KR20140083929A - 장기-작용성 glp-1/글루카곤 수용체 작용제 - Google Patents

장기-작용성 glp-1/글루카곤 수용체 작용제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 페길화된 및 리버스 페길화된 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제, 이를 포함하는 약학 조성물, 및 이의 이용 방법을 개시한다.

Description

장기-작용성 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제 {LONG-ACTING GLP-1/GLUCAGON RECEPTOR AGONISTS}
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2011년 6월 2일자 미국 가출원번호 제 61/492,448호와 2012년 4월 16일자 미국 가출원번호 제 61/624,589호에 대해 우선권을 주장한다. 이들 출원은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 페길화된 옥신토모듈린 및 리버스 페길화된 (reverse pegylated) 옥시토모듈린, 이를 포함하는 약학 조성물, 및 이를 이용하는 방법에 관한 것이다.
단백질, 특히 짧은 펩타이드는 혈액, 간 또는 신장에서 변성되거나 효소적으로 분해되기 쉽다. 그래서, 단백질은 전형적으로 순환성 반감기가 수시간으로 짧다. 펩타이드 약물은, 낮은 안정성으로 인해, 통상적으로, 활성 펩타이드의 유효한 혈장 농도를 유지하기 위해, 지속적인 빈도로 전달된다. 아울러, 펩타이드 약물들은 통상적으로 주입에 의해 투여되기 때문에, 잦은 펩타이드 약물의 주입은 개체에게 상당한 불편함을 야기한다. 이에, 치료학적 단백질과 펩타이드의 높은 약리학적 효능을 유지하면서 반감기를 연장시킬 수 있는 기법들이 요구되고 있다. 또한, 이러한 바람직한 펩타이드는 강화된 혈청 안정성, 높은 활성 및 개체에 주입시 바람직하지 않은 면역 반응의 유발 가능성이 낮아야 하는 등의 요건을 충족시켜야 한다.
짧은 혈청 반감기와 같은 비-우호적인 약물 동태성은 다수의 유망한 후보 약물들을 약학적으로 개발하는데 방해가 될 수 있다. 혈청 반감기는 분자의 실증적인 특징이므로, 각각의 새로운 잠재적인 약물에 대해서는 실험을 통해 결정하여야 한다. 예컨대, 분자량이 낮은 단백질 약물의 경우, 신장 여과와 같은 생리적인 소거 기전은, 필요한 투약 요법에 따른 비용이나 빈도로 인해, 약물을 치료학적 수준으로 유지하기 어렵게 할 수 있다.
위장관은 췌장 단백질 (PP), 글루카곤-유사 펩타이드 1 (GLP-1), 펩타이드 YY (PYY) 및 옥신토모듈린 (OXM) 등의 섭식 행동을 조절하는 다수의 펩타이드 호르몬을 합성하여 방출하는 기능을 한다. OXM은 장과 CNS에서 프로글루카곤의 조직 특이적인 번역 후 가공에 의해 만들어진다. 이것은, 글루카곤의 전체 서열과, 시험관내 및 생체내 OXM 특성에 기여하는 것으로 입증되었지만 단독으로는 펩타이드의 기능을 수행하는데 충분하지 않은 C-말단의 염기성 옥타펩타이드 연장을 포함하여, 아미노산 37개로 구성된다. OXM은, 섭식에 반응하여, 장의 L 세포에서 음식물 칼로리 함량에 비례하여 혈류로 분비된다.
OXM은 경구 투여 및 복막내 투여된 후 인슐린의 분비를 자극함으로써 글루코스 소거 (glucose clearance)를 강화한다. 또한, 이것은, 섭식 조절을 규제한다. OXM을 시상하부의 뇌실 주변 궁상핵 (ARC)으로 뇌실내 (ICV: Intracerebroventricular) 및 핵내 주입하면, 금식 랫에서 재-섭취가 저해된다 (Dakin et al. 2001; Dakin et al. 2004). 또한, 이러한 저해는 암기 (dark phase) 개시 시점에 자유 섭식한 랫에서도 확인되었다. 아울러, OXM의 말초 투여는 금식-유도성 섭식과 암기의 섭식 둘다를 용량 의존적으로 저해하였다 (Dakin et al. 2004).
가역적인 페길화 (reversible pegylation)로 지칭되는 새로운 개념적 접근 방법이 단백질과 펩타이드의 반감기를 연장시키는 방법으로 이미 알려져 있다 (PCT 공개공보 WO 98/05361; Gershonov et al., 2000). 이 기법에 따라, 생리학적 조건 등의 약 염기성 조건에서 제거가능하며 염기에 민감한 관능기로 약물을 유도체화함으로써, 프로드럭을 제조한다. 유도체화는, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티 기가 부착된, 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 및 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS) 등의 링커로, 약물 분자의 하나 이상의 아미노, 하이드록실머캅토 및/또는 카르복실기를 치환하는 것을 포함한다. PEG 모이어티와 약물 간의 연결은 직접적으로 이루어지지 않고, 2개의 잔기들이 염기성 조건에 고도로 민감한 스캐폴드 FMS 또는 Fmoc 구조체의 서로 다른 위치에 연결된다. 본 발명은 가역적인 페길화 기법을 이용하여 펩타이드의 반감기를 연장시킨 OXM 유도체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은, 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)을 통해, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)에 연결 또는 결합된, 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제로 구성된 조성물을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 개체에게, 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)인 유연한 링커를 통해 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)와 접합된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 섭식을 줄이는 방법, 체중을 줄이는 방법 또는 섭식과 체중을 줄이는 방법을 추가로 제공한다. 다른 구현예에서, 상기 링커는 절단성 링커이다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)을 통해 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)와 접합된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제, 및 약제학적으로 허용가능한 담체로 구성된 조성물을 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 내당성을 유도하는 방법, 혈당 조절을 개선하는 방법 또는 이 둘다를 포함하는 방법을 추가로 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)와 접합된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 포함하는 조성물을 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 인슐린 내성을 완화하는 방법을 추가로 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)을 포함하는 유연한 링커를 통해 작용제를 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)와 접합하는 단계로 구성된, GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 생물학적 반감기를 연장하는 방법을 추가로 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)을 포함하는 유연한 링커를 통해 작용제를 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)와 접합하는 단계로 구성된, 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 생물학적 반감기를 연장하는 방법을 추가로 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)을 통해 작용제의 아미노 말단에 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)를 접합하는 단계로 구성된, GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 곡선 하 면적 (AUC)을 개선하는 방법을 추가로 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)을 통해 옥신토모듈린의 아미노 말단에 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)를 접합하는 단계로 구성된, 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 투약 빈도를 줄이는 방법을 추가로 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)와 접합된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 포함하는 조성물을 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 인슐린 민감성을 높이는 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)와 접합된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 포함하는 조성물을 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 급성 처치 또는 만성 치료 후 개체에서 인슐린 민감성을 높이는 방법을 제공한다.
본 발명의 특성들과 장점들은 아래 상세하게 기술된 실시예들과 도면으로부터 명확해질 것이다. 그러나, 상세한 설명과 본 발명의 바람직한 구현예가 기술된 구체적인 실시예들은, 당해 기술 분야의 당업자라면, 상세한 설명으로부터 본 발명의 사상과 범위내에서 다양한 변형 및 수정이 자명할 것이므로, 단순히 설명하기 위해 제공된 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 수컷 랫에서 OXM, PEG10-Fmoc-OXM 및 PEG20-Fmoc-OXM에 대한 약물동력학적 프로파일을 나타낸 그래프이다. 랫에, 0.5 ml PBS 완충액 중의, 천연 OXM (62nmol/kg), PEG10-Fmoc-OXM (278㎍/kg OXM 펩타이드 함유) 또는 PEG20-Fmoc-OXM (62nmol/kg OXM 펩타이드 함유)을 1회 SC로 볼루스 주사하였다. 경정맥에서 지정된 시간대에 혈청 샘플을 취하여, OXM ELISA 키트 (Bachem, Switzerland)를 이용하여 OXM 농도를 분석하였다.
도 2는 수컷 랫에서 OXM 및 PEG40-Fmoc-OXM의 약물 동력학적 프로파일을 나타낸 그래프이다. 랫에, 0.5 ml PBS 완충액 중의, 천연 OXM (62nmol/kg) 또는 PEG40-Fmoc-OXM (62nmol/kg 체중으로 OXM 펩타이드 함유)을 1회 IV로 볼루스 (A) 또는 SC (B) 주사하였다. 경정맥에서 지정된 시간대에 혈청 샘플을 취하여, OXM ELISA 키트 (Bachem, Switzerland)를 이용하여 OXM 농도를 분석하였다. 첨부된 삽입도는 투여 후 처음 2시간이내에 명확하게 확인되는 OXM 프로파일을 강조하여 나타낸 것이다.
도 3은 천연 OXM, PEG40-Fmoc-OXM 및 PEG40-EMCS-OXM의 시험관내 활성을 나타낸 그래프이다. GLP-1 수용체를 과다 발현하는 CHO-K1 세포 (Millipore HTS163C2)를 96웰 반쪽-영역 화이트에 200,000 cells/ml의 밀도로 접종하여, 37℃에서 24시간 인큐베이션하였다. 세포를, 랫 혈청 1% (Bio reclamation)를 첨가하거나 첨가하지 않고, OXM (ALMAC), PEG40-EMCS-OXM 및 PEG40-Fmoc-OXM의 농도를 증가시키면서 첨가하여, 인큐베이션하였다. 세포의 cAMP 농도를 HTRF 분석 (Cisbio 62AM4PEB)으로 정량하고, PRISM 소프트웨어로 EC50 파라미터를 분석하였다.
도 4는 IP 내당능 검사 (IPGTT)로 측정한, 마우스에서의, 천연 OXM, PEG40-Fmoc-OXM 및 PEG40-EMCS-OXM의 내당능 유도를 나타낸 그래프이다. C57BL/6 마우스를 밤샘 금식시킨 다음, PBS (비히클), PEG40-Osu 대조군 (546nmol/kg), 천연 OXM (333nmol/kg), PEG40-Fmoc-OXM (202nmol/kg 펩타이드 함량) 및 PEG40-EMCS-OXM (333nmol/kg)을 IP로 주사하였다. 시험 물질 (비히클, OXM 및 PEG40-Osu)을 투여한지 15분 후에 또는 PEG40-Fmoc-OXM을 투여하고 120분 후에, 글루코스 (1.5gr/kg)를 IP로 투여하였다. 소형 혈당 측정기를 사용하여, 글루코스 투여 전과, 글루코스 투여 후 10, 20, 30, 60 및 120분 후에, 꼬리 정맥에서 혈당치를 측정하였다. 그래프 (A)는 혈당 프로파일이고, 그래프 (B)는 글루코스 AUC이다.
도 5는 섭식으로 인해 비만을 나타낸 수컷 C57BL/6J 마우스에서의, 체중 (A) 및 누적 섭식량 (B)에 대한 OXM (1일 2회) 및 PEG40-FMS-OXM (1, 3, 5, 7일)의 SC 투여 효과를 나타낸 그래프이다. 데이타는 평균 계산하였다 (n = 10). SEM은 통계학적 모델의 오차로부터 계산하였다. 1일에 시작하여 7일간 마우스에 투여하였다. 데이타는 공변량으로서 1일째 체중에 대한 ANCOVA와, 이후 윌리암 검정 (PBS 중의 OXM) 또는 다중 t 검정 (시부트라민 및 PEG40-FMS-OXM)으로 적정 비히클과 비교하여 분석하였다. 적정 비히클 대비 유의한 차이: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. 백분율 값은 8일째 (즉, 7일 투여한 후) 적정 비히클 그룹과의 차이를 나타낸다.
도 6은 식이성 비만을 보이는 수컷 C57BL/6J 마우스에서, 체중 (A) 및 누적 섭식량 (B)에 대한, OXM (1일 2회) 및 공유 결합된 페길화된 OXM PEG40-EMCS-OXM (1일, 4일 및 7일째의 1000nmol/kg 및 5000nmol/kg, 또는 1일 및 7일째에 8000nmol/kg), PEG40-FMS-OXM (1일, 4일 및 7일째의 1000nmol/kg 및 5000nmol/kg, 또는 1일 및 7일째의 8000nmol/kg) 및 PEG30-FMS-OXM (1일, 4일 및 7일째의 5000nmol/kg)의 SC 투여 효과를 나타낸 그래프이다. 데이타는 평균 계산하였다 (n = 10). SEM은 통계학적 모델의 오차로부터 계산하였다. 1일에시작하여 7일간 마우스에 투여하였다.
도 7은 식이 유도성 비만 (DIO) 마우스에서 체중에 대한 가역적으로 페길화된 OXM 투여 효과를 나타낸 것이다. 단독 사육한 첫 주에 (관리 기간), 동물에게 매일 1회 관리 프로토콜을 시작하였으며, 2번째 주 (베이스라인 기간)에 적정 비히클을 하루에 2번 또는 매주 1회 피하 경로를 통해 처치 기간에 투여하는 바와 같이 투여하였다. DIO 마우스 7 그룹 (n=8)에게 29일간 다음과 같이 투여하였다: A. PEG40-SH (662 mg/kg), B. PEG40-EMCS-OXM (6,000nmol/kg), C. PEG30-EMCS-OXM (6,000nmol/kg), D. PEG40-FMS-OXM (6,000nmol/kg), E. PEG30-FMS-OXM (6,000nmol/kg), F. 비히클 (PBS), 및 G. OXM (6,000nmol/kg; PBS). 베이스라인 기간과 처치 기간 동안에, 물 섭취량과 체중을 매일 기록하였다. PEG40-FMS-OXM 또는 PEG30-FMS-OXM을 매주 투여하면 식이 유도성 비만 (DIO) 마우스에서 체중이 현저하게 감소되었다.
도 8은 식이 유도성 비만 (DIO) 마우스에서 내당능에 대한 가역적으로 페길화된 OXM 투여의 급성 효과를 나타낸 것이다. 1일에 약물 또는 비히클 투여를 개시한 후, 마우스들을 모두 밤새 금식시켰다. 2일에, 마우스를 대상으로 경구 내당능 검사 (OGTT)를 수행하였다. 각 동물에 비히클 또는 시험 화합물을 투여하고, 60분 후에 D-글루코스 (2 g/kg po)를 투여하였다. 베이스라인 혈액 샘플을 비히클 또는 시험 화합물 (B1) 투여 직전과 글루코스 주입 (B2) 직전에 채혈하였다. 글루코스를 투여한 후 10, 20, 30, 45, 60 및 120분째에 다시 혈액 샘플을 채혈하였다. 모든 혈액 샘플 (대략 20㎕)을 꼬리 정맥에서 취하였다. 혈장 샘플을 준비하여, 써모일렉트론 인피니티 글루코스 시약 (TR15421)과 Alpco 마우스 초민감성 인슐린 ELISA (80-INSMSU-E10)를 각각 사용하여 글루코스 (n = 2)와 인슐린 (n = 1)을 분석하였다.
도 9는 식이 유도성 비만 (DIO) 마우스에서의 최종 (terminal) 글루코스, 글리세롤, 콜레스테롤 및 인슐린에 대한 가역적으로 페길화된 OXM의 효과를 나타낸 것이다. 최종 (terminal) 혈장 샘플을 심장 천공에 의해 (29일째에 시험 화합물 또는 대조군 화합물을 최종 투여한 후 24시간 경과 시) 채집하여, 마우스 초민감성 인슐린 ELISA (80-INSMSU-E10), 써모일렉트론 인피니피 글루코스 시약 (TR15421) 및 써모일렉트론 인피니피 콜레스테롤 시약 (TR13421)을 이용하여 인슐린, 글루코스 및 콜레스테롤을 분석하였다.
도 10은 식이 유도성 비만 (DIO) 마우스에서 지방, 물, 단백질 및 회분 (뼈)의 최종 체 성분 분석에 대한 가역적으로 페길화된 OXM의 투여 효과를 나타낸 것이다. DIO 마우스의 체 지방 (A), 물 (B), 단백질 (C), 및 회분 수준 (D)을 표준적인 화학 분석 기법으로 측정하였다. 치료군은 다음과 같다: A. PEG40-SH (662 mg/kg), B. PEG40-EMCS-OXM (6,000nmol/kg), C. PEG30-EMCS-OXM (6,000nmol/kg), D. PEG40-FMS-OXM (6,000nmol/kg), E. PEG30-FMS-OXM (6,000nmol/kg), F. 비히클 (PBS), 및 G. OXM (6,000nmol/kg; PBS).
도 11은 PEG-OXM 변형체들, 즉, PEG40-EMCS-OXM, PEG30-EMCS-OXM, PEG40-FMS-OXM, PEG30-FMS-OXM 투여시, 대조군 대비, 공복 글루코스 및 공복 혈장 인슐린의 상당하고 유의한 감소를 보여주는 것이다.
도 12는 PEG-OXM 변형체들, 즉, PEG30-FMS-OXM, PEG40-FMS-OXM 및 PEG60-FMS-OXM 투여시, 대조군 대비, 공복 글루코스 및 공복 혈장 인슐린의 상당하고 유의한 감소를 보여주는 것이다.
도 13은 PEG-OXM 변형체들, 즉, PEG5-FMS-OXM, PEG30-FMS-OXM, PEG40-FMS-OXM 및 PEG60-FMS-OXM 투여시, 대조군 대비, 체중의 상당하고 유의한 감소를 보여주는 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 장기 작용성 듀얼 GLP-1/ 글루카곤 수용체 작용제와 이의 제조 및 생산 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 장기 작용성 옥신토모듈린과 이의 제조 및 생산 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 장기 작용성 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제는 옥신토모듈린, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머) 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)을 포함하거나 이들로 구성된 조성물이다. 다른 구현예에서, 장기 작용성 옥신토모듈린은 옥신토모듈린, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머) 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)을 포함하거나, 또는 이들로 구성된 조성물이다. 다른 구현예에서, 본 발명은 옥신토모듈린 펩타이드, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 폴리머, 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)을 포함하는 변형된 옥신토모듈린 펩타이드를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 옥신토모듈린 펩타이드, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 폴리머, 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)으로 구성된 변형된 옥신토모듈린 펩타이드를 제공한다. 일 구현예에서, 장기 작용성 옥신토모듈린은 옥신토모듈린 및 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)를 포함하거나 이들로 구성된 조성물이다.
일 구현예에서, 듀얼 "GLP-1/글루카곤 수용체 작용제" 및 "작용제"라는 용어는 본원에서 상호 호환적으로 사용된다. 다른 구현예에서, 이들 용어는 또한 당해 기술 분야에 공지된 모든 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 포함한다. 다른 구현예에서, 바람직한 작용제는 옥신토모듈린 또는 OXM, 또는 이들의 기능성 변형체이다.
일 구현예에서, "기능성"이라는 용어는 본원에서 작용제 또는 OXM의 생물학적 활성 능력을 지칭하는 것으로, 비제한적인 예로서, 본원에 추가적으로 제시된 바와 같이, 체중 감소, 인슐린 민감성 증가를 포함한다.
다른 구현예에서, 장기 작용성 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제는 페길화된 옥신토모듈린이다. 다른 구현예에서, 장기 작용성 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제는 가역적으로 페길화된 옥신토모듈린이다. 다른 구현예에서, 장기 작용성 옥신토모듈린은 페길화된 옥신토모듈린이다. 다른 구현예에서, 장기 작용성 옥신토모듈린은 가역적으로 페길화된 옥신토모듈린이다. 다른 구현예에서, "장기 작용성 옥신토모듈린", "리버스된 (reversed) 페길화된 옥신토모듈린", "가역적으로 페길화된 OXM", 및 "옥신토모듈린, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머) 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)을 포함하거나 이것으로 구성된 조성물"이라는 표현들은 상호 호환적으로 사용된다. 다른 구현예에서, 장기 작용성 옥신토모듈린은 Fmoc 또는 FMS를 통해 PEG와 연결된 OXM이다.
일 구현예에서, 본원에 제공되는 장기 작용성 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제는 PEG 폴리머를 포함한다. 다른 구현예에서, 작용제는 Fmoc 또는 FMS를 통해 옥신토모듈린 펩타이드의 아미노 말단에 접합된 PEG 폴리머를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기 작용성 옥신토모듈린은 PEG 폴리머를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기 작용성 옥신토모듈린은 Fmoc 또는 FMS를 통해 옥신토모듈린 펩타이드의 아미노 말단에 접합된 PEG 폴리머를 포함한다.
다른 구현예에서, 장기 작용성 옥신토모듈린은 1:0.2 - 10:0.2-10 몰 비율로 옥신토모듈린, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머), 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)을 포함하거나, 또는 이것으로 구성된 조성물이다. 다른 구현예에서, 장기 작용성 옥신토모듈린은 1:0.5 - 2:0.5-2 몰 비율로 옥신토모듈린, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머), 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)을 포함하거나, 또는 이것으로 구성된 조성물이다. 다른 구현예에서, 장기 작용성 옥신토모듈린은 1:1:1의 몰 비율로 옥신토모듈린, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머), 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)을 포함하거나, 또는 이것으로 구성된 조성물이다. 다른 구현예에서, 장기 작용성 옥신토모듈린은 Fmoc 또는 FMS를 통해 옥신토모듈린의 아미노 말단에 접합된 PEG 폴리머를 포함한다.
