MX2013014069A - Agonistas de receptor de glp-1/glucagón de acción prolongada. - Google Patents

Agonistas de receptor de glp-1/glucagón de acción prolongada.

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Abstract

Se describen agonistas de receptor de GLP1/Glucagón pegilados y pegilados inversos incluyendo composiciones farmacéuticas comprendiendo los mismos y métodos para usar los mismos.

Description

AGONISTAS DE RECEPTOR DE GLP-1/GLU CAGÓN DE ACCIÓN PROLONGADA REFERENCIA CRUZADA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama la prioridad de la Solicitud Provisional de Estados Unidos Serie Número 61/492,448, presentada el 2 de junio de 2011, y Solicitud Provisional de Estados Unidos Serie Número 61/624,589, presentada el 16 de abril de 2012. Estas solicitudes se incorporan en su totalidad en la presente para referencia.
Campo de la invención Se describen la oxintomodulina pegilada y pegilada inversa incluyendo composiciones farmacéuticas que comprenden la misma y métodos de uso de las mismas.
Antecedentes de la invención Las proteínas y péptidos especialmente cortos son susceptibles a la desnaturalización o degradación enzimática en la sangre, hígado o riñon. Por consiguiente, las proteínas típicamente tienen cortas vidas medias circulatorias de varias horas. Debido a su baja estabilidad, los fármacos peptídicos se suministran generalmente en una frecuencia sostenida para mantener una concentración en plasma efectiva del péptido activo. Por otra parte, puesto que los fármacos peptídicos se administran generalmente por infusión, la inyección frecuente de fármacos peptídicos causan malestar considerable a un sujeto. Por lo tanto, hay una necesidad de tecnologías que prolonguen las vidas medias de las proteínas y péptidos terapéuticos mientras se mantiene una alta eficacia farmacológica de los mismos. Tales fármacos peptídicos deseados también deben cumplir los requisitos de estabilidad en suero mejorada, alta actividad y una baja probabilidad para inducir una respuesta inmune no deseada cuando se inyectan en un sujeto.
La farmacocinética desfavorable, tal como una vida media en suero corta, puede prevenir el desarrollo farmacéutico de muchos candidatos de fármacos prometedores de otro modo. La vida media en suero es una característica empírica de una molécula, y se debe determinar experimentalmente para cada nuevo fármaco potencial. Por ejemplo, con fármacos proteínicos de bajo peso molecular, los mecanismos de depuración fisiológicos tal como la filtración renal pueden hacer inviable el mantenimiento de los niveles terapéuticos de un fármaco debido al costo o frecuencia del régimen de dosificación requerido.
El tracto gastrointestinal es el responsable de sintetizar y liberar muchas hormonas peptídicas que regulan la conducta alimentaria incluyendo la proteína pancreática (PP) , péptido 1 similar al glucagón (GLP-1 ), péptido YY (PYY) y Oxintomodulina (OXM). La OXM surge de un procesamiento post-transicional de tejido específico del proglucagon en el intestino y el CNS. Contiene 37 aminoácidos, incluyendo la secuencia de glucagón completa con una extensión de octapéptido básica C-terminal que se ha mostrado que contribuye a las propiedades de OXM tanto in vitro como in vivo, pero no fue suficiente por sí solo para los efectos del péptido. En respuesta a la i ngestión de alimentos, la OXM se secreta por las célu las L i ntestinales en el torrente sanguíneo proporcionalmente al contenido calórico de la comida.
La OXM mejora la depuración de la glucosa a través de la estim ulación de la secreción de la insuli na después de la adm inistración tanto oral como intraperitoneal . También regula el control de la ingesta de alimentos. La inyección intracerebroventricular (I CV) e i ntranuclear de OXM en los n úcleos paraventricular y arqueado (ARC) del hipotálamo inh ibe la re-al imentación en ratas en ayunas (Dakin et al 2001 ; Dakin et al 2004) . Esta inhibición también se ha demostrado en ratas alimentadas libremente en el comienzo de la fase de oscuridad. Por otra parte, la administración periférica de OXM dependiente de la dosis inh ibió la ingesta de alimentos tanto inducida por el ayuno como por la fase de oscuridad (Dakin et al . 2004) .
El nuevo procedimiento conceptual llamado pegilación reversible se describió anteriormente (Publ icación PCT No. WO 98/05361 ; Gershonov et al , 2000), para prolongar la vida media de las proteínas y péptídos. De acuerdo con esta tecnolog ía , los profármacos se preparan deriva ndo el fármaco con grupos funcionales que son sensibles a las bases y removi bles bajo cond iciones básicas moderadas, tales como condiciones fisiológicas. La derivación incl uye una sustitución de al menos un grupo amino, hidroxilo mercapto y/o carboxi lo de la molécula de fármaco con un enlazador tal como 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) y 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS), al cual se une un grupo de la porción de polietilenglicol (PEG). El enlace entre la porción de PEG y el fármaco no es directo, sino más bien ambos residuos se enlazan a diferentes posiciones de las estructuras de FMS o Fmoc de andamiaje que son altamente sensibles a las condiciones básicas. La presente invención se refiere a derivados de OXM en los cuales la vida media del péptido se prolonga utilizando la tecnología de pegilación reversible.
Breve descripción de la invención En una modalidad, la presente invención proporciona una composición que consiste de un agonista dual del receptor de GLP-1 /Glucagón enlazado o unido al polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) a través de 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
En otra modalidad, la presente invención proporciona además un método para reducir la ingesta de alimentos, reducir el peso corporal, o ambos en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto un agonista dual del receptor de GLP-1 /Glucagón conjugado con el polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) a través de un enlazador flexible, en donde el enlazador flexible es 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS). En otra modalidad, el enlazador es un enlazador escindible.
En otra modalidad, la presente invención proporciona además un método para inducir la tolerancia a la glucosa, mejorar el control glucémico, o ambos en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que consiste de un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón enlazado al polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) a través de 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS) y un portador farmacéutico aceptable.
En otra modalidad, la presente invención proporciona además un método para reducir la resistencia a la insulina en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón conjugado con el polímero de polietilenglicol (polímero de PEG).
En otra modalidad, la presente invención proporciona además un método para prolongar la vida media biológica de un agonista del receptor de GLP-1/Glucagón que consiste de la etapa de conjugar el agonista con el polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) a través de un enlazador flexible que comprende 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
En otra modalidad, la presente invención proporciona además un método para prolongar la vida media biológica de un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón, que consiste de la etapa de conjugar el agonista con el polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) a través de un enlazador flexible que comprende 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
En otra modalidad, la presente invención proporciona además un método para mejorar el área bajo la curva (AUC) de un agonista del receptor de GLP-1/Glucagón, que consiste de la etapa de conjugar un polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) con el amino terminal del agonista a través de 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
En otra modalidad, la presente invención proporciona además un método para reducir una frecuencia de dosificación de un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón, que consiste de la etapa de conjugar un polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) con el amino terminal de la oxintomodulina a través de 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para aumentar la sensibilidad a la insulina en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón conjugado con el polímero de polietilenglicol (polímero de PEG). En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para aumentar la sensibilidad a la insulina en un sujeto después del tratamiento agudo o tratamiento crónico, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón conjugado con el polímero de polietilenglicol (polímero de PEG).
Otras características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, ejemplos y figuras. Se debe entender, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican modalidades preferidas de la invención se dan a modo de ilustración solamente, puesto que diversos cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de esta descripción detallada.
Breve descripción de las figuras La Figura 1 es una gráfica que muestra el perfil farmacocinético de OXM, PEGio-Fmoc-OXM y PEG2o-Fmoc-OXM en ratas macho. Las ratas recibieron una inyección única de bolo SC de OXM nativa (62 nmol/kg), PEGio-Fmoc-OXM (que contiene 278 pg/kg de péptido OXM) o PEG2o-Fmoc-OXM (que contiene 62 nmol/kg de péptido OXM) en 0.5 mi de amortiguador de PBS. Las muestras de suero se recolectaron de la vena yugular en los puntos de tiempo especificados y la concentración de OXM se analizó utilizando el kit de Elisa de OXM (Bachem, Suiza).
Las Figuras 2A-B son gráficas que muestran el perfil farmacocinético de OXM y PEG4o-Fmoc-OXM en ratas macho. Las ratas recibieron una inyección única de bolo IV (Figura 2A) o SC (Figura 2B) de OXM nativa (62 nmol/kg) o PEG4o-Fmoc-OXM (que contiene 62 nmol/kg de péptido OXM por peso corporal) en 0.5 mi de amortiguador de PBS. Las muestras de suero se recolectaron de la vena yugular en los puntos de tiempo especificados y la concentración de OXM se analizó utilizando el kit de Elisa de OXM (Bachem , Suiza). El inserto de superposición resalta el perfil de OXM el cual es evidente en las primeras dos horas después de la administración.
La Figura 3 es una gráfica que muestra la actividad in vitro de OXM nativa, PEG4o-Fmoc-OXM y PEG4o-EMCS-OXM. Las células CHO-K1 que sobreexpresan el receptor de GLP-1 (Millipore HTS163C2) se sembraron en 96 cavidades de media área blancas a una densidad de 200.000 células/ml y se incubaron durante 24 horas a 37°C. Las células se incubaron con concentraciones crecientes de OXM (ALMAC), PEG40-EMCS-OXM y PEG40-Fmoc-OXM con o sin suero de rata al 1 % (Bio reclamation) . Las concentraciones de cAMP en las células se cuantificaron por ensayo HTRF (Cisbio 62AM4PEB) y el parámetro de EC50 se analizó por el software PRISM .
Las Figuras 4A-B son gráficas que muestran la inducción de la tolerancia a la glucosa en ratones con OXM nativa y P E G4o-Fmoc-OXM y P EG40-EMCS-OXM como se mide por la prueba de tolerancia a la glucosa IP (I PGTT). Los ratones C57BL/6 se mantuvieron en ayunas durante la noche y luego se inyectaron I P con PBS (vehículo), PEG40-Osu como control (546 nmol/kg), OXM nativa (333 nmol/kg) , PEG40-Fmoc-OXM (202 nmol/kg de contenido de péptido) y PEG40-EMCS-OXM (333 nmol/kg) . La glucosa (1 .5 gr/kg) se administró IP ya sea 15 min después de la administración del artículo de prueba (vehículo, OXM y P EG40-OSU) o 120 minutos después de la administración de P EG40-Fmoc-OXM. Los niveles de glucosa en sangre se midieron por muestreo en la vena de la cola antes de la administración de glucosa y 10, 20, 30, 60 y 120 min después de la administración de glucosa utilizando un glucómetro portátil. La gráfica (Figura 4A) proporciona el perfil de glucosa en la sangre y la gráfica (Figura 4B) muestra el AUC de la glucosa.
Las Figuras 5A-B son gráficas que muestran el efecto de administración SC de OXM (b.i.d) y PEG40-FMS-OXM (días 1, 3, 5, 7) en el peso corporal (Figura 5A) y la ingesta de alimentos acumulada (Figura 5B) en ratones C57BL/6J macho que presentan obesidad inducida por la dieta. Los datos son medias ajustadas (n = 10). Las SEM se calcularon de los residuos del modelo estadístico. Los ratones se dosificaron durante 7 días, iniciando en el Día 1. Los datos se analizaron por ANCOVA con el peso corporal en el Día 1 como covariable seguido por la prueba de Williams (OXM en PBS) o prueba t múltiple (sibutramina y PEG40-FMS-OXM) contra vehículo apropiado. Las diferencias significativas contra vehículo apropiado: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Los valores porcentuales indican la diferencia del grupo de vehículo apropiado en el Día 8 (es decir, después de 7 días de dosificación).
Las Figuras 6A-B es una gráfica que muestra el efecto de la administración SC de OXM (b.i.d) y OXM PEG40-EMCS-OXM pegilada covalentemente unida (1000 nmol/kg y 5000 nmol/kg en los Días 1, 4 y 7 u 8000 nmol/kg en los Días 1 y 7), PEG40-FMS-OXM (1000 nmol/kg y 5000 nmol/kg en los Días 1, 4 y 7 u 8000 nmol/kg en los Días 1 y 7) y PEG30-FMS-OXM (5000 nmol/kg en los Días 1, 4 y 7) en el peso corporal (Figura 6A) y la ingesta de alimentos (Figura 6B) en ratones C57BL/6J machos que presentan obesidad inducida por la dieta. Los datos son medias ajustadas (n = 10). Las SEM se calculan de los residuos del modelo estadístico. Los ratones fueron dosificados durante 7 días iniciando en el Día 1.
La Figura 7 muestra los efectos de la administración de OXM PEGilada reversible en el peso corporal en Ratones con Obesidad Inducida por la Dieta (DIO). Durante la primera semana del alojamiento único (período de manejo), los animales comenzaron un protocolo de manejo una vez al día y durante la segunda semana (período de valor basal), se les dosificó el vehículo apropiado b.i.d. una vez a la semana, ya que se les dosificó durante el período de tratamiento) por una ruta subcutánea. 7 grupos (n = 8) de ratones DIO fueron dosificados durante 29 días como sigue: A. PEG40-SH (662 mg/kg), B. PEG40-EMCS-OXM (6,000 nmol/kg), C. PEG30-EMCS-OXM (6000 nmol/kg), D. PEG40-FMS-OXM (6,000 nmol/kg), E. PEG30-FMS-OXM (6,000 nmol/kg), F. Vehículo (PBS), y G. OXM (6,000 nmol/kg; PBS). Durante el valor basal y el período de tratamiento, se registraron diariamente la ingesta de alimentos, ingesta de agua y peso corporal. La administración semanal de PEG40-FMS-OXM o PEG30-FMS-OXM redujo significativamente el peso corporal en Ratones con Obesidad Inducida por la Dieta (DIO).
La Figura 8 muestra los efectos agudos de la administración de OXM PEGilada reversible en la tolerancia a la glucosa en Ratones con Obesidad Inducida por la Dieta (DIO). En el día 1 después del inicio de la administración del fármaco o vehículo, todos los ratones se mantuvieron en ayunas durante la noche. En el día 2, los ratones se sometieron a una prueba oral de tolerancia a la glucosa (OGTT). Cada animal se dosificó con vehículo o compuesto de prueba y 60 minutos más tarde se dosificaron con D-glucosa (2 g/kg por vía oral). Las muestras de sangre básales se tomaron inmediatamente antes de la dosificación con vehículo o compuesto de prueba (B1) e inmediatamente antes de la carga de glucosa (B2). Las muestras de sangre adicionales se tomaron 10, 20, 30, 45, 60 y 120 minutos después de la administración de glucosa. Todas las muestras de sangre (aproximadamente 20 µ?) se tomaron de la vena de la cola. Las muestras de plasma se prepararon y sometieron a ensayo para la glucosa (n = 2) e insulina (n = 1) utilizando el reactivo de glucosa Thermoelectron Infinity (TR15421) y ELISA de insulina de ratón ultrasensible Alpco (80-INSMSU-E10), respectivamente.
Las Figuras 9A-D muestran los efectos de la administración de OXM PEGilada reversible en glucosa terminal, glicerol, colesterol e insulina en Ratones con Obesidad Inducida por la Dieta (DIO). Se recolectaron muestras de plasma terminal (24 horas después de la dosis final del compuesto de prueba o de control en el día 29) por punción cardiaca y se sometieron a ensayo para la insulina, glucosa y colesterol utilizando ELISA de insulina de ratón ultrasensible (80-INSMSU-E10), reactivo de glucosa Thermoelectron Infinity (TR15421) y Reactivo de colesterol Thermoelectron Infinity (TR13421).
Las Figuras 10A-D muestra los efectos de la administración de OXM PEGilada reversible en el análisis de la composición de cuerpo de terminal de la grasa, agua, proteínas y cenizas (hueso) en Ratones con Obesidad I nducida por la Dieta (DIO). Los niveles de la grasa corporal (Figura 10A), agua (Figura 1 0B), proteínas (Figura 10C), y cenizas (Figura 1 0D) de los cadáveres de ratones DIO se determinaron utilizando técnicas de análisis químico estándares. Los grupos de tratamiento fueron como sigue: A. PEG40-SH (662 mg/kg), B. PEG40-EMCS-OXM (6,000 nmol/kg), C. PEG30-EMCS-OXM (6,000 nmol/kg), D. PEG40-FMS-OXM (6,000 nmol/kg) , E. PEG30-FMS-OXM (6,000 nmol/kg), F. Vehículo (PBS), y G. OXM (6,000 nmol/kg; PBS) .
La Figura 1 1 muestra que la administración de variantes de PEG-OXM PEG40-EMCS-OXM, PEG30-EMCS-OXM, PEG40-FMS-OXM , PEG30-FMS-OXM produjo reducciones marcadas y significativas en la glucosa en ayunas e insulina en plasma en ayunas en comparación con los controles.
La Figura 12 muestra que la administración de variantes de PEG-OXM PEG30-FMS-OXM, PEG40-FMS-OXM y PEG60-FMS-OXM produjo reducciones marcadas y significativas en la glucosa en ayunas e insulina en plasma en ayunas en comparación con los controles.
La Figura 1 3 muestra que la administración de variantes de PEG-OXM PEG5-FMS-OXM, PEG30-FMS-OXM, PEG40-FMS-OXM y PEG60-FMS-OXM produjo reducciones marcadas y significativas en el peso corporal en comparación con los controles.
Descripción detallada de la invención En una modalidad, la presente invención proporciona un agonista dual del receptor de GLP-1 /glucagón de acción prolongada y métodos de producción y uso del mismo. En otra modalidad, la presente invención proporciona una oxintomodulina de acción prolongada y métodos de producción y uso de la misma. En una modalidad, un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón de acción prolongada es una composición que comprende o que consiste de oxintomodulina, polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS). En otra modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada es una composición que comprende o que consiste de oxintomodulina, polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS). En otra modalidad, la presente invención proporciona un péptido oxintomodulina modificado que comprende un péptido oxintomodulina, un polímero de polietilenglicol (PEG), y un 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS). En otra modalidad, la presente invención proporciona un péptido oxintomodulina modificado que consiste de un péptido oxintomodulina, un polímero de polietilenglicol (PEG), y un 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS). En una modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada es una composición que comprende o que consiste de oxintomodulina y polímero de polietilenglicol (polímero de PEG).
En una modalidad, los términos "agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón" y "agonista" se utilizan indistintamente en la presente. En otra modalidad, los términos también incluyen cualquier agonista del receptor de GLP-1/Glucagón conocido en la técnica. En otra modalidad, el agonista preferido es oxintomodulina u OXM o una variante funcional de la misma.
En una modalidad, el término "funcional" se refiere a la capacidad del agonista u OXM proporcionada en la presente para tener actividad biológica, que incluyé pero no se limita a, reducción de peso, aumento de sensibilidad a la insulina, etc., como se proporciona adicionalmente en la presente.
En otra modalidad, un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón de acción prolongada es una oxintomodulina pegilada. En otra modalidad, un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón de acción prolongada es una oxintomodulina pegilada invertida. En otra modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada es una oxintomodulina pegilada. En otra modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada es una oxintomodulina pegilada invertida. En otra modalidad, las frases "oxintomodulina de acción prolongada", "oxintomodulina pegilada invertida", "OXM PEGilada reversible", y "una composición que comprende o que consiste de oxintomodulina, polímero de polietllenglicol (polímero de PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS)" se utilizan indistintamente. En otra modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada es OXM enlazada a PEG a través de Fmoc o FMS.
En una modalidad, un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón de acción prolongada proporcionado en la presente comprende un polímero de PEG. En otra modalidad, el agonista comprende un polímero de PEG conjugado con el amino terminal de un péptido oxintomodulina a través de Fmoc o FMS. En otra modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada de la invención comprende un polímero de PEG. En otra modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada de la invención comprende un polímero de PEG conjugado con el amino terminal de un péptido oxintomodulina a través de Fmoc o FMS.
En otra modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada es una composición que comprende o que consiste de oxintomodulina, polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS) en una relación molar de 1:0.2-10:0.2-10. En otra modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada es una composición que comprende o que consiste de oxintomodulina, polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS) en una relación molar de 1:0.5-2:0.5-2. En otra modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada es una composición que comprende o que consiste de oxintomodulina, polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS) en una relación molar de 1:1:1. En otra modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada incluye un polímero de PEG conjugado con el amino terminal de oxintomodulina a través de Fmoc o FMS.
