CN104093741B - 小鼠抗Aggrus单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供识别由序列号1、3或4所示的氨基酸序列构成的Aggrus的抗原决定簇的小鼠单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段、由保藏号FERM BP‑11446、FERM BP‑11447、FERM BP‑11448或FERM BP‑11449的杂交瘤产生的单克隆抗体或其功能性片段。本发明提供上述杂交瘤、包含上述单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段的Aggrus‑CLEC‑2结合抑制剂、以及用于抑制血小板凝集或抑制癌转移或者处置肿瘤或血栓病的医药组合物。

Description

小鼠抗Aggrus单克隆抗体
技术领域
本发明涉及小鼠抗Aggrus单克隆抗体。
背景技术
血小板凝集诱导因子Aggrus（已知作为podoplanin，gp44等）为I型膜贯通蛋白质，公开了在鳞状细胞癌、间皮瘤、卡波氏肉瘤、睾丸肿瘤和脑肿瘤等各种各样类型的癌症中表达增加（非专利文献1～9）。有报告指出：Aggrus的过量表达与预后不良有关，暗示Aggrus对癌演进的重要的作用（非专利文献10、11）。已知Aggrus的表达引起血小板凝集，会促进小鼠的实验的自发肺转移（非专利文献11、12）。有文献认为导入抑制血小板凝集的点突变，会减弱肺转移的形成，因此Aggrus的血小板凝集诱导活性与转移形成直接相关（非专利文献11、12）。癌细胞诱导血小板凝集，被认为形成大的癌-血小板凝集，会造成在微小血管体系中的癌细胞的栓塞形成增大，保护循环中不受免疫学的攻击。最近，将血小板上表达的C型凝集素样受体（CLEC-2）特别规定为Aggrus的配对受体（Counterpart receptor）中的一种。已知当CLEC-2与在肿瘤细胞上表达的Aggrus结合，即使没有血浆成分，也会在血小板发出活化信号，成为血小板凝集的诱因。相互识别地确定的Aggrus和CLEC-2的区域已经已知（非专利文献13）。
单克隆抗体能够与细胞表面抗原牢固地特异性结合，能够在靶细胞引发免疫学上的应答。因此，现在，许多单克隆抗体用于癌症治疗。癌症治疗中使用的单克隆抗体通过中和、抗体依赖性细胞毒性（antibody-dependent cellular cytotoxicity：ADCC）和补体依赖性细胞毒性（complement-dependent cytotoxicity：CDC）的3个代表性作用方式显示抗癌效果。以贝伐单抗（Bevacizumab）、西妥昔单抗（Cetuximab）为代表的那样，抗体能够抑制配体-受体结合或受体多聚体化、中和信号通路的活化。癌细胞的增殖依赖于信号通路的活化，因此，通过其中和导致细胞死亡。另一方面，以利妥昔单抗（Rituximab）或曲妥珠单抗（Trastuzumab）为代表的那样，抗体能够通过其的Fc区诱导对于靶标癌细胞的免疫应答。巨噬细胞、NK细胞和中性粒细胞等效应细胞和补体识别与癌特异性抗原结合的抗体的Fc区，其结果杀死靶标癌细胞。这三个作用方式，通过抗体的同型或亚类、抗原的特征或识别部位进行规定。
至此，确定了对Aggrus的多个抗体，但是，其大部分是不能干涉Aggrus-CLEC-2的相互作用的抗体。被命名为NZ-1的大鼠抗体，已知作为能够抑制Aggrus-CLEC-2的相互作用和血小板凝集的Aggrus抗体（非专利文献14），但是由于种的屏障（barrier）的原因，存在用通常使用的小鼠的癌模型无法准确地调查等的问题。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Kato Y,Kaneko M,Sata M,Fujita N,Tsuruo T,Osawa M.Enhancedexpression of Aggrus(T1α/podoplanin),a platelet-aggregation-inducing factorin lung squamous cell carcinoma.Tumor Biol2005;26:195-200.
非专利文献2：Martin-Villar E,Scholl FG,Gamallo C etal.Characterization of human PA2.26 antigen(T1α-2,podoplanin),a smallmembrane mucin induced in oral squamous cell carcinomas.Int J Cancer 2005;113:899-910.
非专利文献3：Yuan P,Tenam S,EI-Naggar A et al.Overexpression ofpodoplanin in oral cancer and its association with poor clinicaloutcome.Cancer2006;107:563-569.
非专利文献4：Wicki A.Lehembre F,Wick N,Hantusch B,KerjaschkiD.Christofori G.Tumor invasion in the absence of epithelial-mesenchymaltransition:podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton.CancerCell 2006;9:261-272.
