 제2형 당뇨병을 지닌다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 방법은 약제학적 조성물을 1개월당 1 내지 약 30회, 약 주 1회, 또는 주당 약 2 혹은 3회, 또는 약 매일의 빈도로 투여하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 방법은 약제학적 조성물을 피하에 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.

도 1a는 인간 프로인슐린 서열(서열번호 13)을 도시한다. 프로인슐린 서열은 C 펩타이드와 연결된 B 및 A 사슬로 구성된다. C 펩타이드는 제거되어 두 인접한 이염기 부위(이탤릭체로 밑줄침)에서 효소적 절단 후 숙성 인슐린을 형성한다.
도 1b는, A 사슬의 C-말단에 융합된 120개의 ELP 단위를 지니는, 구조명 PE0139 또는 인슈메라(INSUMERA) 또는 인슐린-ELP1-120의 다이어그램을 도시한다.
도 2는 pPE0139 플라스미드의 맵을 도시한다.
도 3은 프로인슐린 ELP1-120 융합 단백질의 아미노산 서열(서열번호 14)을 도시한다. 프로인슐린 서열(밑줄침)은 ELP1-120 서열에 융합된다. 아미노산 서열은 선택적으로 N 말단에서 개시 메티오닌 잔기를 포함한다.
도 4는 비환원(non-reducing) SDS-PAGE 실험을 도시한다. 비환원 SDS-PAGE는 C-펩타이드가 절단됨에 따라서 효소적 가공처리 후 예상되는 저감된 융합 단백질 분자량을 나타낸다. 레인 1: 씨블루(등록상표) 플러스2(SEEBLUE® Plus2) 사전-염색 표준(인비트로젠사(INVITROGEN)), 레인 2: ELP1-120, 레인 3: 프로인슐린 ELP1-120, 레인 4: 인슐린 ELP-120 3㎍, 레인 5: 인슐린 ELP1-120 6㎍, 레인 6: 씨블루(등록상표) 플러스2(SEEBLUE® Plus2) 사전-염색 표준(인비트로젠사).
도 5는 항-인슐린 B 사슬 웨스턴 블롯을 도시한다. 항-인슐린 B 사슬 웨스턴 블롯은, ELP에 융합된 A 및 B 사슬 모두의 존재를 확인하기 위하여 수행되었다. 데이터는 A 사슬과 B 사슬 간의 이황화 결합 형성을 나타내는 B-사슬 비환원 조건 하의 존재를 나타내었다. 융합 단백질 및 이황화 결합의 저감은, 해당 융합으로부터의 B 사슬의 제거를 유발하였다. 레인 1: B 사슬의 부재를 나타내는 저감된 인슐린 ELP 융합물, 레인 2: B-사슬의 존재를 나타내는 비환원된 인슐린 ELP 융합물, 레인 3: ELP1-120, 레인 4: B-사슬의 존재를 나타내는 프로인슐린 ELP 융합물.
도 6은 비처리된 인슐린-ELP1-120에 대한 ESI-MS 데이터를 표시한다. 전자분무 이온화 질량 분석법은 57008.5 Da의 미처리된 프로인슐린 ELP 융합물의 질량을 확인하였다(SGS Mscan Codes 104531 & 104532). 추가적인 염 부가체가 존재하였다.
도 7은 처리된 pPE0139에 대한 ESI-MS 데이터를 표시한다. 전자분무 이온화 질량 분석법은 C-펩타이드의 효소적 제거 후의 숙성 인슐린 ELP 융합물의 질량을 확인하였다(SGS M-scan Codes 107610). 인슐린 ELP의 ESI-MS는 C-펩타이드 절단 후 숙성 인슐린 ELP를 나타내는 대략 53298 Da의 분자 질량을 지니는 주 생성물 피크를 나타내었다. 미소 피크들은 부분적으로 분해된 융합물 혹은 염 부가체에 기인하는 것으로 여겨진다.
도 8은 인슐린 글라진에 비해서 인슐린-ELP1-120 융합물을 이용한 정상의 마우스에서의 혈당 저하를 나타낸다.
도 9는 제1형 진성 당뇨병(제1형 당뇨병, T1DM) 마우스 모델에서의 인슈메라(INSUMERA)(PE0139) 용량을 도시한다. 구체적으로, 단일 용량 데이터가 표시된다. 결과는, 등몰량의 란투스(LANTUS)(인슐린 글라진, SANOFI-AVENTIS) 용량에 비해서, 인슈메라(INSUMERA)에 대한 보다 큰 지속기간의 포도당 저하를 입증한다. STZ는 스트렙토조토신이고; 미처치군(untreated group)은 정상의 비당뇨병성 동물을 지칭하며; N은 군당 8이다.
도 10은 제1형 진성 당뇨병(제1형 당뇨병, T1DM) 마우스 모델에서의 인슈메라(INSUMERA)(PE0139) 용량을 도시한다. 구체적으로, 1일 용량 데이터가 표시된다. 결과는, 활성(activity) 및 반감기에 관하여 란투스(LANTUS)(인슐린 글라진, SANOFI-AVENTIS)에 비해서 인슈메라(INSUMERA)의 우수성을 입증한다. STZ는 스트렙토조토신이고; 미처치군은 정상의 비당뇨병성 동물을 지칭하며; 제6시간의 시점에서, 25 mg/kg 및 50 mg/kg 군에 대해서 N은 5이고; 제8시간의 시점에서, 25 mg/kg 군에 대해서 N은 3이고 50 mg/kg 군에 대해서 n은 2이며; 제24시간의 시점에서, 25 mg/kg에 대해서 N은 1이고 5 mg/kg 군에 대해서 N은 7이다.
도 11a는 란투스(LANTUS)(인슐린 글라진, SANOFI-AVENTIS)에 디해서 제1형 진성 당뇨병(제1형 당뇨병, T1DM) 마우스 모델에서의 인슈메라(INSUMERA)(PE0139) 저용량 적정을 도시한다. 구체적으로, 도 11a는 단일 피하 용량을 도시한다. STZ는 스트렙토조토신이고; 미처치군은 정상의 비당뇨병성 동물을 지칭하며; 란투스(LANTUS), PE0139 1 mg/kg 및 미처치군에 대해서 N은 8이고; PE0139 3.33 mg/kg 군에 대해서 N은 7이다.
도 11b는 란투스(LANTUS)(인슐린 글라진, SANOFI-AVENTIS)에 비해서 제1형 진성 당뇨병(제1형 당뇨병, T1DM) 마우스 모델에서의 인슈메라(INSUMERA)(PE0139) 저용량 적정을 도시한다. 구체적으로, 도 11b는 14일의 1일 피하(s.c.) 용량을 도시한다. STZ는 스트렙토조토신이고; 미처치군은 정상의 비당뇨병성 동물을 지칭하며; 란투스(LANTUS), PE0139 1 mg/kg 및 미처치군에 대해서 N은 8이고; PE0139 3.33 mg/kg 군에 대해서 N은 7이다.
도 12a는 인슈메라(INSUMERA)(PE0139)가 란투스(LANTUS)(인슐린 글라진, SANOFI-AVENTIS)에 대해서 유의하게 증가된 혈당조절을 지니는 것을 도시한다. 27 내지 39%의 저감은 란투스에 대해서 제1일, 제3일, 제7일 및 제14일째의 곡선하 면적(AUC) 혈당에서 보여진다. 구체적으로, 도 12a는 제1의 화합물 투여 및 0 내지 24시간에서의 혈당 AUC를 도시한다.
도 12b는 인슈메라(INSUMERA)(PE0139)가 란투스(LANTUS)(인슐린 글라진, SANOFI-AVENTIS)에 대해서 유의하게 증가된 혈당조절을 지니는 것을 도시한다. 27 내지 39%의 저감은 란투스에 대해서 제1일, 제3일, 제7일 및 제14일째의 곡선하 면적(AUC) 혈당에서 보여진다. 구체적으로, 도 12b는 제14일의 화합물 투여 및 0 내지 24시간에서의 혈당 AUC를 도시한다.
도 13a는 인슈메라(INSUMERA)(PE0139)가 피하 주사 후 작은 피크 대 최저 비를 지니는 긴 반감기를 달성하는 것을 나타낸다. 구체적으로, 도 13a는 당뇨병 돼지에서 단일 피하(s.c.) 주사 후의 약동학(PK) 약물 수준을 도시한다.
도 13b는 인슈메라(INSUMERA)(PE0139)가 1일 피하 주사 후의 정상 상태 피크 대 최저 약동학(PK) 수준을 달성하는 것을 나타낸다. 구체적으로, 도 13b는 당뇨병 돼지에서 2주 동안 1일 피하 주사를 도시하되; PK 수준은 투약 전에 측정되었다.

본 발명은 지속된 생물학적 작용을 나타내는 인슐린-기반 약제학적 조성물을 제공한다. 또한 본 발명의 조성물을 이용해서 고혈당증 및 당뇨병을 포함하는 질환을 치료하는 방법이 제공된다.

몇몇 실시형태에 있어서, 인슐린 아미노산 서열은 A 사슬 및 B 사슬 아미노산 서열을 포함하되, A 사슬 및 B 사슬은, 일괄적으로, 1 내지 8개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 선택적으로 지니는 서열번호 13의 아미노산 서열(도 1)을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 주사 부위로부터 느린 흡수를 제공하는 아미노산 서열은 인슐린 A 사슬에 공유 결합된다. 다른 실시형태에 있어서, A 사슬과 B 사슬은 1개 이상의 이황화 결합에 의해 결합되거나, 또는 펩타이드 혹은 화학적 링커를 통해서 부착된다.

또 다른 실시형태에 있어서, 지속 방출을 제공하는 아미노산 서열은 프롤린 잔기들의 실질적 반복 패턴이다. 실질적 반복 패턴은 β회전(turn)의 시리즈 혹은 패턴을 형성할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 지속 방출을 제공하는 아미노산 서열은 엘라스틴-유사 펩타이드(elastin-like peptide: ELP) 아미노산 서열이다. 또 다른 실시형태에 있어서, ELP는 VPGXG(서열번호 3)의 반복부를 포함하되, 여기서 각각의 X는 독립적으로 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 글라이신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린 잔기로부터 선택된다. 다른 실시형태에 있어서, ELP 아미노산 서열은 AVGVP(서열번호 4), IPGVG(서열번호 6) 또는 LPGVG(서열번호 8)의 반복부를 포함한다. 각종 실시형태에 있어서, ELP는 ELP 아미노산 단위의 적어도 15, 또는 적어도 30, 또는 적어도 60, 또는 적어도 90, 또는 적어도 120, 또는 적어도 180개의 반복부를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, ELP 아미노산 서열은 생리식염수 중에서 단지 37℃ 미만의 전이 온도를 지닌다.

또 다른 실시형태에 있어서, 약제학적 조성물은 융합 단백질이다. 다른 실시형태에 있어서, 약제학적 조성물은 서열번호 14(도 3)를 포함한다.

또 다른 실시형태에 있어서, 지속 방출을 제공하는 아미노산 서열은, 아미노산의 적어도 50%가 초우-파스만 알고리즘(Chou-Fasman algorithm)로 결정된 바와 같은 2차 구조가 없는 생체고분자를 포함하는, 무작위 코일 또는 비구형 연신 구조(non-globular extended structure) 또는 비구조화된 생체고분자(unstructured biopolymer)를 형성한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 지속 방출을 제공하는 아미노산 서열은 연신된, 비구형 구조 또는 무작위 코일 구조를 지니는 단백질이다.

다른 양상에 있어서, 본 발명은, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 환자는 고혈당증, 제1형 당뇨병 혹은 제2형 당뇨병, 또는 비만을 지닌다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 방법은 약제학적 조성물을 1개월당 1 내지 약 30회, 약 주 1회, 또는 주당 약 2 혹은 3회, 또는 약 매일의 빈도로 투여하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 방법은 약제학적 조성물을 피하에 투여하는 단계를 포함한다.

인슐린 아미노산 서열

예컨대, 인간 인슐린의 인슐린 주사는 당뇨병을 치료하기 위하여 이용될 수 있다. 신체의 인슐린-제조 세포들은 β-세포들이라 불리며, 이들은 췌장샘(pancreas gland)에서 발견된다. 이들 세포는 함께 무리지어, 이를 기술하는 영국 의대생의 이름을 따서 명명한 "랑게르한스 섬"을 형성한다.