일 구현예에서, 장기 작용성 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제는, 비제한적인 예로서, Fmoc 및 FMS 등의 가역적인 링커를 통해 PEG에 연결된다. 다른 구현예에서, 장기 작용성 옥신토모듈린은, 비제한적인 예로서, Fmoc 및 FMS 등의 가역적인 링커를 통해 PEG에 연결된다. 다른 구현예에서, Fmoc 및 FMS는 염기에 민감하며, 생리학적 조건에서 제거가능하다. 다른 구현예에서, 가역적인 링커는 염기에 민감하며 생리학적 조건에서 제거가능한 링커이다. 다른 구현예에서, 가역적인 링커는 염기에 민감하며 생리학적 조건에서 혈액, 혈장 또는 림프에서 제거가능한 링커이다. 다른 구현예에서, 가역적인 링커는 염기에 민감하며 생리학적 조건에서 체액에서 제거가능한 링커이다. 다른 구현예에서, 가역적인 링커는 염기성 pH의 체액에서 제거가능한 링커이다. 다른 구현예에서, 염기에 민감한 링커는 염기성 환경에 노출시 절단되어, 링커 및 PEG로부터 OXM를 분리시킨다.
다른 구현예에서, 리버스 페길화된 옥신토모듈린은 OXM이 가역적인 링커를 통해 PEG에 연결된 조성물이다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 옥신토모듈린은 염기성 환경에 노출시 유리 (free) OXM이 분리된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 옥신토모듈린은 혈액 또는 혈장에 노출시 유리 OXM이 분리된다. 다른 구현예에서, 장기 작용성 옥신토모듈린은, 표준 페길화 공정에서와 같이, 서로 직접 연결되지 않고 염기성에 매우 민감하며 일반적인 생리학적 조건에서 제거가능한 Fmoc 또는 FMS의 서로 다른 위치에, 2개의 잔기가 연결된, PEG와 옥신토모듈린을 포함한다. 다른 구현예에서, 일반적인 생리학적 조건은 혈액 또는 혈장 등의 생리학적 환경을 포함한다.
일 구현예에서, 장기 작용성 옥신토모듈린은 EMCS를 이용하여 PEG에 비-가역적으로 접합된다 (실시예 3 참조).
다른 구현예에서, 구조체와 Fmoc 및 FMS의 제조 방법은 미국 특허 7585837에 기술되어 있다. 미국 특허 7585837의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
다른 구현예에서, 리버스 페길화는 OXM을 장기 작용성 OXM으로 만들어준다. 다른 구현예에서, 장기 작용성 옥신토모듈린은 생물학적 반감기가 연장된 옥신토모듈린이다.
일 구현예에서, 리버스 페길화는 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 분해로부터 보호한다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화는 OXM을 분해로부터 보호한다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화는 OXM의 Cmax에 작용하여 유해한 부작용을 낮춘다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화는 OXM의 Tmax를 연장시킨다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화는 OXM의 순환성 반감기를 연장시킨다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은 비-변형된 OXM에 비해 생체이용성이 개선된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은 비-변형된 OXM에 비해 생물학적 활성이 개선된다. 일부 구현예들에서, 리버스 페길화는 OXM의 효능을 강화한다.
다른 구현예들에서, 리버스 페길화된 OXM은 생화학적 기준 측면들에서 비-변형된 OXM과 적어도 등가이다. 다른 구현예들에서, 리버스 페길화된 OXM은 약리학적 기준 측면에서 비-변형된 OXM과 적어도 등가이다. 다른 구현예들에서, 리버스 페길화된 OXM은 결합력 (Kd) 측면에서 비-변형된 OXM과 적어도 등가이다. 다른 구현예들에서, 리버스 페길화된 OXM은 소화계를 통한 흡수 측면에서 비-변형된 OXM과 적어도 등가이다. 다른 구현예들에서, 리버스 페길화된 OXM은 비-변형된 OXM 보다 소화계를 통해 흡수되는 동안 보다 안정적이다.
다른 구현예에서, 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제는 유리 작용제 (free agonist)에 비해 개선된 곡선 하 면적 (AUC)의 혈액 수준을 나타낸다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은 유리 작용제에 비해 개선된 곡선 하 면적 (AUC)의 혈액 수준을 나타낸다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은 유리 OXM에 비해 개선된 생물학적 활성과 곡선 하 면적 (AUC)의 혈액 수준을 나타낸다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제는 유리 OXM에 비해 개선된 혈액 체류 시간 (t1/2)을 나타낸다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은 유리 OXM에 비해 개선된 혈액 체류 시간 (t1/2)을 나타낸다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은 유리 OXM에 비해 개선된 생물학적 활성 및 혈액 체류 시간 (t1/2)을 나타낸다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은 유리 OXM에 비해 개선된 혈액 Cmax 수준을 나타냄으로써, 잠재적으로 유해한 부작용이 낮다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은 유리 OXM에 비해 개선된 생물학적 활성을 나타낸다. 다른 구현예에서, 본 발명은, 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)을 통해 유리 OXM의 아미노 말단에 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)를 접합하는 단계를 포함하거나, 상기한 단계로 구성된, OXM의 AUC, Cmax, t1/2, 생물학적 활성 또는 이들의 임의 조합을 개선하는 방법을 제공한다. 그리하여, 일 구현예에서, 본 발명은, 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)을 통해 상기 옥신토모듈린의 아미노 말단에 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)를 접합하는 단계로 구성된, 옥신토모듈린의 곡선 하 면적 (AUC)을 개선하는 방법을 추가로 제공한다.
일 구현예에서, 임의의 소정의 글루카곤 유사체 펩타이드의 GLP-1 또는 글루카곤 작용제 활성은, GLP-1 또는 글루카곤 활성에 대해 정해진 분석으로 펩타이드의 EC50 값을 측정함으로써, 정량할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면 인지하는 바와 같이, EC50 값은 특정 분석에서 화합물의 최대 활성의 절반이 달성되는 농도 수치이다. 본 명세서에서, GLP-1 또는 글루카곤 작용제 활성에 대한 분석에서 EC50 값은 각각 EC50[GLP-1] 및 EC50[Glu]로 지칭될 것이다. 여러가지 화합물에 대한 EC50 값들의 비교는, 이들이 다른 동일 조건에서 동일 분석으로 해당 화합물들의 활성을 설명하는 것으로 이해될 것이다.
글루카곤 유사체 펩타이드에 대한 EC50[Glu]/EC50[GLP-1] 비율은 글루카곤의 EC50[Glu]/EC50[GLP-1] 비율 보다 높을 수 있다. 이는, 글루카곤 유사체 펩타이드가 글루카곤에 비해 GLP-1 수용체에 대해 높은 선택성을 가지는 의미로 해석될 수 있다.
다른 구현예에서, 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)을 통해 유리 OXM의 아미노 말단에 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)를 접합함으로써 이루어지는, OXM의 AUC, Cmax, t1/2, 생물학적 활성 또는 이들의 임의 조합의 개선은, OXM의 투약 빈도를 낮출 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명은, 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)을 통해 OXM의 아미노 말단 또는 라이신 잔기에 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)를 접합하는 단계를 포함하거나, 상기 단계로 구성된, OXM의 투약 빈도를 낮추는 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, OXM의 리버스 페길화는 사용되는 투여량을 낮추는데 유리하다.
다른 구현예에서, OXM은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, OXM은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된다. 다른 구현예에서, 서열번호 1은 아미노산 (AA) 서열: HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA (서열번호 1)을 포함하거나 이로 구성된다. 다른 구현예에서, OXM은 CAS No. 62340-29-8으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
다른 구현예에서, OXM은 인간 OXM 또는 임의의 포유류 OXM이다. 다른 구현예에서, OXM은 또한, 글루카곤-37 또는 생활성 엔테로글루카곤 (bioactive enteroglucagon)으로 지칭된다. 다른 구현예에서, OXM은 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제이다. 다른 구현예에서, OXM은 OXM의 생물학적으로 활성인 단편이다. 다른 구현예에서, 생물학적으로 활성인 OXM은 서열번호 1의 아미노산 30번에서 아미노산 37번까지 걸쳐있다. 다른 구현예에서, 생물학적으로 활성인 OXM은 서열번호 1의 아미노산 19번에서 아미노산 37번까지 걸쳐있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 OXM은 C-말단의 아미노산 2개가 결손된 옥타펩타이드이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 OXM은 본원에 기술된 바와 같이 OXM 활성을 보유한 서열번호 1의 임의 단편이다.
일 구현예에서, OXM은 서열번호 1의 펩타이드에 상동적인 펩타이드를 지칭한다. 일 구현예에서, 본 발명의 OXM 아미노산 서열은 국립 생물공학 정보 센터 (NCBI)의 BlastP 소프트웨어에서 디폴트 파라미터를 이용하여 결정된 바와 같이, 서열번호 1에 기재된 OXM 서열과 40% 이상 상동적이다. 일 구현예에서, 본 발명의 OXM 아미노산 서열은, NCBI의 BlastP 소프트웨어에서 디폴트 파라미터를 이용하여 결정된 바와 같이, 서열번호 1에 기재된 OXM 서열과 50% 이상 상동적이다. 일 구현예에서, 본 발명의 OXM 아미노산 서열은, NCBI의 BlastP 소프트웨어에서 디폴트 파라미터를 이용하여 결정된 바와 같이, 서열번호 1에 기재된 OXM 서열과 60% 이상 상동적이다. 일 구현예에서, 본 발명의 OXM 아미노산 서열은, NCBI의 BlastP 소프트웨어에서 디폴트 파라미터를 이용하여 결정된 바와 같이, 서열번호 1에 기재된 OXM 서열과 70% 이상 상동적이다. 일 구현예에서, 본 발명의 OXM 아미노산 서열은, NCBI의 BlastP 소프트웨어에서 디폴트 파라미터를 이용하여 결정된 바와 같이, 서열번호 1에 기재된 OXM 서열과 80% 이상 상동적이다.
일 구현예에서, 본 발명의 OXM 아미노산 서열은, NCBI의 BlastP 소프트웨어에서 디폴트 파라미터를 이용하여 결정된 바와 같이, 서열번호 1에 기재된 OXM 서열과 90% 이상 상동적이다. 일 구현예에서, 본 발명의 OXM 아미노산 서열은, NCBI의 BlastP 소프트웨어에서 디폴트 파라미터를 이용하여 결정된 바와 같이, 서열번호 1에 기재된 OXM 서열과 95% 이상 상동적이다.
야생형 OXM과 비교하여, 본 발명의 OXM 유도체 또는 변형체는 수개의 아미노산 치환을 포함하거나, 및/또는 페길화되거나 또는 다르게 (예, 재조합적으로 또는 화학적으로) 변형될 수 있다.
또한, 본원에 제공되는 OXM은 상기 OXM 서열에 대한 모든 유사체를 망라한다. 서열에서 어떤 하나 이상의 아미노산 잔기는 당해 기술 분야에 잘 공지된 보존적인 치환으로, 즉, 소수성 아미노산 하나를 다른 것으로 치환하는 등의, 하나의 아미노산을 비슷한 화학적 유형의 아미노산으로 치환으로, 독립적으로 치환될 수 있다. 다른 예로, 비-보존적인 아미노산 돌연변이는 OXM의 효과 또는 생물학적 활성을 강화하게 만들 수 있다. 특히, OXM은 다이펩티딜 펩티다제 IV (DPP-IV)에 의한 절단 및 불활성에 내성이 되도록 변형된다.
OXM 유도체 및 변형체, 및 이의 제조 방법은 미국 출원 공개공보 2011/0152182, 2011/0034374, 2010/0144617에 기술되어 있으며, 이들 모두 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일 구현예에서, 본원에 제시된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제는 화학적으로 변형될 수 있다. 다른 구현예에서, 본원에 제시된 OXM은 화학적으로 변형될 수 있다. 특히, OXM의 아미노산 측쇄, 아미노 말단 및/또는 카르복시산 말단이 변형될 수 있다. 예를 들어, OXM은, 알킬화, 이황화 결합 형성, 금속 착화, 아실화, 에스테르화, 아미드화, 질화, 산 처리, 염기 처리, 산화 또는 환원 중 한가지 이상이 진행될 수 있다. 이러한 처리를 수행하는 방법들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 특히, OXM은 저급 알킬 에스테르, 저급 알킬 아미드, 저급 다이알킬 아미드, 산 부가 염, 카르복실레이트 염 또는 이의 알칼리 부가 염으로서 제공된다. 특히, OXM의 아미노 말단 또는 카르복시 말단은, 예를 들어, 에스테르화, 아미드화, 아실화, 산화 또는 환원에 의해 유도체화될 수 있다. 특히, OXM의 카르복시 말단은 아미드 모이어티를 형성하도록 유도체화될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 장기 작용성 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제는 비-변형된 작용제의 생물학적 활성을 유지한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 OXM은 비-변형된 OXM의 생물학적 활성을 유지한다. 일 구현예에서, 본 발명의 장기 작용성 OXM은 비-변형된 OXM의 생물학적 활성을 유지한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기 작용성 OXM은 OXM의 생물학적 활성을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기 작용성 OXM의 생물학적 활성은 소화에 의한 분비 (digestive secretion) 감소를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기 작용성 OXM의 생물학적 활성은 위 공복 저하 및 지연을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기 작용성 OXM의 생물학적 활성은 소장에서 식이 운동성 패턴 (fed motility pattern) 저해를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기 작용성 OXM의 생물학적 활성은 펜타가스트린에 의해 자극된 산 분비의 저해를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기 작용성 OXM의 생물학적 활성은 위 소마토스타틴의 방출 증가를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기 작용성 OXM의 생물학적 활성은 펩타이드 YY의 작용 강화를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기 작용성 OXM의 생물학적 활성은 그렐린 분비 저해를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기 작용성 OXM의 생물학적 활성은 아디포넥틴의 상향-조절을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기 작용성 OXM의 생물학적 활성은 유리 지방산 감소를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기 작용성 OXM의 생물학적 활성은 트리글리세라이드 감소를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기 작용성 OXM의 생물학적 활성은 콜레스테롤 감소를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기 작용성 OXM의 생물학적 활성은 아미노피린 축적과 cAMP 생산의 자극을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기 작용성 OXM의 생물학적 활성은 GLP-1 수용체 또는 글루카곤 수용체의 결합을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기 작용성 OXM의 생물학적 활성은 아데닐레이트 사이클라제의 활성화를 통한 H+ 생산 자극을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기 작용성 OXM의 생물학적 활성은 히스타민에 의해 자극된 위산 분비 저해를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기 작용성 OXM의 생물학적 활성은 섭식 감소를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기 작용성 OXM의 생물학적 활성은 인슐린 분비 자극을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기 작용성 OXM의 생물학적 활성은 외분비 췌장 분비 (exocrine pancreatic secretion) 저해를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기 작용성 OXM의 생물학적 활성은 인슐린 민감성 증가를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기 작용성 OXM의 생물학적 활성은 글루코스 수준 감소를 포함한다.
일 구현예에서, "의 수준 감소"라는 용어는 오리지날, 야생형, 정상 또는 대조군 수준 대비 약 1 - 10%의 감소를 지칭한다. 다른 구현예에서, 감소는 약 11-20%의 감소이다. 다른 구현예에서, 감소는 약 21-30%의 감소이다. 다른 구현예에서, 감소는 약 31-40%의 감소이다. 다른 구현예에서, 감소는 약 41-50%의 감소이다. 다른 구현예에서, 감소는 약 51-60%의 감소이다. 다른 구현예에서, 감소는 약 61-70%의 감소이다. 다른 구현예에서, 감소는 약 71-80%의 감소이다. 다른 구현예에서, 감소는 약 81-90%의 감소이다. 다른 구현예에서, 감소는 약 91-95%의 감소이다. 다른 구현예에서, 감소는 약 96-100%의 감소이다.
일 구현예에서, "의 수준 증가"라는 용어는 오리지날, 야생형, 정상 또는 대조군 수준 대비 약 1 - 10%의 증가를 지칭한다. 다른 구현예에서, 증가는 약 11-20%의 증가이다. 다른 구현예에서, 증가는 약 21-30%의 증가이다. 다른 구현예에서, 증가는 약 31-40%의 증가이다. 다른 구현예에서, 증가는 약 41-50%의 증가이다. 다른 구현예에서, 증가는 약 51-60%의 증가이다. 다른 구현예에서, 증가는 약 61-70%의 증가이다. 다른 구현예에서, 증가는 약 71-80%의 증가이다. 다른 구현예에서, 증가는 약 81-90%의 증가이다. 다른 구현예에서, 증가는 약 91-95%의 증가이다. 다른 구현예에서, 증가는 약 96-100%의 증가이다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)을 통해 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)에 접합된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 필요한 개체에서 내당성을 유도하는 방법, 혈당 조절을 개선하는 방법 또는 이 둘다를 포함하는 방법을 추가로 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)을 통해 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)에 연결된 옥신토모듈린 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 내당성을 유도하는 방법, 혈당 조절을 개선하는 방법 또는 이 둘다를 포함하는 방법을 추가로 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은, 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)을 포함하는 유연한 링커를 통해 작용제를 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)에 접합하는 단계로 구성된, 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 생물학적 반감기를 연장하는 방법을 추가로 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은, 몰비 약 1:1:0.5 내지 약 1:1:3.5로 옥신토모듈린, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머) 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)을 접합하는 단계로 구성된, 옥신토모듈린의 생물학적 반감기를 연장하는 방법을 추가로 제공한다. 다른 구현예에서, OXM : PEG : 링커의 몰비는 1:1:10이다. 다른 구현예에서, 상기 범위는 1:1:5 - 1:1:9이고, 다른 구현예에서, 상기 범위는 1:1:3.7 - 1:1:4.9이다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 유연한 링커를 통해 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)에 접합된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 유연한 링커가 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)인, 개체에서 섭식 감소, 체중 감소 또는 섭식과 체중을 감소시키는 방법을 추가로 제공한다. 다른 구현예에서, 개체는 당뇨병 환자이다. 다른 구현예에서, 개체는 과체중 개체이다. 다른 구현예에서, 개체는 비만 개체이다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 유연한 링커를 통해 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)에 접합된 옥신토모듈린을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 유연한 링커가 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)인, 개체에서 섭식 감소, 체중 감소 또는 섭식과 체중을 감소시키는 방법을 추가로 제공한다. 다른 구현예에서, 개체는 당뇨병 환자이다. 다른 구현예에서, 개체는 과체중 개체이다. 다른 구현예에서, 개체는 비만 개체이다.
일 구현예에서, 본원에 제시된 PEG-OXM 화합물은 인슐린의 수준 증가 없이 글루코스 수준의 유의한 감소를 유도한다. 다른 구현예에서, 본원에 제시된 PEG-OXM 화합물은 PEG-OXM 화합물 1회 투여 후 공복 인슐린 수준의 감소와 더불어 글루코스 수준을 예상치 못하게도 감소시킨다 (본원의 실시예 7 참조). 그래서, 다른 구현예에서, 본 발명은, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)에 접합된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 포함하는 조성물을 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 인슐린 민감성을 높이는 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 예상치못하게도 본원에 제공되는 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 이용하여 개체를 급성 처치한 후 인슐린 민감성의 현저한 증가를 나타내었다 (실시예 7 참조). 다른 구현예에서, 작용제는 링커를 통해 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)에 접합된다. 다른 구현예에서, 작용제는 OXM이다. 다른 구현예에서, 링커는 유연한 링커이다. 다른 구현예에서, 링커는 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)이다. 다른 구현예에서, 링커는 비-절단성 링커이다. 다른 구현예에서, 링커는 N-(ε-말레이미도카프로일옥시) 숙신이미드 에스테르 (EMCS)이다.
다른 구현예에서, 본 발명에 따른 장기 작용성 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 생물학적 활성은 미주 신경 간접 기전을 통한 췌장성 분비 저해를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 장기 작용성 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 생물학적 활성은 소장을 통한 하이드로미네랄 수송 감소를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 장기 작용성 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 생물학적 활성은 글루코스 흡수 자극을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 장기 작용성 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 생물학적 활성은 소마토스타틴 분비 조절/자극을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 장기 작용성 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 생물학적 활성은 섭식 및 체중 증가 둘다의 감소를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 장기 작용성 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 생물학적 활성은 지방 축적 (adiposity) 감소를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 장기 작용성 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 생물학적 활성은 식욕 억제를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 장기 작용성 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 생물학적 활성은 식욕부진증 유도를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 장기 작용성 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 생물학적 활성은 과체중 개체 및 비만 개체에서의 체중 감소를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 장기 작용성 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 생물학적 활성은 지방 호르몬 렙틴 및 아디포넥틴의 수준 변화 유도를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 장기 작용성 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 생물학적 활성은 과체중 개체 및 비만 개체에서의 에너지 섭취 감소 외에도 에너지 소비 증가를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 장기 작용성 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 생물학적 활성은 혈장 트리글리세라이드 감소 및 케톤체 (ketone body) 증가를 포함한다.
일 구현예에서, 급성 처치 후, 본 발명에 따른 장기 작용성 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 생물학적 활성은, 혈장 트리글리세라이드 감소 및 케톤체 증가를 포함한다. 다른 구현예에서, 급성 처치 후, 본 발명에 따른 장기 작용성 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 생물학적 활성은, 글루코스신합성 유전자 Pck1, Pgc1α 및 Pdha1의 발현 증가를 포함한다. 다른 구현예에서, 급성 처치 후, 본 발명에 따른 장기 작용성 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 생물학적 활성은, 피루베이트 탈카르복시화의 주 산물인 아세틸-CoA, 및 말로닐-CoA의 간 풀 (liver pool) 감소를 포함한다. 다른 구현예에서, 급성 처치 후, 본 발명에 따른 장기 작용성 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 생물학적 활성은, 간에서의 지방산 산화 (FAO)를 유도하는 Fgf21 및 Cpt1a 등의 유전자의 상향 조절을 포함한다. 다른 구현예에서, 급성 처치 후, 본 발명에 따른 장기 작용성 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 생물학적 활성은, ChREBP 등의 지질 생성 유전자 (lipogenic gene)의 하향 조절을 포함한다. 다른 구현예에서, 급성 처치 후, 본 발명에 따른 장기 작용성 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 생물학적 활성은, Ldlr 유전자의 상향 조절을 포함한다.
