JP6218603B2

JP6218603B2 - マウス抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体

Info

Publication number: JP6218603B2
Application number: JP2013505892A
Authority: JP
Inventors: 直也藤田; 侑也中澤; 高木　聡; 聡高木
Original assignee: Japanese Foundation for Cancer Research
Current assignee: Japanese Foundation for Cancer Research
Priority date: 2011-03-22
Filing date: 2012-03-09
Publication date: 2017-10-25
Anticipated expiration: 2032-03-09
Also published as: CA2836007A1; US8980264B2; CA2836007C; KR101956566B1; EP2690111A1; JPWO2012128082A1; CN104093741A; ES2566133T3; CN104093741B; US20140235827A1; KR20140053873A; EP2690111A4; EP2690111B1; WO2012128082A1

Description

本願発明は、マウス抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体に関する。

血小板凝集誘導因子Ａｇｇｒｕｓ（ｐｏｄｏｐｌａｎｉｎ、ｇｐ４４等としても知られる）は、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、扁平上皮癌、中皮腫、カポジ肉腫、精巣腫瘍及び脳腫瘍といった様々なタイプの癌で発現増加していることが示されている（非特許文献１〜９）。Ａｇｇｒｕｓの過剰発現は予後不良に関係するとの報告があり、癌進行に対するＡｇｇｒｕｓの重要な関与が示唆されている（非特許文献１０、１１）。Ａｇｇｒｕｓの発現が血小板凝集を引き起こし、マウスにおける実験的な、そして自発的な肺転移を促進することが知られている（非特許文献１１、１２）。血小板凝集を抑制する点突然変異を導入すると、肺転移の形成は減弱するので、Ａｇｇｒｕｓの血小板凝集誘導活性は転移形成に直接関係していると考えられている（非特許文献１１、１２）。癌細胞誘導血小板凝集は、大きな癌−血小板凝集を形成し、微小血管系での癌細胞の塞栓形成増大、循環での免疫学的攻撃からの保護に至ると考えられている。最近、血小板上に発現しているＣ型レクチン様受容体（ＣＬＥＣ−２）が、Ａｇｇｒｕｓのカウンターパート受容体の一つとして特定された。腫瘍細胞上で発現しているＡｇｇｒｕｓにＣＬＥＣ−２が結合すると、血漿成分がなくとも血小板で活性化シグナルが出され、血小板凝集の引き金となることが知られている。相互認識に決定的なＡｇｇｒｕｓ及びＣＬＥＣ−２のドメインは、すでに知られている（非特許文献１３）。

モノクローナル抗体は、細胞表面抗原にしっかりと特異的に結合することができ、標的細胞に免疫学的応答を引き起こすことができる。従って、現在、多くのモノクローナル抗体が癌治療に用いられている。癌治療で用いられるモノクローナル抗体は、中和、抗体依存性細胞傷害活性（antibody-dependent cellular cytotoxicity; ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害活性（complement-dependent cytotoxicity; ＣＤＣ）、の３つの代表的な作用様式を介して抗癌効果を示す。ベバシズマブやセツキシマブに代表されるように、抗体はリガンド−受容体結合又は受容体多量体化を阻害し、シグナル経路の活性化を中和することができる。癌細胞の増殖はシグナル経路の活性化に依存しているので、その中和により細胞死に至る。他方、リツキシマブやトラスツズマブに代表されるように、抗体はそのＦｃドメインを介して標的癌細胞に対する免疫応答を誘導することができる。マクロファージ、ＮＫ細胞及び好中球等のエフェクター細胞と補体は、癌特異的抗原に結合する抗体のＦｃドメインを認識し、その結果標的癌細胞を殺す。これらの３つの作用様式は、抗体のアイソタイプやサブクラス、抗原の特徴や認識される部位により規定される。

これまで、Ａｇｇｒｕｓに対する多くの抗体が確立されてきたが、そのほとんどはＡｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ−２の相互作用を干渉できないものであった。ＮＺ−１と命名されたラット抗体は、Ａｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ−２の相互作用および血小板凝集を阻害することができるＡｇｇｒｕｓ抗体として知られているが（非特許文献１４）、種のバリアのせいで一般的に用いられるマウスの癌モデルでは正確に調べることができない等の問題点があった。

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本発明の課題は、Ａｇｇｒｕｓをターゲットとして癌及び血栓症を処置するための医薬組成物を提供することにある。