인슐린의 합성은 염색체 11 상에 존재하는 인슐린 유전자의 변역(translation)에서 시작된다. 번역 동안, 두 인트론이 mRNA 생성물로부터 이어져, 110개 아미노산 길이의 단백질을 암호화한다. 이 일차적 번역 산물은 프레프로인슐린이라 불리며, 비활성이다. 이것은 24개 아미노산 길이의 신호 펩타이드를 포함하며, 세포막을 가로지르는 단백질을 위해 요구된다. 인간 프로인슐린은 31개의 아미노산 C 펩타이드와 함께 연결된 A 및 B 사슬로 구성된다(도 1).

일단 프레프로인슐린이 세포질 세망에 도달하면, 프로테아제는 신호 펩타이드를 절단시켜 프로인슐린을 작성한다. 구체적으로, 일단 이황화 결합이 A 사슬과 B 사슬 사이에 형성되면, 프로인슐린은 트립신/카복시펩티다제 B-형 시스템에 의한 C 펩타이드의 제거에 의해 생체내에서 숙성 인슐린으로 전환된다. 프로인슐린은 3개의 도메인, 즉, 아미노-말단 B 사슬, 카복실-말단 A 사슬, 그리고 C-펩타이드로서 알려진 중간에 있는 접속용 펩타이드로 구성되어 있다. 인슐린은 2개의 이황화물 브릿지에 의해 함께 연결된 A 사슬(21개의 아미노산 - GIVEQCCASVCSLYQLENYCN)(서열번호 15)과 B 사슬(30개의 아미노산 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA)(서열번호 16)이라 불리는 2사슬의 아미노산으로 구성된다. A 사슬의 제6번째 잔기와 제11번째 잔기를 함께 연결하는 A 사슬 내에 제3의 이황화물 브릿지가 있다. 대부분의 종에서, A 및 B 사슬의 길이와 아미노산 조성물은 유사하며, 3개의 이황화 결합의 위치는 고도로 보존된다. 이 이유를 위하여, 돼지 인슐린은 당뇨병 환자에서 결핍된 인간 인슐린 수준을 대체할 수 있다. 오늘날, 돼지 인슐린은 박테리아에 의해 인간 프로인슐린(재조합 인슐린)의 대량 생산에 의해 크게 교체되었다.

인슐린 분자는 용액 중 이량체를 형성하는 경향을 지니고, 아연 이온의 존재 하에, 인슐린 이량체는 육량체로 회합된다. 인슐린의 단량체는 혈액을 통해서 용이하게 확산되어 신속한 효과를 지니는 반면, 육량체는 서서히 확산되어 작용의 지연성을 지닌다. 재조합 인슐린의 설계에서, 인슐린의 구조는 이량체 및 육량체를 형성하지만 인슐린 수용체에 대한 결합을 방해하지는 않는 인슐린 분자의 경향을 저감시키는 방식으로 변형될 수 있다. 이와 같이 해서, 제제의 범위는 짧은 작용성에서 지속적 작용성에 이르는 범위로 다양하게 된다.

세포질 세망 내에서, 프로인슐린은 C-펩타이드를 제거하고 인슐린의 숙성 및 활성 형태를 생성하는 수개의 특이적 펩티다제에 노출된다. 골지 장치(Golgi apparatus)에 있어서, 인슐린 및 유리 C-펩타이드는 β-세포의 세포질 내에서 축적되는 분비 과립으로 포장된다. 과립의 세포외 배출은 베타 세포 내로의 포도당의 진입에 의해 촉발된다. 인슐린의 분비는 대사에 대한 광범위한 영향을 지닌다.

포도당의 상승에 반응하여 2상의 인슐린 방출이 있다. 첫 번째 상은 인슐린의 즉시 방출이다. 이것은 미리 형성된 인슐린의 방출에 기인하며, 이러한 인슐린은 분비 과립에 저장된다. 짧은 지연 후, 새롭게 합성된 인슐린의 제2의 더 연장된 방출이 있다.

일단 방출되면, 인슐린은 효소에 의해 분해되기 전에 짧은 시간 동안만 활성 상태이다. 간 및 신장에서 발견되는 인슐린분해효소는 혈장 내 인슐린 순환을 파괴시키고, 그 결과, 인슐린은 단지 약 6분의 반감기를 지닌다. 이 짧은 작용 지속 기간은 인슐린의 순환 수준에서 신속한 변화를 야기시킨다.

인슐린 유사체는 향상된 치료적 특성을 가지도록 발전되었고(Owens et al ., 2001, Lancet 358: 739-46; Vajo et al ., 2001, Endocr Rev 22: 706-17), 이러한 유사체는 본 발명과 관련하여 이용될 수 있다. 인슐린 B-사슬의 COOH-말단 단부의 연신 및 알부민에 대해 상당한 친화도를 지니는 지방산-아실화 인슐린의 공학적 조작을 포함하는 각종 전략이 지속적-작용성 인슐린 유사체를 생성하는데 이용된다. 그러나, 이용가능한 지속적-작용성 인슐린 화합물에 의한 생체내 치료는 여전히 저혈당증 및 고혈당증 운동의 높은 빈도 및 HbA1c에서의 보통의 감소를 야기시킨다. 따라서, 진정한 지속적-작용성 및 안정적인 인간 인슐린 유사체의 개발은 여전히 중요한 과제를 남기고 있다.

본 발명에 따라 이용될 수 있는 인슐린의 기능적 유사체는, 리스프로(lispro), 아스파르트 및 글루리신 등과 같은 신속 작용성 유사체를 포함하며, 이들은 피하 주사 후 1시간에 피크에 신속하게 흡수되고(30분 미만), 비교적 짧은 작용 지속 기간(3 내지 4시간)을 지닌다. 또한, 2가지 지속적 작용성 인슐린 유사체, 즉, 글라진과 디터머(detemir)가 개발되어 있으며, 이들은 본 발명과 관련하여 이용될 수 있다. 지속적 작용성 인슐린 유사체는 대략 2시간의 작용 개시를 지니고, 4 내지 6시간에 생물학적 작용의 안정기에 도달하며, 24시간까지 지속될 수 있다.

이와 같이 해서, 일 실시형태에 있어서, 인슐린 아미노산 서열은 리스프로(일라이 릴리(Eli Lilly)사의 휴말로그(HUMALOG)라고도 알려져 있음)의 A 및/또는 B 사슬을 함유할 수 있다. 인슐린 리스프로는, 인슐린 B 사슬의 28번 위치에서 프롤린이 라이신으로 치환되고 위치 29번 위치에서 라이신이 프롤린으로 치환됨으로써 인간 인슐린과는 상이하다. 이들 변형은 수용체 결합을 변화시키지 않지만, 이들은 인슐린 이량체 및 육량체의 형성을 차단하는 것을 도와, 보다 많은 양의 활성 단량체성 인슐린이 식후 주사를 위하여 이용가능하게 할 수 있다.

다른 실시형태에 있어서, 인슐린 아미노산 서열은 아스파르트(노보 노디스크사(Novo Nordisk)사의 노볼로그(NOVOLOG)라고도 알려져 있음)의 A 및/또는 B 사슬을 함유할 수 있다. 인슐린 아스파르트는 인간 인슐린 B 사슬의 28번 위치에서 아미노산 프롤린이 아스파르트산으로 단일 대체되도록 설계되어 있다. 이 변형은 인슐린 육량체에 대한 형성을 차단하는 것을 도와, 신속 작용성 인슐린을 작성한다.

또 다른 실시형태에 있어서, 인슐린 아미노산 서열은 글루리신(사노피-어벤티스(Sanofi-Aventis)사의 아피드라(APIDRA)라고도 알려져 있음)의 A 및/또는 B 사슬을 함유할 수 있다. 인슐린 글루리신은 인간 인슐린 B 사슬의 3번 위치에서 아스파라긴이 라이신으로 치환되고 29번 위치에서 아리신이 글루타미으로 치환되어 착성된 단기 작용성 유사체이다. 인슐린 글루리신은 규칙적 인간 인슐린과 비교해서 더 신속한 작용 개시와 더 짧은 작용 지속 기간을 지닌다.

다른 실시형태에 있어서, 인슐린 아미노산 서열은 글라진(사노피-어벤티스사의 란투스(LANTUS)라고도 알려져 있음)의 A 및/또는 B 사슬을 함유할 수 있다. 란투스(LANTUS)는 중성 생리적 pH의 존재 하에서 인슐린 결정의 미세침전 형성을 초래하는 그의 산성 pH로 인해 지연된 흡수를 지닌다. 인슐린 글라진은, A 사슬의 21번 위치에 있는 아미노산 아스파라긴이 글라이신으로 대체되고 2개의 아르기닌이 B-사슬의 C-말단에 부가되어 있다는 점에서 인간 인슐린과는 상이하다. 취침 시의 중성 프로타민 하게돈(neutral protamine Hagedorn: NPH) 인슐린(중간 작용성 인슐린)과 비교해서, 인슐린 글라진은 제2형 당뇨병을 가진 환자에서 더 적은 야행성 저혈당증과 연관된다.

또 다른 실시형태에 있어서, 인슐린 아미노산 서열은 디터머(노보 노디스크사의 레베미어(LEVEMIR)라고도 알려져 있음)로부터의 A 및/또는 B 사슬을 함유하고 있다. 인슐린 디터머는 가용성(중성 pH에서) 지속적-작용성 인슐린 유사체이고, 여기서 B30에서의 아미노산 트레오닌이 제거되고 14-탄소, 미리스토일 지방산이 LysB29의 엡실론-아미노기에 아세틸화된다. 피하 주사 후, 디터머는 해리됨으로써, 유리 지방산을 노출시켜 알부민 분자에 대한 가역적 결합을 가능하게 한다. 따라서 정상 상태에서, 유리 상태의 비결합 인슐린의 농도는 크게 저감되어 안정적인 혈장 포도당 수준을 초래한다.

몇몇 실시형태에 있어서, 인슐린 아미노산 서열은 단일-사슬 인슐린 유사체(SIA)(예컨대 미국 특허 제6,630,438호 및 WO 2008/019368에 기재된 바와 같으며, 이들 문헌은 참조로 그들의 전문이 본 명세서에 포함됨)일 수 있다. 단일-사슬 인슐린 유사체는 일군의 구조적으로-관련된 단백질을 포함하며, 여기서 A 사슬과 B 사슬은 폴리펩타이드 링커에 의해 공유 결합되어 있다. 폴리펩타이드 링커는 B 사슬의 C-말단을 A 사슬의 N-말단에 접속시킨다. 링커는, 해당 링커가 SIA에 대해서 포도당 흡수 및 인슐린 수용체 결합 효과를 지니니게 하는데 필요한 구조 형태를 제공하는 한 어떠한 길이여도 된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 링커는 약 5 내지 18개의 아미노산 길이이다. 다른 실시형태에 있어서, 링커는 약 9 내지 15개의 아미노산 길이이다. 소정의 실시형태에 있어서, 링커는 약 12개의 아미노산 길이이다. 소정의 예시적인 실시형태에 있어서, 링커는 서열 KDDNPNLPRLVR(서열번호 17) 또는 GAGSSSRRAPQT(서열번호 18)를 갖는다. 그러나, 이 서열의 많은 변이가 포도당 흡수 및 인슐린 수용체 결합 활성에서 생산된 SIA의 효율을 실질적으로 손상시키는 일 없이 아미노산의 길이(부가 및 결실의 둘 모두) 및 치환 등에서 가능한 것임이 이해되어야 한다. 예를 들어, 수개의 상이한 아미노산 잔기는 생산된 SIA의 활성을 실질적으로 감소시키는 일 없이 어느 한쪽 단부로부터 부가되거나 제거될 수 있다.

