KR20140053873A - 마우스 항Ａｇｇｒｕｓ 모노클로날 항체 - Google Patents

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Abstract

본원 발명은, 서열번호 1, 3 또는 4에 의해 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 Aggrus의 에피토프를 인식하는, 마우스 모노클로날 항체 또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트, 수탁번호 FERM BP-11446, FERM BP-11447, FERM BP-11448 또는 FERM BP-11449의 하이브리도마에 의해 산생되는 모노클로날 항체 또는 그 기능적 단편을 제공한다. 본 발명은, 상기 하이브리도마를 제공하고, 또 상기 모노클로날 항체 또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트를 포함하는 Aggrus-CLEC-2 결합 저해제, 및 혈소판 응집 억제 또는 암 전이 억제, 혹은 종양 또는 혈전증의 처치를 위한 의약 조성물을 제공한다.

Description

마우스 항Ａｇｇｒｕｓ 모노클로날 항체{ANTI-MOUSE AGGRUS MONOCLONAL ANTIBODY}
본원 발명은, 마우스 항Aggrus 모노클로날 항체에 관한 것이다.
혈소판 응집유도 인자 Aggrus(포도플라닌(podoplanin), gp44 등으로도 알려짐)는, I형 막관통 단백질이며, 편평상피암, 중피종, 카포시육종, 정소종양 및 뇌종양과 같은 다양한 타입의 암에서 발현 증가하고 있음이 나타나 있다(비특허문헌 1∼9). Aggrus의 과잉 발현은 예후 불량에 관계한다는 보고가 있으며, 암 진행에 대한 Aggrus의 중요한 관여가 시사되어 있다(비특허문헌 10, 11). Aggrus의 발현이 혈소판 응집을 일으키고, 마우스에 있어서의 실험적인, 그리고 자발적인 폐 전이를 촉진함이 알려져 있다(비특허문헌 11, 12). 혈소판 응집을 억제하는 점돌연변이를 도입하면, 폐 전이의 형성은 감약(減弱)하므로, Aggrus의 혈소판 응집유도 활성은 전이 형성에 직접 관계하고 있다고 생각되고 있다(비특허문헌 11, 12). 암세포유도혈소판 응집은, 큰 암-혈소판 응집을 형성하며, 미소혈관계에서의 암세포의 색전 형성 증대, 순환에서의 면역학적 공격으로부터의 보호에 이른다고 생각되고 있다. 최근, 혈소판 상에 발현하여 있는 C형 렉틴 유사 수용체(CLEC-2)가, Aggrus의 카운터파트 수용체의 하나로서 특정되었다. 종양세포 상에서 발현하여 있는 Aggrus에 CLEC-2가 결합하면, 혈장 성분이 없어도 혈소판에서 활성화 시그널이 나와, 혈소판 응집의 방아쇠로 됨이 알려져 있다. 상호인식에 결정적인 Aggrus 및 CLEC-2의 도메인은, 이미 알려져 있다(비특허문헌 13).
모노클로날 항체는, 세포표면 항원에 확실히 특이적으로 결합할 수 있고, 표적 세포에 면역학적 응답을 일으킬 수 있다. 따라서, 현재, 많은 모노클로날 항체가 암치료에 사용되고 있다. 암치료에서 사용되는 모노클로날 항체는, 중화, 항체의존성 세포 상해활성(antibody-dependent cellular cytotoxicity; ADCC) 및 보체의존성 세포 상해활성(complement-dependent cytotoxicity; CDC)의 세가지의 대표적인 작용양식을 통하여 항암효과를 나타낸다. 베바시주맙(Bevacizumab)이나 세툭시맙(Cetuximab)으로 대표되는 바와 같이, 항체는 리간드-수용체 결합 또는 수용체 다량체화를 저해하고, 시그널 경로의 활성화를 중화할 수 있다. 암세포의 증식은 시그널 경로의 활성화에 의존하고 있으므로, 그 중화에 의해 세포사에 이른다. 한편, 리툭시맙(Rituximab)이나 트라스투즈맙(Trastuzumab)으로 대표되는 바와 같이, 항체는 그 Fc도메인을 통하여 표적 암세포에 대한 면역응답을 유도할 수 있다. 매크로파지(macrophage), NK세포 및 호중구(好中球) 등의 이펙터 세포와 보체는, 암특이적 항원에 결합하는 항체의 Fc도메인를 인식하여, 그 결과, 표적 암세포를 죽인다. 이들의 세가지 작용양식은, 항체의 아이소타입이나 서브클래스, 항원의 특징이나 인식되는 부위에 의해 규정된다.
지금까지, Aggrus에 대한 많은 항체가 확립되어 왔지만, 그 대부분은 Aggrus-CLEC-2의 상호작용을 간섭할 수 없는 것이었다. NZ-1로 명명된 래트(rat) 항체는, Aggrus-CLEC-2의 상호작용 및 혈소판 응집을 저해할 수 있는 Aggrus 항체로서 알려져 있지만(비특허문헌 14), 종의 배리어 때문에 일반적으로 사용되는 마우스의 암모델에서는 정확하게 조사할 수 없는 등의 문제점이 있었다.