本発明者らは、鋭意研究の結果、Ａｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ−２相互作用及び血小板凝集を阻害することができるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立した。このハイブリドーマから産生される抗体は、配列番号１（Pro Gly Ala Glu Asp Asp Val Val Thr）、配列番号３（Pro Gly Thr Ser Glu Asp）又は配列番号４（Pro Gly Thr Ser Glu Asp Arg Tyr Lys）により表されるアミノ酸配列からなるＡｇｇｒｕｓのエピトープを認識すること、Ａｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ−２の結合を濃度依存的に阻害すること、血小板凝集抑制及び癌の肺転移抑制効果を示すことを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、配列番号１、３又は４により表されるアミノ酸配列からなるＡｇｇｒｕｓのエピトープを認識する、マウスモノクローナル抗体又はその機能的断片からなるフラグメント（１）を提供する。
また、本発明は、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１４４６、ＦＥＲＭＢＰ−１１４４７、ＦＥＲＭＢＰ−１１４４８又はＦＥＲＭＢＰ−１１４４９のハイブリドーマにより産生される、前記（１）記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片からなるフラグメント（２）を提供する。
さらには、本発明は、ヒト化された、前記（１）又は（２）記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片からなるフラグメント（３）を提供する。
本発明は、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１４４６、ＦＥＲＭＢＰ−１１４４７、ＦＥＲＭＢＰ−１１４４８又はＦＥＲＭＢＰ−１１４４９のハイブリドーマ（４）を提供する。
本発明は、前記（１）〜（３）のいずれか記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片からなるフラグメントを含む、Ａｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ−２結合阻害剤（５）を提供する。
本発明は、血小板凝集抑制又は癌転移抑制、あるいは腫瘍又は血栓症の処置のための、前記（１）〜（３）のいずれか記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片からなるフラグメントを含む、医薬組成物（６）を提供する。
また、本発明は、血栓症が、脳梗塞又は心筋梗塞である、前記（６）記載の医薬組成物（７）を提供する。
さらに、本発明は、癌又は腫瘍が、扁平上皮癌、繊維肉腫、中皮腫、カポジ肉腫、精巣腫瘍、脳腫瘍又は膀胱癌である、前記（６）記載の医薬組成物（８）を提供する。
好ましくは、本発明は、癌又は腫瘍が、扁平上皮癌、中皮腫、精巣腫瘍又は膀胱癌である、前記（８）記載の医薬組成物（９）を提供する。

本発明者らが樹立したハイブリドーマから産生されるＰ２−０、ＭＳ-１、ＭＳ-３、ＭＳ-４と命名されたマウスモノクローナル抗体は、ｉｎｖｉｖｏ及びｉｎｖｉｔｒｏで分析したところ、配列番号１、３又は４により表されるアミノ酸配列からなるＡｇｇｒｕｓのエピトープを認識し、Ａｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ−２の結合を濃度依存的に阻害することが分かった。また、本願発明のモノクローナル抗体は、血小板凝集抑制効果や癌の肺転移抑制効果も示した。本願発明のモノクローナル抗体のヒト化抗体（ヒト型キメラ抗体）は、Ａｇｇｒｕｓ低発現細胞にも癌転移抑制効果を示した。本願発明のモノクローナル抗体は、既に知られているラットのモノクローナル抗体よりも、生体で発現しているネイティブなＡｇｇｒｕｓに対する反応性が異なっており、Ａｇｇｒｕｓ依存的な肺転移をより低濃度で抑制するという、予測し得ない効果が得られた。また、本願発明のモノクローナル抗体は各々異なるエピトープを認識しており、癌で頻発する耐性変異などが生じた場合でも別の抗体を用いれば克服できる可能性が高く、大きな利点を有している。さらに本願発明のモノクローナル抗体はマウスモノクローナル抗体であるため、抗癌剤の開発過程で汎用されるヒト癌を移植したマウスモデル（マウス担癌モデル）において、ラット抗体のように種のバリアを考慮する必要が無い。一般に、ＣＤＲをマウス抗体のＦｃドメインに結合させることにより、マウスキメラ抗体をラット抗体から作製することもできるとはいえ、そのマウスキメラ抗体の産生にはＣＨＯ細胞などの抗体産生細胞にキメラ抗体発現ベクターを遺伝子導入して産生させることが必要であり、マウスキメラ抗体の大量精製にはマウス抗体をマウス腹水で産生させる場合と比べて経済的ではなく、実用に適さない。よって、本願発明のマウスモノクローナル抗体は、例えばヒト癌のマウス担癌モデルを用いた医薬組成物の開発に格別に利便性を有する。