非专利文献5：Kimura N,Kimura I.Podoplanin as a marker formesothelioma.Pathol Int 2005;55:83-86.
非专利文献6：Fukunaga M.Expression of D2-40 in lymphatic endotheliumof normal tissues and in vascular tumours.Histopathology 2005;46:396-402.
非专利文献7：Kato Y,Sasagawa I,Kaneko M,Osawa M,Fujita N,TsuruoT.Aggrus:a diagnostic marker that distinguishes seminoma from embryonalcarcinoma in testicular germ cell tumors.Oncogene2004;23:8552-8556.
非专利文献8：Mishima K,Kato Y,Kaneko MK et al.Podoplanin expression inprimary central nervous system germ cell tumors:a useful histological markerfor the diagnosis of germinoma.Acta Neuropathol 2006;111:563-568.
非专利文献9：Mishima K,Kato Y,Kaneko MK,Nishikawa R,Hirose T,MatsutaniM.Increased expression of podoplanin in malignant astrocytic tumors as anovel molecular marker of malignant progression,Acta Neuropathol2006;111:483-488.
非专利文献10：Yuan P,Teman S,EL-Naggar A,Zhou X,Liu DD,Lee JJ,Mao L,Overexpression of podoplanin in oral cancer and its association with poorclinical outcome.Cancer.2006;107:563-569.
非专利文献11：Kunita A.Kashima TG,Morishita Y,Fukayama M,Kato Y,TsuruoT,Fujita N,The platelet aggregation-inducing factor aggrus/podoplaninpromotes pulmonary metastasis.Am J Pathol.2007;170:1337-1347.
非专利文献12：Kato Y,Fujita N,Kunita A,Sato S,Kaneko M,Osawa M,TsuruoT.Molecular identification of Aggrus/T1alpha as a platelet aggregation-inducing factor expressed in colorectal tumors.J Biol Chem.2003;278:51599-51605.
非专利文献13：Kato Y,Kaneko MK,Kunita A et al.Molecular analysis ofthe pathophysiological binding of the platelet aggregation-inducing factorpodoplanin to the C-type lectin-like receptor CLEC-2.Cancer Sci2008;99:54-61.
非专利文献14：Kato Y,Kaneko MK,Kuno A et al.Inhibition of tumor cell-induced platelet aggregation using a novel anti-podoplanin antibody reactingwith its platelet-aggregation-stimulating domain.Biochem Biophys ResCommun2006;349:1301-1307.
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于提供一种将Aggrus作为靶标用于处置癌症和血栓病的医药组合物。
用于解决课题的方法
