KR20140052034A - 신장 외수질 칼륨 채널의 억제제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 ROMK (Kir1.1) 채널의 억제제인 하기 화학식 Ia의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 화합물은 이뇨제 및/또는 나트륨이뇨제로서 및 심혈관 질환, 예컨대 고혈압, 심부전, 및 과량의 염 및 수분 저류와 연관된 상태를 포함하는 의학적 상태의 치료 및 예방을 위해 사용될 수 있다.
<화학식 Ia>
<화학식 Ia>
Description
신장 외수질 칼륨 (ROMK) 채널 (Kir1.1) (예를 들어 문헌 [Ho, K., et al., Cloning and expression of an inwardly rectifying ATP-regulated potassium channel, Nature, 1993, 362 (6415): p.31-8.1, 2; 및 Shuck, M.E., et al., Cloning and characterization of multiple forms of the human kidney ROM-K potassium channel, J Biol Chem, 1994, 269(39): p. 24261-70] 참조)은 신장의 2개 영역인 두꺼운 상행 헨레 루프 (TALH) 및 피질 집합관 (CCD)에서 발현되는 칼륨 채널의 내향성 정류기 패밀리의 구성원이다 (문헌 [Hebert, S.C., et al., Molecular diversity and regulation of renal potassium channels, Physiol Rev, 2005, 85(1): p.319-713] 참조). TALH에서, ROMK는 Na+/K+/2Cl- 공동수송체의 기능을 위해 중요한 내강 막을 가로지르는 칼륨 재순환에 관여하며, 이는 네프론의 이 부분에서의 염 재흡수를 위한 속도-결정 단계이다. CCD에서, ROMK는 아밀로리드-감수성 나트륨 채널을 통한 나트륨 흡수에 밀접하게 연결된 칼륨 분비 경로를 제공한다 (예를 들어 문헌 [Reinalter, S.C., et al., Pharmacotyping of hypokalaemic salt-losing tubular disorders, Acta Physiol Scand, 2004, 181(4): p.513-21; 및 Wang, W., Renal potassium channels: recent developments, Curr Opin Nephrol Hypertens, 2004, 13(5): p. 549-55] 참조). ROMK 채널의 선택적 억제제 (본원에서 ROMK의 억제제 또는 ROMK 억제제로도 지칭됨)는 고혈압, 및 이뇨제로의 치료가 현재 사용되는 임상 작용제에 비해 잠재적으로 감소된 부담으로 유익할 것인 다른 상태 (즉, 저칼륨혈증 또는 고칼륨혈증, 당뇨병의 새로운 발병, 이상지혈증)의 치료를 위한 신규 이뇨제를 나타낼 것으로 예측된다 (문헌 [Lifton, R.P., A.G.Gharavi, and D.S.Geller, Molecular mechanisms of human hypertension, Cell, 2001, 104(4): p. 545-56] 참조). 인간 유전학 (문헌 [Ji, W., et al., Rare independent mutations in renal salt handling genes contribute to blood pressure variation, Nat Genet, 2008, 40(5): p. 592-9; 및 Tobin, M.D., et al., Common variants in genes underlying monogenic hypertension and hypotension and blood pressure in the general population, Hypertension, 2008, 51(6): p. 1658-64]) 및 설치류에서의 ROMK의 유전적 제거 (문헌 [Lorenz, J.N., et al., Impaired renal NaCl absorption in mice lacking the ROMK potassium channel, a model for type II Bartter's syndrome, J Biol Chem, 2002, 277(40): p. 37871-80 및 Lu, M., et al., Absence of small conductance K+ channel (SK) activity in apical membranes of thick ascending limb and cortical collecting duct in ROMK (Bartter's) knockout mice, J Biol Chem, 2002, 277(40): p. 37881-7] 참조)가 이러한 기대를 뒷받침한다. 본 출원인이 아는 바로는, 문헌 [Lewis, L.M., et al., High-Throughput Screening Reveals a Small-Molecule Inhibitor of the Renal Outer Medullary Potassium Channel and Kir 7.1, Mol Pharmacol, 2009, 76(5): p.1094-1103]에 기재된 바와 같이, VU590을 포함하는 ROMK의 제1 소분자 선택적 억제제가 반더빌트 유니버시티(Vanderbilt University)에서 수행된 연구로부터 보고되었다. 화합물 VU591은 이후에 문헌 [Bhave, G. et al., Development of a Selective Small-Molecule Inhibitor of Kir1.1,the Renal Outer Medullary Potassium Channel, Mol Pharmacol, 2011, 79(1), p.42-50]에 보고되었고, 그의 본문에는 "ROMK (Kir1.1)는 저칼륨혈증을 유발하지 않고 혈압을 강하시키는 신규 부류의 루프 이뇨제를 위한 추정 약물 표적이다"라고 언급되어 있다.
그러나, ROMK의 선택적 소분자 억제제의 계속적인 발견이 고혈압 및 관련 장애를 위한 새로운 치료의 개발을 위해 여전히 필요하다. 본 발명의 화학식 Ia의 화합물은 ROMK 채널의 선택적 억제제이고, 고혈압, 심부전, 및 이뇨제 또는 나트륨이뇨로제로의 치료가 유익할 것인 다른 상태의 치료를 위해 사용될 수 있다.
발명의 개요
본 발명은 하기 화학식 Ia의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
<화학식 Ia>
화학식 Ia의 화합물은 ROMK (Kir1.1) 채널의 억제제이다. 그 결과, 화학식 Ia의 화합물은 ROMK의 억제로부터 유익할 수 있는 하나 이상의 질환 상태의 치료, 억제 또는 개선 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 이뇨제 및/또는 나트륨이뇨제를 필요로 하는 환자에게 치료 또는 예방 유효량의 화학식 Ia의 화합물을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법에 사용될 수 있다. 따라서, 화학식 Ia의 화합물은 심혈관 질환, 예컨대 고혈압, 심부전, 및 과량의 염 및 수분 저류와 연관된 상태를 포함하나 이에 제한되지는 않는 의학적 상태의 치료, 예방 또는 둘 다를 위한 가치 있는 제약 활성 화합물일 수 있다. 본 발명의 화합물은 추가로 고혈압, 심부전, 및 과량의 염 및 수분 저류와 연관된 상태의 치료에 유용한 다른 약물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 치료상 유효한 작용제와 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 화학식 Ia의 화합물, 및 화학식 Ia의 화합물을 포함하는 제약 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 이들 및 다른 측면은 본원에 포함되는 설명으로부터 명백할 것이다.
본 발명은 하기 구조 화학식 Ia을 갖는 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
<화학식 Ia>
상기 식에서,
Z는 
이고;
R1은 
이고,
여기서 ***는 카르보닐 탄소에 대한 부착을 나타내고 **는 화학식 Ia 내의 테트라졸릴 고리에 대한 부착을 나타내고;
X는 O, NH 또는 S이고;
m은 1 또는 2로부터 선택되는 정수이고;
n은 1 또는 2로부터 선택되는 정수이고;
X1, X2 및 X3은 C(R7) 또는 N으로부터 각각 독립적으로 선택되고, 단 X1, X2 및 X3 중 1개 이상은 N이어야만 하고 X1, X2 및 X3 중 2개 이하는 N이고;
Ra는 -CN이고;
Rb는 -H 또는 -C1 - 6알킬이고;
R2는 -H, -F, -Cl, -C1 - 6알킬, -C3 - 6시클로알킬 또는 -OC1 - 6알킬이고;
R3은 -H, -F, -Cl, -CN, -C1 - 6알킬, -C3 - 6시클로알킬 또는 -OC1 - 6알킬이고;
R4는 -F, -Cl, -CN, -C1 - 6알킬, -C3 - 6시클로알킬, -OC1 - 4알킬 또는 N-테트라졸릴이거나;
또는 R3 및 R4는 이들이 부착되어 있는 페닐 고리 내의 탄소 원자와 결합하여
R5는 -H, -Cl, -F, -CN, -C1 - 4알킬, -C3 - 6시클로알킬 또는 -OC1 - 4알킬이고;
단 R3 및 R4가 결합하지 않는 경우, R3, R4 또는 R5 중 오직 1개만 -CN이고;
R6은 -H 또는 -C1 - 4알킬이고;
R7은 -H, -F, -Cl 또는 -C1 - 4알킬이다.
본 발명의 한 실시양태는 하기 구조 화학식 I을 갖는 화학식 Ia의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염이다.
<화학식 I>
상기 식에서, 각각의 가변기 X, m, n, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 및 그 안의 모든 다른 가변기는 화학식 Ia에서 정의된 바와 같다.
실시양태 A는
X가 O, NH 또는 S이고;
R1은 
이고,
여기서 ***가 카르보닐 탄소에 대한 부착을 나타내고 **가 화학식 Ia 또는 I 내의 테트라졸릴 고리에 대한 부착을 나타내고;
m이 1 또는 2로부터 선택되는 정수이고;
n이 1 또는 2로부터 선택되는 정수이고;
X1, X2 및 X3이 CH 또는 N으로부터 각각 독립적으로 선택되고, 단 X1, X2 및 X3 중 1개 이상은 N이어야만 하고 X1, X2 및 X3 중 2개 이하는 N이고;
화학식 Ia 내의 Z가 티에닐인 경우, Ra가 -CN이고, Rb가 -H 또는 -C1 - 3알킬이고, 보다 특히 Rb가 -CH3이고;
R2가 -H 또는 -F이고;
R3이 -H, -F, -CN 또는 -OCH3이고;
R4가 -F, -CN 또는 -OCH3이거나;
또는 R3 및 R4가 이들이 부착되어 있는 페닐 고리 내의 탄소 원자와 결합하여
R5가 -H, -Cl, -F, -CN, -CH3, -CH2CH3, 시클로프로필 또는 -OCH3이고;
단 R3 및 R4가 결합하지 않는 경우, R3, R4 또는 R5 중 오직 1개만 -CN이고;
추가로 R3 및 R4가 결합하는 경우에는, R5가 -H, -Cl, -F, -CH3 또는 -CH2CH3이고;
R6이 -H 또는 -C1 - 4알킬이고;
R7이 -H, -F, -Cl 또는 -C1 - 4알킬인 화학식 Ia 또는 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염이다.
본 발명은 추가로 하기 구조 화학식 II를 갖는 화학식 Ia 또는 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
<화학식 II>
상기 식에서, 각각의 가변기 X, R1, R3, R4, R5 및 그 안의 모든 다른 가변기는 화학식 Ia에서 정의된 바와 같다. 화학식 II의 범위 내의 화합물 및 그의 염은
X가 O 또는 NH이고;
R1이 
이고,
여기서, ***가 카르보닐 탄소에 대한 부착을 나타내고 **가 화학식 II 내의 테트라졸릴 고리에 대한 부착을 나타내고;
R3이 -F이고, R4가 -CN이고, R5가 -CH3이거나; 또는
R3 및 R4가 이들이 부착되어 있는 페닐 고리 내의 탄소 원자와 결합하여
R5가 -H인 것을 포함한다.
본 발명은 추가로 하기 구조 화학식 III를 갖는 화학식 Ia, I 또는 II의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
<화학식 III>
상기 식에서, R2, R3, R4 및 R5 및 그 안의 모든 다른 가변기는 화학식 Ia에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 한 실시양태는 X가 O인 화학식 Ia, 화학식 I, 실시양태 A 또는 화학식 II의 화합물이다. 또 다른 실시양태는 X가 NH인 화학식 Ia, 화학식 I, 실시양태 A 또는 화학식 II의 화합물이다. 또 다른 실시양태는 X가 S인 화학식 Ia, 화학식 I, 실시양태 A 또는 화학식 II의 화합물이다.
한 실시양태는 R1이
인 화학식 Ia, 화학식 I, 실시양태 A 또는 화학식 II의 화합물이다.
또 다른 실시양태는 R1이 
인 화학식 Ia, 화학식 I, 실시양태 A 또는 화학식 II의 화합물이다.
또 다른 실시양태는 R1이 
인 화학식 Ia, 화학식 I, 실시양태 A 또는 화학식 II의 화합물이다.
또 다른 실시양태는 R1이 
(여기서 n은 1 또는 2임)이고, 보다 특히 
인 화학식 Ia, 화학식 I, 실시양태 A 또는 화학식 II의 화합물이다.
또 다른 실시양태는 R1이 
인 화학식 Ia, 화학식 I, 실시양태 A 또는 화학식 II의 화합물이다.
또 다른 실시양태는 R1이 
인 화학식 Ia, 화학식 I, 실시양태 A 또는 화학식 II의 화합물이다.
한 실시양태는 m이 1인 화학식 Ia, 화학식 I 또는 실시양태 A의 화합물이다. 또 다른 실시양태는 m이 2인 화학식 Ia, 화학식 I 또는 실시양태 A의 화합물이다.
한 실시양태는 n이 1인 화학식 Ia, 화학식 I, 실시양태 A 또는 화학식 II의 화합물이다. 또 다른 실시양태는 n이 2인 화학식 I, 실시양태 A 또는 화학식 II의 화합물이다. 그의 한 부류는 m 및 n이 둘 다 1인 화합물이다.
또 다른 실시양태는 R2가 -H 또는 -F이고; R3이 -H, -F, -CN 또는 -OCH3이고; R4가 -F, -CN 또는 -OCH3이고; R5가 -H, -Cl, -F, -CN, -CH3, -CH2CH3, 시클로프로필 또는 -OCH3이고; 단 R3, R4 또는 R5 중 오직 1개만 -CN인 화학식 Ia, 화학식 I, 실시양태 A, 화학식 II 또는 화학식 III의 화합물이다. 그의 한 부류는 R3 또는 R4 중 1개가 -CN인 화합물이다. 그의 하위부류는 R4가 -CN인 화합물이다. 그의 추가의 하위부류는 R2가 -H이고; R3이 -F이고; R4가 -CN이고; R5가 -CH3인 화합물이다.
한 실시양태는 R3 및 R4가 이들이 부착되어 있는 페닐 고리 내의 탄소 원자와 결합하여
R2가 -H이고; R5가 -H, -Cl, -F, -CN, -C1 - 4알킬, -C3 - 6시클로알킬 또는 -OC1 - 4알킬인 화학식 Ia, 화학식 I, 실시양태 A, 화학식 II 또는 화학식 III의 화합물이다. 이 실시양태의 한 부류는 R3 및 R4가 연결되어 5-원 고리를 형성하고 R5가 -H, -CH3 또는 -CH2CH3인 화합물이다. 이 실시양태의 또 다른 부류는 R3 및 R4가 연결되어 6-원 고리를 형성하고 R5가 -H 또는 -F인 화합물이다.
한 실시양태는 R6이 -H인 화학식 Ia, 화학식 I 또는 실시양태 A의 화합물이다. 또 다른 실시양태는 R6이 메틸, 에틸, -C3알킬 또는 -C4알킬인 화학식 Ia 또는 화학식 I의 화합물이다.
한 실시양태는 R7이 -H인 화학식 Ia, 화학식 I, 실시양태 A 또는 화학식 II의 화합물이다. 또 다른 실시양태는 R7이 -F, -Cl, 메틸 또는 에틸, -C3알킬 또는 -C4알킬이고, 보다 특히 -F, -Cl, 메틸 또는 에틸인 화학식 Ia, 화학식 I, 실시양태 A 또는 화학식 II의 화합물이다.
한 실시양태는 Rb가 -CH3인 화학식 Ia 및 실시양태 A의 화합물이다.
상기 기재된 모든 구조 화학식, 실시양태 A 및 다른 실시양태는 본원에 정의된 화합물의 제약상 허용되는 염을 포함한다.
달리 나타낸 경우를 제외하고, 본원에 사용된 "알킬"은 특정 개수의 탄소 원자를 갖는 분지쇄 및 직쇄 포화 지방족 탄화수소 기 둘 다를 포함하는 것으로 의도된다. 명세서 전반에 걸쳐 알킬 기에 대해 일반적으로 사용되는 약어를 사용하였다. 예를 들어 용어 "C1 - 6알킬" (또는 "C1-C6알킬")은 특정 개수의 탄소 원자를 갖는, 모든 이성질체를 포함하는 선형 또는 분지쇄 알킬 기를 의미하고, 모든 헥실 및 펜틸 이성질체 뿐만 아니라 n-, 이소-, sec- 및 tert-부틸 (부틸, s-부틸, i-부틸, t-부틸; Bu = 부틸), n- 및 i-프로필 (Pr = 프로필), 에틸 (Et) 및 메틸 (Me)을 포함한다.
"시클로알킬"은 나타낸 개수의 탄소 원자를 갖는 고리화된 알킬 고리이다. 시클로알킬의 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸 및 시클로헥실을 포함한다.
달리 명백히 도시되거나 기재되지 않는 한, "유동적인" 결합을 갖는 구조 화학식 내에 도시된 가변기, 예컨대 R2는, 가변기가 부착된 고리 내의 임의의 이용가능한 탄소 원자 상에 허용된다.
본 발명은 화학식 Ia의 화합물의 모든 입체이성질체 형태를 포함한다. 화학식 Ia의 화합물 내에 존재하는 비대칭의 중심은 모두 서로 독립적으로 (R) 또는 (S) 배위를 가질 수 있다. 키랄 탄소에 대한 결합이 본 발명의 구조 화학식 내에 직선으로서 도시되거나, 화합물 명칭이 키랄 탄소에 대한 키랄 지정 없이 언급된 경우에는, 키랄 탄소의 (R) 및 (S) 배위 둘 다와 그에 따른 거울상이성질체 둘 다및 그의 혼합물이 화학식 내에 또는 명칭에 의해 포괄된다는 것을 이해한다. 특정 입체이성질체 또는 그의 혼합물의 제조를 이러한 입체이성질체 또는 혼합물이 수득되는 실시예에서 확인할 수 있지만, 이는 결코 본 발명의 범위 내에 모든 입체이성질체 및 그의 혼합물이 포함된다는 것을 제한하지 않는다.
본 발명은 모든 가능한 거울상이성질체 및 부분입체이성질체, 및 2개 이상의 입체이성질체의 모든 비율의 혼합물, 예를 들어 거울상이성질체 및/또는 부분입체이성질체의 혼합물을 포함한다. 따라서, 거울상이성질체는, 좌선성 및 우선성 대장체 둘 다로서의 거울상이성질체적으로 순수한 형태, 라세미체 형태 및 2개의 거울상이성질체의 모든 비율의 혼합물 형태로 본 발명의 대상이다. 시스/트랜스 이성질현상의 경우에, 본 발명은 시스 형태 및 트랜스 형태 둘 다, 뿐만 아니라 이들 형태의 모든 비율의 혼합물을 포함한다. 개별 입체이성질체의 제조는, 원하는 경우에, 통상의 방법, 예를 들어 크로마토그래피 또는 결정화에 의한 혼합물의 분리, 합성을 위한 입체화학적으로 균일한 출발 물질의 사용, 또는 입체선택적 합성에 의해 수행될 수 있다. 임의로, 유도체화가 입체이성질체의 분리 전에 수행될 수 있다. 입체이성질체의 혼합물의 분리는 화학식 Ia의 화합물의 합성 중 중간 단계에서 수행될 수 있거나, 또는 최종 라세미 생성물에 대해 수행될 수 있다. 절대 입체화학은, 필요한 경우 공지된 배위의 입체생성 중심을 함유하는 시약을 사용하여 유도체화된 결정질 생성물 또는 결정질 중간체의 X선 결정학에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 화합물이 호변이성질체화될 수 있는 경우에는, 모든 개별 호변이성질체 뿐만 아니라 그의 혼합물이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명은 이러한 모든 이성질체, 뿐만 아니라 이러한 라세미체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체 및 호변이성질체의 염, 용매화물 (수화물 포함) 및 용매화된 염 및 그의 혼합물을 포함한다.
하기 예 A에서 각각의 키랄 중심에 별표로 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화합물은 화학식 Ia의 중심의 융합된 비시클릭 고리로부터 2개 이상의 키랄 (즉, 비대칭) 중심을 갖는다. 또한, 화학식 Ia의 카르보닐 탄소에 대해 알파인 (화학식 Ia에 정의된 바와 같은) R1의 비-방향족 고리 내의 탄소는 키랄 중심이고, 본원에서는 간결성을 위해 "아자-인단" 키랄 중심 또는 그의 유사-의미 변형으로 지칭된다. 아자-인단 키랄 중심의 예시적인 예는 하기 예 B에서 별표로 나타낸다.
본원에 사용된 아자-인단이라는 용어는 비-방향족 고리가 5 또는 6-원이고, 융합된 방향족 고리가 1 또는 2개의 질소를 함유하는 것을 포함하는, 화학식 Ia에서 R1의 정의에 의해 포괄되는 임의의 구조일 수 있다. 일부 실시예, 예컨대 실시예 2A 및 2B에서는, 입체화학적 할당이 만들어졌으며, 이는 각각의 분리된 이성질체를 아자-인단 키랄 중심에서 S 또는 R로 식별한다. 일부 실시예에서는, 할당은 만들어지지 않았지만 그럼에도 불구하고 아자-인단 키랄 중심에 의해 생성된 이성질체를 분리하였고, 이는 아자-인단 부분입체이성질체(들) 또는 화합물 내에 이러한 특정 키랄 중심을 전하는 유사한 언어로 지칭된다.
추가의 키랄 중심이 분자 상 다양한 치환기의 성질에 따라 존재할 수 있다. 실시예에 나타낸 화학 구조의 일부에서 별표는 1개 이상의 키랄 중심을 확인하는데 사용된다.
본원에서 화학식 Ia의 화합물에 대한 언급은 화학식 I, II 및 III 및 그의 모든 실시양태의 화합물을 포함한다. 특정 화학식 또는 실시양태, 예를 들어 화학식 Ia, I, II 또는 III 또는 그의 실시양태, 또는 임의의 다른 일반적인 구조 화학식의 화합물 또는 본원에 기재되거나 청구된 특정 화합물로서의, 본 발명의 화합물에 대한 언급은 특정 화합물, 또는 화학식 또는 실시양태의 범위 내에 속하는 화합물 (그의 염, 특히 제약상 허용되는 염, 상기 화합물의 용매화물 및 그의 용매화된 염 형태가 포함되며, 달리 명시하지 않는 한 상기 형태들이 가능함)을 포함하는 것으로 의도된다.
화학식 Ia의 화합물에서, 원자는 그의 천연 동위원소 존재비를 나타낼 수 있거나, 또는 원자 중 1개 이상은, 동일한 원자 번호를 갖지만 자연에서 주로 발견되는 원자 질량 또는 질량수와 상이한 원자 질량 또는 질량수를 갖는 특정한 동위원소로 인공적으로 농축될 수 있다. 본 발명은 화학식 Ia의 화합물의 모든 적합한 동위원소 변형을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어 수소 (H)의 다양한 동위원소 형태는 경수소 (1H) 및 중수소 (2H)를 포함한다. 경수소는 자연에서 발견되는 우세한 수소 동위원소이다. 중수소를 농축시키는 것은 특정의 치료 이점, 예컨대 생체내 반감기의 증가 또는 투여량 요건의 감소를 제공할 수 있거나, 또는 생물학적 샘플의 특성화를 위한 표준물로서 유용한 화합물을 제공할 수 있다. 화학식 Ia에 속하는 동위원소-농축된 화합물은 당업자에게 널리 공지된 통상의 기술에 의해, 또는 적절한 동위원소-농축된 시약 및/또는 중간체를 사용하여 본원의 반응식 및 실시예에 기재된 것과 유사한 방법에 의해 과도한 실험 없이 제조될 수 있다.
화학식 Ia의 화합물이 1개 이상의 산성 기 또는 염기성 기를 포함하는 경우, 본 발명은 또한 상응하는 제약상 허용되는 염을 포함한다. 따라서, 산성 기를 함유하는 화학식 Ia의 화합물은 본 발명에 따라, 예를 들어 알칼리 금속 염, 알칼리 토금속 염 또는 암모늄 염으로서 사용될 수 있다. 이러한 염의 예에는 나트륨 염, 칼륨 염, 칼슘 염, 마그네슘 염, 또는 암모니아 또는 유기 아민 예컨대, 예를 들어 에틸아민, 에탄올아민, 트리에탄올아민 또는 아미노산과의 염이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 1개 이상의 염기성 기, 즉 양성자화될 수 있는 기를 함유하는 화학식 Ia의 화합물은 본 발명에 따라 그의 무기 또는 유기산과의 산 부가염 형태, 예를 들어 염화수소, 브로민화수소, 인산, 황산, 질산, 벤젠술폰산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 나프탈렌디술폰산, 옥살산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 타르타르산, 락트산, 살리실산, 벤조산, 포름산, 프로피온산, 피발산, 디에틸아세트산, 말론산, 숙신산, 피멜산, 푸마르산, 말레산, 말산, 술파민산, 페닐프로피온산, 글루콘산, 아스코르브산, 이소니코틴산, 시트르산, 아디프산 등과의 염 (이에 제한되지는 않음) 형태로 사용될 수 있다. 화학식 Ia의 화합물이 분자 내에 산성 및 염기성 기를 동시에 함유하는 경우에, 본 발명은 또한 언급된 염 형태 이외에 내부 염 또는 베타인 (쯔비터이온)을 포함한다. 염은 화학식 Ia의 화합물로부터 당업자에게 공지되어 있는 통상의 방법에 의해, 예를 들어 용매 또는 분산제 중에서의 유기 또는 무기 산 또는 염기와의 조합에 의해, 또는 다른 염으로부터의 음이온 교환 또는 양이온 교환에 의해 수득될 수 있다. 본 발명은 또한 생리학상 상용성이 낮아서 제약에 직접적으로 사용하기에는 적합하지 않지만, 예를 들어 화학 반응을 위한 또는 생리학상 허용되는 염의 제조를 위한 중간체로서 사용될 수 있는 화학식 Ia의 화합물의 모든 염을 포함한다.
