JP2014516993A - 長時間作用型ｇｌｐ−１／グルカゴン受容体アゴニスト - Google Patents

長時間作用型ｇｌｐ−１／グルカゴン受容体アゴニスト Download PDF

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Abstract

ペギル化および逆ペギル化ＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニスト、それを含む薬学的組成物、およびその使用方法が開示される。
【選択図】図１３

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、２０１１年６月２日出願の米国特許仮出願第６１／４９２，４４８号および２０１２年４月１６日出願の米国特許仮出願第６１／６２４，５８９号の優先権を主張する。これらの出願は、参照により本明細書中で援用される。
ペギル化および逆ペギル化オキシントモジュリン、それを含む薬学的組成物、およびその使用方法が開示される。
タンパク質、特に短いペプチドは、血中、肝臓または腎臓内で変性または酵素分解を受け易い。したがってタンパク質は、通常、循環半減期が７時間と短い。ペプチド薬は、その安定性が低いため、通常は、活性ペプチドの有効血症濃度を保持するよう、持続的な頻度で送達される。さらに、ペプチド薬は通常は注入により投与されるため、ペプチド薬の頻繁な注射は、対象に少なからぬ不快を引き起こす。したがって、治療用タンパク質およびペプチドの高い薬理学的効力を保持しつつ、その半減期を延長する技術が必要とされている。このような所望のペプチド薬は、対象に注射された場合の、血清安定性増大、高活性および望ましくない免疫応答を誘導する確率の低さといった要件も満たす必要がある。
好ましくない薬物動態、例えば短い血清半減期は、この点を除けば多数の見込みのある薬剤候補の薬剤開発を妨げ得る。血清半減期は分子の経験的特質であり、各々の新規の潜在的薬剤に関して実験的に決定する必要がある。例えば、低分子量タンパク質薬では、生理学的クリアランス機序、例えば腎臓濾過は、必要とされる投薬レジメンの経費または頻度のため薬剤の治療レベルの保持を実施不能とし得る。
消化管は、摂食行動を調節する多数のペプチドホルモン、例えば膵臓タンパク質（ＰＰ）、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）およびオキシントモジュリン（ＯＸＭ）の合成および放出に関与する。ＯＸＭは、小腸およびＣＮＳにおけるプログルカゴンの組織特異的翻訳後プロセシングから生じる。それは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方でＯＸＭの特性に寄与することが示されたが、単独ではペプチドの作用に十分でないＣ末端塩基性オクタペプチド伸長を有する完全グルカゴン配列を含めた３７のアミノ酸を含有する。食物摂取に応答して、ＯＸＭが、小腸Ｌ細胞により、食事のカロリー含有量に比例して血流中に分泌される。
ＯＸＭは、経口および腹腔内投与の両方の後に、インスリン分泌の刺激によりグルコースクリアランスを増大させる。ＯＸＭは、食物摂取の制御も調節する。視床下部の室傍核および弓状核（ＡＲＣ）中へのＯＸＭの側脳室内（ＩＣＶ）および核内注射は、絶食ラットにおける再供給を抑制する（Ｄａｋｉｎ ｅｔ ａｌ． ２００１；Ｄａｋｉｎ ｅｔ ａｌ． ２００４）。この抑制は、暗期の開始時に自由に食餌させたラットにおいても実証されている。さらに、ＯＸＭの末梢投与は、絶食誘導および暗期食物摂取の両方を、用量依存的に抑制した（Ｄａｋｉｎ ｅｔ ａｌ． ２００４）。
可逆的ペギル化と呼ばれる新規の概念的アプローチは、タンパク質およびペプチドの半減期の延長に関して、以前に報告された（国際公開第ＷＯ９８／０５３６１号；Ｇｅｒｓｈｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。この技法によれば、塩基に対して感受性で、軽度の塩基性条件下、例えば生理学的条件下で除去可能である官能基で薬剤を誘導体化することにより、プロドラッグが調製される。誘導体化は、薬剤分子の少なくとも１つのアミノ、ヒドロキシルメルカプトおよび／またはカルボキシル基を、リンカー、例えば９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）で置換し、それにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分が結合されることを包含する。ＰＥＧ部分と薬剤の間の連結は直接的でなく、むしろ両方の残基が、塩基性条件に高度に感受性である足場ＦＭＳまたはＦｍｏｃ構造の異なる位置に連結される。本発明は、ペギル化技法を利用してペプチドの半減期が延長されるＯＸＭ誘導体に関する。
一実施形態において、本発明は、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を介してポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）と連結されるかまたは結合されるデュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストからなる組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、対象における食物摂取を低減するため、体重を低減するため、またはその両方のための方法であって、フレキシブルリンカーを介してポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）と結合されるデュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを前記対象に投与するステップを含む方法であって、前記フレキシブルリンカーは９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）である方法をさらに提供する。別の実施形態では、リンカーは開裂可能リンカーである。
別の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象においてグルコース耐容性を誘導する、血糖制御を改善する、またはその両方の方法であって、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を介してポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）と連結されるデュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストおよび薬学的に許容可能な担体からなる有効量の組成物を前記対象に投与するステップを含む方法をさらに提供する。
別の実施形態では、本発明は、対象におけるインシュリン抵抗性を低減するための方法であって、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）と結合されるデュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを含む有効量の組成物を前記対象に投与するステップを含む方法をさらに提供する。
別の実施形態では、本発明は、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を含むフレキシブルリンカーを介してポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）とアゴニストを結合するステップからなるＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストの生物学的半減期を延長するための方法をさらに提供する。
別の実施形態では、本発明は、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を含むフレキシブルリンカーを介してポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）とアゴニストを結合させるステップからなる、デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストの生物学的半減期を延長するための方法をさらに提供する。
別の実施形態では、本発明は、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を介して前記アゴニストのアミノ末端とポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）を結合させるステップからなる、ＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストの曲線下面積（ＡＵＣ）を改善するための方法をさらに提供する。
別の実施形態では、本発明は、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を介して前記オキシントモジュリンのアミノ末端とポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）を結合させるステップからなる、ＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストの投薬回数を減らすための方法をさらに提供する。
一実施形態では、本発明は、対象におけるインスリン感受性を増大させる方法であって、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）と結合されるデュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを含む有効量の組成物を前記対象に投与するステップを含む方法をさらに提供する。別の実施形態では、本発明は、短期処置または長期処置後の対象におけるインスリン感受性を増大させる方法であって、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）と結合されるデュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを含む有効量の組成物を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明の例および図面から明らかになる。しかしながら、詳細な記述および具体例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方で、本発明の趣旨および範囲内の種々の変更および修正はこの詳細な記述から当業者に明らかになるため、例証として示されているだけである点が理解されるべきである。
雄ラットにおけるＯＸＭ、ＰＥＧ１０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ２０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭの薬物動態プロフィールを示すグラフ。０．５ｍｌのＰＢＳ緩衝液中のネイティブＯＸＭ（６２ｎｍｏｌ／ｋｇ）、ＰＥＧ１０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ（２７８μｇ／ｋｇのＯＸＭペプチドを含有）またはＰＥＧ２０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ（６２ｎｍｏｌ／ｋｇのＯＸＭペプチドを含有）の単一回ＳＣボーラス注射をラットに投与した。血清試料を特定時点で頚静脈から採取し、ＯＸＭＥＬＩＳＡキット（Ｂａｃｈｅｍ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてＯＸＭ濃度を分析した。 雄ラットにおけるＯＸＭおよびＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭの薬物動態プロフィールを示すグラフ。０．５ｍｌのＰＢＳ緩衝液中のネイティブＯＸＭ（６２ｎｍｏｌ／ｋｇ）またはＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ（６２ｎｍｏｌ／体重１ｋｇのＯＸＭペプチドを含有）の単一回ＩＶボーラス（Ａ）またはＳＣ（Ｂ）注射をラットに投与した。血清試料を特定時点で頚静脈から採取し、ＯＸＭＥＬＩＳＡキット（Ｂａｃｈｅｍ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてＯＸＭ濃度を分析した。貼付け挿入部分は、投与後最初の２時間で明白になるＯＸＭプロフィールを強調する。 雄ラットにおけるＯＸＭおよびＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭの薬物動態プロフィールを示すグラフ。０．５ｍｌのＰＢＳ緩衝液中のネイティブＯＸＭ（６２ｎｍｏｌ／ｋｇ）またはＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ（６２ｎｍｏｌ／体重１ｋｇのＯＸＭペプチドを含有）の単一回ＩＶボーラス（Ａ）またはＳＣ（Ｂ）注射をラットに投与した。血清試料を特定時点で頚静脈から採取し、ＯＸＭＥＬＩＳＡキット（Ｂａｃｈｅｍ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてＯＸＭ濃度を分析した。貼付け挿入部分は、投与後最初の２時間で明白になるＯＸＭプロフィールを強調する。 ネイティブＯＸＭ、ＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示すグラフ。ＧＬＰ−１受容体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＨＴＳ１６３Ｃ２）を過剰発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、２００，０００細胞／ｍｌの密度で、９６ウェル（面積の半分を空白にする）に植え付けて、３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を、漸増濃度のＯＸＭ（ＡＬＭＡＣ）、ＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭおよびＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ（ラット血清１％（Ｂｉｏ ｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ）を含む場合または含まない場合）とともにインキュベートした。細胞ｃＡＭＰ濃度をＨＴＲＦ検定（Ｃｉｓｂｉｏ ６２ＡＭ４ＰＥＢ）により定量し、ＥＣ５０パラメーターをＰＲＩＳＭソフトウェアにより解析した。 ＩＰグルコース耐容性試験（ＩＰＧＴＴ）により測定した場合の、ネイティブＯＸＭおよびＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭによるマウスにおけるグルコース耐容性の誘導を示すグラフ。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを一晩絶食させて、次に、ＰＢＳ（ビヒクル）、ＰＥＧ４０−Ｏｓｕ（対照として）（５４６ｎｍｏｌ／ｋｇ）、ネイティブＯＸＭ（３３３ｎｍｏｌ／ｋｇ）、ＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ（２０２ｎｍｏｌ／ｋｇペプチド含量）およびＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ（３３３ｎｍｏｌ／ｋｇ）をＩＰ注射した。グルコース（１．５ｇｒ／ｋｇ）を、試験物投与の１５分後（ビヒクル、ＯＸＭおよびＰＥＧ４０−Ｏｓｕ）、またはＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ投与の１２０分後に、ＩＰ投与した。グルコース投与前、ならびにグルコース投与後、１０、２０、３０、６０および１２０分に、手で持てる大きさの血糖計を用いて、尾静脈サンプリングにより、血糖レベルを測定した。グラフ（Ａ）は血糖プロフィールを、グラフ（Ｂ）はグルコースＡＵＣを示す。 ＩＰグルコース耐容性試験（ＩＰＧＴＴ）により測定した場合の、ネイティブＯＸＭおよびＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭによるマウスにおけるグルコース耐容性の誘導を示すグラフ。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを一晩絶食させて、次に、ＰＢＳ（ビヒクル）、ＰＥＧ４０−Ｏｓｕ（対照として）（５４６ｎｍｏｌ／ｋｇ）、ネイティブＯＸＭ（３３３ｎｍｏｌ／ｋｇ）、ＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ（２０２ｎｍｏｌ／ｋｇペプチド含量）およびＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ（３３３ｎｍｏｌ／ｋｇ）をＩＰ注射した。グルコース（１．５ｇｒ／ｋｇ）を、試験物投与の１５分後（ビヒクル、ＯＸＭおよびＰＥＧ４０−Ｏｓｕ）、またはＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ投与の１２０分後に、ＩＰ投与した。グルコース投与前、ならびにグルコース投与後、１０、２０、３０、６０および１２０分に、手で持てる大きさの血糖計を用いて、尾静脈サンプリングにより、血糖レベルを測定した。グラフ（Ａ）は血糖プロフィールを、グラフ（Ｂ）はグルコースＡＵＣを示す。 食餌誘導型肥満を示す雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける体重（Ａ）および累積食物摂取量（Ｂ）に及ぼすＳＣ投与ＯＸＭ（１日２回）およびＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭ（１、３、５、７日目）の作用を示すグラフ。データを調整して平均する（ｎ＝１０）。統計モデルの残差から、ＳＥＭを算定する。１日目に開始して、７日間、マウスに投薬した。共変数としての１日目の体重に関するＡＮＣＯＶＡにより、そしてその後のウィリアムズ検定（ＰＢＳ中ＯＸＭ）または多重ｔ検定（シブトラミンおよびＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭ）対適切なビヒクルにより、データを分析した。有意差対適切なビヒクル：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。パーセンテージ値は、８日目（すなわち、７日投薬後）の適切なビヒクル群との差を示す。 食餌誘導型肥満を示す雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける体重（Ａ）および累積食物摂取量（Ｂ）に及ぼすＳＣ投与ＯＸＭ（１日２回）およびＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭ（１、３、５、７日目）の作用を示すグラフ。データを調整して平均する（ｎ＝１０）。統計モデルの残差から、ＳＥＭを算定する。１日目に開始して、７日間、マウスに投薬した。共変数としての１日目の体重に関するＡＮＣＯＶＡにより、そしてその後のウィリアムズ検定（ＰＢＳ中ＯＸＭ）または多重ｔ検定（シブトラミンおよびＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭ）対適切なビヒクルにより、データを分析した。有意差対適切なビヒクル：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。パーセンテージ値は、８日目（すなわち、７日投薬後）の適切なビヒクル群との差を示す。 食餌誘導型肥満を示す雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける体重（Ａ）および食物摂取量（Ｂ）に及ぼすＳＣ投与ＯＸＭ（１日２回）ならびに共有結合ペギル化ＯＸＭ ＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ（１、４および７日目に１０００ｎｍｏｌ／ｋｇおよび５０００ｎｍｏｌ／ｋｇまたは１および７日目に８０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭ（１、４および７日目に１０００ｎｍｏｌ／ｋｇおよび５０００ｎｍｏｌ／ｋｇまたは１および７日目に８０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）ならびにＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭ（１、４および７日目に５０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）の作用を示すグラフ。データを調整して平均する（ｎ＝１０）。統計モデルの残差から、ＳＥＭを算定する。１日目に開始して、７日間、マウスに投薬した。 食餌誘導型肥満を示す雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける体重（Ａ）および食物摂取量（Ｂ）に及ぼすＳＣ投与ＯＸＭ（１日２回）ならびに共有結合ペギル化ＯＸＭ ＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ（１、４および７日目に１０００ｎｍｏｌ／ｋｇおよび５０００ｎｍｏｌ／ｋｇまたは１および７日目に８０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭ（１、４および７日目に１０００ｎｍｏｌ／ｋｇおよび５０００ｎｍｏｌ／ｋｇまたは１および７日目に８０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）ならびにＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭ（１、４および７日目に５０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）の作用を示すグラフ。データを調整して平均する（ｎ＝１０）。統計モデルの残差から、ＳＥＭを算定する。１日目に開始して、７日間、マウスに投薬した。 食餌誘導型肥満（ＤＩＯ）マウスにおける体重に及ぼす可逆的ペギル化ＯＸＭ投与の作用を示す。個別飼育の最初の１週間（調教期間）、動物は１日１回の調教プロトコールを開始し、そして第２週の間（基線期間）、マウスに適切なビヒクルを１日２回、または処置期間中に投薬される場合は週１回、皮下経路で投与した。ＤＩＯマウスの７群（ｎ＝８）に、２９日間、Ａ． ＰＥＧ４０−ＳＨ（６６２ｍｇ／ｋｇ）、Ｂ． ＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ（６，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、Ｃ． ＰＥＧ３０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ（６，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、Ｄ． ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭ（６，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、Ｅ． ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭ（６，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、Ｆ． ビヒクル（ＰＢＳ）およびＧ． ＯＸＭ（６，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ；ＰＢＳ）、のように投薬した。基線および処置期間中、食物摂取量、飲水量および体重を毎日記録した。ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭまたはＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭの毎週投与は、食餌誘導型肥満（ＤＩＯ）マウスにおける体重を有意に低減した。 食餌誘導型肥満（ＤＩＯ）マウスにおけるグルコース耐容性に及ぼす可逆的ペギル化ＯＸＭ投与の作用を示す。薬剤またはビヒクル投与の開始後１日目に、全マウスを一晩絶食させた。２日目に、マウスは経口グルコース耐容性試験（ＯＧＴＴ）を受けた。各マウスにビヒクルまたは試験化合物を投薬し、６０分後に、Ｄ−グルコース（２ｇ／ｋｇ 経口）を投薬した。基線血液試料を、ビヒクルまたは試験化合物投薬直前に（Ｂ１）、そしてグルコース負荷直前に（Ｂ２）、採取した。さらに、グルコース投与の１０、２０、３０、４５、６０および１２０分後に、血液試料を採取した。血液試料（約２０μｌ）はすべて、尾静脈から採取した。血漿試料を調製し、それぞれ、Ｔｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｙグルコース試薬（ＴＲ１５４２１）およびＡｌｐｃｏマウス超感受性インスリンＥＬＩＳＡ（８０−ＩＮＳＭＳＵ−Ｅ１０）を用いて、グルコース（ｎ＝２）およびインスリン（ｎ＝１）に関して検定した。 食餌誘導型肥満（ＤＩＯ）マウスにおける末期グルコース、グリセロール、コレステロールおよびインスリンに及ぼす可逆的ペギル化ＯＸＭ投与の作用を示す。心臓穿刺により末期血漿試料を収集し（２９日目の試験または対照化合物の最終投薬の２４時間後）、マウス超感受性インスリンＥＬＩＳＡ（８０−ＩＮＳＭＳＵ−Ｅ１０）、Ｔｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｙグルコース試薬（ＴＲ１５４２１）およびＴｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｙコレステロール試薬（ＴＲ１３４２１）を用いて、インスリン、グルコースおよびコレステロールに関して検定した。 食餌誘導型肥満（ＤＩＯ）マウスにおける脂肪、水、タンパク質および灰分（骨）の末期身体組成物分析に及ぼす可逆的ペギル化ＯＸＭ投与の作用を示す。ＤＩＯマウス屠体の体脂肪（Ａ）、水（Ｂ）、タンパク質（Ｃ）および灰分レベル（Ｄ）を、標準化学分析技法を用いて確定した。処置群は、Ａ． ＰＥＧ４０−ＳＨ（６６２ ｍｇ／ｋｇ）、Ｂ． ＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ（６，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、Ｃ． ＰＥＧ３０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ（６，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、Ｄ． ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭ（６，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、Ｅ． ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭ（６，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、Ｆ． ビヒクル（ＰＢＳ）およびＧ． ＯＸＭ（６，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ；ＰＢＳ）であった。 食餌誘導型肥満（ＤＩＯ）マウスにおける脂肪、水、タンパク質および灰分（骨）の末期身体組成物分析に及ぼす可逆的ペギル化ＯＸＭ投与の作用を示す。ＤＩＯマウス屠体の体脂肪（Ａ）、水（Ｂ）、タンパク質（Ｃ）および灰分レベル（Ｄ）を、標準化学分析技法を用いて確定した。処置群は、Ａ． ＰＥＧ４０−ＳＨ（６６２ ｍｇ／ｋｇ）、Ｂ． ＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ（６，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、Ｃ． ＰＥＧ３０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ（６，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、Ｄ． ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭ（６，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、Ｅ． ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭ（６，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、Ｆ． ビヒクル（ＰＢＳ）およびＧ． ＯＸＭ（６，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ；ＰＢＳ）であった。 食餌誘導型肥満（ＤＩＯ）マウスにおける脂肪、水、タンパク質および灰分（骨）の末期身体組成物分析に及ぼす可逆的ペギル化ＯＸＭ投与の作用を示す。ＤＩＯマウス屠体の体脂肪（Ａ）、水（Ｂ）、タンパク質（Ｃ）および灰分レベル（Ｄ）を、標準化学分析技法を用いて確定した。処置群は、Ａ． ＰＥＧ４０−ＳＨ（６６２ ｍｇ／ｋｇ）、Ｂ． ＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ（６，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、Ｃ． ＰＥＧ３０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ（６，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、Ｄ． ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭ（６，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、Ｅ． ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭ（６，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、Ｆ． ビヒクル（ＰＢＳ）およびＧ． ＯＸＭ（６，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ；ＰＢＳ）であった。 食餌誘導型肥満（ＤＩＯ）マウスにおける脂肪、水、タンパク質および灰分（骨）の末期身体組成物分析に及ぼす可逆的ペギル化ＯＸＭ投与の作用を示す。ＤＩＯマウス屠体の体脂肪（Ａ）、水（Ｂ）、タンパク質（Ｃ）および灰分レベル（Ｄ）を、標準化学分析技法を用いて確定した。処置群は、Ａ． ＰＥＧ４０−ＳＨ（６６２ ｍｇ／ｋｇ）、Ｂ． ＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ（６，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、Ｃ． ＰＥＧ３０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ（６，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、Ｄ． ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭ（６，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、Ｅ． ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭ（６，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、Ｆ． ビヒクル（ＰＢＳ）およびＧ． ＯＸＭ（６，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ；ＰＢＳ）であった。 ＰＥＧ−ＯＸＭ変型ＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ、ＰＥＧ３０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭの投与が、対照と比較した場合、絶食中グルコースおよび絶食中血漿インスリンの顕著な且つ有意の低減を生じた、ということを示す。 ＰＥＧ−ＯＸＭ変型ＰＥＧ３０-ＦＭＳ−ＯＸＭ、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭおよびＰＥＧ６０-ＦＭＳ-ＯＸＭの投与が、対照と比較した場合、絶食中グルコースおよび絶食中血漿インスリンの顕著な且つ有意の低減を生じた、ということを示す。 ＰＥＧ−ＯＸＭ変型ＰＥＧ５-ＦＭＳ−ＯＸＭ、ＰＥＧ３０-ＦＭＳ−ＯＸＭ、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭおよびＰＥＧ６０-ＦＭＳ-ＯＸＭの投与が、対照と比較した場合、体重の顕著な且つ有意の低減を生じた、ということを示す。