Kato Y, Kaneko M, Sata M, Fujita N, Tsuruo T, Osawa M. Enhanced expression of Aggrus (T1α/podoplanin), a platelet-aggregation-inducing factor in lung squamous cell carcinoma. Tumor Biol 2005; 26: 195-200. Martin-Villar E, Scholl FG, Gamallo C et al. Characterization of human PA2.26 antigen (T1α-2, podoplanin), a small membrane mucin induced in oral squamous cell carcinomas. Int J Cancer 2005; 113: 899-910. Yuan P, Tenam S, EI-Naggar A et al. Overexpression of podoplanin in oral cancer and its association with poor clinical outcome. Cancer 2006; 107: 563-569. Wicki A. Lehembre F, Wick N, Hantusch B, Kerjaschki D, Christofori G. Tumor invasion in the absence of epithelial-mesenchymal transition: podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton. Cancer Cell 2006; 9: 261-272. Kimura N, Kimura I. Podoplanin as a marker for mesothelioma. Pathol Int 2005; 55: 83-86. Fukunaga M. Expression of D2-40 in lymphatic endothelium of normal tissues and in vascular tumours. Histopathology 2005; 46: 396-402. Kato Y, Sasagawa I, Kaneko M, Osawa M, Fujita N, Tsuruo T. Aggrus: a diagnostic marker that distinguishes seminoma from embryonal carcinoma in testicular germ cell tumors. Oncogene 2004; 23: 8552-8556. Mishima K, Kato Y, Kaneko MK et al. Podoplanin expression in primary central nervous system germ cell tumors: a useful histological marker for the diagnosis of germinoma. Acta Neuropathol 2006; 111: 563-568. Mishima K, Kato Y, Kaneko MK, Nishikawa R, Hirose T, Matsutani M. Increased expression of podoplanin in malignant astrocytic tumors as a novel molecular marker of malignant progression. Acta Neuropathol 2006; 111: 483-488. Yuan P, Temam S, El-Naggar A, Zhou X, Liu DD, Lee JJ, Mao L. Overexpression of podoplanin in oral cancer and its association with poor clinical outcome. Cancer. 2006; 107: 563-569. Kunita A, Kashima TG, Morishita Y, Fukayama M, Kato Y, Tsuruo T, Fujita N. The platelet aggregation-inducing factor aggrus/podoplanin promotes pulmonary metastasis. Am J Pathol. 2007; 170: 1337-1347. Kato Y, Fujita N, Kunita A, Sato S, Kaneko M, Osawa M, Tsuruo T. Molecular identification of Aggrus/T1alpha as a platelet aggregation-inducing factor expressed in colorectal tumors. J Biol Chem. 2003; 278: 51599-51605. Kato Y, Kaneko MK, Kunita A et al. Molecular analysis of the pathophysiological binding of the platelet aggregation-inducing factor podoplanin to the C-type lectin-like receptor CLEC-2. Cancer Sci 2008; 99: 54-61. Kato Y, Kaneko MK, Kuno A et al. Inhibition of tumor cell-induced platelet aggregation using a novel anti-podoplanin antibody reacting with its platelet-aggregation-stimulating domain. Biochem Biophys Res Commun 2006; 349: 1301-1307.
본 발명의 과제는, Aggrus를 타겟으로 하여 암 및 혈전증을 처치하기 위한 의약 조성물을 제공함에 있다.
본 발명자들은, 예의연구의 결과, Aggrus-CLEC-2 상호작용 및 혈소판 응집을 저해할 수 있는 모노클로날 항체를 산생(産生)하는 하이브리도마를 수립했다. 이 하이브리도마로부터 산생되는 항체는, 서열번호 1(Pro Gly Ala Glu Asp Asp Val Val Thr), 서열번호 3(Pro Gly Thr Ser Glu Asp) 또는 서열번호 4(Pro Gly Thr Ser Glu Asp Arg Tyr Lys)에 의해 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 Aggrus의 에피토프(epitope)를 인식함, Aggrus-CLEC-2의 결합을 농도의존적으로 저해함, 혈소판 응집 억제 및 암의 폐 전이 억제 효과를 나타냄을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은, 서열번호 1, 3 또는 4에 의해 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 Aggrus의 에피토프를 인식하는, 마우스 모노클로날 항체 또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트(1)를 제공한다.
또한, 본 발명은, 수탁번호 FERM BP-11446, FERM BP-11447, FERM BP-11448 또는 FERM BP-11449의 하이브리도마에 의해 산생되는, 상기 (1)에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트(2)를 제공한다.
또한, 본 발명은, 인간화된, 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트(3)를 제공한다.
본 발명은, 수탁번호 FERM BP-11446, FERM BP-11447, FERM BP-11448 또는 FERM BP-11449의 하이브리도마(4)를 제공한다.
본 발명은, 상기 (1)∼(3) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트를 포함하는, Aggrus-CLEC-2 결합저해제(5)를 제공한다.
본 발명은, 혈소판 응집 억제 또는 암전이 억제, 혹은 종양 또는 혈전증의 처치를 위한, 상기 (1)∼(3) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트를 포함하는, 의약 조성물(6)을 제공한다.
또한, 본 발명은, 혈전증이, 뇌경색 또는 심근경색인, 상기 (6)에 기재된 의약 조성물(7)을 제공한다.
또한, 본 발명은, 암 또는 종양이, 편평상피암, 섬유육종, 중피종, 카포시육종, 정소종양, 뇌종양 또는 방광암인, 상기 (6)에 기재된 의약 조성물(8)을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은, 암 또는 종양이, 편평상피암, 중피종, 정소종양 또는 방광암인, 상기 (8)에 기재된 의약 조성물(9)을 제공한다.
본 발명자들이 수립한 하이브리도마로부터 산생되는 P2-0, MS-1, MS-3, MS-4로 명명된 마우스 모노클로날 항체는, in vivo 및 in vitro에서 분석한 바, 서열번호 1, 3 또는 4에 의해 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 Aggrus의 에피토프를 인식하며, Aggrus-CLEC-2의 결합을 농도의존적으로 저해함을 알 수 있었다. 또한, 본원 발명의 모노클로날 항체는, 혈소판 응집 억제 효과나 암의 폐 전이 억제 효과도 나타냈다. 본원 발명의 모노클로날 항체의 인간화 항체(인간형 키메라 항체)는, Aggrus 저발현세포에도 암전이 억제 효과를 나타냈다. 본원 발명의 모노클로날 항체는, 이미 알려져 있는 래트의 모노클로날 항체보다도, 생체에서 발현하여 있는 네이티브한 Aggrus에 대한 반응성이 다르며, Aggrus 의존적인 폐 전이를 보다 저농도로 억제한다는, 예측할 수 없는 효과가 얻어졌다. 또한, 본원 발명의 모노클로날 항체는 각각 다른 에피토프를 인식하고 있으며, 암에서 빈발하는 내성변이 등이 생긴 경우에도 다른 항체를 사용하면 극복할 수 있는 가능성이 높아, 큰 이점을 갖고 있다. 또한 본원 발명의 모노클로날 항체는 마우스 모노클로날 항체이기 때문에, 항암제의 개발과정에서 범용되는 인간암을 이식한 마우스 모델(마우스 담암(擔癌)모델)에 있어서, 래트 항체와 같이 종의 배리어를 고려할 필요가 없다. 일반적으로, CDR를 마우스 항체의 Fc도메인에 결합시킴으로써, 마우스 키메라 항체를 래트 항체로부터 제작할 수도 있다고는 하나, 그 마우스 키메라 항체의 산생에는 CHO 세포 등의 항체산생 세포에 키메라 항체 발현벡터를 유전자 도입하여 산생시키는 것이 필요하며, 마우스 키메라 항체의 대량정제에는 마우스 항체를 마우스 복수에서 산생시키는 경우와 비교하여 경제적이지 않고, 실용에 적합하지 않다. 따라서, 본원 발명의 마우스 모노클로날 항체는, 예를 들면 인간암의 마우스 담암 모델을 사용한 의약 조성물의 개발에 각별히 편리성을 갖는다.