현재 임상 개발 중에 있는 예시적인 단일-사슬 인슐린 유사체는 알부린(albulin)이다(Duttaroy et al ., 2005, Diabetes 54: 251-8). 알부린은 효모 내 혹은 포유동물 세포 내에서 생산될 수 있다. 이것은 도데카펩타이드 링커에 의해 함께 연결되고 천연 인간 혈청 알부민의 NH2 말단에 융합된 인간 인슐린(천연 인간 인슐린에 대해서 100% 동일성)의 B 및 A 사슬로 구성되어 있다. 알부린의 발현 및 정제를 위하여, Duttaroy 등은 4개의 중첩된 프라이머 및 PCR 증폭을 이용해서 도데카펩타이드 링커에 의해 함께 연결된 숙성 인간 인슐린의 B- 및 A- 사슬을 포함하는 단일-사슬 인슐린을 암호화하는 합성 유전자 작제물을 구축하였다. 얻어지는 PCR 산물은, 효모에서의 발현을 위하여 pSAC35 벡터 내에 포함된, 인간 혈청 알부민(HSA)의 신호 펩타이드와 숙성 HSA의 NH2 말단 사이에서 프레임내 결찰되었다. 본 발명에 따라서, 알부린의 HSA 성분은 본 명세서에 기재된 바와 같은 지속 방출을 제공하는 아미노산 서열과 대체될 수 있다.

이와 같이 해서, 일 양상에 있어서, 본 발명은, 예를 들어, 엘라스틴-유사 펩타이드(ELP)를 포함하는 지속 방출을 제공하는 아미노산 서열 및 인슐린 아미노산 서열을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 예를 들어, 소정의 실시형태에 있어서, 인슐린은 포유동물 인슐린, 예컨대, 인간 인슐린 혹은 돼지 인슐린이다. 본 발명에 따라서, 지속 방출 성분을 제공하는 아미노산 서열은, 인슐린 A 사슬 또는 B 사슬, 또는 둘 모두에 (예컨대, 재조합 융합 또는 화학적 컨쥬게이션을 통해서) 커플링될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 주사 부위로부터 느린 흡수를 제공하는 아미노산 서열은 인슐린 A 사슬에 공유 결합된다. 인슐린은 A, B 및 C 사슬 각각(서열번호 19 및 20)을 포함할 수 있거나, 또는 A 및 B 사슬만을 함유하는, 처리된 형태를 함유할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, A 및 B 사슬은 짧은 연결용 펩타이드에 의해 접속되어, 단일 사슬 인슐린을 작성한다. 인슐린은 1, 2, 3 또는 약 5개의 아미노산을 비롯하여, 1 내지 10개의 아미노산에 의해 (A 및 B 사슬 중 어느 한쪽 또는 양쪽 모두의) N-말단 및/또는 C-말단에서 절단된 기능적 단편을 포함하는, 인간 인슐린의 기능적 유사체일 수 있다. 기능적 유사체는 천연 서열(예컨대, 서열번호 15 및 16)에 관하여 1 내지 10개의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환(일괄적으로)을 함유할 수 있되, 각 경우에 펩타이드의 활성을 보유한다. 예를 들어, 기능적 유사체는 천연 서열(A 및 B 사슬, 또는 A, B 및 C 사슬을 함유할 수 있음)에 관하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환(일괄적으로)을 지닐 수 있다. 이러한 활성은 본 명세서에 기재된 것들을 포함하는, 임의의 입수가능한 검정법을 이용해서 확인 또는 검정될 수 있다. 이들 혹은 다른 실시형태에 있어서, 인슐린 성분은 A 및 B 사슬에 대해서 천연 서열(서열번호 15 및 16)의 각각과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 동일성을 지닌다. 두 서열 간(예컨대, 천연 서열과 기능적 유사체 간) 서열 동일성의 판정은, [Tatusova et al ., Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250 (1999)]를 포함하는, 임의의 정렬 툴을 이용해서 달성될 수 있다. 인슐린 성분은 당업계에 공지된 추가적인 화학적 변성을 포함할 수 있다.

인슐린 유사체 또는 지속 방출을 제공하는 아미노산 서열-함유 인슐린 유사체의 시험관내 결합 특성을 특성 규명하기 위하여, 경쟁 결합 검정(competition binding assay)이 인슐린 수용체를 발현하는 각종 세포주에서 수행될 수 있다(Jehle et al ., 1996, Diabetologia 39: 421-432). 예를 들어, 인간 인슐린 수용체를 과발현하는 CHO 세포를 이용하는 경쟁 결합 검정이 이용될 수 있다. 인슐린은 또한 인슐린 수용체보다 낮은 친화도를 지니는 IGF-1 수용체에 결합될 수 있다. 지속 방출을 제공하는 아미노산 서열-함유 인슐린 유사체의 결합 친화도를 결정하기 위하여, 경쟁 결합 검정은 L6 세포에서 ¹²⁵I-표지된 IGF-1을 이용해서 수행될 수 있다.

인슐린의 활성은 간의 포도당 생산의 저해 및 주변적 포도당 처분(peripheral glucose disposal)의 촉진을 포함한다. 이들 생물학적 활성을 매개하는 지속 방출을 제공하는 아미노산 서열-함유 인슐린 유사체의 능력은 공지된 방법을 이용해서 시험관내에서 검정될 수 있다. 예를 들어, 3T3-L1 지방세포 내에서 포도당 흡수에 대한 지속 방출을 제공하는 아미노산 서열-함유 유사체의 효과가 측정되어 인슐린의 것과 비교될 수 있다. 생물학적으로 활성인 유사체에 의한 세포의 전처리는 일반적으로 2-데옥시글루코스 흡수의 용량-의존적 증가를 발생할 것이다. 포도당 생산을 조절하는 지속 방출을 제공하는 아미노산 서열-함유 인슐린 유사체의 능력은 임의의 다수의 세포 유형, 예를 들어, H4IIe 간암 세포에서 측정될 수 있다. 이 검정에서, 생물학적으로 활성인 유사체에 의한 전처리는 일반적으로 포도당 방출량의 용량-의존적 저해를 초래할 것이다.

지속 방출을 제공하는 아미노산 서열

몇몇 실시형태에 있어서, 지속 방출을 제공하는 아미노산 서열은 단백질 골격 기들 및/또는 곁사슬 기들을 통해서 수소-결합들을 형성하는 구조 단위들을 포함하며, 이들은 기질 형성에 대해서 소수성 상호작용을 부여할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 아미노산 곁사슬은 수소 결합 공여자 기들을 포함하지 않지만, 수소 결합은 단백질 골격을 통해서 실질적으로 형성된다. 예시적인 아미노산으로는 프롤린, 알라닌, 발린, 글라이신 및 아이소류신, 그리고 유사한 아미노산을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 구조 단위는, 실질적 반복 구조 모티프, 및 실질적 반복 수소-결합능을 형성하도록, 실질적 반복 구조 단위이다. 이들 및 다른 실시형태에 있어서, 아미노산 서열은, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 40% 또는 적어도 50% 프롤린을 포함하되, 이는 실질적 반복 패턴으로 위치될 수 있다. 프롤린의 실질적 반복 패턴은 반복되는 β-회전 구조를 작성할 수 있다. 이 맥락에서, 실질적 반복 패턴이란, 아미노산 서열의 프롤린 잔기의 적어도 50% 또는 적어도 75%가 규정가능한 구조 단위의 일부인 것을 의미한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 아미노산 서열은, 세린, 트레오닌 및/또는 티로신 등과 같은, 수소-결합 공여자 곁사슬을 가진 아미노산을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 반복 서열은 1 내지 약 4개의 프롤린 잔기를 포함할 수 있고, 나머지 잔기는, 글라이신, 알라닌, 류신, 아이소류신 및 발린 등과 같은 비극성 잔기로부터 독립적으로 선택된다. 비극성 혹은 소수성 잔기는 기질의 형성에 대한 소수성 상호작용을 부여할 수 있다.

아미노산 서열은 저장 온도보다 높은 온도에서 주사 시 "겔-유사" 상태를 형성할 수 있다. 예시적인 서열은 반복 펩타이드 단위를 갖고/갖거나, 보다 낮은 온도에서 비교적 비구조화될 수 있고, 보다 높은 온도에서 수소-결합되어 구조화된 상태를 달성할 수 있다.

몇몇 실시형태에 있어서, 체온에서 기질을 형성할 수 있는 아미노산 서열은 4 내지 10개의 아미노산의 반복 단위를 가진 펩타이드이다. 반복 단위는 기질의 형성 시 1, 2 혹은 3개의 수소 결합을 형성할 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, 체온에서 기질을 형성할 수 있는 아미노산 서열은 실크, 엘라스틴, 콜라겐 혹은 케라틴, 또는 이들의 모방체의 아미노산 서열, 또는 미국 특허 제6,355,776호에 개시된 아미노산 서열이며, 이 문헌은 참조로 본 명세서에 포함된다.

소정의 실시형태에 있어서, 아미노산 서열은 엘라스틴-유사-단백질(ELP) 서열이다. ELP 서열은 엘라스틴 단백질과 관련된 구조 펩타이드 단위 또는 서열 또는 그들의 모방체를 포함하거나 이로써 구성된다. ELP 서열은 3 내지 약 20개의 아미노산, 또는 몇몇 실시형태에서는, 4 내지 10개의 아미노산, 예컨대, 4, 5 또는 6개의 아미노산의 구조 단위로 구성된다. 개별 구조 단위의 길이는 다양할 수 있거나, 혹은 균일할 수 있다. 예시적인 구조 단위로는, 탄뎀-반복 단위를 포함하는 반복 구조 단위로서 이용될 수 있거나 몇몇 조합으로 이용될 수 있는, 서열번호 1 내지 12(이하)로 정의된 단위들을 포함한다. 이와 같이 해서, ELP는 이하에 정의된 바와 같은 서열번호 1 내지 12로부터 선택된 구조 단위(들)를 포함하거나 이들로 본질적으로 구성될 수 있다.

구조 단위가 ELP 단위인 실시형태들을 포함하는 몇몇 실시형태에 있어서, 아미노산 서열은, 서열번호 1 내지 12로 정의된 단위들 중 하나 혹은 조합 등과 같은, 약 10 내지 약 500개의 구조 단위, 또는 소정의 실시형태에서는, 약 50 내지 약 200개의 구조 단위, 또는 소정의 실시형태에서는 약 80 내지 약 200개의 구조 단위, 또는 약 80 내지 약 150개의 구조 단위를 포함하거나 이로써 본질적으로 구성된다. 이와 같이 해서, 구조 단위들은 일괄적으로 약 50 내지 약 2000개의 아미노산 잔기, 또는 약 100 내지 약 800개의 아미노산 잔기, 또는 약 200 내지 약 700개의 아미노산 잔기, 또는 약 400 내지 약 600개의 아미노산 잔기의 길이를 지닐 수 있다.

아미노산 서열은 선택된 제형에 의해 가시적 및 가역적 역상 전이를 발휘할 수 있다. 즉, 아미노산 서열은 전이 온도(Tt) 이하에서 제형 중에 고도로 가용성이고 구조적으로 무질서할 수 있지만, 제형의 온도가 Tt 이상으로 상승되면 첨예한(2 내지 3℃ 범위) 무질서-대-질서 상 전이를 발휘할 수 있다. 온도 이외에도, 아미노산 고분자(즉, 중합체)의 길이, 아미노산 조성물, 이온 강도, pH, 압력, 온도, 선택된 용매, 유기 용질의 존재 및 단백질 농도가 또한 전이 특성에 영향을 미칠 수 있고, 이들은 목적으로 하는 흡수 프로파일을 위하여 제형에 맞춤화될 수 있다. 흡수 프로파일은 시간 경과에 따른 인슐린 아미노산 서열의 활성 혹은 혈장 농도를 결정함으로써 용이하게 테스트될 수 있다.