図１は、Ｐ２−０抗体の合成ペプチドを用いた認識エピトープの絞り込みを示す図である。図２は、Ｐ２−０抗体が、濃度依存的にＡｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ−２相互作用を阻害することを示す図である。図３は、Ｐ２−０抗体が、血小板凝集抑制効果を有することを示す図である。図４は、Ｐ２−０抗体が、癌の肺転移抑制効果を有することを示す図である。図５は、ヒト化Ｐ２−０抗体（ヒト型キメラＰ２−０抗体）が、血小板凝集抑制効果を有することを示す図である。図６は、ヒト化Ｐ２−０抗体（ヒト型キメラＰ２−０抗体）が、癌の肺転移抑制効果を有することを示す図である。図７は、ヒト化Ｐ２−０抗体（ヒト型キメラＰ２−０抗体）が、Ａｇｇｒｕｓ低発現細胞（ＨＴ１０８０細胞）にも肺転移抑制効果を有することを示す図である。図８は、Ｐ２−０抗体が、ヒト膀胱癌細胞膜表面に発現しているＡｇｇｒｕｓを認識することを示すウェスタンブロット分析の図である。図９は、ＮＺ−１抗体とＰ２−０抗体とのＡｇｇｒｕｓ認識能の違いを示すウェスタンブロット分析の図である。図１０Ａは、ＮＺ−１抗体（図１０Ａ）とＰ２−０抗体（図１０Ｂ）とのＡｇｇｒｕｓ認識能の違いを示すＦＡＣＳ法におけるＮＺ−１抗体の解析結果の図である。図１０Ｂは、ＮＺ−１抗体（図１０Ａ）とＰ２−０抗体（図１０Ｂ）とのＡｇｇｒｕｓ認識能の違いを示すＦＡＣＳ法におけるＰ２−０抗体の解析結果の図である。図１１は、ＮＺ−１抗体とＰ２−０抗体との癌の肺転移抑制効果の違いを示す図である。図１２は、ＭＳ-１、ＭＳ-３およびＭＳ-４抗体がヒトＡｇｇｒｕｓを認識することを、ヒトＡｇｇｒｕｓ遺伝子を導入したＣＨＯ細胞株を用いたフローサイトメトリー解析により確認した図である。図１３は、アラニン変異型Ａｇｇｒｕｓタンパク質を用いたＰ２-０、ＭＳ-１、ＭＳ-３およびＭＳ-４抗体の認識エピトープの絞り込みを示す図である。図１４は、表面プラズモン共鳴を用いた組換えヒトＡｇｇｒｕｓタンパク質に対するＰ２-０、ＭＳ-１、ＭＳ-３およびＭＳ-４抗体の結合度を測定した図である。図１５は、Ｐ２-０、ＭＳ-１、ＭＳ-３およびＭＳ-４抗体がＡｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ−２相互作用を阻害することを示す図である。図１６は、Ｐ２-０、ＭＳ-１、ＭＳ-３およびＭＳ-４抗体が血小板凝集抑制効果を有することを示す図である。図１７は、ＭＳ-１抗体がヒトＡｇｇｒｕｓ発現細胞に対して抗腫瘍活性を発揮することを示す図である。図１８は、ＭＳ-１抗体がヒトＡｇｇｒｕｓ発現細胞の肺への自然転移を阻害することを示す図である。図１９は、ＭＳ−１およびＭＳ−３抗体がヒトＡｇｇｒｕｓ発現細胞の肺転移抑制効果を有することを示す図である。

Ａｇｇｒｕｓは、ｇｐ４４、ｐｏｄｏｐｌａｎｉｎ等としても知られている。

「抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体」は、Ａｇｇｒｕｓに特異的に結合するモノクローナル抗体または誘導体をいい、元の抗体と実質的に同じ抗原特異性を示す当該抗体の断片（本明細書中、「機能的断片」と呼ぶ）をも含むものとする。抗体の機能的断片には、Fab、Fab'、F(ab')₂、単鎖抗体（scFv）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（dsFv）、もしくはCDRを含むペプチドなどの抗体の機能的断片などが含まれる。本発明における抗体は、以下に詳述するように、動物、好ましくはマウスを免疫し、適切な細胞との融合によるハイブリドーマの作製のため脾臓細胞を回収することを含む、従来の方法により作製することができる。

Ａｇｇｒｕｓに対するマウスモノクローナル抗体の好適な例としては、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ;日本国〒305-8566 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１４４６として２０１１年２月１８日付で寄託されたハイブリドーマ、並びに受託番号ＦＥＲＭＢＰ-１１４４７、ＦＥＲＭＢＰ-１１４４８及びＦＥＲＭＢＰ-１１４４９として前記ＩＰＯＤに２０１１年１２月２８日付で寄託されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体が挙げられる。また、これと同等の結合特性を有する他の抗体も本発明の抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体として好ましい。

ヒト以外の動物の抗体を、遺伝子組換え技術を利用してヒト型キメラ抗体あるいはヒト型CDR移植抗体などとしたヒト化抗体もまた、本発明において有利に使用することができる。ヒト型キメラ抗体とは、抗体の可変領域（以下、V領域と表記する）がヒト以外の動物の抗体で、定常領域（以下、C領域と表記する）がヒト抗体である抗体であり（Morrison S.L. et al.、Proc Natl Acad Sci USA.81（21）,6851-6855,1984）、ヒト型CDR移植抗体とは、ヒト以外の動物の抗体のＶ領域中のCDRのアミノ酸配列をヒト抗体の適切な位置に移植した抗体である（Jones P.T. et al.、Nature,321（6069）,522-525,1986）。ヒト化抗体は、ヒトに投与した場合、ヒト以外の動物の抗体に比べ、副作用が少なく、その治療効果が長期間持続する。また、ヒト化抗体は、遺伝子組換え技術を利用して様々な形態の分子として作製することができる。

本発明は、別の態様において、本願発明のモノクローナル抗体又はその機能的断片からなるフラグメントを含む、Ａｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ−２結合阻害剤、及び血小板凝集抑制又は癌転移抑制、あるいは腫瘍又は血栓症の処置のための、本願発明のモノクローナル抗体又はその機能的断片からなるフラグメントを含む、医薬組成物を提供する。血栓症は、好ましくは脳梗塞又は心筋梗塞である。癌又は腫瘍は、好ましくは扁平上皮癌、繊維肉腫、中皮腫、カポジ肉腫、精巣腫瘍、脳腫瘍又は膀胱癌である。なお、本願明細書中、用語「癌」と「腫瘍」とは同じ意味を有する用語として使用される。