도 1은, P2-0 항체의 합성 펩티드를 사용한 인식 에피토프의 범위 좁힘을 나타내는 도면.
도 2는, P2-0 항체가, 농도의존적으로 Aggrus-CLEC-2 상호작용을 저해함을 나타내는 도면.
도 3은, P2-0 항체가, 혈소판 응집 억제 효과를 가짐을 나타내는 도면.
도 4는, P2-0 항체가, 암의 폐 전이 억제 효과를 가짐을 나타내는 도면.
도 5는, 인간화 P2-0 항체(인간형 키메라 P2-0 항체)가, 혈소판 응집 억제 효과를 가짐을 나타내는 도면.
도 6은, 인간화 P2-0 항체(인간형 키메라 P2-0 항체)가, 암의 폐 전이 억제 효과를 가짐을 나타내는 도면.
도 7은, 인간화 P2-0 항체(인간형 키메라 P2-0 항체)가, Aggrus저발현세포(HT1080세포)에도 폐 전이 억제 효과를 가짐을 나타내는 도면.
도 8은, P2-0 항체가, 인간 방광암 세포막 표면에 발현하여 있는 Aggrus를 인식함을 나타내는 웨스턴 블롯(Western blot) 분석의 도면.
도 9는, NZ-1 항체와 P2-0 항체와의 Aggrus 인식능의 차이를 나타내는 웨스턴 블롯 분석의 도면.
도 10a는, NZ-1 항체(도 10a)와 P2-0 항체(도 10b)와의 Aggrus 인식능의 차이를 나타내는 FACS법에 있어서의 NZ-1 항체의 해석결과의 도면.
도 10b는, NZ-1 항체(도 10a)와 P2-0 항체(도 10b)와의 Aggrus 인식능의 차이를 나타내는 FACS법에 있어서의 P2-0 항체의 해석결과의 도면.
도 11는, NZ-1 항체와 P2-0 항체와의 암의 폐 전이 억제 효과의 차이를 나타내는 도면.
도 12는, MS-1, MS-3 및 MS-4 항체가 인간 Aggrus를 인식하는 것을, 인간 Aggrus 유전자를 도입한 CHO 세포주를 사용한 플로우 사이토메트리(flow cytometry) 해석에 의해 확인한 도면.
도 13은, 알라닌 변이형 Aggrus 단백질을 사용한 P2-0, MS-1, MS-3 및 MS-4 항체의 인식 에피토프의 범위 좁힘을 나타내는 도면.
도 14는, 표면 플라스몬 공명을 사용한 재조합 인간 Aggrus 단백질에 대한 P2-0, MS-1, MS-3 및 MS-4 항체의 결합도를 측정한 도면.
도 15는, P2-0, MS-1, MS-3 및 MS-4 항체가 Aggrus-CLEC-2 상호작용을 저해함을 나타내는 도면.
도 16은, P2-0, MS-1, MS-3 및 MS-4 항체가 혈소판 응집 억제 효과를 가짐을 나타내는 도면.
도 17은, MS-1 항체가 인간 Aggrus 발현세포에 대해 항종양활성을 발휘함을 나타내는 도면.
도 18은, MS-1 항체가 인간 Aggrus 발현세포의 폐에의 자연전이를 저해함을 나타내는 도면.
도 19는, MS-1 및 MS-3 항체가 인간 Aggrus발현세포의 폐 전이 억제 효과를 가짐을 나타내는 도면.
Aggrus는, gp44, 포도플라닌(podoplanin) 등으로서도 알려져 있다.
「항Aggrus 모노클로날 항체」는, Aggrus에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 유도체를 말하고, 원래의 항체와 실질적으로 동일한 항원특이성을 나타내는 당해 항체의 단편(본 명세서 중, 「기능적 단편」이라 부른다)도 포함하는 것으로 한다. 항체의 기능적 단편에는, Fab, Fab', F(ab')2, 단쇄 항체(scFv), 디설피드 안정화 V영역 단편(dsFv), 혹은 CDR를 포함하는 펩티드 등의 항체의 기능적 단편 등이 포함된다. 본 발명에 있어서의 항체는, 이하에 상술하는 바와 같이, 동물, 바람직하게는 마우스를 면역하고, 적절한 세포와의 융합에 의한 하이브리도마의 제작을 위해서 비장세포를 회수하는 것을 포함하는, 종래의 방법에 의해 제작할 수 있다.
Aggrus에 대한 마우스 모노클로날 항체의 호적한 예로서는, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(IPOD; 일본국 305-8566 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1-1-1 쥬오다이6)에 수탁번호 FERM BP-11446으로서 2011년 2월 18일자로 기탁된 하이브리도마, 및 수탁번호 FERM BP-11447, FERM BP-11448 및 FERM BP-11449로서 상기 IPOD에 2011년 12월 28일자로 기탁된 하이브리도마가 산생하는 모노클로날 항체를 들 수 있다. 또한, 그것과 동등의 결합 특성을 갖는 다른 항체도 본 발명의 항Aggrus 모노클로날 항체로서 바람직하다.
인간 이외의 동물의 항체를, 유전자 재조합 기술을 이용하여 인간형 키메라 항체 혹은 인간형 CDR이식 항체 등으로 한 인간화 항체도 또한, 본 발명에 있어서 유리하게 사용할 수 있다. 인간형 키메라 항체란, 항체의 가변 영역(이하, V 영역으로 표기함)이 인간 이외의 동물의 항체이고, 정상 영역(이하, C 영역으로 표기함)이 인간 항체인 항체이며(Morrison S.L. et al., Proc Natl Acad Sci USA.81(21), 6851-6855, 1984), 인간형 CDR이식 항체란, 인간 이외의 동물의 항체의 V 영역 중의 CDR의 아미노산 서열을 인간 항체의 적절한 위치에 이식한 항체이다(Jones P.T. et al., Nature,321(6069), 522-525, 1986). 인간화 항체는, 인간에 투여한 경우, 인간 이외의 동물의 항체에 비해, 부작용이 적고, 그 치료효과가 장기간 지속한다. 또한, 인간화 항체는, 유전자 재조합 기술을 이용하여 다양한 형태의 분자로서 제작할 수 있다.