本发明的发明人等进行了潜心研究的结果，构建了产生能够抑制Aggrus-CLEC-2相互作用和血小板凝集的单克隆抗体的杂交瘤。发现从该杂交瘤产生的抗体，显示出识别由序列号1（Pro Gly Ala Glu Asp Val Val Thr）、序列号3（Pro Gly Thr Ser Glu Asp）或序列号4（Pro Gly Thr Ser Glu Asp Arg Tyr Lys）所示的氨基酸序列构成的Aggrus的抗原决定簇（epitope）、依赖于浓度地抑制Aggrus-CLEC-2的结合、抑制血小板凝集和抑制癌的肺转移的效果，从而完成了本发明。
即，本发明提供一种小鼠单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段（1），其识别由序列号1、3或4所示的氨基酸序列构成的Aggrus的抗原决定簇。
另外，本发明提供上述（1）所述的单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段（2），其是由保藏号FERM BP-11446、FERM BP-11447、FERM BP-11448或FERM BP-11449的杂交瘤产生的。
此外，本发明还提供上述（1）或（2）所述的单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段（3），其被人化。
本发明提供保藏号FERM BP-11446、FERM BP-11447、FERM BP-11448或FERM BP-11449的杂交瘤（4）。
本发明提供一种Aggrus-CLEC-2结合抑制剂（5），其包含上述（1）～（3）中任一项所述的单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段。
本发明提供一种医药组合物（6），其用于抑制血小板凝集或抑制癌转移或者处置肿瘤或血栓病，该医药组合物包含上述（1）～（3）中任一项所述的单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段。
此外，本发明还提供上述（6）所述的医药组合物（7），其中，血栓病为脑梗塞或心肌梗塞。
此外，本发明提供一种上述（6）所述的医药组合物（8），其中，癌或肿瘤为鳞状细胞癌、纤维肉瘤、间皮瘤、卡波氏肉瘤、睾丸肿瘤、脑肿瘤或膀胱癌。
优选本发明提供上述（8）所述的医药组合物（9），其中，癌或肿瘤为鳞状细胞癌、间皮瘤、睾丸肿瘤或膀胱癌。
发明的效果
由本发明的发明人等构建的杂交瘤产生的被命名为P2-0、MS-1、MS-3、MS-4的小鼠单克隆抗体，通过体内（in vivo）和体外（in vitro）分析可知，识别由序列号1、3或4所示的氨基酸序列构成的Aggrus的抗原决定簇，浓度依赖性地抑制Aggrus-CLEC-2的结合。此外，本申请发明的单克隆抗体还显示血小板凝集抑制效果和癌的肺转移抑制效果。本申请发明的单克隆抗体的人化抗体（人型嵌合抗体）在Aggrus低表达细胞中也显示癌转移抑制效果。本申请发明的单克隆抗体，相比于已知的大鼠的单克隆抗体，对生物体内表达的天然（native）的Aggrus的反应性不同，能够以更低的浓度抑制Aggrus依赖性的肺转移，得到难以预料的效果。此外，本申请发明的单克隆抗体识别各种不同的抗原决定簇，具有即使在癌中频发的耐性变异等产生的情况下也能够使用其他抗体来克服的可能性高的巨大优点。本申请发明的单克隆抗体为小鼠单克隆抗体，因此，在抗癌剂的研发过程中通用的移植了人癌的小鼠模型（小鼠荷瘤模型）中，不需要像大鼠抗体这样考虑种的屏障。通常，虽然通过将CDR与小鼠抗体的Fc区结合，从大鼠抗体也能够制作小鼠嵌合抗体，但是，该小鼠嵌合抗体的产生需要在CHO细胞等抗体产生细胞中将嵌合抗体表达载体进行基因导入而产生，在小鼠嵌合抗体的大量纯化中与在小鼠腹水中产生小鼠抗体的情况相比不经济且不实用。因此，本申请发明的小鼠单克隆抗体，例如，在使用人癌的小鼠荷瘤模型的医药组合物的开发中具有特别的便利性。
附图说明
图1为表示使用P2-0抗体的合成肽进行的识别抗原决定簇的筛选的图。
图2为表示P2-0抗体以浓度依赖性的方式抑制Aggrus-CLEC-2相互作用的图。
图3为表示P2-0抗体具有血小板凝集抑制效果的图。
图4为表示P2-0抗体具有癌的肺转移抑制效果的图。
图5为表示人化P2-0抗体（人型嵌合P2-0抗体）具有血小板凝集抑制效果的图。
图6为表示人化P2-0抗体（人型嵌合P2-0抗体）具有癌的肺转移抑制效果的图。
图7为表示人化P2-0抗体（人型嵌合P2-0抗体）在Aggrus低表达细胞（HT1080细胞）中也具有肺转移抑制效果的图。
图8为表示P2-0抗体识别在人膀胱癌细胞膜表面表达的Aggrus的蛋白质印迹法分析的图。
图9为表示NZ-1抗体和P2-0抗体对Aggrus识别能力的差异的蛋白质印迹法分析的图。
图10A为表示NZ-1抗体（图10A）和P2-0抗体（图10B）对Aggrus识别能力的差异的FACS法中NZ-1抗体的解析结果的图。
图10B为表示NZ-1抗体（图10A）和P2-0抗体（图10B）对Aggrus识别能力的差异的FACS法中P2-0抗体的解析结果的图。