소정의 실시형태에 있어서, ELP 성분(들)은 이하를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌 구조 단위들로 형성될 수 있다:

(a) 테트라펩타이드 Val-Pro-Gly-Gly 또는 VPGG(서열번호 1);

(b) 테트라펩타이드 Ile-Pro-Gly-Gly 또는 IPGG(서열번호 2);

(c) 펜타펩타이드 Val-Pro-Gly-X-Gly(서열번호 3) 또는 VPGXG, 여기서 X는 임의의 천연 혹은 비천연 아미노산 잔기이고, 또한 X는 중합체 또는 올리고머 반복부 중에서 선택적으로 가변적임;

(d) 펜타펩타이드 Ala-Val-Gly-Val-Pro 또는 AVGVP(서열번호 4);

(e) 펜타펩타이드 Ile-Pro-Gly-X-Gly 또는 IPGXG(서열번호 5), 여기서 X는 임의의 천연 혹은 비천연 아미노산 잔기이고, 또한 X는 중합체 또는 올리고머 반복부 중에서 선택적으로 가변적임;

(f) 펜타펩타이드 Ile-Pro-Gly-Val-Gly 또는 IPGVG(서열번호 6);

(g) 펜타펩타이드 Leu-Pro-Gly-X-Gly 또는 LPGXG(서열번호 7), 여기서 X는 임의의 천연 혹은 비천연 아미노산 잔기이고, 또한 X는 중합체 또는 올리고머 반복부 중에서 선택적으로 가변적임;

(h) 펜타펩타이드 Leu-Pro-Gly-Val-Gly 또는 LPGVG(서열번호 8);

(i) 헥사펩타이드 Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly 또는 VAPGVG(서열번호 9);

(j) 옥타펩타이드 Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Val-Gly 또는 GVGVPGVG(서열번호 10);

(k) 노나펩타이드 Val-Pro-Gly-Phe-Gly-Val-Gly-Ala-Gly 또는 VPGFGVGAG(서열번호 11); 및

(l) 노나펩타이드 Val-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Gly 또는 VPGVGVPGG(서열번호 12).

서열번호 1 내지 12에 의해 정의된 이러한 구조 단위는 구조적 반복 단위들을 형성할 수 있거나, 또는 ELP를 형성하기 위하여 조합하여 이용될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, ELP 성분은 서열번호 1 내지 12로부터 선택된 (예컨대, 2, 3 또는 4개의) 구조 단위 중 하나 혹은 이들의 조합으로 전체적으로(또는 거의 전체적으로) 형성된다. 다른 실시형태에 있어서, ELP 성분의 적어도 75% 또는 적어도 80% 또는 적어도 90%는 서열번호 1 내지 12로부터 선택된 구조 단위들 중 하나 혹은 이들의 조합으로 형성되고, 이는 반복 단위들로서 존재할 수도 있다.

소정의 실시형태에 있어서, ELP는 Val-Pro-Gly-X-Gly(서열번호 3)의 탄뎀 반복 단위들을 포함하는 반복 단위들을 포함하되, 여기서 X는 위에서 정의된 바와 같고, 또한 전체 ELP 성분에 관하여 취해진 Val-Pro-Gly-X-Gly(서열번호 3) 단위(VPGXG(서열번호 3) 이외의 구조 단위들을 포함할 수 있음)의 퍼센트는 ELP의 약 50% 이상 또는 약 75% 이상 또는 약 85% 이상 또는 약 95% 이상이다. ELP는 서열번호 3의 5 내지 15개의 구조 단위(예컨대 약 10개의 구조 단위)의 모티프를 함유할 수 있되, 게스트 잔기 X는 해당 모티프의 단위들의 적어도 2개 혹은 적어도 3개 중에서 다양하다. 게스트 잔기는 아미노산 V, I, L, A, G 및 W 등과 같은 비극성 혹은 소수성 잔기 등으로부터 독립적으로 선택될 수 있다(그리고 목적으로 하는 역상 전이 특성을 보유하도록 선택될 수 있다).

몇몇 실시형태에 있어서, ELP는 β-회전 구조를 형성할 수 있다. β-회전 구조를 형성하는데 적합한 예시적인 펩타이드 서열은 국제 특허 출원 제PCT/US96/05186호에 기술되어 있으며, 이 문헌은 참조로 그의 전문이 본 명세서에 포함된다. 예를 들어, 서열 VPGXG(서열번호 3)에서 네 번째 잔기(X)는 β-회전의 형성을 제외하는 일 없이 변경될 수 있다.

예시적인 ELP의 구조는 표기 ELPk [XiYj-n]을 이용해서 기재될 수 있으며, 여기서 k는 특정 ELP 반복 단위를 지칭하고, 꺽쇠괄호 안의 대문자는 단일 문자 아미노산 코드이고, 그들의 대응하는 아래에 쓴 문자는 (적용가능한 경우) 구조 단위 내 각 게스트 잔기 X의 상대비를 지칭하며, n은 구조 반복부의 수 중 ELP의 총 길이를 기술한다. 예를 들어, ELP1 [V5A2G3-10]은 펜타펩타이드 VPGXG(서열번호 3)의 10개의 반복 단위를 함유하는 ELP 성분을 지칭하며, 여기서 X는 상대비 약 5:2:3의 발린, 알라닌 및 글라이신이고; ELP1 [K1V2F1-4]는 펜타펩타이드 VPGXG(서열번호 3)의 4개의 반복 단위를 함유하는 ELP 성분을 지칭하며, 여기서 X는 상대비 약 1:2:1의 라이신, 발린 및 페닐알라닌이고; ELP1 [K1V7F1-9]는 펜타펩타이드 VPGXG(서열번호 3)의 9개의 반복 단위를 함유하는 폴리펩타이드를 지칭하며, 여기서 X는 상대비 약 1:7:1의 라이신, 발린 및 페닐알라닌이고; ELP1 [V-5]는 펜타펩타이드 VPGXG(서열번호 3)의 5개의 반복 단위를 함유하는 폴리펩타이드를 지칭하며, 여기서 X는 발린이고; ELP1 [V-20]은 펜타펩타이드 VPGXG(서열번호 3)의 20개의 반복 단위를 함유하는 폴리펩타이드를 지칭하며, 여기서 X는 발린이고; ELP2 [5]는 펜타펩타이드 AVGVP(서열번호 4)의 5개의 반복 단위를 함유하는 폴리펩타이드를 지칭하고; ELP3 [V-5]는 펜타펩타이드 IPGXG(서열번호 5)의 5개의 반복 단위를 함유하는 폴리펩타이드를 지칭하며, 여기서 X는 발린이고; ELP4 [V-5]는 펜타펩타이드 LPGXG(서열번호 7)의 5개의 반복 단위를 함유하는 폴리펩타이드를 지칭하며, 여기서 X는 발린이다.

ELP에 관하여, Tt는 게스트 잔기의 소수성의 함수이다. 이와 같이 해서, 게스트 잔기(들)의 동일성 및 그들의 몰 분율(들)을 변화시킴으로써, 광범위에 걸쳐서 역 전이를 보이는 ELP들이 합성될 수 있다. 이와 같이 해서, 주어진 ELP 길이에서의 Tt는 ELP 서열 내 소수성 게스트 잔기의 보다 큰 분획을 혼입함으로써 저감될 수 있다. 적절한 소수성 게스트 잔기의 예로는 발린, 류신, 아이소류신, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 적절하게 소수성인 티로신이 또한 이용될 수 있다. 역으로, Tt는 글루탐산, 시스테인, 라이신, 아스파테이트, 알라닌, 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 글라이신, 아르기닌 및 글루타민으로부터 선택된 것들 등과 같은 잔기를 혼입시킴으로써 증가될 수 있다.

분자량 > 100,000을 지니는 폴리펩타이드를 위하여, 제PCT/US96/05186호(이 문헌은 참조로 그들의 전문이 본 명세서에 포함됨)에 개시된 소수성 규모는 특정 ELP 서열의 대략의 Tt를 예측하기 위한 하나의 수단을 제공한다. 분자량 <100,000을 지니는 폴리펩타이드를 위하여, Tt는 이하의 이차 함수에 의해 예측되거나 결정될 수 있다: Tt = M0 + M1X + M2X2(여기서, X는 융합 단백질의 MW이고, M0 = 116.21; M1 = -1.7499; M2 = 0.010349이다).

ELP는 몇몇 실시형태에 있어서 제형 조건에서 약 10 내지 약 37℃, 예컨대, 약 20 내지 약 37℃ 또는 약 25 내지 약 37℃ 범위의 Tt를 제공하도록 선택되거나 설계된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 생리학적 조건(예컨대, 0.9% 식염수)에서 전이 온도는 다소 낮은 주변 온도를 고려해서 약 34 내지 36℃이다.

소정의 실시형태에 있어서, 체온에서 수소-결합된 기질을 형성할 수 있는 아미노산 서열은 [VPGXG]₉₀(서열번호 31)을 포함하며, 여기서 각각의 X는 V, G 및 A로부터 선택되고, V:G:A의 비는 약 5:3:2일 수 있다. 예를 들어, 체온에서 수소-결합된 기질을 형성할 수 있는 아미노산 서열은 [VPGXG]₁₂₀(서열번호 32)을 포함하며, 여기서 각각의 X는 V, G 및 A로부터 선택되고, V:G:A의 비는 약 5:3:2일 수 있다. 본 명세서에 표시된 바와 같이, 이 ELP의 120개의 구조 단위는 약 5 내지 15 mg/ml(예컨대, 약 10 mg/ml)의 단백질을 이용해서 약 37℃에서 전이 온도를 제공할 수 있다. 약 40 내지 약 100 mg/mL의 농도에서, 상 전이 온도는 약 35℃(체온 바로 아래)이며, 이는 주변 체온이 37℃ 미만이 되도록 허용한다.

대안적으로, 체온에서 기질을 형성할 수 있는 아미노산 서열은 [VPGVG]₉₀(서열번호 31) 또는 [VPGVG]₁₂₀(서열번호 32)을 포함한다. 본 명세서에 표시된 바와 같이, 이 ELP의 120개의 구조 단위는 약 0.005 내지 약 0.05 mg/ml(예컨대, 약 0.01 mg/ml)의 단백질을 이용해서 약 37℃에서 전이 온도를 제공할 수 있다.

엘라스틴-유사-펩타이드(ELP) 단백질 중합체 및 재조합 융합 단백질은 미국 특허 공개 제2010/0022455호에 기재된 바와 같이 제조될 수 있으며, 이 문헌은 참조로 본 명세서에 포함된다.

다른 실시형태에 있어서, 체온에서 기질을 형성할 수 있는 아미노산 서열은 무작위 코일 또는 비구형 연신 구조를 포함할 수 있다. 예를 들어, 체온에서 기질을 형성할 수 있는 아미노산 서열은 미국 특허 공개 제2008/0286808호, WIPO 특허 공개 제2008/155134호 및 미국 특허 공개 제2011/0123487호에 개시된 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이들 문헌의 각각은 참조로 본 명세서에 포함된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 체온에서 기질을 형성할 수 있는 아미노산 서열은 세린, 알라닌 및 글라이신 잔기 중 하나 이상을 지니는 프롤린으로 대부분 구성될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 체온에서 기질을 형성할 수 있는 아미노산 서열은 50% 또는 60% 또는 70% 또는 75% 또는 80% 또는 90%의 프롤린, 세린, 알라닌 및 글라이신 잔기(일괄적으로)이다.

예를 들어, 몇몇 실시형태에 있어서, 아미노산 서열은 적어도 40개의 아미노산의 비구조화된 재조합 중합체를 포함한다. 예를 들어, 비구조화된 중합체는, 비구조화된 중합체 내에 포함된 글라이신(G), 아스파테이트(D), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P) 잔기의 합계가 총 아미노산의 약 80% 이상을 구성할 경우로 정의될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 적어도 50%의 아미노산은 초우-파스만 알고리즘에 의해 결정된 바와 같은 2차 구조가 없다. 비구조화된 중합체는 약 100, 150, 200개 혹은 그 이상의 인접한 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 아미노산 서열은 무작위 코일 영역을 형성한다. 특히, "무작위 코일 형태"를 갖거나 형성하는 폴리펩타이드 혹은 아미노산 중합체는 정의된 2차 혹은 3차 구조를 실질적으로 결여한다.

각종 실시형태에 있어서, 의도된 대상체는 인간이고, 체온은 약 37℃이며, 따라서 약제학적 조성물은 이 온도에서 지속 방출을 제공하도록 설계된다. 수소 결합 및/또는 소수성 상호작용의 반전에 의해 순환으로의 서방출(slow release)은 체온이 일정하게 유지된다고 해도, 주사 부위에서 생성물이 확산됨에 따라서 농도의 강하에 의해 기동된다. 다른 실시형태에 있어서, 대상체는 인간이 아닌 포유동물이며, 약제학적 조성물은, 몇몇 실시형태에서는 소정의 애완동물(예컨대, 개 혹은 고양이) 또는 가축(예컨대, 소, 말, 양 혹은 돼지) 등과 같은 포유동물의 체온(약 30 내지 약 40℃일 수 있음)에서 지속 방출을 발휘하도록 설계되어 있다. 일반적으로, Tt는 제형의 저장 온도(10 내지 약 25℃ 또는 15 내지 22℃일 수 있음)보다 높으므로, 약제학적 조성물은 주사용 용액인 채로 있게 된다.