일 구현예에서, 만성 처치 (chronic treatment) 후, 본 발명에 따른 장기 작용성 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 생물학적 활성은, 렙틴 수준 감소를 포함한다. 다른 구현예에서, 만성 처치 후, 본 발명에 따른 장기 작용성 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 생물학적 활성은, b-하이드록시부티레이트 수준 증가를 포함한다.
다른 구현예에서, PEG 폴리머는 Fmoc 또는 FMS를 통해 옥신토모듈린의 아미노 말단 또는 라이신 잔기에 부착된다. 다른 구현예에서, "부착된" 및 "연결된"은 상호 호환적으로 사용된다. 다른 구현예에서, PEG 폴리머는 OXM의 α-아미노 측쇄에 연결된다. 다른 구현예에서, PEG 폴리머는 OXM의 ε-아미노 측쇄에 연결된다. 다른 구현예에서, PEG 폴리머는 OXM의 하나 이상의 ε-아미노 측쇄에 연결된다. 다른 구현예에서, PEG 폴리머는 설프하이드릴 모이어티를 포함한다.
다른 구현예에서, PEG는 선형이다. 다른 구현예에서, PEG는 분지형이다. 다른 구현예에서, PEG는 분자량이 200 내지 200,000 Da의 범위이다. 다른 구현예에서, PEG의 분자량은 5,000 내지 80,000 Da의 범위이다. 다른 구현예에서, PEG의 분자량은 5,000 내지 40,000 Da의 범위이다. 다른 구현예에서, PEG의 분자량은 20,000 Da 내지 40,000 Da의 범위이다.
다른 구현예에서, 장기 작용성 OXM은 페길화제를 이용하여 제조되며, 즉, 비제한적인 예로서, Fmoc 또는 FMS 모이어티의 플루오렌 고리에 존재하는 NH2, OH, SH, COOH, CHO, --N=C=O, --N=C=S, --SO2Cl, --SO2CH=CH2, --PO2Cl, --(CH2)xHal 등의 관능기와 반응할 수 있는, 임의의 PEG 유도체를 이용하여 제조된다. 다른 구현예에서, 페길화제는 PEG 분자의 한쪽 말단의 하이드록시기 하나만 접합에 이용가능한 모노-메톡시화된 형태로 통상적으로 이용된다. 다른 구현예에서, 접합에 양쪽 말단이 이용가능한 PEG의 2관능성 형태는, 예를 들어, 하나의 PEG 모이어티에 공유 결합된 2개의 펩타이드 또는 단백질 잔기와의 접합체를 수득하는 것이 바람직한 경우에, 이용할 수 있다.
다른 구현예에서, 분지형 PEG는 R이 펜타에리트리톨 또는 글리세롤 등의 중심 코어 모이어티이고; m이 분지 암의 갯수인, R(PEG-OH)m으로 표시된다. 분지 암의 갯수 (m)는 3 내지 수백개 이상의 범위일 수 있다. 다른 구현예에서, 하이드록시기는 화학적 변형된다. 다른 구현예에서, 분지형 PEG 분자는 미국 특허 6,113,906, 5,919,455, 5,643,575, 및 5,681,567에 기술되어 있으며, 이들 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일 구현예에서, GLP-1/글루카곤 수용체 작용제는 옥신토모듈린이다. 다른 구현예에서, GLP-1/글루카곤 수용체 작용제는 옥신토모듈린 변형체이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 표준 페길화 공정에서와 같이 OXM에 직접 부착되지 않고 Fmoc 또는 FMS 등의 링커를 통해 PEG 모이어티가 부착되는 방식으로, PEG 모이어티를 가진 OXM을 제공한다. 다른 구현예에서, 링커는 염기에 민감하고 약 염기성 조건에서 제거가능하다. 다른 구현예에서, Fmoc 또는 FMS를 통해 PEG에 연결된 OXM은 유리 OXM과 등가의 활성을 나타낸다. 다른 구현예에서, Fmoc 또는 FMS를 통해 PEG에 연결된 OXM은 유리 OXM 보다 활성이 높다. 다른 구현예에서, Fmoc 또는 FMS를 통해 PEG에 연결된 OXM은 자유 OSM과는 다른 활성을 포함한다. 다른 구현예에서, Fmoc 또는 FMS를 통해 PEG에 연결된 OXM은 유리 OXM과는 달리 중추 신경계 활성을 가진다. 다른 구현예에서, 가역적인 페길화된 OXM은 혈액-뇌 장벽을 통과하고, 시상하부에 작용하여 본원에 제시된 생물학적 활성을 발휘한다. 다른 구현예에서, Fmoc 또는 FMS를 통해 PEG에 연결된 OXM은 유리 OXM과는 달리 혈액-뇌 장벽을 통해 뇌에 진입할 수 없다. 다른 구현예에서, Fmoc 또는 FMS를 통해 PEG에 연결된 OXM은 유리 OXM과 비교하여 연장된 순환 반감기를 포함한다. 다른 구현예에서, Fmoc 또는 FMS를 통해 PEG에 연결된 OXM은 Fmoc 또는 FMS 모이어티와 더불어 PEG 모이어티를 상실하게 되어, 유리 OXM으로 복원된다.
다른 구현예에서, 본 발명은, Y가 유리 아미노, 카르복시 또는 하이드록시이고; X가 식 (i)의 라디칼인, 식: (X)n-Y의 화합물을 제공한다:
Figure pct00001
다른 구현예에서, R1은 단백질 또는 폴리머 캐리어 모이어티를 함유한 라디칼; 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티이고; R2는 수소, 알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 아릴, 알카릴, 아랄킬, 할로겐, 니트로, --SO3H, --SO2NHR, 아미노, 암모늄, 카르복시, PO3H2, 및 OPO3H2로 이루어진 군으로부터 선택되고; R은 수소, 알킬 및 아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고; R3 및 R4는 동일하거나 상이하게, 각각 수소, 알킬 및 아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고; A는 OXM-Y의 아미노 또는 하이드록시기에 라디칼이 연결된 경우 공유 결합이고; n은 1 이상의 정수인 화합물, 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
다른 구현예에서, "알킬", "알콕시", "알콕시알킬", "아릴", "알카릴" 및 "아랄킬"이라는 용어들은 탄소수 1-8, 바람직하게는 1-4의 알킬 라디칼, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 및 부틸, 및 탄소수 6-10의 아릴 라디칼, 예를 들어 페닐 및 나프틸을 지칭한다. 용어 "할로겐"은 Br, F, Cl 및 I를 포함한다.
다른 구현예에서, R2, R3 및 R4는 각각 수소이고, A는 --OCO--, 즉 9-플루오레닐메톡시카르보닐 라디칼 (이하 "Fmoc")이다. 다른 구현예에서, R은 플루오렌 고리의 2번 위치의 --SO3H이고, R3 및 R4는 각각 수소이고, A는 --OCO--, 즉, 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 라디칼 (이하 "FMS")이다.
다른 구현예에서, OXM의 페길화 및 (PEG-Fmoc)n- OXM 또는 (PEG-FMS)n- OXM 접합체의 제조는 MAL-FMS-NHS 또는 MAL-Fmoc-NHS를 OXM의 아민 성분에 부착하여, MAL-FMS-OXM 또는 MAL-Fmoc-OXM 접합체를 수득한 다음, 말레이미드 모이어티를 PEG-SH로 치환하여, (PEG-FMS)n-OXM 또는 (PEG-Fmoc)n-OXM 접합체를 각각 제조하는 것을 포함한다.
다른 구현예에서, OXM의 페길화는 MAL-FMS-NHS 또는 MAL-Fmoc-NHS를 PEG-SH와 반응시켜 PEG-FMS-NHS 또는 PEG-Fmoc-NHS 접합체를 제조한 다음, 이를 OXM의 아민 성분과 반응시켜, 바람직한 (PEG-FMS)n-OXM 또는 (PEG-Fmoc)n-OXM 접합체를 각각 제조하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, OXM 등의 펩타이드/단백질의 페길화는 미국 특허 7585837에 기술되어 있으며, 이 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 다른 구현예에서, OXM 등의 펩타이드/단백질의 Fmoc 또는 FMS를 이용한 리버스 페길화는 미국 특허 7,585,837에 기술되어 있다.
다른 구현예에서, "장기 작용성 OXM" 및 "리버스 페길화된 OXM"이라는 표현은 상호 호환적으로 사용된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은, n이 1 이상의 정수이고 OXM이 하나 이상의 아미노기를 통해 FMS 또는 Fmoc 라디칼에 연결된, 식: (PEG-FMS)n-OXM 또는 (PEG-Fmoc)n-OXM으로 식별되는 본원의 PEG-FMS-OXM 및 PEG-Fmoc-OXM으로 구성된다.
다른 구현예에서, 놀랍게도, 본원에 개시된 장기 작용성 OXM은 페길화된 형태와 말초 형태에서 모두 활성을 나타낸다. 다른 구현예에서, 놀랍게도, (PEG-FMS)n-OXM 또는 (PEG-Fmoc)n-OXM의 구축은 이 접합체를 불활성이 되도록 하지 않는다. 다른 구현예에서, 놀랍게도, (PEG-FMS)n-OXM 또는 (PEG-Fmoc)n-OXM의 구축은 OXM을 불활성이 되도록 하지 않는다.
치료학적 용도
다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 고혈당증 예방, 혈당 조절 개선, 인슐린 비-의존적인 진성 당뇨병 (일 구현예에서, 2형 당뇨병), 인슐린 의존적인 진성 당뇨병 (일 구현예에서, 1형 당뇨병) 및 임신성 당뇨병 (gestational diabetes mellitus)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 진성 당뇨병, 또는 이들의 임의 조합을 치료하는데 이용된다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 2형 당뇨병 치료에 이용된다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 인슐린 민감성을 높이는데 이용된다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 인슐린 내성을 낮추는데 이용된다.
다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 식욕 억제에 사용된다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 포만증 유도에 사용된다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 체중을 낮추는데 사용된다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 체 지방을 낮추는데 사용된다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 체질량 지수 (body mass index)를 낮추는데 사용된다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 섭식을 낮추는데 사용된다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 비만 치료에 사용된다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 비만으로 인한 진성 당뇨병 치료에 사용된다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 심박수를 높이는데 사용된다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 기초 대사량 (BMR)을 높이는데 사용된다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-옥신토모듈린 및 PEG-FMS-옥신토모듈린, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 에너지 소비를 높이는데 사용된다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-옥신토모듈린 및 PEG-FMS-옥신토모듈린, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 내당능을 유도하는데 사용된다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-옥신토모듈린 및 PEG-FMS-옥신토모듈린, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 혈당 조절을 유도하는데 사용된다. 일 구현예에서, 혈당 조절은 혈당 수준이 높지 않거나 및/또는 변동성이 없거나, 및/또는 당화된 헤모글로빈 수준이 높지 않거나 및/또는 변동성이 없는 것을 의미한다.
다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 체중 증가를 저해하는데 사용된다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 혈당 수준을 낮추는데 사용된다 (도 4A 및 9). 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 칼로리 섭취를 낮추는데 사용된다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 식욕을 낮추는데 사용된다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 체중 조절에 사용된다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 체중 감소를 유도 또는 촉진하는데 사용된다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 바람직한 체중, 바람직한 체질량 지수, 바람직한 외양 및 양호한 건강 중 어느 한가지를 유지하기 위해 사용된다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 지질 프로파일 조절에 사용된다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 트리글리세라이드의 수준을 낮추는데 사용된다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 글리세롤의 수준을 낮추는데 사용된다 (도 9D).
다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 콜레스테롤 수준을 낮추는데 사용된다. 일 구현예에서, 콜레스테롤 수준 감소는 천연 OXM을 투여한 후에 관찰되는 감소분 보다 크다 (도 9C). 일 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 콜레스테롤 수준을 60-70% 낮춘다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 콜레스테롤 수준을 50-100% 낮춘다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 콜레스테롤 수준을 25-90% 낮춘다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 콜레스테롤 수준을 50-80% 낮춘다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 콜레스테롤 수준을 40-90% 낮춘다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, HDL 콜레스테롤 수준을 높이는데 사용된다.
일 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 투여 기간 동안 효능의 유의한 감소없이 본원에 기술된 목적으로 이용될 수 있다 (도 5A, 6A 및 7). 일 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 1일간 유효하게 잔류한다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 2-6일간 유효하게 잔류한다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 1주일간 유효하게 잔류한다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 2주일간 유효하게 잔류한다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 3주일간 유효하게 잔류한다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 4주일간 유효하게 잔류한다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 6주일간 유효하게 잔류한다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 2개월간 유효하게 잔류한다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 4개월간 유효하게 잔류한다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 6개월간 유효하게 잔류한다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 1년 이상 유효하게 잔류한다.
일 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 본원에 기술된 목적으로 이용될 수 있으며, 1차 투여량을 투여한 직후에 효과가 발휘될 수 있다 (도 8A). 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물은, 2회 이상의 투여량을 투여한 이후에 효과가 나타난다.
다른 구현예에서, 전술한 바와 같이 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물을 이용하는 방법은 OXM으로 완화, 저해 및/또는 치료될 수 있는 질환 또는 병태를 앓고 있는 인간 개체에게 적용된다. 다른 구현예에서, 전술한 바와 같이 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물을 이용하는 방법은 수의학적 방법이다. 다른 구현예에서, 전술한 바와 같이 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM, 및 이를 포함하는 약학 조성물을 이용하는 방법은 농장 동물, 애완 동물 및 실험용 동물 등의 동물에게 적용된다. 이에, 일 구현예에서, 본 발명의 개체는 고양이과, 개과, 소과, 돼지, 설치류, 말과 (aquine) 등이다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 본원에 기술된 PEG-Fmoc-OXM 및/또는 PEG-FMS-OXM을 치료학적 유효량으로 개체에게 투여하여, 개체에서 OXM으로 치료 또는 완화가능한 질환을 치료 또는 완화하는 단계를 포함하는, OXM 또는 이를 포함하는 약학 조성물로 치료 또는 완화가능한 질환을 치료 또는 완화하는 방법을 제공한다.
다른 구현예에서, OXM, "펩타이드" 또는 "단백질"은, 본원에서, 천연 펩타이드 (분해 산물, 합성에 의해 합성한 단백질 또는 재조합 단백질) 및 펩타이드 모방체 (전형적으로, 합성에 의해 합성한 단백질), 뿐만 아니라, 단백질 유사체이며, 일부 구현예에서, 단백질이 체내에서 보다 안정적이거나 세포로 더 잘 침투할 수 있게 하는 변형을 가진, 펩토이드 및 세미펩토이드를 포괄한다.
다른 구현예에서, 변형은, 비제한적인 예로서, N 말단 변형, C 말단 변형, 펩타이드 결합 변형, 비제한적인 예로, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH 또는 CF=CH, 벡본 변형, 및 잔기 변형을 포함한다. 펩타이드모방성 화합물의 제조 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992)에 명시되어 있으며, 이 문헌은 본원에 충분히 기술된 것과 같이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 이러한 측면들에 대한 보다 상세한 내용들은 아래에 제공된다.
다른 구현예에서, 펩타이드에서 펩타이드 결합 (-CO-NH-)은 치환된다. 일부 구현예들에서, 펩타이드 결합은 N-메틸화된 결합 (-N(CH3)-CO-)으로 치환된다. 다른 구현예에서, 펩타이드 결합은 에스테르 결합 (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)으로 치환된다. 다른 구현예에서, 펩타이드 결합은 케토메틸렌 결합 (-CO-CH2-)으로 치환된다. 다른 구현예에서, 펩타이드 결합은 R이 임의의 알킬, 예컨대, 메틸인 α-아자 결합 (-NH-N(R)-CO-), 카르바 결합 (-CH2-NH-)으로 치환된다. 다른 구현예에서, 펩타이드 결합은 하이드록시에틸렌 결합 (-CH(OH)-CH2-)으로 치환된다. 다른 구현예에서, 펩타이드 결합은 티오아미드 결합 (-CS-NH-)으로 치환된다. 일부 구현예들에서, 펩타이드 결합은 올레핀 이중 결합 (-CH=CH-)으로 치환된다. 다른 구현예에서, 펩타이드 결합은 레트로 아미드 결합 (-NH-CO-)으로 치환된다. 다른 구현예에서, 펩타이드 결합은 R이 탄소 원자 상에 천연적으로 제시되는 "정상" 측쇄인 펩타이드 유도체 (-N(R)-CH2-CO-)으로 치환된다. 일부 구현예들에서, 이들 변형들은 펩타이드 체인 전체의 임의 결합에서 이루어지며, 동시에 여러곳 (2-3개의 결합)에서도 이루어진다.
일 구현예에서, Trp, Tyr 및 Phe 등의 단백질의 천연 방향족 아미노산은 페닐글리신, TIC, 나프틸렌아닌 (Nol), Phe의 고리-메틸화된 유도체, Phe의 할로겐화된 유도체 또는 o-메틸-Tyr 등의 비-천연 합성 산으로 치환된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 하나 이상의 변형된 아미노산 또는 하나 이상의 비-아미노산 단량체들 (예, 지방산, 컴플렉스 탄수화물 등)을 포함한다.
일 구현예에서, "아미노산" 또는 "아미노산들"은 20개의 천연 아미노산; 예를 들어, 하이드록시프롤린, 포스포세린 및 포스포트레오닌 등의 생체내에서 번역 후 수정된 아미노산; 및 비제한적인 예로서, 2-아미노아디프산, 하이드록시라이신, 이소데스모신, 노르발린, 노르루신 및 오르니틴 등의 기타 특이 아미노산을 포괄하는 것으로 이해된다. 일 구현예에서, "아미노산"은 D-아미노산 및 L-아미노산 둘다를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 OXM은 OXM이 가용성 형태이어야 하는 치료제로 이용된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 OXM은, 비제한적인 예로서, 하이드록시-함유 측쇄로 인해 단백질의 용해성을 높일 수 있는, 세린 및 트레오닌 등의, 비-천연 또는 천연 극성 아미노산을 하나 이상 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 OXM은 표준 고상 기법을 이용함으로써와 같이 생화학적으로 합성된다. 다른 구현예에서, 이들 생합성 방법은 제한적인 고상 합성, 부분 고상 합성, 단편 축합 또는 고전적인 용액 합성을 포함한다.
일 구현예에서, 고상 OXM 합성 공정은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있으며, John Morrow Stewart and Janis Dillaha Young, Solid Phase Protein Syntheses (2nd Ed., Pierce Chemical Company, 1984)에 더욱 기술되어 있다. 다른 구현예에서, 합성 단백질은 분취용 고성능 액체 크로마토그래피로 정제되며 [Creighton T. (1983) Proteins, structures and molecular principles. WH Freeman and Co. N.Y.], 이의 조성은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법들로 아미노산 서열 분석을 통해 검증할 수 있다.
다른 구현예에서, 재조합 단백질 기법이 본 발명의 OXM 제조에 활용된다. 일부 구현예들에서, 재조합 단백질 기법은 본 발명의 OXM을 다량 제조하는데 활용된다. 다른 구현예에서, 재조합 기법들은 Bitter et al., (1987) Methods in Enzymol. 153:516-544, Studier et al. (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89, Brisson et al. (1984) Nature 310:511-514, Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6:307-311, Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680 및 Brogli et al., (1984) Science 224:838-843, Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565 and Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463에 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 OXM은 본 발명의 OXM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 합성된다. 일부 구현예들에서, 본 발명의 OXM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, cis-조절 서열 (예, 프로모터 서열)의 전사 통제를 포함하는 발현 벡터에 연결된다. 일부 구현예들에서, cis-조절 서열은 본 발명의 OXM의 구성적인 발현을 유도하는데 적합하다.
일 구현예에서, "폴리뉴클레오티드"라는 표현은 RNA 서열, 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열 (cDNA), 게놈 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 컴포지트 폴리뉴클레오티드 서열 (예, 상기한 것들의 조합) 형태로 분리 및 제공되는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 핵산 서열을 지칭한다.
일 구현예에서, "상보적인 폴리뉴클레오티드 서열"은 역전사효소 또는 임의의 다른 RNA 의존적인 DNA 중합효소를 이용하여 메신저 RNA의 역전사로부터 만들어지는 서열을 지칭한다. 일 구현예에서, 이 서열은 DNA 중합효소를 이용하여 이후에 생체내 또는 시험관내에서 증폭시킬 수 있다.
일 구현예에서, "게놈 폴리뉴클레오티드 서열"은 염색체로부터 유래된 (분리된) 서열을 지칭하며, 염색체의 연속적인 일부분이다.