본 발명은, 다른 태양에 있어서, 본원 발명의 모노클로날 항체 또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트를 포함하는, Aggrus-CLEC-2 결합저해제, 및 혈소판 응집 억제 또는 암전이 억제, 혹은 종양 또는 혈전증의 처치를 위한, 본원 발명의 모노클로날 항체 또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트를 포함하는, 의약 조성물을 제공한다. 혈전증은, 바람직하게는 뇌경색 또는 심근경색이다. 암 또는 종양은, 바람직하게는 편평상피암, 섬유육종, 중피종, 카포시육종, 정소종양, 뇌종양 또는 방광암이다. 또, 본원 명세서 중, 용어 「암」과 「종양」은 동일한 의미를 갖는 용어로서 사용된다.
본 발명의 의약 조성물의 제형의 종류로서는, 예를 들면, 경구제로서 정제, 분말제, 환제, 산제, 과립제, 세립제, 연·경캅셀제, 필름코팅제, 펠렛제, 설하제, 페이스트제 등, 비경구제로서 주사제, 좌제, 경피제, 연고제, 경고제, 외용액제 등을 들 수 있고, 당업자에 있어서는 투여경로나 투여대상 등에 따른 최적의 제형을 선택할 수 있다. 유효 성분으로서의 항Aggrus 모노클로날 항체는, 제제 중 0.1∼99.9중량% 함유할 수 있다.
본 발명의 약제의 유효 성분의 투여량은, 투여대상, 대상장기, 증상, 투여 방법 등에 따라 차는 있지만, 경구투여의 경우, 일반적으로 예를 들면, 환자(60kg으로서)에 대해 1일에 대해 약 0.1μg∼1000mg, 바람직하게는 약 1.0μg∼100mg, 보다 바람직하게는 약 1.0mg∼50mg이다. 비경구적으로 투여하는 경우는, 그 1회투여량은 투여대상, 대상장기, 증상, 투여 방법 등에 따라서도 다르지만, 예를 들면, 주사제의 형태로는 통상예를 들면, 환자(60kg에 대해), 1일에 대해 약 0.01∼30mg 정도, 바람직하게는 약 0.1∼20mg 정도, 보다 바람직하게는 약 0.1∼10mg 정도를 정맥주사에 의해 투여하는 것이 좋다. 그러나, 최종적으로는, 제형의 종류, 투여 방법, 환자의 연령이나 체중, 환자의 증상 등을 고려하여, 의사 또는 수의사의 판단에 의해 적절히 결정할 수 있다.
이하에 실시예를 들어, 본원 발명을 상세하게 설명한다.
[실시예 1]
마우스 항 인간 Aggrus 모노클로날 항체 생산 하이브리도마의 제작
면역원
인간 Aggrus cDNA의 TT679 부위(위치 38∼51의 14개의 아미노산(서열번호 2 : Glu Gly Gly Val Ala Met Pro Gly Ala Glu Asp Asp Val Val)을 클로닝하고, pGEX-6P-3벡터(GE Healthcare, 영국 버킹엄셔주)에 8회 반복해서 연결했다(TT679-repeat). 이 벡터로 대장균 BL21(Invitrogen, 캘리포니아주 칼즈배드)을 형질 전환하고, 그리고 GST 태그 부착 재조합 단백질을 Glutathione Sepharose(GE Healthcare)에 의해 정제했다.
감작
6주령의 자성(雌性) BALB/c 마우스(니혼찰스리버 가부시키가이샤로부터 구입하여, 통상의 방법에 따라서 사육)에, Freund's complete adjuvant(Difco Laboratories, 미시건주 디트로이트)를 사용하여 상기에서 얻어진 면역원을 경부 피하 투여했다. 격주로의 복강 내 투여에 의하여, 추가 면역을 행했다.
하이브리도마 수립
통상의 방법에 따라, 비장 세포를 채취하고, 폴리에틸렌글리콜 4000(Merck, 뉴저지주)을 사용하여 마우스 미엘로마 세포 P3U1과 융합시켰다. 히포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘을 함유하는 RPMI 1640 배지(Sigma)에서 증식시켜서, 하이브리도마를 선택했다. 그 결과, 15 클론의 하이브리도마가 수립되었다.
[실시예 2]
마우스 항 인간 Aggrus 모노클로날 항체의 분석
웨스턴 블롯 에 의한 검증
상기에서 얻어진 하이브리도마로부터 얻어지는 항체 중, P2-0이라는 항체를 산생하는 하이브리도마를, 2011년 2월 18일에, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 기탁하여, 수탁번호 FERM BP-11446을 부여받았다(수탁번호 FERM P-22069와 동일). P2-0 항체는, 플로우 사이토메트리 및 웨스턴 블롯 분석에 의하여, 인간 Aggrus를 인식함이 나타났다. 또한, 서열번호 2로 나타내는 아미노산 서열이 결실한 Aggrus 변이체를 제작하여 웨스턴 블롯 분석을 행한바, P2-0 항체는 이것을 인식할 수 없었다.
[실시예 3]
에피토프의 탐색
도 1에 나타내는 바와 같이, 다양한 펩티드를 화학 합성하고, 그들에 대한 P2-0 항체의 반응성을 ELISA법으로 검토했다. 그 결과, 위치 44∼52의 아미노산 서열(서열번호 1)을 갖는 펩티드에 대하여 높은 반응성이 나타났다.
[실시예 4]
Aggrus - CLEC -2 결합 저해 시험
포유 동물 세포로부터 정제한 재조합 Aggrus 단백질 및 CLEC-2 단백질을 사용해서, Aggrus-CLEC-2 상호 작용을 ELISA법에 의하여 검출했다. Aggrus 항체의 존재 하에서의 상호 작용에의 영향을 조사했다. 도 2에 나타내는 바와 같이, P2-0 항체는, 농도 의존적으로 Aggrus-CLEC-2 상호 작용을 저해함이 발견되었다.