En una modalidad, un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón de acción prolongada se enlaza a PEG a través de un enlazador reversible tal como, pero no limitado a, Fmoc y FMS. En otra modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada se enlaza a PEG a través de un enlazador reversible tal como, pero no limitado a, Fmoc y FMS. En otra modalidad, Fmoc y FMS son sensibles a las bases y son removibles bajo condiciones fisiológicas. En otra modalidad, un enlazador reversible es un enlazador que es sensible a las bases y es removible bajo condiciones fisiológicas. En otra modalidad, un enlazador reversible es un enlazador que es sensible a las bases y es removible bajo condiciones fisiológicas en la sangre, plasma, o linfa. En otra modalidad, un enlazador reversible es un enlazador que es sensible a las bases y es removible bajo condiciones fisiológicas en un fluido corporal. En otra modalidad, un enlazador reversible es un enlazador que es removible en un fluido corporal que tiene un pH básico. En otra modalidad, un enlazador que es sensible a las bases se escinde en la exposición a un ambiente básico liberando así la OXM del enlazador y PEG.
En otra modalidad, una oxintomodulina pegilada inversa es una composición en donde la OXM se enlaza a PEG a través de un enlazador reversible. En otra modalidad, una oxintomodulina pegilada inversa libera la OXM libre en la exposición a un ambiente básico. En otra modalidad, una oxintomodulina pegilada inversa libera la OXM libre en la exposición a la sangre o plasma. En otra modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada comprende PEG y oxintomodulina que no se enlazan directamente entre sí, como en los procedimientos de pegilación estándar, sino más bien ambos residuos se enlazan a diferentes posiciones de Fmoc o FMS que son altamente sensibles a las bases y son removibles bajo condiciones fisiológicas regulares. En otra modalidad, las condiciones fisiológicas regulares incluyen un ambiente fisiológico tal como la sangre o plasma.
En una modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada es conjugada no reversiblemente a PEG utilizando EMCS (ver ejemplo 3).
En otra modalidad, las estructuras y los procesos para producir Fmoc y FMS se describen en la Patente de Estados Unidos No. 7585837. La descripción de la Patente de Estados Unidos No. 7585837 se incorpora en la presente para referencia en su totalidad.
En otra modalidad, la pegilación inversa vuelve a la OXM una OXM de acción prolongada. En otra modalidad, la oxintomodulina de acción prolongada es una oxintomodulina con una vida media biológica prolongada.
En una modalidad, la pegilación inversa proporciona protección contra la degradación de un agonista dual del receptor de GLP-1 /Glucagón. En otra modalidad, la pegilación inversa proporciona protección contra la degradación de OXM. En otra modalidad, la pegilación inversa afecta a la Cmáx de OXM para reducir los efectos secundarios dañinos. En otra modalidad, la pegilación inversa extiende la Tmáx de OXM. En otra modalidad, la pegilación inversa extiende la vida media circulatoria de OXM. En otra modalidad , la OXM pegilada inversa tiene biodisponibllidad mejorada en comparación con la OXM no modificada. En otra modalidad, la OXM pegilada inversa tiene actividad biológica mejorada en comparación con la OXM no modificada. En algunas modalidades, la pegilación inversa mejora la potencia de la OXM.
En otras modalidades, una OXM pegilada inversa es al menos equivalente a la OXM no modificada, en términos de medidas bioquímicas. En otras modalidades, una OXM pegilada inversa es al menos equivalente a la OXM no modificada, en términos de las medidas farmacológicas. En otras modalidades, una OXM pegilada inversa es al menos equivalente a la OXM no modificada, en términos de capacidad de unión (Kd). En otras modalidades, una OXM pegilada inversa es al menos equivalente a la OXM no modificada, en términos de absorción a través del sistema digestivo. En otras modalidades, una OXM pegilada inversa es más estable durante la absorción a través del sistema digestivo que la OXM no modificada.
En otra modalidad, un agonista dual del receptor de GLP- 1/Glucagón pegilado inverso exhibe área de sangre bajo los niveles de curva (AUC) mejorada en comparación con el agonista libre. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa exhibe área de sangre bajo los niveles de curva (AUC) mejorada en comparación con la OXM libre. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa exhibe actividad biológica y área de sangre bajo los niveles de curva (AUC) mejoradas en comparación con la OXM libre. En otra modalidad, un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón pegilado inverso exhibe tiempo de retención de la sangre mejorado (ti 2) en comparación con la OXM libre. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa exhibe tiempo de retención de la sangre mejorado (ti 2) en comparación con la OXM libre. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa exhibe actividad biológica y tiempo de retención de la sangre mejorados (ti/2) en comparación con la OXM libre. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa exhibe niveles de Cmáx en la sangre mejorados en comparación con la OXM libre, reduciendo así los efectos secundarios potencialmente dañinos. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa exhibe actividad biológica mejorada en comparación con la OXM libre. En otra modalidad, en la presente se proporciona un método para mejorar el AUC , Cmáx, 12 , actividad biológica de la OXM, o cualquier combinación de los mismos que comprende o que consiste de la etapa de conjugar un polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) con el amino terminal de la OXM libre a través de 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS). Por lo tanto, en una modalidad, la presente invención proporciona además un método para mejorar el área bajo la curva (AUC) de la oxintomodulina, que consiste de la etapa de conjugar un polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) con el amino terminal de la oxintomodulina a través de 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
En una modalidad, la actividad agonista de GLP- 1 o glucagón de cualquier péptido análogo del glucagón dado se puede cuantificar determinando un valor de EC50 para ese péptido en un ensayo seleccionado para la actividad de GLP-1 o glucagón. Como el experto en la técnica estará consciente, el valor de EC50 es una medida de la concentración a la cual se logra la mitad de ésta actividad máxima del compuesto en el ensayo particular. En esta especificación, el valor de EC50 en un ensayo para la actividad agonista de GLP-1 o glucagón será referido como ECso[GLP-1 ] y ECso[Glu] respectivamente. Donde se comparan valores de EC50 de diferentes compuestos, se entenderá que describen la actividad de los compuestos relevantes en el mismo ensayo bajo condiciones de otro modo idénticas.
La relación de EC5o[Glu]/EC5o[GLP-1 ] para el péptido análogo del glucagón puede ser mayor que la relación de EC5o[Glu]/EC5o[GLP-1 ] para el glucagón. Esto se puede interpretar en el sentido de que el péptido análogo del glucagón tiene una mayor selectividad para el receptor de GLP-1 que el glucagón.
En otra modalidad, la mejora del AUC, Cmáx , 12 , actividad biológica de OXM, o cualquier combinación de los mismos conjugando un polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) con el amino terminal de OXM libre a través de 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS) permite la reducción de la frecuencia de dosificación de OXM . En otra modalidad, en la presente se proporciona un método para reducir una frecuencia de dosificación de OXM, que comprende o que consiste de la etapa de conjugar un polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) con el amino terminal o residuos lisina de OXM a través de 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS). En otra modalidad, la pegilación inversa de OXM es ventajosa al permitir que se utilicen dosificaciones inferiores.
En otra modalidad, la OXM comprende la secuencia de aminoácidos de SEC I D NO: 1 . En otra modalidad, la OXM consiste de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1. En otra modalidad, la SEC ID NO: 1 comprende o consiste de la siguiente secuencia de aminoácidos (AA): HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA (SEC ID NO: 1). En otra modalidad, la OXM comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos representada en CAS No. 62340-29-8.
En otra modalidad, la OXM es OXM humana o cualquier OXM de mamífero. En otra modalidad, la OXM también es referida como glucagón-37 o enteroglucagón bioactivo. En otra modalidad, la OXM es un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón. En otra modalidad, la OXM es un fragmento biológicamente activo de la OXM. En otra modalidad, la OXM biológicamente activa se extiende desde el aminoácido 30 al aminoácido 37 de SEC ID NO: 1. En otra modalidad, la OXM biológicamente activa se extiende desde el aminoácido 19 al aminoácido 37 de SEC ID NO: 1. En otra modalidad, la OXM de la invención corresponde a un octapéptido del cual se suprimen los dos aminoácidos C-terminales. En otra modalidad, la OXM de la invención corresponde a cualquier fragmento de la SEC ID NO: 1 que retiene la actividad de OXM como se describe en la presente.
En una modalidad, la OXM se refiere a un péptido homólogo del péptido de SEC ID NO: 1. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de OXM de la presente invención es al menos 40% homologa a la secuencia de OXM descrita en la SEC ID NO: 1 como se determina utilizando el software BlastP del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) utilizando los parámetros por defecto. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de OXM de la presente invención es al menos 50% homóloga a la secuencia de OXM descrita en la S EC I D NO: 1 como se determina utilizando el software BlastP del NCBI utilizando los parámetros por defecto. En una modalidad , la secuencia de am inoácidos de OXM de la presente invención es al menos 60% homóloga a la secuencia de OXM descrita en la SEC I D NO: 1 como se determ ina utilizando el software BlastP del NCBI utilizando los parámetros por defecto. En una modalidad , la secuencia de aminoácidos de OXM de la presente i nvención es al menos 70% homóloga a la secuencia de OXM descrita en la SEC I D NO: 1 como se determina utilizando el software BlastP del NCBI utilizando los parámetros por defecto. En una modalidad , la secuencia de am inoácidos de OXM de la presente invención es al menos 80% homóloga a la secuencia de OXM descrita en la SEC I D NO: 1 como se determina util izando el software BlastP del NCBI utilizando los parámetros por defecto.
En una modalidad , la secuencia de am inoácidos de OXM de la presente invención es al menos 90% homóloga a la secuencia de OXM descrita en la SEC I D NO: 1 como se determina uti l izando el software BlastP del NC BI uti lizando los parámetros por defecto. En una modalidad , la secuencia de aminoácidos de OXM de la presente invención es al menos 95% homóloga a la secuencia de OXM descrita en la SEC I D NO: 1 como se determina utilizando el software BlastP del NCBI utilizando los parámetros por defecto.
En comparación con la OXM tipo silvestre, los derivados de OXM o variantes de la presente invención contienen varias sustituciones de aminoácidos, y/o se pueden PEGilar o modificar de otro modo (por ejemplo, recombinante o químicamente).
La OXM proporcionada en la presente también cubre cualquier análogo de la secuencia de OXM anterior. Uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia se pueden remplazar de forma independiente con un remplazo conservador como es bien conocido en la técnica es decir, remplazando un aminoácido con uno de un tipo químico similar tal como remplazando un aminoácido hidrófobo con otro. Alternativamente, se pueden hacer mutaciones de aminoácidos no conservadoras que resultan en un efecto o actividad biológica mejorada de OXM. En particular, la OXM se modifica para ser resistente a la escisión e inactivación por la dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV) Los derivados, y variantes de OXM y métodos para generar los mismos se describen en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos No. 2011/0152182, Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos No. 2011/0034374, Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos No. 2010/0144617, todas las cuales se incorporan para referencia en la presente.
En una modalidad, el agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón proporcionado en la presente se puede modificar químicamente. En otra modalidad, la OXM proporcionada en la presente se puede modificar químicamente. En particular, se pueden modificar las cadenas laterales de aminoácidos, el amino terminal y/o el ácido carboxi terminal de OXM. Por ejemplo, la OXM puede someterse a una o más de alquilación, formación de disulfuro, formación de complejos de metal, acilación, esterificación, amidación, nitración, tratamiento con ácido, tratamiento con base, oxidación o reducción. Los métodos para realizar estos procesos son bien conocidos en la técnica. En particular, la OXM se proporciona como un éster de alquilo inferior, una amida de alquilo inferior, una amida de dialquilo inferior, una sal de adición de ácido, una sal de carboxilato o una sal de adición de álcali de los mismos. En particular, los extremos terminales amino o carboxílico de la OXM se pueden derivar, por ejemplo, por esterificación, amidación , acilación, oxidación o reducción. En particular, el extremo term inal carboxílico de la OXM se puede derivar para formar una porción amida.
En una modalidad, el agonista dual del receptor de GLP- 1 /Glucagón de acción prolongada de la invención mantiene la actividad biológica del agonista no modificado. En otra modalidad, la OXM de la invención mantiene la actividad biológica de la OXM no modificada. En una modalidad, la OXM de acción prolongada de la invención mantiene la actividad biológica de OXM no modificada. En otra modalidad, la OXM de acción prolongada de la invención comprende la actividad biológica de OXM. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende la reducción de las secreciones digestivas. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende la reducción y retraso del vaciado gástrico. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende la inhibición del patrón de motilidad de alimentos en el intestino delgado. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende la inhibición de la secreción de ácido estimulada por pentagastrina. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende un aumento de la liberación de somatostatina gástrica. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende la potenciación de los efectos del péptido YY. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende la inhibición de la liberación de grelina. En otra modalidad, la actividad biológica de la OXM de acción prolongada de la invención comprende la sobrerregulación de la adiponectina. En otra modalidad, la actividad biológica de la OXM de acción prolongada de la invención comprende la reducción de los ácidos grasos libres. En otra modalidad, la actividad biológica de la OXM de acción prolongada de la invención comprende la reducción de los triglicéridos. En otra modalidad, la actividad biológica de la OXM de acción prolongada de la invención comprende la reducción del colesterol. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende la estimulación de la acumulación de aminopirina y la producción de cAMP. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende la unión del receptor de GLP-1 o el receptor de glucagón. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende la estimulación de la producción de H+ activando la adenilato ciclasa. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende la inhibición de la secreción de ácido gástrico estimulada por histamina. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende la inhibición de la ingesta de alimentos. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende la estimulación de la liberación de insulina. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende la inhibición de la secreción pancreática exocrina. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende el aumento de la sensibilidad a la insulina. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende la reducción de los niveles de glucosa.
En una modalidad, los términos "reducción del nivel de" se refiere a una reducción de aproximadamente 1 - 10% con relación a un nivel original, tipo silvestre, normal o de control. En otra modalidad, la reducción es de aproximadamente 11-¦20%. En otra modalidad, la reducción es de aproximadamente 21-¦30%. En otra modalidad, la reducción es de aproximadamente 31-¦40%. En otra modalidad, la reducción es de aproximadamente 41-¦50%. En otra modalidad, la reducción es de aproximadamente 51-¦60%. En otra modalidad, la reducción es de aproximadamente 61-¦70%. En otra modalidad, la reducción es de aproximadamente 71-¦80%. En otra modalidad, la reducción es de aproximadamente 81-¦90%. En otra modalidad, la reducción es de aproximadamente 91-¦95%. En otra modalidad, la reducción es de aproximadamente 96-100%.
En una modalidad, los términos "aumento del nivel de" "prolongación" se refiere a un aumento de aproximadamente 1-10% con relación a un nivel original, tipo silvestre, normal o de control. En otra modalidad, el aumento es de aproximadamente 11 -20%. En otra modalidad, el aumento es de aproximadamente 21 -30%. En otra modalidad, el aumento es de aproximadamente 31 -40%. En otra modalidad, el aumento es de aproximadamente 41 -50%. En otra modalidad, el aumento es de aproximadamente 51 -60%. En otra modalidad, el aumento es de aproximadamente 61 -70%. En otra modalidad, el aumento es de aproximadamente 71 -80%. En otra modalidad, el aumento es de aproximadamente 81 -90%. En otra modalidad, el aumento es de aproximadamente 91 -95%. En otra modalidad, el aumento es de aproximadamente 96-100%.
En otra modalidad, la presente invención proporciona además un método para inducir la tolerancia a la glucosa, mejorar el control glucémico, o ambos en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que consiste de un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón enlazado al polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) a través de 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (F S) y un portador farmacéutico aceptable.
En otra modalidad, la presente invención proporciona además un método para inducir la tolerancia a la glucosa, mejorar el control glucémico, o ambos en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que consiste de una oxintomodulina enlazada al polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) a través de 9- fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS) y un portador farmacéutico aceptable.
En una modalidad, la presente invención proporciona además un método para prolongar la vida media biológica de un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón, que consiste de la etapa de conjugar el agonista con el polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) a través de un enlazador flexible que comprende 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
En una modalidad, la presente invención proporciona además un método para prolongar la vida media biológica de la oxintomodulina, que consiste de la etapa de conjugar la oxintomodulina, un polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS) en una relación molar de aproximadamente 1:1:0.5 a aproximadamente 1:1:3.5. En otra modalidad, la relación molar es 1:1:10 OXM a PEG a enlazador. En otra modalidad, el intervalo es 1:1:5-1:1:9, En otra modalidad, el intervalo es 1:1:3.7-1:1-4.9.
En otra modalidad, la presente invención proporciona además un método para reducir la ingesta de alimentos, reducir el peso corporal, o ambos en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón conjugado con el polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) a través de un enlazador flexible, en donde el enlazador flexible es 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS). En otra modalidad, el sujeto está afectado por la diabetes. En otra modalidad, el sujeto tiene sobrepeso. En otra modalidad, el sujeto está afectado por la obesidad.
En otra modalidad, la presente invención proporciona además un método para reducir la ingesta de alimentos, reducir el peso corporal, o ambos en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto oxintomodulina conjugada con el polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) a través de un enlazador flexible, en donde el enlazador flexible es 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS). En otra modalidad, el sujeto está afectado por la diabetes. En otra modalidad, el sujeto tiene sobrepeso. En otra modalidad, el sujeto está afectado por la obesidad.
En una modalidad, los compuestos de PEG-OXM proporcionados en la presente inducen una reducción significativa del nivel de glucosa sin aumentar el nivel de insulina. En otra modalidad, los compuestos de PEG-OXM proporcionados en la presente reducen inesperadamente los niveles de glucosa junto con la reducción de los niveles de insulina en ayunas después de la administración de una dosis única de los compuestos de PEG-OXM (ver Ejemplo 7, en la presente). Por lo tanto, en otra modalidad, la presente invención proporciona un método para aumentar la sensibilidad a la insulina en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón conjugado con el polímero de polietilenglicol (polímero de PEG). En otra modalidad, la presente invención muestra de forma inesperada un marcado aumento de la sensibilidad a la insulina después del tratamiento agudo en un sujeto con la composición de agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón proporcionada en la presente (ver Ejemplo 7). En otra modalidad, el agonista se conjuga con el polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) a través de un enlazador. En otra modalidad, el agonista es OXM. En otra modalidad, el enlazador es un enlazador flexible. En otra modalidad, el enlazador es 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (F S). En otra modalidad, el enlazador es un enlazador no escindible. En otra modalidad, el enlazador es éster de ?-(e-Maleimidocaproiloxi)succinimida (EMCS).
En otra modalidad, la actividad biológica de un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón de acción prolongada de la invención comprende la inhibición de la secreción pancreática a través de un mecanismo indirecto de los nervios vagos. En otra modalidad, la actividad biológica de un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón de acción prolongada de la invención comprende la reducción del transporte hidromineral a través del intestino delgado. En otra modalidad, la actividad biológica de un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón de acción prolongada de la invención comprende la estimulación de la captación de glucosa. En otra modalidad, la actividad biológica de un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón de acción prolongada de la invención comprende el control/estimulación de la secreción de somatostatina. En otra modalidad, la actividad biológica de un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón de acción prolongada de la invención comprende la reducción tanto de la ingesta de alimentos como la ganancia de peso corporal. En otra modalidad, la actividad biológica de un agonista dual del receptor de GLP-1 /Glucagón de acción prolongada de la invención comprende la reducción de la adiposidad. En otra modalidad, la actividad biológica de un agonista dual del receptor de GLP-1 /Glucagón de acción prolongada de la invención comprende la supresión del apetito. En otra modalidad, la actividad biológica de un agonista dual del receptor de GLP-1 /Glucagón de acción prolongada de la invención comprende la inducción de la anorexia. En otra modalidad, la actividad biológica de un agonista dual del receptor de GLP-1 /Glucagón de acción prolongada de la invención comprende la reducción del peso corporal en sujetos con sobrepeso y obesos. En otra modalidad, la actividad biológica de un agonista dual del receptor de GLP-1 /Glucagón de acción prolongada de la invención comprende la inducción de cambios en los niveles de las hormonas adiposas leptina y adiponectina. En otra modalidad, la actividad biológica de un agonista dual del receptor de GLP-1 /Glucagón de acción prolongada de la invención comprende el aumento del gasto de energía además de la disminución de la ingesta de energía en sujetos con sobrepeso y obesos. En otra modalidad, la actividad biológica de un agonista dual del receptor de GLP-1 /Glucagón de acción prolongada de la invención comprende la disminución de los triglicéridos en plasma y cuerpos cetónicos aumentados.