또한, 본 발명의 화합물은 무정형 형태 및/또는 하나 이상의 결정질 형태로 존재할 수 있으며, 화학식 Ia의 화합물의 이러한 모든 무정형 및 결정질 형태, 및 그의 혼합물은 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다. 또한, 본 발명의 일부 화합물은 물과의 용매화물 (즉, 수화물) 또는 통상적 유기 용매와의 용매화물을 형성할 수 있다. 이러한 본 발명의 화합물의 용매화물 및 수화물, 특히 제약상 허용되는 용매화물 및 수화물은 마찬가지로 비용매화된 형태 및 무수 형태와 함께 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 범위 내 화합물로 생체내 전환되는 본 발명의 화합물의 제약상 허용되는 전구약물 변형 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 예를 들어 에스테르는 화합물 내의 이용가능한 카르복실산 기의 에스테르화 또는 이용가능한 히드록시 기 상의 에스테르의 형성에 의해 임의로 만들어질 수 있다. 유사하게, 불안정 아미드가 만들어질 수 있다. 본 발명의 화합물의 제약상 허용되는 에스테르 또는 아미드는, 특히 생체내에서 산 (또는 전환이 일어나는 유체 또는 조직의 pH에 따라 -COO-) 또는 히드록시 형태로 다시 가수분해될 수 있는 전구약물로서 작용하도록 제조할 수 있으며, 이는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 제약상 허용되는 전구약물 변형의 예에는 페닐 에스테르로 치환된 -C1 - 6알킬 및 -C1 - 6알킬 에스테르가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
따라서, 본원에 기재되고 청구된 일반적인 구조 화학식의 화합물, 실시양태 및 특정 화합물은 그의 염, 모든 가능한 입체이성질체 및 호변이성질체, 물리적 형태 (예를 들어 무정형 및 결정질 형태), 용매화물 및 수화물 형태, 및 이들 형태의 임의의 조합, 뿐만 아니라 그의 염, 그의 전구약물 형태 및 그의 전구약물 형태의 염 (달리 명시하지 않는 한 상기 형태들이 가능함)을 포함한다.
본 발명에 따른 화학식 Ia의 화합물은 ROMK의 억제제이고, 따라서 이뇨제 및/또는 나트륨이뇨제로서 사용될 수 있다. ROMK 억제제는 배뇨를 증가시키고 요량을 증가시키는 것을 돕고, 또한 신장에서 나트륨의 재흡수를 방지하거나 감소시켜 나트륨 및 수분의 증가된 배설을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 화합물은 신체로부터의 수분 및 나트륨 배설 증가로부터 이익을 얻는 장애의 치료 또는 예방 또는 둘 다를 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 ROMK의 억제를 필요로 하는 환자에게 화학식 Ia의 화합물을 ROMK-억제 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 ROMK를 억제하는 방법에 사용될 수 있다. 화학식 Ia의 화합물에 의한 ROMK의 억제는, 예를 들어 하기 기재된 탈륨 플럭스 검정 및/또는 전기생리학 검정에서 검사될 수 있다. 더욱이, 본 발명은 또한 시험관내 검정, 예를 들어 본원에 기재된 탈륨 플럭스 및 전기생리학 검정 (이에 제한되지는 않음)을 입증하기 위한 화학식 Ia의 화합물 또는 그의 염의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 화합물은 화학식 Ia의 화합물을 이뇨, 나트륨이뇨 또는 둘 다의 유발을 필요로 하는 환자에게 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 이뇨, 나트륨이뇨 또는 둘 다를 유발하는 방법에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 화학식 Ia의 화합물은 수분 및 나트륨의 배설 증가로부터 이익을 얻는 의학적 상태, 예컨대 고혈압, 심부전 (급성 및 만성 둘 다, 후자는 울혈성 심부전으로도 공지됨) 및/또는 과량의 염 및 수분 저류와 연관된 다른 상태 중 하나 이상이지만 이에 제한되지 않는 의학적 상태를 치료하거나, 예방하거나 또는 그의 발생 위험을 감소시키는 방법에 사용될 수 있다. 또한, 화학식 Ia의 화합물은 하나 이상의 장애, 예컨대 폐동맥 고혈압 (PAH), 심혈관 질환, 당뇨병, 내피 기능장애, 확장기 기능장애, 안정형 및 불안정형 협심증, 혈전증, 재협착, 심근경색, 졸중, 심기능부전, 폐 고긴장증, 아테롬성동맥경화증, 간 경변증, 복수, 자간전증, 뇌 부종, 신병증, 신증후군, 급성 및 만성 신장 기능부전 (만성 신장 질환, 보다 일반적으로 신장애로도 지칭됨), 고칼슘혈증, 덴트병, 메니에르병, 부종성 상태, 및 이뇨제 또는 나트륨이뇨제 또는 둘 다가 치료적 또는 예방적 이익을 가질 것인 다른 상태를 치료하거나 예방하거나 그의 발생 위험을 감소시키는 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 이뇨제 또는 나트륨이뇨제 또는 둘 다가 본원에 기재된 것과 같은 치료 또는 예방 이익을 가질 것인 하나 이상의 상태를 앓고 있거나, 또는 앓을 위험이 있는 환자에게 투여될 수 있다.
화학식 Ia의 화합물은 현재 사용되는 임상적 작용제에 비해 잠재적으로 감소된 부담 (예를 들어 저칼륨혈증 또는 고칼륨혈증, 당뇨병의 새로운 발병, 이상지혈증 등)을 가질 수 있다. 또한 화합물은 루프 이뇨제의 장기 사용에 문제가 될 수 있는 이뇨제 내성에 대한 감소된 위험을 가질 수 있다.
일반적으로, ROMK 억제제인 화합물은 하기 검정: 1) 탈륨 플럭스 검정, 2) 전기생리학 검정 중 하나 이상에서 시험하는 경우, 5 μM 이하, 바람직하게는 1 μM 이하, 보다 바람직하게는 0.25 μM 이하의 IC50을 갖는 화합물로 확인될 수 있다. 이들 검정은 하기에서 보다 상세히 기재된다.
투여되는 화합물의 투여량은 개별 사례에 따라 달라지며, 최적의 효과를 달성하기 위해 개별 상황에 대해 조정하는 것이 통상적이다. 따라서, 이는 치료할 장애의 성질 및 중증도, 및 또한 치료할 인간 또는 동물의 성별, 연령, 체중 및 개별적 반응성, 사용되는 화합물의 작용의 효능 및 지속기간, 요법이 단기적 또는 장기적 또는 예방적인지의 여부, 또는 화학식 Ia의 화합물 이외에 다른 활성 화합물이 투여되는지의 여부에 따라 달라진다. 상태의 예방, 대응, 또는 진행 정지에 필요한 치료 유효 또는 예방 유효 투여량의 결정 목적을 위한 이들 인자의 고려는 숙련된 임상의의 권한 내에 있다. 화합물은 환자와 관련된 의학적 상태의 치료 또는 예방에 적절한 기간 (수일, 수개월, 수년 또는 환자의 일생동안 지속되는 요법의 과정을 포함함) 동안 매일 장기적으로 투여될 것으로 예상된다.
일반적으로, 대략 0.001 내지 100 mg/kg, 바람직하게는 0.001 내지 30 mg/kg, 특히 0.001 내지 10 mg/kg (각 경우에 kg 체중당 mg)의 1일 용량이, 원하는 결과를 얻기 위해 대략 75 kg 체중의 성인에게 투여하기에 적절하다. 1일 용량은 바람직하게는 단일 용량으로 투여되거나, 수회, 예를 들어 2, 3 또는 4회의 개별 용량으로 분할될 수 있고, 예를 들어 1일 기준 0.1 mg, 0.25 mg, 0.5 mg, 0.75 mg, 1 mg, 1.25 mg, 2 mg, 2.5 mg, 5 mg, 10 mg, 20 mg, 40 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 125 mg, 150 mg, 175 mg, 200 mg 등 (이에 제한되지는 않음)일 수 있다. 일부 경우에, 화합물의 효력 또는 개별 반응에 따라서 주어진 1일 용량으로부터 상향 또는 하향으로 벗어날 필요가 있을 수 있다. 또한, 화합물을 즉시 방출 또는 변형 방출, 예컨대 연장 또는 제어 방출을 위해 제제화할 수도 있다.
용어 "환자"에는 의학적 상태의 예방 또는 치료를 위해 본 발명의 활성제를 사용하는 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간이 포함된다. 환자에 대한 약물 투여는 자가-투여 및 또 다른 사람에 의한 환자에의 투여 둘 다를 포함한다. 환자는 존재하는 질환 또는 의학적 상태의 치료를 필요로 할 수도 있고, 상기 질환 또는 의학적 상태가 발생하거나 질환 또는 의학적 상태로부터 장기간 합병증이 발생할 위험을 예방하거나 감소시키기 위한 예방적 치료를 원할 수도 있다.
용어 치료 유효량은 연구원, 수의사, 의사 또는 다른 임상의에 의해 정해지는, 조직, 계, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 이끌어 낼 약물 또는 제약 작용제의 양을 의미하는 것으로 의도된다. 예방 유효량은 연구원, 수의사, 의사 또는 다른 임상의에 의해 조직, 계, 동물 또는 인간에서 예방되도록 정해지는, 생물학적 또는 의학적 사건의 발생 위험을 예방 또는 감소시킬 제약 약물의 양을 의미하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 용어 "예방하는", "예방", "예방적" 및 이들 용어의 파생어는 환자에게 아직 존재하지 않는 상태의 임상적 증상의 발병 전에 환자에게 화합물을 투여하는 것을 지칭한다. 특정한 1일 투여량은 동시에, 예를 들어 고혈압의 치료를 위한 치료 유효량, 및 예를 들어 심근경색 위험의 예방 또는 감소, 또는 고혈압과 관련된 합병증 위험의 예방 또는 감소를 위한 예방 유효량 둘 다일 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명의 치료 방법에서, ROMK 억제제는 통상적인 비-독성의 제약상 허용되는 담체, 아주반트 및 비히클을 함유하는 투여 단위 제제로 임의의 적합한 투여경로를 통해, 예컨대, 예를 들어 경구, 비경구 또는 직장내 투여될 수 있다. 본원에 사용된 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내 (IV), 근육내, 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 경구 제제는 만성 적응증, 예컨대 고혈압 또는 만성 심부전의 치료에 바람직하고, 특히 고체 경구 투여 단위, 예컨대 환제, 정제 또는 캡슐, 보다 특히 정제가 바람직하다. IV 투여는 급성 치료, 예를 들어 급성 심부전의 치료에 바람직하다.
본 발명은 또한 화학식 Ia의 화합물, 및 하나 이상의 부형제 또는 첨가제로 구성된 제약상 허용되는 담체로 구성된 제약 조성물을 제공한다. 부형제 또는 첨가제는 활성 약물 성분을 제제화하는데 사용되는 불활성 물질이다. 경구 사용을 위한, 활성 성분을 함유하는 본 발명의 제약 조성물은 환제, 정제, 트로키, 로젠지, 수성 또는 유성 현탁액, 분산성 분말 또는 과립, 에멀젼, 경질 또는 연질 캡슐, 또는 시럽 또는 엘릭시르와 같은 형태일 수 있다. 경구 사용으로 의도되는 조성물은 제약 조성물의 제조 분야에 공지된 임의의 방법에 따라 제조할 수 있다. 정제는 활성 성분을 정제의 제조에 적합한 비-독성의 제약상 허용되는 부형제와 혼합하여 함유한다. 부형제는, 예를 들어 불활성 희석제, 예컨대 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토스, 만니톨, 인산칼슘 또는 인산나트륨; 과립화제 및 붕해제, 예를 들어 옥수수 전분 또는 알긴산; 결합제, 예를 들어 전분, 젤라틴 또는 아카시아, 및 윤활제, 예를 들어 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 활석일 수 있다.
제약 조성물은 또한 다른 통상의 첨가제, 예를 들어 습윤제, 안정화제, 유화제, 분산제, 보존제, 감미제, 착색제, 향미제, 방향화제, 증점제, 완충 물질, 용매, 가용화제, 데포 효과 달성용 작용제, 삼투압 변경용 염, 코팅제 또는 항산화제 (이에 제한되지는 않음)를 함유할 수 있다.
경구 즉시-방출 및 시간-제어 방출 투여 형태, 뿐만 아니라 장용 코팅된 경구 투여 형태가 사용될 수 있다. 정제는 비코팅될 수 있거나, 또는 심미적 목적을 위해, 맛을 차폐시키기 위해, 또는 다른 이유를 위해 공지된 기술에 의해 코팅될 수 있다. 또한, 코팅은 위장관에서의 붕해 및 흡수를 지연시킴으로써 보다 긴 기간에 걸친 지속 작용을 제공하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 시간 지연 물질, 예컨대 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트가 사용될 수 있다.
경구 사용을 위한 제제는 또한 활성 성분이 불활성 고체 희석제, 예를 들어 탄산칼슘, 인산칼슘 또는 카올린과 혼합된 경질 젤라틴 캡슐, 또는 활성 성분이 물 또는 혼화성 용매, 예컨대 프로필렌 글리콜, PEG 및 에탄올, 또는 오일 매질, 예를 들어 땅콩 오일, 액상 파라핀 또는 올리브 오일과 혼합된 연질 젤라틴 캡슐로서 존재할 수 있다.
수성 현탁액은 활성 물질을 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 혼합하여 함유한다. 유성 현탁액은 활성 성분을 식물성 오일, 예를 들어 아라키스 오일, 올리브 오일, 참깨 오일 또는 코코넛 오일 중에, 또는 미네랄 오일, 예컨대 액상 파라핀 중에 현탁시킴으로써 제제화할 수 있다. 유성 현탁액은 증점제, 예를 들어 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알콜을 함유할 수 있다. 감미제 및 향미제를 첨가하여 맛좋은 경구 제제를 제공할 수 있다. 이들 조성물은 항산화제, 예컨대 아스코르브산을 첨가함으로써 보존될 수 있다. 시럽 및 엘릭시르는 감미제, 예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨 또는 수크로스와 함께 제제화될 수 있다.
본 발명은 또한 화학식 Ia의 화합물을 제약상 허용되는 담체와 배합하는 것을 포함하는 제약 조성물의 제조 방법을 포함한다. 또한, 화학식 Ia의 화합물을 제약상 허용되는 담체와 배합함으로써 제조된 제약 조성물을 포함한다. 또한, 치료 유효량의 본 발명의 화합물은 ROMK의 억제, 이뇨 및/또는 나트륨이뇨의 유발, 및/또는 본원에 기재된 임의의 의학적 상태의 치료, 예방 또는 위험 감소에 유용한 의약의 제조를 위해 본원에 기재된 투여량으로 사용될 수 있다.
제약 조성물 내의 화학식 Ia의 활성 화합물 및/또는 그의 제약상 허용되는 염의 양은, 예를 들어 유리 산/유리 염기의 중량을 기준으로 용량당 0.1 내지 200 mg, 특히 0.1 내지 100 mg, 보다 특히 0.1 내지 50 mg (이에 제한되지는 않음)일 수 있으나, 제약 조성물의 유형 및 활성 성분의 효력 및/또는 치료되는 의학적 상태에 따라 보다 낮아지거나 보다 높아질 수 있다. 제약 조성물은 통상적으로 유리 산/유리 염기의 중량을 기준으로 0.5 내지 90 중량%의 활성 화합물을 포함한다.
화학식 Ia의 화합물은 ROMK를 억제한다. 이 특성 때문에, 인간 의약 및 수의학적 의약에서 제약 활성 화합물로서의 용도 외에, 이는 또한 과학적 도구로서 또는 ROMK에 대한 이러한 효과가 의도되는 생화학적 연구를 위한 보조제로서, 및 또한 진단 목적을 위해, 예를 들어 세포 샘플 또는 조직 샘플의 시험관내 진단에서 사용될 수 있다. 화학식 Ia의 화합물은 또한 다른 제약 활성 화합물의 제조를 위한 중간체로서 사용될 수 있다.
하나 이상의 추가의 약리학적 활성제를 화학식 Ia의 화합물과 조합하여 투여할 수 있다. 추가의 활성제 (또는 작용제)는 화합물 Ia의 화합물과 상이한 화합물을 의미하는 것으로 의도되고, 이는 투여 후에 제약 활성 형태로 전환되는 전구약물을 포함하는 신체에서 활성인 제약 활성제 (또는 작용제)이고, 또한 상기 추가의 활성제의 유리 산, 유리 염기 및 제약상 허용되는 염을, 이러한 형태가 상업적으로 판매되거나 또는 달리 화학적으로 가능할 경우 포함한다. 일반적으로, 항고혈압제, 추가의 이뇨제, 항아테롬성동맥경화제, 예컨대 지질 변형 화합물, 항당뇨병제 및/또는 항비만제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 추가의 활성제 또는 작용제는, 화학식 Ia의 화합물과 임의로 조합되어 단일 투여 제제로 사용될 수 있거나 (고정 용량 약물 조합물), 또는 활성제의 동시 또는 순차적 투여를 허용하는 하나 이상의 개별 투여 제제로 환자에게 투여될 수 있다 (개별 활성제의 공-투여). 사용될 수 있는 추가의 활성제의 예는 안지오텐신 전환 효소 억제제 (예를 들어 알라세프릴, 베나제프릴, 캅토프릴, 세로나프릴, 실라자프릴, 델라프릴, 에날라프릴, 에날라프릴라트, 포시노프릴, 이미다프릴, 리시노프릴, 모벨티프릴, 페린도프릴, 퀴나프릴, 라미프릴, 스피라프릴, 테모카프릴 또는 트란돌라프릴); 안지오텐신 수용체 차단제 또는 ARB로도 공지된 안지오텐신 II 수용체 길항제 (예를 들어 로사르탄, 즉 코자르(COZAAR)®, 발사르탄, 칸데사르탄, 올메사르탄, 텔메사르탄, 에프로사르탄, 이르베사르탄, 및 히드로클로로티아지드와 조합하여 사용되는 임의의 이들 약물, 예컨대 하이자르(HYZAAR)®); 이뇨제, 예를 들어 히드로클로로티아지드 (HCTZ); 칼륨 보존성 이뇨제, 예컨대 각각 HCTZ가 있거나 없는, 아밀로리드 HCl, 스피로노락톤, 에플레라논, 트리암테렌; 중성 엔도펩티다제 억제제 (예를 들어 티오르판 및 포스포르아미돈); 알도스테론 길항제; 알도스테론 신타제 억제제; 레닌 억제제 (예를 들어 디- 및 트리-펩티드의 우레아 유도체 (미국 특허 번호 5,116,835 참조), 아미노산 및 유도체 (미국 특허 5,095,119 및 5,104,869), 비-펩티드성 결합에 의해 연결된 아미노산 쇄 (미국 특허 5,114,937), 디- 및 트리-펩티드 유도체 (미국 특허 5,106,835), 펩티딜 아미노 디올 (미국 특허 5,063,208 및 4,845,079) 및 펩티딜 베타-아미노아실 아미노디올 카르바메이트 (미국 특허 5,089,471); 또한, 하기 미국 특허 5,071,837; 5,064,965; 5,063,207; 5,036,054; 5,036,053; 5,034,512 및 4,894,437에 개시된 바와 같은 다양한 다른 펩티드 유사체, 및 소분자 레닌 억제제 (디올 술폰아미드 및 술피닐 (미국 특허 5,098,924), N-모르폴리노 유도체 (미국 특허 5,055,466), N-헤테로시클릭 알콜 (미국 특허 4,885,292) 및 피롤이미다졸론 (미국 특허 5,075,451); 또한, 펩스타틴 유도체 (미국 특허 4,980,283) 및 스타톤-함유 펩티드의 플루오로- 및 클로로-유도체 (미국 특허 5,066,643); 에날크레인; RO 42-5892; A 65317; CP 80794; ES 1005; ES 8891; SQ 34017; 알리스키렌 (2(S),4(S),5(S),7(S)-N-(2-카르바모일-2-메틸프로필)-5-아미노-4-히드록시-2,7-디이소프로필-8-[4-메톡시-3-(3-메톡시프로폭시)-페닐]-옥탄아미드 헤미푸마레이트) SPP600, SPP630 및 SPP635 포함); 엔도텔린 수용체 길항제; 혈관확장제 (예를 들어 니트로프루시드); 칼슘 채널 차단제 (예를 들어 암로디핀, 니페디핀, 베라파밀, 딜티아젬, 펠로디핀, 갈로파밀, 닐루디핀, 니모디핀, 니카르디핀); 칼륨 채널 활성화제 (예를 들어 니코란딜, 피나시딜, 크로마칼림, 미녹시딜, 아프릴칼림, 로프라졸람); 교감신경차단제; 베타-아드레날린성 차단 약물 (예를 들어 아세부톨롤, 아테놀롤, 베탁솔롤, 비소프롤롤, 카르베딜롤, 메토프롤롤, 메토프롤롤 타르테이트, 나돌롤, 프로프라놀롤, 소탈롤, 티몰롤); 알파 아드레날린성 차단 약물 (예를 들어 독사조신, 프라조신 또는 알파 메틸도파); 중추성 알파 아드레날린성 효능제; 말초 혈관확장제 (예를 들어 히드랄라진); 지질 강하제, 예를 들어 HMG-CoA 리덕타제 억제제, 예컨대 심바스타틴 및 로바스타틴 (이들은 락톤 전구약물 형태로 조코르(ZOCOR)® 및 메바코르(MEVACOR)®로서 시판되고, 투여 후에 억제제로서 기능함), 및 디히드록시 개방형 고리 산 HMG-CoA 리덕타제 억제제의 제약상 허용되는 염, 예컨대 아토르바스타틴 (특히 리피토르(LIPITOR)®로 판매되는 칼슘 염), 로수바스타틴 (특히 크레스토르(CRESTOR)®로 판매되는 칼슘 염), 프라바스타틴 (특히 프라바콜(PRAVACHOL)®로 판매되는 나트륨 염) 및 플루바스타틴 (특히 레스콜(LESCOL)®로 판매되는 나트륨 염); 콜레스테롤 흡수 억제제, 예컨대 에제티미브 (제티아(ZETIA)®), 및 임의의 다른 지질 강하제, 예컨대 상기 나타낸 HMG-CoA 리덕타제 억제제, 특히 심바스타틴 (비토린(VYTORIN)®) 또는 아토르바스타틴 칼슘과 조합된 에제티미브; 즉시-방출 또는 제어 방출 형태의 니아신, 및 특히 DP 길항제, 예컨대 라로피프란트 (트레답티브(TREDAPTIVE)®) 및/또는 HMG-CoA 리덕타제 억제제와 조합된 니아신; 니아신 수용체 효능제, 예컨대 아시피목스 및 아시프란, 뿐만 아니라 니아신 수용체 부분 효능제; 대사 변경제, 예컨대 인슐린 감작제 및 당뇨병의 치료를 위한 관련 화합물, 예컨대 비구아니드 (예를 들어 메트포르민), 메글리티니드 (예를 들어 레파글리니드, 나테글리니드), 술포닐우레아 (예를 들어 클로르프로파미드, 글리메피리드, 글리피지드, 글리부리드, 톨라자미드, 톨부타미드), 글리타존으로도 지칭되는 티아졸리딘디온 (예를 들어 피오글리타존, 로시글리타존), 알파 글루코시다제 억제제 (예를 들어 아카르보스, 미글리톨), 디펩티딜 펩티다제 억제제, (예를 들어 시타글립틴 (자누비아(JANUVIA)®)), 알로글립틴, 빌다글립틴, 삭사글립틴, 리나글립틴, 두토글립틴, 게미글립틴), 맥각 알칼로이드 (예를 들어 브로모크립틴), 조합 의약, 예컨대 자누메트(JANUMET)® (메트포르민 함유 시타글립틴), 및 주사가능한 당뇨병 의약, 예컨대 엑세나티드 및 프람린티드 아세테이트; 또는 디아족시드를 포함하나 이에 제한되지 않는 상기 언급된 질환의 예방 또는 치료에 유익한 다른 약물을 포함하나 이에 제한되지 않으며; 화학적으로 가능한 경우에는 상기 활성제의 유리 산, 유리 염기 및 제약상 허용되는 염 형태를 포함한다.