[실시예 5]
혈소판 응집 억제 시험
CHO 세포 및 CHO/mock 세포는, 혈소판 응집을 야기할 수 없음이 알려져 있는데 대하여, Aggrus를 발현한 CHO/Aggrus 세포는 혈소판 응집을 야기했다. 광선 투과율의 모니터링에 의한 in vitro 혈소판 응집 분석에 있어서, 반응 개시 시점으로부터 최대의 절반 정도의 값의 시점까지의 시간을 비교했다. 도 3에 나타내는 바와 같이, P2-0 항체의 첨가에 의하여, Aggrus에 의한 혈소판 응집은 농도 의존적으로 지연됨이 발견되었다.
[실시예 6]
폐 전이 억제 시험
정맥 주사 후, 인간 Aggrus 유전자를 도입한 CHO 세포주(細胞株)의 in vivo에 있어서의 실험적 폐 전이에 대한 항체의 영향을 검토했다. CHO 세포는, Aggrus의 강제 발현에 의하여 전이성으로 됨이 알려져 있다. 도 4에 나타내는 바와 같이, P2-0 항체는, 0.1㎍/마리와 같은 매우 소량이어도 매우 강한 폐 전이 억제 효과를 나타냄이 밝혀지고, P2-0 항체는 Aggrus 중화 활성뿐만 아니라, Aggrus 의존적인 혈행성 전이를 저해함도 나타났다.
[실시예 7]
인간화 항체의 제작과 검증
실용 가능하게 하기 위하여, P2-0 항체의 Aggrus 인식 가변 영역을 클로닝하고, 정법(定法)에 따라서 인간 IgG의 정상 영역에 삽입된 인간화 P2-0 항체(인간형 키메라 P2-0 항체)를 제작했다. 또한, 이 인간화 P2-0 항체는, 원숭이 Aggrus를 인식함을 확인했다. 또한, 이 인간화 P2-0 항체는, 원래의 P2-0 항체와 마찬가지로 혈소판 응집 저해 활성(도 5) 및 암의 전이 억제 효과(도 6)를 나타냄도 확인했다. 이 인간화 P2-0 항체는, 도 7에 나타내는 바와 같이, Aggrus 저발현 세포(HT1080 세포)에도 암 전이 억제 효과를 나타냈다.
[실시예 8]
Aggrus 관련 암의 탐색과 래트 항Aggrus 항체( NZ -1 항체)의 비교
본 발명자들은 또한, Aggrus가 방광암에서도 고빈도로 발현 항진하고 있음것을, 방광암의 임상 샘플로부터 얻어진 cDNA(OriGene사로부터 시판되고 있는 TissueScan cDNA Panel)를 템플레이트로 한 real-time PCR법에 의하여 알아내었다.
그래서, 웨스턴 블롯 분석에 의하여, 인간 방광암에 발현해 있는 Aggrus의 P2-0 항체에 의한 인식을 조사했다. 도 8에 나타내는 바와 같이, P2-0 항체는, 각종 인간 방광암 세포막 표면에 발현해 있는 Aggrus(레인 2∼5)를 인식한 것에 대하여, 시판의 D2-40 항체(마우스 항 인간 Aggrus 모노클로날 항체)는, 인간 Aggrus 유전자를 도입한 CHO 세포주만(레인 1)을 인식했지만, 인간 방광암 세포막 표면에 발현해 있는 Aggrus를 인식할 수 없음이 밝혀졌다. 또한, 인간 Aggrus 유전자를 도입한 CHO 세포주 및 각종 인간 방광암 세포주를, 단백질 분해 효소인 트립신 처리의 조건 하(도 9; 레인 7∼9) 혹은 트립신 무처리의 조건 하(도 9; 레인 12∼15)에서 회수하고, 그 세포 용해액을 SDS-PAGE하여, P2-0 항체, NZ-1 항체와 단백질 영동량이 일치하여 있음 것을 확인하기 위한 액틴 항체로 웨스턴 블롯 분석을 행다. 그 결과, 도 9에 나타내는 바와 같이, P2-0 항체는 인간 방광암 세포막 표면에 발현해 있는 Aggrus 단백질을 인식했지만, NZ-1 항체는 인간 Aggrus를 도입한 CHO 세포에 발현해 있는 Aggrus밖에 인식할 수 없고(도 9; 레인 6), 인간 방광암 세포막 표면에 발현해 있는 야생형 Aggrus를 인식할 수 없음이 밝혀졌다.
본 검토에 의하여, P2-0 항체는 지금까지 알려져 있었던 항 인간 Aggrus 항체(NZ-1을 포함함)와 비교해서, 생체에서 발현해 있는 네이티브 Aggrus에 대한 반응성이 강한 것이 실증되어, P2-0 항체는 다종류의 암에서 발현해 있는 Aggrus를 인식할 수 있는 항체임이 시사되었다. 따라서, P2-0 항체는 Aggrus를 타겟으로 한 사용에 있어서, 보다 우수한 효과를 가짐이 시사되었다.
또한, FACS법에 의하여, 상기 웨스턴 블롯 분석의 결과를 재현했다. 구체적으로는, 인간 방광암 세포주 T24를 단백질 분해 효소인 트립신을 함유하지 않는 EDTA만으로 세포 회수하고, 그 세포에 대하여 각각 NZ-1 항체 또는 그 컨트롤 항체인 래트 항체를 4℃에서 1시간 반응시켰다. 과잉한 항체를 PBS로 세정한 후, 2차 항체로서 Alexa488 표지된 항 래트 IgG 항체를 4℃에서 1시간 반응시켰다. 과잉한 항체를 PBS로 세정한 후, Beckman Coulter사의 Cytomics FC500 플로우 사이토미터로 해석했다. 결과를, 도 10a에 나타낸다.
한편, 상기 회수한 인간 방광암 세포주 T24에 대하여 각각 P2-0 항체 또는 그 컨트롤 항체인 마우스 항체를 4℃에서 1시간 반응시켰다. 과잉한 항체를 PBS로 세정한 후, 2차 항체로서 Alexa488 표지된 항 마우스 IgG 항체를 4℃에서 1시간 반응시켰다. 과잉한 항체를 PBS로 세정한 후, 마찬가지로 플로우 사이토미터로 해석했다. 결과를, 도 10b에 나타낸다. 도 10a 및 b에 나타내는 바와 같이, NZ-1 항체는 인간 방광암 세포주 T24에 발현해 있는 Aggrus를 인식하지 못했지만, P2-0 항체는 인식하고 있었다.