En una modalidad, la actividad biológica de un agonista dual del receptor de GLP-1 /Glucagón de acción prolongada de la invención, después del tratamiento agudo comprende la disminución de los triglicéridos en plasma y cuerpos cetónicos aumentados. En otra modalidad, la actividad biológica de un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón de acción prolongada de la invención, después del tratamiento agudo comprende el aumento de la expresión de los genes gluconeogénicos Pck1, Pgda, y Pdhal. En otra modalidad, la actividad biológica de un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón de acción prolongada de la invención, después del tratamiento agudo comprende la disminución de conjuntos hepáticos de acetil-CoA, el principal producto de la descarboxilación de piruvato, y malonil-CoA. En otra modalidad, la actividad biológica de un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón de acción prolongada de la invención, después del tratamiento agudo comprende la sobrerregulacton de los genes que inducen la oxidación de ácidos grasos (FAO) en el hígado, incluyendo Fgf21 y Cptla. En otra modalidad, la actividad biológica de un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón de acción prolongada de la invención, después del tratamiento agudo comprende la regulación negativa de los genes lipogénicos como ChREBP. En otra modalidad, la actividad biológica de un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón de acción prolongada de la invención, después del tratamiento agudo comprende la sobrerregulación del gene Ldlr.
En una modalidad, la actividad biológica de un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón de acción prolongada de la invención, después del tratamiento crónico comprende la disminución de los niveles de leptina. En otra modalidad, la actividad biológica de un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón de acción prolongada de la invención, después del tratamiento crónico comprende el aumento de los niveles de B-hidroxibutirato.
En otra modalidad, un polímero de PEG se une al amino terminal o residuo lisina de la oxintomodulina a través de Fmoc o FMS. En otra modalidad, los términos "unido" y "enlazado" se utilizan indistintamente. En otra modalidad, el polímero de PEG se enlaza a la cadena lateral a-amino de OXM. En otra modalidad, el polímero de PEG se enlaza a la cadena lateral e-amino de OXM. En otra modalidad, el polímero de PEG se enlaza a una o más cadenas laterales e-amino de OXM. En otra modalidad, el polímero de PEG comprende una porción de sulfhidrilo.
En otra modalidad, el PEG es lineal. En otra modalidad, el PEG es ramificado. En otra modalidad, el PEG tiene un peso molecular en el intervalo de 200 a 200,000 Da. En otra modalidad, el PEG tiene un peso molecular en el intervalo de 5,000 a 80,000 Da. En otra modalidad, el PEG tiene un peso molecular en el intervalo de 5,000 a 40,000 Da. En otra modalidad, el PEG tiene un peso molecular en el intervalo de 20,000 Da a 40,000 Da.
En otra modalidad, una OXM de acción prolongada se prepara utilizando agentes de PEGilación, lo que significa cualquier derivado de PEG el cual es capaz de reaccionar con un grupo funcional tal como, pero no limitado a, NH2, OH, SH, COOH, CHO, -N=C=0, -N=C=S, -S02CI, -S02CH=CH2, -P02CI, -(CH2)xHal, presente en el anillo de fluoreno de la porción de Fmoc o FMS. En otra modalidad, el agente de PEGilación se utiliza generalmente en su forma mono-metoxilada donde sólo un grupo hidroxilo en un extremo terminal de la molécula de PEG está disponible para la conjugación. En otra modalidad, una forma bifuncional de PEG, donde se pueden utilizar ambos extremos terminales están disponibles para la conjugación si, por ejemplo, se desea obtener un conjugado con dos residuos de péptido o proteína unidos covalentemente a una porción de PEG única.
En otra modalidad, los PEG ramificados son representados como R(PEG-OH)m en la cual R representa una porción de núcleo central tal como pentaeritritol o glicerol, y m representa el número de brazos de ramificación. El número de brazos de ramificación (m) puede variar de tres a cien o más. En otra modalidad, los grupos hidroxilo están sujetos a modificación química. En otra modalidad, las moléculas de PEG ramificado se describen en las Patentes de Estados Unidos No. 6,113,906, No. 5,919,455, No. 5,643,575, y No. 5,681,567, las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad.
En una modalidad, el agonista del receptor de GLP-1/Glucagón es oxintomodulina. En otra modalidad, el agonista del receptor de GLP-1/Glucagón es una variante de la oxintomodulina.
En otra modalidad, la presente invención proporciona OXM con una porción de PEG que no se une directamente a la OXM, como en el procedimiento de pegilación estándar, sino más bien la porción de PEG se une a través de un enlazador tal como Fmoc o FMS. En otra modalidad, el enlazador es altamente sensible a las bases y es removible bajo condiciones básicas moderadas. En otra modalidad, la OXM conectada a PEG a través de Fmoc o FMS es eq uivalentemente activa a la OXM libre. En otra modalidad , la OXM conectada a PEG a través de Fmoc o FMS es más activa que la OXM l ibre. En otra modalidad , la OXM conectada a PEG a través de Fmoc o FMS comprende d iferente actividad que la OXM l ibre. En otra modalidad , la OXM conectada a PEG a través de Fmoc o FMS a diferencia de la libre OXM , tiene actividad del sistema nervioso central. En otra modalidad , la OXM PEG ilada reversible cruza la barrera hemato-encefálica y actúa sobre el hipotálamo para ejercer las actividades biológicas proporcionadas en la presente. En otra modalidad , la OXM conectada a PEG a través de Fmoc o FMS a diferencia de la OXM libre, no puede entrar en el cerebro a través de la barrera hemato-encefálica . En otra modalidad , la OXM conectada a PEG a través de Fmoc o FMS comprende vida media de circulación prolongada en comparación con la OXM libre. En otra modalidad, la OXM conectada a PEG a través de Fmoc o FMS pierde su porción de PEG j unto con la porción de Fmoc o FMS recuperando así la OXM libre.
En otra modalidad , la presente invención proporciona un compuesto de la fórmula : (X)n-Y, en donde Y es una porción de OXM que porta un amino libre, carboxilo, o hidroxi lo y X es un radical de fórmula (i) : En otra modalidad, Ri es un radical que contiene una porción portadora de proteína o polímero; porción de polietilenglicol (PEG); R2 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo, alcoxi, alcoxialquilo, arilo, alcarilo, aralquilo, halógeno, nitro, -SO3H, -S02NHR, amino, amonio, carboxilo, PO3H2, y OPO3H2; R se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo y arilo; R3 y RA, los mismos o diferentes, se seleccionan cada uno del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo y arilo; A es un enlace covalente cuando el radical se enlaza a un grupo amino o hidroxilo de la OXM-Y; n es un número entero de al menos uno, y sales de los mismos farmacéuticamente aceptables.
En otra modalidad, los términos "alquilo", "alcoxi", "alcoxialquilo", "arilo", "alcarilo" y "aralquilo" se utilizan para denotar radicales alquilo de 1-8, preferiblemente 1-4 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo y butilo, y radicales arilo de 6-10 átomos de carbono, por ejemplo fenilo y naftilo. El término "halógeno" incluye bromo, fluoro, cloro y yodo.
En otra modalidad, R2, R3 y R4 son cada uno hidrógeno y A es -OCO-, principalmente el radical 9-fluorenilmetoxicarbonilo (después "Fmoc"). En otra modalidad, R es -S03H en la posición 2 del anillo de fluoreno, R3 y R4 son cada uno hidrógeno, y A es -OCO-, principalmente el radical 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (después "FMS").
En otra modalidad, la pegilación de OXM y preparación de los conjugados de (PEG-Fmoc)n-OXM o (PEG-FMS)n-OXM incluye la unión de MAL-FMS-NHS o MAL-Fmoc-NHS al componente amina de OXM, obteniendo así un conjugado de MAL-FMS-OXM o MAL-Fmoc- OXM, y luego sustituyendo PEG-S H por la porción de maleimida , produciendo el conjugado (PEG-FMS)n-OXM o (PEG-Fmoc)n-OXM , respectivamente.
En otra modalidad , la pegilación de OXM incluye hacer reaccionar MAL-FMS-N HS o MAL-Fmoc-N HS con PEG-SH, formando de esta manera un conjugado de PEG-FMS-N HS o PEG-Fmoc-N HS , y luego haciéndolo reaccionar con el componente amina de OXM resultante en el conjugado de (PEG-FMS) n-OXM o (PEG-Fmoc)n-OXM deseado, respectivamente. En otra modalidad , la pegilación de péptidos/proteinas tal como la OXM se describen en la Patente de Estados Unidos No. 7585837 , la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad . En otra modalidad , la pegilación inversa de péptidos/proteinas tal como la OXM con Fmoc o FMS se describen en la Patente de Estados Unidos No. 7585837.
En otra modalidad , las frases "OXM de acción prolongada" y "OXM pegilada inversa" se utilizan i ndistintamente. En otra modalidad , la OMX pegilada inversa se compone de PEG-FMS-OXM y PEG-Fmoc-OXM en la presente identificada por las fórmulas: (PEG-FMS)n-OXM o (PEG-Fmoc)n-OXM , en donde n es un número entero de al menos uno, y OXM se enlaza al radical FMS o Fmoc a través de al menos u n grupo amino.
En otra modalidad , sorprendentemente, la OXM de acción prolongada descrita en la presente es tanto activa en su forma pegilada como en su forma periférica . En otra modalidad , sorprendentemente, la construcción de (PEG-FMS)n-OXM o (PEG-Fmoc)n-OXM no vuelve inactivo a éste conj ugado. En otra modal idad , de manera sorprendente, la construcción de (PEG-FMS)n-OXM o (PEG-Fmoc)n-OXM no vuelve inactiva a la OXM.
Usos Terapéuticos En otra modalidad, PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden se utilizan para la prevención de la hiperglucemia, para mejorar el control glucémico, para el tratamiento de la diabetes mellitus seleccionada del grupo que consiste de diabetes mellitus no insulinodependiente (en una modalidad, diabtes Tipo 2), diabetes mellitus insulinodependiente (en una modalidad, diabetes de Tipo 1), y diabetes mellitus gestacional, o cualquier combinación de las mismas. En otra modalidad, PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden se utilizan para el tratamiento de la diabetes Tipo 2. En otra modalidad, la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden se utilizan para aumentar la sensibilidad a la insulina. En otra modalidad, la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden se utilizan para reducir la resistencia a la insulina.
En otra modalidad, la La PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden se utilizan para la supresión del apetito. En otra modalidad, la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden se utilizan para la inducción de la saciedad. En otra modalidad, la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden se utilizan para la reducción del peso corporal. En otra modalidad, la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden se utilizan para la reducción de la grasa corporal. En otra modalidad, la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden se utilizan para la reducción del índice de masa corporal. En otra modalidad , la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden se utilizan para la reducción del consumo de alimentos. En otra modalidad, la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden se utilizan para el tratamiento de la obesidad. En otra modalidad, la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden se utilizan para el tratamiento de la diabetes mellitus asociada con la obesidad. En otra modalidad, la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden se utilizan para el aumento del ritmo cardíaco. En otra modalidad, la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden se utilizan para el aumento de la tasa metabólica basal (BMR) . En otra modalidad , la PEG-Fmoc-oxintomodulina y PEG-FMS-oxintomodulina y composiciones farmacéuticas que las comprenden se utilizan para el aumento del gasto de energía. En otra modalidad, la PEG-Fmoc-oxintomodulina y PEG-FMS-oxintomodulina y composiciones farmacéuticas que las comprenden se utilizan para la inducción de tolerancia a la glucosa. En otra modalidad, la PEG-Fmoc-oxintomodulina y PEG-FMS-oxintomodulina y composiciones farmacéuticas que las comprenden se utilizan para la inducción del control glucémico. En una modalidad , el control glucémico se refiere a los niveles de glucosa en sangre no altos y/o no fluctuantes y/o niveles de hemoglobina g licosilada no altos y/o no fluctuantes.
En otra modal idad , la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden se uti lizan para la inhibición del aumento de peso. En otra modalidad , la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden se utilizan para la reducción de los niveles de glucosa en sangre (Figuras 4A y 9). En otra modal idad, la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden se utilizan para la disminución de la ingesta calórica. En otra modalidad , la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden se uti lizan para la disminución del apetito. En otra modal idad , la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden se utilizan para el control de peso. En otra modalidad , la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las com prenden se utilizan para la ind ucción o promoción de la pérd ida de peso. En otra modalidad , la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden se utilizan para el mantenimiento de cualquiera o más de u n peso corporal deseado , un índice de masa corpora l deseado, una apariencia deseada y buena salud . En otra modalidad , la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y com posiciones farmacéuticas que las comprenden se utilizan para el control de un perfil de l ípidos. En otra modalidad, la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden se utilizan para la reducción de los niveles de triglicéridos. En otra modalidad, la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las com prenden se utilizan para la reducción de los niveles de glicerol (Figura 9D) .
En otra modal idad , la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden se utilizan para la reducción de los niveles de colesterol . En una moda lidad, la reducción de los niveles de colesterol es mayor que la reducción observada después de la ad m inistración de OXM nativa (Figura 9C) . En una modalidad , la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y com posiciones farmacéuticas que las comprenden dism inuyen los niveles de colesterol por 60-70% . En otra modalidad , la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden disminuyen los niveles de colesterol por 50- 100% . En otra modalidad , la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y com posiciones farmacéuticas que las comprenden dismi nuyen los n iveles de colesterol por 25-90% . En otra modalidad , la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas q ue las comprenden dism inuyen los niveles de colesterol por 50-80% . En otra modalidad , la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las com prenden dism inuyen los niveles de colesterol por 40-90% . En otra modal idad, la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden se utilizan para aumentar los niveles de colesterol HD L.
En una modalidad , la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden se pueden uti lizar para los propósitos descritos en la presente sin una disminución significativa de la efectividad durante el transcurso de la administracióN (Figuras 5A, 6A, y 7) . En una modalidad , la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden siguen siendo efectivas durante 1 d ía . En otra modalidad , la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y com posiciones farmacéuticas q ue las comprenden siguen siendo efectivas durante 2-6 d ías. En otra modalidad , la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y com posiciones farmacéuticas que las comprenden siguen siendo efectivas durante 1 semana. En otra modalidad , la PEG-Fmoc-OXM y P EG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las com prenden siguen siendo efectivas durante 2 semanas. En otra modalidad, la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las com prenden sig uen siendo efectivas durante 3 semanas. En otra modal idad , la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y com posiciones farmacéuticas que las com prenden siguen siendo efectivas durante 4 semanas. En otra modalidad, la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y com posiciones farmacéuticas que las comprenden siguen siendo efectivas durante 6 semanas. En otra modal idad , la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y com posiciones farmacéuticas q ue las comprenden sig uen siendo efectivas durante 2 meses. En otra modalidad , la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y com posiciones farmacéuticas que las comprenden siguen siendo efectivas durante 4 meses. En otra modalidad , la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden siguen siendo efectivas durante 6 meses . En otra modal idad , la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden siguen siendo efectivas durante 1 año o más.
En una modalidad , la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden se pueden utilizar para los propósitos descritos en la presente y pueden ser efectivas inmed iatamente después de la adm inistración de la primera dosis (Figura 8A) . En otra modalidad, la PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y com posiciones farmacéuticas que las comprenden son efectivas después de que se han administrado dos o más dosis.
En otra modalidad , los métodos de utilización de PEG-Fmoc- OXM y PEG-FMS-OXM y com posiciones farmacéuticas que las comprenden como se describe anteriormente se aplican a un sujeto humano afectado con una enfermedad o afección q ue se puede aliviar, inhibir, y/o tratar por OXM . En otra modal idad , los métodos de utilización de PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden como se describe anteriormente son métodos veterinarios. En otra modalidad , los métodos de utilización de PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que las comprenden como se describe anteriormente se apl ican a animales tales como animales de granja , mascotas, y animales de laboratorio. Por lo tanto, en una modalidad , un sujeto de la presente invención es un felino , canino, bovi no, porci no, m urino , equino , etc.
En otra modalidad , la presente i nvención proporciona un método para tratar o reducir una enfermedad tratable o reducible por OXM o una formulación farmacéutica q ue comprende la misma , en un sujeto, que comprende la etapa de administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de PEG-Fmoc-OXM y/o PEG-FMS-OXM como se describe en la presente, tratando o reduciendo una enfermedad tratable o reducible por OXM en un sujeto.
En otra modalidad, OXM, "péptido" o "proteína" como se utiliza en la presente abarca péptidos nativos (ya sea productos de degradación, proteínas sintetizadas sintéticamente o proteínas recombinantes) y peptidomiméticos (típicamente, proteínas sintetizadas sintéticamente), así como peptoides y semipeptoides que son análogos de proteínas, que tienen, en algunas modalidades, modificaciones que vuelven a las proteínas aún más estables, mientras están en un cuerpo o más capaces de penetrar en las células.
En otra modalidad, las modificaciones incluyen, pero no se limitan a, modificación N terminal, modificación C terminal, modificación del enlace peptídico, incluyendo, pero no limitado a, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=0, 0 = C-NH, CH2-0, CH2-CH2, S = C-NH, CH = CH o CF=CH, modificaciones del esqueleto, y modificación de residuos. Los métodos para preparar los compuestos peptidomiméticos son bien conocidos en la técnica y se especifican, por ejemplo, en Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Capítulo 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992), que se incorpora para referencia como si se describiera completamente en la presente. Los detalles adicionales aj respecto se proporcionan en la presente.
En otra modalidad, se sustituyen los enlaces peptídicos (-CO-NH-) dentro del péptido. En algunas modalidades, los enlaces peptídicos se sustituyen por enlaces N-metilados (-N(CH3)-CO-). En otras modalidades, los enlaces peptídicos se sustituyen por enlaces de éster (-C(R)H-C-0-0-C(R)-N-). En otra modalidad, los enlaces peptídicos se sustituyen por enlaces de cetometileno (-CO-CH2-). En otra modalidad, los enlaces peptídicos se sustituyen por enlaces a-aza (-NH-N(R)-CO-), en donde R es cualquier alquilo, por ejemplo, metilo, enlaces carba (-CH2-NH-). En otras modalidades, los enlaces peptídicos se sustituyen por enlaces de hidroxietileno (-CH(OH)-CH2-). En otra modalidad, los enlaces peptídicos se sustituyen por enlaces de tioamida (-CS-NH-). En algunas modalidades, los enlaces peptídicos se sustituyen por dobles enlaces olefínicos (-CH=CH-). En otra modalidad, los enlaces peptídicos se sustituyen por enlaces de retroamida (-NH-CO-). En otra modalidad, los enlaces peptídicos se sustituyen por derivados peptídicos (-N(R)-CH2-CO-), en donde R es la cadena lateral "normal", naturalmente presentada en el átomo de carbono. En algunas modalidades, estas modificaciones ocurren en cualquiera de los enlaces a lo largo de la cadena peptídica e incluso en varios (2-3 enlaces) al mismo tiempo.
En una modalidad, los aminoácidos aromáticos naturales de la proteína tales como Trp, Tyr y Phe, se sustituyen por ácido no natural sintético, tal como fenilglicina, TIC, naftilelanina (Nol), derivados de anillo metilado de Phe, derivados halogenados de Phe u o-metil-Tyr. En otra modalidad, los péptidos de la presente invención incluyen uno o más aminoácidos modificados o uno o más monómeros no aminoácidos (por ejemplo, ácido graso, carbohidratos complejos, etc).
En una modalidad , "am inoácido" o "aminoácidos" se entiende que incl uye los 20 am inoácidos de origen natural; los aminoácidos a menudo modificados post-traduccionalmente in vivo, incluyendo, por ejemplo, hidroxiproli na , fosfoserina y fosfotreonina; y otro aminoácido inusual incluyendo, pero no limitado a, ácido 2-aminoadípico, hidroxilisina, isodesmosina, nor-valina , nor-leucina y ornitina . En una modalidad , "ami noácido" incluye tanto D- como L-aminoácidos.
En una modalidad, la OXM de la presente invención se utiliza en terapias que requieren que la OXM esté en una forma soluble. En otra modal idad , la OXM de la presente invención incluye uno o más aminoácidos polares no naturales o naturales, incluyendo, pero no lim itado a, serina y treon ina, que son capaces de aumentar la solubilidad de la proteína debido a su cadena lateral q ue contiene hidroxilo.
En una modalidad, la OXM de la presente invención se sintetiza bioqu ímicamente tal como utilizando técnicas en fase sólida estándar. En otra modalidad , estos métodos bioquím icos incluyen la síntesis en fase sólida exclusiva, sí ntesis en fase sólida parcial , condensación de fragmentos, o síntesis en solución clásica.
En una modalidad , los procedim ientos de síntesis de OXM en fase sólida son bien conocidos por un experto en la técnica y se describen además por John Morrow Stewart y Janis Dillaha Young , Solid Phase Protein Syntheses (2nd Ed . , Pierce Chem ical Com pa ny, 1 984) . En otra modalidad, las proteínas sintéticas se purifican por cromatografía líquida de alto rendimiento preparativa [Creighton T. (1983) Proteins, structures and molecular principies. WH Freeman and Co. N. Y.] y la composición de las cuales se puede confirmar a través de la secuenciacion de aminoácidos por métodos conocidos por un experto en la técnica.