图11为表示NZ-1抗体和P2-0抗体的癌的肺转移抑制效果的差异的图。
图12为通过使用导入了人Aggrus基因的CHO细胞株的流式细胞仪解析来确认MS-1、MS-3和MS-4抗体识别人Aggrus的图。
图13为表示使用丙氨酸变异型Aggrus蛋白质的P2-0、MS-1、MS-3和MS-4抗体的识别抗原决定位置的筛选的图。
图14为使用表面等离子体共振测定P2-0、MS-1、MS-3和MS-4对抗体重组人Aggrus蛋白质的结合度的图。
图15为表示P2-0、MS-1、MS-3和MS-4抗体抑制Aggrus-CLEC-2相互作用的图。
图16为表示P2-0、MS-1、MS-3和MS-4抗体具有血小板凝集抑制效果的图。
图17为表示MS-1抗体对人Aggrus表达细胞发挥抗肿瘤活性的图。
图18为MS-1抗体抑制人Aggrus表达细胞向肺的自然转移的图。
图19为表示MS-1和MS-3抗体具有人Aggrus表达细胞的肺转移抑制效果的图。
具体实施方式
Aggrus作为gp44、podoplanin等已知。
“抗Aggrus单克隆抗体”是指与Aggrus特异性结合的单克隆抗体或衍生物，也包括与原来的抗体显示实质上相同的抗原特异性的该抗体的片段（本说明书中称为“功能性片段”）。抗体的功能性片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体（scFv）、二硫化物稳定化V区片段（dsFv）或者包含CDR的肽等的抗体的功能性片段等。本发明的抗体，如以下所详述，能够通过包括对动物优选对小鼠进行免疫、为了与适当的细胞融合来制作杂交瘤而回收脾脏细胞的步骤的现有的方法制作。
作为对于Aggrus的小鼠单克隆抗体的优选例子，可以列举由国家高级工业科学技术学院国际专利生物保藏中心（IPOD；日本〒3058566茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6）中作为保藏号FERMBP-11446于2011年2月18日保藏的杂交瘤、以及作为保藏号FERMBP-11447、FERM BP-11448和FERM BP-11449在上述IPOD中于2011年12月28日保藏的杂交瘤产生的单克隆抗体。此外，具有与其同等的结合特性的其他抗体也优选作为本发明的抗Aggrus单克隆抗体。
将人以外的动物的抗体利用基因重组技术制成的人型嵌合抗体或者人型CDR移植抗体等人化抗体也能够在本发明中有利地使用。所谓人型嵌合抗体是指抗体的可变区（以下，记为V区）为人以外的动物抗体，恒定区（以下，记为C区）为人抗体的抗体（MorrisonS.L.et al.,Proc Natl Acad Sci USA.81(21),6851-6855,1984），作为人型CDR移植抗体，是将人以外的动物的抗体的V区中的CDR的氨基酸序列移植到人抗体的合适位置的抗体（Jones P.T.et al.Nature,321(6069),522-525,1986）。将人化抗体对人进行给药的情况下，与人以外的动物的抗体相比，副作用小，能够长时间持续其治疗效果。另外，人化抗体能够利用基因重组技术，作为各种形态的分子制作。
在其他方式中，本发明提供包含本发明的单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段的Aggrus-CLEC-2结合抑制剂、以及用于抑制血小板凝集或抑制癌转移或者处置肿瘤或血栓病的包含本发明的单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段的医药组合物，血栓病优选为脑梗塞或心肌梗塞。癌或肿瘤优选为鳞状细胞癌、纤维肉瘤、间皮瘤、卡波氏肉瘤、睾丸肿瘤、脑肿瘤或膀胱癌。其中，本说明书中的“癌”和“肿瘤”作为具有相同意义的用语使用。
本发明的医药组合物的剂型的种类，例如可以列举作为口服剂的片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片、膏剂等，作为非口服剂，可以列举注射剂、栓剂、经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂等，本领域的技术人员能够对应给药路径和给药对象等选择适当的剂型。作为有效成分的抗Aggrus单克隆抗体，在制剂中可以含有0.1到99.9重量%。
本发明的药剂的有效成分的给药量，根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异，但是口服给药的情况下，通常，例如，对患者（60kg）一天约为0.1μg～1000mg，优选约为1.0μg～100mg，更优选约为1.0mg～50mg。非口服给药的情况下，其一次给药量随着给药对象、对象脏器、症状、给药方法等的不同而不同，例如，以注射剂的方式通常例如，对患者（60kg）一天将约0.01到30mg左右、优选约0.1到20mg左右、更优选0.1～10mg左右通过静脉注射给药。然而，最终可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等，通过医生或者兽医的判断进行确定。