一実施形態では、本発明は、長時間作用型デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストならびにその製造方法および使用方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、長時間作用型オキシントモジュリンならびにその製造方法および使用方法を提供する。一実施形態では、長時間作用型デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストは、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を含むかまたはそれらからなる組成物である。別の実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を含むかまたはそれらからなる組成物である。別の実施形態では、本発明は、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を含む修飾オキシントモジュリンペプチドを提供する。別の実施形態では、本発明は、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）からなる修飾オキシントモジュリンペプチドを提供する。一実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは、オキシントモジュリンおよびポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）を含むかまたはそれらからなる組成物である。
一実施形態では、デュアル「ＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニスト」および「アゴニスト」という用語は、本明細書中で互換的に用いられる。別の実施形態では、当該用語は、当該技術分野で既知の任意のＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストも包含する。別の実施形態では、好ましいアゴニストは、オキシントモジュリンまたはＯＸＭまたはその機能的変異体である。
一実施形態では、「機能的」という用語は、本明細書中でさらに提供されるような生物学的活性、例えば体重を低減すること、インスリン感受性を増大すること等（これらに限定されない）を有する本明細書中で提供されるアゴニストまたはＯＸＭの能力を指す。
別の実施形態では、長時間作用型ＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストは、ペギル化オキシントモジュリンである。別の実施形態では、長時間作用型デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストは、逆ペギル化オキシントモジュリンである。別の実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは、ペギル化オキシントモジュリンである。別の実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは逆ペギル化オキシントモジュリンである。別の実施形態では「長時間作用型オキシントモジュリン」、「逆ペギル化オキシントモジュリン」、「可逆的ペギル化ＯＸＭ」および「オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を含むかまたはそれらからなる組成物」という語句は、互換的に用いられる。別の実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは、ＦｍｏｃまたはＦＭＳを介してＰＥＧと連結されるＯＸＭである。
一実施形態では、本明細書中で提供される長時間作用型デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストは、ＰＥＧポリマーを含む。別の実施形態では、当該アゴニストは、ＦｍｏｃまたはＦＭＳを介してオキシントモジュリンのアミノ末端と結合されるＰＥＧポリマーを含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型オキシントモジュリンは、ＰＥＧポリマーを含む。別の実施形態では、本発明の長時間作用型オキシントモジュリンは、ＦｍｏｃまたはＦＭＳを介してオキシントモジュリンペプチドのアミノ末端と結合されるＰＥＧポリマーを含む。
別の実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは、１：０．２〜１０：０．２〜１０のモル比で、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を含むかまたはそれらからなる組成物である。別の実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは、１：０．５〜２：０．５〜２のモル比で、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を含むかまたはそれらからなる組成物である。別の実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは、１：１：１のモル比で、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を含むかまたはそれらからなる組成物である。別の実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは、ＦｍｏｃまたはＦＭＳを介してオキシントモジュリンペプチドのアミノ末端と結合されるＰＥＧポリマーを含む。
一実施形態では、長時間作用型デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストは、可逆的リンカー、例えばＦｍｏｃおよびＦＭＳ（これらに限定されない）を介してＰＥＧと連結される。別の実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは、可逆的リンカー、例えばＦｍｏｃおよびＦＭＳ（これらに限定されない）を介してＰＥＧと連結される。別の実施形態では、ＦｍｏｃおよびＦＭＳは塩基に感受性であり、生理学的条件下で除去可能である。別の実施形態では、可逆的リンカーは、塩基に感受性で、生理学的条件下で除去可能である。別の実施形態では、可逆的リンカーは、塩基に感受性であり、血液、血漿またはリンパ中、生理学的条件下で除去可能である。別の実施形態では、可逆的リンカーは、塩基に感受性であり、体液中、生理学的条件下で除去可能である。別の実施形態では、可逆的リンカーは、塩基性ｐＨを有する体液中で除去可能であるリンカーである。別の実施形態では、塩基に感受性であるリンカーは、塩基性環境への曝露時に開裂され、したがって、リンカーからのＯＸＭおよびＰＥＧを放出する。
別の実施形態では、逆ペギル化オキシントモジュリンは、ＯＸＭが可逆的リンカーを介してＰＥＧと連結される組成物である。別の実施形態では、逆ペギル化オキシントモジュリンは、塩基性環境への曝露時に遊離ＯＸＭを放出する。別の実施形態では、逆ペギル化オキシントモジュリンは、血液または血漿への曝露時に遊離ＯＸＭを放出する。別の実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは、標準ペギル化手法におけるようにＰＥＧおよび互いに直接的に連結されないオキシントモジュリンを含むが、しかしむしろ、両残基は、塩基に対して高度に感受性で、通常の生理学的条件下で除去可能であるＦｍｏｃまたはＦＭＳの異なる位置に連結される。別の実施形態では、通常の生理学的条件としては、血液または血漿のような生理的環境が挙げられる。
一実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは、ＥＭＣＳを用いてＰＥＧと非可逆的に結合される（実施例３参照）。
別の実施形態では、ＦｍｏｃおよびＦＭＳの構造および製造方法は、米国特許第７５８５８３７号に記載されている。米国特許第７５８５８３７号の開示は、参照により本明細書中で援用される。
別の実施形態では、逆ペギル化は、ＯＸＭを長時間作用型ＯＸＭにする。別の実施形態では、長時間作用型オキシントモジュリンは、延長された生物学的半減期を有するオキシントモジュリンである。
一実施形態では、逆ペギル化は、デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストの分解に対する保護を提供する。別の実施形態では、逆ペギル化は、ＯＸＭの分解に対する保護を提供する。別の実施形態では、逆ペギル化は、有害な副作用を低減するようＯＸＭのＣｍａｘに作用する。別の実施形態では、逆ペギル化は、ＯＸＭのＴｍａｘを延長する。別の実施形態では、逆ペギル化は、ＯＸＭの循環半減期を延長する。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、非修飾ＯＸＭと比較して、改善された生物学的利用能を有する。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、非修飾ＯＸＭと比較して、改善された生物学的活性を有する。いくつかの実施形態では、逆ペギル化は、ＯＸＭの潜在力を増強する。
他の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、生化学的測定値に関して、非修飾化ＯＸＭと少なくとも等価である。他の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、薬理学的測定値に関して、非修飾化ＯＸＭと少なくとも等価である。他の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、結合能力（Ｋｄ）に関して、非修飾化ＯＸＭと少なくとも等価である。他の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、消化器系を通しての吸収に関して、非修飾化ＯＸＭと少なくとも等価である。他の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、非修飾化ＯＸＭより消化器系を通しての吸収中に安定している。
別の実施形態では、逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストは、遊離アゴニストと比較して、改善された血中曲線下面積（ＡＵＣ）レベルを示す。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、遊離ＯＸＭと比較して、改善された血中曲線下面積（ＡＵＣ）レベルを示す。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、遊離ＯＸＭと比較して、改善された生物学的活性および血中曲線下面積（ＡＵＣ）レベルを示す。別の実施形態では、逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストは、遊離ＯＸＭと比較して、改善された血中保持時間（ｔ１／２）を示す。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、遊離ＯＸＭと比較して、改善された血中保持時間（ｔ１／２）を示す。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、遊離ＯＸＭと比較して、改善された生物学的活性および血中保持時間（ｔ１／２）を示す。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、遊離ＯＸＭと比較して改善された血中Ｃｍａｘレベルを示し、それにより潜在的有害副作用を低減する。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、遊離ＯＸＭと比較して改善された生物学的活性を示す。別の実施形態では、ＯＸＭのＡＵＣ、Ｃｍａｘ、ｔ１／２、生物学的活性またはその組合せを改善する方法であって、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を介してポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）を遊離ＯＸＭのアミノ末端と結合させるステップを含むかまたはそれからなる方法が、本明細書中で提供される。それゆえ、一実施形態では、本発明は、オキシントモジュリンの曲線下面積（ＡＵＣ）の改善方法であって、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を介してポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）を前記オキシントモジュリンのアミノ末端と結合させるステップからなる方法をさらに提供する。
一実施形態では、任意の所定のグルカゴン類似体ペプチドのＧＬＰ−１またはグルカゴンアゴニスト活性は、ＧＬＰ−１またはグルカゴン活性に関して選択された検定においてそのペプチドに関するＥＣ５０値を決定することにより定量され得る。当業者は十分に承知しているように、ＥＣ５０値は、特定の検定におけるその化合物の最大活性の半分が達成される濃度の測定値である。本明細書において、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニスト活性に関する検定におけるＥＣ５０値は、それぞれＥＣ５０［ＧＬＰ−１］およびＥＣ５０［Ｇｌｕ］として言及される。異なる化合物に関するＥＣ５０値が比較される場合、それらは、他の点では同一条件下で、同一検定における関連化合物の活性を記述する、と理解される。
グルカゴン類似体ペプチドに関するＥＣ５０［Ｇｌｕ］／ＥＣ５０［ＧＬＰ−１］比は、グルカゴンに関するＥＣ５０［Ｇｌｕ］／ＥＣ５０［ＧＬＰ−１］比より大きいことがある。これは、グルカゴン類似体ペプチドがＧＬＰ−１受容体に関してより大きい選択性を有する、ということを意味すると解釈され得る。
別の実施形態では、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を介してポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）を遊離ＯＸＭのアミノ末端と結合させることによるＯＸＭのＡＵＣ、Ｃｍａｘ、ｔ１／２、生物学的活性またはその組合せの改善は、ＯＸＭの投薬回数の低減を可能にする。別の実施形態では、ＯＸＭの投薬回数を減らすための方法であって、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を介してポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）をＯＸＭのアミノ末端またはリシン残基と結合させるステップを含むかまたはそれからなる方法が、本明細書中で提供される。別の実施形態では、ＯＸＭの逆ペギル化は、用いられるべき投与量をより低くさせるのに有益である。
別の実施形態では、ＯＸＭは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、ＯＸＭは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。別の実施形態では、配列番号１は、ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号１）のアミノ酸（ＡＡ）配列を含むかまたはそれからなる。別の実施形態では、ＯＸＭは、ＣＡＳ第６２３４０−２９−８号で示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
別の実施形態では、ＯＸＭはヒトＯＸＭまたは任意の哺乳動物ＯＸＭである。別の実施形態では、ＯＸＭはグルカゴン−３７または生体活性エンテログルカゴンとしても言及される。別の実施形態では、ＯＸＭはデュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストである。別の実施形態では、ＯＸＭはＯＸＭの生物学的活性断片である。別の実施形態では、生物学的に活性なＯＸＭは、配列番号１のアミノ酸３０からアミノ酸３７に及ぶ。別の実施形態では、生物学的に活性なＯＸＭは、配列番号１のアミノ酸１９からアミノ酸３７に及ぶ。別の実施形態では、本発明のＯＸＭは、それから２つのＣ末端アミノ酸が欠失されるオクタペプチドに対応する。別の実施形態では、本発明のＯＸＭは、本明細書中に記載されるようなＯＸＭ活性を保持する配列番号１の任意の断片に対応する。
一実施形態では、ＯＸＭは、配列番号１のペプチドのペプチド相同体である。一実施形態では、本発明のＯＸＭアミノ酸配列は、デフォルトパラメーターを用いてＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを用いて確定した場合、配列番号１で記述されるＯＸＭ配列と少なくとも４０％相同である。一実施形態では、本発明のＯＸＭアミノ酸配列は、デフォルトパラメーターを用いてＮＣＢＩのＢｌａｓｔＰソフトウェアを用いて確定した場合、配列番号１で記述されるＯＸＭ配列と少なくとも５０％相同である。一実施形態では、本発明のＯＸＭアミノ酸配列は、デフォルトパラメーターを用いてＮＣＢＩのＢｌａｓｔＰソフトウェアを用いて確定した場合、配列番号１で記述されるＯＸＭ配列と少なくとも６０％相同である。一実施形態では、本発明のＯＸＭアミノ酸配列は、デフォルトパラメーターを用いてＮＣＢＩのＢｌａｓｔＰソフトウェアを用いて確定した場合、配列番号１で記述されるＯＸＭ配列と少なくとも７０％相同である。一実施形態では、本発明のＯＸＭアミノ酸配列は、デフォルトパラメーターを用いてＮＣＢＩのＢｌａｓｔＰソフトウェアを用いて確定した場合、配列番号１で記述されるＯＸＭ配列と少なくとも８０％相同である。
一実施形態では、本発明のＯＸＭアミノ酸配列は、デフォルトパラメーターを用いてＮＣＢＩのＢｌａｓｔＰソフトウェアを用いて確定した場合、配列番号１で記述されるＯＸＭ配列と少なくとも９０％相同である。一実施形態では、本発明のＯＸＭアミノ酸配列は、デフォルトパラメーターを用いてＮＣＢＩのＢｌａｓｔＰソフトウェアを用いて確定した場合、配列番号１で記述されるＯＸＭ配列と少なくとも９５％相同である。
野生型ＯＸＭとの比較において、本発明のＯＸＭ誘導体または変異体は、いくつかのアミノ酸置換を含有し、および／またはペギル化され得るし、別のやり方で（例えば組換え的にまたは化学的に）修飾され得る。
本明細書中で提供されるＯＸＭは、上記のＯＸＭ配列の任意の類似体にも及ぶ。当該配列中の任意の１つ以上のアミノ酸残基は、独立して、当該技術分野で周知のような保存的置換で取替えられ得る。すなわち、アミノ酸を同様の化学型のうちの１つと取替え、例えば１つの疎水性アミノ酸を別のアミノ酸と取替えられ得る。代替的には、ＯＸＭの増強された作用または生物学的活性を生じる非保存的アミノ酸突然変異がなされ得る。特に、ＯＸＭは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による開裂および不活性化に耐性であるよう修飾される。
ＯＸＭの誘導体および変異体、ならびにその生成方法は、米国特許出願公告第２０１１／０１５２１８２号、米国特許出願公告第２０１１／００３４３７４号、米国特許出願公告第２０１０／０１４４６１７号（これらの記載内容はすべて、参照により本明細書中で援用される）に開示されている。
一実施形態では、本明細書中で提供されるデュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストは、化学的に修飾され得る。別の実施形態では、本明細書中で提供されるＯＸＭは、化学的に修飾される。特に、ＯＸＭのアミノ酸側鎖、アミノ末端および／またはカルボキシ末端が修飾され得る。例えばＯＸＭは、アルキル化、ジスルフィド形成、金属錯体形成、アシル化、エステル化、アミド化、ニトロ化、酸による処理、塩基による処置、酸化または還元のうちの１つ以上を受け得る。これらの工程を実行するための方法は、当該技術分野で周知である。特に、ＯＸＭは、低級アルキルエステル、低級アルキルアミド、低級ジアルキルアミド、酸付加塩、カルボン酸塩またはそのアルカリ性付加塩として提供される。特に、ＯＸＭのアミノまたはカルボキシ末端は、例えばエステル化、アミド化、アシル化、酸化または還元により誘導体化され得る。特に、ＯＸＭのカルボキシ末端は、アミド部分を形成するよう誘導体化され得る。
一実施形態では、本発明の長時間作用型デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストは、非修飾アゴニストの生物学的活性を保持する。別の実施形態では、本発明のＯＸＭは、非修飾ＯＸＭの生物学的活性を保持する。一実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭは、非修飾ＯＸＭの生物学的活性を保持する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物学的活性は、消化分泌液を低減することを包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物学的活性は、胃内容排出を低減するかまたは遅延することを包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物学的活性は、小腸における供給運動性パターンの抑制を包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物学的活性は、ペンタガストリンにより刺激される酸分泌の抑制を包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物学的活性は、胃ソマトスタチン放出の増大を包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物学的活性は、ペプチドＹＹの作用を強力にすることを包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物学的活性は、グレリン放出の抑制を包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物学的活性は、アディポネクチンの上方調節を包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物学的活性は、遊離脂肪酸を低減することを包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物学的活性は、トリグリセリドを低減することを包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物学的活性は、コレステロールを低減することを包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物学的活性は、アミノピリン蓄積およびｃＡＭＰ産生の刺激を包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物学的活性は、ＧＬＰ−１受容体またはグルカゴン受容体を結合することを包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物学的活性は、アデニレートシクラーゼを活性化することによりＨ＋産生を刺激することを包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物学的活性は、ヒスタミン刺激性胃酸分泌を抑制することを包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物学的活性は、食物摂取を抑制することを包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物学的活性は、インスリン放出を刺激することを包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物学的活性は、外分泌膵液分泌を抑制することを包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物学的活性は、インスリン感受性を増大することを包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型ＯＸＭの生物学的活性は、グルコースレベルを低減することを包含する。
一実施形態において、「〜のレベルを低減すること」という用語は、元の、野生型の、正常のまたは対照のレベルに比して約１〜１０％の低減を指す。別の実施形態では、低減は約１１〜２０％の低減である。別の実施形態では、低減は約２１〜３０％の低減である。別の実施形態では、低減は約３１〜４０％の低減である。別の実施形態では、低減は約４１〜５０％の低減である。別の実施形態では、低減は約５１〜６０％の低減である。別の実施形態では、低減は約６１〜７０％の低減である。別の実施形態では、低減は約７１〜８０％の低減である。別の実施形態では、低減は約８１〜９０％の低減である。別の実施形態では、低減は約９１〜９５％の低減である。別の実施形態では、低減は約９６〜１００％の低減である。
一実施形態では、「〜のレベルを増大すること」という用語は、元の、野生型の、正常のまたは対照のレベルに比して約１〜１０％の増大を指す。別の実施形態では、増大は約１１〜２０％の増大である。別の実施形態では、増大は約２１〜３０％の増大である。別の実施形態では、増大は約３１〜４０％の増大である。別の実施形態では、増大は約４１〜５０％の増大である。別の実施形態では、増大は約５１〜６０％の増大である。別の実施形態では、増大は約６１〜７０％の増大である。別の実施形態では、増大は約７１〜８０％の増大である。別の実施形態では、増大は約８１〜９０％の増大である。別の実施形態では、増大は約９１〜９５％の増大である。別の実施形態では、増大は約９６〜１００％の増大である。