몇몇 실시형태에 있어서, 서방출은 본 발명의 약제학적 조성물의 냉 제형(예컨대 2 내지 15℃ 또는 2 내지 10℃ 또는 2 내지 5℃)을 투여함으로써 이루어진다. 따라서, 몇몇 실시형태에 있어서, 냉 제형이 제공된다. 냉 제형은 약 2 내지 약 3℃, 약 2 내지 약 4℃, 약 2 내지 약 5℃, 약 2 내지 약 6℃, 약 2 내지 약 7℃, 약 2 내지 약 8℃, 약 2 내지 약 10℃, 약 2 내지 약 12℃, 약 2 내지 약 14℃, 약 2 내지 약 15℃, 약 2 내지 약 16℃, 약 2 내지 약 20℃, 약 10 내지 약 25℃, 또는 15 내지 22℃에서 투여될 수 있다.

약제학적 조성물은, 제제가 병적 부위 혹은 작용 부위에 국소적으로 전달되지 않는 것을 의미하는 일반적으로 "전신 전달"을 위한 것이다. 대신에, 제제는 주사 부위로부터 혈류 내로 흡수되며, 이때 제제는 순환을 통해서 작용 부위로 이송되거나 전신적으로 작용한다.

지속 방출

일 양상에 있어서, 본 발명은 지속 방출 약제학적 제형을 제공한다. 상기 제형은 전신 투여용의 약제학적 조성물을 포함하되, 여기서 약제학적 조성물은 인슐린 아미노산 서열 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 대상체의 체온에서 가역적 기질을 형성할 수 있는 아미노산 서열(즉, 지속 방출을 제공하는 아미노산 서열)을 포함한다. 가역적 기질은 소수성 기여로부터 뿐만 아니라 수소 결합(예컨대, 분자내- 및/또는 분자간 수소 결합)으로부터 형성된다. 제형은 투여 시 기질의 형성을 유도하는 1종 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제를 더 포함한다. 기질은 주사 부위로부터의 순환에 대해서 느린 흡수를 제공한다. 주사 부위로부터의 지속 방출 혹은 느린 흡수는, 주사 부위에서 농도가 소실됨에 따른 기질의 느린 반전에 연유한다. 일단 생성물이 순환으로 이동하면, 제형은 긴 반감기 및 개선된 안정성을 부여한다. 이와 같이 해서, 느린 흡수와 긴 반감기의 독특한 조합이 달성되어 얕은 피크 대 최저 비 및/또는 긴 Tmax를 지니는 목적으로 하는 PK 프로파일이 얻어진다.

구체적으로, 본 발명은 낮은 비의 피크 대 최저 및/또는 긴 Tmax를 지니는 비교적 평탄한 PK 프로파일을 포함하는, 인슐린 아미노산 서열과 유사한 펩타이드 서열용의 개선된 약동학을 제공한다. PK 프로파일은 몇몇 실시형태에 있어서 1 내지 8회 주사 등과 같은 비교적 저빈도의 투여 스케줄로 유지될 수 있다.

일 양상에 있어서, 본 발명은 지속 방출 약제학적 제형을 제공한다. 제형은 전신 투여용의 약제학적 조성물을 포함하며, 이때 약제학적 조성물은 대상체의 체온에서 기질을 형성할 수 있는 아미노산 서열 및 인슐린 아미노산 서열을 포함한다. 가역적 기질은 소수성 기여로부터 뿐만 아니라 수소 결합(예컨대, 분자내- 및/또는 분자간 수소 결합)으로부터 형성된다. 제형은 투여 시 기질의 형성을 유도하는 1종 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제를 더 포함한다. 기질은 주사 부위로부터의 순환에 대해서 느린 흡수를 제공하며, 이론에 의해 얽매이는 일 없이, 이 느린 흡수는 단백질 농도가 주사 부위에서 감소됨에 따른 기질의 느린 역전에 연유한다. 느린 흡수 프로파일은 편리하고 편안한 투여 요법뿐만 아니라 평탄한 PK 프로파일을 제공한다. 예를 들어, 각종 실시형태에 있어서, 여러 날의 과정(예컨대, 2 내지 약 60일 또는 약 4 내지 약 30일)에 걸친 인슐린 아미노산 서열의 혈장 농도는 약 10배 이상 혹은 약 5배 이상 혹은 약 3배 이상 변하지 않는다. 일반적으로, 이 평탄한 PK 프로파일은 제형의 복수회의(실질적으로 균일하게 간격을 둔) 투여, 적어도 2회, 적어도 약 5회 또는 적어도 약 10회의 투여에 걸쳐서 보여진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 느린 흡수는 약 5시간 이상, 약 10시간 이상, 약 20시간 이상, 약 30시간 이상 또는 약 50시간 이상의 Tmax(최대 혈장 농도까지의 시간)에 의해 발휘된다.

주사 부위로부터의 지속 방출 또는 느린 흡수는, 제형의 성분뿐만 아니라 대상체의 체온에서도 수소-결합된 기질을 형성할 수 있는 아미노산 서열에 의해 제어된다.

제형은 투여 시 기질의 형성을 유발하는 1종 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제를 포함한다. 예를 들어, 이러한 부형제로는 염, 및 수소 결합을 안정화시키도록 작용할 수 있는 기타 부형제를 포함한다. 예시적인 염으로는, 나트륨, 칼륨 및 칼슘 등과 같은 알칼리 토금속염을 포함한다. 상대 이온은 염화물 및 인산염을 포함한다. 예시적인 염은 염화나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘, 염화칼슘 및 인산칼륨을 포함한다.

제형 중의 단백질 농도는, 부형제와 함께, 투여 온도에서 기질의 형성을 기동시키도록 맞춤화된다. 예를 들어, 보다 높은 단백질 농도는 기질의 형성을 기동시키는 것을 돕고, 이 목적을 위하여 필요로 되는 단백질 농도는 이용되는 ELP 시리즈에 따라서 변화된다. 예를 들어, ELP1-120, 또는 견줄만한 전이 온도를 지니는 아미노산 서열을 이용하는 실시형태에 있어서, 단백질은 약 1 mg/mL 내지 약 200 mg/mL의 범위에 존재하거나, 또는 약 5 mg/mL 내지 약 125 mg/mL의 범위에 존재한다. 약제학적 조성물은 약 10 mg/mL 내지 약 50 mg/mL 또는 약 15 mg/mL 내지 약 30 mg/mL의 범위에 존재할 수 있다. ELP4-120, 또는 견줄만한 전이 온도를 지니는 아미노산 서열을 이용하는 실시형태에 있어서, 단백질은 약 0.005 mg/mL 내지 약 50 mg/mL의 범위로 존재하거나, 또는 약 0.01 mg/mL 내지 약 20 mg/mL의 범위로 존재한다.

약제학적 조성물은 pH, 이온 강도에서, 그리고 일반적으로 체온에서(예컨대, 37℃, 또는 몇몇 실시형태에서는 34 또는 36℃에서) 기질의 형성을 기동시키기에 충분한 부형제와 함께 조제된다. 약제학적 조성물은 저장 조건에서는 기질을 형성하지 못하도록 일반적으로 제조된다. 저장 조건은 일반적으로 제형의 전이 온도 이하, 예컨대, 약 32℃ 이하 또는 약 30℃ 이하 또는 약 27℃ 이하 또는 약 25℃ 이하 또는 약 20℃ 이하 또는 약 15℃ 이하이다. 예를 들어, 제형은 혈액과 등장성일 수 있거나, 또는 생리학적 조건을 모방한 이온 강도를 지닐 수 있다. 예를 들어, 제형은 적어도 25mM 염화나트륨의 이온 강도, 또는 적어도 30mM 염화나트륨의 이온 강도, 또는 적어도 40mM 염화나트륨의 이온 강도, 또는 적어도 50mM 염화나트륨의 이온 강도, 또는 적어도 75mM 염화나트륨의 이온 강도, 또는 적어도 100mM 염화나트륨의 이온 강도, 또는 적어도 150mM 염화나트륨의 이온 강도를 지닐 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, 제형은 약 0.9% 식염수의 이온 강도보다 낮은 이온 강도를 지닌다. 몇몇 실시형태에 있어서, 제형은 염화칼슘, 염화마그네슘, 염화칼륨, 제1인산칼륨(potassium phosphate monobasicc), 염화나트륨 및 인산수소이나트륨(sodium phosphate dibasic) 중 둘 이상을 포함한다.

소정의 실시형태에 있어서, 제형은 약 50mM 히스티딘, 또는 40mM 히스티딘, 또는 약 30mM 히스티딘, 또는 약 25mM 히스티딘, 또는 약 20mM 히스티딘, 또는 약 15mM 히스티딘을 포함할 수 있다.

액체 제형은 약 100mM 염화나트륨 및 약 20mM 히스티딘을 포함할 수 있고, 냉장에서 혹은 실온에서 저장될 수 있다. 염 농도는 주사 부위에서 등장성을 제공하도록 변경될 수 있다.

제형은 주 1회, 주 2회, 또는 1개월당 1 내지 8회의 투여를 위하여 사전 투여된 펜 혹은 시린지의 형태로 포장될 수 있거나, 또는 대안적으로 통상의 바이알 등에 채워져 있을 수 있다.

예시적인 실시형태에 있어서, 본 발명은 치료제를 포함하는 지속 방출 약제학적 제형을 제공하되, 해당 치료제(예컨대, 펩타이드 또는 단백질 치료제)는 인슐린 아미노산 서열 및 [VPGXG]₉₀(서열번호 31) 또는 [VPGXG]₁₂₀(서열번호 32)을 포함하는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 X는 V, G 및 A로부터 선택된다. V, G 및 A는 약 5:3:2의 비로 존재할 수 있다. 대안적으로, 아미노산 서열은 [VPGVG]₉₀(서열번호 31) 또는 [VPGVG]₁₂₀(서열번호 32)을 포함한다. 제형은 인간 대상체에게 투여 시 수성 형태로부터 가역적 기질을 형성하기 위한 1종 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제를 더 포함한다. 인슐린 및 그의 유도체는 본 명세서에 그리고 미국 특허 가출원 제61/563,985호에 기재되어 있으며, 이 문헌은 참조로 본 명세서에 포함된다.

이들 실시형태에 있어서, 인슐린 아미노산 서열은 약 0.5 mg/mL 내지 약 200 mg/mL의 범위로 존재할 수 있거나, 또는 약 5 mg/mL 내지 약 125 mg/mL의 범위로 존재한다. 인슐린 아미노산 서열은 약 10 mg/mL 내지 약 50 mg/mL의 범위 또는 약 15 mg/mL 내지 약 30 mg/mL의 범위로 존재한다. 제형은 적어도 25mM 염화나트륨의 이온 강도, 또는 적어도 30mM 염화나트륨의 이온 강도, 또는 적어도 40mM 염화나트륨의 이온 강도, 또는 적어도 50mM 염화나트륨의 이온 강도, 또는 적어도 75mM 염화나트륨의 이온 강도, 또는 적어도 100mM 염화나트륨의 이온 강도를 지닐 수 있다. 제형은 약 0.9% 식염수의 이온 강도보다 낮은 이온 강도를 지닐 수 있다. 제형은 염화칼슘, 염화마그네슘, 염화칼륨, 제1인산칼륨, 염화나트륨 및 인산수소이나트륨 중 둘 이상을 포함한다.

예를 들어, 목적으로 하는 안정성을 달성하기 위한 기타 제형 성분이 또한 이용될 수 있다. 이러한 성분으로는 1종 이상의 아미노산 또는 당 알코올(예컨대, 만니톨), 방부제 및 완충제를 포함하며, 이러한 성분들은 당업계에 잘 알려져 있다.

다른 양상에 있어서, 본 발명은 인슐린 아미노산 서열의 지속 방출 요법을 전달하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 명세서에 기재된 제형을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 여기서 제형은 1개월당 약 1 내지 약 8회 투여된다.

몇몇 실시형태에 있어서, 제형은 대략 주 1회 투여되고, 피하에 혹은 근육내로 투여될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 투여 개소는 병적 부위가 아니며, 예를 들어 의도된 작용 부위가 아니다.