以下，列举实施例，更详细说明本发明。
实施例1
小鼠抗人Aggrus单克隆抗体产生杂交瘤的制作
免疫原
对人Aggrus cDNA的TT679部位（位置38～51的14个的氨基酸（序列号2：Glu GlyGly Val Ala Met Pro Gly Ala Glu Asp Asp Val Val）进行克隆，在pGEX-6P-3载体（GEHealthcare、英国白金汉郡）上反复进行8次连接（TT679-repeat）。用该载体转化大肠杆菌BL21（Invitrogen、加利福尼亚州卡尔斯巴德市），接着，利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶（Glutathione Sepharose，GE Healthcare）纯化带有GST标签（tag）的重组蛋白质。
致敏
使用弗氏完全佐剂（Freund′s complete adjuvant，Difco Laboratories，密歇根州底特律）对6周龄的雌性BALB/c小鼠（由日本Charles River株式会社购入，按照常规方法饲养培育）在颈部皮下将上述得到的免疫原进行给药。通过隔周的腹腔内给药，进行追加免疫。
杂交瘤构建
按照常规方法，采集脾脏细胞，使用聚乙二醇4000（Merck、新泽西州）与小鼠骨髓瘤细胞P3U1融合。用包含次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷的RPMI 1640培养基（Sigma）增殖，选择杂交瘤。其结果，构建出15克隆的杂交瘤。
实施例2
小鼠抗人Aggrus单克隆抗体的分析
利用蛋白质印迹法的验证
2011年2月18日，将从上述得到的杂交瘤得到的抗体中产生称为P2-0的抗体的杂交瘤保藏在国家高级工业科学技术学院 国际专利生物保藏中心，保藏号为FERM BP-11446（与保藏号FERM P-22069相同）。P2-0抗体通过流式细胞仪和蛋白质印迹分析，显示识别人Aggrus。并且，制作序列号2所示的氨基酸序列缺失的Aggrus变异体，进行蛋白质印迹分析，结果P2-0抗体不能识别该Aggrus变异体。
实施例3
抗原决定簇的探索
如图1所示，化学合成各种各样的肽，通过ELISA方法研究P2-0抗体对它们的反应性。其结果，对具有位置44～52的氨基酸序列（序列号1）的肽显示高的反应性。
实施例4
Aggrus-CLEC-2结合抑制试验
使用从哺乳动物细胞纯化的重组Aggrus蛋白质和CLEC-2蛋白质，通过ELISA方法检测Aggrus-CLEC-2相互作用。调查对在Aggrus抗体的存在下的相互作用的影响。如图2所示，发现P2-0抗体以浓度依赖性的方式抑制Aggrus-CLEC-2相互作用。
实施例5
血小板凝集抑制试验
CHO细胞和CHO/mock细胞已知不会引起血小板凝集，而表达Aggrus的CHO/Aggrus细胞引起血小板凝集。在利用光线透过率的监测的in vitro血小板凝集分析中，比较从反应开始时刻到最大的一半的值的时刻的时间。如图3所示，通过添加P2-0抗体，发现通过Aggrus的血小板凝集以浓度依赖性的方式被延迟。
实施例6
肺转移抑制试验
静脉注射后，研究抗体对于导入了人Aggrus基因的CHO细胞株在in vivo的实验的肺转移的影响。CHO细胞已知通过Aggrus的强制表达而成为转移性的。如图4所示可知，P2-0抗体即使以0.1μg/只的非常少量也显示出非常强的肺转移抑制效果，P2-0抗体不仅显示Aggrus中和活性，而且显示抑制Aggrus依赖性的血行性转移。
实施例7
人化抗体的制作和验证
为了能够实用，克隆P2-0抗体的Aggrus识别可变区，按照常规方法制作整合入人IgG的恒定区中的人化P2-0抗体（人型嵌合P2-0抗体）。确认了该人化P2-0抗体，识别猴Aggrus。并且，也确认到该人化P2-0抗体，与原来的P2-0抗体同样显示血小板凝集抑制活性（图5）和癌的转移抑制效果（图6）。该人化P2-0抗体，如图7所示，对Aggrus低表达细胞（HT1080细胞）也显示癌转移抑制效果。
实施例8
Aggrus相关癌的探索和大鼠抗Aggrus抗体（NZ-1抗体）的比较
本发明的发明人等还以由膀胱癌的临床样本得到的cDNA（Origene公司在市场上出售的TissueScan cDNA Panel）作为模板通过实时PCR法，发现Aggrus在膀胱癌中也高频度地表达亢进。