別の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象においてグルコース耐容性を誘導する、血糖制御を改善する、またはその両方の方法であって、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を介してポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）と連結されるデュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニスト、および薬学的に許容可能な担体からなる有効量の組成物を前記対象に投与するステップを含む方法をさらに提供する。
別の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象においてグルコース耐容性を誘導する、血糖制御を改善する、またはその両方の方法であって、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を介してポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）と連結されるオキシントモジュリン、および薬学的に許容可能な担体からなる有効量の組成物を前記対象に投与するステップを含む方法をさらに提供する。
一実施形態では、本発明は、デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストの生物学的半減期を延長するための方法であって、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を含むフレキシブルリンカーを介して、前記アゴニストをポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）と結合させるステップからなる方法をさらに提供する。
一実施形態では、本発明は、オキシントモジュリンの生物学的半減期を延長するための方法であって、オキシントモジュリン、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を約１：１：０．５〜約１：１：３．５のモル比で結合させるステップからなる方法をさらに提供する。別の実施形態では、前記モル比は、１：１：１０のＯＸＭ対ＰＥＧ対リンカーである。別の実施形態では、当該範囲は、１：１：５〜１：１：９である。別の実施形態では、当該範囲は、１：１：３．７〜１：１：４．９である。
別の実施形態では、本発明は、対象における食物摂取を低減するための、体重を低減するための、またはその両方のための方法であって、フレキシブルリンカーを介してポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）と結合されるデュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを前記対象に投与するステップを含む方法であって、前記フレキシブルリンカーは９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）である方法をさらに提供する。別の実施形態では、前記対象は、糖尿病に苦しめられている。別の実施形態では、前記対象は、過剰体重である。別の実施形態では、前記対象は肥満症に苦しめられている。
別の実施形態では、本発明は、対象における食物摂取を低減するための、体重を低減するための、またはその両方のための方法であって、フレキシブルリンカーを介してポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）と結合されたオキシントモジュリンを前記対象に投与するステップを含む方法であって、前記フレキシブルリンカーは９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）である方法をさらに提供する。別の実施形態では、前記対象は、糖尿病に苦しめられている。別の実施形態では、前記対象は、過剰体重である。別の実施形態では、前記対象は肥満症に苦しめられている。
一実施形態では、本明細書中で提供されるＰＥＧ−ＯＸＭ化合物は、インスリンレベルを増大せずにグルコースレベルの有意の低減を誘導する。別の実施形態では、本明細書中で提供されるＰＥＧ−ＯＸＭ化合物は、予期せぬことに、有意用量のＰＥＧ−ＯＸＭ化合物の投与後に絶食インスリンレベルの低減と一緒に、グルコースレベルを低減する（本明細書中の実施例７参照）。それゆえ、別の実施形態では、本発明は、対象におけるインスリン感受性を増大するための方法であって、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）と結合されるデュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを含む有効量の組成物を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、予期せぬことに、本明細書中で提供されるデュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニスト組成物で対象を短期処置した後にインスリン感受性の顕著な増大を示す（実施例７参照）。別の実施形態では、前記アゴニストは、リンカーを介して前記ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）と結合される。別の実施形態では、前記アゴニストはＯＸＭである。別の実施形態では、前記リンカーはフレキシブルリンカーである。別の実施形態では、前記リンカーは９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）である。別の実施形態では、前記リンカーは非開裂可能リンカーである。別の実施形態では、前記リンカーはＮ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）である。
別の実施形態では、本発明の長時間作用型デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストの生物学的活性は、迷走神経間接的機序により膵臓分泌を抑制することを包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストの生物学的活性は、小腸を通した水電解質輸送を低減することを包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストの生物学的活性は、グルコース取込みを刺激することを包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストの生物学的活性は、ソマトスタチン分泌を制御すること／刺激することを包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストの生物学的活性は、食物摂取および体重増加の両方の低減を包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストの生物学的活性は、脂肪過多の低減を包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストの生物学的活性は、食欲抑圧を包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストの生物学的活性は、食欲不振の誘導を包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストの生物学的活性は、過剰体重および肥満対象における体重を低減することを包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストの生物学的活性は、脂肪ホルモンであるレプチンおよびアディポネクチンのレベルの変化を誘導することを包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストの生物学的活性は、過剰体重および肥満対象におけるエネルギー摂取を低減することのほかに、エネルギー消費を増大することを包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストの生物学的活性は、血漿トリグリセリドおよび増大ケトン体を低減することを包含する。
一実施形態では、本発明の長時間作用型デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストの生物学的活性は、短期処置後、血漿トリグリセリドおよび増大ケトン体を低減することを包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストの生物学的活性は、短期処置後、グルコネオジェニック遺伝子Ｐｃｋ１、Ｐｇｃ１αおよびＰｄｈａ１の発現を増大することを包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストの生物学的活性は、短期処置後、アセチル−ＣｏＡ、ピルビン酸脱カルボキシル化の主生成物およびマロニル−ＣｏＡの肝臓プールを低減することを包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストの生物学的活性は、短期処置後、肝臓における脂肪酸酸化（ＦＡＯ）を誘導する遺伝子、例えばＦｇｆ２１およびＣｐｔ１ａを上方調節することを包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストの生物学的活性は、短期処置後、脂質生成遺伝子、例えばＣｈＲＥＢＰを下方調節することを包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストの生物学的活性は、短期処置後、Ｌｄｌｒ遺伝子を上方調節することを包含する。
一実施形態では、本発明の長時間作用型デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストの生物学的活性は、長期処置後、レプチンレベルを低減することを包含する。別の実施形態では、本発明の長時間作用型デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストの生物学的活性は、長期処置後、ｂ−ヒドロキシブチレートレベルを増大することを包含する。
別の実施形態では、ＰＥＧポリマーは、ＦｍｏｃまたはＦＭＳを介してオキシントモジュリンのアミノ末端またはリシン残基と結合される。別の実施形態では、「結合される」および「連結される」という用語は、互換的に用いられる。別の実施形態では、ＰＥＧポリマーは、ＯＸＭのα−アミノ側鎖と連結される。別の実施形態では、ＰＥＧポリマーは、ＯＸＭのε−アミノ側鎖と連結される。別の実施形態では、ＰＥＧポリマーは、ＯＸＭの１つ以上のε−アミノ側鎖と連結される。別の実施形態では、ＰＥＧポリマーはスルフヒドリル部分を含む。
別の実施形態では、ＰＥＧは線状である。別の実施形態では、ＰＥＧは分枝される。別の実施形態では、ＰＥＧは２００〜２００，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。別の実施形態では、ＰＥＧは５，０００〜８０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。別の実施形態では、ＰＥＧは５，０００〜４０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。別の実施形態では、ＰＥＧは２０，０００〜４０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。
別の実施形態では、長時間作用型ＯＸＭはペギル化剤を用いて調製されるが、これは、ＦｍｏｃまたはＦＭＳ部分のフルオレン環に存在する官能基、例えばＮＨ２、ＯＨ、ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨＯ、‐‐Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、‐‐Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、‐‐ＳＯ２Ｃｌ、‐‐ＳＯ２ＣＨ＝ＣＨ２、‐‐ＰＯ２Ｃｌ、‐‐（ＣＨ２）ｘＨａｌ（これらに限定されない）と反応し得る任意のＰＥＧ誘導体を意味する。別の実施形態では、ペギル化剤は、通常は、そのモノメトキシル化形態で用いられるが、ＰＥＧ分子の一末端での１つのヒドロキシル基だけが結合のために利用可能である。別の実施形態では、両末端が結合のために利用可能である二機能性形態のＰＥＧは、例えば単一ＰＥＧ部分と共有結合される２つのペプチドまたはタンパク質との結合体を得ることが所望される場合に用いられ得る。
別の実施形態では、分枝鎖ＰＥＧは、Ｒ（ＰＥＧ−ＯＨ）ｍとして表され、式中、Ｒは中心コア部分、例えばペンタエリトリトールまたはグリセロールを表し、ｍは分枝腕の数を表す。分枝腕の数（ｍ）は、３〜１００またはそれ以上の範囲であり得る。別の実施形態では、ヒドロキシル基は化学修飾を受ける。別の実施形態では、分枝ＰＥＧ分子は、米国特許第６，１１３，９０６号、第５，９１９，４５５号、第５，６４３，５７５号および第５，６８１，５６７号（これらの記載内容は、参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
一実施形態では、ＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストはオキシントモジュリンである。別の実施形態では、ＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストはオキシントモジュリン変異体である。
別の実施形態では、本発明は、標準ペギル化手法の場合のようにＯＸＭと直接結合されないＰＥＧ部分を伴う（しかしむしろＰＥＧ部分はＦｍｏｃまたはＦＭＳのようなリンカーにより結合される）ＯＸＭを提供する。別の実施形態では、リンカーは、塩基に高度に感受性であり、軽度塩基条件下で除去可能である。別の実施形態では、ＦｍｏｃまたはＦＭＳを介してＰＥＧと連結されるＯＸＭは、遊離ＯＸＭと等価的に活性である。別の実施形態では、ＦｍｏｃまたはＦＭＳを介してＰＥＧと連結されるＯＸＭは、遊離ＯＸＭより活性である。別の実施形態では、ＦｍｏｃまたはＦＭＳを介してＰＥＧと連結されるＯＸＭは、遊離ＯＸＭとは異なる活性を含む。別の実施形態では、ＦｍｏｃまたはＦＭＳを介してＰＥＧと連結されるＯＸＭは、中枢神経系活性を有する。別の実施形態では、可逆的ペギル化ＯＸＭは、血液脳関門を横断して、本明細書中で提供される生物学的活性を発揮するよう視床下部に作用する。別の実施形態では、ＦｍｏｃまたはＦＭＳを介してＰＥＧと連結されるＯＸＭは、遊離ＯＸＭと違って、血液脳関門を通って脳に進入できない。別の実施形態では、ＦｍｏｃまたはＦＭＳを介してＰＥＧと連結されるＯＸＭは、遊離ＯＸＭに比して、循環半減期延長を示す。別の実施形態では、ＦｍｏｃまたはＦＭＳを介してＰＥＧと連結されるＯＸＭは、そのＰＥＧ部分をＦｍｏｃまたはＦＭＳとともに失い、したがって遊離ＯＸＭを回復する。
別の実施形態では、本発明は、式：（Ｘ）ｎ−Ｙの化合物、およびその薬学的に許容可能な塩を提供し
Figure 2014516993
式中、Ｙは遊離アミノ、カルボキシルまたはヒドロキシルを保有するＯＸＭの部分であり、Ｘは式（ｉ）のラジカルである。
別の実施形態では、Ｒ１は、タンパク質またはポリマー担体部分；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分；を含有するラジカルであり；Ｒ２は、水素、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アリール、アルカリール、アラルキル、ハロゲン、ニトロ、−−ＳＯ３Ｈ、−−ＳＯ２ＮＨＲ、アミノ、アンモニウム、カルボキシル、ＰＯ３Ｈ２およびＯＰＯ３Ｈ２からなる群から選択され；Ｒは、水素、アルキルおよびアリールからなる群から選択され；Ｒ３およびＲ４は、同一であるかまたは異なり、各々、水素、アルキルおよびアリールからなる群から選択され；Ａは、ラジカルがＯＸＭ−Ｙのアミノまたはヒドロキシル基と連結される場合、共有結合であり；ｎは、１以上の整数である。
別の実施形態では、「アルキル」、「アルコキシ」、「アルコキシアルキル」、「アリール」、「アルカリール」および「アラルキル」という用語は、１〜８、好ましくは１〜４個の炭素原子を有するアルキルラジカル、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピルおよびブチル、ならびに６〜１０個の炭素原子を有するアリールラジカル、例えばフェニルおよびナフチルを意味するために用いられる。「ハロゲン」という用語は、ブロモ、フルオロ、クロロおよびヨードを包含する。
別の実施形態では、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、各々、水素であり、Ａは−−ＯＣＯ−−であって、すなわち９−フルオレニルメトキシカルボニルラジカル（本明細書中では以後、「Ｆｍｏｃ」）である。別の実施形態では、Ｒは、フルオレン環の位置２で−−ＳＯ３Ｈであり、Ｒ３およびＲ４は、各々、水素であり、Ａは−−ＯＣＯ−−であって、すなわち２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニルラジカル（本明細書中では以後、「ＦＭＳ」）である。
別の実施形態では、ＯＸＭのペギル化、ならびに（ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ）ｎ−ＯＸＭまたは（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−ＯＸＭ結合体の調製は、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳまたはＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳをＯＸＭのアミン構成成分と結合し、したがって、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＯＸＭまたはＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ結合体を得て、次に、マレイミド部分をＰＥＧ−ＳＨで置換して、それぞれ（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−ＯＸＭまたは（ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ）ｎ−ＯＸＭ結合体を生成することを包含する。
別の実施形態では、ＯＸＭのペギル化は、ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳまたはＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳをＰＥＧ−ＳＨと反応させて、したがってＰＥＧ−ＦＭＳ−ＮＨＳまたはＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳ結合体を形成し、次に、それをＯＸＭのアミン構成成分と反応させて、それぞれ所望の（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−ＯＸＭまたは（ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ）ｎ−ＯＸＭ結合体を生じることを包含する。別の実施形態では、ペプチド／タンパク質、例えばＯＸＭのペギル化は、米国特許第７５８５８３７号（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されている。別の実施形態では、ＦｍｏｃまたはＦＭＳを用いるペプチド／タンパク質、例えばＯＸＭの逆ペギル化は、米国特許第７５８５８３７号に記載されている。
別の実施形態では、「長時間作用型ＯＸＭ」および「逆ペギル化ＯＸＭ」という語句は、互換的に用いられる。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、次式により本明細書中で同定されるＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭで構成される：（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−ＯＸＭまたは（ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ）ｎ−ＯＸＭ（式中、ｎは１以上の整数であり、ＯＸＭは少なくとも１つのアミノ基を介してＦＭＳまたはＦｍｏｃラジカルと連結される）。
別の実施形態では、意外にも、本明細書中に記載される長時間作用型ＯＸＭは、そのペギル化形態およびその末梢形態の両方で活性である。別の実施形態では、意外にも、（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−ＯＸＭまたは（ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ）ｎ−ＯＸＭの構築は、この結合体を不活性にさせない。別の実施形態では、意外にも、（ＰＥＧ−ＦＭＳ）ｎ−ＯＸＭまたは（ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ）ｎ−ＯＸＭの構築は、ＯＸＭを不活性にさせない。
治療的使用
別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、高血糖症の防止のために、血糖制御を改善するために、非インスリン依存型真性糖尿病（一実施形態では、２型糖尿病）、インスリン依存型真性糖尿病（一実施形態では、１型糖尿病）および妊娠真性糖尿病またはその任意の組合せからなる群から選択される真性糖尿病の処置のために、利用される。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、２型糖尿病を処置するために利用される。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、インスリンに対する感受性を増大するために利用される。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、インスリン抵抗性を低減するために利用される。
別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、食欲の抑圧のために利用される。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、満腹を誘導するために利用される。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、体重の低減のために利用される。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、体脂肪の低減のために利用される。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、体格指数の低減のために利用される。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、食物消費の低減のために利用される。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、肥満症を処置するために利用される。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、肥満症に関連した真性糖尿病を処置するために利用される。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、心拍数を増大するために利用される。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、基礎代謝率（ＢＭＲ）を増大するために利用される。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−オキシントモジュリンおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−オキシントモジュリン、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、エネルギー消費を増大するために利用される。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−オキシントモジュリンおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−オキシントモジュリン、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、グルコース耐容性を誘導するために利用される。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−オキシントモジュリンおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−オキシントモジュリン、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、血糖制御を誘導するために利用される。一実施形態では、血糖制御は、非高および／または非変動性血糖レベルおよび／または非高および／または非変動性グリコシル化ヘモグロビンレベルを指す。
別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、体重増加を抑制するために利用される。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、血糖レベルを低減するために利用される（図４Ａおよび９）。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、カロリー摂取を減少させるために利用される。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、食欲を減らすために利用される。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、体重制御のために利用される。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、体重減少を誘導するかまたは促進するために利用される。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、所望の体重、所望の体格指数、所望の容姿および良好な健康のうちのいずれか１つ以上を保持するために利用される。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、脂質プロフィールを制御するために利用される。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、トリグリセリドレベルを低減するために利用される。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、グリセロールレベルを低減するために利用される（図９Ｄ）。
別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、コレステロールレベルを低減するために利用される。一実施形態では、コレステロールレベルの低減は、ネイティブＯＸＭの投与後に観察される低減より大きい（図９Ｃ）。一実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、コレステロールレベルを６０〜７０％下げる。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、コレステロールレベルを５０〜１００％下げる。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、コレステロールレベルを２５〜９０％下げる。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、コレステロールレベルを５０〜８０％下げる。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、コレステロールレベルを４０〜９０％下げる。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、ＨＤＬコレステロールレベルを増大するために利用される。