일 구현예에서, "컴포지트 폴리뉴클레오티드 서열"은 적어도 부분적으로 상보적이며 적어도 부분적으로 게놈인 서열을 지칭한다. 일 구현예에서, 컴포지트 서열은 본 발명의 펩타이드를 코딩하는데 필수적인 일부 엑손 서열 뿐만 아니라 그 사이에 있는 일부 인트론 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 인트론 서열은 다른 유전자의 것을 비롯하여 임의의 소스의 것일 수 있으며, 전형적으로 보존된 스플라이싱 신호 서열을 포함할 것이다. 일 구현예에서, 인트론 서열은 cis로 작용하는 발현 조절 요소를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 PCR 기법이나 또는 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 임의의 다른 방법 또는 과정을 이용하여 제조된다. 일부 구현예에서, 상기 과정은 2종의 다른 DNA 서열들을 연결하는 단계를 포함한다 (예, "Current Protocols in Molecular Biology", eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992).
일 구현예에서, 다양한 원핵 생물 또는 진핵 생물 세포는 본 발명의 OXM을 발현시키기 위한 숙주-발현 시스템으로서 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 이러한 것으로는, 비제한적인 예로서, 미생물, 예컨대, 단백질 코딩 서열을 포함하는, 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아; 단백질 코딩 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 단백질 코딩 서열을 포함하는, 재조합 바이러스 발현 벡터 (예, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 토바코 모자이크 바이러스, TMV) 또는 Ti 플라스미드 등의 재조합 플라스미드 발현 벡터로 형질전환된 식물 세포 시스템이 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 OXM을 발현하기 위해 비-박테리아 발현 시스템 (예, CHO 세포 등의 포유류 발현 시스템)을 사용한다. 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포유류 세포에서 발현하기 위해 사용되는 발현 벡터는, CMV 프로모터와 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 pCI-DHFR 벡터이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 박테리아 시스템에서, 다수의 발현 벡터는 발현되는 폴리펩타이드에 대한 의도된 용도에 따라 유리하게 선택할 수 있다. 일 구현예에서, 다량의 OXM이 바람직하다. 일 구현예에서, 발현되는 산물을 박테리아의 원형질막 공간 (periplasm)으로 또는 단백질 산물이 쉽게 정제되는 배양 배지로 향하게 하는, 가능하게는 소수성 신호 서열과의 융합체로서, 단백질 산물을 높은 수준으로 발현되게 하는 벡터가 바람직하다. 일 구현예에서, 특정 융합 단백질은 단백질의 회수를 돕기 위해 특정 절단 부위를 구비하도록 조작된다. 일 구현예에서, 이러한 조작에 적용가능한 벡터로는, E. coli 발현 벡터의 pET 시리즈가 있으나, 이로 한정되지 않는다 [Studier et al., Methods in Enzymol. 185:60-89 (1990)].
일 구현예에서, 효모 발현 시스템이 사용된다. 일 구현예에서, 구성적인 프로모터 또는 유도성 프로모터를 포함하는 다수의 벡터는 미국 특허 출원 제 5,932,447호에 기술된 바와 같이 효모에서 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 효모 염색체로의 외래 DNA 서열의 병합을 촉진하는 벡터가 사용된다.
일 구현예에서, 본 발명의 발현 벡터는, 예컨대, 내부 리보좀 도입부 (IRES)와 같은 단일 mRNA 및 프로모터-키메라 단백질의 게놈 통합용 서열로부터 수개의 단백질의 번역을 허용하는, 부가적인 폴리뉴클레오티드 서열을, 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 포유류 발현 벡터로는, 비제한적인 예로서, Invitrogen 사로부터 구입가능한, pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pGL3, pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1, pNMT41, pNMT81; Promega의 pCI; Strategene 사의 pMbac, pPbac, pBK-RSV 및 pBK-CMV; Clontech 사의 pTRES, 및 이들의 유도체들을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명에서는, 레트로바이러스와 같이, 진핵 생물 바이러스 유래의 조절 인자를 포함하는 발현 벡터를 사용한다. SV40 벡터로는 pSVT7 및 pMT2가 있다. 다른 구현예에서, 소 파필로마 바이러스 유래 벡터로는 pBV-1MTHA가 있으며, 엡스타인 바 바이러스 유래의 바이러스로는 pHEBO 및 p2O5가 있다. 다른 예시적인 벡터로는, pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, 베큘로바이러스 pDSVE, 및 SV-40 초기 프로모터, SV-40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤라인 유방암 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터 또는 진핵 생물 세포에서의 발현에 유효한 것으로 입증된 그외 프로모터의 지시 하에, 단백질의 발현을 허용하는, 임의의 기타 벡터를 포함한다.
일 구현예에서, 식물 발현 벡터가 사용된다. 일 구현예에서, 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제 코딩 서열 (예, OXM)의 발현은 다수의 프로모터들에 의해 진행된다. 다른 구현예에서, CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터 등의 바이러스 프로모터 [Brisson et al., Nature 310:511-514 (1984)], 또는 TMV 코트 단백질 프로모터 [Takamatsu et al., EMBO J. 6:307-311 (1987)]가 사용된다. 다른 구현예에서, 예를 들어, RUBISCO의 소형 서브유닛 [Coruzzi et al., EMBO J. 3:1671-1680 (1984); 및 Brogli et al., Science 224:838-843 (1984)] 또는 열 충격 프로모터, 예컨대, 소이빈 hsp17.5-E 또는 hsp17.3-B [Gurley et al., Mol. Cell. Biol. 6:559-565 (1986)] 등의 식물 프로모터가 사용된다. 일 구현예에서, 구조체들은 Ti 플라스미드, Ri 플라스미드, 식물 바이러스 벡터, 직접 DNA 형질전환, 미세주입, 전기천공 및 그외 당업자에게 잘 공지된 기법을 이용하여 식물 세포로 도입된다. 예컨대, Weissbach & Weissbach [Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463 (1988)]를 참조한다. 그외 곤충 및 포유류 숙주 세포 시스템 등의 당해 기술 분야에 널리 공지된 발현 시스템들이 본 발명에서 사용될 수 있다.
삽입된 코딩 서열 (단백질 코딩 서열)의 전사 및 번역에 필수적인 요소를 포함하는 것 이외에도, 본 발명의 발현 구조체는 또한 발현되는 폴리펩타이드의 안정성, 생산, 정제, 수율 또는 활성을 최적화하기 위해 조작된 서열을 포함할 수 있음은 자명할 것이다.
일부 구현예들에서, 숙주 세포 시스템에 본 발명의 발현 벡터를 도입하기 위해 다양한 방법들이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 방법들은 일반적으로 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992), in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) 및 Gilboa et at. [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986]에 기술되어 있으며, 예컨대 안정적인 또는 일시적인 형질감염, 리포펙션, 전기천공 및 재조합 바이러스 벡터에 의한 감염을 포함한다. 또한, 파지티브-네거티브 선별 방법에 대해 미국 특허 5,464,764 및 5,487,992를 참조한다.
일 구현예에서, 형질전환된 세포는, 재조합 조작된 OXM을 다량 발현시킬 수 있는, 유효한 조건 하에 배양된다. 다른 구현예에서, 유효한 배양 조건은, 비제한적인 예로서, 단백질 생산을 허용하는 유효 배지, 생물반응기, 온도, pH 및 산소 조건을 포함한다. 일 구현예에서, 유효 배지는 본 발명의 재조합 OXM을 생산하기 위해 세포를 배양하는 모든 배지를 지칭한다. 다른 구현에에서, 배지는 전형적으로 동화가능한 탄소원, 질소원 및 인원, 및 적절한 염, 미네랄, 금속 및 비타민 등의 그외 영양분을 포함하는 수계 용액이다. 일 구현예에서, 본 발명의 세포는 기존의 발효 생물반응기, 교반 플라스크, 시험관, 마이크로타이터 디쉬 및 페트리 플레이트에서 배양될 수 있다. 다른 구현예에서, 배양은 재조합 세포에 적합한 온도, pH 및 산소 농도에서 수행된다. 다른 구현예에서, 배양 조건은 당해 기술 분야의 당업자의 전문 지식내에 포함된다.
일 구현예에서, 생산하기 위해 사용되는 벡터 및 숙주 시스템에 따라, 본 발명의 제조되는 OXM은 재조합 세포 내부에 체류하거나, 발효 배지로 분비되거나, E. coli와 같이 원형질막 공간 등의 2개의 세포막 사이 공간으로 분비되거나, 또는 세포막이나 바이러스 막의 외표면 상에 유지된다.
일 구현예에서, 미리 결정된 시간동안 배양한 후, 재조합 OXM의 회수를 실시한다.
일 구현예에서, "재조합 OXM의 회수"라는 표현은 본원에서 OXM을 함유한 전체 발현 배지를 수집하는 것을 지칭하며, 부가적인 분리 또는 정제 단계를 내포하지 않을 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 OXM은, 비제한적인 예로서, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 여과, 전기영동, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마노그래피, 역상 크로마토그래피, 콘카나발린 A 크로마토그래피, 크로마토포커싱 (chromatofocusing) 및 차별 가용화 (differential solubilization) 등의 다양한 표준적인 단백질 정제 기법을 이용하여 정제된다.
일 구현예에서, 용이한 회수를 위해, 발현된 코딩 서열은 본 발명의 단백질 및 융합된 절단성 모이어티를 코딩하도록 조작할 수 있다. 일 구현예에서, 융합 단백질은, 단백질을 친화성 크로마토그래피; 예컨대 절단가능한 모이어티에 대해 특이적인 컬럼 상에서의 고정화에 의해 쉽게 분리할 수 있도록, 설계할 수 있다. 일 구현예에서, 절단성 부위는 단백질과 절단가능한 모이어티 사이에서 조작되며, 상기 단백질은 그 부위에서 융합 단백질을 특이적으로 절단하는 적정 효소나 제제를 처리함으로써 크로마토그래피 컬럼으로부터 해리시킬 수 있다 [예, Booth et al., Immunol. Lett. 19:65-70 (1988); 및 Gardella et al., J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990)]. 다른 구현예에서, 본 발명의 OXM은 "실질적으로 순수한" 형태로 회수된다. 다른 구현예에서, "실질적으로 순수한"이라는 표현은 본원에 기술된 출원들에서 OXM의 유효한 사용이 가능한 순도를 지칭한다.
일 구현예에서, 본 발명의 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제는 또한 시험관내 발현 시스템을 이용하여 합성할 수 있다. 일 구현예에서, 시험관내 합성 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 시스템의 구성은 상업적으로 구입가능하다.
다른 구현예에서, 본원에 기술된 천연, 재조합 및/또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제 뿐만 아니라, 이를 포함하는 약학 조성물의, 비제한적인 예로서, 진성 당뇨병, 비만, 식이 장애, 대사성 장애 등의 질환 또는 병태를 치료 또는 완화하는 능력을 측정함으로써, 시험관내 결합 활성을 확정한다. 다른 구현예에서, 생체내 활성은 치료 중인 질환의 공지된 수단에 의해 규명한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 리버스 페길화된 OXM의 투여량은 0.005 내지 0.1 mg/kg OXM 펩타이드이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 리버스 페길화된 OXM의 투여량은 0.005 내지 0.5 mg/kg OXM 펩타이드이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 리버스 페길화된 OXM의 투여량은 0.05 내지 0.1 ㎍ OXM 펩타이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 리버스 페길화된 OXM의 투여량은 주사 용액 중의 0.005 내지 0.1 mg/kg OXM 펩타이드이다.
다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM의 투여량은 매일 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM의 투여량은 36시간 마다 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM의 투여량은 48시간 마다 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM의 투여량은 60시간 마다 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM의 투여량은 72시간 마다 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM의 투여량은 84시간 마다 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM의 투여량은 96시간 마다 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM의 투여량은 5일 마다 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM의 투여량은 6일 마다 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM의 투여량은 7일 마다 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM의 투여량은 8-10일 마다 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM의 투여량은 10-12일 마다 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM의 투여량은 12-15일 마다 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM의 투여량은 15-25일 마다 1회 투여된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 리버스 페길화된 OXM은 근육내 (IM) 주사, 피하 (SC) 주사, 또는 정맥내 (IV) 주사에 의해 매주 1회로 투여된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 리버스 페길화된 OXM은 개체에게 그 자체로 제공될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 리버스 페길화된 OXM은, 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합된 약학 조성물의 일부로서 개체에게 제공될 수 있다.
다른 구현예에서, "약학 조성물"은 생리학적으로 적합한 담체 및 부형제 등의 다른 화학 성분과 함께 본원에 기술된 장기 작용성 OXM으로 구성된 조제물을 지칭한다. 약학 조성물의 목적은 유기체로의 화합물의 투여를 쉽게 하기 위한 것이다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은 생리학적 효과를 부여한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 임의의 조성물은 적어도 리버스 페길화된 OXM을 포함할 것이다. 일 구현예에서, 본 발명은 조합된 조제물 (combined preparation)을 제공한다. 일 구현예에서, "조합된 조제물"은, 특히 전술한 조합 파트너들을 독립적으로 투여하거나 또는 상당량의 조합 파트너들과의 여러가지 고정된 조합물들을, 즉, 동시에, 공동으로, 따로따로 또는 순차적으로 사용함으로써 투여할 수 있다는 의미에서, "부품 키트 (kit of parts)"로 규정된다. 일부 구현예들에서, 그런 후, 부품 키트의 구성 요소들을, 예컨대, 동시에, 또는 연대적 시차적으로 (chronologically staggered), 즉, 다른 시간대에, 부품 키트를 구성하는 임의 구성 요소에 대해 동일한 또는 상이한 시간 간격으로 투여할 수 있다. 조합 파트너들의 총량 비율은, 일부 구현예들에서, 조합된 조제물로 투여할 수 있다. 일 구현예에서, 조합된 조제물은, 예컨대, 당해 기술 분야의 당업자에게 자명할 수 있는 바와 같이, 특정 질환, 질환의 중증도, 연령, 성별 또는 체중으로 인해 요구가 상이할 수 있는, 치료받을 환자 서브집단의 요구 또는 개별 환자의 요구에 맞추어, 변경가능할 수 있다.
다른 구현예에서, "생리적으로 허용가능한 담체" 및 "약제학적으로 허용가능한 담체"라는 표현은, 상호 호환적으로, 유기체에 유의한 자극을 야기하지 않으면서 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 방해하지 않는, 담체 또는 희석제를 지칭한다. 보강제도 이러한 표현에 해당된다. 일 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 담체에 포함되는 성분들 중 한가지는, 예컨대, 유기 매질과 수성 매질 둘다에 대해 광범위한 용해성을 가진 생체친화적인 폴리머인 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)일 수 있다 (Mutter et al. (1979).
다른 구현예에서, "부형제"는 장기 작용성 OXM의 투여를 더욱 쉽게 할 수 있도록 하기 위해 약학 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 지칭한다. 일 구현예에서, 부형제는 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트, 다양한 당류 및 전분 타입들, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
약물의 제형화 및 투여 기법들은 "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, latest edition에서 찾아볼 수 있으며, 이 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 펩타이드의 적정 투여 경로는, 예컨대, 경구, 직장, 경점막, 경비, 장 또는 비경구 전달, 예컨대 근육내, 피하 및 골수강내 (intramedullary) 주입 뿐만 아니라 강내 (intrathecal), 직접 뇌실내 (intraventricular), 정맥내, 복막내, 코내 또는 안내 주입을 포함한다.
또한, 본 발명은, 전술한 임의의 방법에서, 말초에서 뇌로의 경로에 의해 투여하기 위한 약제의 제조에 이용하기 위한 리버스 페길화된 OXM을 포함한다. 말초 경로의 예로는 경구, 직장, 비경구, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 또는 복막내, 점막, 예를 들어, 볼, 설하, 코, 피하, 또는 흡입에 의해 투여를 비롯한 경피 투여를 포함한다. 약제에서 바람직한 OXM 투여량은 아래에 기술된다.
본 발명은, 리버스 페길화된 OXM과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 경구, 직장, 비경구, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 또는 복막내, 점막, 예를 들어, 볼, 설하, 코, 피하 또는 흡입에 의한 투여를 비롯한 경피 투여에 적합한 형태의, 약학 조성물을 제공한다. 단위 투여 형태 (unit dosage form)인 경우라면, 단위 당 투여량 (dose per unit)은 하기 기술된 바와 같거나, 아래 제시된 kg 용량을 기준으로 계산될 수 있다.
다른 구현예에서, 조제물은 전신 방식 보다는 국소적인 방식으로, 예를 들어, 조제물의 환자 신체의 특정 부위로의 직접 주사에 의해 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은 코내 투여 형태로 제형화된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은 주사 투여 형태로 제형화된다.
투여량에 대한 다양한 예들이 본 발명에서 고려된다: 리버스 페길화된 OXM 조성물의 OXM 펩타이드 성분은 0.01-0.5 mg/kg 체중/3일의 범위로 투여된다 (PEG 크기가 실질적으로 다를 수 있어, 가역적으로 페길화된 OXM 조성물에서의 OXM의 함량만 표시함). 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM 조성물의 OXM 펩타이드 성분은 0.01-0.5 mg/kg 체중/7일의 범위로 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM 조성물의 OXM 펩타이드 성분은 0.01-0.5 mg/kg 체중/10일의 범위로 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM 조성물의 OXM 펩타이드 성분은 0.01-0.5 mg/kg 체중/14일의 범위로 투여된다. 다른 구현예에서, 예상치 못하게도, 리버스 페길화된 OXM 조성물내 OXM의 유효량은 유리 OXM의 유효량의 1/4 - 1/10이다. 다른 구현예에서, 예상치 못하게도, OXM의 리버스 페길화는 유리 OXM과 비교하여 환자에게 처방되는 OXM의 양을 50% 이상까지 제한할 수 있다. 다른 구현예에서, 예상치 못하게도, OXM의 리버스 페길화는 유리 OXM과 비교하여 환자에게 처방되는 OXM의 양을 70% 이상까지 제한할 수 있다. 다른 구현예에서, 예상치 못하게도, OXM의 리버스 페길화는 유리 OXM과 비교하여 환자에게 처방되는 OXM의 양을 75% 이상까지 제한할 수 있다. 다른 구현예에서, 예상치 못하게도, OXM의 리버스 페길화는 유리 OXM과 비교하여 환자에게 처방되는 OXM의 양을 80% 이상까지 제한할 수 있다. 다른 구현예에서, 예상치 못하게도, OXM의 리버스 페길화는 유리 OXM과 비교하여 환자에게 처방되는 OXM의 양을 85% 이상까지 제한할 수 있다. 다른 구현예에서, 예상치 못하게도, OXM의 리버스 페길화는 유리 OXM과 비교하여 환자에게 처방되는 OXM의 양을 90% 이상까지 제한할 수 있다.
다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM 조성물의 OXM 펩타이드 성분은 3일 마다 1회로 0.01-0.5 mg/(체중)kg의 범위로 투여된다 (PEG 크기가 실질적으로 다를 수 있어, 리버스 페길화된 OXM 조성물에서의 OXM의 함량만 표시함). 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM 조성물의 OXM 펩타이드 성분은 7일 마다 1회로 0.01-0.5 mg/(체중)kg의 범위로 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM 조성물의 OXM 펩타이드 성분은 10일 마다 1회로 0.01-0.5 mg/(체중)kg의 범위로 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM 조성물의 OXM 펩타이드 성분은 14일 마다 1회로 0.01-0.5 mg/(체중)kg의 범위로 투여된다.
다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은, 유리 OXM에 비해, 효과적인 투약 횟수 (effective dosing frequency)를 2배 이상 단축시키고 매주 유효 투여량 (effective weekly dose)을 2배 이상 감소시켜, OXM 치료법의 사용에 따른 부작용 위험성을 제한하고 순응성을 증가시킨다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은, 유리 OXM에 비해, 유리 OXM에 비해, 효과적인 투약 횟수를 3배 이상 단축시키고 매주 유효 투여량을 3배 이상 감소시켜, OXM 치료법의 사용에 따른 부작용 위험성을 제한하고 순응성을 증가시킨다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은, 유리 OXM에 비해, 효과적인 투약 횟수를 4배 이상 단축시키고 매주 유효 투여량을 4배 이상 감소시켜, OXM 치료법의 사용에 따른 부작용 위험성을 제한하고 순응성을 증가시킨다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은, 유리 OXM에 비해, 효과적인 투약 횟수를 5배 이상 단축시키고 매주 유효 투여량을 5배 이상 감소시켜, OXM 치료법의 사용에 따른 부작용 위험성을 제한하고 순응성을 증가시킨다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은, 유리 OXM에 비해, 효과적인 투약 횟수를 6배 이상 단축시키고 매주 유효 투여량을 6배 이상 감소시켜, OXM 치료법의 사용에 따른 부작용 위험성을 제한하고 순응성을 증가시킨다. 다른 구현예에서, 효과적인 투약 횟수와 매주 유효 투여량은, (1) 리버스 페길화된 OXM 조성물에 함유된 투여되는 OXM 성분의 양; 및 (2) 유리 OXM (비-변형된 OXM) 조성물에 함유된 투여되는 OXM 성분의 양을, 기초로 한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 OXM 치료법이 필요한 만성 질환을 앓고 있는 환자들의 순응성 증가를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 전술한 바와 같이 OXM을 리버스 페길화함으로써 OXM의 투여 횟수를 낮출 수 있다. 다른 구현예에서, 용어 순응성은 충실성을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 OXM 투여 횟수를 줄임으로써 OXM 치료가 필요한 환자의 순응성을 높인다. 다른 구현예에서, OXM의 투여 횟수 감소는 OXM을 보다 안정적이고 보다 강력하게 만드는 리버스 페길화에 의해 달성된다. 다른 구현예에서, OXM의 투여 횟수 감소는 OXM의 T1/2의 연장의 결과로서 달성된다. 다른 구현예에서, OXM의 투여 횟수 감소는 OXM의 혈액 소거성 감소의 결과로서 달성된다. 다른 구현예에서, OXM의 투여 횟수 감소는 OXM의 T1/2의 연장의 결과로서 달성된다. 다른 구현예에서, OXM의 투여 횟수 감소는 OXM의 AUC 값 증가의 결과로서 달성된다.