인간 Aggrus 유전자를 도입한 CHO 세포주의 in vivo에 있어서의 실험적 폐 전이에 대한 P2-0 항체와 NZ-1 항체의 작용을 비교했다. 도 11에 나타내는 바와 같이, P2-0 항체는, 마우스 1마리당 0.01㎍, 0.001㎍과 같은 매우 소량이어도 컨트롤 항체 투여 군과 비교해서 유의하게 폐 전이 억제 효과를 나타내지만, NZ-1 항체는, 0.1㎍/마리로는 유의한 전이 억제 효과를 나타내지만, 0.01㎍/마리, 0.001㎍/마리와 같은 소량으로는 컨트롤 항체와 비교해서 유의한 억제 효과를 나타낼 수 없음이 밝혀졌다. 따라서, P2-0 항체는 NZ-1 항체와 비교해서 강한 혈행성 전이 저해 활성을 가짐이 밝혀졌다. 따라서, P2-0 항체는, Aggrus 인식 및 Aggrus 기능 억제에 있어서 우수한 효과를 갖는 항체이며, 실험적·임상적 사용에 있어서 유리함이 발견되었다.
[실시예 9]
마우스 항 인간 Aggrus 모노클로날 항체 산생 하이브리도마의 제작
면역원
인간 Aggrus cDNA의 PP4262 부위(위치 42∼62의 21개의 아미노산(서열번호 5 : Ala Met Pro Gly Ala Glu Asp Asp Val Val Thr Pro Gly Thr Ser Glu Asp Arg Tyr Lys Ser))를 18회 반복한 것을 pGEX-6P3벡터(GE Healthcare)에 클로닝했다. 이 벡터로 대장균 BL21(Invitrogen)을 형질 전환하고, GST 태그 융합 재조합 단백질을 Glutathione Sepharose(GE Healthcare)에 의해 정제했다.
감작
6주령의 자성 BALB/c 마우스(니혼찰스리버 가부시키가이샤로부터 구입하여, 통상의 방법에 따라서 사육)에, TiterMax Gold(TiterMax USA, Inc.)를 사용하여 상기에서 얻어진 면역원을 경부 피하 투여했다. 격주로의 복강 내 투여에 의하여, 추가 면역을 행했다.
하이브리도마 수립
통상의 방법에 따라서 비장 세포를 채취하고, 폴리에틸렌글리콜 4000(Merck)을 사용하여 마우스 미엘로마 세포 P3U1과 융합시켰다. 히포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘을 함유하는 에스·클론 클로닝미디엄(에이디아 가부시키가이샤)에서 증식시켜서, 하이브리도마를 선택했다. 그 결과, 복수 개의 하이브리도마가 수립되었다.
[실시예 10]
마우스 항 인간 Aggrus 모노클로날 항체의 분석
플로우 사이토메트리 해석에 의한 검증
상기한 하이브리도마로부터 얻어지는 항체 중 MS-1, MS-3 및 MS-4라는 항체를 생산하는 하이브리도마를, 2011년 12월 28일에, 각각 수탁번호 FERM BP-11447, FERM BP-11448 및 FERM BP-11449로서 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 기탁했다. 또, MS-1, MS-3 및 MS-4 항체가 인간 Aggrus를 인식하는 것은, 인간 Aggrus 유전자를 도입한 CHO 세포주를 사용한 플로우 사이토메트리 해석에 의하여 확인했다. 구체적으로는, 인간 Aggrus 유전자를 안정적으로 유전자 도입한 CHO 세포를 배양 용기로부터 회수하고, PBS로 세정한 후 2×106 cells/㎖의 세포 밀도로 조정한 것에, MS-1, MS-3 및 MS-4 항체를 처리하여 30분간 빙상(氷上)에서 반응시켰다. 그 후, 세포를 PBS로 세정하고 2차 항체로서 Alexa488 표지된 항 마우스 IgG 항체를 처리하여 빙상에서 30분간 반응시켰다. 세포를 PBS로 3회 세정한 후, Cytomics FC500(Beckman Coulter)로 해석을 행했다. 해석 결과를 도 12에 나타낸다.
[실시예 11]
에피토프의 탐색
인간 Aggrus cDNA로부터 시그널 펩티드에 상당하는 코돈을 제거한 것을 pGEX-6P3벡터에 클로닝하고, 37 내지 62번째의 아미노산에 상당하는 코돈을 QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)를 사용하여 1개소씩 알라닌에 대응하는 코돈으로 치환함에 의하여, 각종 알라닌 변이형 Aggrus 발현 벡터를 제작했다. 제작한 벡터를 사용하여 대장균 TOP10F'(Invitrogen)을 형질 전환해서 배양한 후, 대장균 파쇄액을 샘플로 해서 웨스턴 블롯법을 행함에 의해, 재조합 인간 Aggrus 단백질에 대한 P2-0, MS-1, MS-3 및 MS-4 항체의 반응성을 검토했다. 그 결과, 도 13 상단에 나타내는 바와 같이, P2-0 항체는 인간 Aggrus 단백질의 45번째의 글리신, 48번째의 아스파라긴산 및 49번째의 아스파라긴산에 대하여 높은 반응성을 나타내고, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열을 인식함이 확인되었다. MS-1 항체는, 인간 Aggrus 단백질의 45번째의 글리신 및 48번째의 아스파라긴산에 대하여 높은 반응성을 나타내고, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열을 인식함이 확인되었다. MS-3 항체는, 인간 Aggrus 단백질의 54번째의 글리신, 55번째의 트레오닌 및 58번째의 아스파라긴산에 대하여 높은 반응성을 나타내고, 서열번호 3으로 나타내는 아미노산 서열을 인식함이 확인되었다. MS-4 항체는, 인간 Aggrus 단백질의 53번째의 프롤린, 55번째의 트레오닌, 57번째의 글루탐산, 58번째의 아스파라긴산 및 61번째의 리신에 대하여 높은 반응성을 나타내고, 서열번호 4로 나타내는 아미노산 서열을 인식함이 확인되었다. 또, P2-0, MS-1, MS-3 및 MS-4 항체의 인식 에피토프의 모식도를 도 13 하단에 나타낸다. 인간 Aggrus 1차 서열 중의 인식 에피토프 중, 흰 문자로 나타낸 아미노산이 항체의 인식 부위이며, 타원과 겹치는 부위는 항체가 인간 Aggrus를 인식할 때에 중요한 영역을 나타낸다.