각종 실시형태에 있어서, 인슐린 아미노산 서열의 혈장 농도는 복수회의 투여, 예컨대, 제형의 적어도 2회, 적어도 약 5회 또는 적어도 약 10회 투여 과정에 걸쳐서 약 10배, 또는 약 5배 또는 약 3배보다 많이 변하지는 않는다. 투여는, 예를 들어, 약 매일, 또는 약 주 1회, 또는 1개월당 1 내지 약 5회 등과 같이 실질적으로 일정 간격을 둔다.

소정의 실시형태에 있어서, 대상체는, 인간이지만, 다른 실시형태에서는, 인간이 아닌 포유동물, 예컨대, 애완 동물(예컨대, 개 혹은 고양이) 또는 가축 혹은 농장 동물(예컨대, 말, 소, 양 혹은 돼지) 등일 수 있다.

컨쥬게이션 및 커플링

본 발명의 소정의 실시형태에 따라서 재조합적으로-생산된 융합 단백질은, 유전자 융합에 의해 서로 결합된 지속 방출을 제공하는 아미노산 서열(예컨대, ELP)과 인슐린 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 융합 단백질은 지속 방출 성분을 제공하는 아미노산 서열로 프레임내 클로닝된 인슐린 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 번역에 의해 생성될 수 있다.

소정의 실시형태에 있어서, 지속 방출 성분을 제공하는 아미노산 서열과 인슐린 아미노산 서열은 각종 길이의 링커 펩타이드를 이용해서 융합되어 보다 큰 물리적 분리를 제공하고 또한 융합된 부분 간에 더 많은 공간적 이동도를 허용하며, 이에 따라서 그의 수용체에 대한 결합을 위한 인슐린 아미노산 서열의 접근성을 최대화할 수 있다. 링커 펩타이드는 가요성이거나 더 강고한 아미노산들로 구성될 수 있다. 예를 들어, 가요성 링커는 소수성일 수도 있는 비교적 작은 곁사슬을 가진 아미노산을 포함한다. 제한 없이, 가요성 링커는 글라이신 및/또는 세린 잔기를 포함할 수 있다. 더 강고한 링커는, 예를 들어, (제한 없이) 티로신 혹은 히스티딘 등과 같은 더욱 입체 장애적 아미노산 곁사슬을 포함할 수 있다. 링커는 약 50, 40, 30, 20, 10 또는 5개 이하의 아미노산 잔기일 수 있다. 링커는 인슐린 아미노산 서열과 지속 방출 성분을 제공하는 아미노산 서열에 그리고 이들 사이에 예를 들어 재조합 융합을 개재해서 공유 결합될 수 있다.

링커 또는 펩타이드 스페이서는 프로테아제-절단성 혹은 비절단성일 수 있다. 예로서, 절단성 펩타이드 스페이서는, 제한 없이, 다양한 유형의 프로테아제(시험관내 또는 생체내) , 예컨대, Tev, 트롬빈, 인자 Xa, 플라스민(혈액 프로테아제), 메탈로프로테아제, 카텝신(예컨대, GFLG, 서열번호 21 등), 및 기타 신체적 구획(corporeal compartment) 내에서 발견되는 프로테아제에 의해 인식되는 펩타이드 서열을 포함한다. 절단성 링커를 이용하는 몇몇 실시형태에 있어서, 융합 단백질은 융합물로서 비활성이거나 덜 활성이거나 덜 강력할 수 있고, 이어서 생체내에서 스페이서의 절단 시 활성화된다. 대안적으로, 인슐린 아미노산 서열이 융합물로서 충분히 활성인 경우, 비절단성 스페이서가 이용될 수 있다. 비절단성 스페이서는, 예를 들어, 식 [(Gly)n-Ser]m(서열번호 34)(여기서 n은 1 내지 4(1과 4를 포함함)이고, m은 1 내지 4(1과 4를 포함함)임)을 지니는 비절단성 스페이서 모이어티를 포함하는 임의의 적절한 유형일 수 있다. 대안적으로, 골격 ELP와는 다른 짧은 ELP 서열은 링커 혹은 스페이서 대신에 이용될 수 있었지만, 필요한 효과를 달성할 수 있었다.

또 다른 실시형태에 있어서, 약제학적 조성물은 지속 방출 성분을 제공하는 아미노산 서열에 의해 각 말단 상의 측면에 있는 인슐린 아미노산 서열을 구비한 재조합 융합물이다. 지속 방출 성분들을 제공하는 아미노산 서열 중 적어도 하나는 절단성 스페이서를 통해서 부착될 수 있으므로, 인슐린 아미노산 서열은 비활성이지만, 단일 ELP 성분의 단백질분해적 제거에 의해 생체내에서 활성화된다. 얻어지는 지속 방출 융합물을 제공하는 단일 아미노산 서열은 활성이며, 생체내에서 향상된 반감기(또는 본 명세서에 기재된 다른 특성)을 지닌다.

다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 인슐린 아미노산 서열과 지속 방출 성분을 제공하는 아미노산 서열의 화학적 컨쥬게이트를 제공한다. 컨쥬게이트는 당업계에 잘 알려진 임의의 다수의 방법(예컨대, 문헌[Nilsson et al ., 2005, Ann Rev Biophys Bio Structure 34: 91-118] 참조)에 의해 지속 방출 성분을 제공하는 아미노산 서열을 인슐린 아미노산 서열에 화학적으로 커플링시킴으로써 형성될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 화학적 컨쥬게이트는, 공유결합 컨쥬게이트를 형성하기 위하여, 인슐린 아미노산 서열을 지속 방출 성분을 제공하는 아미노산 서열분에 직접 혹은 짧은 혹은 긴 링커 모이어티를 통해서, 치료적 단백질성 성분, 예컨대, 아민, 카복실, 페닐, 티올 혹은 하이드록실기 상의 하나 이상의 작용기를 통해서, 공유 결합시켜서 형성될 수 있다. 각종 종래의 링커, 예컨대, 다이아이소사이아네이트, 다이아이소티오시아이네이트, 카보다이이미드, 비스(하이드록시숙신이미드) 에스터, 말레이미드-하이드록시숙신이미드 에스터, 글루타르알데하이드 등이 이용될 수 있다.

비-펩타이드 화학적 스페이서는, 부가적으로, 예를 들어, 문헌[Bioconjugate Techniques, Greg T. Hermanson, published by Academic Press, Inc., 1995]에 기재된 기능성 링커 및 피어스 바이오테크놀로지사(Pierce Biotechnology, Inc.)(일리노이주의 록포드시에 소재)로부터 입수가능한 문헌[Cross-Linking Reagents Technical Handbook]에 기재된 것들을 포함하는 임의의 적절한 유형일 수 있으며, 이들 문헌의 개시내용은 그들의 각각의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 예시적인 화학적 스페이서는 Lys의 아민기에 부착될 수 있는 동종이작용성 링커뿐만 아니라 한쪽 말단에서 Cys에 부착될 수 있고 다른 쪽 말단에서 Lys에 부착될 수 있는 이종이작용성 링커를 포함한다.

소정의 실시형태에 있어서, 실온(또는 인간 체온, 예컨대, Tt > 37℃)에서 전이를 일으키지 않는 비교적 작은 ELP 성분(예컨대, 약 30 kDa, 25 kDa, 20 kDa, 15 kDa 혹은 10 kDa 이하의 ELP 성분)은 화학적으로 커플링되거나 가교결합된다. 예를 들어, 동일 혹은 상이한 특성을 지니는 2가지 비교적 작은 ELP 성분은 화학적을 커플링될 수 있다. 이러한 커플링은, 몇몇 실시형태에 있어서, ELP의 C-말단에서 혹은 그 부근에서 단일의 시스테인 잔기의 부가에 의해 생체내에서 일어날 수 있다. 이러한 ELP 성분은, 표적에서 활성 혹은 산도를 증가시키기 위하여, 각각 하나 이상의 인슐린 아미노산 서열에 융합될 수 있다.

질환의 치료 방법

각종 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 약제학적 조성물은, 당뇨병 혹은 고혈당증, 또는 인슐린 투여가 각종 진성 당뇨병을 비롯한 이들 병태의 증상 및 합병증을 방지하거나 완화시킬 목적을 지시하는 임의의 기타 병태 등과 같은 병적 측면을 가진 환자의 관리 및 케어를 위하여 이용된다. 치료하는 것은 증상 혹은 합병증의 발병을 예방하거나, 증상 혹은 합병증을 완화시키거나 또는 질환, 병태 혹은 장애를 제거하기 위하여 본 발명의 제형을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은, 제1형 당뇨병, 즉, 신체가 인슐린을 생성하지 못하고 따라서 혈액 내 당의 양을 조절할 수 없는 병태, 및 제2형 당뇨병, 즉, 신체가 인슐린을 정상적으로 사용하지 못하고 따라서 혈액 중 당량을 조절할 수 없는 병태의 치료를 포함한다.

각종 실시형태에 있어서, 지속 방출은 진성 당뇨병을 가진 개인에서의 전형적인 수준의 혈당(포도당)을 지칭하는 지속된 혈당조절 혈당조절을 제공한다. 미세혈관성 합병증을 비롯하여, 당뇨병의 장기 합병증의 다수는 수년의 고혈당증으로부터 기인된다. 양호한 혈당조절은 당뇨병 케어의 중요한 목표이다. 혈당 수준이 하루를 통해서 변동하고 포도당 기록치가 이들 변화의 불완전한 표시자이기 때문에, 당화된 헤모글로빈의 퍼센트가 당뇨병을 가진 사람들의 임상적 케어 및 연구 시험에서의 장기 혈당조절의 대용 척도(proxy measure)로서 이용된다. 이 테스트에서, 헤모글로빈 A1c 또는 당화 헤모글로빈은 이전의 2 내지 3개월에 걸친 평균 포도당값을 반영한다.

정상의 포도당 대사를 가진 비당뇨병 개인에 있어서, 당화 헤모글로빈 수준은 가장 통상적인 방법에 의해 보통 약 4 내지 6%이다(정상 범위는 방법에 따라 변할 수 있다). "완벽한 혈당조절"이란 포도당 수준이 항상 정상(예컨대 약 70 내지 130 mg/dl 또는 약 3.9 내지 7.2 mmol/L)이고 당뇨병이 없는 사람과 구별할 수 없는 것을 의미한다. 실제로, 치료 대책의 미비점 때문에, "양호한 혈당조절"도 정상의 더 많은 시간보다 다소 높은 평균치를 갖는 혈당 수준을 기술한다. "양호한 혈당조절"인 것으로 고려되는 것은 환자의 연령 및 저혈당증에 대한 감수성에 의해 변하는 것에 유의해야 한다. 미국 당뇨병 협회는 환자와 의사가 200 mg/dl(11 mmol/l) 및 8% 이하의 평균 포도당값 및 헤모글로빈 A1c 값을 얻고자 노력하도록 옹호하였다. "불량 혈당조절"이란 중증의 합병증이 일어나기 전에 수개월 및 수년에 걸쳐 예컨대, 약 200 내지 500 mg/dl(약 11 내지 28 mmol/L) 및 약 9 내지 15% 또는 그 이상의 범위일 수 있는 지속적으로 상승된 혈당 및 당화 헤모글로빈 수준을 지칭한다.

각종 실시형태에 있어서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물 및 위에서 기재된 것들과 같은 질환 치료에 효과적인 기타 제제를 포함하는 병용 요법 및/또는 공동-제형을 제공한다.

일 실시형태에 있어서, 본 발명은 미국 특허 제8,178,495호에 개시된 바와 같은 GLP-1(서열번호 22), 엑세딘-4(서열번호 23), 또는 기능적 유사체 및/또는 그의 유도체 등과 같은 글루카곤 유사 수용체(GLP)-1 수용체 작용제와의 조합 혹은 공동-제형을 제공하며, 상기 문헌은 참조로 본 명세서에 포함된다. 몇몇 실시형태에 있어서, GLP-1은 GLP-1(A-B)이되, 여기서 A는 1 내지 7의 정수이고, B는 38 내지 45의 정수이다. 몇몇 실시형태에 있어서, GLP-1은 GLP-1(7-36)(서열번호 24) 혹은 그의 기능적 유사체, 또는 GLP-1(7-37)(서열번호 25) 혹은 그의 기능적 유사체이다.