다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은 개체에게 하루에 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은 개체에게 2일 마다 1번 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은 개체에게 3일 마다 1번 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은 개체에게 4일 마다 1번 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은 개체에게 5일 마다 1번 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은 개체에게 6일 마다 1번 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은 개체에게 1주일 마다 1번 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은 개체에게 7-14일 마다 1번 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은 개체에게 10-20일 마다 1번 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은 개체에게 5-15일 마다 1번 투여된다. 다른 구현예에서, 리버스 페길화된 OXM은 개체에게 15-30일 마다 1번 투여된다.
다른 구현예에서, 페길화된 OXM은 개체에게 하루에 1번 투여된다. 다른 구현예에서, 페길화된 OXM은 개체에게 2일 마다 1번 투여된다. 다른 구현예에서, 페길화된 OXM은 개체에게 3일 마다 1번 투여된다. 다른 구현예에서, 페길화된 OXM은 개체에게 4일 마다 1번 투여된다. 다른 구현예에서, 페길화된 OXM은 개체에게 5일 마다 1번 투여된다. 다른 구현예에서, 페길화된 OXM은 개체에게 6일 마다 1번 투여된다. 다른 구현예에서, 페길화된 OXM은 개체에게 1주일 마다 1번 투여된다. 다른 구현예에서, 페길화된 OXM은 개체에게 7-14일 마다 1번 투여된다. 다른 구현예에서, 페길화된 OXM은 개체에게 10-20일 마다 1번 투여된다. 다른 구현예에서, 페길화된 OXM은 개체에게 5-15일 마다 1번 투여된다. 다른 구현예에서, 페길화된 OXM은 개체에게 15-30일 마다 1번 투여된다.
일 구현예에서, 본원에 제시된, 페길화된 OXM 변형체들은, 예상치 못하게도, PEG-OXM 변형체를 1회 투여한 이후에 공복 인슐린 수준 뿐만 아니라 글루코스 수준도 감소시킨다. 다른 구현예에서, 본원에 제시된, 페길화된 OXM 변형체들은, 개체의 인슐린 민감성 증가를 유도한다 (실시예 6).
경구 투여는, 일 구현예에서, 정제, 캡슐제, 로젠제 (lozenges), 씹어먹는 정제, 현탁제, 유제 등을 포함하는 단위 투약 형태 (unit dosage form)를 포함한다. 이러한 단위 투약 형태는 본 발명의 OXM을 안전하고 유효한 양으로 포함하며, 상기 양은, 일 구현예에서, 약 0.7 또는 3.5 mg - 약 280 mg/70 kg이고, 또는 다른 구현예에서, 약 0.5 또는 10 mg - 약 210 mg/70 kg이다. 경구 투여를 위한 단위 투약 형태의 제조에 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 일부 구현예들에서, 정제는 통상적으로 칼슘 카보네이트, 소듐 카보네이트, 만니톨, 락토스 및 셀룰로스 등의 불활성 희석제; 전분, 젤라틴 및 슈크로스 등의 결합제; 전분, 알긴산 및 크로스카멜로스 등의 붕해제; 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 및 탈크 등의 윤활제와 같이 기존의 약제학적으로 혼용가능한 보강제를 포함한다. 일 구현예에서, 분말-혼합물의 유동 특징을 개선시키기 위해 실리콘 다이옥사이드 등의 유동성 개선제 (glidant)가 사용된다. 일 구현예에서, 착색제, 예컨대 FD&C 염료를 외양상 첨가할 수 있다. 아스파르탐, 사카린, 멘톨, 페퍼민트 및 과일향과 같은 감미제 및 향제는 씹어먹는 정제에 사용가능한 보강제이다. 캡슐제는 전형적으로 전술한 하나 이상의 고형 희석제를 포함한다. 일부 구현예들에서, 담체 성분의 선택은, 본 발명의 목적에 있어 중요한 것은 아니지만, 맛, 비용 및 저장 안정성과 같은 부차적인 고려 사항에 따라 결정되며, 당해 기술 분야의 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 경구 투약 형태는 미리 정해진 방출 프로파일을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 경구 투약 형태는 지속 방출 정제 (extended release tablet), 캡슐제, 로젠제 또는 씹어 먹는 정제를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 경구 투약 형태는 서방형 정제, 캡슐제, 로젠제 또는 씹어 먹는 정제를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 경구 투약 형태는 즉시 방출 정제, 캡슐제, 로젠제 또는 씹어 먹는 정제를 포함한다. 일 구현예에서, 경구 투약 형태는 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 장기 작용성 OXM의 바람직한 방출 프로파일에 따라 제형화된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 조성물은 용액제 또는 유제이며, 다른 구현예에서는 본 발명의 화합물을 안전하고 유효한 양으로, 그리고 선택적으로 국소 코내 투여용으로 의도된 그외 화합물을 포함하는 수계 용액제 또는 유제이다. 일부 구현예들에서, 조성물은 대상 화합물을 약 0.001% 내지 약 10.0% w/v로, 더 바람직하게는, 약 0.01% 내지 약 2.0로 포함하며, 이는 코내 경로에 의한 화합물의 전신 전달을 위해 사용된다.
다른 구현예에서, 약학 조성물은 액체 조제물의 정맥내, 동맥내, 피하 또는 근육내 주입에 의해 투여된다. 다른 구현예에서, 액체 제형은 용액제, 현탁제, 분산제, 유제, 오일 등을 포함한다. 일 구현예에서, 약학 조성물은 정맥내로 투여되며, 따라서 정맥내 투여에 적합한 형태로 제형화된다. 다른 구현예에서, 약학 조성물은 동맥내로 투여되며, 따라서 동맥내 투여에 적합한 형태로 제형화된다. 다른 구현예에서, 약학 조성물은 근육내로 투여하며, 따라서 근육내 투여에 적합한 형태로 제형화된다.
추가적으로, 다른 구현예에서, 약학 조성물은 신체 표면에 국소적으로 투여되며, 따라서 국소 투여에 적합한 형태로 제형화된다. 적합한 국소 제형으로는 젤제, 연고제, 크림제, 로션제, 점적제 등이 있다. 국소 투여를 위해서, 본 발명의 화합물은, 추가적인 적정 치료 제제 또는 제제들과 조합되며, 약제학적 담체가 첨가 또는 무첨가된, 생리적으로 허용가능한 희석제 중의 용액제, 현탁제 또는 에멀젼으로서 제조 및 적용된다.
일 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 당해 기술 분야에 공지된 공정, 예컨대 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제조, 레비게이션 (levigating), 에멀젼화, 캡슐화, 포집화 (entrapping) 또는 동결건조 공정을 이용함으로써, 제조된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 조성물은, OXM을 약제학적으로 사용가능한 조제물로 가공하는 것에 도움이 되는, 부형제 및 보조제를 포함하는, 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체를 이용하여, 통상적인 방식으로 제형화된다. 일 구현예에서, 제형은 선택한 투여 경로에 따라 결정된다.
일 구현예에서, 본 발명의 주사제 (injectables)는 수계 용액제로 제형화된다. 일 구현예에서, 본 발명의 주사제는 행크 용액, 링거 용액 또는 생리 염 완충액 등의 생리적으로 사용가능한 완충액 중에서 제형화된다. 일부 구현예들에서, 경점막 투여를 위해, 침투할 장벽에 적합한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 조제물은 비경구 투여용으로, 예컨대 볼루스 주입 또는 연속 주입에 의한 용도로 제형화된다. 다른 구현예에서, 주입용 제형은, 단위 투약 형태, 예컨대 앰플, 또는 다회 투여 (multidose) 용기 형태로, 선택적으로 첨가된 보존제와 함께, 제공된다. 다른 구현예에서, 조성물은 오일성 또는 수계 비히클 중의 현탁제, 용액 또는 에멀젼이며, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산화제와 같은 제형성 제제 (formulatory agent)를 포함한다.
또한, 조성물은, 벤즈알코늄 클로라이드 및 티메로살 등과 같은 보존제; 에디테이트 소듐 등의 킬레이트제; 포스페이트, 시트레이트 및 아세테이트 등의 완충액; 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 글리세린, 만니톨 등의 긴장성 제제 (tonicity agent); 아스코르브산, 아세틸시스틴, 소듐 메타바이설포에이트 등의 항산화제; 방향성 제제; 셀룰로스 및 이의 유도체 등의 폴리머와 같은 점성 조절제; 및 폴리비닐 알코올 및 필요에 따라 이들 수계 조성물의 pH를 조절하기 위한 산과 염기를 포함한다. 또한, 조성물은, 일부 구현예들에서, 국소 마취제 또는 그외 활성제를 포함한다. 조성물은 스프레이, 미스트, 점적제 등으로 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 비경구 투여용 약학 조성물은 수용성 형태로 활성 조제물 수계 용액제를 포함한다. 부가적으로, 장기 작용성 OXM의 현탁제, 일부 구현예에서, 적절한 오일 또는 수 (water) 기반의 주입용 현탁제로서 제조된다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클로서, 일부 구현예들에서, 참기름과 같은 지방 오일, 또는 에틸 올레이트, 트리글리세라이드 또는 리포좀 등의 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 수계 주입용 현탁제는, 일부 구현예들에서, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란 등의, 현탁제의 점성을 증가시키는 물질을 함유한다. 다른 구현예에서, 현탁제는 또한 고도로 농축된 용액을 제조할 수 있도록 장기 작용성 OXM의 용해성을 높이는 적정 안정화제 또는 물질을 포함한다.
다른 구현예에서, 활성 화합물은 비히클, 특히 리포좀 안에 넣어 전달할 수 있다 (Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez- Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, i1일 2회., pp. 317-327; 일반적으로 상기 문헌들을 참조함).
다른 구현예에서, 조절형 방출 시스템 (controlled release system)으로 전달되는 약학 조성물은 정맥내 주입, 이식이능한 삼투성 펌프, 경피 패치, 리포좀 또는 그외 투여 방식용으로 제형된한다. 일 구현예에서, 펌프가 사용된다 (Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989) 참조). 다른 구현예에서, 폴리머성 물질이 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 조절형 방출 시스템은 치료 타겟, 즉 뇌 근처에 위치시킬 수 있으며, 그에 따라 전신 투여량 중 일부만 필요할 수 있다 (예, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984) 참조). 다른 조절형 방출 시스템은 Langer (Science 249:1527-1533 (1990)에 의한 리뷰에 논의되어 있다.
일 구현예에서, 장기 작용성 OXM은 사용하기 전에 적정 비히클, 예컨대, 멸균된, 발열원-제거된 수계 용액을 이용하여 만들기 위한 분말 형태이다. 조성물은, 일부 구현예들에서, 미립자화 (atomization) 및 흡입 투여용으로 제형화된다. 다른 구현예에서, 조성물은 미립자화 수단이 장착된 용기에 수용된다.
일 구현예에서, 본 발명의 조제물은, 예컨대, 코코아 버터 또는 기타 글리세라이드와 같은 통상적인 좌제 베이스를 이용하여, 좌제나 정체 관장제 (retention enemas) 등의 직장 조성물로 제형화된다.
일 구현예에서, 본 발명의 측면으로 사용하기 적합한 약학 조성물은, 장기 작용성 OXM이 의도한 목적을 달성하는데 유효한 양으로 포함된 조성물을 포함한다. 다른 구현예에서, 치료학적 유효량은 치료 중인 개체의 질환 증상을 예방, 경감 또는 개선시키거나 또는 생존을 연장시키는데 유효한 장기 작용성 OXM의 양을 의미한다.
일 구현예에서, 치료학적 유효량의 결정은 당해 기술 분야의 당업자의 능력내에서 충분히 이루어진다.
또한, 조성물은, 벤즈알코늄 클로라이드 및 티메로살 등과 같은 보존제; 에디테이트 소듐 등의 킬레이트제; 포스페이트, 시트레이트 및 아세테이트 등의 완충액; 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 글리세린, 만니톨 등의 긴장성 제제; 아스코르브산, 아세틸시스틴, 소듐 메타바이설포에이트 등의 항산화제; 방향성 제제; 셀룰로스 및 이의 유도체 등의 폴리머와 같은 점성 조절제; 및 폴리비닐 알코올 및 필요에 따라 이들 수계 조성물의 pH를 조절하기 위한 산과 염기를 포함한다. 또한, 조성물은 국소 마취제 또는 그외 활성제를 포함한다. 조성물은 스프레이, 미스트, 점적제 등으로 사용될 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 이의 구성 성분으로서 이용될 수 있는 물질의 일부 예로는, 락토스, 글루코스 및 슈크로스 등의 당류; 옥수수 전분 및 감자 전분 등의 전분류; 소듐 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 메틸 셀룰로스 등의 셀룰로스 및 이의 유도체; 트라가칸트 분말; 말트; 젤라틴; 탈크; 스테아르산 및 마그네슘 스테아레이트 등의 고형 윤활제; 칼슘 설페이트; 땅콩 오일, 면실유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 테오브로마 오일 등의 식물성 오일; 프로필렌 글리콜, 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜 등의 폴리올; 알긴산; Tween™ 상표의 유화제 등의 유화제; 소듐 라우릴 설페이트 등의 습윤제 (wetting agent); 착색제; 향제; 타정제 (tableting agent), 안정화제; 항산화제; 보존제; 발열원-결핍 수; 등장성 염수; 및 포스페이트 완충 용액이다. 화합물과 함께 사용하기 위한 약제학적으로 허용가능한 담체의 선택은, 기본적으로는, 화합물의 투여 방식에 따라 결정된다. 만일 대상 화합물을 주사하고자 한다면, 일 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 담체는, 혈액-친화적인 현탁화제가 첨가된 살균된, 생리 염수이며, 이의 pH는 약 7.4로 조정된 것이다.
아울러, 조성물은, 추가적으로, 결합제 (예, 아카시아, 옥수수 전분, 젤라틴, 카보머, 에틸 셀룰로스, 구아르 검, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스, 포비돈), 붕해제 (예, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산, 실리콘 다이옥사이드, 크로스카르멜로스 소듐, 크로스포비돈, 구아르 검, 소듐 전분 글리콜레이트), pH와 이온 세기가 다양한 완충제 (예, 트리스-HCl, 아세테이트, 포스페이트), 표면 흡수를 방지하기 위한 알부민 또는 젤라틴 등의 첨가제, 디터전트 (예, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, 담즙산염), 프로테아제 저해제, 계면활성제 (예, 소듐 라우릴 설페이트), 침투 강화제 (permeation enhancer), 가용화제 (예, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜), 항산화제 (예, 아스코르브산, 소듐 메타바이설파이트, 부틸화된 하이드록시아니졸), 안정화제 (예, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스), 점성 증가제 (예, 카보머, 콜로이드형 실리콘 다이옥사이드, 에틸 셀룰로스, 구아르 검), 감미제 (예, 아스파르탐, 시트르산), 보존제 (예, 티메로살, 벤질 알코올, 파라벤), 윤활제 (예, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 설페이트), 유동-보조제 (flow-aid) (예, 콜로이드형 실리콘 다이옥사이드), 가소제 (예, 다이에틸 프탈레이트, 트리에틸 시트레이트), 유화제 (예, 카보머, 하이드록시프로필 셀룰로스, 소듐 라우릴 설페이트), 폴리머 코팅제 (예, 폴록사머 또는 폴록사민), 코팅 및 막 형성제 (예, 에틸 셀룰로스, 아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트) 및/또는 보강제를 포함한다.
시럽제, 엘릭서제, 유제 및 현탁제에 대한 전형적인 담체 성분들로는 에탄올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 액상 슈크로스, 소르비톨 및 물을 포함한다. 현탁제의 경우, 전형적인 현탁화제로서 메틸 셀룰로스, 소듐 카복시메틸 셀룰로스, 셀룰로스 (예, Avicel™, RC-591), 트라가칸트 및 소듐 알기레이트를 포함하며; 전형적인 습윤제로서 레시틴 및 폴리에틸렌 옥사이드 소르비탄 (예, 폴리소르베이트 80)을 포함한다. 전형적인 보존제로는 메틸 파라벤 및 소듐 벤조에이트를 포함한다. 다른 구현예에서, 경구 액체 조성물은 또한 전술한 감미제, 향제 및 착색제 등의 하나 이상의 성분들을 포함한다.
조성물은 또한 폴리락트산, 폴리글로콜산, 하이드로겔 등의 폴리머성 화합물의 미립자 조제물로의 또는 상으로의, 또는 리포좀, 마이크로에멀젼, 미셀, 단층 (unilamellar) 또는 다층 (multilamellar) 소낭 (vesicle), 에리트로사이트 고스트 또는 스페로플라스트 상으로의, 활성 물질의 합체를 포함한다. 이러한 조성물은 물리적 상태, 용해성, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 소거율에 영향을 미칠 것이다.
또한, 본 발명은 폴리머 (예, 폴록사머 또는 폴록사민)로 코팅된 미립자 조성물 및 조직-특이적인 수용체, 리간드 또는 항원에 대한 항체와 커플링되거나 조직-특이적인 수용체의 리간드와 커플링된 화합물을 포괄한다.
일 구현예에서, 화합물은, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜-폴리프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸 셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리프롤린 등의 수용성 폴리머의 공유 결합에 의해 변형된다. 다른 구현예에서, 변형된 화합물은 대응되는 비-변형된 화합물 보다는 정맥내 주입 후 실질적으로 연장된 혈중 반감기를 나타낸다. 일 구현예에서, 변형은 또한 화합물의 수용액에서의 용해성을 증가시키고, 응집을 해소시키고, 화합물의 물리적 안정성과 화학적 안정성을 강화하고, 화합물의 면역원성과 반응성을 크게 감소시킨다. 다른 구현예에서, 바람직한 생체내 생물학적 활성은, 비-변형된 화합물 대비, 이러한 폴리머-화합물 앱덕트 (abduct)의 낮은 빈도 또는 낮은 투여량으로의 투여에 의해, 달성된다.
다른 구현예에서, 유효량 또는 투여량의 준비는 시험관내 분석으로 먼저 추정할 수 있다. 일 구현예에서, 투여량은 동물 모델에서 공식화할 수 있으며, 이러한 정보는 인간에 사용가능한 투여량을 보다 정확하게 결정하는데 사용할 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 장기 작용성 작용제 (예, OXM)의 독성과 치료 효능은 시험관내, 세포 배양 또는 실험 동물에서의 표준적인 약학 공정으로 측정할 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 시험관내 및 세포 배양 분석과 동물 실험으로부터 수득한 데이타는 인간에게 사용하기 위한 투여량 범위를 공식화하는데 이용할 수 있다. 일 구현예에서, 투여량은 채택한 투약 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 달라진다. 일 구현예에서, 실제 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태에 비추어 개개 의사가 선택할 수 있다 [예, Fingl, et al., (1975) "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1].
일 구현예에서, 치료할 증상의 중증도와 반응성에 따라, 투약은 1회 투여 또는 다회 투여일 수 있으며, 처치 기간은 수 일 내지 수 개월이거나, 또는 치유되거나 질환 상태의 경감이 달성될 때까지이다.
일 구현예에서, 투여되는 조성물의 양 역시 치료 중인 개체, 고통의 중증도, 투여 방식, 처방의의 판단에 따라 결정될 것이다.
일 구현예에서, 혼용가능한 약제학적 담체 중에 제형화된 본 발명의 조제물을 비롯한 조성물은, 또한, 제조하여, 적정 용기에 넣고, 치료 처방 증상이 표시된다.
다른 구현예에서, 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제는 전신 투여를 통해 투여된다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제는 정맥내, 근육내 또는 피하 주사로 투여된다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제는 비이온성 계면 활성 제제 (즉, 계면활성제), 다양한 당류, 유기 폴리올 및/또는 인간 혈청 알부민과 같은 컴플렉스 유기 부형제 및 안정화제와 조합된 동결건조된 (즉, 냉동-건조된) 조제물이다. 다른 구현예에서, 약학 조성물은 멸균 주사용수 중에 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 동결건조물을 포함한다. 다른 구현예에서, 약학 조성물은 주사용 멸균 PBS 중에 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 동결건조물을 포함한다. 다른 구현예에서, 약학 조성물은 주사용 멸균 0.9% NaCl 중에 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 동결건조물을 포함한다.
다른 구현예에서, 약학 조성물은, 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제와, 인간 혈청 알부민, 폴리올, 당류 및 음이온성 계면 활성 안정화제 등의 컴플렉스 담체를 포함한다. 예로, WO 89/10756 (Hara et al.- 폴리올 및 p-하이드록시벤조에이트 함유)을 참조한다. 다른 구현예에서, 약학 조성물은 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제, 락토바이온산 (lactobionic acid) 및 아세테이트/글리신 완충제를 포함한다. 다른 구현예에서, 약학 조성물은 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제와 인터페론 조성물의 수용성을 높이는 아미노산, 예컨대 아르기닌 또는 글루타메이트를 포함한다. 다른 구현예에서, 약학 조성물은, 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 동결건조물과, 글리신 또는 인간 혈청 알부민 (HSA), 완충제 (예, 아세테이트) 및 등장성 제제 (예, NaCl)를 포함한다. 다른 구현예에서, 약학 조성물은 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 동결건조물과, 포스페이트 완충액, 글리신 및 HSA를 포함한다.