一実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、投与経過の全体に亘って、有効性の有意の減少を伴わずに、本明細書中に記載される目的のために用いられ得る（図５Ａ、６Ａおよび７）。一実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、１日間ずっと有効である。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、２〜６日間ずっと有効である。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、１週間ずっと有効である。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、２週間ずっと有効である。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、３週間ずっと有効である。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、４週間ずっと有効である。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、６週間ずっと有効である。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、２ヶ月間ずっと有効である。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、４ヶ月間ずっと有効である。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、６ヶ月間ずっと有効である。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、１年間ずっとまたはそれ以上の間有効である。
一実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、本明細書中に記載される目的のために用いられ得るし、初回用量の投与時に直ちに有効であり得る（図８Ａ）。別の実施形態では、ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物は、２回以上の投薬後に有効であり得る。
別の実施形態では、本明細書中で上記されたようなＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物の利用方法は、ＯＸＭにより軽減され、抑制され、および／または処置され得る疾患または症状に悩まされるヒト被験者に適用される。別の実施形態では、本明細書中で上記されたようなＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物の利用方法は、獣医学的方法である。別の実施形態では、本明細書中で上記されたようなＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ならびにそれらを含む薬学的組成物の利用方法は、農場動物、ペットおよび実験室動物といったような動物に適用される。したがって、一実施形態では、本発明の対象は、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ネズミ、ウマ等である。
別の実施形態では、本発明は、対象における、ＯＸＭおよびそれを含む薬学的処方物により処置可能または低減可能な疾患を処置するかまたは低減する方法であって、本明細書中に記載されるような治療的有効量のＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよび／またはＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭを対象に投与し、それにより対象においてＯＸＭにより処置可能または低減可能な疾患を処置するかまたは低減するステップを含む方法を提供する。
別の実施形態では、ＯＸＭ、「ペプチド」または「タンパク質」は、本明細書中で用いられる場合、ネイティブペプチド（分解産物、化学合成タンパク質または組換えタンパク質）およびペプチド模倣物（典型的には、化学合成タンパク質）、ならびにペプトイドおよび半ペプトイドを包含するが、これらはタンパク質類似体であって、いくつかの実施形態では、タンパク質を、身体中にある間はより安定にし、または細胞中に浸透しやすくする修飾を有する。
別の実施形態では、修飾としては、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾、例えばＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨまたはＣＦ＝ＣＨ（これらに限定されない）、主鎖修飾および残基修飾が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチド模倣物化合物の調製方法は当該技術分野で周知であり、例えば「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ， Ｃ．Ａ． Ｒａｍｓｄｅｎ Ｇｄ．， Ｃｈａｐｔｅｒ １７．２， Ｆ． Ｃｈｏｐｌｉｎ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ （１９９２）」（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に明記されている。これに関するさらなる詳細は、本明細書中で以下に示される。
別の実施形態では、ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は置換される。いくつかの実施形態では、ペプチド結合は、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）により置換される。別の実施形態では、ペプチド結合は、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）により置換される。別の実施形態では、ペプチド結合は、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）により置換される。別の実施形態では、ペプチド結合は、α−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは任意のアルキル、例えばメチルである）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）により置換される。別の実施形態では、ペプチド結合は、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）により置換される。別の実施形態では、ペプチド結合は、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）により置換される。いくつかの実施形態では、ペプチド結合は、オレフィン系二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）により置換される。別の実施形態では、ペプチド結合は、レトロ型アミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）により置換される。別の実施形態では、ペプチド結合は、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、炭素原子上に天然に提示される「正常」側鎖である）により置換される。いくつかの実施形態では、これらの修飾は、ペプチド鎖に沿って、同時に数箇所（２〜３結合）のこともある結合のいずれかで起こる。
一実施形態では、タンパク質の天然芳香族アミノ酸、例えばＴｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅは、合成非天然酸、例えばフェニルグリシン、ＴＩＣ、ナフチレラニン（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはｏ−メチル−Ｔｙｒに置き換えられる。別の実施形態では、本発明のペプチドは、１つ以上の修飾されたアミノ酸または１つ以上の非修飾アミノ酸モノマーを含む（例えば、脂肪酸、複合炭水化物）。
一実施形態では、「アミノ酸（単数）」または「アミノ酸（複数）」は、２０個の天然アミノ酸を含むと理解される；それらのアミノ酸は、しばしば、ｉｎ ｖｉｖｏで翻訳後に修飾され、例えばヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンである；他の例外的アミノ酸としては、２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、「アミノ酸」は、Ｄ−およびＬ−アミノ酸の両方を包含する。
一実施形態では、本発明のＯＸＭは、ＯＸＭが可溶性形態であることを要する治療薬中に利用される。別の実施形態では、本発明のＯＸＭは、１つ以上の非天然または天然極性アミノ酸、例えばセリンおよびトレオニン（これらに限定されない）を含むが、これらはそのヒドロキシル含有側鎖のため、タンパク質溶解度を増大し得る。
一実施形態では、本発明のＯＸＭは、例えば標準固相技法を用いることにより、生化学的に合成される。別の実施形態では、これらの生化学的方法は、排除固相合成、部分固相合成、断片縮合または古典的溶液合成を包含する。
一実施形態では、固相ＯＸＭ合成手法は、当業者に周知であり、さらに、Ｊｏｈｎ Ｍｏｒｒｏｗ Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｊａｎｉｓ Ｄｉｌｌａｈａ Ｙｏｕｎｇ， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ （２ｎｄ Ｅｄ．， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９８４）により記載されている。別の実施形態では、合成タンパク質は、高速液体クロマトグラフィー（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ Ｔ． （１９８３） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ． ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ． Ｎ．Ｙ．］）により精製され、その組成物は、当業者に既知の方法により、アミノ酸配列を介して確証され得る。
別の実施形態では、本発明のＯＸＭを生成するために組換えタンパク質技法が用いられる。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質技法は、大量の本発明のＯＸＭの生成のために用いられる。別の実施形態では、組換え技法は、Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３：５１６−５４４、Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５：６０−８９、Ｂｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１０：５１１−５１４、Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ． （１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ． ６：３０７−３１１、Ｃｏｒｕｚｚｉ ｅｔ ａｌ． （１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ． ３：１６７１−１６８０およびＢｒｏｇｌｉ ｅｔ ａｌ．， （１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８−８４３、Ｇｕｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ６：５５９−５６５ならびにＷｅｉｓｓｂａｃｈ ＆ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ， １９８８， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， Ｓｅｃｔｉｏｎ ＶＩＩＩ， ｐｐ ４２１−４６３により記載されている。
別の実施形態では、本発明のＯＸＭは、本発明のＯＸＭをコードするポリヌクレオチドを用いて合成される。いくつかの実施形態では、本発明のＯＸＭをコードするポリヌクレオチドは、シス−調節配列（例えばプロモーター配列）の転写制御を含む発現ベクターに結紮される。いくつかの実施形態では、シス−調節配列は、本発明のＯＸＭの構成的発現を指図するのに適している。
一実施形態では、「ポリヌクレオチド」という語句は、ＲＮＡ配列、相補的ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムポリヌクレオチド配列および／または複合ポリヌクレオチド配列（例えば、上記の組合せ）の形態で単離され、提供される一本または二本鎖核酸配列を指す。
一実施形態では、「相補的ポリヌクレオチド配列」は、逆転写酵素または任意の他のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いてメッセンジャーＲＮＡの逆転写から生じる配列を指す。一実施形態では、配列は、その後、ＤＮＡポリメラーゼを用いてｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅され得る。
一実施形態では、「ゲノムポリヌクレオチド配列」は、染色体に由来する（染色体から得られる）配列を指し、したがって、それは染色体の連続部分を表す。
一実施形態では、「複合ポリヌクレオチド配列」は、少なくとも部分的に相補性で、少なくとも部分的にゲノム性である配列を指す。一実施形態では、複合配列は、本発明のペプチドをコードするために必要とされるいくつかのエキソン配列、ならびにその間に存在するいくつかのイントロン配列含み得る。一実施形態では、イントロン配列は、任意の供給源、例えば他の遺伝子を有し得るし、典型的には、保存スプライシングシグナル配列を含む。一実施形態では、イントロン配列は、シス作用性発現調節素子を含む。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲ技法または当業者に既知の方法または手法を用いて調製される。いくつかの実施形態では、当該手法は、２つの異なるＤＮＡ配列の結紮を包含する（例えば、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”， ｅｄｓ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９２参照）。
一実施形態では、種々の原核生物または真核生物細胞が、本発明のＯＸＭを発現するための宿主発現系として用いられ得る。別の実施形態では、これらの例としては、微生物、例えば、タンパク質コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換される細菌；タンパク質コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換される酵母；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染されるか、または組換えプラスミド発現ベクター、例えばタンパク質コード配列を含有するＴｉプラスミドで形質転換される植物細胞系が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、本発明のＯＸＭを発現するために、非細菌発現系が用いられる（例えば、哺乳動物発現系、例えばＣＨＯ細胞）。一実施形態では、哺乳動物細胞中で本発明のポリヌクレオチドを発現するために用いられる発現ベクターは、ＣＭＶプロモーターおよびネオマイシン耐性遺伝子を含むｐＣＩ−ＤＨＦＲベクターである。
別の実施形態では、本発明の細菌系において、発現されるタンパク質に関して意図される用途によって、多数の発現ベクターが選択され得ることは有益である。一実施形態では、大量のＯＸＭが所望される。一実施形態では、おそらくは疎水性シグナル配列との融合物として、高レベルのタンパク質産物の発現を指図する（タンパク質産物が容易に精製される細菌の周辺質または培地中に発現産物を向ける）ベクターが所望される。一実施形態では、特定の開裂部位に関して工学処理されるある種の融合タンパク質は、タンパク質の回収を手助けする。一実施形態では、このような操作に適合可能なベクターとしては、ｐＥＴシリーズの大腸菌発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されない（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５： ６０−８９ （１９９０））。
一実施形態では、酵母発現系が用いられる。一実施形態では、米国特許第５，９３２，４４７号に開示されているように、構成的または誘導性プロモーターを含有する多数のベクターが酵母で用いられる。別の実施形態では、酵母染色体中への外来性ＤＮＡ配列の組込みを促すベクターが用いられる。
一実施形態では、本発明の発現ベクターは、例えば単一ｍＲＮＡからのいくつかのタンパク質の翻訳を可能にする付加的ポリヌクレオチド配列、例えば内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）およびプロモーター−キメラタンパク質のゲノム組込みのための配列をさらに含み得る。
一実施形態では、哺乳動物発現ベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１（これらはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能）、ｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ（これらはＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）、ｐＴＲＥＳ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈから入手可能）、ならびにそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、レトロウイルスのような真核生物ウイルスからの調節素子を含有する発現ベクターが、本発明により用いられる。ＳＶ４０ベクターとしては、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２が挙げられる。別の実施形態では、ウシパピローマウイルス由来のベクターとしてはｐＢＶ−１ＭＴＨＡが挙げられるし、エプスタインバーウイルス由来のベクターとしてはｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５が挙げられる。他の例示的ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥが挙げられ、任意の他のベクターはＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ネズミ乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核生物細胞中での発現のために有効であることが示されたその他のプロモーターの指示下でタンパク質の発現を可能にする。
一実施形態では、植物発現ベクターが用いられる。一実施形態では、デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストコード配列（例えばＯＸＭ）の発現は、多数のプロモーターにより駆動される。別の実施形態では、ウイルスプロモーター、例えばＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡおよび１９Ｓ ＲＮＡプロモーター（Ｂｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１０：５１１−５１４ （１９８４））またはＴＭＶのコートタンパク質プロモーター（Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ６：３０７−３１１ （１９８７））が用いられる。別の実施形態では、植物プロモーター、例えば、ＲＵＢＩＳＣの小サブユニット［Ｃｏｒｕｚｚｉ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ３：１６７１−１６８０ （１９８４）； ａｎｄ Ｂｒｏｇｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８−８４３ （１９８４）］またはヒートショックプロモーター、例えばダイズｈｓｐ１７．５−Ｅまたはｈｓｐ１７．３−Ｂ［Ｇｕｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ６：５５９−５６５ （１９８６）］が用いられる。一実施形態では、構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、電気穿孔および当業者に周知の他の技法を用いて植物細胞中に導入される。例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ＆ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， Ｓｅｃｔｉｏｎ ＶＩＩＩ， ｐｐ ４２１−４６３ （１９８８）を参照。当該技術分野で周知である他の発現系、例えば昆虫および哺乳動物宿主細胞系も、本発明により用いられ得る。
挿入コード配列（タンパク質をコードする）の転写および翻訳のために必要な素子を含有する以外に、本発明の発現構築物は、発現タンパク質の安定性、産生、精製、収率または活性を最適化するよう工学処理される配列も含み得る、と理解される。
種々の方法が、いくつかの実施形態において、宿主細胞系中に本発明の発現ベクターを導入するために用いられ得る。いくつかの実施形態では、このような方法は、一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９， １９９２）に、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｍｄ． （１９８９）， Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｏｍａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， Ｍｉｃｈ． （１９９５）、Ｖｅｇａ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ Ｍｉｃｈ． （１９９５）， Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ， Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ， Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ． （１９８８）およびＧｉｌｂｏａ ｅｔ ａｔ． ［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４ （６）： ５０４−５１２， １９８６］に記載されており、例えば安定または一過性のトランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔および組換えウイルスベクターによる感染を包含する。さらに、陽性−陰性選択法に関しては、米国特許第５，４６４，７６４号および第５，４８７，９９２号を参照。
一実施形態では、形質転換細胞は、多量の組換えＯＸＭの発現を可能にする有効条件下で培養される。別の実施形態では、有効培養条件としては、タンパク質産生を可能にする有効な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素条件が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、有効培地は、細胞が培養されて本発明の組換えＯＸＭを産生する任意の培地を指す。別の実施形態では、培地は、典型的には、同化性炭素、窒素およびリン供給源、ならびに適切な塩、無機物、金属およびその他の栄養素、例えばビタミンを有する水溶液を包含する。一実施形態では、本発明の細胞は、慣用的発酵バイオリアクター、振盪フラスコ、試験管、微量滴定皿およびペトリ皿中で培養され得る。別の実施形態では、培養は、組換え細胞に適した温度、ｐＨおよび酸素含量で実行される。別の実施形態では、培養条件は、当業者の専門知識の範囲内である。
一実施形態では、製造のために用いられるベクターおよび宿主系によって、その結果生じる本発明のＯＸＭは、依然として組換え細胞内にあるか、発酵培地中に分泌されるか、２つの細胞膜の間の空間、例えば大腸菌の周辺質空間に分泌されるか、あるいは依然として細胞またはウイルス膜の外表面上に存在するかである。
一実施形態では、培養中での予定時間後、組換えＯＸＭの回収が実行される。
一実施形態では、本明細書中で用いられる「組換えＯＸＭを回収すること」という語句は、ＯＸＭを含有する全発酵培地を収集することを指し、分離または精製といった付加的ステップを含む必要はない。
一実施形態では、本発明のＯＸＭは、種々の標準タンパク質精製技法、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシングおよび示差可溶化（これらに限定されない）を用いて精製される。
一実施形態では、回収を容易にするために、発現コード配列は、本発明のタンパク質をコードするよう工学処理され、開裂可能部分を融合され得る。一実施形態では、融合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーにより、例えば開裂可能部分に特異的なカラム上での固定化により、当該タンパク質が容易に単離され得るよう設計され得る。一実施形態では、開裂可能部位は、タンパク質と開裂可能部分との間で工学処理され、そしてこの部位で融合タンパク質を特異的に開裂する適切な酵素または作用物質で処理することにより、タンパク質がクロマトグラフィーカラムから放出され得る（例えば、Ｂｏｏｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． １９：６５−７０ （１９８８）；およびＧａｒｄｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１５８５４−１５８５９ （１９９０）参照）。別の実施形態では、本発明のＯＸＭは、「実質的に純粋な」形態で回収される。別の実施形態では、「実質的に純粋な」という語句は、本明細書中に記載される適用におけるＯＸＭの有効使用を可能にする純度を指す。
一実施形態では、本発明のデュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系を用いても合成され得る。一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成法は当該技術分野で周知であり、系の構成成分は市販されている。
別の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合活性は、真性糖尿病、肥満症、摂食障害、代謝障害等（これらに限定されない）のような疾患または症状を処置するかまたは改善する、本明細書中に記載されるようなネイティブ、組換えおよび／または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニスト、ならびにそれを含む薬学的組成物の能力を測定することにより確かめられる。別の実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏ活性は、処置されている疾患の既知の測定値により推定される。
別の実施形態では、本発明の逆ペギル化ＯＸＭの用量は、０．００５〜０．１ミリグラム／ｋｇのＯＸＭペプチドを含む。別の実施形態では、本発明の逆ペギル化ＯＸＭの用量は、０．００５〜０．５ミリグラム／ｋｇのＯＸＭペプチドを含む。別の実施形態では、本発明の逆ペギル化ＯＸＭの用量は、０．０５〜０．１ミリグラム／ｋｇのＯＸＭペプチドを含む。別の実施形態では、本発明の逆ペギル化ＯＸＭの用量は、０．００５〜０．１ミリグラム／ｋｇのＯＸＭペプチドを注射溶液中に含む。
別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭの用量は、１日１回投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭの用量は、３６時間に１回投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭの用量は、４８時間に１回投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭの用量は、６０時間に１回投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭの用量は、７２時間に１回投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭの用量は、８４時間に１回投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭの用量は、９６時間に１回投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭの用量は、５日に１回投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭの用量は、６日に１回投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭの用量は、７日に１回投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭの用量は、８〜１０日に１回投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭの用量は、１０〜１２日に１回投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭの用量は、１２〜１５日に１回投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭの用量は、１５〜２５日に１回投与される。