本発明の医薬組成物の剤型の種類としては、例えば、経口剤として錠剤、粉末剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、軟・硬カプセル剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、舌下剤、ペースト剤等、非経口剤として注射剤、坐剤、経皮剤、軟膏剤、硬膏剤、外用液剤等が挙げられ、当業者においては投与経路や投与対象等に応じた最適の剤型を選ぶことができる。有効成分としての抗Ａｇｇｒｕｓモノクローナル抗体は、製剤中０．１から９９．９重量％含有することができる。

本発明の薬剤の有効成分の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、患者（６０kgとして）に対して一日につき約０．１μg〜１０００mg、好ましくは約１．０μg〜１００mg、より好ましくは約１．０mg〜５０mgである。非経口的に投与する場合は、その一回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、患者（６０ｋｇに対して）、一日につき約０．０１から３０mg程度、好ましくは約０．１から２０mg程度、より好ましくは約０．１〜１０mg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。しかしながら、最終的には、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。
以下に実施例を挙げて、本願発明を詳細に説明する。

マウス抗ヒトＡｇｇｒｕｓモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
免疫原
ヒトＡｇｇｒｕｓｃＤＮＡのＴＴ６７９部位（位置３８〜５１の１４個のアミノ酸（配列番号２：Glu Gly Gly Val Ala Met Pro Gly Ala Glu Asp Asp Val Val）をクローニングし、ｐＧＥＸ−６Ｐ−３ベクター（GE Healthcare、英国バッキンガムシャー州）に８回反復してつないだ（TT679-repeat）。このベクターで大腸菌ＢＬ２１（Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド）を形質転換し、そしてＧＳＴタグ付け組換えタンパク質をGlutathione Sepharose（GE Healthcare）により精製した。

感作
６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールズリバー株式会社から購入し、常法に従って飼育）に、Freund's complete adjuvant（Difco Laboratories、ミシガン州デトロイト）を用いて上記で得られた免疫原を頸部皮下投与した。隔週での腹腔内投与により、追加免疫を行った。

ハイブリドーマ樹立
常法に従って、脾臓細胞を採取し、ポリエチレングリコール４０００（Merck、ニュージャージー州）を用いてマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１と融合させた。ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Sigma）で増殖させて、ハイブリドーマを選択した。その結果、１５クローンのハイブリドーマが樹立された。

マウス抗ヒトＡｇｇｒｕｓモノクローナル抗体の分析
ウェスタンブロットによる検証
上記で得られたハイブリドーマから得られる抗体のうち、Ｐ２−０という抗体を産生するハイブリドーマを、２０１１年２月１８日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１４４６を付された（受託番号ＦＥＲＭＰ−２２０６９と同一）。Ｐ２−０抗体は、フローサイトメトリー及びウェスタンブロット分析により、ヒトＡｇｇｒｕｓを認識することが示された。さらに、配列番号２で示されるアミノ酸配列が欠失したＡｇｇｒｕｓ変異体を作製してウェスタンブロット分析を行ったところ、Ｐ２−０抗体はこれを認識できなかった。

エピトープの探索
図１に示されるように、様々なペプチドを化学合成し、それらに対するＰ２−０抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法にて検討した。その結果、位置４４〜５２のアミノ酸配列（配列番号１）を有するペプチドに対して高い反応性が示された。

Ａｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ−２結合阻害試験
哺乳動物細胞から精製した組換えＡｇｇｒｕｓタンパク質及びＣＬＥＣ−２タンパク質を用いて、Ａｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ−２相互作用をＥＬＩＳＡ法により検出した。Ａｇｇｒｕｓ抗体の存在下での相互作用への影響を調べた。図２に示されるように、Ｐ２−０抗体は、濃度依存的にＡｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ−２相互作用を阻害することが見出された。

血小板凝集抑制試験
ＣＨＯ細胞及びＣＨＯ／ｍｏｃｋ細胞は、血小板凝集を引き起こせないことが知られているのに対し、Ａｇｇｒｕｓを発現したＣＨＯ／Ａｇｇｒｕｓ細胞は血小板凝集を引き起こした。光線透過率のモニタリングによるｉｎｖｉｔｒｏ血小板凝集分析において、反応開始時点から最大の半分の値の時点までの時間を比較した。図３に示されるように、Ｐ２−０抗体の添加により、Ａｇｇｒｕｓによる血小板凝集は濃度依存的に遅延されることが見出された。

肺転移抑制試験
静脈注射後、ヒトＡｇｇｒｕｓ遺伝子を導入したＣＨＯ細胞株のｉｎｖｉｖｏにおける実験的肺転移に対する抗体の影響を検討した。ＣＨＯ細胞は、Ａｇｇｒｕｓの強制発現により転移性となることが知られている。図４に示されるように、Ｐ２−０抗体は、０．１μｇ／匹といった非常に少量でも非常に強い肺転移抑制効果を示すことが明らかとなり、Ｐ２−０抗体はＡｇｇｒｕｓ中和活性だけでなく、Ａｇｇｒｕｓ依存的な血行性転移を阻害することも示された。