다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 GLP-2(서열번호 26), GIP(서열번호 27), 글루카곤(서열번호 28), 및 옥신토모듈린(oxyntomodulin)(서열번호 29) 또는 그들의 기능적 유사체 및/또는 유도체와의 조합 또는 공동-제형을 제공한다. 기능적 유사체는 천연 서열에 관하여 1 내지 10개의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환(일괄적으로)을 함유할 수 있다.

각종 실시형태에 있어서, 조합(즉, 병용) 요법 및/또는 공동-제형은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 ELP 또는 기질-형성 성분을 지니는 융합 단백질을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, ELP는 VPGXG의 적어도 60 단위(서열번호 30), 또는 90 단위(서열번호 31), 또는 120 단위(서열번호 32), 또는 180 단위(서열번호 33)를 포함하되, 여기서 X는 독립적으로 선택된 아미노산이다. 각종 실시형태에 있어서, X는 5:3:2의 비의 V, G 또는 A이거나, 또는 1:2:1의 비의 K, V 또는 F이거나, 또는 1:7:1의 비의 K, V 또는 F이거나 또는 V이다.

다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 인슐린의 각종 형태와 조합 혹은 공동-제형을 위하여 제공된다. 일 실시형태에 있어서, 인슐린은 신속하거나 빠르게 작용하는 인슐린이다.

실시예

인간 프로인슐린은 ELP1-120 생체고분자에 유전자 융합되고, 대장균(E coli)의 가용성 분획에서 발현되었다. 프로인슐린 모이어티의 숙성 인슐린으로의 정제 효소 처리 후, 융합 단백질은 정상의 마우스 모델에서 포도당 저하에 대해 테스트되고 인슐린 단독과 비교되었다. 인슐린 ELP 융합은 인슐린과 유사한 포도당 저하를 보였다. 또한, 융합 단백질의 저하 효과는 상기 모델 내 인슐린의 것보다 길거나 그 이상의 긴 지속 기간을 연장시키는 것으로 나타났다.

인슐린 융합 구성

인간 프로인슐린은 31개의 아미노산 C 펩타이드와 함께 연결된 B 및 A 사슬로 구성되어 있다(도 1a 및 도 1b). 일단 이황화물이 B 사슬과 A 사슬 사이에 형성되면, 프로인슐린은 트립신/카복시펩티다제 B-유사 시스템에 의한 C 펩타이드의 제거에 의해 생체내에서 숙성 인슐린으로 전환된다. 이 펩타이드 가공처리는 재조합 트립신 및 카복시펩티다제 B를 이용해서 시험관내에서 반복될 수 있다. 융합은 대장균(E. coli)의 가용성 분획에서 발현되므로, 리폴딩 단계는 필요하지 않다.

프로인슐린 뉴클레오타이드 서열은 합성되어서 ELP1-120 서열의 N-말단에 그것을 위치시키는 pET 기반 벡터 pPB1031로 서브클로닝되어 플라스미드 pPE0139를 만든다(도 2).

도 3은 프로인슐린 ELP1-120 융합 단백질의 아미노산 서열(서열번호 14)을 도시한다. 프로인슐린 서열(밑줄침)은 ELP1-120 서열에 융합된다. 아미노산 서열은 선택적으로 N 말단에서 개시 메티오닌 잔기를 포함한다.

발효

인슐린 ELP 융합 플라스미드 pPE0139는 유가식 발효 과정(fed-batch fermentation process)에서 T7 프로모터의 제어 하에 대장균(E. coli)의 세포내 분획에서 발현되었다. 글라이세롤 세포 스톡은, 1차 탄소 공급원으로서 글라이세롤 및 1차 질소 공급원으로서 호모 추출물을 지니는 반규정된 무동물 배지(animal-free medium)(ECPM + 프롤린)에서 2-단계 진탕 플라스크 시드 트레인(seed train)을 이용해서 확장시켰다. 충분한 세포 밀도가 시트 트레인에서 얻어진 후에, 배양액을 시트 트레인과 동일한 배지를 함유하는 발효기로 옮겼다. 공정 파라미터(pH, 온도, 용존 산소)는 PID 대조군을 통해서 설정된 점에서 유지되었다. 배양액은 정상 상에 도달할 때까지 성장시킨 후에 글라이세롤/호모 추출물/황산 마그네슘 공급을 개시하였다. 배양액은 탄소 제한 하에 유지되었고, 프로모터의 유도는 IPTG를 이용해서 달성하였다. 발효의 말기에, 배양액을 원심분리하여 소모된 배지로부터 인슐린 ELP 융합물을 함유하는 바이오매스를 분리하였다. 세포 페이스트는 후속의 정제 시까지 -70℃에서 보존되었다.

정제

동결된 세포 페이스트를 2M 요소를 함유하는 용해 완충액(인슐린 ELP의 해리용) 중에 재현탁시키고, 균질화될 때까지 혼합하였다. 용해는 세포막을 파열시키기 위하여 마이크로플루타이저를 이용해서 달성하였다. 2단계 접선 흐름 여과(tangential flow filtration: TFF) 시스템은 생성물을 투명하게 만들어 농축시키기 위하여 이용되었다. 인슐린 ELP 융합물은 포획 단계에서 HIC 칼럼 위로 통과시켜, 숙주 세포 오염물을 씻어내었다. 생성물은, 어떠한 생성물-관련 불순물(분해된 종들)이라도 분별하기 위하여 구배를 이용해서 용리시켰다. TFF 완충액 교환은 선택된 분획에 대해 수행하여, 잔류 DNA, 엔도톡신 및 숙주 세포 단백질을 제거하는 2개의 음이온 교환 칼럼 이전에 잔류 염을 제거하였다. 최종 TFF 농도 및 완충액 교환은 생성물을 조제하기 위하여 이용하였다. 0.2μM 여과는 멸균을 위하여 이용하였다. 생성물을 효소 소화될 때까지 4℃에서 보존하였다.

프로인슐린 ELP 융합물(PE0083)의 효소 처리

정제된 프로인슐린 ELP1-120을 제형 완충액 중 1 mg/mL로 희석시켰다. 프로인슐린 ELP를 숙성 인슐린 ELP로 처리하기 위한 2X 효소 용액은 다음과 같이 준비하였다: 50mM 중탄산나트륨, 2 ug/mL 트립신 및 20 ug/mL 카복시펩티다제 B. 2X 효소 용액을 동일 부피의 1 mg/mL PE0083에 첨가하고 37℃에서 1 내지 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 효소 반응은 ELP의 상 전이 특성을 이용해서 중지시켰다. 융합물의 상 전이를 유도시키기 위하여 염화나트륨을 반응물에 첨가하였다. 숙성 인슐린 ELP는 코아세르베이트를 형성하였고, 원심분리를 통해서 펠릿화되었다. 잔류 효소를 씻어내버리고, 펠릿화된 융합물을 저염 완충액 중에서 재용해시켰다. 2단계 전이 정제가 수행되었다.

비환원 SDS-PAGE(도 4)는 C-펩타이드가 절단됨에 따라서 효소적 가공처리 후 예상되는 저감된 융합 단백질 분자량을 나타낸다.

항-인슐린 B 사슬 웨스턴 블롯(도 5)은 ELP에 융합된 A 사슬과 B 사슬의 둘 모두의 존재를 확인하기 위하여 수행되었다. 데이터는 A 사슬과 B 사슬 간의 이황화 결합 형성을 나타내는 B-사슬 비환원 조건 하의 존재를 나타내었다. 융합 단백질 및 이황화 결합의 저감은, 해당 융합으로부터의 B 사슬의 제거를 유발하였다.

전자분무 이온화 질량 분석법은, 프로인슐린 ELP 융합물(도 6) 및 C-펩타이드의 효소적 제거 후의 숙성 인슐린 ELP 융합물(도 7)의 질량을 확인하였다. 추가적인 염 부가체는 두 샘플 모두에서 존재하였다. 이황화 결합의 존재는 엘만의 시약 검정(Ellman's reagent assay)을 이용해서 확인되었다. 유리 티올의 부재는 이황화 결합이 형성된 것을 나타내었다.

생체내 포도당 저하

정상의 마우스들은 하룻밤 절식시키고, 식염수(음성 대조군), 13nmol/kg 인슐린 글라진(양성 대조군) 또는 35nmol/kg 인슐린 ELP 융합물(인슈메라(INSUMERA))을 피하 주사하였다. 혈당 판독치는 투약 전에 그리고 투약 후 8시간까지 각 시각에 및 24시간에 취하였다. 음식물은 투약 후 1시간에 입수가능하게 하였다. 도 8은 혈당 데이터(평균 +-SE)를 도시한다. 인슐린 ELP 융합물은 식염수 대조군에 대해서 유의한 혈당 저하를 나타낸다. 또한, 인슐린 ELP 융합물은, 인슐린 글라진 대조군(2시간)보다 더 연장된(7시간) 혈당 저하를 나타내었다.

제1형 당뇨병 모델에서의 생체내 효과

ELP-인슐린 융합물인 인슈메라(INSUMERA)(PE0139)는, 제1형 진성 당뇨병(제1형 당뇨병, T1DM) 마우스 모델에서 투약되었다. 구체적으로, 단일 용량 데이터는 도 9에 도시되어 있다. 이 결과는, 등몰량의 란투스(LANTUS)(인슐린 글라진, SANOFI-AVENTIS) 투약에 비해서, 인슈메라(INSUMERA)에 대한 보다 큰 지속기간의 포도당 저하를 입증하였다. 화합물이 1일 요법으로 투약된 경우(도 10), 그 결과는, 활성 및 반감기에 관하여, 란투스(LANTUS)(인슐린 글라진, SANOFI-AVENTIS)에 비해서 인슈메라(INSUMERA)의 우수성을 입증한다.

도 11a 및 도 11b는, 란투스(LANTUS)(인슐린 글라진, SANOFI-AVENTIS)에 비해서 제1형 진성 당뇨병(제1형 당뇨병, T1DM) 마우스 모델에서의 인슈메라(INSUMERA)(PE0139) 저용량 적정을 도시한다. 도 11a는 단일 피하 용량을 도시하는 반면 도 11b는 14일의 1일 피하 투약을 도시한다. 두 경우에 있어서, 인슈메라(INSUMERA)의 더욱 현저하고 지속적인 혈당 저하 효과를 나타내고 있다.

연구는 또한 인슈메라(INSUMERA)의 환자에서의 전형적인 수준의 혈당의 척도인 혈당조절의 정도를 결정하기 위하여 수행되었다. 도 12a 및 도 11b는 인슈메라(INSUMERA)(PE0139)가 란투스(LANTUS)(인슐린 글라진, SANOFI-AVENTIS)에 대해서 유의하게 증가된 혈당조절을 지니는 것을 도시한다. 27 내지 39%의 저감은 곡선하 면적(AUC) 혈당에서 보여진다. 도 12a는 제1일의 화합물 투여 및 0 내지 24시간에서의 혈당 AUC를 도시한다. 도 12b는 0 내지 24시간에 제14일의 화합물 및 혈당 AUC를 도시한다. 인슈메라(INSUMERA)는 두 용량 요법에서, 란투스(LANTUS)보다 더 효과적으로 혈당 AUC를 저감시켰다.

연구는 또한 인슈메라(INSUMERA) 치료의 약동학(PK)을 평가하기 위하여 수행되었다. 당뇨병 돼지에서, 단일 피하 주사(도 13a) 또는 2주 동안 1일 피하 주사(도 13b) 요법이 수행되었다. 결과는 인슈메라(INSUMERA)가 피하 주사 후 작은 피크 대 최저 비율을 지니는 긴 반감기를 달성하는 것을 나타낸다.