別の実施形態では、本発明の逆ペギル化ＯＸＭは、筋肉内（ＩＭ）注射、皮下（ＳＣ）注射または静脈内（ＩＶ）注射により、週１回投与される。
別の実施形態では、本発明の逆ペギル化ＯＸＭは、個体にそれ自体提供され得る。一実施形態では、本発明の逆ペギル化ＯＸＭは、薬学的組成物の一部として個体に提供され得るが、それは薬学的に許容可能な担体と混合される。
別の実施形態では、「薬学的組成物」は、生理学的に適した担体および賦形剤のような他の化学構成成分を伴う本明細書中に記載されるような長時間作用型ＯＸＭの調製物を指す。薬学的組成物の目的は、生物体への化合物の投与を助長することである。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、生物学的作用に関して説明可能である。
別の実施形態では、本発明の組成物のいずれかは、少なくとも逆ペギル化ＯＸＭを含む。一実施形態では、本発明は、組合せ調製物を提供する。一実施形態では、「組合せ調製物」は、上記のような組合せ相手が、独立して、または識別可能量の組合せ相手との異なる固定化組合せの使用により、すなわち同時的に、共存的に、別々に、または逐次的に、投薬され得るという意味で、特に「パーツのキット」を定義する。いくつかの実施形態では、パーツのキットのパーツは、その場合、同時に投与されるか、または時間的にずらされて、すなわち、異なる時点で、そしてパーツのキットの任意のパーツに関して等しいまたは異なる間隔で、投与され得る。組合せ相手の全体量の割合は、いくつかの実施形態では、組合せ調製物中に投与され得る。一実施形態では、当業者により容易になされ得るように、例えば、処置されるべき患者亜集団の必要性、あるいは異なる必要性が特定の疾患、疾患の重症度、年齢、性別または体重のためであり得る単一患者の必要性に対処するために、組合せ調製物は変更され得る。
別の実施形態では、互換的に用いられる「生理学的に許容可能な担体」および「薬学的に許容可能な担体」という語句は、生物体に対して有意の刺激を生じない、そして投与化合物の生物学的活性および特性を妨げない担体または希釈剤を指す。アジュバントが、これらの語句の下に包含される。一実施形態では、薬学的に許容可能な担体に含まれる成分の１つは、例えば、有機および水性培地中で広範囲の溶解度を有する生体適合性ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり得る（Ｍｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９７９））。
別の実施形態では、「賦形剤」は、長時間作用型ＯＸＭの投与をさらに促すために薬学的組成物に付加される不活性物質を指す。一実施形態では、賦形剤としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、ならびにデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールの型の賦形剤が挙げられる。
薬剤の処方および投与のための技法は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ」（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に見出される。
別の実施形態では、本発明のペプチドの適切な投与経路としては、例えば経口、直腸、経粘膜、経鼻、腸または非経口送達、例えば筋肉内、皮下および髄内注射、ならびにくも膜下腔内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻内または眼内注射が挙げられる。
本発明は、上記の処置の方法のいずれかのために、脳に対して末梢的な経路による投与のための医薬剤の製造において用いるための逆ペギル化ＯＸＭも包含する。末梢経路の例としては、経口、直腸、非経口、例えば静脈内、筋肉内または腹腔内、粘膜、例えば頬、舌下、鼻、皮下または経皮投与、例えば吸入による投与が挙げられる。医薬剤のためのＯＸＭの好ましい投与量は、以下で示される。
本発明は、経口、直腸、非経口、例えば静脈内、筋肉内または腹腔内、粘膜、例えば頬、舌下、鼻、皮下または経皮投与、例えば吸入による投与に適した形態で、逆ペギル化ＯＸＭおよび薬学的に適した担体を含む薬学的組成物を提供する。単位剤形の場合、単位当たりの用量は、例えば下記のようであるか、または以下で示される用量１ｋｇ当たりを基礎にして算定されるようなものであり得る。
別の実施形態では、調製物は、全身的というよりむしろ局所的に、例えば患者の身体の特定領域に直接、調製物を注射することにより、投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、鼻内剤形で処方される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、注射用剤形で処方される。
投与量範囲の種々の実施形態が本発明により意図される：逆ペギル化ＯＸＭ組成物内のＯＸＭペプチド構成成分は、０．０１〜０．５ミリグラム／体重１ｋｇ／３日の範囲で投与される（ＰＥＧのサイズが実質的に異なり得る場合、逆ペギル化ＯＸＭ組成物内のＯＸＭの重量のみが提供される）。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭ組成物内のＯＸＭペプチド構成成分は、０．０１〜０．５ミリグラム／体重１ｋｇ／７日の範囲で投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭ組成物内のＯＸＭペプチド構成成分は、０．０１〜０．５ミリグラム／体重１ｋｇ／１０日の範囲で投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭ組成物内のＯＸＭペプチド構成成分は、０．０１〜０．５ミリグラム／体重１ｋｇ／１４日の範囲で投与される。別の実施形態では、意外にも、逆ペギル化ＯＸＭ組成物中のＯＸＭの有効量は、遊離ＯＸＭの有効量の１／４〜１／１０である。別の実施形態では、意外にも、ＯＸＭの逆ペギル化は、遊離ＯＸＭと比較して少なくとも５０％、患者に処方されるＯＸＭの量を制限させる。別の実施形態では、意外にも、ＯＸＭの逆ペギル化は、遊離ＯＸＭと比較して少なくとも７０％、患者に処方されるＯＸＭの量を制限させる。別の実施形態では、意外にも、ＯＸＭの逆ペギル化は、遊離ＯＸＭと比較して少なくとも７５％、患者に処方されるＯＸＭの量を制限させる。別の実施形態では、意外にも、ＯＸＭの逆ペギル化は、遊離ＯＸＭと比較して少なくとも８０％、患者に処方されるＯＸＭの量を制限させる。別の実施形態では、意外にも、ＯＸＭの逆ペギル化は、遊離ＯＸＭと比較して少なくとも８５％、患者に処方されるＯＸＭの量を制限させる。別の実施形態では、意外にも、ＯＸＭの逆ペギル化は、遊離ＯＸＭと比較して少なくとも９０％、患者に処方されるＯＸＭの量を制限させる。
別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭ組成物内のＯＸＭペプチド構成成分は、０．０１〜０．５ミリグラム／体重１ｋｇの範囲で、３日に１回投与される（ＰＥＧのサイズが実質的に異なり得る場合、逆ペギル化ＯＸＭ組成物内のＯＸＭの重量のみが提供される）。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭ組成物内のＯＸＭペプチド構成成分は、０．０１〜０．５ミリグラム／体重１ｋｇの範囲で、７日に１回投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭ組成物内のＯＸＭペプチド構成成分は、０．０１〜０．５ミリグラム／体重１ｋｇの範囲で、１０日に１回投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭ組成物内のＯＸＭペプチド構成成分は、０．０１〜０．５ミリグラム／体重１ｋｇの範囲で、１４日に１回投与される。
別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、遊離ＯＸＭと比較して、有効投薬回数を少なくとも２倍低減し、有効毎週用量を少なくとも２倍低減し、したがって、有害事象の危険を制限し、ＯＸＭ療法の使用のコンプライアンスを向上させる。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、遊離ＯＸＭと比較して、有効投薬回数を少なくとも３倍低減し、有効毎週用量を少なくとも３倍低減し、したがって、有害事象の危険を制限し、ＯＸＭ療法の使用のコンプライアンスを向上させる。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、遊離ＯＸＭと比較して、有効投薬回数を少なくとも４倍低減し、有効毎週用量を少なくとも４倍低減し、したがって、有害事象の危険を制限し、ＯＸＭ療法の使用のコンプライアンスを向上させる。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、遊離ＯＸＭと比較して、有効投薬回数を少なくとも５倍低減し、有効毎週用量を少なくとも５倍低減し、したがって、有害事象の危険を制限し、ＯＸＭ療法の使用のコンプライアンスを向上させる。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、遊離ＯＸＭと比較して、有効投薬回数を少なくとも６倍低減し、有効毎週用量を少なくとも６倍低減し、したがって、有害事象の危険を制限し、ＯＸＭ療法の使用のコンプライアンスを向上させる。別の実施形態では、有効投薬回数および有効毎週用量は、（１）逆ペギル化ＯＸＭ組成物内の投与ＯＸＭ構成成分の重量；および（２）遊離ＯＸＭ（非修飾ＯＸＭ）組成物内の投与ＯＸＭ構成成分の重量に基づいている。
別の実施形態では、本発明の方法は、ＯＸＭ療法を必要としている慢性疾病の患者のコンプライアンスを向上させることを包含する。別の実施形態では、本発明の方法は、本明細書中に上記したように、逆ペギル化ＯＸＭによるＯＸＭの投薬回数の低減を可能にする。別の実施形態では、応諾コンプライアンスという用語は遵守を含む。別の実施形態では、本発明の方法は、ＯＸＭの投与の回数を低減することにより、ＯＸＭ療法を必要とする患者のコンプライアンスを向上させることを包含する。別の実施形態では、ＯＸＭの投与回数の低減は、ＯＸＭをより安定に且つより強力にさせる逆ペギル化に頼む。別の実施形態では、ＯＸＭの投与回数の低減は、ＯＸＭのＴ１／２を増大することの結果として達成される。別の実施形態では、ＯＸＭの投与回数の低減は、ＯＸＭの血液クリアランスを低減することの結果として達成される。別の実施形態では、ＯＸＭの投与回数の低減は、ＯＸＭのＴ１／２を増大することの結果として達成される。別の実施形態では、ＯＸＭの投与回数の低減は、ＯＸＭのＡＵＣ測定値を増大することの結果として達成される。
別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、１日１回、対象に投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、２日に１回、対象に投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、３日に１回、対象に投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、４日に１回、対象に投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、５日に１回、対象に投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、６日に１回、対象に投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、毎週１回、対象に投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、７〜１４日に１回、対象に投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、１０〜２０日に１回、対象に投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、５〜１５日に１回、対象に投与される。別の実施形態では、逆ペギル化ＯＸＭは、１５〜３０日に１回、対象に投与される。
別の実施形態では、ペギル化ＯＸＭは、１日１回、対象に投与される。別の実施形態では、ペギル化ＯＸＭは、２日に１回、対象に投与される。別の実施形態では、ペギル化ＯＸＭは、３日に１回、対象に投与される。別の実施形態では、ペギル化ＯＸＭは、４日に１回、対象に投与される。別の実施形態では、ペギル化ＯＸＭは、５日に１回、対象に投与される。別の実施形態では、ペギル化ＯＸＭは、６日に１回、対象に投与される。別の実施形態では、ペギル化ＯＸＭは、毎週１回、対象に投与される。別の実施形態では、ペギル化ＯＸＭは、７〜１４日に１回、対象に投与される。別の実施形態では、ペギル化ＯＸＭは、１０〜２０日に１回、対象に投与される。別の実施形態では、ペギル化ＯＸＭは、５〜１５日に１回、対象に投与される。別の実施形態では、ペギル化ＯＸＭは、１５〜３０日に１回、対象に投与される。
一実施形態では、本明細書中で提供されるペギル化ＯＸＭ変異体は、意外にも、単一用量のＰＥＧ−ＯＸＭ変異体の投与後、絶食インスリンレベルの低減と一緒に、グルコースを低減する。別の実施形態では、本明細書中で提供されるペギル化ＯＸＭ変異体は、インスリンに対する対象の感受性の増大をもたらす（実施例６参照）。
経口投与は、一実施形態では、錠剤、カプセル、舐剤、咀嚼錠、懸濁液、乳濁液等を含む単位剤形を包含する。このような単位剤形は、安全且つ有効量の本発明のＯＸＭを含み、その各々は、一実施形態では、約０．７または３．５ｍｇ〜約２８０ｍｇ／７０ｋｇであり、あるいは別の実施形態では、約０．５または１０ｍｇ〜約２１０ｍｇ／７０ｋｇである。経口投与のための単位剤形の調製に適した薬学的に許容可能な担体は、当該技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、錠剤は、典型的には、不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、マンニトール、ラクトースおよびセルロース；結合剤、例えばゼラチンおよびスクロース；崩壊剤、例えばデンプン、アルギン酸およびクロスカルメロール；滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸およびタルクのような慣用的な薬学的適合性アジュバントを含む。一実施形態では、粉末混合物の流動特質を改善するために、流動促進剤、例えば二酸化ケイ素が用いられ得る。一実施形態では、着色剤、例えばＦＤ＆Ｃ染料が外見のために付加され得る。甘味剤および風味剤、例えばアスパルターム、サッカリン、メントール、ペパーミントおよび果実風味は、咀嚼錠のための有用なアジュバントである。カプセルは、典型的には、上記の１つ以上の固体希釈剤を含む。いくつかの実施形態では、担体構成成分の選択は、味、価格および貯蔵安定性によって決まるが、これは本発明の目的のためには重要ではなく、当業者により容易になされ得る。
一実施形態では、経口剤形は、予め決定された放出プロフィールを含む。一実施形態では、本発明の経口剤形は、延長放出錠剤、カプセル、舐剤または咀嚼錠を含む。一実施形態では、本発明の経口剤形は、緩徐放出錠剤、カプセル、舐剤または咀嚼錠を含む。一実施形態では、本発明の経口剤形は、即時放出錠剤、カプセル、舐剤または咀嚼錠を含む。一実施形態では、本発明の経口剤形は、当業者に既知であるような長時間作用型ＯＸＭの所望の放出プロフィールによって処方される。
別の実施形態では、本発明の方法に用いるための組成物は溶液または乳濁液を含み、これは、別の実施形態では、安全且つ有効量の本発明の化合物、および任意に局所的鼻内投与のために意図される他の化合物を含む水性溶液または乳濁液である。いくつかの実施形態では、組成物は、約０．００１％〜約１０．０％ｗ／ｖの対象化合物、さらに好ましくは約０．０１％〜約２．０％の対象化合物を含み、これは、鼻内経路による化合物の全身送達に用いられる。
別の実施形態では、薬学的組成物は、液体調製物の静脈内、動脈内、皮下または筋肉内注射により投与される。別の実施形態では、液体処方物としては、溶液、懸濁液、分散液、乳濁液、油等が挙げられる。一実施形態では、薬学的組成物は、静脈内投与され、したがって、静脈内投与に適した形態で処方される。別の実施形態では、薬学的組成物は動脈内に投与され、したがって、動脈内投与に適した形態で処方される。別の実施形態では、薬学的組成物は、筋肉内に投与され、したがって、筋肉内投与に適した形態で処方される。
さらに、別の実施形態では、薬学的組成物は、身体表面に局所的に投与され、したがって、局所投与に適した形態で処方される。適切な局所的処方物としては、ゲル、軟膏、クリーム、ローション、滴薬等が挙げられる。局所投与のために、本発明の化合物は、薬学的担体を伴ってまたは伴わずに、生理学的に許容可能な希釈剤中の溶液、懸濁液または乳濁液として調製され、適用される単数または複数の付加的な適切な治療薬と組み合わされる。
一実施形態では、本発明の薬学的組成物は、当該技術分野で既知の方法により、例えば慣用的な混合、溶解、造粒、糖衣作製、均質混合物化、乳化、封入、閉じ込めまたは凍結乾燥法により、製造される。
一実施形態では、本発明に従って用いるための薬学的組成物は、薬学的に用いられ得る調製物へのＯＸＭの加工処理を助長する賦形剤および助剤を含む１つ以上の生理学的に許容可能な担体を用いて、慣用的やり方で処方される。一実施形態では、処方物は選択される投与経路によって決まる。
一実施形態では、本発明の注射剤は水溶液中に処方される。一実施形態では、本発明の注射剤は、生理学的に適合性の緩衝液、例えばハンクス溶液、リンガー溶液または生理学的食塩緩衝液中に処方される。いくつかの実施形態では、経粘膜投与のために、浸透されるべきバリアに適した浸透剤が処方物中に用いられる。このような浸透剤は、一般的に当該技術分野で既知である。
一実施形態では、本明細書中に記載される調製物は、例えばボーラス注射または連続注入により、非経口投与のために処方される。別の実施形態では、注射のための処方物は、単位剤形で、例えばアンプル中に、または多用量容器中に、任意に付加防腐剤とともに存在する。別の実施形態では、組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳濁液であり、処方剤、例えば沈澱防止剤、安定化剤および／または分散剤を含有する。
組成物は、別の実施形態では、防腐剤、例えば塩化ベンズアルコニウムおよびチメロサール等；キレート化剤、例えばエデト酸ナトリウム等；緩衝剤、例えばリン酸塩、クエン酸塩および酢酸塩；等張化剤、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール等；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、アセチルシスチン、メタ重亜硫酸ナトリウム等；芳香剤；粘度調整剤、例えばポリマー、例えばセルロースおよびその誘導体；ならびにポリビニルアルコールおよび酸および塩基（必要に応じて、これらの水性組成物のｐＨを調整する）も含む。組成物は、いくつかの実施形態では、局部麻酔薬またはその他の活性作用物質も含む。組成物は、スプレー、ミスト、滴剤等として用いられ得る。
一実施形態では、非経口投与のための薬学的組成物は、水溶性形態で活性調製物の水溶液を包含する。付加的には、長時間作用型ＯＸＭの懸濁液は、いくつかの実施形態では、適切な油性または水性注射用懸濁液として調製される。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、いくつかの実施形態では、脂肪油、例えばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えばエチルオレエート、トリグリセリドまたはリポソームが挙げられる。水性注射用懸濁液は、いくつかの実施形態では、懸濁液の粘度を増大する物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含有する。別の実施形態では、懸濁液は、適切な安定化剤、または長時間作用型ＯＸＭの溶解度を増大して、高濃度溶液の調製を可能にする作用物質も含有する。
別の実施形態では、活性化合物は、ビヒクル中で、特定のリポソーム中で送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３ （１９９０）；Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ， Ｌｏｐｅｚ− Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ （ｅｄｓ．）， Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ３５３−３６５ （１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ， 同書 ｐｐ． ３１７−３２７（同書参照）参照）。
別の実施形態では、制御放出系で送達される薬学的組成物は、静脈内注入、埋込み式浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソームまたは他の投与方式のために処方される。一実施形態では、ポンプが用いられる（Ｌａｎｇｅｒ， ｓｕｐｒａ； Ｓｅｆｔｏｎ， ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｆ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ． １４：２０１ （１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７ （１９８０）； Ｓａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２１：５７４ （１９８９）参照）。別の実施形態では、高分子物質が用いられる。さらに別の実施形態では、制御放出系が、治療標的、例えば脳の近位に配置され、したがって必要とされるのは全身用量のほんの一部分であり得る（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ， ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， ｓｕｐｒａ， ｖｏｌ． ２， ｐｐ． １１５−１３８ （１９８４）参照）。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ （Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３ （１９９０）による論評で考察されている。
一実施形態では、長時間作用型ＯＸＭは、使用前に、適切なビヒクル、例えば滅菌、発熱物質除去水ベースの溶液を用いて構成するために、粉末形態で存在する。組成物は、いくつかの実施形態では、霧化および吸入投与のために処方される。別の実施形態では、組成物は、霧化手段を取り付けた容器中に含入される。
一実施形態では、本発明の調製物は、例えば慣用的坐薬基剤、例えばココアバターまたは他のグリセリドを用いて、直腸用組成物、例えば坐薬または停留浣腸中に処方される。
一実施形態では、本発明の状況で用いるのに適した薬学的組成物は、意図された目的を達成するために有効な量で長時間作用型ＯＸＭが含入される組成物を包含する。別の実施形態では、治療的有効量は、疾患の症候を防止し、軽減し、または改善するために、あるいは処置されている対象の生存を延長するために有効な長時間作用型ＯＸＭの量を意味する。
一実施形態では、治療的有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
組成物は、防腐剤、例えば塩化ベンズアルコニウムおよびチメロサール等；キレート化剤、例えばエデト酸ナトリウム等；緩衝剤、例えばリン酸塩、クエン酸塩および酢酸塩；等張化剤、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール等；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、アセチルシスチン、メタ重亜硫酸ナトリウム等；芳香剤；粘度調整剤、例えばポリマー、例えばセルロースおよびその誘導体；ならびにポリビニルアルコールおよび酸および塩基（必要に応じて、これらの水性組成物のｐＨを調整する）も含む。組成物は、局部麻酔薬またはその他の活性作用物質も含む。組成物は、スプレー、ミスト、滴剤等として用いられ得る。
薬学的に許容可能な担体またはその構成成分として役立ち得る物質のいくつかの例は、糖、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース；デンプン、例えばコーンスターチおよびジャガイモデンプン；セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよびメチルセルロース；粉末トラガカントゴム；モルト；ゼラチン；タルク；固体滑剤、例えばステアリン酸およびステアリン酸マグネシウム；硫酸カルシウム；植物油、例えば落花生油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびカカオ属の油；ポリオール、例えばプロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；アルギン酸；乳化剤、例えばトゥイーン（商標）銘柄の乳化剤；湿潤剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム；着色剤；風味剤；錠剤化剤、安定化剤；酸化防止剤；防腐剤；発熱性物質除去水；等張生理食塩水；ならびにリン酸塩緩衝溶液である。当該化合物と一緒に用いられるべき薬学的に許容可能な担体は、基本的には、化合物が投与されるべき方法により決定される。対象化合物が注射されるべきものである場合、一実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、血液相溶性沈澱防止剤を伴い、そのｐＨが約７．４に調整されている滅菌生理食塩水である。
さらに、組成物は、結合剤（例えば、アラビアゴム、コーンスターチ、ゼラチン、カルボマー、エチルセルロース、グアーゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポビドン）、崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸、二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、グアーゴム、デンプングリコール酸ナトリウム）、種々のｐＨおよびイオン強度の緩衝剤（例えば、トリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、表面への吸収を防止するための添加物、例えばアルブミンまたはゼラチン、洗剤（トゥイーン２０、トゥイーン８０、プルロニックＦ６８、胆汁酸塩）、プロテアーゼ阻害剤、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）、浸透増強剤、可溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリコール）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシアニソール）、安定化剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、粘度増加剤（例えば、カルボマー、コロイド二酸化ケイ素、エチルセルロース、グアーゴム）、甘味剤（例えば、アスパルテーム、クエン酸）、防腐剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、滑剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、流動助剤（例えば、コロイド二酸化ケイ素）、可塑剤（例えば、ジエチルフタレート、トリエチルシトレート）、乳化剤（例えば、カルボマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム）、ポリマーコーティング（例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン）、コーティングおよび皮膜形成剤（例えば、エチルセルロース、アクリレート、ポリメタクリレート）および／またはアジュバントをさらに含む。