ヒト化抗体の作製と検証
実用可能とするために、Ｐ２−０抗体のＡｇｇｒｕｓ認識可変領域をクローニングし、定法に従ってヒトＩｇＧの定常領域に組み込んだヒト化Ｐ２−０抗体（ヒト型キメラＰ２−０抗体）を作製した。また、このヒト化Ｐ２−０抗体は、サルＡｇｇｒｕｓを認識することを確認した。さらに、このヒト化Ｐ２−０抗体は、元のＰ２−０抗体と同様に血小板凝集阻害活性（図５）及び癌の転移抑制効果（図６）を示すことも確認した。このヒト化Ｐ２−０抗体は、図７に示されるように、Ａｇｇｒｕｓ低発現細胞（ＨＴ１０８０細胞）にも癌転移抑制効果を示した。

Ａｇｇｒｕｓ関連癌の探索とラット抗Ａｇｇｒｕｓ抗体（ＮＺ−１抗体）との比較
本発明者らはさらに、Ａｇｇｒｕｓが膀胱癌でも高頻度に発現亢進していることを、膀胱癌の臨床サンプルより得られたｃＤＮＡ（OriGene社より市販されているTissueScan cDNA Panel）をテンプレートとしたreal-time PCR法により見いだした。

そこで、ウェスタンブロット分析により、ヒト膀胱癌に発現しているＡｇｇｒｕｓのＰ２−０抗体による認識を調べた。図８に示されるように、Ｐ２−０抗体は、各種ヒト膀胱癌細胞膜表面に発現しているＡｇｇｒｕｓ（レーン２〜５）を認識したのに対し、市販のＤ２−４０抗体（マウス抗ヒトＡｇｇｒｕｓモノクローナル抗体）は、ヒトＡｇｇｒｕｓ遺伝子を導入したＣＨＯ細胞株のみ（レーン１）を認識したが、ヒト膀胱癌細胞膜表面に発現しているＡｇｇｒｕｓを認識できないことが明らかとなった。さらに、ヒトＡｇｇｒｕｓ遺伝子を導入したＣＨＯ細胞株及び各種ヒト膀胱癌細胞株を、タンパク質分解酵素であるトリプシン処理の条件下（図９；レーン７〜９）あるいはトリプシン無処理の条件下（図９；レーン１２〜１５）で回収し、その細胞溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥし、Ｐ２−０抗体、ＮＺ−１抗体とタンパク質泳動量が揃っていることを確認するためのアクチン抗体でウェスタンブロット分析を行った。その結果、図９に示されるように、Ｐ２−０抗体はヒト膀胱癌細胞膜表面に発現しているＡｇｇｒｕｓタンパク質を認識したが、ＮＺ−１抗体はヒトＡｇｇｒｕｓを導入したＣＨＯ細胞に発現しているＡｇｇｒｕｓしか認識できず（図９；レーン６）、ヒト膀胱癌細胞膜表面に発現している野生型Ａｇｇｒｕｓを認識することができないことが明らかとなった。

本検討により、Ｐ２−０抗体はこれまでに知られていた抗ヒトＡｇｇｒｕｓ抗体（ＮＺ−１を含む）と比較して、生体で発現しているネイティブＡｇｇｒｕｓに対する反応性が強いことが実証され、Ｐ２−０抗体は多種類の癌で発現しているＡｇｇｒｕｓを認識できる抗体であることが示唆された。従って、Ｐ２−０抗体はＡｇｇｒｕｓをターゲットとした使用において、より優れた効果を有することが示唆された。

さらに、ＦＡＣＳ法により、上記ウェスタンブロット分析の結果を再現した。具体的には、ヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４をタンパク質分解酵素であるトリプシンを含まないＥＤＴＡのみで細胞回収し、その細胞に対してそれぞれＮＺ−１抗体又はそのコントロール抗体であるラット抗体を４℃で１時間反応させた。過剰な抗体をＰＢＳで洗浄した後、２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識された抗ラットＩｇＧ抗体を４℃で１時間反応させた。過剰な抗体をＰＢＳで洗浄した後、Beckman Coulter社のCytomics FC500フローサイトメーターで解析した。結果を、図１０Ａに示す。

他方、上記回収したヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４に対してそれぞれＰ２−０抗体又はそのコントロール抗体であるマウス抗体を４℃で１時間反応させた。過剰な抗体をＰＢＳで洗浄した後、２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識された抗マウスＩｇＧ抗体を４℃で１時間反応させた。過剰な抗体をＰＢＳで洗浄した後、同様にフリーサイトメーターで解析した。結果を、図１０Ｂに示す。図１０Ａ及びＢに示されるように、ＮＺ−１抗体はヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４に発現しているＡｇｇｒｕｓを認識しなかったが、Ｐ２−０抗体は認識していた。

ヒトＡｇｇｒｕｓ遺伝子を導入したＣＨＯ細胞株のｉｎｖｉｖｏにおける実験的肺転移に対するＰ２−０抗体とＮＺ−１抗体の作用を比較した。図１１に示されるように、Ｐ２−０抗体は、マウス１匹当たり０．０１μｇ、０．００１μｇといった非常に少量でもコントロール抗体投与群と比較して有意に肺転移抑制効果を示すが、ＮＺ−１抗体は、０．１μｇ／匹では有意な転移抑制効果を示すが、０．０１μｇ／匹、０．００１μｇ／匹といった少量ではコントロール抗体と比較して有意な抑制効果を示せないことが明らかとなった。よって、Ｐ２−０抗体はＮＺ−１抗体と比較して強い血行性転移阻害活性を持つことが明らかとなった。従って、Ｐ２−０抗体は、Ａｇｇｒｕｓ認識およびＡｇｇｒｕｓ機能抑制において優れた効果を有する抗体であり、実験的・臨床的使用において有利であることが見出された。

マウス抗ヒトＡｇｇｒｕｓモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
免疫原
ヒトＡｇｇｒｕｓｃＤＮＡのＰＰ４２６２部位（位置４２〜６２の２１個のアミノ酸（配列番号５：Ala Met Pro Gly Ala Glu Asp Asp Val Val Thr Pro Gly Thr Ser Glu Asp Arg Tyr Lys Ser））を１８回繰り返したものをｐＧＥＸ-６Ｐ３ベクター（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）にクローニングした。このベクターで大腸菌ＢＬ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換し、ＧＳＴタグ融合組み換えタンパク質をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製した。

感作
６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールズリバー株式会社から購入し、常法に従って飼育）に、ＴｉｔｅｒＭａｘＧｏｌｄ（ＴｉｔｅｒＭａｘＵＳＡ，Ｉｎｃ．）を用いて上記で得られた免疫原を頸部皮下投与した。隔週での腹腔内投与により、追加免疫を行った。

ハイブリドーマ樹立
常法に従って脾臓細胞を採取し、ポリエチレングリコール４０００（Ｍｅｒｃｋ）を用いてマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１と融合させた。ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含むエス・クロンクローニングメディウム（エーディア株式会社）で増殖させて、ハイブリドーマを選択した。その結果、複数個のハイブリドーマが樹立された。

マウス抗ヒトＡｇｇｒｕｓモノクローナル抗体の分析
フローサイトメトリー解析による検証
上記のハイブリドーマから得られる抗体のうちＭＳ-１、ＭＳ-３およびＭＳ-４という抗体を産生するハイブリドーマを、２０１１年１２月２８日に、それぞれ受託番号ＦＥＲＭＢＰ-１１４４７、ＦＥＲＭＢＰ-１１４４８およびＦＥＲＭＢＰ-１１４４９として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。なお、ＭＳ-１、ＭＳ-３およびＭＳ-４抗体がヒトＡｇｇｒｕｓを認識することは、ヒトＡｇｇｒｕｓ遺伝子を導入したＣＨＯ細胞株を用いたフローサイトメトリー解析により確認した。具体的には、ヒトＡｇｇｒｕｓ遺伝子を安定的に遺伝子導入したＣＨＯ細胞を培養容器から回収し、ＰＢＳで洗浄した後２ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に調整したところに、ＭＳ-１、ＭＳ-３およびＭＳ-４抗体を処理し３０分間氷上で反応させた。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識された抗マウスＩｇＧ抗体を処理し氷上で３０分間反応させた。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、ＣｙｔｏｍｉｃｓＦＣ５００（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）で解析を行った。解析結果を図１２に示す。

エピトープの探索
ヒトＡｇｇｒｕｓｃＤＮＡからシグナルペプチドに相当するコドンを除去したものをｐＧＥＸ-６Ｐ３ベクターへクローニングし、３７から６２番目のアミノ酸に相当するコドンをＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＳｉｔｅ-ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて１個所ずつアラニンに対応するコドンへと置換することにより、各種アラニン変異型Ａｇｇｒｕｓ発現ベクターを作製した。作製したベクターを用いて大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換して培養した後、大腸菌破砕液をサンプルとしてウェスタンブロット法を行うことにより、組換えヒトＡｇｇｒｕｓタンパク質に対するＰ２-０、ＭＳ-１、ＭＳ-３およびＭＳ-４抗体の反応性を検討した。その結果、図１３上段に示されるように、Ｐ２-０抗体はヒトＡｇｇｒｕｓタンパク質の４５番目のグリシン、４８番目のアスパラギン酸および４９番目のアスパラギン酸に対して高い反応性を示し、配列番号１で示すアミノ酸配列を認識することが確認された。ＭＳ-１抗体は、ヒトＡｇｇｒｕｓタンパク質の４５番目のグリシンおよび４８番目のアスパラギン酸に対して高い反応性を示し、配列番号１で示すアミノ酸配列を認識することが確認された。ＭＳ-３抗体は、ヒトＡｇｇｒｕｓタンパク質の５４番目のグリシン、５５番目のスレオニンおよび５８番目のアスパラギン酸に対して高い反応性を示し、配列番号３で示すアミノ酸配列を認識することが確認された。ＭＳ-４抗体は、ヒトＡｇｇｒｕｓタンパク質の５３番目のプロリン、５５番目のスレオニン、５７番目のグルタミン酸、５８番目のアスパラギン酸および６１番目のリジンに対して高い反応性を示し、配列番号４で示すアミノ酸配列を認識することが確認された。なお、Ｐ２-０、ＭＳ-１、ＭＳ-３およびＭＳ-４抗体の認識エピトープの模式図を図１３下段に示す。ヒトＡｇｇｒｕｓ一次配列中の認識エピトープのうち、白抜き文字で示したアミノ酸が抗体の認識部位であり、楕円と重なる部位は抗体がヒトＡｇｇｒｕｓを認識する際に重要な領域を示す。