본 발명의 화합물의 몇몇 제조 방법을 실시예에 기재한다. 출발 물질 및 중간체는 구입하거나, 공지된 절차에 따라 제조하거나, 또는 달리 예시한다. 화학식 Ia의 화합물에 대해 빈번하게 적용되는 일부 경로를 또한 하기 반응식에 기재한다. 일부 경우, 반응식의 단계를 수행하는 순서는 반응을 용이하게 하거나 또는 원치 않는 반응 생성물을 회피하기 위해 달라질 수 있다.
본 발명의 화합물은 반응식 1에 나타낸 바와 같이 구조 2의 카르복실산과 적절하게 치환된 피페라진 1을 커플링시켜 아미드를 형성함으로써 제조할 수 있다. 이는 HOBt 및 염기, 예컨대 트리에틸아민의 존재 또는 부재 하에 EDC를 사용하는 것, 또는 다양한 다른 아미드 커플링 시약, 예컨대 HATU를 사용하는 것을 포함하는, 화학자에게 널리 공지된 다수의 방법으로 달성될 수 있다.
반응식 1
피페라진 1은 반응식 2에 따라 제조할 수 있다. 에폭시드 3을 용매, 예컨대 에탄올, DMSO 또는 톨루엔 중에서 가열함으로써 적절하게 보호된 히드록시알킬피페라진 4와 커플링시켜 디올 5를 제공한다 (문헌 [Nomura, Y. et al. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 1995, 43(2), 241-6]). 가열은 통상적인 열조 또는 마이크로웨이브 조사에 의해 수행될 수 있다. 적합한 용매, 예컨대 벤젠 또는 톨루엔 중에서 시약 시아노메틸렌 트리-n-부틸포스포란과 함께 가열하는 것을 포함하는 다양한 방법에 의해 디올 5를 고리화시켜 6 또는 7-원 고리 6을 제공할 수 있다. 가열은 통상적인 열조 또는 마이크로웨이브 조사에 의해 수행할 수 있다. 생성된 화합물 6은 일반적으로 시스 및 트랜스 이성질체의 혼합물이다. 이어서 보호기 (문헌 [Greene, T.; Wuts, P. G. M. protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Inc., New York, NY 1991])를 제거할 수 있다. 예를 들어 보호기가 반응식 2에 나타낸 바와 같은 Boc인 경우, 제거를 산, 예컨대 TFA 또는 HCl로의 처리에 의해 달성하여 피페라진 1A를 제공할 수 있다. 대안적으로는, 화합물 6을 실리카 크로마토그래피 또는 키랄 칼럼을 사용하는 정제용 고압 액체 크로마토그래피에 의해 분리하여, 분리된 시스 6 (시스) 및 트랜스 6 (트랜스) 이성질체를 제공할 수 있다. 순수한 시스 및 트랜스 이성질체의 보호기는, Boc 기의 경우에 산, 예컨대 TFA 또는 HCl로의 처리에 의해 제거하여 피페라진 1A를 순수한 시스 및 트랜스 이성질체 1A (시스) 및 1A (트랜스)로서 제공할 수 있다. 히드록시알킬피페라진 4의 단일 거울상이성질체를 사용하는 경우에는, 단일 거울상이성질체 시스 및 트랜스 이성질체 1A (시스) 및 1A (트랜스)를 수득할 수 있다.
반응식 2
보호된 피페라진 6은 또한 반응식 3에 따라 먼저 히드록시알킬피페라진 4를 브로모메틸케톤 (또는 클로로메틸 케톤) 7과 커플링시켜 헤미케탈 8을 제공함으로써 제조할 수 있다. 이는 전형적으로 염기, 예컨대 트리에틸아민 또는 디에틸이소프로필아민의 존재 하에 달성된다. 생성된 헤미케탈 8은, 예를 들어 산 촉매, 예컨대 트리플루오로아세트산의 존재 하에 트리에틸실란을 사용한 환원에 의해 피페라진 1A로 직접 전환시킬 수 있다. 시스 및 트랜스 이성질체의 분리가 바람직한 경우에는, 보호기, 예컨대 Boc를 예를 들어 Boc2O를 사용하여 부착함으로써 중간체 6을 수득할 수 있고, 이를 반응식 2에 기재된 바와 같이 시스 및 트랜스 이성질체로 분리할 수 있다. 대안적으로는, 헤미케탈 8을, 메실 클로라이드 및 염기, 예컨대 트리에틸아민으로 메실레이트를 형성시키고, 이어서 염기의 존재 하에 제거하여 엔올 에테르 9를 제공하는 것을 포함하는 3단계 순서에 의해 환원시킬 수 있다. 이어서 엔올 에테르 9를 촉매, 예컨대 탄소상 팔라듐의 존재 하에 수소화함으로써 환원시켜 보호된 피페라진 6을 제공할 수 있고, 이를 반응식 2에 기재된 바와 같이 시스 및 트랜스 이성질체로 분리할 수 있다. 이들을 반응식 2에 기재된 바와 같이 피페라진 중간체 1A (시스) 및 1A (트랜스)로 전환시킬 수 있다.
반응식 3
대안적으로, 중간체 1의 하위부류인 피페라진 1B는 반응식 4에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 중간체 5 (반응식 2에 기재된 바와 같이 제조함)의 Boc 보호 기를 산, 예컨대 TFA 또는 HCl로의 최초 처리에 이어서 염기, 예컨대 트리에틸아민의 존재 하에 벤질 클로로포르메이트와 커플링시킴으로써 벤질 카르바메이트 (Cbz) 기로 전환시킨다. 생성된 Cbz-피페라진 디올 5A를 티오닐 클로라이드와 함께 가열함으로써 상응하는 디클로로 중간체로 전환시키고; 이어서 디클로라이드를 아이오딘화나트륨의 존재 하에 알릴아민과 함께 가열하여 아릴 치환된 융합된 피페라진 10을 제공한다. 알릴 기는 촉매, 예컨대 팔라듐 테트라키스 트리페닐포스핀의 존재 하에 1,3-디메틸피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온과 함께 가온하는 것을 포함하는 몇몇 방법에 의해 제거할 수 있다. 이어서 노출된 아민을 아민, 예컨대 트리에틸아민의 존재 하에 Boc2O로의 처리에 의해 tert-부톡시카바메이트 기로 재보호하여, 일반적으로 시스 및 트랜스 이성질체의 혼합물로서 중간체 6B를 제공한다. 시스 및 트랜스 이성질체는 반응식 2에 기재된 바와 같이 실리카 크로마토그래피 또는 키랄 정제용 HPLC에 의해 분리할 수 있다. 중간체 5를 (반응식 2에 기재된 바와 같이) 4의 단일 거울상이성질체로부터 제조한 경우에는, 생성된 중간체 6B (시스) 및 6B (트랜스)도 단일 이성질체이다. 대안적으로는, 시스 및 트랜스 이성질체의 분리를 중간체 10의 시스/트랜스 이성질체의 분리에 의해 보다 이전 단계에서 수행할 수 있다. 중간체 6B (시스) 및 6B (트랜스)의 Cbz 보호기는, 예를 들어 촉매, 예컨대 탄소상 팔라듐 존재 하에서의 가수소분해에 의해 제거하여 중간체 1B (시스) 및 1B (트랜스)를 수득할 수 있다.
반응식 4
대안적으로, 중간체 1의 하위 부류 (1C)는 반응식 5에 따라 제조할 수 있다. 먼저 디올 5를 메탄술포닐 클로라이드, 염기, 예컨대 트리에틸 아민 및 촉매, 예컨대 4-디메틸아미노피리딘으로의 처리에 의해 그의 상응하는 모노-메실레이트로 전환시킨다. 용매, 예컨대 디메틸 술폭시드 (DMSO) 중 티오아세트산칼륨과의 후속 반응으로 중간체 11을 제공한다. 이어서 11의 나머지 히드록실 기를, 예를 들어 티오닐 클로라이드로의 처리에 이은 염기, 예컨대 피리딘의 첨가에 의해 상응하는 클로로 중간체로 전환시킨다. 이어서 생성된 클로로 중간체를 소듐 메톡시드로 처리하여 고리화 술피드 6C를 제공한다. 사용된 출발 디올 5가, 거울상이성질체적으로 순수한 에폭시드 3 및 거울상이성질체적으로 순수한 히드록시알킬피페라진 4로부터 출발한 단일 이성질체 (반응식 2)인 경우에는, 생성된 중간체 6C를 단일 이성질체로서 수득할 수 있다. 대안적으로, 라세미 에폭시드 3 및 단일 거울상이성질체 히드록시알킬피페라진 4를 사용하는 경우에는, 생성된 중간체 6C를 2개의 이성질체 (시스 및 트랜스)의 혼합물로서 수득하며, 이어서 이를 실리카 크로마토그래피 또는 키랄 정제용 HPLC에 의해 단일 이성질체 6C (시스) 및 6C (트랜스)로 분리할 수 있다. 이어서 산, 예컨대 TFA 또는 HCl로의 처리에 의해 tert-부틸 카르바메이트 보호기의 제거를 달성하여 피페라진 1C (시스) 및 1C (트랜스)를 제공할 수 있다.
반응식 5
(반응식 1에서의) 중간체 2는 2의 구조에 따라 다양한 방법으로 제조하며; 몇몇 방법을 하기 실험 섹션에 나타낸다.
에폭시드 3은 다양한 방법에 의해 제조할 수 있다. 한 가지 접근법을 반응식 6에 기재한다. 아릴 또는 헤테로사이클 할라이드 (나타낸 브로마이드 12)를 적절한 포스핀 리간드와의 팔라듐 촉매화 커플링 조건 하에 다수의 방법, 예를 들어 헤크(Heck) 반응 또는 비닐 테트라플루오로보레이트와의 반응 (문헌 [Molander, G.; Luciana, A. Journal of Organic Chemistry, 2005, 70(10), 3950-3956])에 의해 커플링시켜 알켄 생성물 13을 형성할 수 있다 (문헌 [Molander, G.; Brown, A. Journal of Organic Chemistry, 2006, 71(26), 9681-9686]). 이어서 알켄 13을 메타-클로로퍼옥시벤조산으로의 처리를 포함하는 몇몇 방법에 의해 상응하는 에폭시드 3으로 전환시킬 수 있다 (문헌 [Fringuelli, F. et al. Organic Preparations and Procedures International, 1989, 21(6), 757-761]).
반응식 6
브로모메틸케톤 7은 다양한 방법으로 제조할 수 있으며; 한 경로를 반응식 7에 도시한다. 반응식에 따라, 아릴 또는 헤테로시클릭 할라이드 (나타낸 브로마이드 12)를 금속 촉매, 예컨대 PdCl2(PPh3)2의 존재 하에 트리부틸(1-에톡시비닐)주석과 반응시켜 중간체 에틸렌올에테르를 제공할 수 있다. 후속적으로 이것을 동일한 반응 용기에서 테트라히드로푸란 및 물을 첨가하면서 N-브로모숙신이미드 (NBS)로 처리하여 브로모메틸케톤 7을 제공한다. 클로로메틸 케톤은 N-브로모숙신이미드 대신 N-클로로숙신이미드를 사용함으로써 유사하게 제조할 수 있다.
반응식 7
부분입체이성질체 및 거울상이성질체의 독립적 합성 또는 그들의 크로마토그래피성 분리는 본원에 개시된 방법론의 적절한 변형에 의해 당업계에 공지된 바와 같이 달성될 수 있다. 그들의 절대 입체화학은, 필요한 경우 공지된 절대 입체화학의 비대칭 중심을 함유하는 시약을 사용하여 유도체화된 결정질 생성물 또는 결정질 중간체의 X선 결정학에 의해 결정될 수 있다.
대상 화합물은 실시예에 개시된 절차의 적절한 변형에 의해 제조할 수 있다. 출발 물질은 상업적으로 입수가능하거나 공지된 절차 또는 예시된 바와 같이 제조한다. 하기 실시예는 오직 추가 예시의 목적으로 제공되며 개시된 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
수분 또는 공기에 민감한 반응은 무수 용매 및 시약을 사용하여 질소 또는 아르곤 하에서 수행하였다. 반응의 진행은 통상적으로 E. 머크(Merck) 사전 코팅된 TLC 플레이트, 실리카 겔 60F-254, 층 두께 0.25 mm로 수행되는 분석용 박층 크로마토그래피 (TLC) 또는 액체 크로마토그래피-질량 분광측정법 (LC-MS)에 의해 결정하였다.
전형적으로, 사용된 분석용 LC-MS 시스템은 오토샘플러가 있는 애질런트(Agilent) 1100 시리즈 HPLC와 양이온 검출 방식의 전기분무 이온화를 사용하는 워터스(Waters) ZQ 플랫폼으로 이루어져 있다. 칼럼은 통상적으로 워터스 엑스테라(Water Xterra) MS C18, 3.0 x 50 mm, 5 μm였다. 유량은 1 mL/분이었고, 주입 부피는 10 μL였다. UV 검출은 210-400 nm 범위였다. 이동상은 용매 A (물 + 0.06% TFA) 및 용매 B (아세토니트릴 + 0.05% TFA)로 이루어졌고, 0.7분 동안의 100% 용매 A를 3.75분에 걸친 100% 용매 B로 바꾸고 1.1분 동안 유지한 다음 0.2분에 걸친 100% 용매 A로 되돌아가는 구배를 사용하였다.
정제용 HPLC 정제는 통상적으로 질량 분광측정법 지정 시스템을 사용하여 수행하였다. 통상적으로, 이는 전기분무 이온화를 사용하는 워터스 ZQ 단일 사중극자 MS 시스템, 워터스 2525 구배 펌프, 워터스 2767 주입기/수집기, 워터스 996 PDA 검출기로 이루어진 LC-MS 시스템, 150-750 amu, 양성 전기분무, MS에 의해 유발된 수집 및 워터스 선파이어(Waters Sunfire) C-18 5 마이크로미터, 30 mm(id)x100 mm 칼럼의 MS 조건으로 설정된 워터스 크로마토그래피 워크스테이션 상에서 수행하였다. 이동상은 0.1% TFA를 함유하는 물 중 아세토니트릴 (10-100%)의 혼합물로 이루어졌다. 유량은 50 mL/분으로 유지하였고, 주입 부피는 1800μL였고, UV 검출 범위는 210-400 nm였다. 이동상 구배는 개별 화합물에 대해 최적화하였다.
마이크로웨이브 조사를 사용하여 수행되는 반응은 일반적으로 퍼스널 케미스트리(Personal Chemistry)에 의해 제조된 엠리스 옵티마이저(Emrys Optimizer) 또는 바이오타지(Biotage)에 의해 제조된 이니시에이터(Initiator)를 사용하여 실행하였다.
용액의 농축은 감압 하에 회전 증발기 상에서 수행하였다. 플래시 크로마토그래피는 통상적으로 명시된 크기의 사전 패킹된 카트리지 내 실리카 겔 (32-63 mM, 60Å 기공 크기) 상에서 바이오타지 플래시 크로마토그래피 장치 (다이액스 코포레이션(Dyax Corp.))를 사용하여 수행하였다. 1H-NMR 스펙트럼은 달리 나타내지 않는 한, CDCl3 용액 중에서 500 MHz 분광계로 획득하였다. 화학적 이동은 백만분율 (ppm)로 보고하였다. 테트라메틸실란 (TMS)을 CD3Cl 용액 중의 내부 참조로서 사용하였으며, 잔류 CH3OH 피크 또는 TMS를 CD3OD 용액 중의 내부 참조로서 사용하였다. 커플링 상수 (J)는 헤르츠 (Hz)로 보고하였다.
키랄 분석용 크로마토그래피는 통상적으로, 등용매계로서 명시된 퍼센트의 헥산 중 에탄올 (%Et/Hex) 또는 헵탄 중 이소프로판올 (%IPA/Hep)을 사용하여 키랄팩(Chiralpak) AS, 키랄팩 AD, 키랄셀(Chiralcel) OD, 키랄셀 IA 또는 키랄셀 OJ 칼럼 (250 x 4.6 mm) (다이셀 케미칼 인더스트리즈, 리미티드(Daicel Chemical Industries, Ltd.) 중 하나 상에서 수행하였다. 키랄 정제용 크로마토그래피는 때때로, 분석용 키랄 크로마토그래피와 동일한 바람직한 등용매계를 사용하여 키랄팩 AS, 키랄팩 AD, 키랄셀 OD, 키랄셀 IA 또는 키랄셀 OJ 칼럼 (20 x 250 mm) (다이셀 케미칼 인더스트리즈, 리미티드) 중 하나 상에서 수행하였다. 대안적으로는, 키랄 정제용 크로마토그래피를 키랄팩 AS, 키랄팩 AD-H, 키랄셀 OD-H, 키랄팩 IC 또는 키랄셀 OJ-H 칼럼 (250 x 21.2 mm) (다이셀 케미칼 인더스트리즈, 리미티드) 중 하나를 사용하여 초임계 유체 (SFC) 조건에 의해 수행하였다. 체류 시간이 실시예 및 표에 제공되는 경우, 이것은 특정 화합물의 최종적인 특성인 것으로 의도되지 않는데, 이는 당업자에게 공지된 바와 같이 크로마토그래피의 조건, 예컨대 사용된 칼럼, 칼럼의 상태, 및 사용된 용매계 및 기기에 따라 체류 시간은 달라질 것이고, 피크 용리의 시기 및/또는 순서는 변할 수 있기 때문이다.
플래쉬 크로마토그래피는 실리카 겔 (230-400 메쉬) 상에서 수행하였다. NMR 스펙트럼은 달리 나타내지 않는 한, CDCl3 용액 중에서 얻었다. 커플링 상수 (J)는 헤르츠 (Hz) 단위이다. 본원에 사용된 약어: 에틸 아세테이트 (EtOAc), 디클로로메탄 (DCM), 출발 물질 (SM), 디에틸 에테르 (에테르), 트리플루오로아세트산 (TFA), 트리에틸아민 (TEA), N,N-디이소프로필에틸아민 (DIEA, 휘니그 염기, DIPEA), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필), 카르보디이미드 (EDC, EDAC 또는 EDCI), 2-(7-아자-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU), 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (HOBt), 메틸 tert-부틸 에테르 (MTBE), 시클로펜틸 메틸 에테르 (CPME), 1,3-비스(디페닐포스피노)프로판 (DPPP), 2-디시클로헥실포스피노-2'4'6'-트리이소프로필비페닐 (X-포스), 1,2-디클로로에탄 (DCE), N-브로모 숙신이미드 (NBS), N-아이오도숙신이미드 (NIS), 리튬 디이소프로필아미드 (LDA), 테트라히드로푸란 (THF), 디메틸술폭시드 (DMSO), 이소프로판올 (IPA), t-부틸옥시카르보닐 (Boc 또는 BOC), 디-t-부틸 디카르보네이트 (BOC2O, Boc2O), 아세트산 (AcOH; HOAc), N,N-디메틸포름아미드 (DMF), 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP), mCPBA (3-클로로퍼옥시벤조산), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (NADP), 석유 에테르 (PE), 수소화알루미늄리튬 (LAH), 디-이소프로필아민 (DIPA), 카르보닐디이미다졸 (CDI), p-톨루엔술폰산 (TsOH), p-톨루엔-SO2- (토실 또는 Ts), 메탄 술포닐 클로라이드 또는 메실 클로라이드 (Ms-Cl), 메탄술폰산 (MsOH), CH3SO2- (메실 또는 Ms), 디메톡시에탄 (DME), Pd(dppf)Cl2 또는 PdCl2(dppf)는 CH2Cl2와 착화될 수 있는 1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II)임, 헥사메틸포스포르아미드 (HMPA), 이소프로필 아세테이트 (IPAc), 둥근 바닥 플라스크 (RB 또는 RBF), 포화 수성 (sat'd), 중압 액체 크로마토그래피 (MPLC), 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC), 액체 크로마토그래피 (LC), 박층 크로마토그래피 (TLC), 액체 크로마토그래피-질량 분광측정법 (LC-MS 또는 LC/MS), 칼럼 부피 (CV), 실온 (rt, r.t. 또는 RT), 시간 (h 또는 hr), 분 (min). 셀라이트(Celite)는 규조토에 대한 상표명이고 솔카 플록(Solka Floc)은 분말화 셀룰로스에 대한 상표명이다. X 또는 x는 반복되는 작용의 횟수를 나태내거나 (예를 들어, 2 x 200 mL의 1N HCl로 세척함), 또는 치수를 전달하기 위해 (예를 들어, 칼럼의 치수는 30 x 250mm임) 사용될 수 있다.
다음은 이후에 이어지는 실시예에 기재된 최종 생성물을 제조하기 위해 사용되는 중간체의 제조를 위한 대표적인 절차이다. 이들 실시예는 오직 추가 예시의 목적으로 제공되며 개시된 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
중간체 1A 및 1B
1A: tert-부틸(3R,9aS)-3-(1-옥소-1,3-디히드로-2-벤조푸란-5-일)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트; 1B: tert-부틸(3S,9aS)-3-(1-옥소-1,3-디히드로-2-벤조푸란-5-일)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트
단계 A: 5-에테닐-2-벤조푸란-1(3H)-온: 5-브로모프탈리드 (50g, 235 mmol), 포타슘 비닐 트리플루오로보레이트 (62.9 g, 469 mmol) 및 PdCl2(dppf)-CH2Cl2 부가물 (9.58 g, 11.7 mmol)을 에탄올 (500 mL)에 첨가한 다음, TEA (65.4 mL, 469 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 탈기한 다음, 환류 하에 8시간 동안 가열하였다. 반응물을 에틸 아세테이트로 희석하고 염수로 2회 세척함으로써 후처리하였다. 유기 층을 건조시키고, 증발 건조시켰다. 조 생성물을 25% EtOAc/헥산 (3 L)에 이어서 30% EtOAc/헥산 (2 L)을 사용하여 MPLC (실리카, 600g 칼럼)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 B: 5-(옥시란-2-일)-2-벤조푸란-1(3H)-온: 5-에테닐-2-벤조푸란-1(3H)-온 (28.4 g, 177 mmol)을 DCM (400 mL) 중에 용해시킨 다음, mCPBA (47.7g, 213 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 일부 출발 올레핀이 남아있었다. 또 다른 25 g의 mCPBA를 첨가하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 혼합물을 빙냉 Na2SO3 용액 (포화)에 부었다. 층을 분리하고, 유기 층을 5% NaOH 용액, 염수로 세척한 다음, 건조시켰다 (MgSO4). 조 생성물을 MPLC (330 g 칼럼, 40% EtOAc/헥산 2 L에 이어서 45% EtOAc/헥산 2 L로 용리시킴)에 의해 정제하여 5-(옥시란-2-일)-2-벤조푸란-1(3H)-온을 수득하였다.
단계 C: tert-부틸(3S)-3-(히드록시메틸)-4-[2-히드록시-2-(1-옥소-1,3-디히드로-2-벤조푸란-5-일)에틸]피페라진-1-카르복실레이트: 5-(옥시란-2-일)-2-벤조푸란-1(3H)-온 (1.5 g, 8.5 mmol) 및 상업적으로 입수가능한 (S)-4-N-BOC-2-히드록시메틸 피페라진 (2.394 g, 11.07 mmol)을 마이크로웨이브 튜브에서 에탄올 (10 mL)중에 합하였다. 혼합물을 탈기한 다음, 150℃에서 60분 동안 가열하였다. LC-MS는 생성물 피크를 나타내었다. 반응물에 에틸 아세테이트를 첨가하고 염수로 1회 세척함으로써 후처리 하였다. 유기 층을 분리하고, 건조시키고, 농축 건조시켰다. 조 생성물을 80 g 레디-셉(Redi-sep) 칼럼을 사용하여 50%-100% EtOAc/헥산으로 용리시키면서 MPLC에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 D: tert-부틸(9aS)-3-(1-옥소-1,3-디히드로-2-벤조푸란-5-일)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: tert-부틸(3S)-3-(히드록시메틸)-4-[2-히드록시-2-(1-옥소-1,3-디히드로-2-벤조푸란-5-일)에틸]피페라진-1-카르복실레이트 (3.3g, 8.4 mmol) 및 시아노메틸렌 트리-n-부틸포스포란 (3.65 g, 15.1 mmol)을 30 mL의 벤젠 중에 용해시키고, 용액을 탈기한 다음, 100℃로 3시간 동안 가열하였다. LC-MS는 생성물 피크 (M+1= 389)를 나타내었다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 증발 건조시켰다. 잔기를 330 g 레디-셉 칼럼을 통해 15% 아세톤/85% 헥산 혼합물로 용리시키면서 MPLC에 의해 정제하여 표제 화합물의 시스-트랜스 혼합물을 수득하였다.