다른 구현예에서, 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 포함하는 약학 조성물은 pH 약 4 - 7.2의 완충화된 용액 중에 두었을 때 안정화된다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 포함하는 약학 조성물은 안정화제로서 아미노산과, 일부 경우에는, 염 (아미노산에 하전된 측쇄가 없는 경우)을 이용하여 안정화시킨다.
다른 구현예에서, 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 포함하는 약학 조성물은 아미노산인 안정화제를 약 0.3% 내지 5%로 포함하는 액체 조성물이다.
다른 구현예에서, 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 포함하는 약학 조성물은 투약 정확성 (dosing accuracy) 및 제품 안전성을 제공한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 포함하는 약학 조성물은 주사 적용에 사용하기 위한 생물학적으로 활성형이고, 안정적인 액체 조성물을 제공한다. 다른 구현예에서, 약학 조성물은 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제의 비-동결건조물을 포함한다.
다른 구현예에서, 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 포함하는 약학 조성물은 투여하기 전에 저장 및 수송에 용이한 액체 상태로 장기간 동안 저장할 수 있는 액체 제형을 제공한다.
다른 구현예에서, 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 포함하는 약학 조성물은 매트릭스 물질로서 고상 지질 (solid lipid)을 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 포함하는 주사용 약학 조성물은 매트릭스 물질로서 고상 지질을 포함한다. 다른 구현예에서, 분무 응결 (spray congealing)에 의한 액체 미세입자의 제조에 대해서는 Speiser (Speiser and al., Pharm. Res. 8 (1991) 47-54)에 의해 기술되었으며, 경구 투여용 액체 나노펠렛이 개시되어 있다 (Speiser EP 0167825 (1990)). 다른 구현예에서, 사용되는 지질은 신체에 잘 허용된다 (예, 비경구 영양용 유제에 존재하는 지방산으로 구성된 글리세라이드).
다른 구현예에서, 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 포함하는 약학 조성물은 리포좀 형태이다 (J. E. Diederichs and al., Pharm./nd. 56 (1994) 267- 275).
다른 구현예에서, 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 포함하는 약학 조성물은 폴리머성 미세입자를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 포함하는 주사용 약학 조성물은 폴리머성 미세입자를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 포함하는 약학 조성물은 나노입자를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 포함하는 약학 조성물은 리포좀을 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 포함하는 약학 조성물은 지질 유제를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 포함하는 약학 조성물은 마이크로스피어를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 포함하는 약학 조성물은 지질 나노입자를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 포함하는 약학 조성물은 양쪽성 지질 (amphiphilic lipid)을 포함하는 지질 나노입자를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 포함하는 약학 조성물은 약물, 지질 매트릭스 및 계면활성제를 포함하는 지질 나노입자를 포함한다. 다른 구현예에서, 지질 매트릭스는 50% w/w 이상으로 모노글리세라이드를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 팩 또는 분배 장치, 예컨대 FDA 승인된 키트로서 제공되며, 여기에는 장기 작용성 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제를 포함하는 하나 이상의 단위 투약 형태가 포함된다. 일 구현예에서, 팩은 예컨대 블리스터 팩 등의 금속 또는 플라스틱 호일로 구성된다. 일 구현예에서, 팩 또는 분배 장치는 투여 설명서를 수반한다. 일 구현예에서, 팩 또는 분배기는 약제의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관으로부터 지정된 형태로 용기에 첨부된 고지를 수반하며, 고지는 조성물의 형태 또는 인간이나 수의학적 투여 기관에 의한 인가를 나타낸다. 이러한 고지는, 일 구현예에서, 처방약에 대한 미국 식의약청에 의해 승인받은 라벨링이거나 또는 승인된 제품 인써트 (product insert)에 대한 고지이다.
일 구현예에서, 본 발명의 페길화된 또는 리버스 페길화된 듀얼 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제는 각 제제 자체에 의한 치료와 비교하여 개선된 치료학적 효과를 달성하기 위해, 추가적인 활성 제제와 함께 개체에게 제공될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 다른 구현예에서, 병용 요법 (combination therapy)과 관련있는 유해한 부작용에 대해 조처 (예, 보완제 (complementary agent)의 투약 및 선택)가 취해진다.
본 발명의 추가적인 목적, 이점 및 새로운 특징들은, 한정하고자 하는 의도된 것이 아닌 후술된 실시예의 수행을 통해 당해 기술 분야의 당업자에게 명확해질 것이다. 아울러, 상기에서 논의되고 하기 청구항 부분에서 청구된 본 발명의 각각의 다양한 구현예들과 측면들은 후술된 실시예로부터 실험적으로 뒷받침된다.
실시예들
일반적으로, 본원에서 사용된 명칭과 본원에서 이용된 실험 공정들은 분자, 생화학, 미생물 및 재조합 DNA 기법들을 포함한다. 이러한 기법들은 문헌들에 잘 기술되어 있다. 예를 들어, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 미국 특허 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 and 5,272,057에 기술된 방법들; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)을 참조하며; 이용가능한 면역분석법들은 특허 및 과학 문헌, 예컨대, 미국 특허 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 및 5,281,521에 광범위하게 기술되어 있으며; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)를 참조하며, 이들 모두 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 그외 일반적인 참조문헌들도 이러한 문서에 전반적으로 제시되어 있다.
재료 및 방법
PEG 40 -Fmoc-OXM 및 PEG 40 -FMS-OXM 합성
OXM 합성: HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA (서열번호 1) 서열의 옥신토모듈린을 펩타이드 체인 조립 전체에 Fmoc-전략을 채택한 고상 방법으로 합성하였다 (Almac Sciences, Scotland). 펩타이드 서열은 하기 단계로 조립하였다: (1) 캡핑: 수지를 DMF (Rathburn) 중의 0.5M 무수 아세트산 (Fluka) 용액을 이용하여 캡핑하였다; (2) 탈보호: DMF (Rathburn) 중의 20% v/v 피페리딘 (Rathburn) 용액을 이용하여 자라나는 펩타이드에서 Fmoc-보호기를 제거하였다; (3) 아미노산 커플링: DMF (Rathburn) 중의 0.5 M 아미노산 (Novabiochem) 용액을 DMF (Rathburn) 중의 1M HOBt (Carbosynth) 용액과 DMF (Rathburn) 중의 DIC (Carbosynth) 용액을 이용하여 활성화하였다. 각 커플링에 각 아미노산 4당량을 사용하였다.
펩타이드 조산물을 수지로부터 잘라낸 다음 트리이소프로필실란 (Fluka), 물, 디메틸설파이드 (Aldrich), 암모늄 아이오다이드 (Aldrich) 및 TFA (Applied Biosystems) 칵테일에서 4시간 교반하여, 보호기를 제거하였다. 그런 후, 펩타이드 조산물을 차가운 다이에틸 에테르로부터 석출에 의해 수집하였다.
펩타이드 정제: 펩타이드 조산물을 아세토니트릴 (Rathburn)/물 (MilliQ) (5:95)에 용해하여, 분취용 HPLC 컬럼에 로딩하였다. 크로마토그래피의 파라미터는 다음과 같다: 컬럼: Phenomenex Luna C18 250mm x 30mm, 15㎛, 300A; 이동상 A: 물 + 0.1% v/v TFA (Applied Biosystems); 이동상 B: 아세토니트릴 (Rathburn) + 0.1% v/v TFA (Applied Biosystems); UV 검출: 214 또는 220 nm; 농도 구배: 4컬럼 부피 동안 25%B -> 31%B; 유속 43mL/min.
단계 2 - 링커 합성 - MAL-FMS-NHS 링커 합성:
Figure pct00002
화합물 2-5의 합성은 Albericio et al. in Synthetic Communication, 2001, 31(2), 225-232에 기술된 공정을 기초로 하며, 이 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
2-(Boc-아미노)플루오렌 (2): 2-아미노플루오렌 (18g, 99mmol)을 얼음조에서 자기 교반하면서 디옥산:물 (2:1) (200ml) 혼합물과 2N NaOH (60ml)에 현탁하였다. Boc2O (109mmol, 1.1 eq)을 첨가하여, RT에서 계속 교반하였다. 반응을 TLC (Rf= 0.5, 헥산/ 에틸 아세테이트 2:1)로 모니터링하고, 2N NaOH를 첨가하여 pH를 9-10으로 유지하였다. 반응 종료시, 현탁물을 1M KHSO4로 pH=3으로 산성화하였다. 고상을 여과하여, 차가운 물 (50ml), 디옥산-물 (2:1)으로 헹군 다음, 다음 단계에 사용하기 전에 톨루엔으로 2번 공비 (azeotrope)하였다.
9-포르밀-2-(Boc-아미노)플루오렌 (3): 3구 RBF에서, NaH (오일 중의 60%; 330mmol, 3.3eq)를 드라이 THF (50ml)에 현탁하고, 드라이 THF (230ml) 중의 단계 2의 2-(Boc-아미노)플루오렌 용액 (28g; 100mmol)을 20분에 걸쳐 점적하였다. 진한 노란색 슬러리가 관찰되었으며, 이 혼합물을 질소 하에 RT에서 10분간 교반하였다. 여기에 에틸 포르메이트 (20.1ml, 250mmol, 2.5eq)를 점적하였다 (주의: 가스 발생). 슬러리는 연갈색 용액으로 바뀌었다. 이 용액을 20분간 교반하였다. 반응은 TLC (Rf=0.5, 헥산/에틸 아세테이트 1:1)로 모니터링하고, 출발 물질이 매우 소량만 관찰될 때 빙수 (300ml)로 퀀칭하였다. 혼합물을 감압 하에 THF 대부분이 제거될 때까지 증발시켰다. 수득되는 혼합물에 아세트산을 처리하여 pH=5로 만들었다. 수득되는 백색 침전물을 에틸 아세테이트에 용해하여, 유기상을 분리하였다. 수상은 에틸 아세테이트로 추출하고, 모든 유기층을 합하여 포화 소듐 바이카보네이트, 브린으로 세척한 다음 MgSO4 상에 건조하였다. 여과 및 용매 제거 후, 노란색 고형물을 수득하였다. 이 물질을 다음 단계에 사용하였다.
9-하이드록시메틸-2-(Boc-아미노)플루오렌 (4): 화합물 3를 MeOH (200ml)에 현탁하고, 소듐 보로하이드라이드를 15분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 이 혼합물을 30분간 교반하였다 (주의: 발연 반응 및 가스 발생). 반응을 TLC (Rf=0.5, 헥산/EtOAc 1:1)로 모니터링하고, 반응을 종료하였다. 여기에 물 (500ml)을 첨가하고, 아세트산으로 pH를 5로 조절하였다. 워크 업으로 에틸 아세테이트로 2번 추출하고, 조합한 유기층을 소듐 바이카보네이트와 브린으로 헹군 다음 MgSO4 상에 건조하고, 여과 및 건조 상태로 농축하였다. 수득한 조산물을 헵탄/EtOAc (3:1)를 이용하여 플라스크 크로마토그래피로 정제하여, 노란색 폼 (36g, 97.5%의 순도, 1H-NMR에서 에틸 아세테이트 및 다이에틸 에테르가 미량 관찰됨).
9-하이드록시메틸-2-아미노플루오렌 (5): 화합물 4를 디옥산 중의 4N HCl 빙랭 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT로 승온시키고, 밤새 교반하였다. 연 노란색 석출물이 수득되었다. 현탁물을 0℃에서 냉장시키고, 5시간 동안 추가로 교반하였다. 이 후, 고형물을 여과하여 DCM (5x30ml)로 잘 세척하였다. 이의 건조 후, 연 노란색 고형물을 수득하였으며 (20g, 96.5%의 순도), 3단계의 전체 수율은 80%이었다.
9-하이드록시메틸-2-(아미노-3-말레이미도프로피오네이트)불소 (6): 9 하이드록시메틸-2-아미노플루오렌 (5, 5.5g, 26mmol) 및 말레이미도프로피온 무수물 (6.93g, 26mmol)을 교반기, 환류 컨덴서 및 질소 발포기 (bubbler)가 장착된 250ml RBF에 넣었다. 반응 혼합물을 25시간 동안 85℃에서 환류하였다. TLC (Rf=0.25, 헥산/EtOAc 1:4)에서 이 시간 후 반응 완료가 확인되었다. 반응 혼합물을 진공 농축하여, 노란색 고형물을 수득하였다. 산물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.
MAL-Fmoc-NHS (7): 오버헤드 교반기가 장착된 깨끗한 건조한 500ml RBF에 트리포스겐 (1.58g, 0.35eq.)을 드라이 THF (55ml) 중에 충전하여, 주위 분위기에서 용액을 수득하였다. 이 용액을 얼음/수 조를 사용하여 약 0℃로 냉각시키고, NHS (0.67g, 0.38eq)를 용해한 드라이 THF (19ml) 용액을 10분에 걸쳐 질소 하 0℃에서 점적하였다. 수득되는 용액을 30분간 교반하였다. 건조 THF (36ml) 중의 NHS (1.34g, 0.77eq)을 추가로 10분에 걸쳐 0℃에서 점적하여, 15분간 교반하였다.
화합물 6 (5.5g, 1eq), 드라이 THF (55ml) 및 피리딘 (3.07ml, 2.5eq)을 함께 교반하여, 현탁물을 제조하였다. 이를 0-5℃에서 조금씩 NHS 용액에 첨가하고, 얼음조에서 꺼내 RT가 되게 두었다. 20시간 후, 반응을 정지시켰다 (출발 물질이 여전히 존재하며, 반응을 강제로 종료시키면, 다이머 불순물 (dimmer impurity)이 관찰되었음). 반응 혼합물을 여과하고, 여과물에 4% 브린 (200ml)과 EtOAc (200ml)를 첨가하였다. 분리 후, 유기층을 5% 시트르산 (220ml)과 물 (220ml)로 세척하였다. 유기층을 농축하여, MAL-Fmoc-NHS 조산물 7.67g을 수득하였다. 이 물질을 사이클로헥산/EtOAc 70:30 -> 40:60의 농도 구배로 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 산물이 함유된 분획을 진공 농축하여, 3.47g (45%)의 MAL-Fmoc-NHS를 수득하였다.
MAL-FMS-NHS (테스트 반응): 트리플루오로아세트산 (10ml) 중의 MAL-Fmoc-NHS (100mg, 0.2mmol) 용액에, 클로로설폰산 (0.5ml)을 첨가하였다. 15분 후, 빙랭한 다이에틸 에테르 (90ml)를 첨가하여, 산물을 석출시켰다. 물질을 원심분리로 수집하고, 다이에틸 에테르로 세척한 다음, 진공 건조하였다. 베이지색 고형물 41.3mg (35%)이 수득되었다.
단계 3 - 접합
PEG-Fmoc-OXM 접합: PEG, Fmoc 및 OXM의 접합은 몰비 1:1:1로 수행하였으며, 예를 들어, PEG40-SH (44mg, 4.4ml 물, 1.0 ㎛ol)를 펩타이드 (4.5mg, 1.0 ㎛ol)에 첨가하고, NaHCO3 (1M, 0.1ml)를 첨가하였다. Fmoc (Almac, DMF 중의 10mg/ml, 50㎕)를 교반하면서 첨가하였다. 반응을 RT에서 24시간 교반하였다.
PEG-FMS-OXM 접합: 모든 접합은 다음과 같은 시약을 이용하여 PEG : 링커 : OXM 몰비 1:1:1로 수행하였다: PEG40-SH 및 PEG30-SH (NOF), FMS (Almac), EMCS (Termo Scientific), OXM (Almac). PEG40-SH를 0.1M 소듐 포스페이트 완충액 (Sigma) pH 7.2에 농도 10mg/mL로 용해하였다. 이 용액을 1 당량의 정제한 OXM 펩타이드 (Almac)에 첨가하였다. MAL-FMS-NHS (Almac) 링커를 DMF에 10mg/mL 농도로 용해하여, 1 당량을 반응물에 첨가하였다. 혼합물을 30분간 교반하였다. 이 용액을 빙초산 (Fisher)을 이용하여 pH 4로 중화하였다. 중화한 혼합물을 여과하고 (0.45㎛), 분취용 크로마토그래피로 분리하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 분취용 HPLC (Phenomenex Luna C18)로 정제한 다음 동결건조하여 냉동 보관하였다.
크로마토그래피의 파라미터는 다음과 같다: 컬럼: Phenomenex Luna C18(2) 250mm x 30mm, 15㎛ prep, 100A; 이동상 A: 물 (MilliQ) + 0.1% v/v TFA (Applied Biosystems); 이동상 B: 물/아세토니트릴 (Rathburn) (25:75) + 0.1% v/v TFA (Applied Biosystems); UV 검출: 214nm; 농도구배: 41분간 10%B -> 65%B; 유속 43mL/min.
아미노산 분석 (AAA) 또는 염기성 가수분해를 이용하여 OXM 함량을 측정하였다. 동결건조한 OXM 접합체를 정해진 양으로 20 mg/ml 농도로 물에 용해하였다. 그런 후, 280nm에서의 흡광도를 측정하고, 280nm에서의 흡광도에 대한 농도를 ε280=29,700으로 계산하였다. 펩타이드 농도는 일부를 산-가수분해로 정확하게 정량한 다음, 아미노산 분석을 수행하였으며; 이상적인 분획은 280nm에서의 계산한 흡광도와 펩타이드 함량이 거의 일치되는 것이다.
cAMP 세포성 분석
GLP-1 수용체를 과다 발현하는 CHO-K1 세포 (Millipore HTS163C2)를 96웰 절반 화이트 플레이트 (Greiner)에 200,000 cells/ml의 밀도로 접종하여, 37℃에서 24시간 인큐베이션하였다. 랫 혈청 1% (Bio reclamation)을 첨가 또는 무첨가하면서, OXM (ALMAC), PEG40-EMCS-OXM 및 PEG40-Fmoc-OXM를 농도 상향식으로 첨가하여, 세포를 배양하였다. 세포의 cAMP 농도를 HTRF 분석 (Cisbio 62AM4PEB)으로 정량하고, EC50 파라미터를 PRISM 소프트웨어로 분석하였다.
약물 동력학적 실험
PEG40-Fmoc-OXM의 약물동력학적 프로파일을 다음과 같이 분석하였다: 수컷 Wistar 랫에 천연 OXM (n=9, 278㎍/kg) 또는 PEG40-Fmoc-OXM (n=6, 278㎍/kg 펩타이드 당량)을 정맥내 (IV) 또는 피하 (SC)로 1회 투여하였다. 그룹 당 동물 3마리 코호트에서 여러 시간대에 채혈하였다. OXM 혈청 농도를 시판 ELISA 키트 (Cat# S-1393, Bachem)를 이용하여 분석하였다.
IP 내당능 검사
C57BL/6 수컷 마우스를 밤새 단식시키고, 체중을 측정한 다음, 소형 혈당측정기를 이용하여 꼬리 정맥에서 샘플링하여 혈당을 측정하였다. 마우스에 PBS (비히클), OXM (333nmol/kg), PEG40-EMCS-OXM (비-가역적인, 페길화된 OXM, 333nmol/(체중)kg 펩타이드 함량) 및 PEG40-Fmoc-OXM (202nmol/(체중)kg 펩타이드 함량) 및 대조군으로서 PEG40-Osu (546nmol/kg)를 IP로 주사하였다. 시험 물질 (비히클, OXM 및 PEG40-Osu)을 투여하고 15분 후에, 또는 PEG40-Fmoc-OXM을 투여하고 120분 후에, 글루코스 (1.5gr/kg)를 IP로 투여하였다. 글루코스를 투여하기 전과, 글루코스 투여 후 10, 20, 30, 60 및 120분째에, 소형 혈당측정기를 이용하여, 꼬리 정맥 샘플링으로 혈당을 측정하였다.
식이-유도성 비만 마우스 모델
실험 1: C57BL/6J 마우스 (4-6 주령, Harlan UK Limited, Bicester, Oxon, UK)를 입수하면 폴리프로필렌 사육장에 그룹 사육하였다. 동물들은 모두 항상 고지방 식이 (D12451; 지방에 기인한 칼로리 45%; Research Diets, New Jersey, USA)와 수돗물에 자유롭게 접근할 수 있게 하였다. 동물은 주야 사이클 12시간 (07:00에 조명을 켬)의 정상 주기로 유지시켰다. 동물은 6개월 이상 (평균 체중이 약 50 g이 될 때까지) 적정 식이에 노출시켰다. 그런 후, 동물들을 각각 폴리프로필렌 사육장에 한마리씩 추가로 2주간 사육하고, 반대 주기로 빛에 노출시켰다 (09:30 - 17:30　h의 8시간 동안 차광함). 단독 사육 2주째에, 동물에 대해 1일 1회 관리 프로토콜과 7일 베이스라인 기간을 개시하였다. 그런 후, 마우스에 표 1에 후술된 바와 같이 비히클과 시험 약물을 투여하였다.
그룹 처리 (sc) 빈도 n
A 비히클 (PBS) 1일 2회 10
B OXM 5000nmol/(체중)kg (PBS) 1일 2회 10
C 시부트라민 20 mg/kg (PBS) 1일 2회 10
D PEG40-FMS-OXM 5000nmol/(체중)kg (사이트레이트 완충액) 1, 3, 5, 7일 10
E 556 mg/kg (27.8 mg/ml) PEG-SH (사이트레이트 완충액) 1, 3, 5, 7일 10
체중과 섭식량은 8일까지 매일 측정하였다. 마지막 체중 측정은 12일째에 수행하였다. OXM과 시부트라민을 PBS 중에 제형화하고, PEG40-FMS-OXM 및 PEG-SH는 147mM NaCl 10mM 사이트레이트 완충액 pH 6 중에 제형화하였다. PEG40-FMS-OXM에서의 OXM 함량을 염기성 가수분해로 측정하였다.