등가물

당업자라면, 본 명세서에 구체적으로 기재된 특정 실시형태에 대한 수많은 등가물을, 단지 일상적인 실험을 이용해서, 인식할 것이고 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 이하의 특허청구범위의 범주 내에 포함되도록 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> PhaseBio Pharmaceuticals, Inc. Jowett, James Woods, Christopher <120> THERAPEUTIC AGENTS COMPRISING INSULIN AMINO ACID SEQUENCES <130> PHAS-025/01WO 309646-2127 <150> US 61/563,985 <151> 2011-11-28 <160> 34 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELP component sequence <400> 1 Val Pro Gly Gly 1 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELP component sequence <400> 2 Ile Pro Gly Gly 1 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELP component sequence <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring or non-natural amino acid <400> 3 Val Pro Gly Xaa Gly 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELP component sequence <400> 4 Ala Val Gly Val Pro 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELP component sequence <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring or non-natural amino acid <400> 5 Ile Pro Gly Xaa Gly 1 5 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13 <211> 86 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 14 <211> 691 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELP-1-120 fusion protein <400> 14 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly 85 90 95 Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val 100 105 110 Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro 115 120 125 Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly 130 135 140 Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val 145 150 155 160 Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly 165 170 175 Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val 180 185 190 Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro 195 200 205 Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly 210 215 220 Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val 225 230 235 240 Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly 245 250 255 Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val 260 265 270 Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro 275 280 285 Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly 290 295 300 Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val 305 310 315 320 Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly 325 330 335 Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val 340 345 350 Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro 355 360 365 Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly 370 375 380 Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly 385 390 395 400 Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly 405 410 415 Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val 420 425 430 Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro 435 440 445 Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly 450 455 460 Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala 465 470 475 480 Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly 485 490 495 Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val 500 505 510 Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro 515 520 525 Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly 530 535 540 Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val 545 550 555 560 Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly 565 570 575 Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val 580 585 590 Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro 595 600 605 Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly 610 615 620 Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val 625 630 635 640 Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly 645 650 655 Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val 660 665 670 Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro 675 680 685 Gly Trp Pro 690 <210> 15 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Ala Ser Val Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 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Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg 20 25 30 Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly 35 40 45 Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln 50 55 60 Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 21 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker peptide <400> 21 Gly Phe Leu Gly 1 <210> 22 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val 1 5 10 15 Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu 20 25 30 Val Lys Gly Arg Gly 35 <210> 23 <211> 87 <212> PRT <213> Heloderma suspectum <400> 23 Met Lys Ile Ile Leu Trp Leu Cys Val Phe Gly Leu Phe Leu Ala Thr 1 5 10 15 Leu Phe Pro Ile Ser Trp Gln Met Pro Val Glu Ser Gly Leu Ser Ser 20 25 30 Glu Asp Ser Ala Ser Ser Glu Ser Phe Ala Ser Lys Ile Lys Arg His 35 40 45 Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu 50 55 60 Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser 65 70 75 80 Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly 85 <210> 24 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 25 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 26 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 27 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Met Val Ala Thr Lys Thr Phe Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu Phe Leu 1 5 10 15 Ala Val Gly Leu Gly Glu Lys Lys Glu Gly His Phe Ser Ala Leu Pro 20 25 30 Ser Leu Pro Val Gly Ser His Ala Lys Val Ser Ser Pro Gln Pro Arg 35 40 45 Gly Pro Arg Tyr Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala 50 55 60 Met Asp Lys Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln 65 70 75 80 Lys Gly Lys Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln Arg Glu Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Glu Leu Ala Ser Gln Ala Asn Arg Lys Glu Glu Glu Ala 100 105 110 Val Glu Pro Gln Ser Ser Pro Ala Lys Asn Pro Ser Asp Glu Asp Leu 115 120 125 Leu Arg Asp Leu Leu Ile Gln Glu Leu Leu Ala Cys Leu Leu Asp Gln 130 135 140 Thr Asn Leu Cys Arg Leu Arg Ser Arg 145 150 <210> 28 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Met Lys Ser Ile Tyr Phe Val Ala Gly Leu Phe Val Met Leu Val Gln 1 5 10 15 Gly Ser Trp Gln Arg Ser Leu Gln Asp Thr Glu Glu Lys Ser Arg Ser 20 25 30 Phe Ser Ala Ser Gln Ala Asp Pro Leu Ser Asp Pro Asp Gln Met Asn 35 40 45 Glu Asp Lys Arg His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys 50 55 60 Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn 65 70 75 80 Thr Lys Arg Asn Arg Asn Asn Ile Ala Lys Arg His Asp Glu Phe Glu 85 90 95 Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu 100 105 110 Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 115 120 125 Arg Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly Arg 130 135 140 Arg His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp 145 150 155 160 Asn Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile 165 170 175 Thr Asp Arg Lys 180 <210> 29 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn 20 25 30 Arg Asn Asn Ile Ala 35 <210> 30 <211> 300 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELP biopolymer sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(300) <223> Xaa may be any natural or non-natural amino acid residue <400> 30 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 1 5 10 15 Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro 20 25 30 Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly 35 40 45 Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa 50 55 60 Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 65 70 75 80 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 85 90 95 Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro 100 105 110 Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly 115 120 125 Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa 130 135 140 Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 145 150 155 160 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 165 170 175 Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro 180 185 190 Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly 195 200 205 Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa 210 215 220 Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 225 230 235 240 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 245 250 255 Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro 260 265 270 Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly 275 280 285 Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 290 295 300 <210> 31 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELP biopolymer sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(450) <223> Xaa may be any natural or non-natural amino acid residue <400> 31 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 1 5 10 15 Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro 20 25 30 Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly 35 40 45 Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa 50 55 60 Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 65 70 75 80 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 85 90 95 Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro 100 105 110 Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly 115 120 125 Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa 130 135 140 Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 145 150 155 160 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 165 170 175 Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro 180 185 190 Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly 195 200 205 Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa 210 215 220 Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 225 230 235 240 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 245 250 255 Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro 260 265 270 Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly 275 280 285 Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa 290 295 300 Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 305 310 315 320 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 325 330 335 Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro 340 345 350 Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly 355 360 365 Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa 370 375 380 Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 385 390 395 400 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 405 410 415 Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro 420 425 430 Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly 435 440 445 Xaa Gly 450 <210> 32 <211> 600 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELP biopolymer sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(600) <223> Xaa may be any natural or non-natural amino acid residue <400> 32 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 1 5 10 15 Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro 20 25 30 Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly 35 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Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro 260 265 270 Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly 275 280 285 Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa 290 295 300 Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 305 310 315 320 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 325 330 335 Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro 340 345 350 Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly 355 360 365 Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa 370 375 380 Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 385 390 395 400 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 405 410 415 Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro 420 425 430 Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly 435 440 445 Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa 450 455 460 Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 465 470 475 480 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 485 490 495 Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro 500 505 510 Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly 515 520 525 Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa 530 535 540 Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 545 550 555 560 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 565 570 575 Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro 580 585 590 Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 595 600 <210> 33 <211> 900 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELP biopolymer sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(900) <223> Xaa may be any natural or non-natural amino acid residue <400> 33 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 1 5 10 15 Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro 20 25 30 Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly 35 40 45 Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa 50 55 60 Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 65 70 75 80 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 85 90 95 Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro 100 105 110 Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly 115 120 125 Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa 130 135 140 Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 145 150 155 160 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 165 170 175 Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro 180 185 190 Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly 195 200 205 Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa 210 215 220 Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 225 230 235 240 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 245 250 255 Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro 260 265 270 Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly 275 280 285 Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa 290 295 300 Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 305 310 315 320 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 325 330 335 Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro 340 345 350 Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly 355 360 365 Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa 370 375 380 Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 385 390 395 400 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 405 410 415 Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro 420 425 430 Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly 435 440 445 Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa 450 455 460 Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 465 470 475 480 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 485 490 495 Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro 500 505 510 Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly 515 520 525 Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa 530 535 540 Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 545 550 555 560 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 565 570 575 Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro 580 585 590 Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly 595 600 605 Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa 610 615 620 Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 625 630 635 640 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 645 650 655 Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro 660 665 670 Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly 675 680 685 Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa 690 695 700 Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 705 710 715 720 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 725 730 735 Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro 740 745 750 Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly 755 760 765 Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa 770 775 780 Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 785 790 795 800 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 805 810 815 Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro 820 825 830 Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly 835 840 845 Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa 850 855 860 Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 865 870 875 880 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 885 890 895 Pro Gly Xaa Gly 900 <210> 34 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> non-cleavable spacer peptide <220> <221> REPEAT <222> (1)..(20) <223> Gly residues in Gy Gly Gly Gly Ser subsequence may be repeated 1 to 4 times <220> <221> REPEAT <222> (1)..(20) <223> Gy Gly Gly Gly Ser subsequence may be repeated 1 to 4 times <400> 34 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20

Claims

지속된 혈당조절을 제공하기 위한 약제학적 조성물로서, 인슐린 아미노산 서열과 주사 부위로부터 지속 방출을 제공하는 아미노산 서열을 포함하는 유효량의 단백질, 및 지속 방출을 달성하기 위한 약제학적 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 인슐린 아미노산 서열은 A 사슬 및 B 사슬 아미노산 서열을 포함하되, 상기 A 사슬 및 B 사슬은, 일괄적으로, 1 내지 8개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 선택적으로 지니는 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 것인 약제학적 조성물.
제2항에 있어서, 상기 주사 부위로부터 느린 흡수를 제공하는 아미노산 서열은 상기 인슐린 A 사슬에 공유 결합된 것인 약제학적 조성물.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 A 사슬과 B 사슬은 1개 이상의 이황화 결합에 의해 결합된 것인 약제학적 조성물.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 A 사슬과 B 사슬은 펩타이드 혹은 화학적 링커를 통해서 부착된 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지속 방출을 제공하는 아미노산 서열은 프롤린 잔기들의 실질적 반복 패턴인 것인 약제학적 조성물.
제6항에 있어서, 상기 지속 방출을 제공하는 아미노산 서열은 엘라스틴-유사 펩타이드(elastin-like peptide: ELP) 아미노산 서열인 것인 약제학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 ELP는 VPGXG(서열번호 3)의 반복부를 포함하되, 각각의 X는 독립적으로 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 글라이신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린 잔기로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물.
제8항에 있어서, X는 발린인 것인 약제학적 조성물.
제9항에 있어서, 상기 ELP의 아미노산 서열은 AVGVP(서열번호 4), IPGVG(서열번호 6) 또는 LPGVG(서열번호 8)의 반복부를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제10항에 있어서, 상기 ELP는 ELP 아미노산 단위의 적어도 15개의 반복부를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제10항에 있어서, 상기 ELP는 ELP 단위의 적어도 30개의 반복부를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제10항에 있어서, 상기 ELP는 ELP 단위의 적어도 60개의 반복부를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제10항에 있어서, 상기 ELP는 ELP 단위의 적어도 90개의 반복부를 포함하는 것인 약제학적 조성물.조성물.
제10항에 있어서, 상기 ELP는 ELP 단위의 적어도 120개의 반복부를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제10항에 있어서, 상기 ELP는 ELP 단위의 적어도 180개의 반복부를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 서열번호 14를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 ELP는 생리식염수 중에서 단지 37℃ 미만의 전이 온도를 지니는 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지속 방출을 제공하는 아미노산 서열은, 아미노산의 적어도 50%가 초우-파스만 알고리즘(Chou-Fasman algorithm)로 결정된 바와 같은 2차 구조가 없는 생체고분자를 포함하는, 무작위 코일 또는 비구형 연신 구조(non-globular extended structure) 또는 비구조화된 생체고분자(unstructured biopolymer)를 형성하는 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 연신된, 비구형 구조 또는 무작위 코일 구조를 지니는 단백질인 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 융합 단백질인 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 약 110mM 염화나트륨 및 약 20mM 히스티딘을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 주당 약 1회 투여를 위하여 조제된 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 매일 투여를 위하여 조제된 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 약 0.5 mg/mL 내지 약 200 mg/mL의 용량으로 투여를 위하여 조제된 것인, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 약 10 mg/mL 내지 약 50 mg/mL의 용량으로 투여를 위하여 제조된 것인, 약제학적 조성물.
당뇨병을 치료하는 방법으로서, 인슐린 아미노산 서열과 주사 부위로부터 지속 방출을 제공하는 아미노산 서열을 포함하는 유효량의 단백질, 및 지속 방출을 달성하기 위한 약제학적 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병의 치료방법.
제27항에 있어서, 상기 환자는 제1형 당뇨병을 지니는 것인, 당뇨병의 치료방법.
제27항에 있어서, 상기 환자는 제2형 당뇨병을 지니는 것인, 당뇨병의 치료방법.
제27항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 월당 1 내지 30회의 빈도로 투여되는 것인, 당뇨병의 치료방법.
제27항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 대략 주마다 투여되는 것인, 당뇨병의 치료방법.
제27항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 주당 2 또는 3회 투여되는 것인, 당뇨병의 치료방법.
제27항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 대략 매일 투여되는 것인, 당뇨병의 치료방법.
제27항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 피하에 투여되는 것인, 당뇨병의 치료방법.