在此，通过蛋白质印迹法，研究在人膀胱癌中表达的Aggrus的由P2-0抗体的识别。如图8所示，可知P2-0抗体识别在各种人膀胱癌细胞膜表面表达的Aggrus（泳道2～5），相对于此，市售的D2-40抗体（小鼠抗人Aggrus单克隆抗体）只识别导入了人Aggrus基因的CHO细胞株（泳道1），而不能识别在人膀胱癌细胞膜表面表达的Aggrus。另外，将导入了人Aggrus基因的CHO细胞株和各种人膀胱癌细胞株，在作为蛋白质分解酶的胰蛋白酶处理的条件下（图9：泳道7～9）或者无胰蛋白酶处理的条件下（图9：泳道12～15）回收，将其细胞溶解液进行SDS-PAGE，用P2-0抗体、NZ-1抗体和用于确认蛋白质电泳量的肌动蛋白抗体进行蛋白质印迹分析。其结果，如图9所示，P2-0抗体识别在人膀胱癌细胞膜表面表达的Aggrus蛋白质，但是NZ-1抗体只能识别导入了人Aggrus的CHO细胞表达的Aggrus（图9：泳道6），不能够识别在人膀胱癌细胞膜表面表达的野生型Aggrus。
根据本研究，实际证明了P2-0抗体与目前已知的抗人Aggrus抗体（包括NZ-1）比较，对在生物体中表达的天然的Aggrus反应性强，暗示P2-0抗体是能够识别多种癌中表达的Aggrus的抗体。因此，表明P2-0抗体在将Aggrus作为靶标的使用中，具有更优异的效果。
而且，通过FACS法，再现了上述蛋白质印迹分析的结果。具体来说，仅用不含作为蛋白质分解酶的胰蛋白酶的EDTA对人膀胱癌细胞株T24进行细胞回收，对该细胞，分别使用NZ-1抗体或作为其对照抗体大鼠抗体在4℃反应1小时。用PBS清洗过剩的抗体，之后，作为2次抗体使Alexa488标记的抗大鼠IgG抗体在4℃反应1小时。用PBS清洗过剩的抗体，之后，用Beckman Coulter公司的Cytomics FC500流式细胞仪进行分析。结果示于图10A。
另一方面，对上述回收的人膀胱癌细胞株T24，分别使各个P2-0抗体或者作为其对照抗体的小鼠抗体在4℃反应1小时。用PBS清洗过剩的抗体，之后，作为2次抗体使Alexa488标记的抗小鼠IgG抗体在4℃反应1小时。用PBS清洗过剩的抗体，同样，用流式细胞仪进行分析。结果示于图10B。如图10A和图10B所示，NZ-1抗体未能识别人膀胱癌细胞株T24中表达的Aggrus，而P2-0抗体能够识别。
比较P2-0抗体和NZ-1抗体对于导入了人Aggrus基因的CHO细胞株在in vivo的实验的肺转移的作用。如图11所示可知，P2-0抗体即使以每一只小鼠给药0.01μg、0.001μg这样非常少的量，与对照抗体给药组比较，还是能够显示显著的肺转移抑制效果，但是，NZ-1抗体以0.1μg/只显示显著的转移抑制效果，以0.01μg/只、0.001μg/只这样非常少的量就无法显示显著的抑制效果。因此可知，P2-0抗体与NZ-1抗体比较，具有强的血行性转移抑制活性。因此，发现P2-0抗体为在Aggrus识别和Aggrus功能抑制中具有优异效果的抗体，在实验、临床中使用非常有利。
实施例9
小鼠抗人Aggrus单克隆抗体产生杂交瘤的制作
免疫原
将人Aggrus cDNA的PP4262部位（位置42～62的21个氨基酸（序列号5：Ala MetPro Gly Ala Glu Asp Asp Val Val Thr Pro Gly Thr Ser Glu Asp Arg Tyr Lys Ser））重复18次而成的序列克隆到pGEX-6P3载体（GE Healthcare）中。用该载体转化大肠杆菌BL21（Invitrogen）。将GST标签融合重组蛋白质通过谷胱甘肽琼脂糖凝胶（GlutathioneSepharose，GE Healthcare）进行纯化。
致敏
对6周龄的雌性BALB/c小鼠（由日本Charles River公司购入，按照常规方法进行饲养培育），使用TiterMax Gold（TiterMax USA Inc.）将上述得到的免疫原通过颈部皮下给药。通过隔周的腹腔内给药进行追加免疫。
杂交瘤构建
按照常规方法采集脾脏细胞，使用聚乙二醇4000（Merck）与小鼠骨髓瘤细胞P3U1融合，用包含次黄嘌呤、氨蝶呤、胸腺嘧啶核苷的S-clone cloning medium（Eidia株式会社）进行增殖，选择杂交瘤。其结果，构建出多个杂交瘤。
实施例10
小鼠抗人Aggrus单克隆抗体的分析
利用流式细胞仪解析的验证
从上述的杂交瘤得到的抗体中产生MS-1、MS-3和MS-4抗体的杂交瘤，在2011年12月28日分别作为保藏号FERM BP-11447、FERMBP-11448和FERM BP-11449保藏在国家高级工业科学技术学院国际专利生物保藏中心。而且，MS-1、MS-3和MS-4抗体识别人Aggrus，通过使用导入了人Aggrus基因的CHO细胞株的流式细胞仪解析进行了确认。具体来说，从培养容器回收稳定地基因导入了人Aggrus基因的CHO细胞，用PBS清洗，之后，调整为2×106cells/ml的细胞密度，然后处理MS-1、MS-3和MS-4抗体，使其在冰上反应30分钟。其后，用PBS清洗细胞，处理作为2次抗体的Alexa488标记的抗小鼠IgG抗体，使其在冰上反应30分钟。用PBS清洗细胞3次，之后，用Cytomics FC500（Beckman Coulter）进行解析。解析结果如图12所示。