表面プラズモン共鳴を用いた組換えヒトＡｇｇｒｕｓタンパク質に対する抗体の結合度測定
Ｐ２-０、ＭＳ-１、ＭＳ-３およびＭＳ-４抗体の組換えヒトＡｇｇｒｕｓタンパク質に対する結合度測定は、表面プラズモン共鳴解析装置ＢｉａｃｏｒｅＸ１００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いた。カルボキシメチルデキストランコート処理が施されたセンサーチップＣＭ５上にアミンカップリング法を用いて組換えヒトＡｇｇｒｕｓタンパク質を固定化し、約２，０００ＲＵ相当の固定化量を得た。２５度、３０マイクロリットル／ｍｉｎの流速の条件下、ＨＢＳ-ＥＰ＋ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０）を流路に満たして測定を行った。ＨＢＳ-ＥＰ＋ｂｕｆｆｅｒを用いてＰ２-０、ＭＳ-１、ＭＳ-３およびＭＳ-４抗体溶液を１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭおよび６．２５ｎＭに各々希釈し、組換えヒトＡｇｇｒｕｓタンパク質が固定化されたセンサーチップＣＭ５上に６０秒間流して結合反応を観察し、引き続きＨＢＳ-ＥＰ＋ｂｕｆｆｅｒを１２０秒間流して解離反応を観察した。測定により得られたセンサーグラムをもとにＢｉａｃｏｒｅＸ１００ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓｏｆｔｗａｒｅｂｉｖａｌｅｎｔａｎａｌｙｔｅｍｏｄｅｌを用いて解析を行い、解離定数Ｋ_Ｄ値を算出した。図１４に示されるように、組換えヒトＡｇｇｒｕｓタンパク質に対するＰ２-０抗体の解離定数は９．３ｘ１０^-９Ｍ、ＭＳ-１抗体の解離定数は９．０ｘ１０^-９Ｍ、ＭＳ-３抗体の解離定数は６．３ｘ１０^-８Ｍ、ＭＳ-４抗体の解離定数は２．０ｘ１０^-６Ｍであった。

Ａｇｇｒｕｓ-ＣＬＥＣ-２結合阻害試験
哺乳動物細胞から精製した組換えＡｇｇｒｕｓタンパク質およびＣＬＥＣ-２タンパク質を用いて、Ａｇｇｒｕｓ-ＣＬＥＣ-２相互作用をＥＬＩＳＡ法により検出した。また、抗Ａｇｇｒｕｓ抗体がＡｇｇｒｕｓ-ＣＬＥＣ-２相互作用に与える影響を検討した。図１５上段に示されるように、Ｐ２-０およびＭＳ-１抗体は、処理濃度依存的にＡｇｇｒｕｓ-ＣＬＥＣ-２相互作用を阻害することが示された。また、図１５下段に示されるように、ＭＳ-３およびＭＳ-４抗体は４０マイクログラム／ｍｌもしくは８０マイクログラム／ｍｌと高濃度で処理することにより、Ａｇｇｒｕｓ-ＣＬＥＣ-２相互作用を阻害することが示された。

血小板凝集抑制試験
血小板凝集を引き起こさない細胞株であるＣＨＯ細胞にヒトＡｇｇｒｕｓ遺伝子を導入すれば、血小板凝集を引き起こすようになることが知られている。ＭＣＭＨＥＭＡＴＲＡＣＥＲ３１３Ｍ（エム・シー・メディカル）を用いた光透過率のモニタリングによるｉｎｖｉｔｒｏ血小板凝集分析を行い、反応開始時点から最大凝集率の５０％に至るまでの時間を比較した。図１６に示されるように、ヒトＡｇｇｒｕｓ導入ＣＨＯ細胞により誘導される血小板凝集は、コントロール抗体（マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社カタログ番号Ｉ５３８１をＰＢＳ透析したもの））存在下では反応開始から２〜３．５分で５０％凝集率に到達するのに対し、Ｐ２-０抗体存在下では反応開始から１１〜１９分後に遅延した。また、ＭＳ-１抗体存在下では、反応開始から９分後、ＭＳ-３抗体存在下では反応開始から１４．５分後、ＭＳ-４抗体存在下では反応開始から１０分後に遅延した。このことから、Ｐ２-０、ＭＳ-１、ＭＳ-３およびＭＳ-４抗体はＡｇｇｒｕｓ依存的な血小板凝集を阻害する活性を有することが示された。