실험 2: 실험 2는 실험 1에 기술된 바와 같이 수행하였다. 베이스라인 기간 경과 후, 동물에 표 2에 나타낸 계획에 따라 투여하였다.
그룹 처리 (SC) 빈도 n
A 비히클 (PBS) 1일 2회 8
B OXM 5000nmol/(체중)kg (PBS) 1일 2회 8
C PEG40-FMS-OXM 1000nmol/(체중)kg (사이트레이트 완충액) 1, 4, 7일 9
D PEG40-FMS-OXM 5000nmol/(체중)kg (사이트레이트 완충액) 1, 4, 7일 9
E PEG40-FMS-OXM 8000nmol/(체중)kg (사이트레이트 완충액) 1, 7일 9
F PEG40-EMCS-OXM 1000nmol/(체중)kg (사이트레이트 완충액) 1, 4, 7일 9
G PEG40-EMCS-OXM 5000nmol/(체중)kg (사이트레이트 완충액) 1, 4, 7일 9
H PEG40-EMCS-OXM 8000nmol/(체중)kg (사이트레이트 완충액) 1, 7일 9
I PEG30-FMS-OXM 5000nmol/(체중)kg (사이트레이트 완충액) 1, 4, 7일 9
J PEG40-SH (사이트레이트 완충액) 1, 4, 7일 9
K 시부트라민 1일 2회 8
14일째까지 체중과 섭식량을 측정하였다.
실험 3: 실험 3은 실험 1&2에 기술된 바와 같이 수행하였으며, 단, 실험 개시시의 마우스 체중은 45-46g이었다. 베이스라인 기간이 경과한 후, 동물에 표 3에 나타낸 계획에 따라 투여하였다.
그룹 처리 (sc) n
A PEG5-FMS-OXM 6000 nmol/kg: 1, 8, 15일 7
B PEG30-FMS-6000 nmol/kg: 1, 8, 15일 7
C PEG40-FMS-OXM 6000 nmol/kg: 1, 8, 15일 7
D PEG60-FMS-OXM 6000 nmol/kg: 1, 8, 15일 7
E 비히클 (PBS sc) 7
F 리라글루티드 (200 ㎍/kg 1일 2회), PBS 7
데이타 및 통계 분석
OXM 및 시부트라민은 PBS 중에 제형화하고, PEG40-EMCS-OXM, PEG40-FMS-OXM 및 PEG-SH는 147mM NaCl 10mM 사이트레이트 완충액 pH 6 중에 제형화하였다. PEG40-FMS-OXM 및 PEG40-EMCS-OXM의 OXM 함량을 AAA로 측정하였다.
체중과 섭식량은 평균값 ± SEM으로 나타낸다. 체중, 체중 증가, 1일 및 평균 섭식량 데이타와 누적 섭식량을 공변량으로서 베이스라인을 사용하여 ANCOVA로 분석한 다음, 적절한 비교 (양방 검정 (two-tailed))를 통해 대조군 대비 유의한 차이를 확인하였다. P<0.05는 통계학적으로 유의한 것으로 간주한다. 베이스라인은 1일째의 체중 또는 베이스라인 기간 동안의 평균 음식물 또는 물 섭취량 값이다.
실시예 1
PEG-Fmoc-OXM의 합성 및 특정화
펩타이드 체인 조립에 Fmoc-전략을 채택하여 고상 방법으로 OXM 펩타이드를 합성하였다. 펩타이드는 Phenomenex Luna C18 (250 x 30mm) 컬럼에 용액 A (0.1% TFA+H2O) 및 B (0.1% TFA + MeCN)의 농도 구배를 적용함으로써, 분취용 HPLC로 정제하였다. 펩타이드 순도는 95% 이상이었으며, 분자량은 4449 Da (MALDI로 측정됨)이었다. OXM 펩타이드의 Fmoc 링커를 통한 PEG40-SH 접합은 NaHCO3의 존재 하에 수행하였다. 반응물을 RT에서 24시간 교반한 다음 여과하고, 분취용 HPLC (Jupiter C5)로 정제하였다. 접합체의 분자량을 MALDI로 분석하고, OXM 펩타이드 함량을 AAA로 분석하였다. 평균 OXM 펩타이드 함량은 189㎍ OXM/1mg PEG10-Fmoc-OXM 접합체, 132.4㎍ OXM/1mg PEG20-Fmoc-OXM 접합체, 61.7㎍ OXM/1mg PEG40-Fmoc-OXM 접합체 및 40㎍ OXM/1mg PEG40-FMS-OXM 접합체였다.
실시예 2
PEG10-Fmoc-OXM, PEG20-Fmoc-OXM 및 PEG40-Fmoc-OXM의, 천연 OXM 대비 약물 동력학
PEG10-Fmoc-OXM 및 PEG20-Fmoc-OXM 대비, OXM의 약물 동력학적 프로파일을 수컷 Wistar 랫에서 조사하였다. 동물에게, 천연 OXM (278㎍/kg 펩타이드), PEG10-Fmoc-OXM (278㎍/kg 펩타이드 함량) 또는 PEG20-Fmoc-OXM (278㎍/kg 펩타이드 함량)를 SC로 1회 주사하여 투여하였다. 지정된 시간 간격으로 화합물의 혈청내 농도를 측정하였다 (시판 ELISA, 도 1에 나타낸 PK 프로파일, 일반적인 비-구획성 PK 파라미터는 표 3에 요약 개시됨). PEG10 및 PEG20에 각각 접합된 OXM의 가역적인 페길화로, 천연 OXM의 반감기가 연장되었다 (천연 OXM은 0.15시간; PEG10-Fmoc-OXM은 16.16시간, PEG20-Fmoc-OXM은 27.38시간). AUC 파라미터에 의해 확인되는 바와 같이, 노출은, PEG10-Fmoc-OXM의 경우 약 ~450배로, PEG20-Fmoc-OXM의 경우 약 ~2210배로 길어져다. 즉, PEG20에 OXM의 가역적인 접합은 PEG10 보다 보다 우수한 연장 효과를 구현하였다. Fmoc 링커를 통해 PEG40에 가역적으로 접합된 OXM의 PK 프로파일을 추가로 특정하기 위해, 수컷 Wistar 랫에 천연 OXM 또는 PEG40-Fmoc-OXM (278㎍/kg 펩타이드 함량)을 IV 또는 SC로 주사하고, 지정된 시간대에 혈청 농도를 분석하였다 (시판 ELISA, 도 2에 나타낸 PK 프로파일, 일반적인 비-구획성 PK 파라미터는 표 4에 요약 개시됨). 그 결과, 가역적인 페길화가 OXM 펩타이드의 반감기를 100배 연장시키며, AUC 파라미터에 의해 확인되는 바와 같이 노출을 현저하게 증가시키는 것으로 나타났다. 아울러, 천연 펩타이드의 생체이용성은 4.37%에 불과한 반면, PEG40-Fmoc-OXM의 투여에 따른 생체이용성은 84%이었다.
표 3: 랫에 SC 투여 후 OXM, PEG10-Fmoc-OXM 및 PEG20-Fmoc-OXM에 대한 비-구획성 PK 파라미터들
AUC
hr*ng/ml		 T1/2 term.
hr		 MRT
hr
OXM 3.2 0.15 0.3
PEG10-Fmoc-OXM 1456 16.16 20.6
PEG20-Fmoc-OXM 7079 27.38 37.2
표 4: 랫에 IV 또는 SC 투여 후 OXM 및 PEG40-Fmoc-OXM에 대한 PK 파라미터들
투여 경로 AUChr*ng/ml
hr		 T1/2 term. MRT
hr		 F
%
OXM IV 72.44 0.44 0.414 100
SC 3.34 0.69 0.913 .374
PEG 40 -Fmoc-OXM IV 435,73 23.3 24.3 100
SC 656,65 30.4 57.7 4.68
실시예 3
OXM과 가역적으로 페길화된 OXM에 의한 cAMP 유도
OXM의 시험관내 활성을 PEG40-Fmoc-OXM 및 PEG40-EMCS-OXM (비-가역적으로 페길화된 OXM)과 비교하여 분석하기 위해, GLP-1 수용체를 과다 발현하는 CHO-K1 세포를 여러가지 화합물들을 농도를 증가시키면서 첨가하여 배양한 후, cAMP를 정량하였다. 천연 OXM은, PEG40-Fmoc-OXM 및 PEG40-EMCS-OXM과 비교하여, 개선된 활성을 나타내었으며, 이는 시험관내 활성과 비슷하였다 (OXM, PEG40-EMCS-OXM 및 PEG40-Fmoc-OXM 각각의 EC50는, 2.53 x 10-9, 2.07 x 10-6 및 5.87 x 10-7임, 도 3). 중요하게도, OXM 페길화는 OXM에 의해 유도되는 GLP-1 수용체의 활성화를 완전히 무효화시키지 않았다. 아울러, OXM을 혈청내 인큐베이션하면 아마도 펩타이드의 부분적인 단백질 분해로 인해, 활성은 감소되었지만, PEG40-Fmoc-OXM 및 PEG40-EMCS-OXM의 경우에는 랫 혈청의 존재 및 부재 시 비슷한 수준의 활성이 달성되었는데, 이는 페길화가 OXM 상의 잠재적인 단백질 분해 사이트를 차폐함을 시사해준다.
실시예 4
가역적으로 페길화된 장기 작용성 OXM 유도성 내당능
OXM 또는 PEG40-Fmoc-OXM의 생체내 활성을 평가하기 위해, IPGTT 모델을 이용하였다. 밤새 단식시킨 C57BL/6 마우스에 OXM 펩타이드 또는 PEG40-Fmoc-OXM를 IP로 주사한 다음, 글루코스를 IP 주사하고, 혈당 측정기로 꼬리 정맥에서 혈당치를 측정하였다. 글루코스 IP 주사 (1.5gr/kg)하기 15분 전 (OXM 및 PEG40-EMCS-OXM) 또는 2시간 (PEG40-Fmoc-OXM) 전에, OXM (333nmol/kg), PEG40-EMCS-OXM (비-가역적으로 페길화된 OXM, 333nmol/(체중)kg 펩타이드 함량) 및 PEG40-Fmoc-OXM (202nmol/(체중)kg 펩타이드 함량)을 IP 투여하였다. 내당능 유도를 비히클 그룹과 비교하였다. PEG40의 효과에 대한 대조군으로서, 대조군에 PEG40-Osu (546nmol/kg)를 투여하였다. OXM 펩타이드는 비히클 그룹과 비교하여 내당능에 대한 효과가 미미하였지만, OXM 몰 함량이 심지어 적은 PEG40-Fmoc-OXM을 투여하면 내당능이 유도되었다 (도 4). 놀랍게도, 비-가역적으로 페길화된 OXM의 투여시 내당능이 유도되었으며, 이는 페길화된 OXM이 약리학적으로 생체내에서 활성을 나타낸다는 것을 시사한다.
실시예 5
가역적으로 페길화된 장기 작용성 OXM은 DIO 마우스에서 체중을 줄여주고 섭식을 저해한다.
천연 OXM 및 가역적으로 페길화된 OXM을 SC 주사한 후 DIO 마우스에서 OXM의 약리학적 활성을 추가로 평가하였다. 실험 1에서, 수컷 DIO 마우스 (n = 10/그룹)에 OXM을 5000nmol/(체중)kg으로 1일 2회로, 또는 PEG40-FMS-OXM을 OXM 5000nmol/(체중)kg으로 2일에 1회로, 7일간 투여하였다. 8일간 매일 체중과 섭식량을 측정하고, 12일째에 마지막으로 체중을 측정하였다. OXM을 하루에 2회 주사한 결과, 체중이 조금 감소하였고 (8일째의 비히클 대조군 대비 체중 감소율 6%), 섭식이 통계학적으로 유의하게 저해되었다. 반면, 투여 당 OXM을 동일한 함량으로 포함하는 PEG40-FMS-OXM을 2일에 1회로 주사한 결과, 체중이 현저하게 감소되었고 (8일째에 PEG-SH 대조군 대비 체중 감소율 24%), 섭식이 실질적으로 저해되었다 (도 4). 신경전달인자 재흡수 저해제인 시부트라민은 양성 대조군으로 사용되었는데, 체중이 15.6%까지 감소되었다. 흥미롭게도, PEG40-FMS-OXM 군에서의 체중 감소는 마지막 투여 후 5일째인 12일째에 마지막으로 측정할 때까지 일정하였는데, 이는 가역적으로 페길화된 OXM의 장기 작용적인 행태를 의미한다 (도 5).
IPGTT 모델에서의 PEG40-EMCS-OXM 유도성 내당능은 체중 및 섭식 측면에서 비-가역적으로 페길화된 OXM의 효능을 가역적으로 페길화된 OXM과 비교하는데 중요하였다. 이에, 이러한 점을 해결하기 위한 추적 실험을 설계하였다 (실험 2, 재료 및 방법). PEG40-FMS-OXM을 3일 마다 5000nmol/(체중)kg으로 투여한 결과 체중은 실질적으로 감소되었지만, PEG40-EMCS-OXM을 동일한 빈도로 5000nmol/(체중)kg으로 주사하였을 때에는 체중에 거의 효과가 없었다. 특히, PEG40-FMS-OXM을 8000nmol/(체중)kg으로 1일에 1회 주사시 6일간의 명확하게 체중 감소가 유도되었다. 놀랍게도, PEG30-FMS-OXM을 5000nmol/(체중)kg으로 투여하면 높은 수준의 체중 감소가 발생되었으며, 이는 PEG40-FMS-OXM에 대비 효능 개선을 시사한다 (도 6).
OXM은, 과체중이고 비만인 건강한 개체에서 천연 OXM에 의해 달성되는 체중 감소로 확인되는 바와 같이, 당뇨병 및 비만 등의 대사성 장애를 치료할 가능성 있는 펩타이드이다 (Wynne et al, 2005). 아직까지, 펩타이드의 짧은 반감기와 생체내 낮은 안정성으로 인해, 인간에서 약리학적 효과를 달성하기 위해서는 생리학적 용량 보다 높은 수준으로 매일 반복 투여하여야 한다. 본 발명은 작용성 OXM을 가역적으로 페길화하여 장기 작용성을 부여함으로써 생리학적 조건에서 OXM을 안정화하는 효과적인 수단을 제공한다. 예상치 못하게도, 변형된 OXM-페길화된 버전은 활성형이며, 단순히 프로드럭은 아니다.
가역적으로 페길화된 OXM은 랫에서 우수한 약물 동력학적 프로파일을 나타내었으며, 천연 OXM과 비교하여 실질적인 노출 증가와 반감기 연장이 확인되었다. OXM에 가역적으로 접합된 다양한 분자량의 PEG가 OXM-PK 프로파일에 미치는 효과들을 비교하였을 때, PEG40-접합체는 PEG10 또는 PEG20에 비해 월등한 장기적인 효과를 나타내었다 (도 1 및 2). 중요하게도, PEG40-Fmoc-OXM을 SC로 투여한 후 OXM의 생체이용성이 4.37%에서 84.6%로 현저하게 증가되어, 가역적으로 페길화된 펩타이드의 노출 증가에 기여하였다 (표 2). PEG40-Fmoc-OXM은, 밤새 금식한 C57BL/6 마우스 IPGTT 모델에서 평가한 바와 같이, 천연 OXM에 비해 내당성을 개선하였다. 이 모델에서, PEG40에 접합된 비-가역적으로 페길화된 OXM (PEG40-EMCS-OXM)이 PEG40-Fmoc-OXM과 유사한 수준의 내당능 유도 활성을 가지는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는, 입체적 간섭으로 인해 페길화된 펩타이드에서 관찰되는 현상인, OXM의 일반적인 페길화가 OXM이 이의 수용체에 결합하는 것을 완전히 무효화하지 않으며, 따라서 생물학적 활성을 완전히 상실시키지 않는다는, PEG40-EMCS-OXM 및 PEG40-Fmoc-OXM에서 관찰되는 시험관내 활성에 의해, 추가로 뒷받침되었다 (도 3 및 4).
다음으로, 체중 및 섭식에 대한 PEG40-FMS-OXM의 효과를 DIO 마우스에서 천연 OXM과 비교하여 평가하였다. 천연 OXM을 5000nmol/kg으로 SC 주사한 결과, 투여 7일 후 체중 및 섭식이 다소 감소하였다. 반면, 5000nmol/kg PEG40-FMS-OXM을 2일 마다 주사하면 8일째의 대조군과 비교하여 체중과 섭식량이 현저하게 감소하였다 (OXM 및 PEG40-FMS-OXM의 경우 체중 감소율 각가 6% 및 24.9%, 도 5). 결론적으로, PEG40-FMS-OXM은 지속적인 항-비만 효과를 나타내며, PEG40-FMS-OXM에 대한 실험을 진행하는 동안에 투여된 OXM 누적 용량이 천연 OXM을 투여한 그룹에 비해 거의 4배 낮다는 점을 고려하면, 개선된 효과를 나타내었다.
비-가역적으로 페길화된 OXM인 PEG40-EMCS-OXM은, IPGTT 검사에서 내당능을 개선시키는 것으로 확인되었다. 이에, DIO 모델에서, 일반적인 페길화의 섭식 조절 활성을 가역적으로 페길화된 OXM 및 천연 OXM과 비교 평가할 필요가 있었다. 이에 PEG40-EMCS-OXM을 3일 마다 5000nmol/kg으로 투여한 결과, 투여 후 3일째까지 섭식 저해가 명확하게 나타났지만, 체중 감소는 거의 없었다 (도 6). 적정 수준의 섭식 저해는 아마도 위장에서의 OXM의 직접 활성으로 인한 것으로, IPGTT 모델에서 관찰되는 말초 활성과 관련있다. OXM 식이 조절 활성은 혈액 뇌 장벽의 통과 및 ARC에서 뉴런 수용체와의 결합을 수반하므로, OXM이 CNS에 침투하는 침투력은 무효화되지 않아야 한다. PEG40-EMCS-OXM에 DIO 마우스의 체중을 감량시키는 능력이 결여된 것과는 반대로, 이 화합물에서 관찰되는 말초 생활성은, PEG 모이어티와의 공유 결합이 시상하부내 잠재적인 OXM 작용 부위인 ARC로 BBB를 통과하는 PEG40-EMCS-OXM의 통과력을 제한한다는 것을, 시사해준다. 이와는 대조적으로, 동일한 빈도로 PEG40-FMS-OXM을 5000nmol/kg으로 주사하면 체중이 현저하게 감소되었고, 12일에 측정된 바와 같이 섭식이 20%까지 저해되었다. 특히, 1주일에 1회로 8000nmol/kg PEG40-FMS-OXM을 주사하였을 때 마찬가지로 체중이 20%까지 감소되었는데, 이는, 인간에서, 가역적으로 페길화된 OXM을 1주일에 한번 또는 그 보다 적은 빈도로 투여하면 현저한 체중 감소가 달성될 수 있음을, 의미한다.
가역적인 페길화 전략은, 약물의 장기적인 효과를 유지하면서, 일반적인 페길화에서 종종 관찰되는 활성 소실을 극복하고자 하는 것이다. 페길화된 프로드럭의 생활성이 급격하게 감소되거나 또는 심지어 없어지는 경우, 가역적인 페길화를 적용하였을 때의 이점은 기존에 입증된 바 있다 (미국 특허 7585837). 아직까지는, 생활성을 보유한 공유적으로 비-가역적으로 페길화된 프로드럭과 비교하여, 가역적으로 페길화된 프로드럭의 효능에 대해서는 알려져 있지 않다. 접합체에서 펩타이드의 느린 해리로 인해, 접합체의 혈중 농도 평가시, 특히 공유적으로 페길화된 펩타이드의 PK 프로파일이 가역적으로 페길화된 펩타이드 보다 우수할 것으로 예상하는 것이 특히 적절하다. PEG40-EMCS-OXM은 시험관내와 IPGTT 모델의 생체내에서 모두 활성을 나타내는 것으로 입증되었다. 이에, 이 분자는 마우스에 SC 투여된 후 안전성을 유도하고 체중을 낮추는 것도 가능하다. 그러나, 이는, PEG40-EMCS-OXM이 DIO 마우스에서 체중을 감소시키지 못하는 반면 PEG40-FMS-OXM은 현저한 효과를 나타낸다는 점에서, 틀린 것으로 입증되었다. 상충되는 데이타를 제시한 기존의 공개물은 OXM의 말초 활성과 OXM의 CNS 활성에 관한 것이다. 한편, ip OXM의 식욕감퇴 작용은 GLP-1R exendin9-39을 ARC내로 미리 투여함으로써 차단되었으며, 이는 OXM의 CNS-관련 활성의 중요성을 시사해준다 (Dakin et al 2004). 그렇지만, 과체중 마우스에 OXM을 발현하는 비피도박테리움을 경구 전달하면, 체중은 감소되었지만, OXM이 마우스의 혈장에서 검출되지 않았으며, 이는 위장 세포의 직접 활성화가 OXM의 체중 감소 활성에 중요하다는 것을 시사해준다 (Long et al, 2010). 전술한 바와 같이, OXM의 작용 방식과 페길화 효과에 대한 정보 부족으로 인해, 가역적으로 페길화된 OXM을 천연 OXM과 공유 결합된 페길화된 OXM과 비교 예측하기는 불가능하였다.