En otra modalidad, las técnicas de proteína recombinante se utilizan para generar la OXM de la presente invención. En algunas modalidades, las técnicas de proteína recombinante se utilizan para la generación de grandes cantidades de la OXM de la presente invención. En otra modalidad, las técnicas recombinantes se describen por Bitter et al., (1987) Methods in Enzymol. 153:516-544, Studier et al. (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89, Brisson et al. (1984) Nature 310:511-514, Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6:307-311, Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680 y Brogli et al., (1984), Science 224:838-843, Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565 y Weissbach & eissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Sección VIII, p. 421-463.
En otra modalidad, la OXM de la presente invención se sintetiza utilizando un polinucleótido que codifica la OXM de la presente invención. En algunas modalidades, el polinucleótido que codifica la OXM de la presente invención se liga en un vector de expresión, que comprende un control de la transcripción de una secuencia cis-reguladora (por ejemplo, secuencia promotora). En algunas modalidades, la secuencia cis-reguladora es adecuada para dirigir la expresión constitutiva de la OXM de la presente invención.
En una modalidad, la frase "un polinucleótido" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos de hebra única o doble la cual se aisla y proporciona en la forma de una secuencia de RNA, una secuencia de polinucleótido complementaria (cDNA), una secuencia de polinucleótido genómica y/o una secuencia de polinucleótido compuesta (por ejemplo, una combinación de las anteriores).
En una modalidad, "secuencia de polinucleótido complementaria" se refiere a una secuencia, que resulta de la transcripción inversa del RNA mensajero utilizando una transcriptasa inversa o cualquier otra DNA polimerasa dependiente de RNA. En una modalidad, la secuencia se puede amplificar posteriormente in vivo o in vitro utilizando una DNA polimerasa.
En una modalidad, "secuencia de polinucleótido genómica" se refiere a una secuencia derivada (aislada) de un cromosoma y por lo tanto representa una porción contigua de un cromosoma.
En una modalidad, "secuencia de polinucleótido compuesta" se refiere a una secuencia, que es al menos parcialmente complementaria y al menos parcialmente genómica. En una modalidad, una secuencia compuesta puede incluir algunas secuencias exonales requeridas para codificar el péptido de la presente invención, así como algunas secuencias intrónicas interpuestas entre éstas. En una modalidad , las secuencias intrónicas pueden ser de cualquier fuente, incluyendo de otros genes, y típicamente incluirán secuencias señales de empalme conservadas. En una modalidad, las secuencias intrónicas incluyen elementos reguladores de la expresión de acción cis.
En una modalidad , los polinucleótidos de la presente invención se preparan util izando técnicas de PCR, o cualquier otro método o procedimiento conocido por un experto en la técnica. En algunas modalidades, el procedim iento involucra la ligadura de dos secuencias de DNA diferentes (ver, por ejemplo, "Current Protocole ¡n Molecular Biology" , eds. Ausubel et al . , John Wiley & Sons, 1 992) .
En una modalidad, se puede utilizar una variedad de células procarióticas o eucarióticas como sistemas de expresión de huésped para expresar la OXM de la presente invención . En otra modalidad, estas incluyen, pero no se lim itan a , m icroorgan ismos, tales como bacterias transformadas con un vector de expresión de DNA de bacteriófago recombinante, de DNA de plásmido o de DNA de cósmido que contiene la secuencia codificante de proteína; levadura transformada con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen la secuencia codificante de proteína; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, virus de mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmido recombinantes, tal como el plásm ido Ti , que contiene la secuencia codificante de la proteína .
En una modalidad, se uti lizan sistemas de expresión no bacterianos (por ejemplo, sistemas de expresión de mam íferos tales como cél ulas CHO) para expresar la OXM de la presente invención . En una modalidad , el vector de expresión util izado para expresar los polinucleótidos de la presente invención en células de mamíferos es el vector pCI-DHFR que comprende un promotor de CMV y un gene de resistencia a neomicina.
En otra modalidad, en los sistemas bacterianos de la presente invención, un número de vectores de expresión se pueden seleccionar ventajosamente dependiendo del uso previsto para la proteína expresada. En una modalidad, se desean grandes cantidades de OXM. En una modalidad, se desean vectores que dirigen la expresión de altos niveles del producto proteico, posiblemente como una fusión con una secuencia señal hidrofóbica, que dirige el producto expresado en el periplasma de la bacteria o el medio de cultivo donde el producto proteico se purifica fácilmente. En una modalidad, cierta proteína de fusión se modifica genéticamente con un sitio de escisión específico para ayudar en la recuperación de la proteína. En una modalidad, los vectores adaptables a tal manipulación incluyen, pero no se limitan a, la serie pET de vectores de expresión de E. Coli [Studier et al., Methods in Enzymol. 185:60-89 (1990)].
En una modalidad, se utilizan sistemas de expresión de levadura. En una modalidad, un número de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles se pueden utilizar en la levadura como se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos No: 5932447. En otra modalidad, se utilizan vectores que promueven la integración de secuencias de DNA extraño en el cromosoma de la levadura.
En una modalidad, el vector de expresión de la presente invención puede incluir además secuencias de polinucleótidos adicionales que permiten, por ejemplo, la traducción de varias proteínas a partir de un mRNA único tal como un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) y secuencias para la integración genómica de la proteína promotora-quimérica.
En una modalidad, los vectores de expresión de mamíferos incluyen, pero no se limitan a, pcDNA3, pcDNA3.1 (+/-), pGL3, pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1, pNMT41, pNMT81, que están disponibles de Invitrogen, pCI que está disponible de Promega, pMbac, pPbac, pBK-RSV y pBK-CMV que están disponibles de Stratagene, pTRES que está disponible de Clontech, y sus derivados.
En otra modalidad, los vectores de expresión que contienen elementos reguladores de virus eucarióticos tales como retrovirus se utilizan por la presente invención. Los vectores SV40 incluyen pSVT7 y pMT2. En otra modalidad, los vectores derivados del virus del papiloma bovino incluyen pBV-1MTHA, y los vectores derivados del virus de Epstein Bar incluyen pHEBO, y p205. Otros vectores ejemplares incluyen pMSG, pAV009/A*, pMTO10/A+, pMAMneo-5, pDSVE de baculovirus, y cualquier otro vector que permite que la expresión de proteínas bajo la dirección del promotor temprano de SV-40, promotor tardío de SV-40, promotor de la metalotioneína, promotor del virus del tumor mamario murino, promotor del virus del sarcoma de Rous, promotor de polihedrina, u otros promotores, muestre efectividad para la expresión en células eucarióticas.
En una modalidad, se utilizan vectores de expresión de plantas. En una modalidad, la expresión de la secuencia codificante del agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón (tal como la OXM) es impulsada por un número de promotores. En otra modalidad, se utilizan los promotores virales tales como los promotores 35S RNA y 19S RNA de CaMV [Brisson et al., Nature 310:511-514 (1984)], o el promotor de cubierta proteica para TMV [Takamatsu et al., EMBO J. 6:307-311 (1987)]. En otra modalidad, se utilizan promotores de plantas tales como, por ejemplo, la subunidad pequeña de RUBISCO [Coruzzi et al., EMBO J. 3:1671-1680 (1984); y Brogli et al., Science 224:838-843 (1984)] o promotores de choque de calor, por ejemplo, hsp17.5-E o hsp17.3-B de soya [Gurley et al., Mol. Cell. Biol. 6:559-565 (1986)]. En una modalidad, los constructos se introducen en células de plantas utilizando el plásmido Ti, plásmido Ri, vectores virales de plantas, transformación directa de DNA, microinyección, electroporación y otras técnicas bien conocidas por el experto en la técnica. Ver, por ejemplo, Weissbach & Weissbach [Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Sección VIII, p. 421-463 (1988)]. Otros sistemas de expresión tales como sistemas de células huésped de insectos y mamífero, que son bien conocidos en la técnica, también se pueden utilizar por la presente invención.
Se apreciará que diferente del que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada (que codifica la proteína), el constructo de expresión de la presente invención también puede incluir secuencias modificadas genéticamente para optimizar la estabilidad, producción, purificación, rendimiento o actividad de la proteína expresada.
Varios métodos, en algunas modalidades, se pueden utilizar para introducir el vector de expresión de la presente invención en el sistema de célula huésped. En algunas modalidades, tales métodos se describen generalmente en Sambrook et al., Molecular Cloning:. A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992), en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) y Gilboa et at. [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986] e incluyen, por ejemplo, la transfección estable o transitoria, lipofección, electroporación e infección con vectores virales recombinantes. Además, ver las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,464,764 y 5,487,992 para los métodos de selección positiva-negativa.
En una modalidad, las células transformadas se cultivaron bajo condiciones efectivas, que permiten la expresión de grandes cantidades de OXM recombinante. En otra modalidad, las condiciones de cultivo efectivas incluyen, pero no se limitan a, condiciones efectivas de medios, biorreactor, temperatura, pH y oxígeno que permitan la producción de proteínas. En una modalidad, un medio efectivo se refiere a cualquier medio en el cual una célula se cultiva para producir la OXM recombinante de la presente invención. En otra modalidad, un medio típicamente incluye una solución acuosa que tiene fuentes asimilables de carbono , nitrógeno y fosfato, y sales, minerales, metales y otros nutrientes apropiados, tales como vita minas. En una modalidad , las células de la presente invención se pueden cultivar en biorreactores de fermentación convencionales, matraces de agitación , tubos de ensayo, placas de microtitu lación y placas de petri . En otra modal idad , el cultivo se realiza a una tem peratura , pH y contenido de oxígeno apropiados para una célu la recombinante. En otra modalidad , las condiciones de cultivo están dentro de la pericia de u n experto normal en la técnica.
En una modalidad, dependiendo del vector y el sistema huésped uti lizados para la prod ucción , la OXM resultante de la presente invención ya sea permanece dentro de la célula recombinante, secretada en el medio de fermentación, secretada en un espacio entre dos membranas celulares, tal como el espacio periplásmico en E. coli; o se retiene en la superficie externa de una célula o membrana viral .
En una modalidad , después de un tiempo predeterminado en cultivo, se efectúa la recu peración de la OXM recom binante.
En una modalidad, la frase " recuperación de la OXM recombi nante" utilizada en la presente se refiere a la recolección del medio de fermentación completo que contiene la OXM y no necesariamente impl ica etapas adicionales de separación o purificación .
En una modalidad , la OXM de la presente invención se purifica utilizando u na variedad de técnicas de purificación de proteínas convencionales, tales como, pero no l imitado a, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, filtración , electroforesis, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de filtración en gel, cromatografía en fase inversa, cromatografía en concanavalina A, cromatoenfoque y solubilización diferencial.
En una modalidad, para facilitar la recuperación, la secuencia codificante expresada se puede modificar genéticamente para codificar la proteína de la presente invención y fusionar a la porción escindible. En una modalidad, una proteína de fusión se puede diseñar de manera que la proteína se puede aislar fácilmente por cromatografía de afinidad; por ejemplo, por inmovilización sobre una columna específica para la porción escindible. En una modalidad, un sitio de escisión se modifica genéticamente entre la proteína y la porción escindible y la proteína se puede liberar de la columna cromatográfica mediante tratamiento con una enzima o agente apropiado que escinde específicamente la proteína de fusión en este sitio [por ejemplo, ver Booth et al., Immunol. Lett. 19:65-70 (1988); y Gardella et al., J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990)]. En otra modalidad, la OXM de la presente invención se recupera en forma "sustancialmente pura". En otra modalidad, la frase "sustancialmente pura" se refiere a una pureza que permite el uso efectivo de la OXM en las aplicaciones descritas en la presente.
En una modalidad, el agonista dual del receptor de GLP- 1/Glucagón de la presente invención también se puede sintetizar utilizando sistemas de expresión in vitro. En una modalidad, los métodos de síntesis in vitro son bien conocidos en la técnica y los componentes del sistema están disponibles comercialmente.
En otra modalidad, la actividad de unión in vitro se determina midiendo la capacidad del agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón nativo, recombinante y/o pegilado inverso como se describe en la presente, así como las composiciones farmacéuticas que comprenden el mismo para tratar o aliviar las enfermedades o afecciones tales como, pero no limitadas a: diabetes mellitus, obesidad, trastornos de alimentación, trastornos metabólicos, etc. En otra modalidad, la actividad in vivo se deduce por las medidas conocidas de la enfermedad que se está tratando.
En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa de la presente invención comprende desde 0.005 a 0.1 miligramos/kg de péptido OXM. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa de la presente invención comprende desde 0.005 a 0.5 miligramos/kg de péptido OXM. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa de la presente invención comprende desde 0.05 a 0.1 microgramos de péptido OXM. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa de la presente invención comprende desde 0.005 a 0.1 miligramos/kg de péptido OXM en una solución inyectable.
En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez al día. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez cada 36 horas. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez cada 48 horas. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez cada 60 horas. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez cada 72 horas. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez cada 84 horas. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez cada 96 horas. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez cada 5 días. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez cada 6 días. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez cada 7 días. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez cada 8-10 días. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez cada 10-12 días. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez cada 12-15 días. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez cada 15-25 días.
En otra modalidad, la OMX pegilada inversa de la presente invención se administra por una inyección intramuscular (IM), inyección subcutánea (SC), inyección intravenosa (IV) una vez a la semana.
En otra modalidad, la OXM pegilada inversa de la presente invención se puede proporcionar al individuo per se. En una modalidad, la OXM pegilada inversa de la presente invención se puede proporcionar al individuo como parte de una composición farmacéutica donde se mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable.
En otra modalidad, una "composición farmacéutica" se refiere a una preparación de OXM de acción prolongada como se describe en la presente con otros componentes químicos tales como portadores y excipientes fisiológicamente adecuados. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa es responsable del efecto biológico.
En otra modalidad , cualqu iera de las com posiciones de esta invención com prenderá al menos una OXM pegilada inversa . En una modalidad , la presente invención proporciona preparaciones combinadas. En una modalidad , "una preparación combinada" define especialmente un "kit de partes" en el sentido de que los socios de combinación como se definió anteriormente se pueden dosificar independ ientemente o mediante el uso de d iferentes combinaciones fijas con cantidades distinguidas de los socios de combi nación, es decir, simultánea , concurrente, separada o secuencialmente. En algunas modalidades, las partes del kit de partes, por ejemplo, luego se pueden administrar simultáneamente o espaciadas cronológicamente, es decir en diferentes puntos de tiempo y con intervalos de tiempo iguales o diferentes para cualquier parte del kit de partes. La relación de las cantidades totales de los socios de combinación , en algunas modal idades, se puede administrar en la preparación combi nada . En una modalidad, la preparación combinada se puede variar, por ejemplo, para hacer frente a las necesidades de una subpoblacion de pacientes a ser tratados o las necesidades del paciente ún ico, las necesidades diferentes pueden deberse a una enfermedad particular, la gravedad de una enfermedad , edad , sexo, o peso corporal como se puede hacer fácilmente por una persona experta en la técnica .
En otra modalidad , las frases "portador fisiológicamente aceptable" y "portador farmacéuticamente aceptable" , las cuales se pueden utilizar ind istintamente se refieren a un portador o un diluyente que no causa irritación significativa a un organismo y no merma la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado. Un adyuvante se incluye bajo estas frases. En una modalidad, uno de los ingredientes incluidos en el portador farmacéuticamente aceptable puede ser, por ejemplo polietilenglicol (PEG), un polímero biocompatible con un amplio intervalo de solubilidad en medios tanto orgánicos como acuosos (Mutter et al. (1979).
En otra modalidad, "excipiente" se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar adicionalmente la administración de una OXN de acción prolongada. En una modalidad, los excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.
Las técnicas para la formulación y administración de fármacos se encuentran en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición, la cual se incorpora en la presente para referencia.
En otra modalidad, las rutas adecuadas de administración del péptido de la presente invención, por ejemplo, incluyen el suministro oral, rectal, transmucosal, transnasal, intestinal o parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas e intramedulares, así como inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares.
La presente invención también incluye OXM pegilada inversa para uso en la manufactura de un medicamento para la administración por una ruta periférica al cerebro por cualquiera de los métodos de tratamiento descritos anteriormente. Los ejemplos de rutas periféricas incluyen administración oral, rectal, parenteral por ejemplo intravenosa, intramuscular, o intraperitoneal, mucosal por ejemplo bucal, sublingual, nasal, subcutánea o transdérmica, incluyendo administración por inhalación. A continuación se dan cantidades de dosis preferidas de OXM para los medicamentos.
La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende OXM pegilada inversa y un portador farmacéuticamente adecuado, en una forma adecuada para la administración oral, rectal, parenteral, por ejemplo intravenosa, intramuscular, o intraperitoneal, mucosal por ejemplo bucal, sublingual, nasal, subcutánea o transdérmica, incluyendo la administración por inhalación. Si está en forma de dosificación unitaria, la dosis por unidad puede ser, por ejemplo, como se describe a continuación o como se calcula sobre la base de la dosis por kg dada a continuación.
En otra modalidad, la preparación se administra de una manera local antes que sistémica, por ejemplo, a través de la inyección de la preparación directamente en una región específica del cuerpo de un paciente. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa se formula en una forma de dosificación intranasal. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa se formula en una forma de dosificación inyectable.
Diversas modalidades de intervalos de dosificación se contemplan por esta invención: el componente de péptido OXM dentro de la composición de OXM pegilada inversa se administra en un intervalo de 0.01 a 0.5 miligramos/kg de peso corporal por 3 días (sólo el peso de la OXM dentro de la composición de OXM pegilada inversa que se proporciona como el tamaño del PEG puede diferir sustancialmente). En otra modalidad , el componente de péptido OXM dentro de la com posición de OXM pegilada inversa se admi nistra en un intervalo de 0.01 a 0.5 mi ligramos/kg de peso corporal por 7 días. En otra modalidad , el componente de péptido OXM dentro de la composición de OXM peg ilada inversa se administra en un intervalo de 0.01 a 0.5 mil igramos/kg de peso corporal por 1 0 d ías. En otra modal idad , el componente de péptido OXM dentro de la composición de OXM pegilada inversa se administra en un intervalo de 0.01 a 0.5 miligramos/kg de peso corporal por 14 d ías. En otra modal idad, de forma inesperada, la cantidad efectiva de OXM en una composición de OXM pegilada inversa es 1 /4-1 /1 0 de la cantidad efectiva de OXM libre. En otra modalidad, de forma inesperada, la pegilación inversa de OXM permite limitar la cantidad de OXM prescrita a un paciente por al menos 50% en comparación con la OXM libre. En otra modalidad, de forma inesperada , la pegilación inversa de OXM permite lim itar la cantidad de OXM prescrita a un paciente por al menos 70% en comparación con la OXM l ibre. En otra modalidad , de forma inesperada , la pegilación inversa de OXM permite limitar la cantidad de OXM prescrita a un paciente por al menos 75% en comparación con la OXM libre. En otra modalidad , de forma inesperada, la pegilación inversa de OXM perm ite lim itar la cantidad de OXM prescrita a un paciente por a l menos 80% en com paración con la OXM libre. En otra modalidad , de forma inesperada, la pegilación inversa de OXM permite limitar la cantidad de OXM prescrita a un paciente por al menos 85% en comparación con la OXM libre. En otra modalidad, de forma inesperada, la pegilación inversa de OXM permite limitar la cantidad de OXM prescrita a un paciente por al menos 90% en comparación con la OXM libre.
En otra modalidad, el componente de péptido OXM dentro de la composición de OXM pegilada inversa se administra en un intervalo de 0.01 a 0.5 miligramos/kg de peso corporal una vez cada 3 días (sólo el peso de la OXM dentro de la composición de OXM pegilada inversa que se proporciona como el tamaño de PEG puede diferir sustancialmente). En otra modalidad, el componente de péptido OXM dentro de la composición de OXM pegilada inversa se administra en un intervalo de 0.01-0.5 miligramos/kg de peso corporal una vez cada 7 días. En otra modalidad, el componente de péptido OXM dentro de la composición de OXM pegilada inversa se administra en un intervalo de 0.01-0.5 miligramos/kg de peso corporal una vez cada 10 días. En otra modalidad, el componente de péptido OXM dentro de la composición de OXM pegilada inversa se administra en un intervalo de 0.01-0.5 miligramos/kg de peso corporal una vez cada 14 días.