[실시예 12]
표면 플라스몬 공명을 사용한 재조합 인간 Aggrus 단백질에 대한 항체의 결합도 측정
P2-0, MS-1, MS-3 및 MS-4 항체의 재조합 인간 Aggrus 단백질에 대한 결합도 측정은, 표면 플라스몬 공명 해석 장치 Biacore X100(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)을 사용했다. 카르복시메틸덱스트란 코팅 처리가 실시된 센서 칩 CM5 위에 아민커플링법을 사용하여 재조합 인간 Aggrus 단백질을 고정화하여, 약 2,000 RU 상당의 고정화량을 얻었다. 25도, 30마이크로리터/min의 유속의 조건 하, HBS-EP+ buffer(10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% v/v Surfactant P20)를 유로에 채워서 측정을 행했다. HBS-EP+ buffer를 사용하여 P2-0, MS-1, MS-3 및 MS-4 항체 용액을 100nM, 50nM, 25nM, 12.5nM 및 6.25nM로 각각 희석하고, 재조합 인간 Aggrus 단백질이 고정화된 센서 칩 CM5 위에 60초간 흘려서 결합 반응을 관찰하고, 계속해서 HBS-EP+ buffer를 120초간 흘려서 해리 반응을 관찰했다. 측정에 의하여 얻어진 센서그램을 바탕으로 Biacore X100 evaluation software bivalent analyte model을 사용하여 해석을 행하고, 해리 상수 KD값을 산출했다. 도 14에 나타내는 바와 같이, 재조합 인간 Aggrus 단백질에 대한 P2-0 항체의 해리 상수는 9.3×10-9 M, MS-1 항체의 해리 상수는 9.0×10-9 M, MS-3 항체의 해리 상수는 6.3×10-8 M, MS-4 항체의 해리 상수는 2.0×10-6 M이었다.
[실시예 13]
Aggrus - CLEC -2 결합 저해 시험
포유 동물 세포로부터 정제한 재조합 Aggrus 단백질 및 CLEC-2 단백질을 사용하여, Aggrus-CLEC-2 상호 작용을 ELISA법에 의해 검출했다. 또한 항Aggrus 항체가 Aggrus-CLEC-2 상호 작용에 주는 영향을 검토했다. 도 15 상단에 나타내는 바와 같이, P2-0 및 MS-1 항체는, 처리 농도 의존적으로 Aggrus-CLEC-2 상호 작용을 저해함이 나타났다. 또한, 도 15 하단에 나타내는 바와 같이, MS-3 및 MS-4 항체는 40마이크로그램/㎖ 혹은 80마이크로그램/㎖로 고농도로 처리함에 의하여, Aggrus-CLEC-2 상호 작용을 저해함이 나타났다.
[실시예 14]
혈소판 응집 억제 시험
혈소판 응집을 야기하지 않는 세포주인 CHO 세포에 인간 Aggrus 유전자를 도입하면, 혈소판 응집을 야기하게 됨이 알려져 있다. MCM HEMA TRACER 313M(엠 씨 메디컬)을 사용한 광투과율의 모니터링에 의한 in vitro 혈소판 응집 분석을 행하고, 반응 개시 시점으로부터 최대 응집율의 50%에 이르기까지의 시간을 비교했다. 도 16에 나타내는 바와 같이, 인간 Aggrus 도입 CHO 세포에 의해 유도되는 혈소판 응집은, 컨트롤 항체(마우스 IgG(Sigma사 카탈로그 번호 I5381을 PBS 투석한 것)) 존재 하에서는 반응 개시로부터 2∼3.5분에서 50% 응집율에 도달함에 대하여, P2-0 항체 존재 하에서는 반응 개시로부터 11∼19분 후로 지연되었다. 또한, MS-1 항체 존재 하에서는, 반응 개시로부터 9분 후, MS-3 항체 존재 하에서는 반응 개시로부터 14.5분 후, MS-4 항체 존재 하에서는 반응 개시로부터 10분 후로 지연되었다. 이것으로부터, P2-0, MS-1, MS-3 및 MS-4 항체는 Aggrus 의존적인 혈소판 응집을 저해하는 활성을 가짐이 나타났다.
[실시예 15]
항 종양 활성 시험
BALB/c-nu/nu 누드 마우스 12마리의 배부(背部) 피하에 인간 Aggrus 유전자를 도입한 CHO 세포주를 1×105 cells/마리의 세포 수로 이식하고, 6마리 2군으로 나눴다. 세포 이식을 행한 날을 Day 0으로 하여, Day 1, Day 5 및 Day 9의 합계 3회에 걸쳐 컨트롤 항체(마우스 IgG2a(Sigma사 카탈로그 번호 M9144를 PBS 투석한 것)) 및 MS-1 항체를 각 군에 투여했다. 또, 1회의 항체 투여량은 30마이크로그램/마리로 하고, 투여 경로로는 미정맥(尾靜脈)을 채용했다. 종양 체적을 1주간에 2회 측정하고, 피하 이식으로부터 30일 후까지 측정함에 의하여, MS-1 항체의 항 종양 효과를 검토했다. 그 결과, 도 17의 그래프에 나타내는 바와 같이, 컨트롤 항체 투여 군에서는 6마리 중 5마리의 마우스에 있어서 종양의 증식이 관찰되며, Day 30에 있어서의 평균 종양 체적은 약 1200㎣이었다. 한편, MS-1 항체 투여 군에서는 6마리 중 2마리의 마우스에 있어서 종양의 소실, 3마리의 마우스에 있어서 종양의 증식 억제가 관찰되며, Day 30에 있어서의 평균 종양 체적은 400㎣이었다. 이것으로부터, MS-1 항체는 인간 Aggrus 발현 세포에 대하여 항 종양 활성을 발휘함이 나타났다. 또, Day 18에 있어서의 마우스와 종양의 모양을 도 17 우측에 사진으로 나타낸다. 마우스에 기록된 1에서 6까지의 숫자는, 각 그래프의 1에서 6까지의 범례에 대응하고 있다.