シロップ、エリキシル、乳濁液および懸濁液のための担体の典型的構成成分としては、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、液体スクロース、ソルビトールおよび水が挙げられる。懸濁液に関しては、典型的沈澱防止剤としては、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セルロース（例えば、アビセル（商標）、ＲＣ−５９１）、トラガカントゴムおよびアルギン酸ナトリウムが挙げられる；典型的湿潤剤としては、レシチンおよびポリエチレンオキシドソルビタン（例えば、ポリソルベート８０）が挙げられる。典型的防腐剤としては、メチルパラベンおよび安息香酸ナトリウムが挙げられる。別の実施形態では、経口液体組成物は、上記の甘味剤、風味剤および着色剤のような１つ以上の構成成分も含有する。
組成物は、高分子化合物、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル等の特定調製物中へのまたはその上へ、あるいはリポソーム、マイクロエマルション、ミセル、単層または多層膜小胞（赤血球ゴーストまたはスフェロプラスト）上への、活性物質の組入れも包含する。このような組成物は、物理的状態、溶解性、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度およびｉｎ ｖｉｖｏクリアランス率に影響を及ぼす。
ポリマー（例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン）で被覆された粒状組成物、および組織特異的受容体、リガンドまたは抗原に対して向けられる抗体と結合されるか、あるいは組織特異的受容体のリガンドと結合される化合物、も本発明に含まれる。
一実施形態では、化合物は、水溶性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンまたはポリプロリンの共有結合により修飾される。別の実施形態では、修飾化合物は、対応する非修飾化合物よりも、静脈内注射後の血中での実質的により長い半減期を示す。一実施形態では、修飾は、さらにまた、水溶液中での化合物の溶解度を増大し、凝集を排除し、化合物の物理的および化学的安定性を増強し、そして化合物の免疫原性および反応性を大いに低減する。別の実施形態では、所望のｉｎ ｖｉｖｏ生物学的活性は、このようなポリマー−化合物付加物の投与により、非修飾化合物の場合より低頻度でまたは低用量で達成される。
別の実施形態では、有効量または用量の調製は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ検定から最初に概算され得る。一実施形態では、用量は動物モデルで処方され、このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより精確に決定するために用いられ得る。
一実施形態では、本明細書中に記載されるような長時間作用型アゴニスト（例えばＯＸＭ）の毒性および治療効力は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの、細胞培養における、または実験動物における標準薬学的手順により確定され得る。一実施形態では、これらのｉｎ ｖｉｔｒｏおよび細胞培養検定ならびに動物試験から得られるデータは、ヒトに用いるための一連の投与量を処方するのに用いられ得る。一実施形態では、投与量は、用いられる剤形、および利用される投与経路によって変わる。一実施形態では、精確な処方、投与経路および投与量は、患者の症状にかんがみて、個々の医者により選択され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌ， ｅｔ ａｌ．， （１９７５） “Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”， Ｃｈ． １ ｐ．１参照）。
一実施形態では、処置されるべき症状の重症度および応答性によって、投薬は、単一または複数回の投与であり、処置過程は、数日から数週間まで、あるいは治癒が実行されるかまたは疾患状態の縮小が達成されるまで続く。
一実施形態では、投与されるべき組成物の量は、もちろん、処置されている対象、苦痛の重症度、投与方法、処方医の判断等によって決まる。
一実施形態では、適合性薬学的担体中に処方される本発明の調製物を含む組成物も調製され、適切な容器中に入れられて、指示症状の処置に関するラベルを貼られる。
別の実施形態では、本明細書中に記載されるようなペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストは、全身投与により投与される。別の実施形態では、本明細書中に記載されるようなペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストは、静脈内、筋肉内または皮下注射により投与される。別の実施形態では、本明細書中に記載されるようなペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストは、複合有機賦形剤および安定化剤、例えば非イオン性表面活性作用物質（すなわち界面活性剤）、種々の糖、有機ポリオールおよび／またはヒト血清アルブミンと組み合わせた凍結乾燥（フリーズドライ）調製物である。別の実施形態では、薬物学的組成物は、注射用の滅菌水中に本明細書中に記載されるような凍結乾燥ペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを含む。別の実施形態では、薬学的組成物は、注射用の滅菌ＰＢＳ中に本明細書中に記載されるような凍結乾燥ペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを含む。別の実施形態では、薬学的組成物は、注射用の滅菌０．９％ＮａＣｌ中に本明細書中に記載されるような凍結乾燥ペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを含む。
別の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書中に記載されるようなペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニスト、ならびに複合担体、例えばヒト血清アルブミン、ポリオール、糖および陰イオン性表面活性安定化剤を含む。例えば、ＷＯ ８９／１０７５６（Ｈａｒａ等、ポリオールおよびｐ−ヒドロキシベンゾエートを含有）参照。別の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書中に記載されるような逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストならびにラクトビオン酸および酢酸塩／グリシン緩衝液を含む。別の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書中に記載されるようなペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストならびにアミノ酸、例えばアルギニンまたはグルタミン酸塩（水中のインターフェロン組成物の溶解性を増大する）を含む。別の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書中に記載されるような凍結乾燥ペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニスト、ならびにグリシンまたはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、緩衝液（例えば酢酸塩）および等張化剤（例えばＮａＣｌ）を含む。別の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書中に記載されるような凍結乾燥ペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニスト、ならびにリン酸塩緩衝液、グリシンおよびＨＳＡを含む。
別の実施形態では、本明細書中に記載されるようなペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを含む薬学的組成物は、約４〜７．２のｐＨを有する緩衝溶液中に入れられると、安定化される。別の実施形態では、本明細書中に記載されるようなペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを含む薬学的組成物は、安定化剤としてのアミノ酸で、いくつかの場合には塩（アミノ酸が荷電側鎖を含有しない場合）で安定化される。
別の実施形態では、本明細書中に記載されるようなペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを含む薬学的組成物は、約０．３重量％〜５重量％で安定化剤（アミノ酸）を含む液体組成物である。
別の実施形態では、本明細書中に記載されるようなペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを含む薬学的組成物は、投薬精度および生成物安全性を提供する。別の実施形態では、本明細書中に記載されるようなペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを含む薬学的組成物は、注射用途に用いるための生物学的に活性な安定液体処方物を提供する。別の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書中に記載されるような非凍結乾燥化ペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを含む。
別の実施形態では、本明細書中に記載されるようなペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを含む薬学的組成物は、液体状態での長期間の保存を可能にして、投与前の貯蔵および輸送を手助けする。
別の実施形態では、本明細書中に記載されるようなペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを含む薬学的組成物は、マトリックス物質として固体脂質を含む。別の実施形態では、本明細書中に記載されるようなペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを含む注射用薬学的組成物は、マトリックス物質として固体脂質を含む。別の実施形態では、噴霧凝固による脂質マイクロ粒子の製造は、Ｓｐｅｉｓｅｒ（Ｓｐｅｉｓｅｒ ａｎｄ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ８（１９９１） ４７−５４）により記載されており、その後、経口投与のための脂質ナノペレットを生じる（Ｓｐｅｉｓｅｒ、 ＥＰ ０１６７８２５（１９９０））。別の実施形態では、用いられる脂質は、身体により良好に耐容される（例えば、非経口栄養のための乳濁液中に存在する脂肪酸からなるグリセリド）。
別の実施形態では、本明細書中に記載されるようなペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを含む薬学的組成物は、リポソームの形態である（Ｊ．Ｅ． Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓ ａｎｄ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ．／ｎｄ． ５６ （１９９４） ２６７−２７５）。
別の実施形態では、本明細書中に記載されるようなペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを含む薬学的組成物は、高分子マイクロ粒子を含む。別の実施形態では、本明細書中に記載されるようなペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを含む注射用薬学的組成物は、高分子マイクロ粒子を含む。別の実施形態では、本明細書中に記載されるようなペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを含む薬学的組成物は、ナノ粒子を含む。別の実施形態では、本明細書中に記載されるような逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを含む薬学的組成物は、リポソームを含む。別の実施形態では、本明細書中に記載されるようなペギル化または逆ペギル化ＯＸＭを含む薬学的組成物は、脂質乳濁液を含む。別の実施形態では、本明細書中に記載されるようなペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを含む薬学的組成物は、マイクロスフェアを含む。別の実施形態では、本明細書中に記載されるようなペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを含む薬学的組成物は、脂質ナノ粒子を含む。別の実施形態では、本明細書中に記載されるようなペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを含む薬学的組成物は、両親媒性脂質を含む脂質ナノ粒子を含む。別の実施形態では、本明細書中に記載されるようなペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを含む薬学的組成物は、薬剤、脂質マトリックスおよび界面活性剤を含む脂質ナノ粒子を含む。別の実施形態では、脂質マトリックスは、少なくとも５０％ｗ／ｗであるモノグリセリド含量を有する。
一実施形態では、本発明の組成物は、パックまたはディスペンサー装置、例えばＦＤＡ認可キット中で提示され、これは、長時間作用型デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストを含有する１つ以上の単位剤形を含有する。一実施形態では、パックは、例えばブリスターパックのように、金属またはプラスチック箔を含む。一実施形態では、パックまたはディスペンサー装置は、投与のための使用説明書を添付される。一実施形態では、パックまたはディスペンサーは、医薬品の製造、使用または販売を調節する政府機関により処方される形態での容器に関連した通知により適応されるが、この通知は、組成物の形態あるいはヒトまたは獣医学的投与に付いての当該機関による認可を反映する。このような通知は、一実施形態では、処方薬に関してまたは認可製品挿入物の米国食品医薬品局により認可されたラベルである。
一実施形態では、本発明のペギル化または逆ペギル化デュアルＧＬＰ−１／グルカゴン受容体アゴニストは、付加的活性作用物質とともに個体に提供されて、各作用物質それ自体による処置の場合と比較して、改善された治療効果を達成し得る、と理解される。別の実施形態では、組合せ両方に関連した副作用に対して、測定（例えば相補的作用物質の投薬および選択）がなされる。
本発明の付加的な目的、利点および新規の特徴は、以下の実施例を試験時に当業者に明らかになるが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。付加的には、本明細書中の上記で説明したような、および以下の特許請求の範囲で主張されるような本発明の種々の実施形態および態様は、各々、以下の実施例で実験的に支持される。
一般に、本明細書中で用いられる命名法、ならびに本発明で利用される実験室手法は、分子的、生化学的、微生物学的および組換えＤＮＡ技法を包含する。このような技法は、文献中で十分に説明されている。例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８９）； “Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｒ． Ｍ．， ｅｄ． （１９９４）； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， “Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ （１９８９）； Ｐｅｒｂａｌ， “Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）； Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， “Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ） “Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ”， Ｖｏｌｓ． １−４， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９８）； ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ ａｓ ｓｅｔ ｆｏｒｔｈ ｉｎ Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏｓ． ４，６６６，８２８； ４，６８３，２０２； ４，８０１，５３１； ５，１９２，６５９ ａｎｄ ５，２７２，０５７； “Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ｃｅｌｌｉｓ， Ｊ． Ｅ．， ｅｄ． （１９９４）； “Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ − Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ” ｂｙ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｎ． Ｙ． （１９９４）， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ； “Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ． Ｅ．， ｅｄ． （１９９４）； Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ）， “Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ” （８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）， Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ， Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ （１９９４）； Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ （ｅｄｓ）， “Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８０）； ａｖａｉｌａｂｌｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ ａｒｅ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｅｎｔ ａｎｄ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ， ｓｅｅ， ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏｓ． ３，７９１，９３２； ３，８３９，１５３； ３，８５０，７５２； ３，８５０，５７８； ３，８５３，９８７； ３，８６７，５１７； ３，８７９，２６２； ３，９０１，６５４； ３，９３５，０７４； ３，９８４，５３３； ３，９９６，３４５； ４，０３４，０７４； ４，０９８，８７６； ４，８７９，２１９； ５，０１１，７７１ ａｎｄ ５，２８１，５２１； “Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” Ｇａｉｔ， Ｍ． Ｊ．， ｅｄ． （１９８４）； “Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ” Ｈａｍｅｓ， Ｂ． Ｄ．， ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ． Ｊ．， ｅｄｓ． （１９８５）； “Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ” Ｈａｍｅｓ， Ｂ． Ｄ．， ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ． Ｊ．， ｅｄｓ． （１９８４）； “Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ” Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ． Ｉ．， ｅｄ． （１９８６）； “Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ” ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， （１９８６）； “Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ” Ｐｅｒｂａｌ， Ｂ．， （１９８４） ａｎｄ “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌ． １−３１７， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； “ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ （１９９０）； Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．， “Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ” ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ （１９９６）（これらすべての記載内容は参照により本明細書中で援用される）を参照。他の一般的参考文献が、この文書全体を通して提供される。
材料および方法
ＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭ合成
ＯＸＭ合成：ペプチド鎖アセンブリー（Ａｌｍａｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓｃｏｔｌａｎｄ）全体を通して、Ｆｍｏｃ戦略を用いて固相法により、配列：ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号１）のオキシントモジュリンを合成した。（１）キャッピングステップ：ＤＭＦ（Ｒａｔｈｂｕｒｎ）中の０．５Ｍ無水酢酸（Ｆｌｕｋａ）溶液を用いて、樹脂をキャッピングした；（２）脱保護化ステップ：ＤＭＦ（Ｒａｔｈｂｕｒｎ）中の２０％ｖ／ｖ ピペリジン（Ｒａｔｈｂｕｒｎ）溶液を用いて、Ｆｍｏｃ保護基を成長中のペプチド鎖から除去した；ならびに（３）アミノ酸カップリングステップ：ＤＭＦ（Ｒａｔｈｂｕｒｎ）中の１Ｍ ＨＯＢｔ（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ）溶液およびＤＭＦ（Ｒａｔｈｂｕｒｎ）中の１Ｍ ＤＩＣ（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ）溶液を用いて、ＤＭＦ（Ｒａｔｈｂｕｒｎ）中の０．５Ｍアミノ酸（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）溶液を活性化した。カップリング当たり４当量の各アミノ酸を用いることにより、ペプチド配列を組み立てた。
粗製ペプチドを樹脂から切断し、トリイソプロピルシラン（Ｆｌｕｋａ）、水、ジメチルスルフィド（Ａｌｄｒｉｃｈ）、ヨウ化アンモニウム（Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＴＦＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のカクテル中で４時間撹拌することにより、保護基を除去した。次いで、冷ジエチルエーテルから沈澱させることにより、粗製ペプチドを収集した。
ペプチド精製：粗製ペプチドをアセトニトリル（Ｒａｔｈｂｕｒｎ）／水（ＭｉｌｌｉＱ）（５：９５）中に溶解し、分取ＨＰＬＣカラム上に載せた。クロマトグラフィーパラメーターを以下に示す：カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８ ２５０ｍｍ×３０ｍｍ、１５μｍ、３００Ａ；移動相Ａ：水＋０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；移動相Ｂ：アセトニトリル（Ｒａｔｈｂｕｒｎ）＋０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；ＵＶ検出：２１４または２２０ｎｍ；勾配；４カラム容積全体で２５％Ｂ〜３１％Ｂ；および流量 ４３ｍＬ／分。
段階２−リンカー合成−ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳリンカーの合成
Figure 2014516993
化合物２〜５の合成は、Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ， ２００１， ３１（２）， ２２５−２３２（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）により記載された手法を基礎にした。
２−（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレン（２）：２−アミノフルオレン（１８ｇ、９９ｍｍｏｌ）を、磁気撹拌しながら、氷浴中のジオキサン：水（２：１）（２００ｍｌ）および２Ｎ ＮａＯＨ（６０ｍｌ）の混合物中に懸濁した。Ｂｏｃ２Ｏ（１０９ｍｍｏｌ、１．１当量）を次に付加し、室温で撹拌を継続した。反応をＴＬＣ（Ｒｆ＝０．５、ヘキサン／酢酸エチル２：１）によりモニタリングし、２Ｎ ＮａＯＨの付加によりｐＨを９〜１０に保持した。反応完了時に、懸濁液を１Ｍ ＫＨＳＯ４で酸性にして、ｐＨ＝３とした。固相を濾過し、冷水（５０ｍｌ）、ジオキサン−水（２：１）で洗浄して、次に、トルエンとの共沸混合を２回行なった後、それを次のステップに用いた。
９−ホルミル−２−（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレン（３）：三つ首丸底フラスコ（ＲＢＦ）中で、ＮａＨ（油中６０％；３３０ｍｍｏｌ、３．３当量）をドライＴＨＦ（５０ｍｌ）中に懸濁し、ドライＴＨＦ（２３０ｍｌ）中のステップ２からの２−（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレン（２８ｇ；１００ｍｍｏｌ）の溶液を２０分掛けて滴下した。濃い黄色のスラリーが観察されたら、混合物を窒素下で室温で１０分間撹拌した。蟻酸エチル（２０．１ｍｌ、２５０ｍｍｏｌ、２．５当量）を滴下した（注意：ガス発生）。スラリーが淡褐色溶液に変わった。溶液を２０分間撹拌した。ＴＬＣ（Ｒｆ＝０．５、ヘキサン／酢酸エチル １：１）により反応をモニタリングし、微量の出発物質しか観察されなくなったら、それを、氷水（３００ｍｌ）でクエンチした。ＴＨＦのほとんどが除去されるまで、混合物を減圧下で蒸発させた。その結果生じた混合物を、酢酸で処理して、ｐＨ＝５とした。得られた白色沈澱を酢酸エチル中に溶解すると、有機層が分離した。水性層を酢酸エチルで抽出し、有機層すべてを併合して、飽和重炭酸ナトリウム、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥した。濾過および溶媒除去後、黄色固体を得た。この物質を次のステップに用いた。
９−ヒドロキシメチル−２−（Ｂｏｃ−アミノ）フルオレン（４）： 化合物３をＭｅＯＨ（２００ｍｌ）中に懸濁し、水素化ホウ素ナトリウムを１５分間に亘って一部ずつ付加した。混合物を３０分間撹拌した（注意：発熱反応およびガス発生）。反応を、ＴＬＣ（Ｒｆ＝０．５、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ １：１）によりモニタリングし、完了させた。水（５００ｍｌ）を付加し、ｐＨを酢酸でｐＨ５に調整した。一連の検査には、酢酸エチルによる２回の抽出、重炭酸ナトリウム、ブラインで併合有機層を洗浄すること、ＭｇＳＯ４上での乾燥、濾過ならびに濃縮乾燥が含まれていた。得られた粗製物を、ヘプタン／ＥｔＯＡｃ （３：１）を用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、黄色発泡体を得た（３６ｇ、純度９７．５％、１Ｈ−ＮＭＲで微量の酢酸エチルおよびジエチルエーテルが観察された）。
９−ヒドロキシメチル−２−アミノフルオレン（５）：化合物４を、ジオキサン中の４Ｎ ＨＣｌの氷冷溶液に付加した。反応混合物を室温に上げさせて、一晩撹拌した。淡黄色沈澱を得た。懸濁液を０oＣで冷却して、さらに５時間撹拌した。この後に、固体を濾過し、ＤＣＭ（５ｘ３０ｍｌ）で徹底的に洗浄した。乾燥後、淡黄色固体（２０ｇ、純度９６．５％）を、３ステップに亘って、全収率８０％で得た。
９−ヒドロキシメチル−２−（アミノ−３−マレイミドプロピオネート）フルオリン（６）：９ヒドロキシメチル−２−アミノフルオレン（５、５．５ｇ、２６ｍｍｏｌ）および無水マレイミドプロピオン酸（６．９３ｇ、２６ｍｍｏｌ）を、撹拌器、還流冷却基および窒素発泡装置を装備した２５０ｍｌ ＲＢＦ中に入れた。反応混合物を、８５oＣで２５時間、還流した。ＴＬＣ（Ｒｆ＝０．２５、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ １：４）は、この時点後に反応完了を示した。反応混合物を真空下で濃縮して、黄色固体を得た。生成物を、カラムクロマトグラフィーにより精製した。
ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳ（７）：頭上撹拌装置を有する清浄乾燥５００ｍｌ ＲＢＦに、ドライＴＨＦ（５５ｍｌ）中のトリホスゲン（１．５８ｇ、０．３５当量）を投入して、周囲温度で溶液を生成した。溶液を氷／水浴で約０ｏＣに冷却し、ドライＴＨＦ（１９ｍｌ）中のＮＨＳ（０．６７ｇ、０．３８当量）の溶液を、窒素下で０ｏＣで、１０分間に亘って滴下した。その結果生じた溶液を、３０分間撹拌した。ドライＴＨＦ（３６ｍｌ）中のＮＨＳ（１．３４ｇ、０．７７当量）のさらなる部分を、０ｏＣで１０分間に亘って滴下し、１５分間撹拌した。
化合物６（５．５ｇ、１当量）、ドライＴＨＦ（５５ｍｌ）およびピリジン（３．０７ｍｌ、２．５当量）を一緒に撹拌して、懸濁液を生成した。これを、０〜５ｏＣで分けてＮＨＳ溶液に付加し、次いで、氷浴を除去することにより室温に上げさせた。２０時間後、反応を停止した（出発物質は依然として存在し、反応が強制的に完了させられた場合、薄暗い不純物が観察された）。反応混合物を濾過し、濾液に、４％ブライン（２００ｍｌ）およびＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）を付加した。分離後、有機層を５％クエン酸（２２０ｍｌ）および水（２２０ｍｌ）で洗浄した。次に、有機層を濃縮して、７．６７ｇの粗製ＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳを得た。当該物質を、シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ ７０：３０〜４０：６０の勾配を用いて、カラムクロマトグラフィーにより精製した。生成物を含有する分画を真空濃縮して、３．４７ｇ（４５％）のＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳを得た。
ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ（試験反応）：トリフルオロ酢酸（１０ｍｌ）中のＭＡＬ−Ｆｍｏｃ−ＮＨＳ（１００ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）の溶液に、クロロスルホン酸（０．５ｍｌ）を付加した。１５分後、氷冷ジエチルエーテル（９０ｍｌ）を付加すると、生成物が沈殿した。当該物質を遠心分離により収集し、ジエチルエーテルで洗浄して、真空乾燥した。４１．３ｍｇ（３５％）のベージュ色固体を得た。
段階３−結合
ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ結合：ＰＥＧ、ＦｍｏｃおよびＯＸＭを用いた結合を、１：１：１のモル比で実施し、例えばＰＥＧ４０−ＳＨ（４４ｍｇ、４．４ｍｌの水中、１．０μｍｏｌと等価）をペプチド（４．５ｍｇ、１．０μｍｏｌと等価）に付加し、ＮａＨＣＯ３（１Ｍ、０．１ｍｌ）を付加した。Ｆｍｏｃ（Ａｌｍａｃ、ＤＭＦ中１０ｍｇ／ｍｌｍ、５０μｌ）を撹拌しながら付加した。反応を室温で２４時間撹拌した。
ＰＥＧ−ＦＭＳ−ＯＸＭ結合：ＰＥＧ、リンカーおよびＯＸＭ間で、１：１：１のモル比で、ＰＥＧ４０−ＳＨおよびＰＥＧ３０−ＳＨ（ＮＯＦ）、ＦＭＳ（Ａｌｍａｃ）、ＥＭＣＳ（Ｔｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＯＸＭ（Ａｌｍａｃ）の試薬を用いて、全結合を実施した。ＰＥＧ４０−ＳＨを、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ７．２中に溶解して、濃度を１０ｍｇ／ｍＬにした。その溶液を、１等量の精製ＯＸＭペプチド（Ａｌｍａｃ）に付加した。ＭＡＬ−ＦＭＳ−ＮＨＳ（Ａｌｍａｃ）リンカーをＤＭＦ中に溶解して１０ｍｇ／ｍＬの濃度にして、１当量を反応に付加した。混合物を３０分間撹拌した。氷酢酸（Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて溶液を中和して、ｐＨ４とした。中和混合物を濾過し（０．４５μｍ）、分取クロマトグラフィーを用いて分離した。反応混合物を濾過し、分取ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８）により精製し、凍結乾燥して、凍結保存した。
クロマトグラフィーパラメーターを以下に示す：カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２） ２５０ｍｍ×３０ｍｍ、１５μｍ ｐｒｅｐ、１００Ａ；移動相Ａ：水（ＭｉｌｌｉＱ）＋０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；移動相Ｂ：水／アセトニトリル（Ｒａｔｈｂｕｒｎ）（２５：７５）＋０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；ＵＶ検出：２１４ｎｍ；勾配：１０％Ｂ〜６５％Ｂ（４１分間掛けて）；および流量：４３ｍＬ／分。
アミノ酸分析（ＡＡＡ）または塩基性加水分解を用いて、ＯＸＭ含量を決定した。限定量の凍結乾燥ＯＸＭ結合体を、２０ｍｇ／ｍｌの濃度で水中に溶解した。次いで、２８０ｎｍでの吸光度を確定し、２８０ｎｍでの吸光度による濃度を、ε２８０＝２９，７００を用いて算定した。アリコートを酸性加水分解し、その後、定量的アミノ酸分析することにより、ペプチドの濃度を精確に定量した；理想的な分画は、２８０ｎｍでの算定吸光度とペプチド含量との間の厳密な一致を有するものである。
ｃＡＭＰ細胞ベースの検定の誘導
ＧＬＰ−１受容体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＨＴＳ１６３Ｃ２）を過剰発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、９６ウェル半領域白色プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中に２００，０００細胞／ｍｌの密度で植え付けて、３７oＣで２４時間インキュベートした。ＯＸＭ（ＡＬＭＡＣ）、ＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭおよびＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭの濃度を増大しながら、ラット血清１％（Ｂｉｏ ｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ）を用いて、または用いずに、細胞をインキュベートした。細胞のｃＡＭＰ濃度をＨＴＲＦ検定（Ｃｉｓｂｉｏ ６２ＡＭ４ＰＥＢ）により定量し、ＥＣ５０パラメーターをＰＲＩＳＭソフトウェアにより解析した。
薬物動態試験
ＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭの薬物動態プロフィールを、雄Ｗｉｓｔａｒラットに、単回用量のネイティブＯＸＭ（ｎ＝９、２７８μｇ／ｋｇ）を、またはＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ（ｎ＝６、２７８μｇ／ｋｇペプチド当量）を、静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）投与して、評価した。動物３匹／群のコホートを、交互時点で採血した。ＯＸＭ血清濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｃａｔ＃ Ｓ−１３９３、Ｂａｃｈｅｍ）を用いて分析した。
ＩＰグルコース耐容性試験
Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスを一晩絶食させて、計量し、掌サイズの血糖計を用いて、尾静脈試料採取により血糖レベルを測定した。ＰＢＳ（ビヒクル）、ＯＸＭ（３３３ｎｍｏｌ／ｋｇ）、ＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ（非可逆的ペギル化ＯＸＭ、３３３ｎｍｏｌ／体重１ｋｇのペプチド含量）およびＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ（２０２ｎｍｏｌ／体重１ｋｇのペプチド含量）および対照としてＰＥＧ４０−Ｏｓｕ（５４６ｎｍｏｌ／ｋｇ）を、マウスに腹腔内（ＩＰ）注射した。試験物（ビヒクル、ＯＸＭおよびＰＥＧ４０−Ｏｓｕ）投与の１５分後に、またはＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ投与の１２０分後に、グルコース（１．５ｇｒ／ｋｇ）をＩＰ投与した。グルコース投与前、ならびにグルコース投与の１０、２０、３０、６０および１２０分後に、掌サイズの血糖計を用いて、尾静脈試料採取により血糖レベルを測定した。
食餌誘導性肥満症マウスモデル
試験１：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（４〜６週齢、Ｈａｒｌａｎ ＵＫ Ｌｉｍｉｔｅｄ， Ｂｉｃｅｓｔｅｒ， Ｏｘｏｎ， ＵＫ）を、到着時にポリプロピレンケージに群分けして収容した。全動物には、高脂肪餌（Ｄ１２４５１；脂肪由来熱量 ４５％；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， ＵＳＡ）および水道水をいつでも自由に飲食させた。動物を、１２時間の明暗周期（０７：００に点灯）の標準期で保持した。動物を、少なくとも６ヶ月間（平均体重が約５０ｇになるまで）、適切な餌に曝した。その後、動物をさらに２週間、ポリプロピレンケージ中に単独で収容し、逆明期に置いた（０９：３０から１７：３０まで、８時間消灯）。第２週の単独収容中、動物は１日１回の実行プロトコールおよび７日基線期間を開始した。その後、以下の表１に示すように、ビヒクルまたは試験薬をマウスに投薬した。
Figure 2014516993
体重および食餌摂取量の測定を、８日目まで毎日実施した。１２日目に、体重の最終測定を実行した。ＯＸＭおよびシブトラミンをＰＢＳ中に処方し、一方、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＳＨを１４７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭクエン酸塩緩衝液、ｐＨ６中に処方した。ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭ中のＯＸＭ含量を、塩基性加水分解により確定した。
試験２：試験１に関して記載されたように、試験２を実行した。基線期間後、表２に記載される以下の計画に従って、動物に投薬した。
Figure 2014516993
体重および食餌摂取量の測定を、１４日目まで毎日実施した。
試験３：試験１および２に関して記載されたように、試験３を実行したが、但し、実験開始時のマウスは体重が４５〜４６ｇであった。基線期間後、表３に記載するような以下の計画に従って、動物に投薬した。
Figure 2014516993
データおよび統計学的分析
ＯＸＭおよびシブトラミンをＰＢＳ中に処方し、一方、ＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭおよびＰＥＧ−ＳＨを１４７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭクエン酸塩緩衝液、ｐＨ６中に処方した。ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭおよびＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ中のＯＸＭ含量を、ＡＡＡにより確定した。
体重および食餌摂取量を、平均値±ＳＥＭで表す。体重、体重増加、１日および平均食餌摂取量データならびに累積食餌摂取量を、共変数として基線を用いてＡＮＣＯＶＡにより分析し、その後、適切な比較（両側検定）を用いて、対照群からの有意差を確定した。Ｐ＜０．０５は、統計学的に有意であるとみなされる。基線は、基線期の間の体重あるいは平均食餌または水消費量に関する１日目の値であった。
実施例１ ＰＥＧ−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭの合成および特性決定
ペプチド鎖アセンブリー全体を通してＦｍｏｃ戦略を用いた固相法により、ＯＸＭペプチドを合成した。溶液Ａ（０．１％ＴＦＡ＋Ｈ２Ｏ）およびＢ（０．１％ＴＦＡ＋ＭｅＣＮ）間の勾配を適用することにより、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２５０×３０ｍｍ）カラムを用いる分取ＨＰＬＣにより、ペプチドを精製した。ペプチド純度は９５％より高く、分子量は４４４９Ｄａ（ＭＡＬＤＩにより測定）であった。Ｆｍｏｃリンカーを介したＯＸＭペプチドとＰＥＧ４０−ＳＨとの結合を、ＮａＨＣＯ３の存在下で実施した。反応混合物を室温で２４時間撹拌し、その後、濾過して、分取ＨＰＬＣ（Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ５）により精製した。結合物分子量をＭＡＬＤＩにより分析し、ＯＸＭペプチド含量をＡＡＡにより分析した。平均ＯＸＭペプチド含量は、１８９μｇ ＯＸＭ／１ｍｇのＰＥＧ１０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ結合体１３２、４μｇ ＯＸＭ／１ｍｇ ＰＥＧ２０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ結合体、６１．７μｇ ＯＸＭ／１ｍｇ ＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ結合体および４０μｇ ＯＸＭ／１ｍｇ ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭ結合体であった。
実施例２ ネイティブＯＸＭと比較した場合のＰＥＧ１０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ、ＰＥＧ２０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭの薬物動態プロフィール
ＯＸＭと、ＰＥＧ１０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ２０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭのとの薬物動態プロフィールの比較を、雄Ｗｉｓｔａｒラットで評価した。ネイティブＯＸＭ（２７８μｇ／ｋｇ ペプチド）、ＰＥＧ１０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ（２７８μｇ／ｋｇ ペプチド含量）またはＰＥＧ２０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ（２７８μｇ／ｋｇ ペプチド含量）の単一回ＳＣ注射を、動物に投与した。指示時間間隔での化合物の血清濃度を測定した（市販ＥＬＩＳＡ、図１に示したＰＫプロフィール、および慣用的ノンコンパートメントＰＫパラメーターを、表４に要約する）。結合ＰＥＧ１０およびＰＥＧ２０の両方と結合されるＯＸＭの可逆的ペギル化は、ネイティブＯＸＭの半減期の延長を生じた（ネイティブＯＸＭ：０．１５時間；ＰＥＧ１０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ：１６．１６時間およびＰＥＧ２０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ：２７．３８時間）。ＡＵＣパラメーターにより反映されるような曝露は、ＰＥＧ１０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭに関しては約〜４５０倍、ＰＥＧ２０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭに関しては約〜２２１０倍、増大された。したがって、ＯＸＭのＰＥＧ２０への可逆的結合は、ＰＥＧ１０と比較して、より長い延長効果を生じた。Ｆｍｏｃリンカーを介してＰＥＧ４０と可逆的に結合されるＯＸＭのＰＫプロフィールをさらに決定するために、雄Ｗｉｓｔａｒラットに、ネイティブＯＸＭまたはＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ（２７８μｇ／ｋｇ ペプチド含量）をＩＶまたはＳＣ注射して、指示時点での血清濃度を分析した（市販のＥＬＩＳＡを用いて、図２に示したＰＫプロフィールおよび慣用的ノンコンパートメントＰＫパラメーターを表５に要約する）。結果は、可逆的ペギル化がＯＸＭペプチドの半減期を１００倍延長し、ＡＵＣパラメーターにより反映されるように曝露を有意に増大する、ということを示した。さらに、ネイティブペプチドの生物学的利用能は４．３７％に過ぎなかったが、一方、ＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭの投与は８４％の生物学的利用能を生じた。
表４：ラットにおけるＳＣ投与後のＯＸＭならびにＰＥＧ１０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ２０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭのノンコンパートメントＰＫパラメーター
Figure 2014516993
表５：ラットにおけるＩＶまたはＳＣ投与後のＯＸＭおよびＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭのＰＫパラメーター
Figure 2014516993
実施例３ ＯＸＭおよび可逆的ペギル化ＯＸＭによるｃＡＭＰの誘導
ＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ（非可逆的ペギル化ＯＸＭ）と比較した場合のＯＸＭのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を評価するために、ＧＬＰ−１受容体を過剰発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、漸増濃度の異なる化合物とともにインキュベートし、その後、ｃＡＭＰを定量した。ネイティブＯＸＭは、ＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ（比較可能なｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を有した）と比較して、改善された活性を実証した（ＯＸＭ、ＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭおよびＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭに関するＥＣ５０は、それぞれ２．５３×１０−９、２．０７×１０−６および５．８７×１０−７であった。図３）。ＯＸＭペギル化は、ＯＸＭにより誘導されるＧＬＰ−１受容体活性化を阻止したわけではなかった、ということは重要である。さらに、血清中のＯＸＭのインキュベーションは活性低減を生じたが、これはおそらくはペプチドの部分的タンパク質分解のためであって、ラット血清の存在下および非存在下で、匹敵する活性が、ＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭおよびＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭに関して得られたが、これは、ペギル化がＯＸＭ上の潜在的タンパク質分解部位を遮蔽する、ということを示唆している。
実施例４ 可逆的ペギル化長時間作用型ＯＸＭがグルコース耐容性を誘導
ＯＸＭまたはＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭのｉｎ ｖｉｖｏ活性を評価するために、ＩＰＧＴＴモデルを適用した。一晩絶食Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＯＸＭペプチドまたはＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭをＩＰ注射し、その後、グルコースをＩＰ注射して、血糖計により尾静脈からの血糖レベルを測定した。ＯＸＭ（３３３ｎｍｏｌ／ｋｇ）、ＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ（非可逆的ペギル化ＯＸＭ、３３３ｎｍｏｌ／体重１ｋｇ ペプチド含量）およびＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ（２０２ｎｍｏｌ／体重１ｋｇ ペプチド含量）を、グルコースＩＰ注射（１．５ｇｒ／ｋｇ）の１５分前（ＯＸＭおよびＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ）または２時間前（ＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭ）にＩＰ投与した。グルコース耐容性の誘導を、ビヒクル群と比較した。ＰＥＧ４０の作用に対する対照として、ＰＥＧ４０−Ｏｓｕ（５４６ｎｍｏｌ／ｋｇ）を対照群に投与した。ＯＸＭペプチドは、ビヒクル群と比較して、グルコース耐容性に及ぼす作用が小さかったが、より低いＯＸＭモル含量を有するＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭの投与は、グルコース耐容性誘導を生じた（図４）。意外にも、非可逆的ペギル化の投与はグルコース耐容性の誘導を生じたが、これは、ペギル化ＯＸＭがｉｎ ｖｉｖｏで薬理学的に活性であることを示唆している。
実施例５ 可逆的ペギル化長時間作用型ＯＸＭがＤＩＯマウスで体重を低減させ、食餌摂取量を抑制
ネイティブＯＸＭおよび可逆的ペギル化ＯＸＭのＳＣ注射後のＤＩＯマウスにおいて、ＯＸＭの薬理学的活性をさらに評価した。試験１において、雄ＤＩＯマウス（ｎ＝１０／群）に、５０００ｎｍｏｌ／体重１ｋｇのＯＸＭを１日２回、または５０００ｎｍｏｌ／体重１ｋｇのＯＸＭを含有するＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭを、投薬の７日間、１日おきに投与した。体重および食餌摂取量を８日間毎日測定し、１２日目に最終体重測定した。ＯＸＭの１日２回注射は、体重の中等度の減少（ビヒクル対照群と比較して、８日目に６％の体重減少）および食餌摂取量の統計学的に有意の抑制を生じた。他方で、用量当たり同一のＯＸＭペプチド含量を有するが、１日おきに注射したＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭの投与は、顕著な体重減少を生じ（ＰＥＧ−ＳＨ対照群と比較して、８日目に２４％の体重減少）、食餌摂取量の実質的抑制を示した（図４）。陽性対照として用いられる神経伝達物質再取込み阻害剤であるシブトラミンは、体重を１５．６％低減した。注：ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭ群における体重の低減は、最終投与の５日後である１２日目の最終測定まで一貫していたが、これは、可逆的ペギル化ＯＸＭの長期持続性作用を示している（図５）。
ＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭはＩＰＧＴＴモデルにおいてグルコース耐容性を誘導するため、体重および食餌摂取量の状況において非可逆的ペギル化ＯＸＭと可逆的ペギル化ＯＸＭの効力を比較することが重要であった。その結果、この問題に対処するために追跡調査試験を計画した（材料および方法における試験２）。５０００ｎｍｏｌ／体重１ｋｇのＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭの３日毎の投与（合計３回の注射）は体重の実質的低減を生じた一方、同一頻度での５０００ｎｍｏｌ／体重１ｋｇのＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭの注射は体重に及ぼす影響はごくわずかであった。際立っていたのは、８０００ｎｍｏｌ／体重１ｋｇのＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭの１日目の単一回注射は、６日間明らかな体重低減を生じたことである。意外にも、５０００ｎｍｏｌ／体重１ｋｇのＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭの投与は、体重の低減増大を生じたが、これは、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭに比して改善された効力を示している（図６）。
ＯＸＭは、過剰体重および肥満健常対象においてネイティブＯＸＭにより得られる体重減少により実証されるように、代謝障害、例えば糖尿病および肥満症の処置のための強力なペプチドである（Ｗｙｎｎｅ ｅｔ ａｌ， ２００５）。さらに、ペプチドの短い半減期およびそのｉｎ ｖｉｖｏでの低安定性のため、ヒトにおいて薬理学的効果を達成するためには、生理学的用量を越える用量の反復毎日投与が必要とされる。本特許は、作用ＯＸＭを可逆的にペギル化し、したがって長期作用性にさせることにより、生理学的条件においてＯＸＭを安定化するための有効な手段を提供する。予期せぬことに、修飾ＯＸＭ−ペギル化バージョンは活性であり、単なるプロドラッグではない。
可逆的ペギル化ＯＸＭは、ネイティブＯＸＭと比較して、曝露における実質的増大および半減期延長を有するラットにおいて、優れた薬物動態プロフィールを実証した。ＯＸＭと可逆的に結合された種々の分子量を有するＰＥＧの、ＯＸＭ−ＰＫプロフィールに及ぼす作用を比較した場合、ＰＥＧ４０−結合体は、ＰＥＧ１０またはＰＥＧ２０と比較して、優れた延長作用を実証した。したがって、薬理学的試験でＰＥＧ４０をさらに評価した（図１および２）。ＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭのＳＣ投与後、ＯＸＭの生物学的利用能は４．３７％から８４．６％に有意に増大され、可逆的ペギル化ペプチドの曝露増大に寄与した、ということは重要である（表２）。一晩絶食Ｃ５７ＢＬ／６マウスＩＰＧＴＴモデルで評価した場合、ＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭは、ネイティブＯＸＭと比較して、グルコース耐容性を改善した。このモデルにおいて、ＰＥＧ４０と結合された非可逆的ペギル化ＯＸＭ（ＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ）は、ＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭに匹敵するグルコース耐容性誘導活性を実証した。この結果は、ＯＸＭの慣用的ペギル化がＯＸＭとその受容体との結合を完全に無効にするわけではなく、その結果、生物学的活性の全体的損失を生じないＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭおよびＰＥＧ４０−Ｆｍｏｃ−ＯＸＭに関して観察されたｉｎ ｖｉｔｒｏ活性（立体障害のためにペギル化ペプチドに関して観察される現象）によりさらに支持される（図３および４）。
次に、ネイティブＯＸＭと比較した場合の、体重および食餌摂取量に及ぼすＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭの作用を、ＤＩＯマウスにおいて評価した。１日２回投与される５０００ｎｍｏｌ／ｋｇのネイティブＯＸＭのＳＣ注射は、７日の投薬後、体重および食餌摂取量における中等度の低減を生じた。これに対比して、５０００ｎｍｏｌ／ｋｇのＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭの１日おきの注射は、８日目に対照と比較して、体重および食餌摂取量の両方の顕著な低減を生じた（それぞれＯＸＭおよびＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭに関する体重の６％および２４．９％低減、図５）。要するに、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭは、抗肥満作用延長および効力改善を示したが、これは、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭに関する試験中に投与されるＯＸＭの累積用量が、ネイティブＯＸＭを投与される群と比較してほぼ４倍少なかったことを考慮している。