实施例11
抗原决定簇的探索
将从人Aggrus cDNA中除去相当于信号肽的密码子后的序列克隆在pGEX-6P3载体上，使用Quickchange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene），将相当于第37位到第62位的氨基酸的密码子每一个取代为对应丙氨酸的密码子，由此制作各种丙氨酸变异型Aggrus表达载体。使用制作的载体，对大肠杆菌TOP10F′（Invitrogen）进行转化，培养之后，将大肠杆菌破碎液作为样品进行蛋白质印迹法，由此研究P2-0、MS-1、MS-3和MS4抗体对重组人Aggrus蛋白质的反应性。其结果，如图13的上段所示，确认了P2-0抗体对人Aggrus蛋白质的第45位的甘氨酸、第48位的天冬氨酸和第49位的天冬氨酸显示高的反应性，且能识别序列号1表示的氨基酸序列。确认了MS-1抗体对人Aggrus蛋白质的第45位的甘氨酸和第48位的天冬氨酸显示高的反应性，且能识别序列号1表示的氨基酸序列。确认了MS-3抗体对人Aggrus蛋白质的第54位的甘氨酸、第55位的苏氨酸和第58位的天冬氨酸显示高的反应性，且能识别序列号3表示的氨基酸序列。确认了MS-4抗体对人Aggrus蛋白质的第53位的脯氨酸、第55位的苏氨酸、第57位的谷氨酸、第58位的天冬氨酸和第61位的赖氨酸显示高的反应性，且能识别序列号4表示的氨基酸序列。此外，P2-0、MS-1、MS-3和MS-4抗体的识别抗原决定簇的模式图在图13的下段表示。人Aggrus一级序列中的识别抗原决定簇中的空心文字表示的氨基酸为抗体识别部位，与椭圆重合的部位表示抗体识别人Aggrus时重要的区域。
实施例12
使用表面等离子体共振的抗体对于重组人Aggrus蛋白质的结合度的测定
P2-0、MS-1、MS-3和MS-4抗体的对于重组人Aggrus蛋白质的结合度测定，使用表面等离子体共振解析装置Biacore X100（GEHealthcare，Buckinghamshire，UK）。在实施了羧甲基葡聚糖涂覆处理的传感芯片CM5上使用胺偶联法将重组人Aggrus蛋白质固定化，得到相当于约2000RU的固定化量。在25度、30微升/分钟的流速的条件下，流路中充满HBS-EP+buffer（HBS-EP+缓冲液）（10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05%v/v表面活性剂P20），进行测定。使用HBS-EP+buffer将P2-0、MS-1、MS-3和MS-4抗体溶液分别稀释到100nM、50nM、25nM、12.5nM和6.25nM，在重组人Aggrus蛋白质固定化的传感芯片CM5上流动60秒钟观察结合反应，接着，流动120秒钟HBS-EP+buffer观察解离反应。根据测定得到的传感图（センサーグラム），使用Biacore X100evaluation software bivalent analyte model进行分析，计算解离常数KD值。如图14所示，P2-0抗体对重组人Aggrus蛋白质的解离常数为9.3×10- 9M，MS-1抗体的解离常数为9.0×10-9M，MS-3抗体的解离常数为6.3×10-8M，MS-4抗体的解离常数为2.0×10-6M。
实施例13
Aggrus-CLEC-2结合抑制试验
使用从哺乳动物细胞纯化得到的重组Aggrus蛋白质和CLEC-2蛋白质，通过ELISA法检测Aggrus-CLEC-2相互作用。此外，研究抗Aggrus抗体对Aggrus-CLEC-2的相互作用的影响。如图15上段所示，P2-0和MS-1抗体显示以依赖于处理浓度的方式抑制Aggrus-CLEC-2相互作用。此外，如图15的下段所示，MS-3和MS-4抗体通过以40微克/ml或80微克/ml的高浓度进行处理，显示抑制Aggrus-CLEC-2相互作用。
实施例14
血小板凝集抑制试验
已知在作为不引起血小板凝集的细胞株的CHO细胞中导入人Aggrus基因，就会引起血小板凝集。通过使用MCM HEMA TRACER 313M（MC Medical,INC.）的光透过率的监测进行in vitro血小板凝集分析，比较从反应开始时刻直到最大凝集率的50%为止的时间。如图16所示，通过人Aggrus导入CHO细胞诱导的血小板凝集，在对照抗体（小鼠IgG（将Sigma公司目录号15381进行PBS透析得到的））存在下，从反应开始2～3.5分钟到达50%凝集率，相对于此在P2-0抗体存在下，延迟到从反应开始11～19分钟后。此外，在MS-1抗体存在下，延迟到从反应开始9分钟后，在MS-3抗体存在下，延迟到从反应开始14.5分钟后，在MS-4抗体存在下，延迟到从反应开始10分钟后。由此表明，P2-0、MS-1、MS-3和MS-4抗体具有Aggrus依赖性的抑制血小板凝集的活性。