[실시예 16]
폐에의 자연 전이 저해 시험
인간 Aggrus를 도입한 CHO 세포를 피하 이식했을 경우, 이식 후 30일 정도에서 폐에의 자연 전이가 관찰됨이 알려져 있다. 그래서, 항 종양 활성 시험을 실시한 12마리의 마우스의 폐를 세포 이식 후 30일째에 적출하여, PBS 세정 후에 포화 피크르산 용액으로 염색하고, 폐 표면에 생긴 전이 결절 수를 카운트했다. 도 18 상측에 카운트한 전이 결절 수를 기록한 그래프를, 하측에 피크르산 염색한 마우스의 폐의 사진을 나타낸다. 컨트롤 항체(마우스 IgG2a(Sigma사 카탈로그 번호 M9144를 PBS 투석한 것)) 투여 군에서는 평균 30개 정도의 폐 전이 결절이 관찰된 것에 대하여, MS-1 항체 투여 군에서는 6마리 중 5마리에 있어서 폐 전이 결절의 형성이 완전히 저해되었다. 이로부터, MS-1 항체는 인간 Aggrus 의존적인 폐에의 자연 전이를 저해하는 활성을 갖고 있음이 나타났다.
[실시예 17]
폐 전이 억제 시험
인간 Aggrus를 도입한 CHO 세포를 BALB/c-nu/nu 누드 마우스의 미정맥으로부터 주사하면, 약 20일 후에 폐 전이 결절을 형성함이 알려져 있다. 그래서, 세포 주사 전날에 컨트롤 항체(마우스 IgG2a(Sigma사 카탈로그 번호 M9144를 PBS 투석한 것)), MS-1 항체 및 MS-3 항체를 미정맥 경로로 각 군 8마리의 누드 마우스에 투여하고, Aggrus 의존적인 실험적 폐 전이에 주는 영향을 검토했다. 도 19에 나타내는 바와 같이, MS-1 및 MS-3 항체를 사전 투여함에 의하여, 농도 의존적으로 인간 Aggrus 도입 CHO 세포의 폐 전이가 현저히 억제되었다. 따라서, MS-1 및 MS-3 항체는 Aggrus 중화 활성이 있을 뿐만 아니라, Aggrus 의존적인 혈행성 전이를 저해함도 나타났다.
독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 IPODFERMBP-11446 20110218 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 IPODFERMBP-11447 20111228 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 IPODFERMBP-11448 20111228 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 IPODFERMBP-11449 20111228
SEQUENCE LISTING <110> JAPANESE FOUNDATION FOR CANCER RESEARCH <120> An anti aggrus monoclonal antibody <130> FP3425PCT <150> JP2011-062686 <151> 2011-03-22 <160> 5 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> designed peptide <400> 1 Pro Gly Ala Glu Asp Asp Val Val Thr 1 5 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> designed peptide <400> 2 Glu Gly Gly Val Ala Met Pro Gly Ala Glu Asp Asp Val Val 1 5 10 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> designed peptide <400> 3 Pro Gly Thr Ser Glu Asp 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> designed peptide <400> 4 Pro Gly Thr Ser Glu Asp Arg Tyr Lys 1 5 <210> 5 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> designed peptide <400> 5 Ala Met Pro Gly Ala Glu Asp Asp Val Val Thr Pro Gly Thr Ser Glu 1 5 10 15 Asp Arg Tyr Lys Ser 20

Claims (9)

  1. 서열번호 1, 3 또는 4에 의하여 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 Aggrus의 에피토프를 인식하는, 마우스 모노클로날 항체 또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트.
  2. 제1항에 있어서,
    수탁번호 FERM BP-11446, FERM BP-11447, FERM BP-11448 또는 FERM BP-11449의 하이브리도마에 의하여 산생되는, 모노클로날 항체 또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    인간화된, 모노클로날 항체 또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트.
  4. 수탁번호 FERM BP-11446, FERM BP-11447, FERM BP-11448 또는 FERM BP-11449의 하이브리도마.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트를 포함하는, Aggrus-CLEC-2 결합 저해제.
  6. 혈소판 응집 억제 또는 암 전이 억제, 혹은 종양 또는 혈전증의 처치를 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 기능적 단편으로 이루어지는 프래그먼트를 포함하는, 의약 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    혈전증이 뇌경색 또는 심근경색인, 의약 조성물.
  8. 제6항에 있어서,
    암 또는 종양이, 편평상피암, 섬유육종, 중피종, 카포시육종, 정소종양, 뇌종양 또는 방광암인, 의약 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    암 또는 종양이, 편평상피암, 중피종, 정소종양 또는 방광암인, 의약 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2895184A4 (en) * 2012-09-12 2016-09-07 Oklahoma Med Res Found MODULATION OF PLATELET ACTIVATION WITH PODOPLANIN MEDIATION
JP6078845B2 (ja) * 2012-09-28 2017-02-15 株式会社Ｌｓｉメディエンス 可溶型ｃｌｅｃ−２に基づく血小板活性化測定方法
JP6473418B2 (ja) * 2013-10-10 2019-02-20 幸成 加藤 抗ポドプラニン抗体
KR20180023951A (ko) * 2015-07-15 2018-03-07 고에키자이단호진 간겐큐카이 항Aggrus 모노클로널 항체, CLEC-2와의 결합에 필요한 Aggrus의 영역, 및 Aggrus-CLEC-2 결합저해제의 스크리닝 방법
CN105754953B (zh) * 2016-03-17 2019-06-25 苏州大学附属第一医院 抗人平足蛋白血小板聚集区的单克隆抗体及其应用
WO2019081714A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 Vib Vzw POSITIVE MACROPHAGES TO PODOPLANIN
KR20230131222A (ko) * 2021-01-13 2023-09-12 가부시키가이샤 엘에스아이 메디엔스 가용형 clec2를 이용한 암 환자에 있어서의 혈전증리스크의 예측 방법

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1425580A4 (en) * 2001-07-12 2006-03-29 Ludwig Inst Cancer Res LYMPHATIC ENDOTHELIAL CELLS AND METHODS THEREOF
US20080176851A1 (en) * 2006-12-12 2008-07-24 Shiseido Company, Ltd. Method for inhibiting lymphangiogenesis and inflammation
WO2011040565A1 (ja) 2009-09-30 2011-04-07 Kato Yukinari 抗ポドプラニン抗体、及び抗ポドプラニン抗体を含む医薬組成物
US20140017266A1 (en) * 2010-12-03 2014-01-16 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of Hhs, Nih Anti-podoplanin antibodies and methods of use
US20130023479A1 (en) * 2011-07-22 2013-01-24 Protgen Ltd. Use of nucleolin as a biomarker for lymphangiogenesis in cancer prognosis and therapy

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