En otra modalidad, la OMX pegilada inversa en comparación con la OXM libre tanto reduce la frecuencia de dosificación efectiva por al menos 2 veces como reduce la dosis semanal efectiva por al menos 2 veces, lo que limita el riesgo de los eventos adversos y aumenta el cumplimiento con el uso de la terapia de OXM. En otra modalidad, la OMX pegilada inversa en comparación con la OXM libre tanto reduce la frecuencia de dosificación efectiva por al menos 3 veces como reduce la dosis semanal efectiva por al menos 3 veces, lo que l imita el riesgo de los eventos adversos y aumenta el cum plimiento con el uso de la terapia de OXM . En otra modalidad , la OMX pegi lada inversa en com paración con la OXM libre tanto reduce la frecuencia de dosificación efectiva por al menos 4 veces como reduce la dosis semana l efectiva por al menos 4 veces, lo q ue limita el riesgo de los eventos adversos y aumenta el cumplimiento con el uso de la terapia de OXM . En otra modalidad , la OMX pegilada inversa en com paración con la OXM libre tanto reduce la frecuencia de dosificación efectiva por al menos 5 veces como reduce la dosis semanal efectiva por al menos 5 veces, lo q ue l im ita el riesgo de los eventos adversos y aumenta el cumplimiento con el uso de la terapia de OXM . En otra modalidad , la OMX pegilada inversa en comparación con la OXM libre tanto reduce la frecuencia de dosificación efectiva por al menos 6 veces como reduce la dosis semanal efectiva por al menos 6 veces, lo que lim ita el riesgo de los eventos adversos y aumenta el cumplim iento con el uso de la terapia de OXM. En otra modalidad , la frecuencia de dosificación efectiva y dosis semanal efectiva se basan en : ( 1 ) el peso del com ponente de OXM administrado dentro de la composición de OXM peg ilada i nversa; y (2) el peso del com ponente de OXM se adm inistra dentro de la com posición de OXM libre (OXM no modificada) .
En otra modalidad , los métodos de la invención incluyen el aumento del cumplimiento de los pacientes afectados con enfermedades crónicas que están en necesidad de terapia de OXM . En otra modalidad , los métodos de la invención perm iten la reducción de la frecuencia de dosificación de OXM por peg ilación inversa de OXM como se describe anteriormente en la presente. En otra modal idad , el término cumplimiento comprende la adherencia . En otra modalidad , los métodos de la invención incluyen el aumento del cum pl imiento de los pacientes en necesidad de terapia de OXM reduciendo la frecuencia de administración de OXM . En otra modalidad , la reducción de la frecuencia de adm inistración de la OXM se logra gracias a la pegilación inversa que vuelve a la OXM más estable y más potente. En otra modalidad, la reducción de la frecuencia de adm inistración de la OXM se logra como un resultado del aumento de T1 /2 de la OXM . En otra modalidad, la reducción de la frecuencia de administración de la OXM se logra como un resultado de la reducción de la depuración de la sangre de la OXM . En otra modalidad , la reducción de la frecuencia de administración de la OXM se logra como un resultado del aumento de T 1 /2 de la OXM. En otra modalidad , la reducción de la frecuencia de adm inistración de la OXM se logra como un resultado del aumento de la medida de AUC de la OXM.
En otra modal idad, una OXM pegilada i nversa se admi nistra a un sujeto una vez al día . En otra modalidad , una OXM pegilada inversa se administra a un sujeto una vez cada dos días. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa se administra a un sujeto una vez cada tres días. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa se administra a un sujeto una vez cada cuatro d ías. En otra modal idad , una OXM pegilada inversa se adm inistra a un sujeto una vez cada cinco días. En otra modalidad , una OXM pegilada inversa se administra a un sujeto una vez cada seis días. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa se administra a un sujeto una vez cada semana. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa se administra a un sujeto una vez cada 7-14 días. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa se administra a un sujeto una vez cada 10-20 días. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa se administra a un sujeto una vez cada 5-15 días. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa se administra a un sujeto una vez cada 15-30 días.
En otra modalidad, una OXM pegilada se administra a un sujeto una vez al día. En otra modalidad, una OXM pegilada se administra a un sujeto una vez cada dos días. En otra modalidad, una OXM pegilada se administra a un sujeto una vez cada tres días. En otra modalidad, una OXM pegilada se administra a un sujeto una vez cada cuatro días. En otra modalidad, una OXM pegilada se administra a un sujeto una vez cada cinco días. En otra modalidad, una OXM pegilada se administra a un sujeto una vez cada seis días. En otra modalidad, una OXM pegilada se administra a un sujeto una vez cada semana. En otra modalidad, una OXM pegilada se administra a un sujeto una vez cada 7-14 días. En otra modalidad, una OXM pegilada se administra a un sujeto una vez cada 10-20 días. En otra modalidad, una OXM pegilada se administra a un sujeto una vez cada 5-15 días. En otra modalidad, una OXM pegilada se administra a un sujeto una vez cada 15-30 días.
En una modalidad, las variantes de OXM pegilada proporcionadas en la presente reducen de forma inesperada la glucosa junto con la reducción de los niveles de insulina en ayunas después de la administración de una dosis única de la variante de PEG-OXM. En otra modalidad, las variantes de OXM pegilada proporcionadas en la presente conducen al aumento de la sensibilidad de un sujeto a la insulina (ver Ejemplo 6).
La administración oral, en una modalidad, comprende una forma de dosificación unitaria que comprende tabletas, cápsulas, pastillas, tabletas masticables, suspensiones, emulsiones y similares. Tales formas de dosificación unitaria comprenden una cantidad segura y efectiva de OXM de la invención, cada una de los cuales es en una modalidad, desde aproximadamente 0.7 o 3.5 mg a aproximadamente 280 mg/70 kg, o en otra modalidad, aproximadamente 0.5 o 10 mg a aproximadamente 210 mg/70 kg. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados para la preparación de formas de dosificación unitarias para la administración peroral son bien conocidos en la técnica. En algunas modalidades, las tabletas típicamente comprenden adyuvantes farmacéuticamente compatibles convencionales como diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, manitol, lactosa y celulosa; aglutinantes tales como almidón, gelatina y sacarosa; disgregantes tales como almidón, ácido algínico y croscarmelosa; lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico y talco. En una modalidad, los deslizantes tales como dióxido de silicio se pueden utilizar para mejorar las características de flujo de la mezcla de polvo. En una modalidad, agentes colorantes, tales como los tintes FD&C, se pueden añadir para la apariencia. Los edulcorantes y agentes saborizantes, tales como aspartamo, sacarina, mentol, menta, y sabores de frutas, son adyuvantes útiles para los tabletas masticables. Las cápsulas comprenden típicamente uno o más diluyentes sólidos descritos anteriormente. En algunas modalidades, la selección de componentes portadores depende de las consideraciones secundarias como el sabor, costo, y estabilidad en anaquel, que no son críticas para los propósitos de esta invención, y se puede hacer fácilmente por una persona experta en la técnica.
En una modalidad, la forma de dosificación oral comprende perfil de liberación predefinido. En una modalidad, la forma de dosificación oral de la presente invención comprende unas tabletas de liberación prolongada, cápsulas, pastillas o tabletas masticables. En una modalidad, la forma de dosificación oral de la presente invención comprende unas tabletas de liberación lenta, cápsulas, pastillas o tabletas masticables. En una modalidad, la forma de dosificación oral de la presente invención comprende unas tabletas de liberación inmediata, cápsulas, pastillas o tabletas masticables. En una modalidad, la forma de dosificación oral se formula de acuerdo con el perfil de liberación deseado de la OXM de acción prolongada como se conoce por un experto en la técnica.
En otra modalidad, las composiciones para uso en los métodos de esta invención comprenden soluciones o emulsiones, que en otra modalidad son soluciones acuosas o emulsiones que comprenden una cantidad segura y efectiva de los compuestos de la presente invención y, opcionalmente , otros compuestos, destinados para la administración intranasal tópica . En algunas modalidades, las composiciones comprenden desde aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 1 0.0% p/v de un compuesto objeto, más preferiblemente desde aproximadamente 00. 1 % a a proximadamente 2.0, que se util iza para el sum inistro sistémico de los compuestos por ruta intranasal.
En otra modalidad , las composiciones farmacéuticas se administran por inyección intravenosa , intraarterial , subcutánea o intram uscular de una preparación líquida. En otra modalidad, las formulaciones líquidas i ncluyen sol uciones, suspensiones, dispersiones, emulsiones , aceites y similares. En una modalidad, las com posiciones farmacéuticas se administran intravenosamente, y por lo tanto se formulan en una forma adecuada para la administración i ntravenosa . En otra modal idad , las composiciones farmacéuticas se administran ¡ntraarterialmente, y por lo tanto se formulan en una forma adecuada para la admi nistración intraarterial . En otra modalidad , las composiciones farmacéuticas se administran intramuscularmente, y por lo tanto se formulan en una forma adecuada para la administración intramuscular.
Además, en otra modalidad , las composiciones farmacéuticas se administran tópicamente a las superficies del cuerpo, y por lo tanto se form ulan en una forma adecuada para la administración tópica. Las form ulaciones tópicas adecuadas incluyen geles, ungüentos, cremas , lociones, gotas y similares. Para la administración tópica, los compuestos de la presente invención se combinan con un agente o agentes terapéuticos apropiados adicionales, se preparan y aplican como soluciones, suspensiones, o emulsiones en un diluyente fisiológicamente aceptable con o sin un portador farmacéutico.
En una modalidad, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se manufacturan por procesos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezclado, disolución, granulación, elaboración de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización.
En una modalidad, las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con la presente invención se formulan de manera convencional utilizando uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares, que facilitan el procesamiento de OXM en preparaciones que se pueden utilizar farmacéuticamente. En una modalidad, la formulación es dependiente de la ruta de administración elegida.
En una modalidad, los inyectables, de la invención se formulan en soluciones acuosas. En una modalidad, los inyectables, de la invención se formulan en amortiguadores fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer, o amortiguador de sal fisiológica. En algunas modalidades, para la administración transmucosal, los penetrantes apropiados para la barrera a ser permeada se utilizan en la formulación. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica.
En una modalidad, las preparaciones descritas en la presente se formulan para la administración parenteral, por ejemplo, por inyección de bolo o infusión continua. En otra modalidad, las formulaciones para inyección se presentan en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampolletas o en contenedores multidosis con opcionalmente, un conservador añadido. En otra modalidad, las composiciones son suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y contienen agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.
Las composiciones también comprenden, en otra modalidad, conservadores, tales como cloruro de benzalconio y timerosal y similares; agentes quelantes, tales como edetato de sodio y otros; amortiguadores tales como fosfato, citrato y acetato; agentes de tonicidad tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, glicerina, manitol y otros; antioxidantes tales como ácido ascórbico, acetilcistina, metabisulfato de sodio y otros; agentes aromáticos; ajustadores de la viscosidad, tales como polímeros, incluyendo celulosa y derivados de la misma; y alcohol de polivinilo y ácido y bases para ajustar el pH de estas composiciones acuosas como sea necesario. Las composiciones también comprenden, en algunas modalidades, anestésicos locales u otros activos. Las composiciones se pueden utilizar como pulverizaciones, nebulizaciones, gotas, y similares.
En una modalidad, las composiciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de la preparación activa en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones de OXM de acción prolongada, en algunas modalidades, se preparan como suspensiones de inyección oleosas o a base de agua apropiadas. Los solventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen, en algunas modalidades, aceites grasos tales como aceite de ajonjolí, o ésteres de ácidos grasos sintéticos tales como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección contienen, en algunas modalidades, sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetil celulosa de sodio, sorbitol o dextrano. En otra modalidad, la suspensión también contiene estabilizantes o agentes que aumentan la solubilidad de OXM de acción prolongada para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.
En otra modalidad, el compuesto activo se puede administrar en una vesícula, en particular un liposoma (ver Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cáncer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, tbid . , pp. 317-327; ver generalmente ¡bid).
En otra modalidad, la composición farmacéutica suministrada en un sistema de liberación controlada se formula para infusión intravenosa, bomba osmótica implantable, parche transdérmico, liposomas, u otros modos de administración. En una modalidad, se utiliza una bomba (ver Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al, N. Engl. J. Med 321:574 (1989). En otra modalidad, se pueden utilizar materiales poliméricos. En todavía otra modalidad, un sistema de liberación controlada se puede colocar en la proximidad al objetivo terapéutico, es decir, el cerebro, requiriendo así sólo una fracción de la dosis sistémica (ver, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Reléase, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984). Otros sistemas de liberación controlada se discuten en la revisión de Langer {Science 249:1527-1533 (1990).
En una modalidad, la OXM de acción prolongada está en la forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, solución a base de agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso. Las composiciones se formulan, en algunas modalidades, para administración por atomización y inhalación. En otra modalidad, las composiciones están contenidas en un recipiente con medios de atomización adjuntos.
En una modalidad, la preparación de la presente invención se formula en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, utilizando, por ejemplo, bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
En una modalidad, las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso en el contexto de la presente invención incluyen composiciones en donde la OXM de acción prolongada está contenida en una cantidad efectiva para conseguir el propósito pretendido. En otra modalidad, una cantidad terapéuticamente efectiva significa una cantidad de OXM de acción prolongada efectiva para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de la enfermedad o prolongar la supervivencia del sujeto que es tratado.
En una modalidad, la determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica.
Las composiciones también comprenden conservadores, tales como cloruro de benzalconio y timerosal y similares; agentes quelantes, tales como edetato de sodio y otros; amortiguadores tales como fosfato, citrato y acetato; agentes de tonicidad tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, glicerina, manitol y otros; antioxidantes tales como ácido ascórbico, acetilcistina, metabisulfato de sodio y otros; agentes aromáticos; ajustadores de la viscosidad, tales como polímeros, incluyendo celulosa y derivados de la misma; y alcohol de polivinilo y ácido y bases para ajustar el pH de estas composiciones acuosas como sea necesario. Las composiciones también comprenden anestésicos locales u otros activos. Las composiciones se pueden utilizar como pulverizaciones, nebulizaciones, gotas, y similares.
Algunos ejemplos de sustancias que pueden servir como portadores o componentes farmacéuticamente aceptables de los mismos son azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetil celulosa, etil celulosa, y metil celulosa de sodio; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; lubricantes sólidos, tales como ácido esteárico y estearato de magnesio; sulfato de calcio; aceites vegetales, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de ajonjolí, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de theobroma; polioles tales como propilenglicol, glicerina, sorbitol, manitol, y polietilenglicol; ácido algínico; emulsionantes, tales como los emulsionantes de la marca Tween™; agentes humectantes, tales como lauril sulfato de sodio; agentes colorantes; agentes saborizantes; agentes de tableteado, estabilizantes; antioxidantes; conservadores; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; y soluciones de amortiguador de fosfato. La elección de un portador farmacéuticamente aceptable para ser utilizado en conjunción con el compuesto se determina básicamente por la forma en que el compuesto será administrado. Si el compuesto objeto será inyectado, en una modalidad, el portador farmacéuticamente aceptable es solución salina fisiológica estéril, con un agente de suspensión compatible con la sangre, el pH de la cual se ha ajustado a aproximadamente 7.4.
Además, las composiciones comprenden además aglutinantes (por ejemplo acacia, almidón de maíz, gelatina, carbómero, etilcelulosa, goma guar, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metil celulosa, povidona), agentes disgregantes (por ejemplo almidón de maíz, almidón de papa, ácido algínico, dióxido de silicio, croscarmelosa de sodio, crospovidona, goma de guar, glicolato de almidón de sodio), amortiguadores (por ejemplo, Tris-HCI, acetato, fosfato) de varios pH y fuerza iónica, aditivos tales como albúmina o gelatina para prevenir la absorción a superficies, detergentes (por ejemplo, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sales de ácidos biliares), inhibidores de la proteasa, surfactantes (por ejemplo lauril sulfato de sodio), potenciadores de la permeación, agentes solubilizantes (por ejemplo, glicerol, polietileno glicerol), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio, hidroxianisol butilado), estabilizantes (por ejemplo, hidroxipropil celulosa, hidroxipropilmetil celulosa), agentes que aumentan la viscosidad (por ejemplo, carbómero, dióxido de silicio coloidal, etil celulosa, goma guar), edulcorantes (por ejemplo aspartamo, ácido cítrico), conservadores (por ejemplo, timerosal, alcohol bencílico, parabenos), lubricantes (por ejemplo, ácido esteárico, estearato de magnesio, polietilenglicol, lauril sulfato de sodio), auxiliares de flujo (por ejemplo, dióxido de silicio coloidal), plastificantes (por ejemplo ftalato de dietilo, citrato de trietilo), emulsionantes (por ejemplo, carbómero, hidroxipropil celulosa, lauril sulfato de sodio), recubrimientos poliméricos (por ejemplo, poloxámeros o poloxaminas), agentes formadores de recubrimiento y película (por ejemplo, etil celulosa, acrilatos, polimetacrilatos) y/o adyuvantes.
Los componentes típicos de portadores para jarabes, elixires, emulsiones y suspensiones incluyen etanol, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, sacarosa líquida, sorbitol y agua. Para una suspensión, los agentes de suspensión típicos incluyen metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, celulosa (por ejemplo, Avicel™, RC-591), tragacanto y alginato de sodio; los agentes humectantes típicos incluyen lecitina y óxido de polietileno sorbitán (por ejemplo, polisorbato 80). Los conservadores típicos incluyen metilparabeno y benzoato de sodio. En otra modalidad, las composiciones líquidas perorales también contienen uno o más componentes tales como edulcorantes, agentes saborizantes y colorantes descritos anteriormente.
Las composiciones también incluyen la incorporación del material activo en o sobre preparaciones particuladas de compuestos poliméricos tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, hidrogeles, etc. , o sobre liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilaminares o multilaminares, fantasmas de eritrocitos, o esferoplastos). Tales composiciones influirán en el estado físico, solubilidad, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de depuración in vivo.
También comprendidas por la invención están las composiciones particuladas recubiertas con polímeros (por ejemplo poloxámeros o poloxaminas) y el compuesto acoplado a anticuerpos dirigidos contra los receptores, ligandos o antígenos específicos de tejido o acoplado a ligandos de receptores específicos de tejido.
En una modalidad, los compuestos modificados por la unión covalente de polímeros solubles en agua tales como polietilenglicol, copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona o poliprolina. En otra modalidad, los compuestos modificados exhiben vidas medias sustancialmente más largas en la sangre después de la inyección intravenosa que lo que hacen los compuestos no modificados correspondientes. En una modalidad, las modificaciones también aumentan la solubilidad del compuesto en solución acuosa, eliminan la agregación, mejoran la estabilidad física y química del compuesto, y reducen considerablemente la inmunogenicidad y reactividad del compuesto. En otra modalidad, la actividad biológica in vivo deseada se logra mediante la admin istración de tales abductos de compuesto polimérico con menos frecuencia o en dosis menores que con el compuesto no modificado.
En otra modalidad, la preparación de la cantidad o dosis efectiva se puede estimar inicialmente a partir de ensayos in vitro. En una modalidad , se puede formular una dosis en modelos an imales y tal información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en seres humanos.
En una modalidad , la toxicidad y la eficacia terapéutica del agonista de acción prolongada (tal como OXM) como se describe en la presente se pueden determi nar med iante procedim ientos farmacéuticos estándar in vitro , en cultivos celulares o animales experi mentales. En una modalidad, los datos obtenidos de éstos ensayos in vitro y de cultivo celular y estudios en animales se pueden util izar para formular un intervalo de dosificación para uso en humanos. En una modalidad, las dosificaciones varían dependiendo de la forma de dosificación em pleada y la ruta de adm inistración utilizada . En una modalidad , la formulación exacta , ruta de adm in istración y dosificación se pueden elegir por el médico ind ividual en vista de la condición del paciente. [Ver, por ejemplo, Fingí, et al . , ( 1 975) "The Pharmacological Basis of Therapeutics" , Cap. 1 p. 1 ] .
En una modalidad , dependiendo de la gravedad y capacidad de respuesta de la afección a tratar, la dosificación puede ser de una sola o una pluralidad de administraciones, con el curso de tratamiento durando desde varios días a varias semanas o hasta que se efectúe la cura o se logre la disminución del estado de la enfermedad.
En una modalidad, la cantidad de una composición a ser administrada, por supuesto, dependerá del sujeto a ser tratado, la gravedad de la aflicción, la manera de administración, el juicio del médico que prescribe, etc.
En una modalidad, las composiciones que incluyen la preparación de la presente invención formulada en un portador farmacéutico compatible también se pueden preparar, colocar en un recipiente apropiado, y etiquetarse para el tratamiento de una afección indicada.