단계 E: tert-부틸(3R,9aS)-3-(1-옥소-1,3-디히드로-2-벤조푸란-5-일)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 및 tert-부틸(3S,9aS)-3-(1-옥소-1,3-디히드로-2-벤조푸란-5-일)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: 이전 단계로부터의 시스-트랜스 이성질체 혼합물을 키랄셀 OD 4.6 x 250mm 10μ 칼럼을 사용하여 45% IPA/55% 헵탄 용매계로 용리시키면서 분리하였다. 트랜스-이성질체 1A는 11.46분에 첫 번째로 용리되었고, 시스-이성질체 1B는 17.43분에 두 번째로 용리되었다.
중간체 2
5-브로모-4-메틸-2-벤조푸란-1(3H)-온
단계 A: (3-브로모-2-메틸페닐)메탄올: THF (200 mL) 중 3-브로모-2-메틸 벤조산 (35.0 g, 163 mmol)의 용액에 보란 THF 착물 (1.0 M, 212 mL, 212 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 24시간 동안 교반되도록 하였다. TLC는 하나의 단일 생성물 반점을 나타내었다. 반응물을 물로 켄칭하였다. 용매 THF를 감압 하에 제거하였다. 생성된 고체를 에틸 아세테이트 (500 mL) 중에 용해시키고, 1N의 HCl, 탄산나트륨 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시켜 (3-브로모-2-메틸페닐)메탄올을 수득하였다.
단계 B: 5-브로모-4-메틸-2-벤조푸란-1(3H)-온: (3-브로모-2-메틸페닐)메탄올 (6.0 g, 30 mmol)이 채워진 플라스크에 탈륨 트리플루오로아세테이트 (16.2 g, 29.8 mmol)의 1M TFA 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. TLC에 의한 분석은 출발 물질이 남아있지 않음을 나타내었다. 용매를 진공 하에 제거하고, TFA의 완전한 제거를 확실히 하기 위해 잔기를 고진공 하에 30분 동안 펌핑하였다. 이어서 이 잔기에 팔라듐(II) 클로라이드 (529 mg, 2.98 mmol), 염화리튬 (2.53 g, 59.7 mmol), 산화마그네슘 (2.41 g, 59.7 mmol) 및 MeOH (150 mL)를 첨가하였다. 반응물을 CO로 2회 플러싱하고, 실온에서 CO 하에 유지하였다. LC에 의한 분석은 2시간 내에 큰 생성물 반점을 나타내었다. 이 용액에 에틸 아세테이트를 첨가하여 염을 침전시켰다. 용액을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, EtOAc로 세척하고, 실리카 상에 흡착시키고, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다:
중간체 3
4-메틸-5-옥시란-2-일-2-벤조푸란-1(3H)-온
단계 A: 5-에테닐-4-메틸-2-벤조푸란-1(3H)-온: 5-브로모-4-메틸-2-벤조푸란-1(3H)-온 (598 mg, 4.47 mmol), 포타슘 비닐 트리플루오로보레이트 (507 mg, 2.23 mmmol), PdCl2(dppf)-CH2Cl2 부가물 (182 mg, 0.223 mmmol) 및 TEA (0.622 mL, 4.47 mmol)를 20 mL 마이크로웨이브 튜브에서 10 mL 에탄올에 첨가하였다. 튜브를 밀봉하고, 탈기한 다음 140℃에서 20분 동안 가열하였다. LC-MS에 의한 분석은 생성물 피크를 나타내었다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 염수로 2회 세척하고, 건조시키고, 증발 건조시켰다. 조 생성물을 120 g 레디-셉 칼럼 및 0-80% ETOAC/헥산 용매계를 사용하여 MPLC 크로마토그래피에 의해 정제하여 5-에테닐-4-메틸-2-벤조푸란-1(3H)-온을 수득하였다.
단계 B: 4-메틸-5-옥시란-2-일-2-벤조푸란-1(3H)-온: 5-에테닐-4-메틸-2-벤조푸란-1(3H)-온 (1.46 g, 8.38 mmol)을 DCM (25 mL)에 0℃에서 첨가한 다음, mCPBA (2.89 g, 16.8 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 수성 Na2S2O3, NaHCO3 및 염수로 각각 1회 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켰다. 조 물질을 120 g 레디-셉 칼럼을 통해 0-80% EtOAc/헥산 용매계로 용리시키면서 MPLC에 의해 정제하여 표적 4-메틸-5-옥시란-2-일-2-벤조푸란-1(3H)-온을 수득하였다.
중간체 3A 및 3B (방법 1)
3A: 4-메틸-5-[(2S)-옥시란-2-일]-2-벤조푸란-1(3H)-온 및 3B: 4-메틸-5-[(2R)-옥시란-2-일]-2-벤조푸란-1(3H)-온: 라세미 4-메틸-5-옥시란-2-일-2-벤조푸란-1(3H)-온을 베르게르(Berger) MGIII 정제용 SFC 기기 상 초임계 유체 크로마토그래피 (SFC) 조건 하에 키랄팩® AD-H 칼럼 (5 x 25cm) 상에서 분해하였다. 라세미체를 1:1 DCM:MeOH 중에 50 mg/mL로 희석하였다. 10% EtOH/CO2, 유량 200 mL/분, 100 bar, 25℃를 사용하여 분리를 달성하였다. 매 2.12분의 간격을 두고 500ul를 주입하였다. 보다 빠르게 용리되는 에폭시드 3B는 5.2분에 용리되었고, 보다 느리게 용리되는 에폭시드 3A는 5.6분에 용리되었다.
대안적으로는, 100ml/분의 유량으로 8% MeOH/98% CO2의 이동상을 사용하여 분해를 달성할 수도 있었다. 이 경우, 샘플은 메탄올 20mg/ml 중에 용해시키고, 주입당 1 mL 부피를 사용함으로써 제조하였다. 분리한 후, 분획을 조 온도 40℃에서 회전 증발기를 통해 건조시켰다.
각각의 거울상이성질체 3A 및 3B의 절대 입체화학은 3B로 제조된 최종 화합물의 X-선 결정 구조 결정에 근거하여 추정하거나, 3B로부터 출발하여 제조된 에스테르의 모셔(Mosher) 에스테르 및 트로스트(Trost) 에스테르 HNMR 분석에 의해 추정하였다 (tert-부틸-4-[(2R-2-히드록시-2-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로-2-벤조푸란-5-일)에틸}피페라진-1-카르복실레이트를 사용함).
중간체 3B (방법 2)
단계 A: 3-히드록시메틸-2-메틸 페놀: 오버헤드 교반기가 구비된 5L 3 구 RB에 NaBH4 (87.0 g, 2.30 mol) 및 THF (3.0 L)를 채우고, 생성된 슬러리를 10℃로 냉각시켰다. 이어서 슬러리에 3-히드록시-2-메틸 벤조산 (175 g, 1.15 mol)을 20분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다 (Tmax 17℃). 교반가능한 슬러리를 형성시키고, 추가로 45분 동안 10-15℃에서 숙성시킨 후, BF3-OEt2 (321 mL, 2.53 mol)를 1.5시간에 걸쳐 천천히 첨가하였다. 슬러리를 10℃-15℃에서 2시간 동안 숙성시킨 다음, 반응 완결 (98.5% 전환)을 검정하였다. 슬러리를 10℃ 미만으로 냉각시키고, 931 mL MeOH로 1.5시간에 걸쳐 천천히 켄칭하였다 (기체 발생). 생성된 슬러리를 실온에서 밤새 숙성시켰다. 배치를 10℃ 미만으로 냉각시킨 다음, 1 N HCl (1.5 L)로 켄칭하여 균질 용액 (~1의 pH 용액)을 얻었고, 이를 30분 동안 숙성시킨 다음, 유기 용매를 회전 증발에 의해 대략 1.8 L의 전체 반응 부피까지 제거하였다 (조 온도는 50℃로 설정하였고; 회전 증발 후의 농축물 내부 온도는 ~40℃였음). 슬러리를 45℃에 30분 동안 두었고, 이어서 15℃로 천천히 냉각시켰다. 고체를 여과하고, 차가운 (15℃) 물 (2 x 300 mL)로 세척하여 3-히드록시메틸-2-메틸 페놀을 수득하였다.
단계 B: 4-브로모-3-히드록시메틸-2-메틸 페놀: 3-히드록시메틸-2-메틸 페놀 (113.9 g, 824.0 mmol)을 3-구 5-L 플라스크에서 질소 하에 아세토니트릴 (850 mL) 및 트리플루오로아세트산 (750.0 mL, 9,735 mmol)의 혼합물 중에 용해시켰다. 반응 혼합물을 -33℃로 냉각시켰다. N-브로모숙신이미드 (141 g, 791 mmol)를 15분에 걸쳐 첨가하였고, 첨가하는 동안의 온도는 -35 내지 -33℃ 범위였다. 반응 혼합물을 추가로 15분 동안 교반되도록 하였고, 이 시간 동안 온도는 -40℃로 감소되었다. 냉각조를 제거하고, 물로 총 1.0 L의 부피까지 희석한 탄산칼륨 (741.0 g, 5,358 mmol)을 첨가하였다. 기체 방출이 관찰되었고, 온도를 25℃로 증가시켰다. MTBE (1.5 L)를 첨가하고, 반응 혼합물을 분리 깔때기로 옮겼다. 층을 분리하였다. 수성 층을 물 (500 mL)로 희석하고, MTBE (1 L) + EtOAc (500 mL)에 이어서 MTBE (500 mL) + EtOAc (250 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 물 (240 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 황산나트륨을 여과에 의해 제거하고, 추가의 MTBE로 세척하고, 감압 하에 농축시켰다. MTBE (684 mL, 2 부피)를 첨가하고, 현탁액을 40℃로 가열하여 균질 용액을 생성하였다. 용액을 실온으로 냉각되도록 하였다. 헵탄 6 부피를 첨가하고, 현탁액을 밤새 교반하였다. 현탁액을 여과하고, 고체를 4:1 헵탄:MTBE (500 mL)에 이어서 헵탄 (500 mL)으로 세척하였다. 고체를 진공 하에 건조시켜 4-브로모-3-히드록시메틸-2-메틸 페놀을 수득하였다.
단계 C: 5-히드록시-4-메틸-3H-이소벤조푸란-1-온: 오버헤드 교반기, N2 유입구 및 응축기가 구비된 2 L 3 구 플라스크에 4-브로모-3-히드록시메틸-2-메틸 페놀 (100 g, 461 mmol), CuCN (83.0 g, 921 mmol) 및 DMF (500 mL)를 채웠다. 용액을 N2로 15분 동안 폭기한 다음, 145℃로 가열하여 균질 용액을 수득하였다. 용액을 145℃에서 2시간 동안 숙성시키고, 이어서 반응 혼합물을 95℃로 냉각시켰다. 41.5 mL의 물을 첨가하고 (N2로 폭기함), 반응물을 20시간 동안 숙성시켰다. 반응물을 실온으로 냉각시킨 다음, 고체를 솔카 플록을 통해 여과하고, 케이크를 50 mL의 DMF로 세척하였다. 1 L의 EtOAc가 들은 3 L 플라스크에 DMF 여과물을 첨가하였다. 침전물 코팅이 플라스크 바닥에 형성되었다. DMF/EtOAc 현탁액을 솔카 플록을 통해 여과하고, 케이크를 250 mL EtOAc로 세척하였다. 생성된 여과물을 5% 염수 용액 (3 x 500 mL)으로 세척하였다. 수성 층을 500 mL EtOAc로 추출하고, 합한 유기부를 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 고체를 실온에서 250 mL MTBE 중에 슬러리화하고, 이어서 여과하고, 100 mL MTBE로 세척하였다. 고체를 진공 하에 실온에서 건조시켜 5-히드록시-4-메틸-3H-이소벤조푸란-1-온을 수득하였다.
단계 D: 트리플루오로메탄술폰산 4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로-이소벤조푸란-5-일 에스테르
5-히드록시-4-메틸-3H-이소벤조푸란-1-온 (46.8 g, 285 mmol)을 오버헤드 교반기가 구비된 2-L 둥근바닥 플라스크에서 질소 하에 디클로로메탄 (935 mL) 중에 현탁시켰다. 트리에틸아민 (59.5 mL, 427 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 빙조에서 3.8℃로 냉각시켰다. 트리플루오로메탄술폰산 무수물 (67.4 mL, 399 mmol)을 온도 10℃ 미만을 유지하면서 첨가 깔때기를 통해 50분에 걸쳐 첨가하였다. 반응 혼합물을 추가로 15분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 물 (200 mL)로 켄칭하고, 이어서 DARCO® KB (활성 탄소, 25 g)와 함께 15분 동안 교반하였다. 2상 혼합물을 솔카 플록 상에서 추가의 디클로로메탄으로 세척하면서 여과하고, 분리 깔때기로 옮기고, 여기서 이를 추가의 물 (300 mL)로 희석하였다. 층을 분리하고, 유기 층을 물 (500 mL) 및 10% 염수 (200 mL)로 세척하였다. 디클로로메탄 용액을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 고체를 실리카 겔 (27.5 g) 상에 흡착시키고 실리카 겔의 패드 (271 g)를 통해 25% 에틸 아세테이트/헥산으로 용리시켰다. 생성된 용액을 진공 하에 농축시켰고, 농축하는 동안 생성물이 침전되었다. 현탁액을 여과하고, 고체를 헵탄으로 세척하고, 진공 및 질소 하에 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다.
단계 E: 5-(1-부톡시-비닐)-4-메틸-3H-이소벤조푸란-1-온: 1 L 3-구에 트리플루오로메탄술폰산 4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로-이소벤조푸란-5-일 에스테르 (63.0 g, 213 mmol), DMF (315 mL), 부틸 비닐 에테르 (138 mL, 1063 mmol)에 이어서 Et3N (35.6 mL, 255 mmol)을 채웠다. 용액을 20분 동안 N2로 폭기시켰다. 용액에 Pd(OAc)2 (1.19 g, 5.32 mmol) 및 DPPP (2.41 g, 5.85 mmol)를 첨가하고, 추가로 10분 동안 폭기시킨 다음, 80℃로 가열하였다. 1시간 숙성 후, 용액을 10℃ 미만으로 냉각시키고, 이어서 630 mL EtOAc로 켄칭하고, 5% NH4Cl (2 x 315 mL), 10% 염수 (2 x 315 mL)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 회전 증발에 의해 농축시키고, EtOAc (3 x 100 mL)로 플러싱하여 과량의 부틸 비닐 에테르를 제거하여 조 5-(1-부톡시-비닐 포함)-4-메틸-3H-이소벤조푸란-1-온을 수득하였다.
단계 F: 5-(2-브로모-아세틸)-4-메틸-3H-이소벤조푸란-1-온: 오버헤드 교반기가 구비된 1 L 3-구 플라스크에 조 5-(1-부톡시-비닐)-4-메틸-3H-이소벤조푸란-1-온 (55.8 g) 및 THF (315 mL)를 첨가하였다. 용액을 5℃ 미만으로 냉각시킨 후 물 (79 mL)을 첨가하고, 용액을 5℃ 미만으로 유지하였다. 이어서 Tmax = 19℃로 유지하면서 NBS (41.6 g)를 조금씩 첨가하였다. 이어서 용액을 실온으로 30분 동안 가온하였다. HBr (48%, 0.241 mL)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 대략 1시간 동안 숙성시킨 후 이어서 236 mL의 물을 배치에 첨가하였다. 수조를 사용하여 온도를 20℃로 유지하였다. 또 다른 315 mL의 물을 첨가하고 (용매 조성 1:2 THF:물), 슬러리를 15℃로 냉각시켰다. 생성된 고체를 여과하고, 차가운 1:2 THF:물 (15℃): 150 mL 치환 세척액에 이어서 100 mL 슬러리 세척액으로 세척하였다. 고체를 진공 하에 실온에서 건조시켜 5-(2-브로모-아세틸)-4-메틸-3H-이소벤조푸란-1-온을 수득하였다.
단계 G: 4-메틸-5-[(2R)-옥시란-2-일]-2-벤조푸란-1(3H)-온: 5-(2-브로모-아세틸)-4-메틸-3H-이소벤조푸란-1-온 (48.8 g, 181 mmol)을 오버헤드 교반기, 열전쌍 및 가열 맨틀이 구비된 5 L 3 구 RB 플라스크에 채웠다. 2-프로판올 (1.22 L)에 이어서 pH 7의 0.1M 인산칼륨 완충제 610 mL를 첨가하였다. 완충 용액 (610 mL)을1.0 L 에를렌마이어에 채우고, NADP 2.44 g을 에를렌마이어에 첨가하고, 휘저어 용해시켰다. 환원 효소 KRED MIF-20 (2.44 g) (캘리포니아주 94063 레드우드 시티 페노브스콧 드라이브 200에 소재한 코덱시스, 인크.(Codexis, Inc.) (www.codexis.com, 전화번호 1-650-421-8100)로부터 입수가능함)을 에를렌마이어 플라스크에 첨가하고, 혼합물을 휘저어 고체를 용해시켰다. 생성된 용액을 5 L 둥근 바닥에 첨가하고, 이어서 이를 28℃로 가열하고 6시간 동안 숙성시키고, 이 시점에 반응물을 실온으로 냉각시키고, 트리에틸아민 (50.2 mL, 360 mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을 40℃에서 1시간 동안 숙성시켰다. 밝은색 슬러리 용액을 실온으로 냉각시킨 후 122 g NaCl을 첨가하였다. 용액을 실온에서 숙성시키고, 이어서 1.22 L 이소프로필 아세테이트 (IPAc)로 추출하였다. 수성 층을 400 mL IPAc로 재추출하고, 합한 유기부를 400 mL 20% 염수 용액으로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 회전 증발에 의해 농축시켰다. 생성된 고체를 100 mL IPAc에 녹였다 (농후한 슬러리). 헥산 (400 mL)을 첨가하고, 현탁액을 실온에서 숙성시킨 다음, 여과하고 5:1 헥산:IPAc 용액 (150 mL)으로 세척하였다. 고체를 진공 하에 실온에서 건조시켜 4-메틸-5-[(2R)-옥시란-2-일]-2-벤조푸란-1(3H)-온을 수득하였다.
중간체 4A 및 4B
4A: tert-부틸(3R,9aS)-3-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로-2-벤조푸란-5-일)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 및
4B: tert-부틸(3S,9aS)-3-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로-2-벤조푸란-5-일)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트
단계 A: tert-부틸(3S)-3-(히드록시메틸)-4-[2-히드록시-2-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로-2-벤조푸란-5-일)에틸]피페라진-1-카르복실레이트: 4-메틸-5-옥시란-2-일-2-벤조푸란-1(3H)-온 (3.00 g, 15.8 mmol) 및 (S)-4-N-BOC-2-히드록시메틸피페라진 (5.12 g 23.7 mmol)을 20 mL 마이크로웨이브 튜브에서 에탄올 (10 mL) 중에 현탁시켰다. 반응 혼합물을 탈기하고, 마이크로웨이브 장치에서 150℃로 30분 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 증발 건조시킨 다음 330 g 레디-셉 칼럼을 통해 1:1 EtOAc/헥산에서 100% EtOAc의 용매계로 용리시키면서 크로마토그래피하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 B: tert-부틸(9aS)-3-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로-2-벤조푸란-5-일)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: tert-부틸(3S)-3-(히드록시메틸)-4-[2-히드록시-2-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로-2-벤조푸란-5-일)에틸]피페라진-1-카르복실레이트 (3.3 g, 8.2 mmol) 및 시아노메틸렌 트리-n-부틸포스포란 (2 당량)을 밀봉되고 탈기된 튜브에서 45 mL 벤젠 중에 용해시켰다. 혼합물을 100℃로 3시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 증발 건조시켰다. 잔기를 330 g 레디-셉 칼럼을 통해 30% 아세톤/70% 헥산 혼합물로 용리시키면서 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 시스-트랜스 혼합물로서 수득하였다.
단계 C: 중간체 4A 및 4B: 단계 B의 생성물의 시스/트랜스 혼합물을 키랄팩 AD 4.6 x 250 mm 10μ 칼럼과 30% IPA/70% 헵탄 용매계를 사용하여 분리하였다. 트랜스 이성질체 4A는 15.7분에 첫 번째로 용리되었고, 시스-이성질체 4B는 24.9분에 두 번째로 용리되었다.
중간체 4C 및 4D
4C: tert-부틸(3S,9aR)-3-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로-2-벤조푸란-5-일)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트
4D: tert-부틸(3R,9aR)-3-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로-2-벤조푸란-5-일)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트
(S)-4-N-BOC-2-히드록시메틸피페라진 대신 (R)-4-N-BOC-2-히드록시메틸피페라진을 사용한 것을 제외하고는 4A 및 4B에 대해 상기 기재된 것과 유사한 방식으로 중간체 4C 및 4D를 제조하였다. 시스-트랜스 이성질체 4C 및 4D를 키랄셀 OD 4.6 x 250mm 10μ 칼럼과 20% IPA/80% 헵탄 용매계를 사용하여 분리하였다. 트랜스-이성질체 4C는 22.8분에 첫 번째로 용리되었고, 시스-이성질체 4D는 37.8분에 용리되었다:
중간체 5
6-브로모-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온
방법 A: 격막, 질소 유입구 바늘 및 열전쌍이 구비된 250-mL 3 구 둥근 바닥 플라스크에 디이소프로필아민 (3.10 g, 30.6 mmol) 및 30 mL의 THF를 채웠다. 반응 혼합물을 -20℃로 냉각시키는 한편, n-BuLi (2.5 M, 12.2 mL, 30.6 mmol)를 내부 온도를 0℃ 미만으로 유지하면서 시린지를 통해 적가하였다. 생성된 반응 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 -40℃로 냉각시키면서 THF 10 mL 중 4-브로모-2-메틸벤조니트릴 (4.00 g, 20.4 mmol)을 시린지를 통해 1시간 동안 적가하였다. 첨가하는 동안, 약 -40℃의 내부 온도를 유지하였다. 생성된 반응 혼합물을 -40℃에서 30분 동안 교반한 다음, DMF (2.98 g, 40.8 mmol, 약 50 ppm 물)를 한 번에 채웠다. 반응 혼합물을 -40℃에서 15분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 MeOH (5 vol., 20 mL)로 켄칭하고, 이어서 NaBH4 (0.770 g, 20.4 mmol)를 한 번에 채우고, 실온으로 가온되도록 하였다. 중간체 알데히드의 완전한 환원 (HPLC 분석에 의해 판정함) 후, 반응 혼합물을 5 M의 HCl (냉각시킴)로 조심스럽게 켄칭하여 pH를 2-3으로 조정하였다. 반응 혼합물을 EtOAc로 추출한 다음, EtOH (40 mL)로 용매-전환하였다. H2SO4 (98%, 20.0 g, 204 mmol)를 한 번에 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 환류 하에 24시간 동안 교반하였다. 완전한 고리화 (HPLC 분석에 의해 모니터링함) 후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시킨 다음 EtOAc로 용매-전환하였다. 생성된 유기 층을 물, 염수로 세척하고 MTBE로 용매-전환하였다. 1:1 MTBE:헵탄으로부터 침전시켜 6-브로모-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온을 수득하였다.
방법 B: THF (900 mL) 중 DIPA (4 M, 270 mL, 1080 mmol)의 용액을 -65℃로 냉각시키고, 내부 온도를 -55℃ 미만으로 유지하면서 헥실 리튬 (2.1 M, 505 mL, 1060 mmol)을 15분에 걸쳐 적가하였다. 첨가가 완결된 후, 반응 혼합물을 -40℃로 가온하였으며, 여기서 이를 30분 동안 교반하였다. 생성된 LDA의 용액에 4-브로모-2-메틸벤조산 (90 g, 419 mmol)을 THF (400 mL) 중 용액으로서 천천히 (15분에 걸침) 첨가하였다. 반응 혼합물을 -40℃에서 30분 동안 교반한 다음 15℃로 가온하고, 이 시점에 온도를 18℃ 미만으로 유지하면서 (빙수조) 파라포름알데히드 (50.30 g, 1674 mmol)를 고체로서 3번에 나누어 첨가하였다. 이어서 교반을 실온에서 1시간 동안 계속하였다. 두 번째 교반 시간 후, 용기를 빙수조에 담그고, 3N HCl (650 mL)을 내부 온도를 30℃ 미만으로 유지할 수 있는 속도로 첨가하였다. 반응 용기의 내용물을 후속적으로 분리 깔때기로 옮기고, 여기서 이를 3x 400 mL EtOAc로 추출한 다음, 합한 유기 상을 ~800 mL 총 부피로 농축시켰다. 여기에 앰버리스트(Amberlyst) 15 수지 (12 g)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 48℃에서 밤새 (~14시간) 교반하였다. 다음날 아침에 HPLC 분석은 목적한 6-브로모-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온으로의 고리화가 거의 완성되었음을 나타내었다. 수지를 여과에 의해 제거하고, 용액을 ~200 mL 총 부피로 농축시켰고, 이 시점에 목적 생성물이 침전되기 시작하였으며, 이어서 고체를 여과에 의해 수집하였다. 케이크를 후속적으로 MTBE (2 x 80 mL)로 세척하여 생성물의 제1 수확물을 수득하였다. 수집된 상청액을 200 mL 10% K2CO3 수용액에 이어 200 mL 1M H3PO4로 2회 세척함으로써 추가의 물질을 얻었다. ~100 mL로 농축시킨 후, 침전된 물질을 여과에 의해 수집하고, MTBE로 세척하고, 이어서 제1 수확물인 6-브로모-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온과 합하고, 건조시켰다.