실험 2에서 확인된 바와 같이, PEG40-FMS-OXM과 비교하여 PEG30-FMS-OXM의 월등한 효과는 놀라웠다. PEG30-FMS-OXM의 PK 프로파일은 조사하지 않았지만, PEG40-FMS-OXM의 PK 프로파일은 PEG10-FMS-OXM 및 PEG20-FMS-OXM 보다 확실히 우수하였다. PEG30의 사용은, 한편으로는 접합된 PEG30-FMS-OXM의 신장에서의 소거를 현저하게 낮추면서, 약리학적 활성을 도출하는데 필요한 지속적인 OXM 제시를 구현할 수 있는 접합체로부터의 가수분해 속도를 조장하는, 유리한 PEG 크기를 제공할 수 있다.
실험 3
본 실험에서, 다양한 크기의 PEG에 OXM을 접합하여 이를 평가하였다. 이전 실험들에서 입증된 바와 같이, PEG30-FMS-OXM 및 PEG40-FMS-OXM을 매주 1회로 투여하면 체중에 현저한 효과가 있었다. 놀랍게도, PEG5-FMS-OXM은 비히클 그룹에 비해 체중 감소를 유도하는 능력을 완전히 상실하였지만, PEG60-FMS-OXM은 PEG30-FMS-OXM 보다 훨씬 강력한 체중 감소를 유도하였다. 본 실험에서 PEG30-FMS-OXM과 PEG40-FMS-OXM 간의 체중 감소 차이는 본 실험에서 가변성 범위내였으며, 유의하지 않았다.
실시예 6
가역적으로 페길화된 OXM을 처리한 비만 마우스에서 혈당 프로파일과 혈중지질 파일 개선
재료 및 방법
식이 유도성 (DIO) 마우스 모델의 실험 절차:
DIO 모델은 RenaSci Ltd 사 (Nottingham, UK)에서 수행하였다. C57BL/6J 마우스 (4-6주령, Harlan UK Limited, Bicester, Oxon, UK)를 적어도 6개월간 (평균 체중이 약 50g이 될 때까지) 고지방 식이 (D12451; 지방 칼로리 45%; Research Diets, New Jersey, USA)에 노출시켰다. 약물 투여하기 2주 전에, 동물을 한마리씩 넣어, 주야 주기를 반대로 적용하였다 (09:30 - 17:30　h으로, 8시간 동안 차광). 단독 사육 1주 동안 (관리 기간)에, 동물에 대해 1일 1회 관리 프로토콜을 시작하고, 2주차 (베이스라인 기간)에는 적정 비히클을 1일 2회 또는 (처치 기간 동안 투여하는 바와 같이) 매주 1회로 피하 경로에 의해 투여하였다. DIO 마우스 7개의 그룹 (n=8)에 다음과 같이 29일간 투여하였다.
그룹 처리 (SC) 빈도
A PEG40-SH (662 mg/kg) 주당 1회 (1, 8, 15, 22, 29)
B PEG40-EMCS-OXM (6,000nmol/kg) 주당 1회 (1, 8, 15, 22, 29)
C PEG30-EMCS-OXM (6,000nmol/kg) 주당 1회 (1, 8, 15, 22, 29)
D PEG40-FMS-OXM (6,000nmol/kg) 주당 1회 (1, 8, 15, 22, 29)
E PEG30-FMS-OXM (6,000nmol/kg) 주당 1회 (1, 8, 15, 22, 29)
F 비히클 (PBS) 1일 2회
G OXM (6,000nmol/kg; PBS) 1일 2회
베이스라인 및 처치 기간 동안에, 섭식, 물 섭취 및 체중을 매일 기록하였다. 2주 베이스라인을 지나 1일 및 22일째에, 마우스들을 모두 밤새 금식시켰다. 2일 및 23일째에, 마우스에서 경구 내당능 검사 (OGTT)를 수행하였다. 각 동물에 비히클 또는 시험 화합물을 투여하고, 60분 후에 D-글루코스 (2 g/kg po)를 투여하였다. 비히클 또는 시험 화합물 (B1)을 투여하기 직전과 글루코스 부하 (B2) 직전에 베이스라인 혈액 샘플을 채혈하였다. 또한, 글루코스 투여 후 10, 20, 30, 45, 60 및 120분 후에 채혈하였다. 모든 혈액 샘플 (대략 20㎕)은 꼬리 정맥에서 취하였다. 혈장 샘플을 준비하고, 써모일렉트론 인피니피 글루코스 시약 (TR15421) 및 Alpco 마우스 초민감 인슐린 ELISA (80-INSMSU-E10) 각각을 사용하여 글루코스 (n = 2)과 인슐린 (n = 1)을 분석하였다. 30일째에, 심장 천공으로 최종 혈장 샘플을 취하고 (29일째 마지막 투여 후 24시간째), 마우스 초민감성 인슐린 ELISA (80-INSMSU-E10), 써모일렉트론 인피니피 글루코스 시약 (TR15421), 써모일렉트론 인피니피 콜레스테롤 시약 (TR13421) 및 Sigma 트리글리세라이드 키트 (TR0100)를 사용하여 인슐린, 글루코스, 콜레스테롤 및 트리글리세라이드를 분석하였다. 최종 혈액 샘플링 후 마지막 사체의 체중을 기록하고, -20℃에서 냉동 보종하였다.
체 성분 실험에 대한 실험 절차:
사체의 체 지방, 단백질, 물 및 회분 수준을 표준적인 화학 분석 기법을 이용하여 측정하였다. 지방, 단백질, 물 및 회분 함량만 조사하였는데, 다른 성분들 (주로 탄수화물)은 전체 신체 조성의 2% 미만이었기 때문이다. 사체의 수분량을 마우스 사체를 무게가 일정해질 때까지 동결 건조함으로써, 측정하였다. 건조한 사체를 이후 분석을 위해 실험 분쇄기에서 분쇄하였다. 사체 지방을, 제조사의 권고 프로토콜에 따라, Tecator Soxtec 2050 시스템 (Foss UK Ltd, Wheldrake, UK)에서 변형된 속슬레 추출 프로토콜 (페트롤륨 에테르, 40-60℃)을 이용하여 동결건조한 샘플에서 측정하였다. 사체 단백질 함량은 Tecator 2012 분해 블럭과 2200 증류 유닛 (Foss UK Ltd)을 이용하여 동결건조한 샘플에서 마이크로-킬달 절차로 측정하였다. 사체의 나머지 회분은 머플 회분화 용광로를 이용하여 고온에서 동결건조한 샘플을 화장하여, 측정하였다.
데이타 및 통계 분석:
체중, 섭식량과 물 섭취량은 평균 ± SEM으로 나타내었다. 체중, 체중 증가, 1일 및 평균 음식물 및 물 섭취 데이타와 누적 섭식를, 공변량으로서 베이스라인을 사용하여 ANCOVA로 분석한 다음, 적정 비교 (양방)를 수행하여, 대조군 대비 유의한 차이를 측정하였다. P<0.05는 통계학적으로 유의한 것으로 간주된다. 베이스라인은 1일째의 체중 또는 베이스라인 기간 동안의 평균 음식물 또는 물 섭취량 값이었다.
마지막 혈장 인슐린, 콜레스테롤 및 트리글리세라이드를, 인자로서 처리와 공변량으로서 채혈 순서와 베이스라인 체중을 이용한 일반 선형 모델로 분석한 다음, 적정 비교 (양방)를 수행하여, 적절한 비히클 그룹 대비 유의한 차이를 측정하였다. log 변환 및/또는 로버스트 회귀 기법을 필요에 따라 사용하였다.
각 체 성분 파라미터 (지방, 단백질, 물 및 회분)에 대한 데이타를 g/사체 및 전체 %로 표시하였다. 최종 사체 무게도 직접 비교로서 분석하였다. 분석은, 인자로서 처리와 공변량으로서 베이스라인에서의 체중을 이용한 로버스트 회귀에 의해 수행한 다음, 적절한 다중 비교 검정 (양방)을 수행하여, 각 처리군의 효과를 적절한 비히클 그룹과 비교하였다.
결과
30일 동안, 가역적인 PEG30 (PEG30-FMS-OXM (6,000 nmol/kg; 사이트레이트 완충액)) 또는 가역적인 PEG40 (PEG40-FMS-OXM (6,000 nmol/kg; 사이트레이트 완충액))를 매주 투여하면, 천연 옥신토모듈린을 1일 2회 주사한 그룹에서의 체중 감소율 17%와 비교하여, 각각 28% 및 23%로 체중이 감소되었으며 (도 7) - 가역적인 PEG30과 함께 주사한 옥신토모듈린의 순 누적 투약시에는 30일간 8.6%에 불과하였다. 비-가역적으로 페길화된 OXM (PEG40-EMCS-OXM 및 PEG30-EMCS-OXM)은 체중 감소에 대한 효과가 훨씬 미미하였다.
가역적으로 페길화된 OXM (PEG30-FMS-OXM 또는 PEG40-FMS-OXM)을 매주 주사한 후 DIO 마우스에서의 내당능은, 2일 (도 8A) 및 23일 (도 8B)째의 천연 옥신토모듈린을 1일 2회 투여시에 도출되는 내당능과 유사한 수준이었다.
아울러, 가역적으로 페길화된 OXM을 매주 1회 투여시, 최종 글루코스 감소 (도 9A), 최종 인슐린 감소 (도 9B), 최종 콜레스테롤 감소 (도 9C) 및 최종 글리세롤 감소 (도 9D)로 입증되는 바와 같이, DIO 마우스에서 혈당 프로파일과 혈중 지질 프로파일이 개선되었다.
마지막으로, DIO 마우스의 체 성분 분석을 통해, 가역적으로 페길화된 OXM을 처리한 마우스에서 나타나는 체중 감소는 지방의 특이적인 감소로 인한 것으로 확인되었다 (도 10).
더불어, 리버스 페길화는 여러가지 독성 설치류 동물 모델에서 안전하며 허용가능한 것으로 입증되었다. 리버스 페길화는 또한 타겟 조직으로의 침투 잠재력 (예, BBB 침투)은 유지하면서 OXN 반감기를 연장할 수 있다.
가역적으로 페길화된 OXM은 우수한 장기 작용성 특징을 나타내었으며, 이는 인간에서 매주 1회 주사시에 뒷받침되었다. 가역적으로 페길화된 OXM은 지방의 특이적인 감소에 의해 체중을 감소시켰다 (체 성분 평가). 가역적으로 페길화된 OXM은 혈당 프로파일과 혈중 지질 프로파일을 개선시켰다. 가역적으로 페길화된 OXM은 비만과 2형 당뇨병 환자에서 혈당 활성 및 지방 감소에 대한 유효한 효과를 통해 장기간 치료를 제공할 것으로 예상된다.
실시예 7
가역적으로 페길화된 OXM의 혈당 및 인슐린 분비 효과
식이 유도성 비만 (DIO) 마우스 모델에 대한 실험 절차:
DIO 모델은 RenaSci Ltd 사 (Nottingham, UK)에서 수행하였다. C57BL/6J 마우스 (4-6주령, Harlan UK Limited, Bicester, Oxon, UK)를 적어도 6개월간 (평균 체중이 약 50g이 될 때까지) 고지방 식이 (D12451; 지방 칼로리 45%; Research Diets, New Jersey, USA)에 노출시켰다. 약물 투여하기 2주 전에, 동물을 한마리씩 넣어, 순화 기간을 시작하였다. 1주째, 관리 기간에, 동물에 대해 1일 1회 관리 프로토콜을 시작하고, 2주차, 베이스라인 기간에는 적정 비히클을 1일 2회 또는 (처치 기간 동안 투여하는 바와 같이) 매주 1회로 피하 경로에 의해 투여하였다. 베이스라인 및 처치 기간 동안에, 섭식, 물 섭취 및 체중을 매일 기록하였다. 1일 오전에, 마우스에 투여한 다음 밤새 금식시켰다. 2일째에, 투여 후 14시간 (A-E 그룹)째에 또는 오전 투여 전 (F-H 그룹)에, 마우스에서 공복 혈당과 공복 인슐린 분석을 위해 샘플을 취하였다. 모든 혈액 샘플 (대략 20㎕)은 꼬리 정맥에서 취하였다. 혈장 샘플을 준비하여, 써모일렉트론 인피니피 글루코스 시약 (TR15421) 및 Alpco 마우스 초민감 인슐린 ELISA (80-INSMSU-E10)를 각각 사용하여, 글루코스 (n　=　2)와 인슐린 (n　=　1)을 분석하였다.
결과
본 실험 세트에서, 2번의 독립적인 생체내 실험을 수행하였다. 1차 실험에는, 다음과 같이 2일간 투여하는 DIO 마우스로 구성된 8개의 그룹 (n=8)을 포함시켰다.
그룹 처리 (SC) 빈도
A PEG40-SH (662 mg/kg) 1일에 1회 주사
B PEG40-EMCS-OXM (6,000nmol/kg) 1일에 1회 주사
C PEG30-EMCS-OXM (6,000nmol/kg) 1일에 1회 주사
D PEG40-FMS-OXM (6,000nmol/kg) 1일에 1회 주사
E PEG30-FMS-OXM (6,000nmol/kg) 1일에 1회 주사
F 비히클 (PBS) 1일 2회
G OXM (6,000nmol/kg; PBS) 1일 2회
H 리라글루티드 (200㎍/kg) 1일 2회
2차 실험에는, 다음과 같이 2일간 투여하는 DIO 마우스로 구성된 7개의 그룹 (n=7)을 포함시켰다.
그룹 처리 (SC) 빈도
A PEG60-SH (947.4 mg/kg) 1일에 1회 주사
B PEG5-FMS-OXM 6000 nmol/kg 1일에 1회 주사
C PEG30-FMS-6000 nmol/kg 1일에 1회 주사
D PEG40-FMS-OXM 6000 nmol/kg 1일에 1회 주사
E PEG60-FMS-OXM 6000 nmol/kg 1일에 1회 주사
F 비히클 (PBS) 1일 2회
G PBS 중의 리라글루티드 (200 ㎍/kg 1일 2회) 1일 2회
이들 2가지 실험들에서, PEG-OXM 변형체들: : PEG40-EMCS-OXM, PEG30-EMCS-OXM, PEG40-FMS-OXM, PEG30-FMS-OXM (Exp. #1) 또는 PEG30-FMS-OXM, PEG40-FMS-OXM 및 PEG60-FMS-OXM (Exp. #2)을 모두 1회 투여시, 비히클과 비교하여, 공복 혈당이 두드러지고 현저하게 감소되었다 (도 11 및 12). 실험 #1에서, 비히클 그룹 (PEG40-SH)의 글루코스 수준은 9.5 mM이고, PEG-OXM 처리군의 글루코스 수준은 5.18 내지 5.8 mM이었다. 동일한 수준의 글루코스 감소는, 또한, 비히클 그룹 11.9 mM에서 PEG-OXM 처리군 5-5.7mM으로의 글루코스 감소를 보여준, 실험 #2 (PEG5-OXM 군은 제외됨)의 PEG-OXM 처리군에서도 확인되었다. 이러한 효과는, 도 11에 나타낸 바와 같이, 실험 #1에서 공복 혈장 인슐린 수준의, 비히클 2.8 ng/ml에서 PEG-OXM 처리군 1.4-1.9 ng/ml로의 감소와 연관성이 있었다. 실험 #2에서, 공복 인슐린 수치는 0.99 ng/ml이었으나, PEG-OXM (PEG5-OXM 제외)의 공복 인슐린 수치는 0.78 내지 0.91 ng/ml이었다.
이들 2가지 실험들에서, 리라글루티드는 비히클 (PBS) 대비 공복 글루코스를 현저하게 감소시켰으며; 실험 #1에서 비히클을 9.3 mM에서 6.06 mM로 감소시켰고, 실험 #2에서 비히클을 11.5 mM에서 6.7 mM로 감소시켰다. 이러한 글루코스 감소와 더불어, 이 처리군에서는, 혈장 인슐린은, 실험 #1의 경우 비히클 2.5 ng에서 4.4 ng/ml로, 실험 #2의 경우 1.98 ng/ml에서 3 ng/ml으로 유의하게 증가하였다. OXM 천연 펩타이드를 실험 #1에서 분석하였으나, 어쩌면 짧은 혈청 반감기와 매우 신속한 체내 소거성으로 인해, 비히클과 비교하여, 글루코스 수준과 인슐린 수준에 어떠한 유의한 차이도 나타나지 않았다.
DIO 마우스에서의 2번의 독립적인 실험들의 결과를 통해, PEG-OXM 화합물들이, 리라글루티드 투여 후에 관찰되는 바와 같이, 그리고 OXM 천연 펩타이드에서 확인된 기존 데이타들에서 예상되는 바와 같이, 인슐린 수치 증가 없이도, 글루코스 수준의 유의한 감소를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 예상하지 못했던 글루코스 수준 감소와 더불어 공복 인슐린 수준 감소는, PEG-OXM 1회 투여가 이미 급성 노출된 인슐린에 대한 동물의 민감성을 증가시키며, 만성적인 처치로 인한 것은 아님을 의미한다.
본 발명의 특정한 특징들이 본원에 예시 및 기술되어 있지만, 당해 기술 분야의 당업자라면 여러가지 변형, 치환, 변화 및 등가를 구현할 수 있을 것이다. 따라서, 첨부된 청구항은 본 발명의 진정한 사상내에서 상기한 모든 변형들과 변화를 포괄하는 것으로 이해된다.
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Claims (39)

  1. 옥신토모듈린, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머) 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)로 구성된 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 PEG 폴리머가 Fmoc 또는 FMS를 통해 상기 옥신토모듈린의 아미노 말단 또는 라이신 잔기에 부착된 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 옥신토모듈린이 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 PEG 폴리머가 설프하이드릴 모이어티를 가진 PEG 폴리머인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 PEG 폴리머가 PEG30, PEG40 또는 PEG60인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항에 따른 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  7. 옥신토모듈린, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머) 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)을 약 1:1:0.5 내지 약 1:1:3.5의 몰비로 접합하는 단계를 포함하는, 옥신토모듈린의 생물학적 반감기를 연장하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 옥신토모듈린이 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 PEG 폴리머가 Fmoc 또는 FMS를 통해 상기 옥신토모듈린의 아미노 말단 또는 라이신 잔기에 접합된 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 PEG 폴리머가 설프하이드릴 모이어티를 가진 PEG 폴리머인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 PEG 폴리머가 PEG30, PEG40 또는 PEG60인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 유효량의 제1항에 따른 조성물과 약제학적으로 허용가능한 담체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 내당성 (glucose tolerance) 또는 혈당 조절 (glycemic control), 또는 내당성과 혈당 조절을 모두 유도하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 옥신토모듈린이 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, PEG 폴리머가 Fmoc 또는 FMS를 통해 상기 옥신토모듈린의 아미노 말단 또는 라이신 잔기에 접합된 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제12항에 있어서, PEG 폴리머가 설프하이드릴 모이어티를 가진 PEG 폴리머인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제12항에 있어서, PEG 폴리머가 PEG30, PEG40 또는 PEG60인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 옥신토모듈린의 아미노 말단에 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)을 통해 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)를 접합하는 단계를 포함하는, 옥신토모듈린의 곡선 하 면적 (AUC)을 개선하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 옥신토모듈린이 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 PEG 폴리머가 Fmoc 또는 FMS를 통해 상기 옥신토모듈린의 아미노 말단 또는 라이신 잔기에 접합된 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 PEG 폴리머가 설프하이드릴 모이어티를 가진 PEG 폴리머인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제17항에 있어서, 상기 PEG 폴리머가 PEG30, PEG40 또는 PEG60인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 옥신토모듈린의 아미노 말단에 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)을 통해 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)를 접합하는 단계를 포함하는, 옥신토모듈린의 투약 빈도를 줄이는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 옥신토모듈린이 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 PEG 폴리머가 Fmoc 또는 FMS를 통해 상기 옥신토모듈린의 아미노 말단 또는 라이신 잔기에 접합된 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제22항에 있어서, 상기 PEG 폴리머가 설프하이드릴 모이어티를 가진 PEG 폴리머인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제22항에 있어서, 상기 PEG 폴리머가 PEG30, PEG40 또는 PEG60인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)인 유연한 링커를 통해 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)에 접합된 옥신토모듈린을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 섭식 또는 체중, 또는 섭식과 체중을 모두 줄이는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 옥신토모듈린이 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 PEG 폴리머가 Fmoc 또는 FMS를 통해 상기 옥신토모듈린의 아미노 말단 또는 라이신 잔기에 접합된 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제27항에 있어서, 상기 PEG 폴리머가 설프하이드릴 모이어티를 가진 PEG 폴리머인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제27항에 있어서, 상기 PEG 폴리머가 PEG30, PEG40 또는 PEG60인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)에 접합된 옥신토모듈린을 포함하는 조성물을 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 인슐린 민감성을 높이는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 PEG 폴리머가 PEG30, PEG40 또는 PEG60인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제32항에 있어서, 상기 옥신토모듈린이 링커를 통해 상기 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)에 접합된 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 링커가 절단가능한 유연한 (flexible) 링커인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제33항에 있어서, 상기 링커가 비-절단성 링커인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제35항에 있어서, 상기 유연한 링커가 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMS)인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제36항에 있어서, 상기 링커가 N-(ε-말레이미도카프로일옥시) 숙신이미드 에스테르 (EMCS)인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제32항에 있어서, 상기 조성물의 투여가 상기 개체에서 인슐린 민감성을 급속 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
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