ES2566133T3 - Anticuerpos monoclonales de ratón anti-Aggrus - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal de ratón o un fragmento funcional del mismo, que reconoce un epítopo de Aggrus que comprende una secuencia de aminoácidos representada por una ID de Secuencia 1, 3 o 4.

Description

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Además, cuando se llevó a cabo la transferencia western utilizando mutantes de Aggrus preparados con una ID de secuencia de aminoácidos 2 deficiente, el mAb P20 no podía reconocer a los mismos.

Realización 3 5 Exploración del epítopo

Como se muestra en la Figura 1, se examinó la reactividad del mAb P20 con varios péptidos por síntesis química por el método ELISA. Como resultado, el mAb P20 mostraba una alta reactividad contra un péptido que contenía una secuencia de 4452 aminoácidos (ID de Secuencia 1).

Realización 4

Ensayo de inhibición de la interacción entre AggrusCLEC2

15 Utilizando proteínas Aggrus y CLEC2 recombinantes preparadas a partir de células de mamífero, se detectó la interacción entre AggrusCLEC2 por el método de ELISA. Los efectos de la interacción entre AggrusCLEC2 se examinaron bajo la presencia de mAb contra Aggrus. Como se muestra en la Figura 2, el mAb P20 inhibía la interacción AggusCLEC2 de una manera que dependía de la concentración.

Realización 5

Ensayo de inhibición de la agregación plaquetaria

25 Aunque se sabía que las células CHO parentales y CHO/falsas eran incapaces de inducir agregación plaquetaria, las células CHO que sobreexpresan Aggrus (CHO/Aggrus) inducían agregación plaquetaria. En un análisis de agregación plaquetaria in vitro controlando la transmitancia lumínica, se comparó el tiempo desde el punto de inicio de la reacción hasta alcanzar la mitad del punto del valor máximo. Como se muestra en la Figura 3, la agregación plaquetaria inducida por Aggrus se atenuó con la adición del anticuerpo P20 de una manera que dependía de la concentración.

Realización 6

Ensayo de inhibición de la metástasis pulmonar

35 Se examinaron los efectos de los mAb sobre la metástasis pulmonar experimental in vivo de células CHO inyectadas por vía intravenosa a las que se había introducido un gen Aggrus humano. Se sabe que las células CHO muestran la capacidad de metástasis a partir de la expresión forzada de Aggrus. Como se muestra en la Figura 4, el mAb P20 muestra una actividad inhibidora de la metástasis pulmonar extremadamente alta con la administración concurrente de cantidades extremadamente pequeñas tales como de 0,1 mg/ratón, lo que indica que el mAb P20 poseía una actividad inhibidora de metástasis hematógena dependiente de Aggrus así como una capacidad de neutralizar a Aggrus.

Realización 7

45 Generación y verificación del anticuerpo humanizado (quimérico murino/humano)

Con el fin de poner en uso práctico, se generó un anticuerpo P20 humanizado (anticuerpo P20 quimérico murino/humano) clonando la región variable de P20 y uniendo la misma según el procedimiento común con la región constante de una IgG1 humana. Se confirmó que el anticuerpo P20 humanizado (anticuerpo P20 quimérico murino/humano) reconocía el Aggrus de simio. Al igual que el anticuerpo P20 original, el anticuerpo P20 humanizado (anticuerpo P20 quimérico murino/humano) mostraba inhibición de la agregación plaquetaria (Fig. 5) y actividad inhibidora de la metástasis (Fig. 6). Como se muestra en la Figura 7, el anticuerpo P20 humanizado (anticuerpo P20 quimérico murino/humano) también muestra actividad inhibidora de metástasis en células que

55 expresan poco Aggrus (células HT1080).

Realización 8

Exploración de un cáncer que expresa Aggrus y comparación del mAb antiAggrus de rata (anticuerpo NZ1)

Por el método de PCR en tiempo real utilizando moldes de ADNc (Panel TissueScan cDNA disponible en el comercio en OriGene) que se prepararon a partir de muestras clínicas de cáncer de vejiga, frecuentemente se identificó la regulación positiva de la expresión de Aggrus en el cáncer de vejiga.

65 Por lo tanto, se examinó por transferencia western el reconocimiento del mAb P20 contra la proteína Aggrus que se expresa en las células de cáncer de vejiga humano. Como se muestra en la Figura 8, el mAb P20 reconocía la

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Realización 10

Análisis de mAb de ratón antiAggrus humano. Verificación por citometría de flujo

5 Entre los anticuerpos que se obtuvieron a partir de los hibridomas mencionados anteriormente, se depositaron los hibridomas que producían el mAb MS1, MS3, o MS4 en el Organismo Depositario de Patentes Internacionales del Instituto Nacional del Tecnología y Evaluación el 28 de diciembre de 2011 (con los ID de depósito asignados FERM BP11447, FERM BP11448, y FERM BP11449 respectivamente). Se confirmó que MS1, MS3 y MS4 reconocían el Aggrus humano por análisis de citometría de flujo utilizando células CHO en las que se había introducido un gen Aggrus humano. Específicamente, las células CHO transfectadas establemente con un gen Aggrus humano se recolectaron del recipiente de cultivo, y tras un lavado con PBS y el ajuste a una concentración celular de 2 x 106 células/ml, se incubaron con los mAb MS1, MS3 y MS4 durante 30 min en hielo. Tras el lavado de las células con PBS, las células se incubaron con antiIgG de ratón marcado con Alexa flúor 488 y se dejaron reaccionar durante 30 min en hielo. Tras lavar las células tres veces con PBS, se llevó a cabo el análisis en un Cytomics FC500 (Beckman