중간체 6A 및 6B
6A: 6-[(3R,9aS)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온
단계 A: 6-(브로모아세틸)-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온: 6-브로모-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온 (6.90 g, 30.4 mmol), 트리부틸(1-에톡시에테닐)스탄난 (10.8 mL, 31.9 mmol, 1.05 당량) 및 PdCl2(PPh3)2 (1.07 g, 1.52 mmol, 0.05 당량)를 250 mL 둥근 바닥 플라스크에 칭량하여 넣었다. 여기에 디옥산 (70 mL)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 80℃에서 4시간 동안 교반하였다. HPLC에 의하면 반응이 완료되지 않았고, 따라서 주석 시약을 추가로 0.1 당량 첨가하였다. HPLC에 의해 나타난 바와 같이, 30분 후 6-브로모-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온이 완전히 소모되었다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 35 mL THF에 이어서 14 mL H2O를 첨가하였다. 여기에 고체 N-브로모숙신이미드 (5.68 g, 31.9 mmol, 1.05 당량)를 도입하였고, 5분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 30분 동안 교반한 후에도, 남아있는 엔올 에테르의 증거가 여전히 존재하였고, 따라서 HPLC에 의해 그것이 다 소모되었음이 입증될 때까지 NBS를 소량씩 첨가하였다 (추가 ~300 mg을 첨가함). 이어서 물을 첨가하고, 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 수성 층을 EtOAc로 추가로 2회 추출하였고, 합한 유기부를 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 이를 EtOAc와 함께 100 mL 둥근 바닥 플라스크에 옮기고, 생성된 용액을 총 부피 ~25 mL까지 농축시켰고, 이 시점에 헥산 (50 mL)을 적가하였다. 불균질 혼합물의 30분 동안의 교반이 완료되었을 때, 0℃로 냉각시키고, 10분 동안 교반하고, 이어서 여과하고, 헥산으로 2회 세척하였다. 목적 생성물을 질소 자루 하에서 건조시키고, 이어서 플래쉬 크로마토그래피 (12에서 100% EtOAc/Hex)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 B: tert-부틸(9aS)-3-히드록시-3-(1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: 6-(브로모아세틸)-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온 (~1.54 g, ~5.72 mmol, α-클로로케톤의 존재가 나타남, ~10%) 및 상업적으로 입수가능한 (S)-4-N-BOC-2-히드록시메틸피페라진 (1.24 g, 5.72 mmol)을 둥근 바닥 플라스크에 첨가하고, THF (50 mL)로 희석하였다. 이어서, 디이소프로필에틸아민 (1.30 mL, 7.44 mmol)을 도입하고, 혼합물을 14시간 동안 실온에서 교반되도록 두었고, 이 시간 동안 상당한 양의 고체가 형성되었다 (짐작컨대 DIPEA의 HBr 염). 반응 혼합물을 EtOAc로 희석한 다음, 포화 NH4Cl 수용액에 이어서 H2O로 세척하였다. 두 수성 층을 순차적으로 또 다른 양의 EtOAc로 1회 다시 추출하였고, 이어서 유기부를 합하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 회수된 조 생성물을 플래쉬 크로마토그래피 (바이오타지, 50% EtOAc/Hex)로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 C: 6-[(3R,9aS)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온: tert-부틸(9aS)-3-히드록시-3-(1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 (1.84 g, 4.55 mmol)를 TFA (18 mL, 234 mmol)로 희석하고, 0℃로 냉각시켰다. 약간의 기체 방출이 나타났고, 몇 분 후에 균질 용액이 형성되었다. 대략 TFA 첨가 5분 후, Et3SiH (5.09 mL, 31.8 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물이 실온으로 천천히 가온되도록 하였고 (빙조에서 자연적으로 가온되도록 함), 여기서 이것을 18시간 동안 교반하였다. 트랜스:시스 부분입체이성질체 비는 ~95:5인 것으로 여겨졌다. 반응 용기를 회전 증발기로 옮기고, 진공 하에 농축시켜 2상 액체를 수득하였다. 이 조 물질을 CH2Cl2로 희석하고, NaHCO3 수용액에 이어서 물로 세척하였다. 분리되어 유지되는 수성 층을 후속적으로 동일한 비율의 CH2Cl2로 1회 추출하고, 합한 유기부를 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 조 잔류물을 하우스 진공 하에 건조시킨 다음, 혼합물을 추가로 플래쉬 크로마토그래피 (CH2Cl2 중 2% MeOH 2% Et3N)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
6B: 6-[(3S,9aR)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온
6-[(3R,9aS)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온을 제조하는 상기 기재된 동일한 절차를 사용하여 6-(브로모아세틸)-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온 및 상업적으로 입수가능한 (R)-4-N-BOC-2-히드록시메틸피페라진으로부터 출발하여 표제 화합물을 제조하였다;
중간체 7 및 이성질체 7A 및 7B
6-브로모-3-메틸-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온 및 개별 이성질체 (3R)-6-브로모-3-메틸-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온 및 (3S)-6-브로모-3-메틸-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온: THF (155 mL) 중 디이소프로필아민 (13.3 mL, 93.0 mmol)의 -78℃ 용액을 n-BuLi (헥산 중 1.6 M; 58 mL, 93 mmol)로 시린지 펌프를 사용하여 15분의 시간에 걸쳐 처리하였다. 별개의 플라스크에서, THF (155 mL) 중 2-메틸-4-브로모 벤조산 (10.0 g, 46.5 mmol) 및 HMPA (8.33 mL, 46.5 mmol)의 용액을 -78℃로 냉각시켰다. 메틸 리튬 (29.1 mL, 46.5 mmol)을 냉각된 용액에 시린지를 통해 천천히 첨가하였다. 생성된 용액을 10분 동안 교반한 다음, 캐뉼라를 통해 -78℃의 LDA 용액에 옮겼다. 생성된 용액을 -78℃에서 추가로 1시간 동안 교반한 후, 무수 아세트알데히드 (7.88 mL, 140 mmol)로 켄칭한 다음, 반응물을 드라이아이스 아세톤 조에서 꺼내고, 추가로 1시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응 혼합물이 들은 플라스크를 드라이아이스 아세톤 조에 다시 담근 후, 이를 디옥산 (50 mL) 중 4M HCl에 이어서 MeOH 25 mL로 켄칭하였다. 반응물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 조 반응 혼합물을 200 mL 에틸 아세테이트와 200 mL 물 사이에 분배하였다. 유기 층을 물, 염수로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 생성물을 MPLC (30-70% DCM/헥산)에 의해 정제하여 7을 라세미 혼합물로서 수득하였으며, 이를 예를 들어 키랄팩 AS 칼럼을 사용한 키랄 SFC HPLC에 의해 분리하여 7A 및 7B를 수득할 수 있었다.
중간체 7A (방법 2)
(3R)-6-브로모-3-메틸-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온
단계 A: 4-브로모-N,N-디에틸-2-메틸벤즈아미드: DCM (400 mL) 중 4-브로모-2-메틸벤조산 (25.0 g, 116 mmol)의 용액을 옥살릴 클로라이드 (11.7 mL, 134 mmol) 및 건조 DMF (0.1 mL)의 촉매량으로 처리하였다. 반응물을 질소 하에 실온에서 2시간 동안 교반되도록 하였다. 과량의 용매 제거로 조 산 클로라이드를 제공하였고, 이를 DCM (400 mL) 중에 재용해시켰다. 이어서, 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 트리에틸 아민 (40.5 mL, 291 mmol)을 첨가하고, 이어서 디에틸 아민 (24.3 mL, 233 mmol)을 서서히 첨가하였다. 이어서, 반응물을 밤새 실온으로 가온되도록 하였다. 이어서, 조 혼합물을 물 400 mL로 희석하고, DCM (3 x 500 mL)으로 추출하였다. 이어서, 합한 유기 층을 염수 (200 mL)로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 농축시켰다. 조 물질을 MPLC (10% EtOAc/Hex)에 의해 정제하여 4-브로모-N,N-디에틸-2-메틸벤즈아미드를 수득하였다:
단계 B: 4-브로모-N,N-디에틸-2-(2-옥소프로필)벤즈아미드: -78℃로 냉각된 THF (176 mL) 중 LDA (35.2 mL, 70.3 mmol)의 2M 용액을 건조 THF (176 mL) 중 4-브로모-N,N-디에틸-2-메틸벤즈아미드 (19 g, 70.3 mmol)의 느린 첨가로 처리하였다. 반응물을 -78℃에서 1시간 동안 교반되도록 한 후, 이것을 N-메톡시-N-메틸아세트아미드 (22.43 mL, 211 mmol)로 켄칭하고, 실온으로 천천히 가온되도록 하였다. 반응물을 밤새 교반한 다음, 1N HCl (200 mL)와 EtOAc (400 mL) 사이에 분배하였다. 수성 층을 EtOAc (2x150 mL)로 추가로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수 (150 mL)로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 물질은 오일이었고, 이로부터 생성물이 침전되었다. 오일을 가만히 따르고, 고체를 헥산으로 세척하고, 부흐너 깔때기를 사용하여 건조시켜 4-브로모-N,N-디에틸-2-(2-옥소프로필)벤즈아미드를 수득하였다:
단계 C: 4-브로모-N,N-디에틸-2-[(2R)-2-히드록시프로필]벤즈아미드: 오버헤드 교반기가 구비된 플라스크를 pH=8 포스페이트 완충제 (156 mL, 31.2 mmol)에 이어서 D-글루코스 (1.298 g, 7.21 mmol)로 채우고, 이어서 30℃로 가온하였다. 그 다음, 135 mg 글루코스 데히드로게나제 및 270 mg NADP+ 이나트륨을 글루코스/완충제 용액에 한 번에 첨가하고, 1분 교반한 후, 균질 용액을 수득하였다. 그 다음, 케토-리덕타제 효소 KRED P1B2 (캘리포니아주 94063 레드우드 시티 페노브스콧 드라이브 200에 소재한 코덱시스, 인크. (www.codexis.com, 전화번호 1-650-421-8100)로부터 입수가능함) 577 mg을 반응 용기에 첨가하고, 30℃에서 500 rpm으로 효소가 습윤될 때까지 (약 40분) 교반하였다. 마지막으로, DMSO (14.56 mL) 중에 용해된 4-브로모-N,N-디에틸-2-(2-옥소프로필)벤즈아미드의 용액 (1.5 g, 4.80 mmol) (교반 플레이트에서 30℃로 사전에 가온함)을 ~3분에 걸쳐 첨가하고, 30℃ (400 rpm)에서 밤새 교반하였다.
48시간 후, 반응물을 실온으로 냉각시킨 다음, 탄산칼륨 75 g을 조금씩 반응물에 첨가하고, 교반을 멈추었을 때 효소가 서로 뭉치게 될 때까지 15분 동안 교반하였다. 그 다음, 아세토니트릴 (50 mL)을 반응 플라스크에 붓고, 층을 완전히 혼합하였다. 15-20분 후에 교반을 멈추고, 층을 분리되도록 하고 상부 층을 가만히 따랐다. 이를 추가의 아세토니트릴 50 mL로 2회 더 반복하였다. 이어서, 합한 유기 층을 중간 다공도의 깔때기를 통해 여과한 다음, 농축시키고, 이어서 50 mL MTBE를 농축물에 첨가하고, 5분 동안 교반한 다음, 분리 깔때기로 옮기고 층을 분리하였다. 수성 층을 추가의 또 다른 50 mL MTBE로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. MPLC (30-70% EtOAc/Hex)에 의해 정제하여 4-브로모-N,N-디에틸-2-[(2R)-2-히드록시프로필]벤즈아미드를 수득하였다.
단계 D: (3R)-6-브로모-3-메틸-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온: 디옥산 (200 mL) 중 4N HCl 중에 용해된 4-브로모-N,N-디에틸-2-[(2R)-2-히드록시프로필]벤즈아미드 (12.2 g, 38.8 mmol)의 용액을 실온에서 교반하고, TLC에 의해 모니터링하였다. 3일 후, 반응물을 EtOAc (300 mL)와 물 (300 mL) 사이에 분배하였다. 수성 상을 EtOAc (2 x 250 mL)로 추가로 추출하였다. 이어서, 합한 유기 층을 물 (200 mL), 염수 (200 mL)로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 이어서, 조 물질을 MPLC (15-30% EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 (3R)-6-브로모-3-메틸-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온을 수득하였다:
중간체 7B (방법 2)
(3S)-6-브로모-3-메틸-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온: 단계 C에서 케토-리덕타제 효소 KRED P1H9 (캘리포니아주 94063 레드우드 시티 페노브스콧 드라이브 200에 소재한 코덱시스, 인크. (www.codexis.com, 전화번호 1-650-421-8100)로부터 입수가능함)를 사용한 것을 제외하고는 (3R)-6-브로모-3-메틸-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온과 유사한 방식으로 (3S)-6-브로모-3-메틸-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온을 제조하였고, 이는 생성된 알콜의 반대되는 거울상이성질체를 제공하였다.
중간체 8A 및 8B
8A: tert-부틸 (3R,9aS)-3-[(3R)-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트
8B: tert-부틸 (3S,9aS)-3-[(3R)-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트
단계 A: (3R)-6-에테닐-3-메틸-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온: EtOH (39.8 mL) 중 (3R)-6-브로모-3-메틸-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온 (2.4 g, 9.96 mmol) 및 트리에틸아민 (2.78 mL, 19.91 mmol)의 용액을 PdCl2(dppf)-CH2Cl2 (0.406 g, 0.498 mmol) 및 포타슘 비닐트리플루오로보레이트 (2.000 g, 14.93 mmol)를 함유하는 마이크로웨이브 바이알에 첨가하였다. 바이알의 내용물을 100℃로 1시간 동안 가열한 후, 혼합물을 냉각시키고, 클로로포름 (50 mL)으로 희석하고, 수성 염화암모늄 (25 mL)으로 세척하였다. 이어서, 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 감압 하에 증발시켰다. MPLC 정제 (15-60% EtOAc/Hex)에 의해 표제 화합물을 수득하였다.
단계 B: (3R)-3-메틸-6-(옥시란-2-일)-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온: DCM (60 mL) 중 6-에테닐-3-메틸-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온 (1.69 g, 8.98 mmol)의 용액을 mCPBA (3.100 g, 17.96 mmol)로 실온에서 밤새 처리하였다. 이어서, 반응물을 물 (50 mL) 및 DCM (50 mL)으로 희석하였다. 유기 층을 연속적으로 포화 수성 중탄산나트륨 (30 mL), 물 (30 mL) 및 염수 (30mL)로 추가로 세척하였다. 이어서, 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔기를 MPLC (15-40% EtOAc/Hex)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 C: tert-부틸 (3S)-3-(히드록시메틸)-4-{2-히드록시-2-[(3R)-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]에틸}피페라진-1-카르복실레이트: EtOH (7 mL) 중에 용해시킨 (3R)-3-메틸-6-(옥시란-2-일)-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온 (325 mg, 1.59 mmol) 및 tert-부틸 (3S)-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (345 mg, 1.59 mmol)의 용액을 밀봉된 튜브에서 155℃로 3시간 동안 마이크로웨이브 내에서 가열하였다. 반응물을 냉각시키고, 농축시켜 조 생성물을 수득하였으며, 이를 MPLC (40-100% EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 표제 화합물을 부분입체이성질체의 혼합물로서 수득하였다.
단계 D: tert-부틸 (3R,9aS)-3-[(3R)-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 및 tert-부틸 (3S,9aS)-3-[(3R)-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: 무수 벤젠 (8 mL) 중에 용해시킨 부분입체이성질체의 혼합물로서의 tert-부틸 (3S)-3-(히드록시메틸)-4-{2-히드록시-2-[(3R)-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]에틸}피페라진-1-카르복실레이트 (530 mg, 1.26 mmol) 및 시아노메틸렌트리부틸포스포란 (304 mg, 1.26 mmol)이 들은 밀봉된 튜브를 질소로 2회 탈기하고, 이어서 마이크로웨이브를 사용하여 135℃로 2.5시간 동안 가열하였다. 반응물을 냉각되도록 하고, 조 혼합물을 농축시키고, MPLC (20-65% EtOAc/Hex) 상에서 정제하여 부분입체이성질체의 혼합물 뿐만 아니라 회수된 출발 물질을 수득하였다. 시스/트랜스 혼합물을 AS 칼럼을 사용하여 키랄 HPLC (10% EtOH/헵탄)에 의해 정제하여 트랜스 이성질체를 보다 빠르게 용리되는 피크로서, 시스 이성질체를 보다 느리게 용리되는 피크로서 수득하였다. 대안적으로는, 혼합물을 IC 칼럼을 사용하여 키랄 SFC-HPLC (40% 2:1 MeOH:MeCN/CO2)에 의해 분리할 수 있다.
중간체 8C 및 8D
8C: tert-부틸 (3R,9aS)-3-[(3S)-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트
8D: tert-부틸 (3S,9aS)-3-[(3S)-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: (3S)-6-브로모-3-메틸-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온을 출발 물질로서 사용한 것을 제외하고는 중간체 8A 및 8B와 유사한 방식으로 8C 및 8D를 제조하였다. 시스/트랜스 혼합물을 AD 칼럼 상에서 키랄 HPLC (30% 2:1 MeOH:MeCN/CO2)에 의해 정제하였다. 보다 빠르게 용리되는 부분입체이성질체는 트랜스 이성질체였다.
중간체 8E 및 8F
8E: tert-부틸 (3S,9aR)-3-[(3S)-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트:
8F: tert-부틸 (3R,9aR)-3-[(3S)-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: (3S)-6-브로모-3-메틸-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온 및 tert-부틸 (3R)-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트를 출발 물질로서 사용한 것을 제외하고는 중간체 8A 및 8B와 유사한 방식으로 중간체 8E 및 8F를 제조하였다. 시스/트랜스 혼합물을 MPLC (20-65% EtOAc/Hex)에 의해 정제하였다. 보다 빠르게 용리되는 부분입체이성질체는 트랜스 이성질체였다:
중간체 8G 및 8H
8G: tert-부틸 (3S,9aR)-3-[(3R)-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트
8H: tert-부틸 (3R,9aR)-3-[(3R)-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: (3R)-6-브로모-3-메틸-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온 및 tert-부틸 (3R)-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트를 출발 물질로서 사용한 것을 제외하고는 중간체 8A 및 8B와 유사한 방식으로 8G 및 8H를 제조하였다. 시스/트랜스 혼합물을 OJ 칼럼 상에서 키랄 HPLC (20% 2:1 MeOH:MeCN/CO2)에 의해 정제하였다. 보다 느리게 용리되는 부분입체이성질체는 트랜스 이성질체였다:
중간체 9
(3S)-3-메틸-6-(9a-메틸옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일)이소크로만-1-온
단계 A: 벤질 4-(2-히드록시-2-((S)-3-메틸-1-옥소이소크로만-6-일)에틸)-3-(히드록시메틸)-3-메틸피페라진-1-카르복실레이트: EtOH (13 mL) 중 라세미 벤질 3-(히드록시메틸)-3-메틸피페라진-1-카르복시레이트 (1.0 g, 3.8 mmol) (미국 특허 출원 공개 번호 US2007/0088039A1, 실시예 10에 기재된 바와 같이 제조함)의 용액에 (3S)-3-메틸-6-(옥시란-2-일) 이소크로만-1-온 (773 mg, 3.80 mmol)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 80℃로 16시간 동안 가열하고, 반응 혼합물을 농축 건조시키고, 실리카 겔 상에서 정제하여 표제 화합물을 수득하였다:
단계 B: 벤질 9a-메틸-3-((S)-3-메틸-1-옥소이소크로만-6-일) 헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: 건조 벤젠 중 벤질 4-(2-히드록시-2-((S)-3-메틸-1-옥소이소크로만-6-일)에틸)-3-(히드록시메틸)-3-메틸피페라진-1-카르복실레이트 (762 mg, 1.60 mmol) 및 시아노메틸렌트리부틸포스포란 (471 mg, 1.90 mmol)의 혼합물을 탈기하고, 마이크로웨이브 반응기에서 135℃로 3.5시간 동안 가열하였다. 그 후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 농축 건조시키고, 실리카 겔 상에서 정제하여 표제 화합물 (시스 또는 트랜스)을 수득하였다:
단계 C: (3S)-3-메틸-6-(9a-메틸옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일)이소크로만-1-온: MeOH (10 mL) 중 벤질 9a-메틸-3-((S)-3-메틸-1-옥소이소크로만-6-일)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 (215 mg, 0.500 mmol) 및 10% Pd-C (56 mg, 0.05 mmol)의 혼합물을 수소 풍선 하에 16시간 동안 교반하였다. 그 후, 용액을 셀라이트를 통해 여과하고, 생성된 여과물을 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다:
중간체 10
6-브로모-5-플루오로-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온
단계 A: 4-브로모-N-tert-부틸-3-플루오로-2-(2-히드록시에틸)벤즈아미드: THF (200 mL) 중 디이소프로필아민 (6.2 mL, 44 mmol)의 용액을 n-부틸리튬 (17.4 mL, 44.0 mmol)으로 0℃에서 처리하였다. 용액을 30분 동안 교반한 다음, -78℃로 냉각시켰다. 그 다음, THF (100 mL) 중 4-브로모-N-tert-부틸-3-플루오로벤즈아미드 (4.8 g, 17 mmol)의 용액을 첨가하였다. 이어서, 용액을 -40℃로 가온하고, 1시간 동안 그것을 유지하였다. 그 다음, 에틸렌 옥시드 (10 mL, 200 mmol)를 첨가하고, 용액을 0℃로 가온하였다. 1시간 후, 빙조를 제거하고, 용액을 실온으로 가온되도록 하였다. LC/MS는 목적 생성물이 존재함을 나타내었다. 용액을 MeOH로 켄칭하고, 염수 (200 mL)로 희석하고, EtOAc (300 mL)로 추출하였다. 유기 층을 제거하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 생성물을 340 g 바이오타지 스냅(SNAP) (0-60% 헥산:EtOAc) 카트리지를 사용하여 정제하여 표제 화합물을 수득하였다:
단계 B: 6-브로모-5-플루오로-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온: 톨루엔 (100 mL)/THF (10 mL) 중 4-브로모-N-tert-부틸-3-플루오로-2-(2-히드록시에틸) 벤즈아미드 (1.8 g, 5.7 mmol) 및 TsOH (1.3 g, 6.9 mmol)의 용액을 환류 하에 가열하였다. 1시간 후, TLC 및 LC/MS 분석은 전환의 완료를 나타내었다. 용액을 농축 건조시키고, 이어서 Et2O (150 mL)로 희석하였다. 유기 층을 염수로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하여 표제 화합물을 수득하였다:
중간체 11A (트랜스)
(3R,9aS)-tert-부틸 3-(5-플루오로-1-옥소이소크로만-6-일)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: 상기 tert-부틸 (3R,9aS)-3-[(3R)-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여 6-브로모-5-플루오로-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온으로부터 표제 화합물을 제조하였다. 주요 트랜스 이성질체를 MPLC (30-100% EtOAc/Hex)를 통해 보다 빠르게 용리되는 이성질체로서 단리시켰다:
중간체 12A
3-(R)-6-브로모-5-플루오로-3-메틸-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온
단계 A: 4-브로모-N-tert-부틸-3-플루오로벤즈아미드: DCM (200 mL) 중 4-브로모-3-플루오로벤조산 (19 g, 87 mmol)의 현탁액에 옥살릴 클로라이드 (9.10 mL, 104 mmol)에 이어서 한 방울의 DMF를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반되도록 하였다. 현탁액이 맑아졌을 때, 용액을 농축 건조시켰다. 잔기를 DCM (200 mL) 중에 재용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. 그 다음, 용액을 TEA (30.2 mL, 217 mmol)에 이어서 tert-부틸 아민 (12.0 mL, 113 mmol)으로 처리하였다. 용액을 12시간 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 1N HCl (200 mL)로 희석하였다. 이어서, 유기 층을 제거하고, 1N NaOH로 세척하였다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다.