En otra modalidad, un agonista dual del receptor de GLP-1 /Glucagón pegilado o pegilado inverso como se describe en la presente se administra a través de la administración sistémica. En otra modalidad, un agonista dual del receptor de GLP-1 /Glucagón pegilado o pegilado inverso como se describe en la presente se administra por inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea. En otra modalidad, un agonista dual del receptor de GLP-1 /Glucagón pegilado o pegilado inverso como se describe en la presente es una preparación liofilizada (es decir, se seca por congelación) en combinación con excipientes y estabilizadores orgánicos complejos tales como agentes de superficie activa no iónicos (es decir, surfactantes) , varios azúcares, polioles orgánicos y/o albúmina de suero humano. En otra modalidad, una composición farmacéutica comprende un agonista dual del receptor de GLP-1 /Glucagón pegilado o pegilado inverso liofilizado como se describe en la presente en agua estéril para inyección. En otra modalidad, una composición farmacéutica comprende un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón pegilado o pegilado inverso liofilizado como se describe en la presente en agua estéril para inyección. En otra modalidad, una composición farmacéutica comprende un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón pegilado o pegilado inverso liofilizado como se describe en la presente en 0.9% NaCI estéril para inyección.
En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende un agonista dual del receptor de GLP-1 /Glucagón pegilado o pegilado inverso como se describe en la presente y portadores complejos tales como albúmina de suero humano, polioles, azúcares, y agentes estabilizadores de superficie activa aniónica. Ver, por ejemplo, WO 89/10756 (Hará et al. que contiene poliol y p-hidroxibenzoato). En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón pegilado inverso como se describe en la presente y el ácido lactobiónico y un amortiguador de acetato/glicina. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón pegilado o pegilado inverso como se describe en la presente y aminoácidos, tales como arginina o glutamato que aumentan la solubilidad de las composiciones de interferón en agua. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón pegilado o pegilado inverso liofilizado como se describe en la presente y glicina o albúmina de suero humano (HSA), un amortiguador (por ejemplo acetato) y un agente isotónico (por ejemplo, NaCI). En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón pegilado o pegilado inverso liofilizado como se describe en la presente y amortiguador de fosfato, glicina y HSA.
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón pegilado o pegilado inverso como se describe en la presente se estabiliza cuando se coloca en soluciones amortiguadas que tienen un pH entre aproximadamente 4 y 7.2. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón pegilado o pegilado inverso como se describe en la presente se estabiliza con un aminoácido como agente estabilizante, y en algunos casos una sal (si el aminoácido no contiene una cadena lateral cargada).
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón pegilado o pegilado inverso como se describe en la presente es una composición líquida que comprende un agente estabilizante entre aproximadamente 0.3% y 5% en peso el cual es un aminoácido.
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón pegilado o pegilado inverso como se describe en la presente proporciona precisión de dosificación y seguridad del producto. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón pegilado o pegilado inverso como se describe en la presente proporciona una formulación líquida estable biológicamente activa para uso en aplicaciones inyectables. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón pegilado o pegilado inverso no liofilizado como se describe en la presente.
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón pegilado o pegilado inverso como se describe en la presente proporciona una formulación líquida que permite el almacenamiento durante un largo período de tiempo en un estado líquido que facilita el almacenamiento y envío antes de la administración.
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón pegilado o pegilado inverso como se describe en la presente comprende lípidos sólidos como material de matriz. En otra modalidad, la composición farmacéutica inyectable que comprende un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón pegilado o pegilado inverso como se describe en la presente comprende lípidos sólidos como material de matriz. En otra modalidad, la producción de micropartículas de lípidos por congelación por pulverización se describió por Speiser (Speiser et al., Phann. Res. 8 (1991) 47-54) seguido por nanopelotillas de lípidos para la administración peroral (Speiser EP 0167825 (1990)). En otra modalidad, los lípidos, los cuales se utilizan, son bien tolerados por el cuerpo (por ejemplo, glicéridos compuestos de ácidos grasos que están presentes en las emulsiones para nutrición parenteral).
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un agonista dual del receptor de GLP-1/Glucagón pegilado o pegilado inverso como se describe en la presente está en la forma de liposomas (J . E. Diederichs et al . , Pharm ./nd . 56 (1 994) 267-275).
En otra modalidad , la composición farmacéutica comprende un agonista dual del receptor de GLP- 1 /Glucagón pegilado o pegilado inverso como se describe en la presente comprende micropartículas poliméricas. En otra modalidad, la composición farmacéutica inyectable que comprende un agonista dual del receptor de GLP-1 /Glucagón pegilado o pegilado inverso como se describe en la presente comprende micropartículas poliméricas. En otra modalidad , la composición farmacéutica que comprende un agonista dual del receptor de GLP-1 /Glucagón pegilado o peg ilado inverso como se describe en la presente comprende nanopartículas. En otra modalidad , la composición farmacéutica que comprende un agonista dual del receptor de GLP-1 /Glucagón peg ilado inverso como se describe en la presente comprende liposomas. En otra modalidad , la com posición farmacéutica comprende una OXM pegilada o pegilada inversa como se describe en la presente com prende la emulsión de l ípidos. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un agonista dual del receptor de G LP- 1 /Glucagón pegilado o pegilado inverso como se describe en la presente com prende m icroesferas. En otra modalidad , la composición farmacéutica que comprende un agonista dual del receptor de G LP-1 /Glucagón pegilado o pegilado inverso como se describe en la presente comprende nanopartículas de l ípidos. En otra modalidad , la composición farmacéutica que comprende u n agonista dual del receptor de GLP-1 /Glucagón pegilado o pegilado inverso como se describe en la presente comprende nanopartículas de lípidos que com prenden lípidos anfifílicos. En otra modalidad , la composición farmacéutica que comprende un agonista dual del receptor de G LP- 1 /Glucagón pegilado o pegilado inverso como se describe en la presente comprende nanopartículas de lípidos que comprenden un fármaco, una matriz li pídica y un surfactante. En otra modalidad , la matriz lipídica tiene un contenido de monoglicéridos que es al menos 50% p/p.
En una modalidad , las composiciones de la presente invención se presentan en un envase o dispositivo d ispensador, tal como un kit aprobado por la FDA, que contiene una o más formas de dosificación unitarias que contienen el agonista dual del receptor de GLP-1 /Glucagón de acción prolongada . En una modalidad , el envase, por ejem plo, comprende una lám ina metálica o plástico, tal como un envase bl íster. E n una modalidad , el envase o dispositivo dispensador está acompañado por instrucciones para la admin istración . En una modalidad, el envase o dispensador está alojado mediante un anuncio relacionado con el contenedor en u na forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la manufactu ra, uso o venta de productos farmacéuticos, el an uncio es un reflejo de la aprobación por la agencia de la forma de las composiciones o administración humana o veterinaria. Tal aviso, en una modalidad , es el etiquetado aprobado por la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos para la prescripción de fármacos o de un inserto de producto aprobado.
En una modalidad , se apreciará que el agonista dual del receptor de GLP- 1 /Glucagón pegilado o pegilado inverso de la presente invención se puede proporcionar al individuo con agentes activos adicionales para lograr un efecto terapéutico mejorado en comparación con el tratamiento con cada agente por sí mismo. En otra modalidad, se toman medidas (por ejemplo, la dosificación y selección del agente complementario) para los efectos laterales adversos que se asocian con las terapias de combinación.
Los objetivos, ventajas y nuevas características adicionales de la presente invención se harán evidentes para un experto habitual en la técnica en el examen de los siguientes ejemplos, que no pretenden ser limitantes. Además, cada una de las diversas modalidades y aspectos de la presente invención como se expone anteriormente y como se reivindica en la sección de reivindicaciones a continuación encuentra apoyo experimental en los siguientes ejemplos.
Ejemplos Generalmente, la nomenclatura utilizada en la presente y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de DNA recombinante técnicas. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al. , ( 1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes l-l ll Ausubel, R. M. , ed. (1994); Ausubel et al. , "Current Protocols in Molecular Biology" , John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland ( 1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1 988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologías como se describe en las Patentes de Estados Unidos Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes l-lll Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), tercera edición; "Current Protocols in Immunology" Volumes l-lll Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8a Edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen extensamente en la patente y literatua científica, ver, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 y 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" URL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todas los cuales se incorporan para referencia. Otras referencias generales se proporcionan en todo este documento.
Materiales y métodos Síntesis de PEG4o-Fmoc-OXM y PEG40-FMS-OXM Síntesis de OXM: Oxintomodulina de secuencia: HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA (SEC ID NO: 1) se sintetizó por el método en fase sólida empleando la estrategia de Fmoc en todo el montaje de la cadena de péptido (Almac Sciences, Escocia). La secuencia peptídica se ensambló utilizando las siguientes etapas: (1) Protección: la resina se protegió utilizando solución solución de anhídrido acético 0.5 M (Fluka) en DMF (Rathburn); (2) Desprotección: el grupo protector Fmoc se removió de la cadena peptídica en crecimiento utilizando 20% v/v de solución de piperidina (Rathburn) en DMF (Rathburn); y (3) Acoplamiento de Aminoácidos: la solución de aminoácido 0.5 M (Novabiochem) en DMF (Rathburn) se activó utilizando solución de HOBt 1M (Carbosynth) en DMF (Rathburn) y solución de DIC 1 M (Carbosynth) en DMF (Rathburn). Cuatro equivalentes de cada aminoácido se utilizaron por acoplamiento.
El péptido crudo se escindió de la resina, y los grupos protectores se removieron mediante agitación en un cóctel de triisopropilsilano (Fluka), agua, sulfuro de dimetilo (Aldrich), yoduro de amonio (Aldrich) y TFA (Applied Biosystems) durante 4 horas. El péptido crudo luego se recolectó por precipitación a partir de éter dietílico frío.
Purificación del péptido: El péptido crudo se disolvió en acetonitrilo (Rathburn)/agua (Milli-Q) (5:95) y se cargó en la columna de HPLC preparativa. Los parámetros cromatográficos son los siguientes: Columna: Phenomenex Luna C18 250 mm x 30 mm, 15µ??, 300A; Fase móvil A: agua + 0.1% v/v de TFA (Applied Biosystems); Fase móvil B: acetonitrilo (Rathburn) + 0.1% v/v de TFA (Applied Biosystems); Detección UV: 214 o 220 nm; Gradiente: 25% B a 31% B en 4 volúmenes de columna; y velocidad de flujo de 43 mL/min.
Síntesis del Enlazador - Síntesis del Enlazador MAL-FMS- La síntesis de los compuestos 2-5 se basó en los procedimientos descritos por Albericio et al. en Synthetic Communication, 2001, 31(2), 225-232, que se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. 2-(Boc-amino)fluoreno (2): El 2-aminofluoreno (18 g, 99mmol) se suspendió en una mezcla de dioxano:agua (2:1) (200 mi) y NaOH 2 N (60 mi) en un baño de hielo con agitación magnética. Luego se añadió B0C2O (109 mmol, 1.1 eq), y se continuó la agitación a RT. La reacción se monitoreó por TLC (Rf = 0.5, hexano/acetato de etilo 2:1), y el pH se mantuvo entre 9-10 mediante la adición de NaOH 2N. Después de la terminación de la reacción, la suspensión se acidificó con KHS04 1 M a pH = 3. La fase sólida se filtró y se lavó con agua fría (50 mi), dioxano-agua (2:1) y luego se formó azeótropo con tolueno dos veces antes de usarla en la siguiente etapa. 9-Formil-2-(Boc-amino)fluoreno (3): En un RBF de 3 bocas, el NaH (60% en aceite; 330mmol, 3.3eq) se suspendió en THF seco (50 mi), una solución de 2-(Boc-amino)fluoreno de la etapa 2 (28 g; 100 mmol) en THF seco (230 mi) se añadió por goteo durante 20 minutos;. Se observó una pasta aguada amarilla espesa, y la mezcla se agitó durante 10 minutos a RT bajo nitrógeno. Se añadió por goteo formiato de etilo (20.1 mi, 250 mmol, 2.5 eq) (precaución: emisión de gas). La pasta aguada se volvió una solución marrón pálida. La solución se agitó durante 20 minutos. La reacción se monitoreó por TLC (Rf = 0.5, hexano/acetato de etilo 1:1) y cuando se observó sólo trazas de material de partida, se inactivo con agua helada (300 mi). La mezcla se evaporó bajo presión reducida hasta que la mayor parte del THF se ha removido. La mezcla resultante se trató con ácido acético a pH = 5. El precipitado blanco obtenido se disolvió en acetato de etilo y la capa orgánica se separó. La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo y toda la capa orgánica se combinó y se lavó con bicarbonato de sodio saturado, salmuera y se secó sobre MgS04. Después de la filtración y remoción del solvente, se obtuvo un sólido amarillo. Este material se utilizó en la siguiente etapa. 9-Hidroximetil-2-(Boc-amino)fluoreno (4): El compuesto 3 se suspendió en MeOH (200 mi) y borohidruro de sodio se añadió en porciones durante 15 minutos. La mezcla se agitó durante 30 minutos (precaución: reacción exotérmica y emisión de gas). La reacción se monitoreó por TLC (Rf = 0.5, hexano/EtOAc 1:1) y se completó. Se añadió agua (500 mi) y el pH se ajustó a 5 con ácido acético. La elaboración implicó la extracción dos veces con acetato de etilo, lavado de las capas orgánicas combinadas con bicarbonato de sodio y salmuera, secado sobre MgSC , filtración y concentración a sequedad. El crudo obtenido se purificó por cromatografía en matraz utilizando heptano/EtOAc (3:1), produciendo una espuma amarilla (36 g, 97.5% de pureza, trazas de acetato de etilo y éter dietílico observadas en la 1H-NMR). 9-hidroximetil-2-aminofluoreno (5): el compuesto 4 se añadió a una solución enfriada con hielo de HCI 4 N en dioxano. La mezcla de reacción se dejó alcanzar la RT y se agitó durante la noche. Se obtuvo un precipitado amarillo pálido. La suspensión se enfrió a 0°C y se agitó adicionalmente durante 5 horas. Después de este tiempo, el sólido se filtró y se lavó completamente con DC (5x30ml). Después del secado, se obtuvo un sólido amarillo pálido (20 g, 96.5% de pureza) con un rendimiento total de 80% durante 3 etapas. 9-hidroximetil-2-(amino-3-maleimidopropionato)fluoro (6): El 9-hidroximetil-2-aminofluoreno (5, 5.5 g, 26 mmol) y anhídrido maleimidopropiónico (6.93 g, 26 mmol) se colocaron en un RBF de 250 mi equipado con un agitador, un condensador de reflujo y un burbujeador de nitrógeno. La mezcla de reacción se calentó a reflujo a 85°C durante 25 horas. La TLC (Rf = 0.25, hexano/EtOAc 1:4) mostró la terminación de la reacción después de este tiempo. La mezcla de reacción se concentró bajo vacío para proporcionar un sólido amarillo. El producto se purificó mediante cromatografía en columna.
MAL-Fmoc-NHS (7): Un RBF de 500 mi limpio y seco con agitación por encima se cargó con trifosgeno (1.58 g, 0.35 eq.) en THF seco (55 mi) para formar una solución a temperatura ambiente. La solución se enfrió a aproximadamente 0°C con un baño de hielo/agua, y una solución de NHS (0.67 g, 0.38 eq) en THF seco (19 mi) se añadió por goteo durante 10 minutos bajo nitrógeno a 0°C. La solución resultante se agitó durante 30 minutos. Se añadió por goteo una porción adicional de NHS (1.34 g, 0.77 eq) en THF seco (36 mi) a 0°C durante 10 minutos y se agitó durante 15 minutos.
El compuesto 6 (5.5 g, 1 eq), THF seco (55 mi) y piridina (3.07 mi, 2.5 eq) se agitaron juntos para formar una suspensión. Esto se añadió a la solución de NHS en porciones de 0-5°C y luego se dejó ir a RT removiendo el baño de hielo. Después de 20 horas, se detuvo la reacción (material de partida todavía presente, si la reacción es empujada hasta su terminación se ha observado una impureza atenuadora). La mezcla de reacción se filtró y al filtrado se añadieron 4% salmuera (200 mi) y EtOAc (200 mi). Después de la separación, la capa orgánica se lavó con 5% ácido cítrico (220 mi) y agua (220 mi). La capa orgánica luego se concentró para producir 7.67 g de MAL-Fmoc-NHS cruda. El material se purificó por cromatografía en columna utilizando un gradiente de ciclohexano/EtOAc 70:30 a 40:60. Las fracciones que contienen el producto se concentraron bajo vacío para producir 3.47 g (45%) de MAL-Fmoc-NHS.
MAL-FMS-NHS (reacción de prueba): a una solución de MAL-Fmoc-NHS (100 mg, 0.2 mmol) en ácido trifluoroacético (10 mi), se añadió ácido clorosulfónico (0.5 mi). Después de 15 minutos, se añadió éter dietílico enfriado con hielo (90 mi) y el producto se precipitó. El material se recolectó por centrifugación, se lavó con éter dietílico y se secó bajo vacío. Se obtuvieron 41.3 mg (35%) de sólido beige.
Etapa 3 - Conjugación Conjugación de PEG-Fmoc-OXM: La conjugación con PEG, Fmoc y OXM se realizó en una relación molar de 1:1:1 por ejemplo PEG40-SH (44 mg, en 4.4 mi de agua equivalente a 1.0 µ?t???) se añadió al péptido (4.5 mg, equivalente a 1.0 µ????) y se añadió NaHC03 (1 M, 0.1 mi). Fmoc (Almac, 10 mg/ml en DMF, 50 µ?) se añadió con agitación. La reacción se agitó durante 24 h a RT.
Conjugación de PEG-FMS-OXM: Todas las conjugaciones se realizaron a relación molar 1:1:1 entre el PEG, el enlazador y OXM con los siguientes reactivos: PEG40-SH y PEG30-SH (NOF), FMS (Almac), EMCS (Termo Scientific), OXM (Almac). PEG 0-SH se disolvió en amortiguador de fosfato de sodio 0.1 M (Sigma) pH 7.2 a una concentración de 10 mg/ml. La solución se añadió a un equivalente de péptido OXM purificado (Almac). El enlazador MAL-FMS-NHS (Almac) se disolvió en DMF a una concentración de 10 mg/ml, se añadió un equivalente a la reacción. La mezcla se agitó durante 30 minutos. La solución se neutralizó a pH 4 utilizando ácido acético glacial (Fisher). La mezcla neutralizada se filtró (0.45 pm) y se separó utilizando cromatografía preparativa. La mezcla de reacción se filtró y se purificó por HPLC preparativa (Phenomenex Luna C18), se liofilizó y se almacenó congelada.
Los parámetros cromatográficos fueron los siguientes: Columna: Phenomenex Luna C18(2) 250 mm x 30 mm, 15 pm prep., 100A; Fase móvil A: agua (Milli-Q) + 0.1% v/v de TFA (Applied Biosystems); Fase móvil B: agua/acetonitrilo (Rathburn) (25:75) + 0.1% v/v de TFA (Applied Biosystems); Detección UV: 214 nm; Gradiente: 10% B a 65% B durante 41 minutos; y Flujo: 43 mL/min.
El contenido de OXM se determinó utilizando análisis de aminoácidos (AAA) o hidrólisis básica. Una cantidad definida de conjugado de OXM liofilizado se disolvió en agua a una concentración de 20 mg/ml. La absorbancia a 280 luego se determinó, y la concentración de acuerdo con la absorbancia a 280 nm se calculó utilizando e280 = 29,700. La concentración del péptido se cuantificó con precisión por hidrolización con ácido de una alícuota seguida por análisis cuantitativo de aminoácidos; la fracción ideal es una que tiene una estrecha concordancia entre la absorbancia calculada a 280 nm y el contenido de péptido.
Inducción del ensayo basado en células cAMP Las células CHO-K1 que sobreexpresan el receptor de GLP-1 (Millipore HTS163C2) se sembraron en una placa blanca de área media de 96 cavidades (Greiner) a una densidad de 200,000 células/ml y se incubaron durante 24 horas a 37°C. Las células se incubaron con concentraciones crecientes de OXM (ALMAC), PEG40-EMCS-OXM y PEG40-Fmoc-OXM con o sin suero de rata al 1 % (Bio reclamation). Las concentraciones de cAMP de las células se cuantificaron mediante el ensayo de HTRF (Cisbio 62AM4PEB), y el parámetro de EC50 se analizó por el software PRISM.