抗腫瘍活性試験
ＢＡＬＢ／ｃ-ｎｕ／ｎｕヌードマウス１２匹の背部皮下にヒトＡｇｇｒｕｓ遺伝子を導入したＣＨＯ細胞株を１ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／匹の細胞数で移植し、６匹２群にわけた。細胞移植を行った日をＤａｙ０とし、Ｄａｙ１、Ｄａｙ５およびＤａｙ９の合計３回にわたりコントロール抗体（マウスＩｇＧ２ａ（Ｓｉｇｍａ社カタログ番号Ｍ９１４４をＰＢＳ透析したもの））およびＭＳ-１抗体を各群に投与した。なお、１回の抗体投与量は３０マイクログラム／匹とし、投与経路には尾静脈を採用した。腫瘍体積を１週間に２回測定し、皮下移植から３０日後まで測定することにより、ＭＳ-１抗体の抗腫瘍効果を検討した。その結果、図１７のグラフに示されるように、コントロール抗体投与群では６匹中５匹のマウスにおいて腫瘍の増殖が観察され、Ｄａｙ３０における平均腫瘍体積は約１２００ｍｍ^３であった。一方、ＭＳ-１抗体投与群では６匹中２匹のマウスにおいて腫瘍の消失、３匹のマウスにおいて腫瘍の増殖抑制が観察され、Ｄａｙ３０における平均腫瘍体積は４００ｍｍ^３であった。このことから、ＭＳ-１抗体はヒトＡｇｇｒｕｓ発現細胞に対して抗腫瘍活性を発揮することが示された。なお、Ｄａｙ１８におけるマウスと腫瘍の様子を図１７右側に写真で示す。マウスに記された１から６までの数字は、各グラフの１から６までの凡例に対応している。

肺への自然転移阻害試験
ヒトＡｇｇｒｕｓを導入したＣＨＯ細胞を皮下移植した場合、移植後３０日程度で肺への自然転移が観察されることが知られている。そこで、抗腫瘍活性試験を実施した１２匹のマウスの肺を細胞移植後３０日目に摘出し、ＰＢＳ洗浄後に飽和ピクリン酸溶液で染色し、肺表面に生じた転移結節数をカウントした。図１８上側にカウントした転移結節数を記したグラフを、下側にピクリン酸染色したマウスの肺の写真を示す。コントロール抗体（マウスＩｇＧ２ａ（Ｓｉｇｍａ社カタログ番号Ｍ９１４４をＰＢＳ透析したもの））投与群では平均３０個程度の肺転移結節が観察されたのに対し、ＭＳ-１抗体投与群では６匹中５匹において肺転移結節の形成が完全に阻害された。このことから、ＭＳ-１抗体はヒトＡｇｇｒｕｓ依存的な肺への自然転移を阻害する活性を有していることが示された。

肺転移抑制試験
ヒトＡｇｇｒｕｓを導入したＣＨＯ細胞をＢＡＬＢ／ｃ-ｎｕ／ｎｕヌードマウスの尾静脈より注射すると、約２０日後に肺転移結節を形成することが知られている。そこで、細胞注射の前日にコントロール抗体（マウスＩｇＧ２ａ（Ｓｉｇｍａ社カタログ番号Ｍ９１４４をＰＢＳ透析したもの））、ＭＳ-１抗体およびＭＳ-３抗体を尾静脈経路で各群８匹のヌードマウスに投与し、Ａｇｇｒｕｓ依存的な実験的肺転移に与える影響を検討した。図１９に示されるように、ＭＳ-１およびＭＳ-３抗体を事前投与することにより、濃度依存的にヒトＡｇｇｒｕｓ導入ＣＨＯ細胞の肺転移が顕著に抑制された。従って、ＭＳ-１およびＭＳ-３抗体はＡｇｇｒｕｓ中和活性があるだけでなく、Ａｇｇｒｕｓ依存的な血行性転移を阻害することも示された。

ＦＥＲＭＢＰ−１１４４６
ＦＥＲＭＢＰ−１１４４７
ＦＥＲＭＢＰ−１１４４８
ＦＥＲＭＢＰ−１１４４９

Claims

配列番号１、３又は４により表されるアミノ酸配列をエピトープとし、
Ａｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ-２の相互作用を干渉することを特徴とする抗Ａｇｇｒｕｓマウスモノクローナル抗体又はその機能的断片からなるフラグメント。
受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１４４６、ＦＥＲＭＢＰ-１１４４７、ＦＥＲＭＢＰ-１１４４８又はＦＥＲＭＢＰ-１１４４９のハイブリドーマにより産生される請求項１記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片からなるフラグメント。
請求項１又は２記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片からなるフラグメントを
ヒト化したことを特徴とするモノクローナル抗体又はその機能的断片からなるフラグメント。
受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１４４６、ＦＥＲＭＢＰ−１１４４７、ＦＥＲＭＢＰ−１１４４８又はＦＥＲＭＢＰ−１１４４９のハイブリドーマ。
請求項１〜３のいずれか一項記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片からなるフラグメントを含む、Ａｇｇｒｕｓ−ＣＬＥＣ−２結合阻害剤。
血小板凝集抑制又は癌転移抑制、あるいは腫瘍又は血栓症の処置のための、請求項１〜３のいずれか一項記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片からなるフラグメントを含む、医薬組成物。
血栓症が、脳梗塞又は心筋梗塞である、請求項６記載の医薬組成物。
癌又は腫瘍が、扁平上皮癌、繊維肉腫、中皮腫、カポジ肉腫、精巣腫瘍、脳腫瘍又は膀胱癌である、請求項６記載の医薬組成物。
癌又は腫瘍が、扁平上皮癌、中皮腫、精巣腫瘍又は膀胱癌である、請求項８記載の医薬組成物。