단계 B: 4-브로모-N-tert-부틸-3-플루오로-2-[(2R)-2-히드록시프로필]벤즈아미드: THF (200 mL) 중 디이소프로필아민 (11.7 mL, 82.0 mmol)의 용액을 n-부틸리튬 (33 mL, 82 mmol)으로 0℃에서 처리하였다. 용액을 30분 동안 교반한 후, -78℃로 냉각시켰다. 그 다음, THF (100 mL) 중 4-브로모-N-tert-부틸-3-플루오로벤즈아미드 (9.0 g, 33 mmol)의 용액을 첨가하였다. 이어서, 용액을 -40℃로 가온하고, 1시간 동안 그것을 유지하였다. 그 다음, (R)-(+)-프로필렌 옥시드 (6.9 mL, 98 mmol)를 첨가하고, 용액을 0℃로 가온하였다. 1시간 후, 빙조를 제거하고, 용액을 실온으로 가온되도록 하였다. LC/MS는 목적 생성물이 존재함을 나타내었다. 용액을 MeOH로 켄칭하고, 염수 (200 mL)로 희석하고, EtOAc (300 mL)로 추출하였다. 유기 층을 제거하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 물질을 340 g 바이오타지 스냅 (0-60% 헥산:EtOAc) 카트리지를 사용하여 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 C: 3-(R)-6-브로모-5-플루오로-3-메틸-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온: 톨루엔 (100 mL) 중 4-브로모-N-tert-부틸-3-플루오로-2-[(2R)-2-히드록시프로필]벤즈아미드 (4.60 g, 13.8 mmol) 및 TsOH (2.60 g, 13.8 mmol)의 용액을 환류 하에 가열하였다. 1시간 후, TLC 및 LC/MS 분석은 전환의 완료를 나타내었다. 용액을 농축 건조시키고, 이어서 Et2O (150 mL)로 희석하였다. 유기 층을 염수로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다:
중간체 12B
3-(S)-6-브로모-5-플루오로-3-메틸-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온: 단계 B에서 (S)-(+)-프로필렌 옥시드를 사용한 것을 제외하고는 3-(R)-6-브로모-5-플루오로-3-메틸-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온에 대해 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다:
중간체 13A (트랜스)
tert-부틸 (3R,9aS)-3-[(3R)-5-플루오로-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: tert-부틸 (3R,9aS)-3-[(3R)-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여 3-(R)-6-브로모-5-플루오로-3-메틸-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온으로부터 표제 화합물을 제조하였다. 시스/트랜스 혼합물을 AD 칼럼 상에서 키랄 HPLC (30% 2:1 MeOH:MeCN/CO2)에 의해 정제하였다. 보다 느리게 용리되는 부분입체이성질체는 트랜스 이성질체였다.
중간체 13B (시스)
tert-부틸 (3S,9aS)-3-[(3R)-5-플루오로-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: 표제 화합물을 tert-부틸 (3R,9aS)-3-[(3R)-5-플루오로-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트의 키랄 HPLC 정제 동안 보다 빠르게 용리되는 피크로서 단리시켰다:
중간체 13C (트랜스)
tert-부틸 (3R,9aS)-3-[(3S)-5-플루오로-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: tert-부틸 (3R,9aS)-3-[(3R)-5-플루오로-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 (상기)에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여 3-(S)-6-브로모-5-플루오로-3-메틸-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온으로부터 표제 화합물을 제조하였다. 시스/트랜스 혼합물을 OJ 칼럼 상에서 키랄 SFC-HPLC (30% 2:1 MeOH:MeCN/CO2)에 의해 정제하였다. 보다 빠르게 용리되는 부분입체이성질체는 트랜스 이성질체였다.
중간체 13D (시스)
tert-부틸 (3S,9aS)-3-[(3S)-5-플루오로-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: 표제 화합물을 tert-부틸 (3R,9aS)-3-[(3S)-5-플루오로-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트의 키랄 SFC-HPLC 정제 동안 보다 느리게 용리되는 피크로서 단리시켰다:
중간체 13E (트랜스)
tert-부틸 (3S,9aR)-3-[(3R)-5-플루오로-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트; tert-부틸 (3R,9aS)-3-[(3R)-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 (상기)에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하되 단계 C에서 tert-부틸 (3R)-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트를 아미노 알콜로 대체하여, 3-(R)-6-브로모-5-플루오로-3-메틸-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온으로부터 표제 화합물을 제조하였다. 시스/트랜스 혼합물을 AD 칼럼 상에서 키랄 HPLC (40% 2:1 MeOH:MeCN/CO2)에 의해 정제하였다. 보다 빠르게 용리되는 부분입체이성질체는 트랜스 이성질체였다.
중간체 13F (시스)
tert-부틸 (3R,9aR)-3-[(3R)-5-플루오로-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: 표제 화합물을 tert-부틸 (3S,9aR)-3-[(3R)-5-플루오로-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트의 키랄 SFC-HPLC 정제 동안 보다 느리게 용리되는 피크로서 단리시켰다:
중간체 13G (트랜스)
tert-부틸 (3S,9aR)-3-[(3S)-5-플루오로-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: tert-부틸 (3R,9aS)-3-[(3R)-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 (상기)에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 사용하되 단계 C에서의 tert-부틸 (3R)-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트를 아미노 알콜로 대체하여, 3-(S)-6-브로모-5-플루오로-3-메틸-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온으로부터 표제 화합물을 제조하였다. 시스/트랜스 혼합물을 OJ 칼럼 상에서 키랄 SFC-HPLC (30% 2:1 MeOH:MeCN/CO2)에 의해 정제하였다. 보다 빠르게 용리되는 부분입체이성질체는 트랜스 이성질체였다.
중간체 13H (시스)
tert-부틸 (3R,9aR)-3-[(3S)-5-플루오로-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: 표제 화합물을 tert-부틸 (3S,9aR)-3-[(3S)-5-플루오로-3-메틸-1-옥소-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-6-일]헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 (상기)의 SFC-HPLC 정제 동안 보다 느리게 용리되는 피크로서 단리시켰다:
중간체 14B (시스)
(3S,9aS)-tert-부틸 3-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로이소벤조푸란-5-일)헥사히드로-1H-피라지노[1,2-a]피라진-2(6H)-카르복실레이트
단계 A: (S)-tert-부틸 4-((S)-2-히드록시-2-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로이소벤조푸란-5-일)에틸)-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트: 에탄올 (12 mL) 중 (S)-4-메틸-5-(옥시란-2-일)이소벤조푸란-1(3H)-온 (0.75g, 3.95 mmol) 및 (S)-tert-부틸 3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (1.02 g, 4.73 mmol)를 마이크로웨이브에서 150℃로 1.5시간 동안 가열하였다. 반응 용액을 농축시키고, 잔기를 바이오타지 시스템 상에서 40-100% 에틸 아세테이트/헥산을 사용하여 MPLC에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 B: (S)-벤질 4-((S)-2-히드록시-2-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로이소벤조푸란-5-일)에틸)-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트: 메틸렌 클로라이드 (3 mL) 중 (S)-tert-부틸 4-((S)-2-히드록시-2-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로이소벤조푸란-5-일)에틸)-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (2.57 g, 6.32 mmol)의 용액에 트리플루오로아세트산 (10 mL, 130 mmol)을 실온에서 1시간 동안 첨가하였다. 감압 하에 휘발성 물질을 제거한 후, 잔기를 메틸렌 클로라이드 (100 mL) 중에 용해시켰다. 상기 용액에 트리에틸아민 (4.40 mL, 31.6 mmol) 및 벤질 클로로포르메이트 (0.95 mL, 6.64 mmol)를 0℃에서 0.5시간 동안 첨가하였다. 반응물을 물에 이어서 포화 탄산나트륨의 첨가에 의해 켄칭하였다. 혼합물을 메틸렌 클로라이드로 추출하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시키고, 잔기를 바이오타지 시스템 상에서 40-100% EtOAc/헥산을 사용하여 MPLC에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 C: (9aR)-벤질 8-알릴-7-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로이소벤조푸란-5-일)헥사히드로-1H-피라지노[1,2-a]피라진-2(6H)-카르복실레이트: 티오닐 클로라이드 (20 mL, 274 mmol) 중 (S)-벤질 4-((S)-2-히드록시-2-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로이소벤조푸란-5-일)에틸)-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (1.4 g, 3.2 mmol)의 용액을 환류 하에 1시간 동안 가열하였다. 휘발성 물질을 제거한 후, 잔기를 N,N-디메틸포름아미드 (20 mL) 중에 용해시키고, 0℃에서 알릴아민 (1.31 mL, 17.48 mmol)으로 처리하였다. 생성된 용액을 아이오딘화나트륨 (0.088 g, 0.318 mmol)으로 처리하고, 90℃에서 1시간 동안 가열하였다. 용액을 에틸 아세테이트 (300 mL)로 희석하고, 포화 중탄산나트륨으로 3회 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시키고, 잔기를 바이오타지 시스템 상에서 40-100% 에틸 아세테이트/헥산을 사용하여 MPLC에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 D: (3S,9aS)-8-벤질 2-tert-부틸 3-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로이소벤조푸란-5-일)테트라히드로-1H-피라지노[1,2-a]피라진-2,8(9H,9aH)-디카르복실레이트: 메틸렌 클로라이드 (10 mL) 중 (9aR)-벤질 8-알릴-7-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로이소벤조푸란-5-일)헥사히드로-1H-피라지노[1,2-a]피라진-2(6H)-카르복실레이트 (0.98 g, 2.12 mmol), 1,3-디메틸피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온 (0.995 g, 6.37 mmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (123 mg, 0.106 mmol)의 혼합물을 35℃에서 4시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 디-tert-부틸 디카르보네이트 (556 mg, 2.55 mmol) 및 트리에틸아민 (1194 μl, 8.49 mmol)을 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 농축시킨 후, 잔기를 바이오타지 시스템 상에서 20-100% EtOAc/헥산을 사용하여 MPLC에 의해 정제하고 분해하여 표제 화합물 (덜 극성임): 
; 및 표제 화합물의 상응하는 (3R,9aS) 이성질체 (더 극성임): 
를 수득하였다.
단계 E: (3S,9aS)-tert-부틸 3-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로이소벤조푸란-5-일)헥사히드로-1H-피라지노[1,2-a]피라진-2(6H)-카르복실레이트: 메탄올 (30 mL) 중 단계 D의 표제 화합물 (0.46 g, 0.88 mmol)의 용액에 탄소 상 팔라듐 (10%, 0.094 g, 0.088 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 수소화 처리하였다. 여과 후, 여과물을 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다.
중간체 15
tert-부틸 7-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로-2-벤조푸란-5-일)옥타히드로-2H-피라지노[1,2-d][1,4]옥사제핀-2-카르복실레이트 및 4개의 분리된 이성질체
단계 A: tert-부틸 3-(2-히드록시에틸) 피페라진-1-카르복실레이트: tert-부틸 3-(2-메톡시-2-옥소에틸) 피페라진-1-카르복실레이트 (7.28 g, 28.2 mmol)를 0℃에서 THF (100 mL) 중에 용해시킨 다음, LAH (21.14 mL, 21.14 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 TLC에 의해 모니터링하였다. 30분 후, 반응물을 먼저 0.8 mL 물로 켄칭하고, 이어서 1.6 mL 2N NaOH에 이어 4 mL 물을 첨가하였다. 상기 슬러리를 에틸 아세테이트로 희석하고, MgSO4을 첨가하였다. 혼합물을 1/2시간 동안 실온에서 교반하고, 이어서 여과하고, 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다:
단계 B: tert-부틸 3-(2-히드록시에틸)-4-(2-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로이소벤조푸란-5-일)-2-옥소에틸)피페라진-1-카르복실레이트: tert-부틸 3-(2-히드록시에틸) 피페라진-1-카르복실레이트 (6.91 g, 30.0 mmol) 및 5-(2-브로모아세틸)-4-메틸이소벤조푸란-1(3H)-온 (6.73 g, 25 mmol)을 테트라히드로푸란 (100 mL) 중에 용해시킨 다음, 휘니그 염기 (8.73 mL, 50.0 mmol)를 첨가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응물을 염수에 붓고, EtOAc (2x)로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켰다. 조 생성물을 이스코 레디-셉 330 g 칼럼을 통해 크로마토그래피하고 5% MeOH/DCM 용매계로 용리시켜 표제 화합물을 수득하였다.
단계 C: tert-부틸 4-(2-히드록시-2-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로이소벤조푸란-5-일)에틸)-3-(2-히드록시에틸)피페라진-1-카르복실레이트: tert-부틸 3-(2-히드록시에틸)-4-(2-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로이소벤조푸란-5-일)-2-옥소에틸) 피페라진-1-카르복실레이트 (6.16 g, 14.7 mmol)를 0℃에서 메탄올 (100mL) 중에 용해시킨 다음, NaBH4 (1.67 g, 44.2 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하였다. 10분 후, TLC는 SM이 남아있지 않음을 나타내었다. 메탄올을 증발시키고, 잔기를 염수로 녹이고, 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 합한 유기 층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 생성물을 이스코 330 g 레디-셉 칼럼을 통해 크로마토그래피하고 5% MeOH/DCM으로 용리시켜 표제 화합물을 수득하였다:
단계 D: tert-부틸 7-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로-2-벤조푸란-5-일)옥타히드로-2H-피라지노[1,2-d][1,4]옥사제핀-2-카르복실레이트: tert-부틸 4-(2-히드록시-2-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로이소벤조푸란-5-일)에틸)-3-(2-히드록시에틸)피페라진-1-카르복실레이트 (2.22 g, 5.30 mmol)를 벤젠 (30mL) 중에 용해시킨 다음, 시아노메틸렌 트리부틸 포스포란 (2.31 g, 9.55 mmol)을 첨가하고, 이어서 이것을 100℃로 밤새 가열하였다. 벤젠을 회전 증발에 의해 제거하고, 잔기를 이스코 레디-셉 330 g 칼럼을 통해 크로마토그래피하고 15% 아세톤:85% DCM으로 용리시켰다. 이것은 표제 화합물의 트랜스-부분입체이성질체로부터 시스-부분입체이성질체를 분리시켰다. 시스-부분입체이성질체를 추가로 하기 조건을 이용하여 S,S 및 R,R 부분입체이성질체로 분리하였다:
트랜스-부분입체이성질체를 추가로 하기 조건을 이용하여 S,R 및 R,S 부분입체이성질체로 분리하였다:
트랜스-부분입체이성질체 A 및 트랜스-입체이성질체 B의 체류 시간은 분석용 칼럼 키랄팩 AD: 4.6 x 250 mm, 15% (2:1 MeOH:CH3CN)/CO2, 2.1ml/분, 100 bar, 35℃, 254nm 상에서 6.68분 및 8.08분이었다:
중간체 16 (이성질체 혼합물), 16A 및 16B
tert-부틸 (3R,9aS)-3-(3-시아노-4-플루오로페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 및 tert-부틸 (3S,9aS)-3-(3-시아노-4-플루오로페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트
단계 A: 2-플루오로-5-(1-히드록시에틸)벤조니트릴: 3-시아노-4-플루오로벤즈알데히드 (2.17 g, 14.7 mmol)를 THF (50 mL) 중에 용해시킨 다음, -70℃로 냉각시켰다. 이 혼합물에 메틸 마그네슘브로마이드 (5.34 mL, 16.0 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 교반한 다음, 염수로 켄칭하고, 에테르로 추출하였다. 에테르성 층을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켰다. 잔기를 120 g 레디-셉 칼럼을 통해 0-50% EtOAc/헥산 용리액을 사용하여 MPLC 크로마토그래피에 의해 정제하여 2-플루오로-5-(1-히드록시에틸)벤조니트릴을 수득하였다:
단계 B: 5-아세틸-2-플루오로벤조니트릴: 2-플루오로-5-(1-히드록시에틸)벤조니트릴 (0.80 g, 4.8 mmol)을 DCM (50 mL) 중에 용해시켰다. 이 혼합물에 피리디늄 디크로메이트 (2.73 g, 7.27 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 플로리실(Florisil) (26 g)을 반응 혼합물에 첨가하고, 이어서 이를 에테르 50 mL로 희석하고, 셀라이트 패드를 통해 여과하였다. 여과물을 증발 건조시키고, 잔기를 120 g 레디-셉 칼럼을 통해 0-100% EtOAc/헥산으로 용리시키면서 MPLC에 의해 정제하여 5-아세틸-2-플루오로벤조니트릴을 수득하였다.
단계 C: 5-(브로모아세틸)-2-플루오로벤조니트릴: 5-아세틸-2-플루오로벤조니트릴 (400 mg, 2.45 mmol)을 THF (20 mL) 중에 용해시킨 다음, 브로민화구리 (II) (1.10 g, 4.90 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에테르 20 mL로 희석한 다음, 물에 이어서 염수로 세척하였다. 유기 층을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하였다. 여과물을 증발 건조시킨 다음, 80 g 레디-셉 칼럼을 통해 0-50% 에틸 아세테이트/헥산 용리액을 사용하여 MPLC 크로마토그래피에 의해 정제하여 5-(브로모아세틸)-2-플루오로벤조니트릴을 수득하였다:
단계 D: tert-부틸 (3S)-4-[2-(3-시아노-4-플루오로페닐)-2-옥소에틸]-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트: 5-(브로모아세틸)-2-플루오로벤조니트릴 (590 mg, 2.44 mmol) 및 (S)-4-N-BOC-2-히드록시메틸-피페라진 (527 mg, 2.44 mmol)을 0℃에서 THF (40 mL) 중에 용해시킨 다음, TEA (247 mg, 2.44 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하고, 이어서 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켰다. 조 생성물을 80 g 레디-셉 칼럼을 통해 0-100% EtOAc/헥산을 사용하여 MPLC에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 E: tert-부틸 (3S)-4-[2-(3-시아노-4-플루오로페닐)-2-히드록시에틸]-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트: tert-부틸 (3S)-4-[2-(3-시아노-4-플루오로페닐)-2-옥소에틸]-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (800 mg, 2.12 mmol)를 에탄올 (50 mL) 중에 용해시킨 다음, 수소화붕소나트륨 (321 mg, 8.48 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. LC-MS 분석은 생성물이 존재함을 나타내었다. 에탄올을 제거하고, 잔기를 EtOAc 중에 재용해시키고, 1N HCl와 함께 5분 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 포화 수성 NaHCO3으로 중화시키고, EtOAc로 2회 추출하였다. 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다.
단계 F: tert-부틸 (9aS)-3-(3-시아노-4-플루오로페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: tert-부틸 (3S)-4-[2-(3-시아노-4-플루오로페닐)-2-히드록시에틸]-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (358 mg, 0.944 mmol)를 DCM (25 mL) 중에 용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. 이 혼합물에 TEA (0.197 mL, 1.42 mmol)에 이어서 메탄술포닐 클로라이드 (0.096 mL, 1.2 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하고, 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 염수로 2회 세척하고, 건조시키고, 증발 건조시켰다. 잔기를 40 g 레디-셉 칼럼을 통해 EtOAc/Hex 0-100%로 용리시키면서 크로마토그래피에 의해 정제하여 중간체 클로라이드 (470 mg, 1.81 mmol)를 수득하였다. 이어서, 이 클로라이드를 THF (25 mL) 중에 용해시키고, 0℃에서 테트라부틸암모늄 클로라이드 (436 mg, 1.18 mmol)에 이어서 NaH (47.2 mg, 1.18 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 환류 하에 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc로 희석하고, 염수로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켰다. 조 잔류물을 40 g 레디-셉 칼럼을 통해 0-100% 에틸 아세테이트로 용리시키면서 MPLC 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 2개 이성질체의 혼합물로서 수득하였다:
단계 G: tert-부틸 (3R,9aS)-3-(3-시아노-4-플루오로페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 및 tert-부틸 (3S,9aS)-3-(3-시아노-4-플루오로페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: 이전 단계에서 수득한 이성질체의 혼합물의 정제용 HPLC 분리에 의해 표제 화합물을 수득하였다.
중간체 16C 및 16D
tert-부틸 (3S,9aR)-3-(3-시아노-4-플루오로페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 및 tert-부틸 (3R,9aR)-3-(3-시아노-4-플루오로페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트
단계 A: 3-브로모-4-플루오로-N-메톡시-N-메틸벤즈아미드: 건조 DCM 1L 중 3-브로모-4-플루오로벤조산 (100 g, 0.456 mol) 및 CDI (77.2 g, 0.547 mol)의 용액을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, O,N-디메틸-히드록실아민 (53.4 g, 0.547 mol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 밤새 교반하였다. 용매를 진공 하에 제거하고, 잔기를 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 3-브로모-4-플루오로-N-메톡시-N-메틸벤즈아미드를 수득하였다.
단계 B: 1-(3-브로모-4-플루오로페닐)에타논: THF 500 mL 중 3-브로모-4-플루오로-N-메톡시-N-메틸벤즈아미드 (50 g, 0.19 mol)의 용액을 빙조에서 0℃로 냉각시킨 다음, 혼합물에 MeMgCl (27.3 g, 0.21 mol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 N2 하에 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 NH4Cl로 켄칭하고, EtOAc로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 잔기를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 1-(3-브로모-4-플루오로페닐)에타논을 수득하였다.
단계 C: 5-아세틸-2-플루오로벤조니트릴: DMF 300 mL 중 1-(3-브로모-4-플루오로페닐)에타논 (81.3 g, 0.344 mol)의 용액에 CuCN (67.4 g, 0.749 mol)을 첨가하고, 혼합물을 환류 하에 가열하고, N2 하에 10시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 켄칭하고, 에테르로 추출하였다. 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 잔기를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물 5-아세틸-2-플루오로벤조니트릴을 수득하였다.
단계 D: 5-(브로모아세틸)-2-플루오로벤조니트릴: DCM 500 mL 중 5-아세틸-2-플루오로벤조니트릴 (20.0 g, 0.123 mol)의 용액을 환류 하에 2시간 동안 가열한 다음, 300 mL DCM 중 브로민의 용액을 비등 혼합물에 적가하였다. 반응 혼합물을 환류 하에 가열하고, N2 보호 하에 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 세척하고, DCM으로 추출하였다. 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 잔기를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 5-(브로모아세틸)-2-플루오로벤조니트릴을 수득하였다.
단계 D: tert-부틸 (3R)-4-[2-(3-시아노-4-플루오로페닐)-2-옥소에틸]-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트: DMF (160 mL) 중 5-(브로모아세틸)-2-플루오로벤조니트릴 (13.1 g, 0.054 mol)의 용액에 tert-부틸 (3R)-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (13.1 g, 0.065 mol) 및 K2CO3 (11.77 g, 0.075mol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물로 세척하고, EtOAc로 추출하였다. 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켜 표제 화합물을 수득하였으며, 이를 후속 단계에서 추가의 정제 없이 사용하였다.
단계 E: tert-부틸 (3R)-4-[2-(3-시아노-4-플루오로페닐)-2-히드록시에틸]-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트: MeOH (400 mL) 중 tert-부틸 (3R)-4-[2-(3-시아노-4-플루오로페닐)-2-옥소에틸]-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (20 g, 0.053 mol)의 용액에 0℃에서 NaBH4 (15.6 g, 0.424 mol)를 조금씩 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, EtOAc로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 잔기를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 F: tert-부틸 (9aR)-3-(3-시아노-4-플루오로페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: THF 100 mL 중 tert-부틸 (3R)-4-[2-(3-시아노-4-플루오로페닐)-2-히드록시에틸]-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (5.0 g, 13.2 mmol)의 용액을 0℃에서 10분 동안 교반한 다음, NaH (60%) (1.32 g, 33.0 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 생성된 백색 현탁액을 0℃에서 5분에 이어서 실온에서 1시간 동안 격렬히 교반하였다. 이어서, 반응 현탁액을 0℃로 재냉각시키고, N-토실이미다졸을 첨가하고, 생성된 용액을 0℃에서 추가로 10분 동안 교반한 후, 다시 실온으로 가온하고, 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 용액을 0℃로 1회 더 냉각시키고, 과량의 수소화나트륨을 포화 NH4Cl 용액의 느린 첨가에 의해 조심스럽게 켄칭하였다. 생성된 2상 용액을 포화 NH4Cl과 EtOAc 사이에 분배하였다. 유기 층을 물 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 잔기를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다:
단계 G: tert-부틸 (3S,9aR)-3-(3-시아노-4-플루오로페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 및 tert-부틸 (3R,9aR)-3-(3-시아노-4-플루오로페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: 이전 단계에서 수득한 이성질체 혼합물의 정제용 HPLC 분리에 의해 단일 이성질체를 수득하였다.