Estudio farmacocinético El perfil farmacocinético de P EG4o-Fmoc-OXM se evaluó de la siguiente manera: Ratas Wistar macho fueron administradas intravenosamente (IV) o subcutáneamente (SC) con una dosis única de OXM nativa (n = 9, 278 pg/kg) o con PEG-to-Fmoc-OXM (n = 6, 278 pg/kg de equivalente de péptido). Las cohortes de 3 animales por grupo se sangraron a puntos de tiempo alternados. La concentración en suero de OXM se analizó utilizando un kit de ELISA comercial (Cat # S-1393, Bachem).
Prueba de tolerancia a la glucosa IP Ratones C57BL/6 machos se mantuvieron en ayunas durante la noche y se pesaron, y los niveles de glucosa en sangre se midieron por muestreo de la vena de la cola utilizando un glucometro portátil. Los ratones fueron inyectados I P con PBS (vehículo), OXM (333 nmol/kg) , PEG40-EMCS-OXM (OXM pegilada no reversible, 333 nmol/kg de contenido de péptido por peso corporal) y PEG4o-Fmoc-OXM (202 nmol/kg de contenido de péptido por peso corporal) y PEG40-OSU (546 nmol/kg) como control. La glucosa ( 1 .5 gr/kg) se administró I P ya sea 1 5 min después de la administración del artículo de prueba (vehículo, OXM y PEG4o-Osu) o 120 min después de la administración de P EG4o-Fmoc-OXM. Los niveles de glucosa en sangre se midieron por muestreo en la vena de la cola antes de la administración de glucosa y 1 0, 20, 30, 60 y 120 min después de la administración de glucosa utilizando un glucómetro portátil.
Modelo de ratón de obesidad inducida por la dieta Estudio 1 : ratones C57BL/6J (4-6 semanas de edad, Harían UK Limited, Bicester, Oxon, Reino Unido), fueron alojados en grupo a su llegada en jaulas de polipropileno. Todos los animales tuvieron libre acceso a una dieta alta en grasas (D12451 ; 45% de kcal derivadas de la grasa; Research Diets, New Jersey, EUA) y agua de la llave en todo momento. Los animales se mantuvieron en un ciclo de fase normal de 12 h luz-oscuridad (luces encendidas a las 07:00). Los animales se expusieron a la dieta apropiada durante al menos 6 meses (hasta que el peso corporal promedio fue aproximadamente 50 g). Posteriormente, los animales fueron alojados individualmente en jaulas de polipropileno por un período adicional de dos semanas y se colocaron en la iluminación de fase inversa (luces apagadas durante 8 h desde las 09: 30-17:30 h).
Durante la segunda semana de alojamiento único, los animalee comenzaron un protocolo de manejo una vez al dia y un período de referencia de 7 días. Posteriormente, los ratones fueron dosificados con vehículo o fármaco de prueba como se da a continuación en la Tabla 1: Tabla 1 Las mediciones del peso corporal e ingesta de alimentos se realizaron diariamente hasta el día 8. La medición final de peso corporal se realizó en el Día 12. La OXM y sibutramina se formularon en PBS, ; mientras que PE.G40-FMS-OXM y PEG-SH se formularon en NaCl 147 mM, amortiguador de citrato 10 mM pH 6. El contenido de OXM en PEG40-FMS-OXM se determinó por hidrólisis básica.
Estudio 2: El Estudio 2 se realizó como se describe para el , Estudio 1. Después de un período de valor basal, los animales se ; dosificaron de acuerdo con el siguiente diseño descrito en la Tabla 2: Taoia 2 Las mediciones de peso corporal e ingesta de aumentos se : realizaron diariamente hasta el Día 14.
Estudi o 3: El Estudio 3 se realizó como se describe para el ; Estudio 1 y 2 con una diferencia, los ratones al comienzo del j experimento pesaron 45-4T g. Después de un período de valor basai, los animales se dosificaron de acuerdo con el siguiente diseño descrito en la Tabla 3: Tabla 3 Datos y análisis estadístico La OXM y Sibutramina se formularon en PBS, mientras que la PEQ40-E CS-OX , PEG40-FMS-OXM y PEG-SH 6T formularon en NaCI 147 mM, amortiguador de citrato 10 mM pH 6. El contenido de OXM en PEG40-FMS-OXM y PEG40-EMCS-OXM se determinaron por AAA.
El peso corporal e ingesta de alimentos se expresaron como valores medios ± SEM. Los datos de peso corporal, ganancia de peso corporal, ingesta de alimentos diaria y promedio e ingesta de alimentos acumulada se analizaron por ANCOVA con el valor basal como covariable, seguido por comparaciones apropiadas (dos colas) para determinar las diferencias significativas del grupo de control. P <0.05 se consideró que es estadísticamente significativo. El valor basal fue el valor del dfa 1 para el peso corporal o el consumo promedio de agua o alimentos durante el periodo de valor basal.
Ejemplo 1 Síntesis y caracterización de PEG-Fmoc-OX El péptido OXM se sintetizó por el método en fase sólida empleando la estrategia de Fmoc en todo el montaje de la cadena peptídica. El péptido se purificó por HPLC preparativa utilizando columna Phenomenex Luna C18 (250 x 30 mm) aplicando el gradiente entre la solución A (0.1% TFA + H20) y B (0.1% TFA + MeCN). La pureza del péptido fue superior al 95%, el peso molecular fue de 4449 Da (medido por MALDI). La conjugación del péptido OXM con PEGt0-SH a través del enlazador Fmoc se realizó en la presencia de NaHC03. La mezcla de reacción se agitó durante 24 h a RT, seguido por filtración y purificación por HPLC preparativa (Júpiter C5). El peeo molecular del conjugado se analizó por MALDI y el contenido de péptido OXM se analizó por AAA. El contenido promedio de péptido OXM fue 189 Mg de OXM por 1 mg de conjugado PEG-i0-Fmoc-OXM, 132,4 pg de OXM por i mg de conjugado PEGao-Fmoc-OXM , 61.7 µ9 de OXM por 1 mg dé conjugado PEG^-Frnoc-OXM y 40 g de OXM por 1 mg de conjugado PEG40-FMS-OXM.
Ejemplo 2 Perfil farmacocinético de PEG10-Fmoc-OXM, PEG2Q-Fmoc-OXM y PEG40-Fmoc-OXM en comparación con OXM nativa El perfil farmacocínético de OXM en comparación con PEG10-Fmoc-OXM y PEG20-Fmoc-OX se evaluó en ratas Wistar macho. Los animales fueron administrados con una inyección SC única de OXM nativa (278 pg/kg de péptido), PEG10-Fmoc-OXM (275 g/kg de contenido de péptido) o PEG20-Fmoc-OXM (278 pg/kg de contenido de péptido). La concentración en suero del compuesto a intervalos de tiempo indicados se midió (ELISA comercial, el perfil PK se muestra en la Figura 1 y los parámetros PK no compartimentaies convencionales 60 resumen en la Tabla 3). La pegilación reversible de OXM conjugada tanto con PEG10 y PEG20 resultó en la prolongación de la vida media de OXM nativa (0.15 hr para OXM nativa; 16.1T hr para PEG10-Fmoc-OXM y 27.38 hr para PEGíe-Fmoc-OXM). La exposición como se reflejó por el parámetro de AUC, se incrementó por aproximadamente ~450 , eces para PEG10-Fmoc-OXM y aproximadamente ~2210 para PEG2C>-Fmoc-OXM. Por lo tanto, la conjugación reversible de OXM a PEGÍ0 resultó en un efecto más prolongado en comparación con PEG10, Para caracterizar adicionalmente el perfil PK de OXM reversiblemente conjugada con PEG4o a través del enlazador Fmoc, las ratas Wistar machos fueron inyectadas IV o SC con OXM nativa o PEG„e-Fmoc-OXM (27T pg/kg de contenido de péptido) y la concentración en suero en los puntos de tiempo indicados se analizó (utilizando ELISA comercial, el perfil PK se muestra en las Figuras 2A-B y I06 parámetros PK no compartimentaies convencionales se resumen en la Tabla 4). Los resultados indicaron que la pegilación reversible prolonga la vida media del péptido OXM por roo veces, y aumenta la exposición significativamente como se refleja por él parámetro de AUC. Además, la biodisponibilidad del péptido nativo fue sólo 4.37% mientras que la administración de PEG4o-Fmoc-OXM resultó en 84% de biodisponibilidad.
Tabla 3: Parámetros PK no compartimentales de OXM y PEGi o-Fmoc-OXM y PEG2o-Fmoc-OXM después de la administración SC en ratas.
Tabla 4: Parámetros PK de OXM y PEG40-Fmoc-OXM después de la administración IV o SC en ratas.
Ejemplo 3 Inducción de cAMP por OXM y OXM pegilada reversible Para evaluar la actividad in vitro de la OXM en comparación con PEG40-Fmoc-OXM, y PEG40-EMCS-OXM (OXM PEGilada no reversible), las células CHO-K1 que sobreexpresan el receptor de GLP-1 se incubaron con concentraciones crecientes de los diferentes compuestos seguidos por cuantificación de cAMP. La OXM nativa demostró actividad mejorada en comparación con P EG4o-Fmoc-OXM y PEG40-EMCS-OXM que tuvo actividad comparable in-vitro (EC50 de 2.53x10-9, 2.07x10-6 y 5.87x10-7 para OXM, PEG40-EMCS-OXM y PEG40-Fmoc-OXM, respectivamente, Figura 3). De manera importante, la pegilación de OXM no abroga completamente la activación del receptor de GLP-1 inducida por OXM. Además, mientras que la incubación de OXM en suero resultó en una actividad reducida, probablemente debido a la proteólisis parcial del péptido, las actividades comparables en la presencia y ausencia de suero de rata se obtuvieron para PEG40-Fmoc-OXM y P EG40-EMCS-OXM, lo que sugiere que la pegilación enmascara los sitios de proteólisis potenciales en la OXM.
Ejemplo 4 Tolerancia a la glucosa inducida por OXM pegilada reversible de acción prolongada Para evaluar la actividad in vivo de la OXM o PEG4o-Fmoc-OXM, se aplicó el modelo I PGTT. Los ratones C57BL/6 en ayunas durante la noche fueron inyectados I P con péptido OXM o PEG4o-Fmoc- OXM seguido por inyección I P de glucosa y medición de los niveles de glucosa en sangre de la vena de la cola por glucómetro. La OXM (333 nmol/kg), PEG40-EMCS-OXM (OXM pegilada no reversible, 333 nmol/kg de contenido de péptido por peso corporal) y PEG40-Fmoc-OXM (202 nmol/kg de contenido de péptido por peso corporal) se administraron IP 1 5 min (OXM y P E G40-EMCS-OXM) o 2 horas PEG4o-Fmoc-OXM, antes de la inyección I P de glucosa (1 .5 gr/kg). La inducción de la tolerancia a la glucosa se comparó con el grupo de vehículo. Como control para el efecto de PEG40 , un grupo de control se administró con P EG40-OSU (546 nmol/kg). Mientras que el péptido OXM tuvo un efecto menor sobre la tolerancia a ia glucosa en comparación con el grupo de vehículo, la administración de P EG4o-Fmoc-OXM que tiene incluso menor contenido molar de OXM resultó en tolerancia a la glucosa inducida (Figuras 4A-B). Sorprendentemente, la administración de OXM pegilada no reversible resultó en la inducción de la tolerancia a la glucosa lo que sugiere que la OXM pegilada es farmacológicamente activa in vivo.
Ejemplo 5 La OXM pegilada reversible de acción prolongada reduce el peso corporal e inhibe la ingesta de alimentos en ratones DIO La actividad farmacológica de OXM se evaluó en ratones DIO después de la inyección SC de OXM nativa, y OXM pegilada reversiblemente. En el estudio 1 , los ratones DIO machos (n = 10 por grupo) se administraron ya sea con 5000 nmol/kg de peso corporal de OXM b. i.d o PEG40-FMS-OXM que contiene 5000 nmol/kg de OXM por peso corporal cada dos días durante siete días de dosificación. El peso corporal y la ingesta de alimentos se midieron diariamente durante 8 días con una medición final del peso corporal en el día 12. La inyección dos veces al día de OXM resultó en una reducción moderada tanto del peso corporal (6% de pérdida de peso en el día 8 en comparación con el grupo de control de vehículo) como la inhibición estadísticamente significativa de la ingesta de alimentos. Por otra parte, la administración de PEG40-FMS-OXM que tiene el mismo contenido de péptido OXM por dosis, pero inyectado cada dos días resultó en una marcada pérdida de peso (24% de pérdida de peso en el día 8 en comparación con el grupo de control de PEG-SH) y manifestó una inhibición sustancial de la ingesta de alimentos (Figuras 4A-B). La sibutramina, un inhibidor de la recaptación de neurotransmisores, que se utilizó como control positivo redujo el peso corporal por 15.6%. De nota, la reducción del peso corporal en el grupo PEG40-FMS-OXM fue consistente hasta la última medición en el día 12, que es de 5 días después de la última dosis, lo que indica un comportamiento de larga duración de la OXM pegilada reversiblemente (Figuras 5A-B).
Puesto que PEG40-EMCS-OXM indujo la tolerancia a la glucosa en el modelo IPGTT, fue importante comparar la eficacia de OXM pegilada no reversible a OXM pegilada reversiblemente en el contexto del peso corporal y la ingesta de alimentos. En consecuencia, un estudio de seguimiento fue diseñado para hacer frente a este problema (estudio 2 en los materiales y métodos). Mientras que la administración de 5000 nmol/kg de peso corporal de PEG40-FMS-OXM cada 3 días (total de 3 inyecciones) resultó en una reducción sustancial del peso corporal , inyección de 5000 n mol/kg de peso corporal P EG40-EMCS-OXM en la m isma frecuencia resultó en un efecto insignificante sobre el peso corporal . Sorprendentemente, la inyección ún ica en el Día 1 de 8000 nmol/kg de peso corporal de PEG40-FMS-OXM resultó en la reducción de peso aparente durante 6 días. Sorprendentemente, la administración de 5000 nmol/kg de peso corporal de P EG30-FMS-OXM resultó en una red ucción elevada del peso corporal lo que indica una eficacia mejorada en comparación con PEG40-FMS-OXM (Fig uras 6A-B).
La OXM es un péptido potencial para el tratamiento de trastornos metabólicos tales como la diabetes y la obesidad , como se demuestra por la pérdida de peso obtenida por la OXM nativa en sujetos saludables con sobrepeso y obesos (Wynne et al , 2005) . Sin em bargo, debido a la corta vida media del péptido y su baja estabil idad in vivo, se requ ieren admin istraciones diarias repetidas de dosis supra-fisiológicas para lograr u n efecto farmacológico en los seres h umanos. Esta patente proporciona med ios efectivos para la estabilización de OXM en cond iciones fisiológicas pegilando reversiblemente la OXM volviéndola de acción prolongada . I nesperadamente, la OXM modificada - la versión pegilada es activa y no es un mero pro-fármaco.
La OXM pegilada reversiblemente demostró perfil farmacocinético superior en las ratas con un aumento sustancial en la exposición y vida media prolongada en comparación con la OXM nativa . Al com parar el efecto de PEG con varios pesos moleculares conj ugados reversiblemente con OXM en el perfil OXM-PK, el conjugado PEG40 demostró un efecto de prolongación superior en comparación con PEG 10 o P EG20. Por lo tanto, el P EG40 se evaluó adicionalmente en estud ios farmacológ icos (Figuras 1 y 2) . De manera im portante, la biodisponibi lidad de OXM aumentó significativamente desde 4.37% a 84.6% después de la adm inistración SC de PEG4o-Fmoc-OXM, que contribuye a la exposición aumentada de péptido pegilado reversiblemente (Tabla 2) . P EG4o-Fmoc-OXM mejoró la tolerancia a la glucosa en comparación con la OXM nativa como se evaluó en el modelo I PGTT de ratones C57BL/6 en ayunas durante la noche. En este modelo una OXM pegilada no reversible conj ugada con P EG40 ( P EG40-EMCS-OXM) demostró una actividad de inducción de tolerancia a la glucosa comparable con PEG40-Fmoc-OXM . Este resultado es apoyado además por la actividad in vitro observada para P EG40-EMCS-OXM y PEG40-Fmoc-OXM en las cuales la peg ilación convencional de OXM no suprime completamente la unión de OXM a su receptor, un fenómeno observado para los péptidos pegilados debido a la interferencia esférica , y en consecuencia no resulta en la pérdida total de la actividad biológica (Figuras 3 y 4) .
A continuación , el efecto de P EG40-FMS-OXM en el peso corporal y la ingesta de alimentos se evaluó en ratones DIO en comparación con la OXM nativa . La inyección SC de 5000 nmol/kg de OXM nativa administrada dos veces al día resultó en u na reducción moderada del peso corporal y la ingesta de alimentos después de 7 días de dosificación. En contraste, la inyección de 5000 nmol/kg de P EG40-FMS-OXM cada dos días resultó en una marcada reducción tanto del peso corporal como de la ingesta de alimentos (6% y 24.9% de reducción del peso corporal para OXM y P EG40-FMS-OXM respectivamente, Figuras 5A-B) en comparación con el control en el Día 8. En conclusión , PEG40-FMS-OXM exhibió un efecto anti-obesidad prolongado y eficacia mejorada considerando que la dosis acumulativa de la OXM admi nistrada durante el estudio para P EG40-FMS-OXM fue casi 4 veces menor en comparación con el grupo ad m inistrado con la OXM nativa .
La OXM pegi lada no reversible, P EG40-EMCS-OXM , mostró que mejora la tolerancia a la glucosa en la prueba I PGTT. Por lo tanto, fue imperativo evaluar la actividad de regulación de los alimentos de la peg ilación convencional en comparación con la OXM pegi lada reversiblemente y OXM nativa en el modelo de DI O. La administración de 5000 nmol/kg de PEG40-EMCS-OXM cada tres días resu ltó en una reducción insignificante del peso corporal a pesar de q ue la inh ibición de la ingesta de alimentos fue evidente hasta 3 d ías después de la dosificación (Figuras 6A-B) . La inhibición moderada de la ingesta de alimentos probablemente resulta de la actividad directa de OXM en el tracto gastrointestinal y se correlaciona con la actividad periférica observada en el modelo de I PGTT. Como la actividad de regu lación de los alimentos por OXM implica el cruce de la barrera hematoencefalica y la un ión a los receptores en las neuronas en el ARC , es im perativo que la capacidad de la OXM para penetrar en el SNC no será abolida. La bioactividad periférica observada de P E G40-EMCS-OXM como se opone a la falta de capacidad de este compuesto para reducir el peso corporal de ratones DI O sugiere que el enlace covalente a la porción de PEG restringe la capacidad de PEG40-EMCS-OXM para pasar a través la B6B en el ARC, que es el sitio de acción de potencial de la OXM en el hipotálamo. En contraste, la inyección de 5000 nmol/kg de PEG40-FMS-OXM en la misma frecuencia reduce notablemente el peso corporal y la ingesta de alimentos i nhibida por 20% como se mide en el día 12. Sorprendentemente, la inyección de 8000 nmol/kg de PEG40-FMS-OXM una vez a la semana resultó en reducción del peso corporal similar por 20% , lo que indica que en los seres humanos, la pérdida de peso significativa se puede lograr por una inyección una vez a la semana o incluso dosificación menos frecuente de la OXM pegilada reversiblemente.
La estrategia de pegilación reversible es el objetivo para superar la pérdida de actividad observada a menudo en la pegilación convencional mientras se retiene el efecto de prolongación del fármaco. En los casos donde la bioactividad del profármaco pegilado se pierde drásticamente o incluso es abolida , la ventaja de la aplicación de peg ilación reversible se probó previamente (Patente de Estados U nidos No. 7585837) . Si n embargo, no se sabe cuál será la eficacia de un profármaco pegilado reversiblemente en comparación con el fármaco covalentemente pegilado no reversible que retiene su actividad biológica. Esto es especialmente relevante cuando se espera que el perfil PK del péptido covalentemente pegilado sea superior en comparación con el péptido pegilado reversible cuando se evalúan las concentraciones en sangre de conjugado, debido a la lenta liberación del péptido del conjugado. La P EG40-EMCS-OXM mostró que es activa tanto in vitro como en el modelo de I PGTT in vivo. Por lo tanto, fue posible que esta molécula también indujera la saciedad y redujera el peso corporal después de la administración SC a ratones. Sin embargo, esto ha mostrado ser incorrecto ya que la P EG40-EMCS-OXM no reduce el peso corporal en ratones DIO mientras que la P EG40-FMS-OXM tuvo un efecto marcado. La publicación previa presentó datos contradictorios referentes a la contribución de la actividad periférica de OXM y la actividad en el CNS de OXM. Por una parte, las acciones anoréxicas de la OXM ip fueron bloqueadas por la administración previa ¡ntra-ARC de GLP-1 R, exendinag- 39 indicando la importancia de la actividad relacionada con el CNS de OXM (Dakin et al 2004). Sin embargo, un suministro oral de Bifidobacterium que expresa OXM a ratones con sobrepeso resultó en la reducción del peso corporal, mientras que la OXM no se detectó en el plasma de este ratones, lo que sugiere que la activación directa de las células gastrointestinales es importante para la actividad de la pérdida de peso de OXM (Long et al, 2010). Como se mencionó anteriormente la falta de información sobre el modo de acción de la OXM y el impacto de la pegilacion, fue imposible predecir cuál será la eficacia de la OXM pegilada reversiblemente en comparación con la OXM nativa y la OXM pegilada covalentemente unida.