15 Coulter). Los resultados se muestran en la Figura 12.

Realización 11

Análisis del epítopo

Clonando el ADNc de Aggrus humano al que se había retirado el codón correspondiente al péptido de señal en el vector pGEX6P3, y remplazando uno a uno el codón correspondiente a los aminoácidos 37 a 62 con el codón correspondiente de alanina utilizando el kit de mutagénesis de sitio dirigido QuickChange (Stratagene), se prepararon distintos vectores que expresaban variantes de alanina de Aggrus. Se transfectaron E. coli TOP 10F’ con 25 cada vector, y se preparó la muestra homogeneizada tras el cultivo utilizando estas muestras, se llevó a cabo la transferencia western y se analizó la reactividad de la proteína Aggrus recombinante para P20, MS1, MS3, y MS4, respectivamente. Como resultado, como se muestra en el panel superior de la Figura 13, el mAb P20 mostraba una alta reactividad contra Gly45, Asp48, y Asp49 de la proteína Aggrus humana, lo que indica que el mAb P20 reconoce la secuencia de aminoácidos que se muestra en la ID de Secuencia 1. El mAb MS1 mostraba una alta reactividad contra Gly45 y Asp48 de la proteína Aggrus humana, lo que indica que el mAb MS1 reconoce la secuencia de aminoácidos que se muestra en la ID de Secuencia 1. El mAb MS3 mostraba una alta reactividad a Gly54, Thr55, y Asp58 de la proteína Aggrus humana, lo que indica que el mAb MS3 reconoce la secuencia de aminoácidos que se muestra en la ID de Secuencia 3. El mAb MS4 mostraba una alta reactividad contra Pro53, Thr55, Glu57, Asp58, y Lys61 de la proteína Aggrus humana, lo que indica que el mAb MS4 reconoce la secuencia de aminoácidos que se muestra en la ID de Secuencia 4.

35 Se muestra una vista esquemática del reconocimiento del epítopo de los anticuerpos P20, MS1, MS3, y MS4 en el panel inferior de la Figura 13. En el reconocimiento del epítopo de la secuencia primaria de Aggrus humana, los aminoácidos que se muestran en letra negrita blanca son los sitios de reconocimiento de los mAb. Los sitios solapados por elipses muestran las regiones críticas de reconocimiento por los anticuerpos de la Aggrus humana.

Realización 12

Afinidad de unión de los anticuerpos a la proteína Aggrus recombinante humana utilizando resonancia de plasmón superficial

45 Se llevó a cabo la medición de la afinidad de unión a la proteína Aggrus recombinante humana de P20, MS1, MS3 y MS4 utilizando el analizador de resonancia de plasmones superficiales sistema Biacore X100 (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). La proteína Aggrus recombinante se unió covalentemente a un chip sensor CM5 revestido con carboximetil dextrano por el método de acoplamiento de amina. Los niveles finales de inmovilización eran aproximadamente de 2000 unidades de respuesta. Todos los experimentos se llevaron a cabo a 25 °C con un caudal constante de 30 µl/min, con tampón HBSEP+ (10 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,05 % v/v de Tensioactivo P20). Los anticuerpos P20, MS1, MS3, y MS4 se diluyeron utilizando el tampón HBSEP+ a 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM y 6,25 nM, respectivamente, se pasaron sobre el chip sensor CM5 con la proteína Aggrus recombinante humana inmovilizada durante 60 segundos, para observar la reacción de unión, y se pasó el tampón HBSEP+ solo durante 120 segundos para observar la reacción de disociación. Se analizaron los

55 sensorgramas que se obtuvieron de las mediciones utilizando el software de evaluación Biacore X100 de modelos de analitos bivalentes, y se determinó la constante de disociación (KD). Como se muestra en la Figura 14, la constante de disociación de P20 con la proteína Aggrus recombinante humana era de 9,3 x 109 M, la constante de disociación de MS1 era de 9,0 x 109, la constante de disociación de MS3 era de 6,3 x 109 M, y la constante de disociación del mAb MS4 era de 2,0 x 106 M, respectivamente.

Realización 13

Ensayo de inhibición de la interacción entre AggrusCLEC2

65 Utilizando proteínas Aggrus y CLEC2 recombinantes preparadas a partir de células de mamífero, se detectó la interacción entre AggrusCLEC2 por el método ELISA. Se examinaron los efectos de los mAb antiAggrus contra la

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