중간체 17A 및 17B (방법 1)
17A: tert-부틸(3R,9aS)-3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트
17B: tert-부틸(3S,9aS)-3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트
단계 A: 3-브로모-6-플루오로-2-메틸벤조니트릴 (방법 A): 상업적으로 입수가능한 2-플루오로-6-메틸벤조니트릴 (아폴로 사이언티픽(Apollo Scientific), 15.0 g, 111 mmol)을 0℃에서 트리플산 (75 mL) 중에 용해시킨 다음, NBS (20.7 g, 117 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 얼음에 붓고, DCM으로 2회 추출하였다. 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 이어서 여과하고, 증발 건조시켜 3-브로모-6-플루오로-2-메틸벤조니트릴을 수득하였다:
대안적 단계 A (방법 B): 오버헤드 교반기가 구비된 3 L 3 구 RB에 2-플루오로-6-메틸-벤조니트릴 (191.8 g, 1419 mmol) 및 MsOH (563 mL, 8516 mmol)를 채웠다. NBS (265 g, 1490 mmol)를 이 교반 용액에 30분에 걸쳐 조금씩 첨가하고, 혼합물을 50℃에서 33시간 동안 교반하였다. 이 때, HPLC가 반응이 거의 완결되었음을 나타내면, 반응물을 얼음 1L에 붓고 (발열이 나타남), 700 mL 30% EtOAc/헥산으로 희석하고, 교반하였다. 수성 층을 제거하고, 유기부를 1N NaOH 및 물로 2회 세척하였다. 제거한 수성부에는 불순물이 상당히 농축되어 있음이 관찰되었다. 유기부를 MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시킨 다음, -10℃ 동결기에 밤새 보관하였다. 이 시간에 걸쳐 침전물이 형성되었으며, 이를 여과하고, 5% EtOAc/헥산으로 세척하였다. 침전물의 제2 수확물을 제1 수확물과 합하여 3-브로모-6-플루오로-2-메틸-벤조니트릴을 수득하였다.
단계 B: 3-에테닐-6-플루오로-2-메틸벤조니트릴: 3-브로모-6-플루오로-2-메틸벤조니트릴 (23.6 g, 110 mmol), 포타슘 비닐 트리플루오로보레이트 (29.5 g, 221 mmol), PdCl2(dppf)-CH2Cl2 부가물 (4.03 g, 5.51 mmol) 및 TEA (30.7 mL, 221 mmol)를 에탄올 250 mL에 첨가하였다. 반응 혼합물을 탈기한 다음, 환류 하에 4시간 동안 교반하였다. LC-MS로 생성물의 존재를 확인하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 염수로 2회 세척하고, 건조시키고, 증발 건조시켰다. 이어서, 조 물질을 330 g 레디-셉 칼럼을 사용하여 10% EtOAc/헥산 용매계로 용리시키면서 MPLC 크로마토그래피에 의해 정제하여 3-에테닐-6-플루오로-2-메틸벤조니트릴을 수득하였다.
단계 C: 6-플루오로-2-메틸-3-(옥시란-2-일)벤조니트릴: 3-에테닐-6-플루오로-2-메틸벤조니트릴 (14.9 g, 92.0 mmol)을 DCM (400 mL)에 0℃에서 첨가한 다음, mCPBA (47.85 g, 277.5 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 72시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 수성 Na2S2O3에 이어서 1N NaOH 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켰다. 조 생성물을 330 g 레디-셉 칼럼을 통해 0-100% 헥산/DCM 용매계로 용리시키면서 크로마토그래피에 의해 정제하여 6-플루오로-2-메틸-3-(옥시란-2-일)벤조니트릴을 수득하였다.
단계 D: tert-부틸 (3S)-4-[2-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)-2-히드록시에틸]-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트: 6-플루오로-2-메틸-3-(옥시란-2-일)벤조니트릴 (12.0 g, 67.7 mmol) 및 (S)-4-N-BOC-2-히드록시메틸피페라진 (22.0 g 102 mmol)을 에탄올 (100 mL) 중에 현탁시킨 다음, 마이크로웨이브 장치에서 150℃로 30분 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 증발 건조시켰다. 잔기를 330 g 레디-셉 칼럼을 통해 5% MeOH/95% EtOAc 용매계로 용리시키면서 MPLC 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 E: tert-부틸 (9aS)-3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: tert-부틸 (3S)-4-[2-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)-2-히드록시에틸]-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (18.5 g, 47.0 mmol) 및 시아노메틸렌트리-n-부틸포스포란 (20.4 g, 85.0 mmol)을 벤젠 180 mL 중에 용해시켰다. 반응 혼합물을 탈기하고, 100℃로 16시간 동안 가열하였다. LC-MS 분석은 생성물 피크 (M+1= 376)를 나타내었다. 반응물을 냉각시키고, 증발 건조시켰다. 잔기를 330 g 레디-셉 칼럼을 통해 20% 아세톤/80% 헥산 혼합물로 용리시키면서 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물의 시스-트랜스 혼합물을 수득하였다.
단계 F: tert-부틸(3R,9aS)-3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 및 tert-부틸(3S,9aS)-3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: 단계 E 생성물의 시스-트랜스 이성질체를 키랄팩 AD 4.6 x 250mm 10μ 칼럼과 20% IPA/80% 헵탄 용매계를 사용하여 분리하였다:
중간체 17B (방법 2)
단계 A: 2-플루오로-6-메틸-벤조니트릴: 어댑터, 열전쌍 및 교반 막대가 구비된 10 L 둥근 바닥 플라스크에 DMA (6 L)를 채우고, 진공 하에 탈기하고, N2로 3회 퍼징하였다. 혼합물에 팔라듐 테트라키스 트리페닐포스핀 (87.5 g, 72.0 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 진공 하에 탈기하고, N2로 3회 퍼징하였다. 반응물을 80℃로 30분 동안 가열하였다. 3-플루오로-2-아이오도톨루엔 (575 g, 2.4 mol) 및 시안화아연 (171.7 g, 1.46 mol)을 첨가하고, 혼합물을 진공 하에 탈기하고, N2로 3회 퍼징하였다. 반응 혼합물을 80℃로 16시간 동안 가열한 다음, 실온으로 냉각되도록 하였다. 용액을 1N NH4OH의 2.0 L 수용액에 첨가하고, 1.5 L EtOAc로 3회 추출하였다. 추출물을 2 L 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 생성물을 냉각된 DCM 중 mCPBA로 처리한 다음, 크로마토그래피 (PE/EA = 10:1)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 B: 3-브로모-6-플루오로-2-메틸-벤조니트릴: 오버헤드 교반기가 구비된 3 L 3 구 둥근 바닥 플라스크에 2-플루오로-6-메틸-벤조니트릴 (191.8 g, 1419 mmol) 및 MsOH (563 mL, 8516 mmol)를 채웠다. NBS (265 g, 1490 mmol)를 이 교반 용액에 30분에 걸쳐 조금씩 첨가하고, 혼합물을 50℃에서 33시간 동안 교반하였다. 이 때, HPLC가 반응이 거의 완료되었음을 나타내면, 반응물을 얼음 1L에 붓고 (발열이 나타남), 700 mL 30% EtOAc/헥산으로 희석하고, 교반하였다. 수성 층을 제거하고, 유기부를 1N NaOH 및 물로 2회 세척하였다. 제거한 수성부에는 불순물이 상당히 농축되어 있음이 관찰되었다. 유기부를 MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시킨 다음, -10℃ 동결기에 밤새 보관하였다. 이 시간에 걸쳐 침전물이 형성되었으며, 이를 여과하고, 5% EtOAc/헥산으로 세척하여 생성물의 제1 수확물을 수득하였다. 침전물의 제2 수확물로 추가의 3-브로모-6-플루오로-2-메틸-벤조니트릴을 수득하였다.
단계 C: 3-(2-브로모-아세틸)-6-플루오로-2-메틸-벤조니트릴: 탈기된 트리부틸(1-에톡시비닐)주석 (200 mL, 591 mmol)을 탈기된 디옥산 (1149 mL) 중 3-브로모-6-플루오로-2-메틸-벤조니트릴 (115 g, 537 mmol) 및 시스-PdCl2(PPh3)2 (18.9 g, 26.9 mmol)의 실온의 교반 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 100℃에서 22시간 동안 교반하였다. 이 때, HPLC는 출발 물질의 완전한 전환을 나타내었고 (12시간 이상이 필요함), 반응의 완결은 플라스크의 측면에 팔라듐 금속이 도금된 것으로부터 알 수 있었다. 이 때, 반응물을 0℃로 냉각시키고, THF (575 mL) 및 물 (230 mL)에 이어서 NBS (110 g, 618 mmol)를 첨가하였다 (내부 온도를 5℃ 미만으로 유지하면서 15분에 걸쳐 조금씩 첨가함). 30분 후, HPLC는 중간체 엔올 에테르의 완전한 소모를 나타내었다. 용액을 MTBE (1000 mL)로 희석하고, 0.5% 수성 HBr (3x 500 mL)로 세척한 다음, 물로 세척하였다. 유기부를 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 침전물이 생성되었고, 고체를 여과하고, 헥산으로 수회 세척하였다. 이를 질소 스위프에 의해 건조시켜 3-(2-브로모-아세틸)-6-플루오로-2-메틸-벤조니트릴을 수득하였다.
단계 D: (3R,9aS)-3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸-페닐)-3-히드록시-헥사히드로-피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8-카르복실산 tert-부틸 에스테르: 디이소프로필에틸아민 (44.0 mL, 252 mmol)을 THF (1000 mL) 중 72 중량% 3-(2-브로모-아세틸)-6-플루오로-2-메틸-벤조니트릴 (69 g, 194 mmol) 및 (S)-4-N-Boc-2-히드록시메틸-피페라진 (42.0 g, 194 mmol)의 실온의 교반 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응물을 1 L EtOAc로 희석하고, 500 mL 10% w/w NaHCO3 수용액으로 2회 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔기를 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피 (40-80% EtOAc/헥산, 선형 구배)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 E: (S)-3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸-페닐)-6,7,9,9a-테트라히드로-1H-피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8-카르복실산 tert-부틸 에스테르: CH2Cl2 (1000 mL) 중 (3R,9aS)-3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸-페닐)-3-히드록시-헥사히드로-피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8-카르복실산 tert-부틸 에스테르 (66.6 g, 170 mmol) 및 트리에틸아민 (71.1 mL, 510 mmol)의 5℃ 미만 내부 온도의 교반 혼합물에 메실-Cl (17.2 mL, 221 mmol)을 적가하고 (발열이 생기므로 느린 첨가를 유지해야 함), 반응물이 30분 동안 실온으로 가온되도록 하였고, 이 때에 반응이 완료되었다. 용액을 500 mL 10% w/w NaHCO3 수용액으로 세척하였다. 유기부를 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성된 물질을 최소량의 EtOAc (125 mL) 중에 약간의 가열 (용액은 50℃ 미만으로 유지되었음)로 모든 고체가 용해될 때까지 녹였다. 용액을 교반하면서 냉각되도록 하고, 이어서 밤새 350 mL 헥산을 적가하였다. 다음 날 아침에, 용액은 맑아졌고, 상당량의 분말이 존재하였다. 고체를 여과에 의해 수집하고, 20% EtOAc/헥산으로 세척하여 생성물을 수득하였다. 모액을 침전물이 나타날 때까지 농축하였고, 이것을 여과하여 추가의 (S)-3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸-페닐)-6,7,9,9a-테트라히드로-1H-피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8-카르복실산 tert-부틸 에스테르를 수득하였다.
단계 F: (3S,9aS)-3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸-페닐)-헥사히드로-피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8-카르복실산 tert-부틸 에스테르: 1 L 3 구 RB에 5% Pd/CaCO3 (10.0 g, 4.02 mmol), MeOH (405 mL) 및 (S)-3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸-페닐)-6,7,9,9a-테트라히드로-1H-피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8-카르복실산 tert-부틸 에스테르 (15.0 g, 40.2 mmol)를 채웠다. 용액을 N2로 5분 동안 폭기하고, 이어서 풍선 압력의 수소 분위기 하에 두고, 교반하면서 40℃로 가온하였다. 38시간 후, HPLC는 부분입체이성질체의 5:1 시스:트랜스 비를 갖는 올레핀의 완전한 전환을 나타내었다. 현탁액을 실온으로 냉각시키고, 셀라이트의 패드를 통해 여과하고, 농축시켰다. 잔기를 칼럼 크로마토그래피 (60-100% EtOAc/헥산, 선형 구배)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
중간체 17A (방법 2)
질소 유입구 어댑터, 열전쌍 및 격막이 구비된 3 구 둥근 바닥 플라스크에 (3R,9aS)-3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸-페닐)-3-히드록시-헥사히드로-피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8-카르복실산 tert-부틸 에스테르 (330 g, 840 mmol), TFA (1.65 L, 21 mol) 및 DCM 3300 mL를 채웠다. Et3SiH (292 g, 2.52 mol, 3 당량)를 한 번에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 톨루엔 (100 mL)과 공비혼합하여 TFA를 제거하였다. 생성된 물질을 DCM (1.7 L) 중에 용해시키고, 2.5 M Na2CO3 (pH는 염기성이어야 함)를 조심스럽게 채웠다. Boc2O (218 g, 1.2 당량)를 한 번에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 유기 층을 분리하고, 농축시키고, 칼럼 크로마토그래피 (0-30% 아세톤-헥산)에 의해 정제하여 생성물 시스/트랜스 이성질체의 혼합물을 수득하였다. 키랄 SFC 정제 (베르게르 멀티그램(MultiGram)TM SFC, 메틀러 톨레도 컴퍼니, 리미티드(Mettler Toledo Co, Ltd), AD 250 mm*50 mm, 5 um 칼럼, A: 초임계 CO2, B: 메탄올, A:B = 150 mL/분에서 85:15)로 주요 트랜스 부분입체이성질체 17A 뿐만 아니라 시스 부분입체이성질체 17B도 수득하였다.
중간체 17C 및 17D (방법 1)
17C: tert-부틸(3S,9aR)-3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트
17D: tert-부틸(3R,9aR)-3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트
단계 A: tert-부틸 (3R)-4-[2-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)-2-히드록실에틸]-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트: 6-플루오로-2-메틸-3-(옥시란-2-일)벤조니트릴 (I-17A 및 I-17B, 방법 1, 단계 A-C에 대해 상기 기재된 바와 같이 제조함) (4.80 g, 27.1 mmol) 및 (R)-4-N-BOC-2-히드록시메틸-피페라진 (예를 들어 에세시스 파마테크(Acesys Pharmatech), 카탈로그 # A1612R로부터 상업적으로 이용가능하고; 문헌 [J. Org. Chem, 2007, 72(22), p. 8591-8592]에도 기재됨) (8.79 g, 40.6 mmol)을 EtOH (30 mL) 중에 현탁시키고, 마이크로웨이브 장치에서 150℃에서 1시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 증발 건조시켰다. 잔기를 330 g 이스코 레디-셉 칼럼을 통해 에틸 아세테이트에서 5% MeOH/에틸 아세테이트 구배로 용리시키면서 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 B: tert-부틸(3S,9aR)-3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 및 tert-부틸(3R,9aR)-3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: tert-부틸 (3R)-4-[2-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)-2-히드록실에틸]-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (7.14 g, 18.2 mmol) 및 시아노메틸렌 트리부틸포스포란 (7.88 g, 32.7 mmol)을 벤젠 (60.0 mL) 중에 용해시킨 다음, 100℃에서 밤새 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 증발 건조시켰다. 잔기를 330 g 이스코 레디-셉 칼럼을 통해 10% 아세톤/DCM에서 20% 아세톤/DCM 구배로 용리시키면서 크로마토그래피에 의해 정제하여 트랜스-시스 혼합물을 수득하였다. 이성질체를 키랄 HPLC (100 bar 및 35℃에서 30x 250 mm 키랄팩 IC 칼럼 (디아셀 케미칼 인더스트리즈, 리미티드(Diacel Chemical Industries, LTD.) 상 70mL/분의 15% 2:1 MeOH:MeCN:CO2, 230 nM)에 의해 분해하였다.
중간체 17C 및 17D (방법 2)
단계 A: 2-플루오로-6-메틸-벤조니트릴: 어댑터, 열전쌍 및 교반 막대가 구비된 10 L 둥근 바닥 플라스크에 DMA (6 L)를 채우고, 진공 하에 탈기하고, N2로 3회 퍼징하였다. 혼합물에 팔라듐 테트라키스 트리페닐포스핀 (87.5 g, 72.0 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 진공 하에 탈기하고, N2로 3회 퍼징하였다. 반응물을 80℃로 30분 동안 가열하였다. 3-플루오로-2-아이오도톨루엔 (575 g, 2.4 mol) 및 시안화아연 (171.7 g, 1.46 mol)을 첨가하고, 혼합물을 진공 하에 탈기하고, N2로 3회 퍼징하였다. 반응 혼합물을 80℃로 16시간 동안 가열한 다음, 실온으로 냉각되도록 하였다. 용액을 1N NH4OH의 2.0 L 수용액에 첨가하고, 이를 1.5 L EtOAc로 3회 추출하고, 2 L 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 생성물을 냉각된 DCM 중 mCPBA (~0.2 당량)로 처리하여 트리페닐포스핀을 산화시키고, 정제를 용이하게 하고, 이어서 크로마토그래피 (PE/EA = 10:1)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 B: 3-브로모-6-플루오로-2-메틸-벤조니트릴: 오버헤드 교반기가 구비된 3 L 3 구 둥근 바닥 플라스크에 2-플루오로-6-메틸-벤조니트릴 (191.8 g, 1419 mmol) 및 MsOH (563 mL, 8516 mmol)를 채웠다. NBS (265 g, 1490 mmol)를 이 교반 용액에 30분에 걸쳐 조금씩 첨가하고, 혼합물을 50℃에서 33시간 동안 교반하였다. 반응물을 얼음 1L에 붓고, 700 mL 30% EtOAc/헥산으로 희석하고, 교반하였다. 수성 층을 제거하고, 유기부를 1N NaOH에 이어서 물로 2회 세척하였다. 유기부를 MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시킨 다음, -10℃ 동결기에 밤새 보관하였다. 이 시간에 걸쳐 침전물이 형성되었으며, 이를 여과하고, 5% EtOAc/헥산으로 세척하여 생성물의 제1 수확물을 수득하였다. 침전물의 제2 수확물로 추가의 3-브로모-6-플루오로-2-메틸-벤조니트릴을 수득하였다.
단계 C: 3-(2-브로모-아세틸)-6-플루오로-2-메틸-벤조니트릴: 탈기된 트리부틸(1-에톡시비닐)주석 (200 mL, 591 mmol)을 탈기된 디옥산 (1149 mL) 중 3-브로모-6-플루오로-2-메틸-벤조니트릴 (115 g, 537 mmol) 및 시스-PdCl2(PPh3)2 (18.9 g, 26.9 mmol)의 실온의 교반 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 100℃에서 22시간 동안 교반하였다. 반응의 완결은 플라스크의 측면에 팔라듐 금속이 도금된 것으로부터 알 수 있었다. 반응물을 0℃로 냉각시키고, THF (575 mL) 및 물 (230 mL)에 이어서 NBS (110 g, 618 mmol)를 첨가하였다 (내부 온도를 5℃ 미만으로 유지하면서 15분에 걸쳐 조금씩 첨가함). 30분 후, HPLC는 중간체 엔올 에테르의 완전한 소모를 나타내었다. 용액을 MTBE (1000 mL)로 희석하고, 0.5% 수성 HBr (3x 500 mL)로 세척한 다음, 물로 세척하였다. 유기부를 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 침전물이 생성되었고, 고체를 여과하고, 헥산으로 수회 세척하였다. 이를 질소 스위프에 의해 건조시켜 3-(2-브로모-아세틸)-6-플루오로-2-메틸-벤조니트릴을 수득하였다.
단계 D: (3S,9aR)-3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸-페닐)-3-히드록시-헥사히드로-피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8-카르복실산 tert-부틸 에스테르: 디이소프로필에틸아민 (156 mL, 894 mmol)을 THF (3500 mL) 중 3-(2-브로모-아세틸)-6-플루오로-2-메틸-벤조니트릴 (176 g, 688 mmol) 및 (R)-4-N-Boc-2-히드록시메틸-피페라진 (149 g, 688 mmol)의 실온의 교반 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응물을 3 L EtOAc로 희석하고, 1500 mL 10% NaHCO3 수용액으로 2회 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔기를 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피 (40-80% EtOAc/헥산, 선형 구배)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 E: 17C 및 17D: 질소 유입구 어댑터, 열전쌍 및 격막이 구비된 5000-mL 3구 둥근 바닥 플라스크에 단계 D의 생성물 (273 g, 696.2 mmol), TFA (1340 mL, 17.45 mol, 25 당량) 및 DCM 1300 mL를 채웠다. Et3SiH (333 mL, 2.1 mol, 3 당량)를 한 번에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시켜 TFA를 제거하였다. 생성된 물질을 DCM (600 mL) 중에 용해시키고, 2.5 M Na2CO3 (1400 mL, 3.5 mol, 5 당량) (pH는 염기성이어야 함)를 조심스럽게 채웠다. Boc2O (243 mL, 1.05 mol, 1.5 당량)를 한 번에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 유기 층을 분리하고, 농축시키고, 칼럼 크로마토그래피 (0-30% 아세톤-헥산)에 의해 정제하여 생성물 (대략 2:1 트랜스:시스)을 수득하였고, 이를 키랄 SFC에 의해 두 단일 이성질체로 분리하였다: 키랄 SFC HPLC 분리 조건: 기기: 베르게르 멀티그램 SFC, 메틀러 톨레도 컴퍼니 리미티드; 칼럼: 키랄팩 AD 칼럼 (디아셀 케미칼 인더스트리즈, 리미티드) 250 mm X 50 mm, 5 um; 이동상: A: 초임계 CO2, B: MeOH, A:B =150 mL/분에서 85:15; 칼럼 온도: 38℃; 노즐 압력: 100 Bar; 노즐 온도: 60℃; 증발기 온도: 20℃; 트리머 온도: 25℃; 파장: 235 nm.
중간체 18A
(3R,9aS)-tert-부틸 3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로-1H-피라지노[1,2-a]피라진-2(6H)-카르복실레이트
단계 A: (3S)-tert-부틸 4-(2-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)-2-히드록시에틸)-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트: 에탄올 (10mL) 중 6-플루오로-2-메틸-3-(옥시란-2-일)벤조니트릴 (785 mg, 4.43 mmol) 및 (S)-tert-부틸 3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (1340 mg, 6.2 mmol)의 혼합물을 마이크로웨이브에서 150℃에서 3시간 동안 가열하였다. 휘발성 물질을 증발시키고, 잔기를 바이오타지 상에서 40-100% 에틸 아세테이트/헥산을 사용하여 정제하여 표제 화합물을 수득하였다:
단계 B: (3S)-벤질 4-(2-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)-2-히드록시에틸)-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트: 메틸렌 클로라이드 (20 mL) 중 (3S)-tert-부틸 4-(2-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)-2-히드록시에틸)-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (2.87 g, 7.32 mmol)의 용액에 실온에서 트리플루오로아세트산 (20 mL)을 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 휘발성 용매를 제거한 후, 잔기를 메틸렌 클로라이드 (50 mL) 중에 용해시켰다. 상기 용액에 트리에틸아민 (6.12 mL, 43.9 mmol) 및 벤질 클로로포르메이트 (1.1 mL, 7.3 mmol)를 0℃에서 적가하였다. 반응 용액을 0℃에서 1시간 동안 교반한 후, 포화 중탄산나트륨 용액 (200 mL)으로 켄칭하였다. 이어서, 혼합물을 메틸렌 클로라이드 (3x100 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다.
단계 C: (7R,9aR)-벤질 8-알릴-7-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로-1H-피라지노[1,2-a]피라진-2(6H)-카르복실레이트 및 (7S,9aR)-벤질 8-알릴-7-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로-1H-피라지노[1,2-a]피라진-2(6H)-카르복실레이트: 술포닐 클로라이드 (14.0 g, 118 mmol) 중 (3S)-벤질 4-(2-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)-2-히드록시에틸)-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (1.68 g, 3.93 mmol)의 용액을 90℃에서 1시간 동안 가열하였다. 휘발성 물질을 제거한 후, 잔기를 DMF (16 mL) 중에 용해시키고, 0℃의 밀봉된 튜브에서 알릴아민 (1.726 mL, 23.58 mmol) 및 아이오딘화나트륨 (0.059 g, 0.39 mmol)으로 처리하고, 생성된 혼합물을 90℃에서 1시간 동안 가열하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트 (300 mL) 중에 희석하고, 포화 중탄산나트륨 (3 x 200 mL)으로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시키고, 잔기를 바이오타지 상에서 40-80% 에틸 아세테이트/헥산을 사용하여 정제하여 표제 화합물 (TLC 상에서 더 극성임)을 수득하였다.