非可逆的ペギル化ＯＸＭ、ＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭは、ＩＰＧＴＴ試験においてグルコース耐容性を改善することが示された。したがって、ＤＩＯモデルにおいて、可逆的ペギル化ＯＸＭおよびネイティブＯＸＭと比較した場合の慣用的ペギル化の食餌調節活性を評価することは絶対必要であった。５０００ｎｍｏｌ／ｋｇのＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭの３日毎の投与は、体重のごくわずかな低減を生じたが、しかし食餌摂取量の抑制は、投薬後３日まで明らかであった（図６）。食餌摂取量の中等度の抑制は、おそらくは、消化管におけるＯＸＭの直接活性に起因するものであり、ＩＰＧＴＴモデルで観察される末梢活性と相関する。ＯＸＭ食餌調節活性は血液脳関門の横断およびＡＲＣにおけるニューロン上の受容体との結合を包含するので、ＣＮＳに浸透するＯＸＭの能力が無効にされないことは絶対に必要である。ＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭの観察された末梢生物活性は、ＤＩＯマウス体重を低減するこの化合物の能力と対比した場合、ＰＥＧ部分との共有結合が、ＢＢＢを通過して、視床下部におけるＯＸＭの潜在的作用部位であるＡＲＣに向かうＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭの能力を制限する、ということを示唆している。これに対比して、同一頻度での５０００ｎｍｏｌ／ｋｇのＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭの注射は、１２日目に測定した場合、顕著に体重を低減し、食餌摂取量を２０％抑制した。際立っていたのは、８０００ｎｍｏｌ／ｋｇ ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭの週１回の注射が同様の体重低減（２０％）を生じたことで、これは、ヒトにおいて、可逆的ペギル化ＯＸＭの週１回注射により、またはそれより低い投薬回数でも、有意の体重減少が達成され得る、ということを示している。
可逆的ペギル化戦略は、当該薬剤の延長作用を保持しながら、慣用的ペギル化においてしばしば観察される活性の損失を克服することを目指している。ペギル化プロドラッグ生体活性が劇的に失われる場合、あるいは無効にされる場合でも、可逆的ペギル化を適用するに際しての利点は、以前に立証済みである（米国特許第７５８５８３７号）。さらに、その生物学的活性を保持する共有的非可逆的ペギル化薬剤と比較した場合、可逆的ペギル化プロドラッグの効力が何であるかは不明である。結合体からのペプチドの緩徐放出のため、結合体血中濃度を評価すると、結合共有的ペギル化ペプチドのＰＫプロフィールは、可逆的ペギル化ペプチドと比較して優れていると予測されるので、これは問題とされる。ＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ならびにｉｎ ｖｉｖｏでのＩＰＧＴＴモデルにおいて、活性であることが示された。したがって、この分子は、さらにまた、マウスへのＳＣ投与後、満腹を誘導し、体重を低減する、ということが考えられた。しかしながら、ＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭはＤＩＯマウスにおける体重を低減できないが、一方、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭは顕著な効果を有したので、これは正しくないことが示された。従来の出版物は、ＯＸＭの末梢活性およびＯＸＭのＣＮＳ活性の関与という矛盾するデータを提示している。他方で、腹腔なＯＸＭの食欲減退作用は、ＧＬＰ−１ＲのＡＲＣ内投与前のエキセンジン９?３９により遮断されたが、これは、ＯＸＭのＣＮＳ関連活性の重要性を示している（Ｄａｋｉｎ ｅｔ ａｌ ２００４）。さらに、ＯＸＭを発現するビフィズス菌の過剰体重マウスへの経口送達は体重の低減を生じる一方、ＯＸＭはこのマウスの血漿中には検出されなかったが、これは、胃腸細胞の直接活性化がＯＸＭの体重減少活性のために重要であることを示唆している（Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ， ２０１０）。上記のように、ＯＸＭの作用方式およびペギル化の影響に関する情報の欠如のため、ネイティブＯＸＭおよび共有結合ペギル化ＯＸＭと比較した場合、可逆的ペギル化ＯＸＭの効力が難であるかを予測できない。
試験２で示したようなＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭと比較した場合のＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭの優れた効力は、意外であった。ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭのＰＫプロフィールは評価されなかったが、しかしＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭ ＰＫプロフィールは、ＰＥＧ１０−ＦＭＳ−ＯＸＭおよびＰＥＧ２０−ＦＭＳ−ＯＸＭより明らかに優れていた。ＰＥＧ３０の使用は好ましいＰＥＧサイズを提示する一方で、結合ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭの腎クリアランスを有意に低減するが、その薬理学的活性を引き出すために必要とされるＯＸＭの持続的存在を可能にする結合体からのＯＸＭ加水分解速度を助長することができる。
試験３
この試験では、ＯＸＭと種々のサイズのＰＥＧとの結合体を評価した。以前の試験で示されたように、ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭおよびＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭの週１回の投与は、体重に顕著な作用を及ぼした。意外にも、ＰＥＧ５−ＦＭＳ−ＯＸＭは、ビヒクル群と比較して体重減少を誘導する能力を完全に失ったが、一方、ＰＥＧ６０−ＦＭＳ−ＯＸＭは、ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭよりさらに顕著な低減を誘導した。この試験におけるＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭおよびＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭ間の体重減少の差は実験変動性範囲であって、有意ではなかった。
実施例６ 可逆的ペギル化ＯＸＭで処理される肥満マウスにおける血糖症および脂肪血症改善
材料および方法
食餌誘導性肥満症（ＤＩＯ）マウスモデルに関する実験手順：
ＤＩＯモデルを、ＲｅｎａＳｃｉ Ｌｔｄ Ｃｏｍｐａｎｙ （Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ， ＵＫ）で実行した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（４〜６週齢、Ｈａｒｌａｎ ＵＫ Ｌｉｍｉｔｅｄ， Ｂｉｃｅｓｔｅｒ， Ｏｘｏｎ， ＵＫ）を高脂肪食餌（Ｄ１２４５１；脂肪由来熱量の４５％；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， ＵＳＡ）に、少なくとも６ヶ月間（平均体重が約５０ｇになるまで）曝露した。薬剤投与の２週間前に、動物を単独収容して、逆相照明上に置いた（０９：３０〜１７：３０の間８時間消灯）。単独収容の第１週の間（調教期間）、動物は１日１回調教プロトコールを開始し、第２週の間（基線期）、適切なビヒクルを用いて１日２回、または週１回（処置期間中に皮下経路により投薬される場合）、動物に投薬した。７群（ｎ＝８）のＤＩＯマウスに、２９日間、以下のように投薬した。
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基線および処置期間中、食餌摂取量、水分摂取および体重を毎日記録した。２週間基線後１日目および２２日目に、全マウスを一晩絶食させた。２および２３日目に、マウスに経口グルコース耐容性試験（ＯＧＴＴ）を施した。各動物にビヒクルまたは試験化合物を投薬し、６０分後、Ｄ−グルコース（２ｇ／ｋｇ、経口）を投薬した。ビヒクルまたは試験化合物の投薬直前（Ｂ１）ならびにグルコース負荷直前（Ｂ２）に、基線血液試料を採取した。さらに、グルコース投与後、１０、２０、３０、４５、６０および１２０分に、血液試料を採取した。血液試料（約２０μｌ）はすべて、尾静脈から採取した。血漿試料を調製し、それぞれＴｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｙグルコース試薬（ＴＲ１５４２１）およびＡｌｐｃｏマウス超感受性インスリンＥＬＩＳＡ（８０−ＩＮＳＭＳＵ−Ｅ１０）を用いて、グルコース（ｎ＝２）およびインスリン（ｎ＝１）に関して検定した。３０日目に、心臓穿刺により終末血漿試料を収集し（２９日目の最終投薬の２４時間後）、マウス超感受性インスリンＥＬＩＳＡ（８０−ＩＮＳＭＳＵ−Ｅ１０）、Ｔｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｙグルコース試薬（ＴＲ１５４２１）、Ｔｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｙコレステロール試薬（ＴＲ１３４２１）およびＳｉｇｍａトリグリセリドキット（ＴＲ０１００）を用いて、インスリン、グルコース、コレステロールおよびトリグリセリドに関して検定した。終末血液試料採取後に最終死骸重量を記録し、死骸を−２０℃で冷凍した。
身体組成試験に関する実験手順：
標準化学分析技法を用いて、死骸の体脂肪、タンパク質、水分および灰分レベルを確定した。他の構成成分（主に炭水化物）は全身体組成の２％未満を構成するため、脂肪、タンパク質、水分および灰分含量のみを測定した。マウス死骸を凍結乾燥して、重量を一定にすることにより、死骸水分を確定した。次に、乾燥死骸を、その後の分析の準備のために実験室粉砕機で粉砕した。メーカー推奨プロトコールに従って、Ｔｅｃａｔｏｒ Ｓｏｘｔｅｃ ２０５０系（Ｆｏｓｓ ＵＫ Ｌｔｄ， Ｗｈｅｌｄｒａｋｅ， ＵＫ）とともに修正Ｓｏｘｈｌｅｔ抽出プロトコール（石油エーテル、４０〜６０℃）を用いて、凍結乾燥試料で死骸脂肪を確定した。Ｔｅｃａｔｏｒ ２０１２消化ブロックおよび２２００蒸留ユニット（Ｆｏｓｓ ＵＫ Ｌｔｄ）を用いて、凍結乾燥試料に関するミクロ−Ｋｊｅｌｄａｈｌ手法を用いて、死骸タンパク質を確定した。残りの死骸灰分は、マッフル灰化炉を用いて、高温で凍結乾燥試料を燃焼することにより確定した。
データおよび統計学的分析
体重、食餌摂取量および水分摂取量を、平均値±ＳＥＭで表す。体重、体重増加、１日および平均食餌および水分摂取量データならびに累積食餌摂取量を、共変数として基線を用いてＡＮＣＯＶＡにより分析し、その後、適切な比較（両側検定）を用いて、対照群からの有意差を確定した。Ｐ＜０．０５は、統計学的に有意であるとみなされる。基線は、基線期の間の体重あるいは平均食餌または水分消費量に関する１日目の値であった。
終末血漿インスリン、コレステロールおよびトリグリセリドを、一因子としての処置、ならびに共変数として採血順および基線体重を用いて一般線形モデルにより分析し、その後、適切な比較（両側検定）を用いて、関連ビヒクル群からの有意差を確定した。対数変換および／またはロバスト回帰技法を、適宜用いた。
各身体組成物パラメーター（脂肪、タンパク質、水分および灰分）に関するデータを、ｇ／死骸および全体の％として示した。最終死骸重量も、直接比較として分析した。一因子としての処置、ならびに共変数としての基線での体重を用いてロバスト回帰により分析を実行し、その後、適切な多数の比較試験（両側検定）で各処置群の作用を関連ビヒクル群と比較した。
結果
３０日の期間中の可逆的ＰＥＧ３０（ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭ（６，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ；クエン酸塩緩衝液））または可逆的ＰＥＧ４０（ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭ（６，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ；クエン酸塩緩衝液））の毎週注射は、ネイティブオキシントモジュリンを用いて１日２回注射した群に関する１７％の体重減少と比較して、それぞれ２８％および２３％の体重減少を提供した（図７）が、一方、可逆的ＰＥＧ３０とともに注射した正味オキシントモジュリンの累積投薬は、３０日の期間中、８．６％に過ぎなかった。非可逆的ペギル化ＯＸＭ（ＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭおよびＰＥＧ３０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ）は、体重低減に際してさらに低い作用を示した。
可逆的ペギル化ＯＸＭ（ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭまたはＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭ）を毎週注射した後のＤＩＯマウスにおけるグルコース耐容性は、２日目（図８Ａ）および２３日目（図８Ｂ）のネイティブオキシントモジュリンの１日２回の注射により引き出されたグルコース耐容性に匹敵した。
さらに、可逆的ペギル化ＯＸＭの週１回投与は、ＤＩＯマウスにおける血糖症および脂肪血症プロフィールを改善し、終末グルコースの低減（図９Ａ）、終末インスリンの低減（図９Ｂ）、終末コレステロールの低減（図９Ｃ）および終末グリセロールの低減（図９Ｄ）により実証された。
最後に、ＤＩＯマウスの身体組成物分析は、可逆的ペギル化ＯＸＭで処置したマウスにより実証される体重減少が脂肪における特異的低減に起因することを実証した（図１０）。
要するに、逆ペギル化は、異なる毒物学的齧歯類動物モデルにおいて安全で且つ耐容可能であることが示された。逆ペギル化は、標的組織に浸透する（例えば、ＢＢＢに浸透する）その能力を保持しながら、ＯＸＭ半減期の延長も可能にする。
可逆的ペギル化ＯＸＭは、優れた長時間作用特性を実証し、ヒトにおける週１回注射を支持する。可逆的ペギル化ＯＸＭは、脂肪における特異的低減により体重を低減した（身体組成物評価）。可逆的ペギル化ＯＸＭは、血糖症および脂肪血症プロフィールを改善した。可逆的ペギル化ＯＸＭは、血糖活性および脂肪減少に及ぼすその印象的作用により、肥満症およびＩＩ型糖尿病患者のための長期療法を提供すると予測される。
実施例７ グルコースレベルおよびインスリン分泌に及ぼす可逆的ペギル化ＯＸＭの作用
食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）マウスモデルに関する実験手順：
ＤＩＯモデルを、ＲｅｎａＳｃｉ Ｌｔｄ Ｃｏｍｐａｎｙ （Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ， ＵＫ）で実行した。５７ＢＬ／６Ｊマウス（４〜６週齢、Ｈａｒｌａｎ ＵＫ Ｌｉｍｉｔｅｄ， Ｂｉｃｅｓｔｅｒ， Ｏｘｏｎ， ＵＫ）を高脂肪食餌（Ｄ１２４５１；脂肪由来熱量の４５％；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， ＵＳＡ）に、少なくとも６ヶ月間（平均体重が約５０ｇになるまで）曝露した。薬剤投与の２週間前に、動物を単独収容して、そこで動物は順化期を開始した。第１週目（調教期間）に、動物は１日１回調教プロトコールを開始し、第２週の間（基線期）、適切なビヒクルを用いて（１日２回、または週１回、処置期間の間）、皮下経路により投薬した。基線および処置期間中、食餌摂取量、水分摂取および体重を毎日記録した。１日目の午前中にマウスに投薬し、その後、一晩絶食させた。２日目（投与後２４時間）（群Ａ〜Ｅ）に、または午前中投薬の前（群Ｆ〜Ｈ）に、絶食中グルコースおよび絶食中インスリンに関してマウスを試料採取した。血液試料（２０μｌ）はすべて、尾静脈から採取した。血漿試料を調製し、それぞれＴｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｙグルコース試薬（ＴＲ１５４２１）およびＡｌｐｃｏマウス超感受性インスリンＥＬＩＳＡ（８０−ＩＮＳＭＳＵ−Ｅ１０）を用いて、グルコース（ｎ＝２）およびインスリン（ｎ＝１）に関して検定した。
結果
この実験組において、２つの独立したｉｎ ｖｉｖｏ試験を実行した。第一の実験は、以下のように２日間投薬されたＤＩマウスの８群（ｎ＝８）を含んでいた。
Figure 2014516993
第２の実験は、以下のように２日間投薬されたＤＩＯマウスの７群（ｎ＝７）を含んでいた。
Figure 2014516993
両試験において、ＰＥＧ−ＯＸＭ変異体：ＰＥＧ４０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ、ＰＥＧ３０−ＥＭＣＳ−ＯＸＭ、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭ、ＰＥＧ３０−ＦＭＳ−ＯＸＭ（実験１）またはＰＥＧ３０-ＦＭＳ−ＯＸＭ、ＰＥＧ４０−ＦＭＳ−ＯＸＭおよびＰＥＧ６０-ＦＭＳ-ＯＸＭ（実験２）すべての単一投薬は、ビヒクルと比較した場合、絶食中グルコースの顕著な且つ有意の低減を生じた（図１１および１２）。実験１において、ビヒクル群（ＰＥＧ４０−ＳＨ）は、９．５ｍＭのグルコースレベルを示すが、一方、ＰＥＧ−ＯＸＭ処置群は、５．１８〜５．８ｍＭのグルコースレベルを示す。実験２において、ＰＥＧ−ＯＸＭ処置群に関してもグルコースレベルの同一低減が得られた（ＰＥＧ５−ＯＸＭ群を除く）が、これは、ビヒクル群の１１．９ｍＭからＰＥＧ−ＯＸＭ処置群の５〜５．７ｍＭへのグルコースの低減を示した。この作用は、図１１に示したような、ビヒクル群の２．８ｎｇ／ｍｌからＰＥＧ−ＯＸＭ処置群の１．４〜１．９ｎｇ／ｍｌへの、実施例１における絶食時血漿インスリンレベルの低減と関連づけられた。実験２では、絶食時インスリンレベルは０．９９ｎｇ／ｍｌであったが、一方、ＰＥＧ−ＯＸＭ（ＰＥＧ５−ＯＸＭを除く）の絶食時インスリンレベルは、０．７８〜０．９１ｎｇ／ｍｌであった。
両実験におけるリラグルチドは、ビヒクル（ＰＢＳ）と比較して、絶食中グルコースを有意に低減した；ビヒクルの９．３ｍＭは、実験１では６．０６ｍＭに減少され、ビヒクルの１１．５ｍＭは、実験２では６．７ｍＭに減少された。グルコースのこの低減と合わせて、この処置群は、実験１ではビヒクルの２．５ｎｇ／ｍｌから４．４ｎｇ／ｍｌへの、そして実験２では１．９８ｎｇ／ｍｌから３ｎｇ／ｍｌへの、血漿インスリンの有意の増大を示した。ＯＸＭネイティブペプチドを実験１で分析したが、おそらくはその短い血清半減期および非常に迅速な身体からのクリアランスのために、ビヒクルと比較して、グルコースおよびインスリンレベルにおける如何なる有意差も示さなかった。
ＤＩＯマウスにおけるこれら２つの独立した実験からの結果は、ＰＥＧ−ＯＸＭ化合物はグルコースレベルの有意の低減を誘導するが、しかしリラグルチド投与後に観察されたような、そしてＯＸＭネイティブペプチドに関して示された以前のデータから予測されるような、インスリンレベルの増大を伴わない、ということを明示している。グルコースレベルのこの予期せぬ低減は、絶食時インスリンレベルの低減と合わせて、単回用量のＰＥＧ−ＯＸＭは、短期曝露後直ぐにインスリンに対する動物の感受性を増大させ、長期処置のためではない、ということを示している。
本発明のいくつかの特徴を本明細書中で例証し、記載してきたが、多数の修正、置換、変更および等価物を当業者は想到できるであろう。したがって、本発明の真の趣旨を逸脱しない限り、このような修正および変更はすべて、添付の特許請求の範囲が包含するよう意図されることが理解されるべきである。

Claims (39)

  1. 組成物であって、
    オキシントモジュリンと、
    ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）と、
    ９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）とを含んでなる組成物。
  2. 前記ＰＥＧポリマーが、前記オキシントモジュリンのアミノ末端またはリシン残基に、ＦｍｏｃまたはＦＭＳを介して結合されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
  3. 前記オキシントモジュリンが、配列番号１で記述されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
  4. 前記ＰＥＧポリマーが、スルフヒドリル部分を有するＰＥＧポリマーであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
  5. 前記ＰＥＧポリマーが、ＰＥＧ３０、ＰＥＧ４０またはＰＥＧ６０であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
  6. 請求項１に記載の組成物および薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物。
  7. オキシントモジュリンの生物学的半減期を延長するための方法であって、
    オキシントモジュリンと、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）と、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）とを、約１：１：０．５〜約１：１：３．５のモル比で結合させるステップを含む方法。
  8. 前期オキシントモジュリンが、配列番号１のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項７に記載の方法。
  9. 前記ＰＥＧポリマーが、前記オキシントモジュリンのアミノ末端またはリシン残基に、ＦｍｏｃまたはＦＭＳを介して結合されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
  10. 前記ＰＥＧポリマーが、スルフヒドリル部分を有するＰＥＧポリマーであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
  11. 前記ＰＥＧポリマーが、ＰＥＧ３０、ＰＥＧ４０またはＰＥＧ６０であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
  12. 対象のグルコース耐容性、血糖制御またはその両方を誘導する方法であって、
    有効量の請求項１に記載の組成物および薬学的に許容可能な担体を、前記対象に対して投与するステップを含む方法。
  13. 前記オキシントモジュリンが、配列番号１のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  14. 前記ＰＥＧポリマーが、前記オキシントモジュリンのアミノ末端またはリシン残基に、ＦｍｏｃまたはＦＭＳを介して結合されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  15. 前記ＰＥＧポリマーが、スルフヒドリル部分を有するＰＥＧポリマーであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  16. 前記ＰＥＧポリマーが、ＰＥＧ３０、ＰＥＧ４０またはＰＥＧ６０であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  17. オキシントモジュリンの曲線下面積（ＡＵＣ）の改善方法であって、
    ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）を、前記オキシントモジュリンのアミノ末端に、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を介して結合させるステップを含む方法。
  18. 前記オキシントモジュリンが、配列番号１のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ＰＥＧポリマーが、前記オキシントモジュリンのアミノ末端またはリシン残基に、ＦｍｏｃまたはＦＭＳを介して結合されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
  20. 前記ＰＥＧポリマーが、スルフヒドリル部分を有するＰＥＧポリマーであることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
  21. 前記ＰＥＧポリマーが、ＰＥＧ３０、ＰＥＧ４０またはＰＥＧ６０であることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
  22. オキシントモジュリンの投薬回数を減らすための方法であって、
    ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）を、前記オキシントモジュリンのアミノ末端に、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）を介して結合させるステップを含む方法。
  23. 前記オキシントモジュリンが、配列番号１のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
  24. 前記ＰＥＧポリマーが、前記オキシントモジュリンのアミノ末端またはリシン残基に、ＦｍｏｃまたはＦＭＳを介して結合されることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
  25. 前記ＰＥＧポリマーが、スルフヒドリル部分を有するＰＥＧポリマーであることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
  26. 前記ＰＥＧポリマーが、ＰＥＧ３０、ＰＥＧ４０またはＰＥＧ６０であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
  27. 対象における食物摂取を低減するための、体重を低減するための、またはその両方のための方法であって、
    フレキシブルリンカーを介してポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）に結合されたオキシントモジュリンを、前記対象に対して投与するステップを含み、
    前記フレキシブルリンカーが、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）である方法。
  28. 前記オキシントモジュリンが、配列番号１のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
  29. 前記ＰＥＧポリマーが、前記オキシントモジュリンのアミノ末端またはリシン残基に、ＦｍｏｃまたはＦＭＳを介して結合されることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
  30. 前記ＰＥＧポリマーが、スルフヒドリル部分を有するＰＥＧポリマーであることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
  31. 前記ＰＥＧポリマーが、ＰＥＧ３０、ＰＥＧ４０またはＰＥＧ６０であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
  32. 対象におけるインスリン感受性を増大させる方法であって、
    ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）に結合されたオキシントモジュリンを含む有効量の組成物を、前記対象に対して投与するステップを含む方法。
  33. 前記ＰＥＧポリマーが、ＰＥＧ３０、ＰＥＧ４０またはＰＥＧ６０であることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
  34. 前記オキシントモジュリンが、前記ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧポリマー）に、リンカーを介して結合されることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
  35. 前記リンカーが、開裂可能なフレキシブルリンカーであることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
  36. 前記リンカーが、非開裂可能リンカーであることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
  37. 前記フレキシブルリンカーが、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）または２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）であることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
  38. 前記リンカーが、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）であることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
  39. 前記組成物の投与により、前記対象におけるインスリン感受性の急速な増大を生じさせるようにしたことを特徴とする請求項３２に記載の方法。
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