实施例15
抗肿瘤活性试验
在BALB/c-nu/nu裸小鼠12只的背部皮下以1×105cells/只的细胞数移植导入了人Aggrus基因的CHO细胞株，将6只分为两组。将进行细胞移植的日期作为Day0，在Day1、Day5和Day9合计3次对各组投加对照抗体（小鼠IgG2a（将Sigma公司目录号M9144进行PBS透析得到的））和MS-1抗体。其中，1次的抗体给药量为30微克/只，给药途径采用尾静脉。1周测定2次肿瘤体积，从皮下移植到30天后为止进行测定，由此，研究MS-1抗体的抗肿瘤效果。其结果，如图17的曲线所示，对照抗体给药组中，在6只中的5只小鼠中观察到肿瘤的增殖，Day30时的平均肿瘤体积约为1200mm3。另一方面，MS-1抗体给药组中，在6只中的2只小鼠中观察到肿瘤消失，3只小鼠中观察到肿瘤的增殖得到抑制，Day30时的平均肿瘤体积为400mm3。由此可知MS-1抗体对人Aggrus表达细胞发挥了抗肿瘤活性。其中，Day18时小鼠和肿瘤的样子如图17右侧照片所示。在小鼠上标记的1到6的数字对应各曲线的1到6的图例。
实施例16
向肺的自然转移抑制试验
已知在皮下移植导入了人Aggrus的CHO细胞的情况下，在移植后30天左右观察到向肺的自然转移。在此，在细胞移植后第30天，摘出实施了抗肿瘤活性试验的12只小鼠的肺，用PBS清洗后，用饱和苦味酸溶液染色，对肺表面产生的转移结节数进行计数。图18上侧表示记入计数得到的转移结节数的图，下侧表示苦味酸染色后的小鼠的肺的照片。在对照抗体（小鼠IgG2a（将Sigma公司目录号M9144进行PBS透析得到的））给药组中观察到平均30个左右的肺转移结节，相对于此，在MS-1抗体给药组中，6只中的5只完全抑制了肺转移结节的形成。由此，可知MS-1抗体具有人Aggrus依赖性的抑制向肺的自然转移的活性。
实施例17
肺转移抑制试验
已知将导入了人Aggrus的CHO细胞通过尾静脉注射到BALB/c-nu/nu裸小鼠，则在约20天后能够形成肺转移结节。在此，在细胞注射的前一天，将对照抗体（小鼠IgG2a（将Sigma公司目录号M9144进行PBS透析得到的））、MS-1抗体和MS-3抗体通过尾静脉途径投加给各组8只的裸小鼠，研究对Aggrus依赖性实验的肺转移的影响。如图19所示，预先投加MS-1和MS-3抗体，由此，能够浓度依赖性地显著抑制人Aggrus导入CHO细胞的肺转移。因此，MS-1和MS-3抗体不仅具有Aggrus中和活性而且显示Aggrus依赖性地抑制血行性转移。
保藏号
FERM BP-11446
FERM BP-11447
FERM BP-11448
FERM BP-11449

Claims (9)

1.一种小鼠单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段，其特征在于：
其识别由序列号1、3或4所示的氨基酸序列构成的Aggrus的抗原决定簇，
其中，所述功能性片段为Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体(scFv)或者二硫化物稳定化V区片段(dsFv)。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段，其特征在于：
其是由保藏号为FERM BP-11446、FERM BP-11447、FERM BP-11448或FERM BP-11449的杂交瘤产生的。
3.如权利要求1所述的单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段，其特征在于：
其被人化。
4.保藏号为FERM BP-11446、FERM BP-11447、FERM BP-11448或FERM BP-11449的杂交瘤。
5.一种Aggrus-CLEC-2结合抑制剂，其特征在于：
其包含权利要求1所述的单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段。
6.一种医药组合物，其用于抑制血小板凝集或抑制癌转移、或者处置肿瘤或血栓病，该医药组合物的特征在于：
包含权利要求1所述的单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段。
7.如权利要求6所述的医药组合物，其特征在于：
血栓病为脑梗塞或心肌梗塞。
8.如权利要求6所述的医药组合物，其特征在于：
癌或肿瘤为鳞状细胞癌、纤维肉瘤、间皮瘤、卡波氏肉瘤、睾丸肿瘤、脑肿瘤或膀胱癌。
9.如权利要求8所述的医药组合物，其特征在于：
癌或肿瘤为鳞状细胞癌、间皮瘤、睾丸肿瘤或膀胱癌。
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