La eficacia superior de P EG30-FMS-OXM en comparación con PEG40-FMS-OXM como se muestra en el estudio 2 fue sorprendente. Aunque el perfil PK de P EG30-FMS-OXM no se evaluó, el perfil PK PEG40-FMS-OXM fue claramente superior a PEG10-FMS-OXM y P EG20-FMS-OXM. Es posible que el uso de PEG30 presente el tamaño de PEG favorable que, por una parte, reduce de manera significativa la depuración renal del conjugado P EG30-FMS-OXM, mientras que facilita la velocidad de hidrólisis de la OXM del conjugado que permite una presencia sostenida de OXM requerida para la obtención de sus actividades farmacológicas.
Estudio 3 En este estudio se evaluó la conjugación de OXM con PEG de diversos tamaños. Como se muestra en los estudios previos, la administración de PEG30-FMS-OXM y PEG40-FMS-OXM una vez a la semana tuvo un marcado efecto sobre el peso corporal. Sorprendentemente, PEG5-FMS-OXM perdió completamente la capacidad de inducir la pérdida de peso en comparación con el grupo de vehículo, mientras que PEG60-FMS-OXM indujo una reducción aún más pronunciada que PEG30-FMS-OXM . La diferencia en la pérdida de peso entre PEG30-FMS-OXM y PEG40-FMS-OXM en este estudio estuvo en el intervalo de variabilidad del experimento y no fue significativa.
Ejemplo 6 Perfiles Glucémicos y Lipidémicos Mejorados en Ratones Obesos Tratados con OXM PEGilada Reversible Materiales y Métodos Procedimientos Experimentales para el Modelo de Ratón con Obesidad Inducida por la Dieta (DIO): El modelo de DIO se realizó en RenaSci Ltd (Nottingham , Reino Unido). Los ratones C57BL/6J (4-6 semanas de edad, Harían UK Limited, Bicester, Oxon, Reino Unido), fueron expuestos a una dieta alta en grasas (D12451; 45% de kcal derivadas de la grasa; Research Diets, New Jersey, EUA) durante al menos 6 meses (hasta que el peso corporal promedio es aproximadamente 50 g). Dos semanas antes de la administración del fármaco, los animales fueron alojados individualmente y se colocaron en iluminación de fase inversa (luces apagadas durante 8 h desde 09:30-17:30 h). Durante la primera semana de alojamiento único (período de manejo), los animales comenzaron un protocolo de manejo una vez al día y durante la segunda semana (período de valor basal), fueron dosificados con el vehículo apropiado b.i.d. o una vez a la semana, ya que fueron dosificados durante el período de tratamiento) por una ruta subcutánea. 7 grupos (n = 8) de ratones DIO fueron dosificados durante 29 días de la siguiente manera: Durante el valor basal y período de tratamiento, la ingesta de alimentos, ingesta de agua y peso corporal se registraron diariamente. En los días 1 y 22 después de un valor basal de dos semanas, todos los ratones se mantuvieron en ayunas durante la noche. En los días 2 y 23, los ratones se sometieron a una prueba oral de tolerancia a la glucosa (OGTT). Cada animal fue dosificado con vehículo o compuesto de prueba y 60 minutos más tarde fue dosificado con D-glucosa (2 g/kg por vía oral). Las muestras de sangre de valor basal fueron tomadas inmediatamente antes de la dosificación con vehículo o compuesto de prueba (B1 ) e inmediatamente antes de la carga de glucosa (B2). Las muestras de sangre adicionales se tomaron 1 0, 20, 30, 45, 60 y 120 minutos después de la administración de glucosa. Todas las muestras de sangre (aproximadamente 20 µ?) se tomaron de la vena de la cola. Las muestras de plasma se prepararon y se sometieron a ensayo para la glucosa (n = 2) y la insulina (n = 1 ) utilizando el reactivo de glucosa Thermoelectron Infinity (TR15421 ) y ELISA de insulina de ratón ultrasensible Alpco (80-INSMSU-E 10), respectivamente. En el Día 30, se recolectaron muestras de plasma terminales (24 horas después de la dosis final en el día 29) por punción cardiaca y se sometieron a ensayo para la insuli na , glucosa, colesterol y triglicéridos utilizando ELI SA de insulina de ratón ultrasensible (80-I NSMS U-E 1 0) , reactivo de glucosa Thermoelectron I nfinity (TR1 5421 ) , reactivo de colesterol Thermoelectron I nfinity (TR1 3421 ) y el kit de Sigma Triglyceride (TR01 00) . Los pesos finales de esqueletos se registraron después del muestreo de sangre terminal y los cadáveres se congelaron a -20°C.
Procedim ientos experimentales para los estudios de composición corporal : Los niveles de grasa corporal , proteínas, agua y cenizas de los cadáveres se determinaron utilizando técnicas de anál isis químico estándar. Sólo se midió el contenido de grasa , proteína, agua y cenizas, puesto que otros componentes (principalmente carbohidratos) forman menos de 2% de la composición total del cuerpo. El agua del cadáver se determinó por liofilización de los cadáveres de ratón a peso constante. Los cadáveres secos luego se molieron en una trituradora de laboratorio listos para análisis subsecuente. La grasa del cadáver se determinó en las muestras liofilizadas utilizando un protocolo de extracción de Soxhiet modificado (éter de petróleo a 40-60°C) con u n sistema Tecator Soxtec 2050 (Foss U K Ltd , Wheldrake, Reino Unido) de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. Las proteínas del cadáver se determ inaron utiliza ndo un procedimiento de m icro-Kjeldahl en las muestras liofilizadas uti lizando un bloque de d igestión Tecator 201 2 y unidad de destilación 2200 (Foss UK Ltd) . Las cenizas de cadáveres residuales se determinaron incinerando las muestras liofilizadas a altas temperaturas utilizando un horno de i ncineración de mufla .
Datos y análisis estadísticos: Los pesos corporales, la ingesta de ali mentos y la ingesta de agua se expresan como valores medios ± SEM . Los datos del peso corporal , ganancia de peso corporal , ingesta de alimentos diaria y promedio e ingesta de agua e ingesta de alimento acumulada se analizaron por ANCOVA con valor basal como una covariable, seguido por comparaciones apropiadas (dos colas) para determinar las diferencias significativas del grupo control . P < 0.05 se consideró estadísticamente sig nificativo. El valor basal fue el valor del día 1 para el peso corporal o el consumo promedio de alimento o agua durante el período de valor basal.
La insulina , colesterol y triglicéridos en plasma terminal se analizaron por modelo lineal general con el tratamiento como un factor y el orden de sangrado y el peso corporal de valor basal como covariables seguido por comparaciones apropiadas (dos colas) para determinar las diferencias significativas del grupo de vehículo relevante. Si es apropiado se util izaron técnicas de regresión robusta y/o transformación logarítmica .
Los datos para cada parámetro de composición corporal (grasa , proteínas, agua y cenizas) se presentaron como g/cadáver y % total . Los pesos finales de cadáveres también se anal izaron como una comparación directa . El análisis se hizo mediante regresión robusta con el tratam iento como un factor y el peso corporal en el valor basal como una covariable, seguido por pruebas apropiadas de comparaciones múltiples (dos colas) para com parar los efectos de cada grupo de tratamiento con el grupo de vehículo relevante.
Resultados Una inyección semanal de PEG30 reversible (PEG30-FMS-OXM (6, 000 nmol/kg; amortiguador de citrato)) o PEG40 reversible (PEG40-FMS-OXM (6,000 nmol/kg ; amortiguador de citrato)) , durante un período de 30 días , proporcionó 28% y 23% de pérd ida de peso, respectivamente, en comparación con 1 7% de pérdida de peso para el grupo inyectado dos veces al día con oxintomodulina nativa (Figura 7) -mientras que la dosificación acumulativa de la oxintomodulina neta inyectada con PEG30 reversible fue sólo 8.6% para el período de 30 días. Las OXM pegiladas no reversiblemente (PEG40-EMCS-OXM y PEG30-EMCS-OX ) fueron aún menos efectivas en la reducción del peso corporal.
La tolerancia a la glucosa en ratones DI O después de las inyecciones semanales con OXM PEGilada reversible (PEG30-FMS-OXM o PEG40-FMS-OXM) fue comparable con la tolerancia a la glucosa provocada por una inyección dos veces al d ía de oxintomodulina nativa en el Día 2 (Figura 8A) y en el Día 23 (Figura 8B) .
Además, una administración una vez a la semana de OXM PEGilada reversi ble mejoró los perfil glucémico y lipídico en ratones DIO, demostrado por una reducción en la glucosa terminal (Fig ura 9A) , una reducción en la insulina terminal (Figura 9B), una reducción en el colesterol terminal (Figura 9C), y una reducción en el glicerol terminal (Figura 9D).
Finalmente, un análisis de la composición corporal de los ratones DIO demostró que la pérdida de peso demostrada por los ratones tratados con OXM PEGilada reversible resultó de una reducción específica de la grasa (Figuras 10A-D).
En conjunto, la PEGilación inversa mostró que es segura y tolerable en diferentes modelos toxicológicos de animales roedores. La PEGilación inversa también permite el alargamiento de la vida media de la OXM, mientras mantiene su potencial para penetrar en los tejidos objetivo (por ejemplo, penetrar la BBB).
La OXM pegilada reversiblemente demostró propiedades superiores de acción prolongada, soportando la inyección una vez a la semana en los seres humanos. La OXM PEGilada reversiblemente redujo el peso corporal por una reducción específica en grasas (evaluación de composición corporal) . La OXM PEGilada reversiblemente mejoró los perfiles glucémicos y Mpidémicos. Se espera que la OXM PEGilada reversiblemente proporcione terapia de largo plazo para pacientes con obesidad y diabetes Tipo I I a través de sus impresionantes efectos sobre la actividad de la glucemia y la pérdida de grasa.
Ejemplo 7 Efecto de la OXM pegilada reversible en el nivel de la glucosa y la secreción de insulina Proced imientos experimentales para el modelo de ratón de Obesidad I nducida por la Dieta (DIO): El modelo de DIO se real izó en RenaSci Ltd (Nottingham , Reino Unido) . Los ratones 57BL/6J (4-6 semanas de edad , Harían U K Limited , Bicester, Oxon , Reino U nido) , se expusieron a una dieta rica en grasas ( 1 2451 D; 45% de kcal derivadas de la grasa; Research Diets, New Jersey, EUA) durante al menos 6 meses (hasta que el peso corporal promed io fue aproximadamente 50 g) . Dos semanas antes de la administración del fármaco, los animales fueron alojados individualmente, donde comenzaron un período de aclimatación. En la primera semana, el periodo de manejo, los animales comenzaron un protocolo de manejo una vez al d ía y durante la segunda semana, el período de valor basal, fueron dosificados con el veh ículo apropiado; (b. i. d . o una vez a la semana cuando fueron dosificados durante el periodo de tratamiento) por una ruta subcutánea . Durante el valor basal y el período de tratamiento, la ingesta de al imentos, ingesta de agua y el peso corporal se registraron diariamente. En la mañana del día 1 , los ratones fueron dosificados seguido de un ayuno durante la noche. En el día 2, 24h después de la siguiente administración (grupos A-E) o antes de la dosis de la mañana (grupos F-H) , los ratones fueron muestreados para la glucosa en ayunas e insu lina en ayunas. Todas las muestras de sangre (aproximadamente 20 µ?) se tomaron de la vena de la cola. Las muestras de plasma se prepararon y se sometieron a ensayo para la glucosa (n = 2) y la insulina (n = 1 ) util izando el reactivo de glucosa Thermoelectron Ifinity (TR1 5421 ) y ELISA de insulina de ratón ultrasensible Alpco (80-I NSMSU-E 10), respectivamente.
Resultados En este conjunto de experimentos se realizaron dos estudios in vivo independientes. El primer experimento incluyó 8 grupos (n = 8) de ratones DIO que fueron dosificados durante 2 días de la siguiente manera: El segundo experimento incluyó 7 grupos (n = 7) de ratones DIO que fueron dosificados durante 2 días de la siguiente manera: En ambos estudios la administración de una dosis única de todas las variantes de PEG-OXM: PEG40-EMCS-OXM, PEG30-EMC S-OXM, PEG40-FMS-OXM, PEG30-FMS-OXM (Exp. #1 ) o PEG30-FMS-OXM, PEG40-FMS-OXM y PEG60-FMS-OXM (Exp. #2) produjo reducciones marcadas y significativas en la glucosa en ayunas en comparación con el vehículo (Figuras 1 1 y 12). En el experimento #1 el grupo de vehículo (PEG40-SH) exhibe nivel de glucosa de 9.5 mM mientras que los grupos tratados con PEG-OXM exhiben nivel de glucosa de 5.1 8 a 5.8 mM. Se obtuvo la misma reducción del nivel de glucosa también para el grupo tratado con PEG-OXM en el Experimento # 2 (excepto el grupo de PEG5-OXM) que mostró reducción de glucosa desde 1 1 .9 mM del grupo de vehículo a 5-5.7 mM del grupo tratado con PEG-OXM. Este efecto estuvo asociado con una reducción de los niveles de insulina en plasma en ayunas en el experimento #1 desde 2.8 ng/ml del grupo de vehículo a 1 .4-1 .9 ng/ml de los grupos tratados con PEG- OXM , como se m uestra en la Figura 1 1 . En el Experimento #2 el nivel de insulina en ayunas fue 0.99 ng/m l mientras que el nivel de insul ina en ayunas de PEG-OXM (excepto PEG5-OXM) fue 0.78 a 0.91 ng/ml .
El liraglutido en am bos experimentos redujo sig nificativamente la glucosa en ayunas en comparación con el vehícu lo (PBS) ; 9.3 m M de vehículo se dismin uyó a 6.06 m M en el experimento #1 y 1 1 .5 m M de vehículo se d isminuyó a 6.7 mM en el experimento #2. Junto con esta reducción de la glucosa , este grupo tratado exhibió el aumento significativo en la insulina en plasma desde 2.5 ng/ml de vehículo a 4.4 ng/ml en el experimento #1 y desde 1 .98 ng/m l a 3 ng/ml en el experimento #2. El péptido OXM nativo se analizó en el experimento #1 y no mostró alguna diferencia significativa en los niveles de glucosa e insulina en comparación con el veh ículo, probablemente debido a su corta vida media en suero y depuración m uy rápida del cuerpo.
Los resu ltados de estos dos experimentos i ndepend ientes en ratones DIO revelan que los compuestos PEG-OXM inducen una reducción significativa del nivel de glucosa pero sin aumentar el nivel de insulina como se observó después de la administración de liraglutido, y como se esperaba a partir de los datos anteriormente que se han mostrado para el péptido OXM nativo. Esta reducción inesperada del nivel de glucosa junto con la reducción de los niveles de insulina en ayunas indica que una dosis única de PEG-OXM conduce al aumento de la sensibilidad de los animales a la insulina ya después de la exposición aguda y no debido al tratamiento crónico.
Mientras que ciertas características de la invención se han ilustrado y descrito en la presente, muchas modificaciones, sustituciones, cambios y equivalentes se les ocurrirán a los expertos en la técnica. Por lo tanto, se debe entender que las reivindicaciones adjuntas están destinadas a cubrir todas las modificaciones y cambios que caigan dentro del verdadero espíritu de la invención.

Claims (39)

REIVINDICACIONES
1 . Una composición, caracterizada porque consiste de una oxintomodulina, un polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (F S).
2. La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque el polímero de PEG se une al amino terminal o residuo Usina de la oxintomodulina a través de Fmoc o FMS.
3. La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque la oxintomodulina consiste de la secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID NO: 1 .
4. La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque el polímero de PEG es un polímero de PEG con una porción de sulfhidrilo.
5. La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque el polímero de PEG es P EG30, P EG40 o PEG60.
6. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende la composición de conformidad con la reivindicación 1 y un portador farmacéutico aceptable.
7. Un método para prolongar la vida media biológica de la oxintomodulina, caracterizado porque consiste de la etapa de conjugar la oxintomodulina, un polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS) en una relación molar de aproximadamente 1 : 1 :0.5 a aproximadamente 1:1:3.5.
8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la oxintomodulina consiste de una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1.
9. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el polímero de PEG se conjuga con el amino terminal o residuo lisina de la oxintomodulina a través de Fmoc o F S.
10. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el polímero de PEG es un polímero de PEG con una porción de sulfhidrilo.
11. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el polímero de PEG es PEG30, PEG40 o PEG60.
12. Un método para inducir la tolerancia a la glucosa, control glucémico, o ambos en un sujeto en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 1 y un portador farmacéutico aceptable.
13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la oxintomodulina consiste de una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1.
14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el polímero de PEG se conjuga con el amino terminal o residuo lisina de la oxintomodulina a través de Fmoc o FMS.
15. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el polímero de PEG es un polímero de PEG con una porción de sulfhidrilo.
16. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el polímero de PEG es PEG30, PEG40 o PEG60.
17. Un método para mejorar el área bajo la curva (AUC) de la oxintomodulina, caracterizado porque consiste de la etapa de conjugar un polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) con el amino terminal de la oxintomodulina a través de 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
1 8. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la oxintomodulina consiste de una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1 .
19. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el polímero de PEG se conjuga con el amino terminal o residuo lisina de la oxintomodulina a través de Fmoc o FMS.
20. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el polímero de PEG es un polímero de PEG con una porción de sulfhidrilo.
21 . El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el polímero de PEG es PEG30, PEG40 o PEGeo.
22. Un método para reducir la frecuencia de dosificación de la oxintomodulina, caracterizado porque consiste de la etapa de conjugar un polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) con el amino terminal de la oxintomodulina a través de 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la oxintomodu lina consiste de una secuencia de am inoácidos de SEC I D NO: 1 .
24. El método de conformidad con la reivind icación 22 , caracterizado porque el pol ímero de PEG se conjuga con el amino terminal o residuo lisina de la oxintomodulina a través de Fmoc o FMS.
25. El método de conformidad con la reivind icación 22 , caracterizado porque el polímero de PEG es un polímero de PEG con una porción de sulfhidrilo.
26. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el polímero de PEG es PEG3o, P EG40 o PEGeo.
27. Un método para reducir la ingesta de alimentos, reducir el peso corporal , o ambos en un sujeto, caracterizado porque comprende la etapa de adm in istrar la oxintomodulina conjugada con el polímero de polietilenglicol (pol ímero de PEG) a través de un en lazador flexible al sujeto, en donde el enlazador flexible es 9-fluoreni lmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-su lfo-9-fluoren ilmetoxicarbonilo (FMS).
28. El método de conformidad con la reivindicación 27 , caracterizado porque la oxintomodulina consiste de una secuencia de aminoácidos de SEC I D NO: 1 .
29. El método de conformidad con la reivindicación 27 , caracterizado porque el polímero de PEG se conj uga con el amino terminal o residuo l isina de la oxintomodulina a través de Fmoc o FMS.
30. El método de conformidad con la reivindicación 27 , caracterizado porque el polímero de PEG es un pol ímero de PEG con una porción de sulfhidri lo.
31 . El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el polímero de PEG es PEG30 , PEG40 o PEG6o.
32. Un método para aumentar la sensibilidad a la insulina en un sujeto, caracterizado porque comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende la oxintomodulina conjugada con el polímero de polietilenglicol (polímero de PEG).
33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el polímero de PEG es PEG30, PEG40 o PEG60.
34. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la oxintomodulina se conjuga con el polímero de polietilenglicol (polímero de PEG) a través de un enlazador.
35. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el enlazador es un enlazador flexible escindible.
36. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el enlazador es un enlazador no escindible.
37. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el enlazador flexible es 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
38. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el enlazador es éster de ?-(e-maleimidocaproiloxi)succinimida (EMCS).
39. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la administración de la composición resulta en un aumento agudo en la sensibilidad a la insulina en el sujeto. RES UM E N Se describen agonistas de receptor de GLP-1 /Glucagón pegilados y pegilados inversos incluyendo composiciones farmacéuticas comprendiendo los mismos y métodos para usar los mismos.
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