단계 D: (3R,9aS)-8-벤질 2-tert-부틸 3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)테트라히드로-1H-피라지노[1,2-a]피라진-2,8(9H,9aH)-디카르복실레이트: 메틸렌 클로라이드 (10 mL) 중 (7R,9aR)-벤질 8-알릴-7-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로-1H-피라지노[1,2-a]피라진-2(6H)-카르복실레이트 (1260 mg, 2.81 mmol), 1,3-디메틸피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온 (1316 mg, 8.430 mmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) (162 mg, 0.140 mmol)의 혼합물을 35℃에서 4시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 디-tert-부틸 디카르보네이트 (736 mg, 3.37 mmol) 및 트리에틸아민 (1579 μL, 11.24 mmol)을 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 농축 후, 잔기를 바이오타지 상에서 40% EtOAc/헥산을 사용하여 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 E: (3R,9aS)-tert-부틸 3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로-1H-피라지노[1,2-a]피라진-2(6H)-카르복실레이트: MeOH (100 mL) 중 (3R,9aS)-8-벤질 2-tert-부틸 3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)테트라히드로-1H-피라지노[1,2-a]피라진-2,8(9H,9aH)-디카르복실레이트 (600 mg, 1.180 mmol)의 용액에 탄소 상 팔라듐 (10%, 126 mg, 0.118 mmol)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 수소화 처리하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 메탄올 및 메틸렌 클로라이드 (1:1)의 혼합물로 세척하고, 여과물을 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다:
중간체 18B
(3S,9aS)-tert-부틸 3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로-1H-피라지노[1,2-a]피라진-2(6H)-카르복실레이트
단계 A: (3S,9aS)-8-벤질 2-tert-부틸 3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)테트라히드로-1H-피라지노[1,2-a]피라진-2,8(9H,9Ah)-디카르복실레이트: 메틸렌 클로라이드 (10 mL) 중 (7S,9aR)-벤질 8-알릴-7-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로-1H-피라지노[1,2-a]피라진-2(6H)-카르복실레이트 (518 mg, 1.155 mmol), 1,3-디메틸피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온 (518 mg, 1.16 mmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) (66.7 mg, 0.058 mmol)의 혼합물을 35℃에서 4시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 디-tert-부틸 디카르보네이트 (302 mg, 1.39 mmol) 및 트리에틸아민 (649 μL, 4.62 mmol)을 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 농축 후, 잔기를 바이오타지 상에서 40% EtOAc/헥산을 사용하여 정제하여 표제 화합물을 수득하였다:
단계 B: (3S,9aS)-tert-부틸 3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로-1H-피라지노[1,2-a]피라진-2(6H)-카르복실레이트: MeOH (100 Ml) 중 (3S,9aS)-8-벤질 2-tert-부틸 3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)테트라히드로-1H-피라지노[1,2-a]피라진-2,8(9H,9Ah)-디카르복실레이트 (0.78 g, 1.534 mmol)의 용액에 탄소 상 팔라듐 (10%, 0.163 g, 0.153 mmol)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 수소화 처리하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 메탄올 및 메틸렌 클로라이드 (1:1)의 혼합물로 세척하고, 여과물을 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다:
중간체 18C
(3S,9aR)-tert-부틸 3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로-1H-피라지노[1,2-a]피라진-2(6H)-카르복실레이트: 6-플루오로-2-메틸-3-(옥시란-2-일)벤조니트릴 및 (R)-tert-부틸 3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트로부터 출발하여 (3R,9aS)-tert-부틸 3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로-1H-피라지노[1,2-a]피라진-2(6H)-카르복실레이트의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
중간체 18D
(3R,9aR)-tert-부틸 3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로-1H-피라지노[1,2-a]피라진-2(6H)-카르복실레이트: (7R,9aS)-벤질 8-알릴-7-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로-1H-피라지노[1,2-a]피라진-2(6H)-카르복실레이트 ((3S,9aR)-tert-부틸 3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로-1H-피라지노[1,2-a]피라진-2(6H)-카르복실레이트의 합성으로부터 수득함)로부터 출발하여 (3S,9aS)-tert-부틸 3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로-1H-피라지노[1,2-a]피라진-2(6H)-카르복실레이트의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
중간체 19A 및 19B
(3S,9aS)-tert-부틸 3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]티아진-8(1H)-카르복실레이트 및 (3R,9aS)-tert-부틸 3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]티아진-8(1H)-카르복실레이트
단계 A: (3S)-tert-부틸 3-(아세틸티오메틸)-4-(2-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)-2-히드록시에틸)피페라진-1-카르복실레이트: (3S)-tert-부틸 4-(2-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)-2-히드록시에틸)-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (합성은 상기 기재됨, 0.090 g, 0.23 mmol)를 THF (2.3 mL) 중에 용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. 트리에틸아민 (0.038 mL, 0.274 mmol)을 첨가하고, 이어서 Ms-Cl (0.020 mL, 0.252 mmol) 및 DMAP (2.79 mg, 0.023 mmol)를 첨가하였다. 빙조를 제거하고, 교반을 2시간 동안 계속하였다. 이어서, 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 생성된 물질을 DMSO (2 mL) 중에 재용해시키고, 티오아세트산칼륨 (0.035 g, 0.306 mmol)으로 처리하였다. 반응 혼합물을 질소 하에 실온에서 밤새 교반한 다음, 45℃에서 2시간 동안 가열하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 물 (3회) 및 염수로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 생성물을 칼럼 크로마토그래피 (100% 헥산에서 80% EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 목적 생성물을 수득하였다.
단계 B: (3S)-tert-부틸 3-(아세틸티오메틸)-4-(2-클로로-2-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)에틸)피페라진-1-카르복실레이트: 톨루엔 (0.62 mL) 중 (3S)-tert-부틸 3-(아세틸티오메틸)-4-(2-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)-2-히드록시에틸)피페라진-1-카르복실레이트 (30.8 mg, 0.0680 mmol)의 용액에 티오닐 클로라이드 (14.9 μL, 0.205 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 빙조를 사용하여 냉각시키고, 이어서 피리딘 (22.1 μL, 0.273 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 20분 동안 교반한 다음, 1시간에 걸쳐 실온으로 가온되도록 하고, 최종적으로 70℃로 30분 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔기를 에틸 아세테이트로 희석하고, 최소량의 포화 중탄산나트륨 수용액에 이어서 염수로 세척하였다. 유기 층을 분리하고, 무수 황산나트륨 패드를 통해 여과하고, 농축시켰다. 후속 단계에 바로 사용하였다.
단계 C: (3S,9aS)-tert-부틸 3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]티아진-8(1H)-카르복실레이트 및 (3R,9aS)-tert-부틸 3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]티아진-8(1H)-카르복실레이트: THF (34 mL) 중 (3S)-tert-부틸 3-(아세틸티오메틸)-4-(2-클로로-2-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)에틸)피페라진-1-카르복실레이트 (320 mg, 0.681 mmol)를 소듐 메톡시드 (441 mg, 2.04 mmol)로 처리하였다. 혼합물을 N2 하에 실온에서 3시간 동안 교반하였다. LC-MS는 목적 생성물의 형성을 부분입체이성질체의 쌍으로서 나타내었다. 반응 혼합물을 농축시키고, 에틸 아세테이트와 물 사이에 분배하였다. 유기 층을 분리하고, 염수로 세척하고, 건조시키고, 증발 건조시켰다. 조 생성물을 칼럼 크로마토그래피 (2 CV에 대해 100% 헥산, 4 CV에 대해 100% 헥산에서 35% EtOAc/헥산, 이어서 4 CV에 대해 35%로 유지한 다음, 4 CV를 통해 80% EtOAc/헥산으로 증가시킴 (CV = 칼럼 부피))에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
중간체 20A 및 20B
20A: tert-부틸 (3R,9aS)-3-(3-시아노-2,4-디플루오로페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: 20B: tert-부틸 (3S,9aS)-3-(3-시아노-2,4-디플루오로페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트
단계 A: 2,6-디플루오로-3-히드록시벤조니트릴: 2,6-디플루오로-3-메톡시벤조니트릴 (4.42 g, 26.1 mmol)을 0℃에서 DCM (10 mL) 중에 용해시킨 다음, 1 M BBr3 (52.2 mL, 52.2 mmol)을 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음물에 붓고, 추가의 DCM으로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켜 2,6-디플루오로-3-히드록시벤조니트릴을 수득하였다:
단계 B: 3-시아노-2,4-디플루오로페닐 트리플루오로메탄술포네이트: 2,6-디플루오로-3-히드록시벤조니트릴 (3.50 g, 22.6 mmol)을 DCM (50 mL) 중에 용해시키고, 0℃로 냉각시키고, TEA (7.87 mL, 56.4 mmol)에 이어서 트리플산 무수물 (7.63 mL, 45.1 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 교반한 다음, 얼음물에 붓고, 추가의 DCM으로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 포화 수성 NaHCO3에 이어서 염수로 세척하고, 이어서 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켰다. 조 물질을 330 g 레디-셉 칼럼을 통해 0-80% EtOAc/헥산으로 용리시키면서 MPLC 크로마토그래피에 의해 정제하여 3-시아노-2,4-디플루오로페닐 트리플루오로메탄술포네이트를 수득하였다.
단계 C: 3-에테닐-2,6-디플루오로벤조니트릴: 3-시아노-2,4-디플루오로페닐 트리플루오로메탄술포네이트 (5.20 g, 18.1 mmol), 포타슘 비닐 트리플루오로보레이트 (4.85 g, 36.2 mmol), PdCl2(dppf)-CH2Cl2 부가물 (0.662 g, 0.905 mmol) 및 TEA (5.05 mL, 36.2 mmol)를 에탄올 75 mL에 첨가하였다. 반응 혼합물을 탈기한 다음, 환류 하에 4시간 동안 가열하였다. LC-MS 분석으로 생성물 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 염수로 2회 세척하고, 건조시키고, 증발 건조시켰다. 이어서, 조 물질을 330 g 레디-셉 칼럼을 통해 10% EtOAc/헥산 용매계로 용리시키면서 MPLC 크로마토그래피에 의해 정제하여 3-에테닐-2,6-디플루오로벤조니트릴을 수득하였다.
단계 D: 2,6-디플루오로-3-(옥시란-2-일)벤조니트릴: 3-에테닐-2,6-디플루오로벤조니트릴 (1.70 g, 10.3 mmol)을 0℃에서 DCM (10 mL)에 첨가하였다. 이어서, mCPBA (5.33 g, 30.9 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 수성 Na2S2O3에 이어서 1N NaOH 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켰다. 조 생성물을 120 g 레디-셉 칼럼을 통해 0-100% EtOAc/헥산 용매계로 용리시키면서 MPLC 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 2,6-디플루오로-3-(옥시란-2-일)벤조니트릴을 단리시켰다.
단계 E: tert-부틸 (3S)-4-[2-(3-시아노-2,4-디플루오로페닐)-2-히드록시에틸]-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트: 2,6-디플루오로-3-(옥시란-2-일)벤조니트릴 (1.50 g, 8.28 mmol) 및 (S)-4-N-BOC-2-히드록시메틸피페라진 (2.40 g, 11.1 mmol)을 에탄올 (15 mL) 중에 현탁시킨 다음, 마이크로웨이브 장치에서 150℃로 30분 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 증발 건조시켰다. 잔기를 120 g 레디-셉 칼럼을 통해 5% MeOH/95% EtOAc로 용리시키면서 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 F: tert-부틸(9aS)-3-(3-시아노-2,4-디플루오로페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: tert-부틸 (3S)-4-[2-(3-시아노-2,4-디플루오로페닐)-2-히드록시에틸]-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (1.2 g, 3.0 mmol) 및 시아노메틸렌트리-n-부틸포스포란 (1.31 g, 5.44 mmol)을 벤젠 5 mL 중에 용해시켰다. 반응 혼합물을 탈기하고, 100℃로 16시간 동안 가열하였다. LC-MS 분석은 2.07분 (M+1= 380)에서 생성물 피크를 나타내었다. 반응물을 냉각시키고, 증발 건조시켰다. 잔기를 80 g 레디-셉 칼럼을 통해 40% EtOAc/60% 헥산 혼합물로 용리시키면서 MPLC 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물의 시스-트랜스 혼합물을 수득하였다.
단계 G: 이성질체 20A 및 20B: 단계 F 생성물의 이성질체를 키랄팩 AD 4.6x 250 mm 10μ 칼럼을 사용하여 25% IPA/75% 헵탄으로 용리시키면서 키랄 HPLC에 의해 분리하였다. (3R,9aS) 트랜스-이성질체 20A는 첫 번째로 용리되었고, (3S,9aS) 시스-이성질체 20B는 두 번째로 용리되었다:
중간체 20C 및 20D
20C: (3S,9aR)-tert-부틸 3-(3-시아노-2,4-디플루오로페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 및 20D: (3R,9aR)-tert-부틸 3-(3-시아노-2,4-디플루오로페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트
단계 A: (3R)-tert-부틸 4-(2-(3-시아노-2,4-디플루오로페닐)-2-히드록시에틸)-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트: 2,6-디플루오로-3-(옥시란-2-일)벤조니트릴 (3.70 g, 20.4 mmol) 및 (R)-tert-부틸 3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (6.63 g, 30.6 mmol)를 에탄올 (36.0 mL) 중에 용해시키고, 이어서 3-20mL 밀봉된 튜브에 넣고, 140℃에서 1시간 동안 마이크로웨이브로 처리하였다. 용매를 증발시키고, 합한 잔기를 120 g 이스코 레디-셉 칼럼을 통해 50%에서 100% 에틸 아세테이트/헥산 용매계를 사용하여 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 B: (9aR)-tert-부틸 3-(3-시아노-2,4-디플루오로페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 및 (3S,9aR)-tert-부틸 3-(3-시아노-2,4-디플루오로페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: (3R)-tert-부틸 4-(2-(3-시아노-2,4-디플루오로페닐)-2-히드록시에틸)-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (7.30 g, 18.4 mmol)를 벤젠 (90 mL) 중에 용해시키고, 시아노메틸렌 트리부틸 포스포란 (7.98 g, 33.1 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 5개의 별개 20 mL 마이크로웨이브 튜브에 넣고, 탈기하고, 100℃로 밤새 가열하였다. LC-MS는 생성물 피크를 나타내었다. 모든 반응 혼합물을 합하고, 농축시켰다. 조 생성물을 330 g 이스코 레디-셉 칼럼과 10% 아세톤/헥산 용매계를 사용하여 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. 부분입체이성질체를 다음의 조건을 이용하는 정제용 SFC에 의해 분해하였다: 키랄 OJ 21 x 250 mm 칼럼 상 (15% MeOH와 0.2% DEA)/CO2, 50 ml/분, 뜨거운 MeOH/MeCN 중 191 mg/mL, 35℃, 220 nm.
중간체 21A 및 21B
21A: 2,4-디플루오로-5-[(3S,9aS)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴 및 21B: 2,4-디플루오로-5-[(3R,9aS)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴
단계 A: 5-시아노-2,4-디플루오로벤조산: THF 80 mL 및 물 20 mL 중 5-브로모-2,4-디플루오로벤조니트릴 (6.00 g, 27.5 mmol)의 용액에 TEA (3.00 g, 29.7 mmol) 및 Pd(dppf)Cl2 (0.8 g)를 첨가하였다. 반응물을 18시간 동안 CO 2MPa에서 100℃로 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응물을 물 500 mL에 부었다. 침전된 갈색 고체를 여과하였다. 여과물 케이크를 물로 세척한 다음, 실리카 겔 칼럼에 의해 정제하여 5-시아노-2,4-디플루오로벤조산을 수득하였다.
단계 B: 5-(브로모아세틸)-2,4-디플루오로벤조니트릴: 옥살릴 클로라이드 (5 mL)를 DCM 30 mL 및 DMF 0.5 mL 중 5-시아노-2,4-디플루오로벤조산 (2.00 g, 10.9 mmol)의 현탁액에 0℃에서 적가하였다. 혼합물을 25℃에서 45분 동안 교반하고, 투명한 용액을 감압 하에 농축 건조시켰다. 이 산 클로라이드를 THF 70 mL에 녹이고, 얼음/물을 사용하여 0℃로 냉각시켰다. CH2N2 용액 (에테르 ~150 mL 중 70 mmol)을 적가하고, 0℃에서 2시간 동안 교반한 후, 농축된 (47%) HBr 15 mL을 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 20분 동안 교반한 다음, EtOAc 600 mL로 희석하였다. 이어서, 혼합물을 물 (30 mL), 포화 NaHCO3 (30 mL) 및 염수 (30 mL)로 후속적으로 세척하였다. EtOAc 층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켜 5-(브로모아세틸)-2,4-디플루오로벤조니트릴을 수득하였다.
단계 C: tert-부틸(3S)-4-[2-(5-시아노-2,4-디플루오로페닐)-2-옥소에틸]-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트: THF 50 mL 중 5-(브로모아세틸)-2,4-디플루오로벤조니트릴 (2.5 g, 9.6 mmol), tert-부틸 (3S)-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (2.1 g, 9.6 mmol) 및 DIEA (1.90 g, 14.4 mmol)의 현탁액을 20℃에서 10시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음물에 붓고, EtOAc (3x 200 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 물 및 염수로 세척하고, 건조시키고, 농축시켰다. 잔기를 DCM 중 5% MeOH로 용리시키면서 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 D: 21B: 2,4-디플루오로-5-[(3R,9aS)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴 및 21A: 2,4-디플루오로-5-[(3S,9aS)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴: TFA 50 mL 중 tert-부틸 (3S)-4-[2-(5-시아노-2,4-디플루오로페닐)-2-옥소에틸]-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (3.1 g, 7.8 mmol)의 용액에 Et3SiH (10.4 g, 89.0 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 50℃에서 90분 동안 교반하고, 감압 하에 농축 건조시켰다. 잔기를 에테르로 세척하고, 생성된 오일을 정제하고, 이성질체를 SFC (칼럼: 키랄팩 AD-H 100x4.6 mm I.D., 5 um; 이동상: 5%에서 40%의 CO2 중 메탄올 (0.05% DEA); 유량:4.5 mL/분; 파장: 220nm; 온도: 40; 구배: 0분 5%, 0.5분 5%, 2.25분 40%, 3.65분 40%, 4.0분 5%, 5.0분 5%)에 의해 분리하여 표제 화합물을 수득하였다:
중간체 22
tert-부틸 (3S,9aR)-3-(5-시아노-2-플루오로-4-메톡시페닐) 헥사히드로피라지노 [2,1-c] [1,4] 옥사진-8 (1H)-카르복실레이트
단계 A: 1-브로모-4-플루오로-2-메톡시벤젠: DMF 300 mL 중 2-브로모-5-플루오로페놀 (50 g, 0.26 mol)의 용액에 K2CO3 (72.8 g, 0.520 mol)를 한 번에 첨가하고, MeI (44.6 g, 0.310 mol)를 0℃에서 적가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반한 후, 반응물을 물 1L에 붓고, EtOAc (300 mL X 3)로 추출하였다. 합한 유기 층을 물, 염수로 세척하고, 건조시키고, 농축시켜 1-브로모-4-플루오로-2-메톡시벤젠을 수득하였다.
단계 B: 4-플루오로-2-메톡시벤조니트릴: DMF 250 mL 중 1-브로모-4-플루오로-2-메톡시벤젠 (25 g, 0.12 mol)의 용액에 Zn(CN)2 (28.6 g, 0.240 mol) 및 Pd(PPh3)4 (7.05 g, 6.10 mmol)를 한 번에 첨가하고, 반응물에 Ar을 채우고, 100℃로 10시간 동안 가열하였다. 이어서, 반응물을 EtOAc 1L에 붓고, 규조토 패드를 통해 여과하였다. 여과물을 물, 염수로 세척하고, 건조시키고, 고체로 농축시키고, 이를 실리카 겔 칼럼에 의해 정제하여 4-플루오로-2-메톡시벤조니트릴을 수득하였다.
단계 C: 5-브로모-4-플루오로-2-메톡시벤조니트릴: 진한 H2SO4 300 mL 중 4-플루오로-2-메톡시벤조니트릴 (35 g, 0.23 mol)의 용액에 -10℃에서 NBS (42 g, 0.23 mol)를 조금씩 첨가하고, 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 얼음 2 L에 조금씩 붓고, 침전된 고체를 여과하였다. 필터 케이크를 물로 세척한 다음, 고체를 진공 하에 건조시켜 5-브로모-4-플루오로-2-메톡시벤조니트릴을 수득하였다.
단계 D: 5-(브로모아세틸)-4-플루오로-2-메톡시벤조니트릴: 500 mL 플라스크에 5-브로모-4-플루오로-2-메톡시벤조니트릴 (4.00 g, 17.4 mmol), 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II)클로라이드 (0.61 g, 0.87 mmol), 트리부틸(1-에톡시-비닐)주석 (9.42 mL, 26.1 mmol)을 첨가하고, 이어서 1,4 디옥산 (40 mL)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 95℃에서 3시간 동안 교반하고; 플라스크를 오일조에서 꺼내고, 실온으로 냉각시키고, 이어서 THF/H2O (50/25 mL)의 혼합물로 처리하고, 빙조에 넣었다. 플라스크에 NBS (6.19 g, 34.8 mmol)를 소량씩 첨가하고; 0℃에서 0.5시간 동안 교반한 후, LC는 목적 생성물의 형성을 나타내었다. 반응 혼합물을 빙조에서 꺼내고, 천천히 실온으로 가온하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (3 X 100 mL)로 추출하고, 염수 및 물로 세척한 다음, 이것을 건조 (Na2SO4)시키고, 여과하고, 농축 건조시키고, 이어서 실리카 겔 상에서 헥산/EtOAc (1/0.5) 용매계를 사용하여 목적 생성물을 수득하였다.
단계 E: tert-부틸 (3R)-4-[5-시아노-2-플루오로-4-메톡시페닐)-2-옥소에틸]-3-(히드록시메틸) 피페라진-1-카르복실레이트: 250 mL 플라스크에 5-(브로모아세틸)-4-플루오로-2-메톡시벤조니트릴 (2.00 g, 7.35 mmol), (R)-N-Boc-2-히드록시메틸-피페라진 (3.18 g, 14.7 mmol), DIEA (2.57 mL, 14.7 mmol) 및 THF (50 mL)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였고; 반응 혼합물의 LC 분석은 반응의 완결을 나타내었다. 용액을 EtOAc (100 mL)로 처리하고, 염수로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 여과하고, 농축 건조시켰다. 이어서, 잔기를 실리카 겔 상에서 DCM 중 5% MeOH 용매계를 사용하여 정제하여 목적 생성물을 수득하였다.
단계 F: tert-부틸 (3S,9aR)-3-(5-시아노-2-플루오로-4-메톡시페닐) 헥사히드로피라지노 [2,1-c] [1,4] 옥사진-8 (1H)-카르복실레이트: 500 mL 플라스크에 tert-부틸 (3R)-4-[5-시아노-2-플루오로-4-메톡시페닐)-2-옥소에틸]-3-(히드록시메틸) 피페라진-1-카르복실레이트 (2.20 g, 5.40 mmol), 트리에틸실란 (4.31 mL, 27.0 mmol) 및 DCM/TFA (50/20 mL)의 혼합물을 첨가하였다. 이어서, 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물의 LC 분석은 환원의 완결을 나타내었다. 반응 혼합물을 농축 건조시키고, 생성된 잔류물을 DCM (20 mL) 및 수성 NaHCO3 및 BOC2O (1.2 g, 5.4 mmol) 중에 용해시키고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. LC에 의한 반응 혼합물의 분석은 완전한 반응을 나타내었다. 반응 혼합물을 추가로 DCM (50 mL)으로 희석하고, 혼합물을 분리 깔때기로 옮기고, 층을 분리하였다. 유기 층을 염수, 물로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 여과하고, 실리카 겔 상에서 DCM 중 5% MeOH 용매계를 사용하여 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. 주: 트랜스 이성질체가 전적으로 형성되었다.
중간체 23A 및 23B
23A: tert-부틸 (3R,9aS)-3-(3-시아노-4-플루오로-2-메톡시페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 및 23B: tert-부틸 (3S,9aS)-3-(3-시아노-4-플루오로-2-메톡시페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트
단계 A: 3-브로모-6-플루오로-2-메톡시벤조니트릴 (방법 1): 2-플루오로-6-메톡시벤조니트릴 (8.30 g, 54.9 mmol)을 0℃에서 트리플산 (75 mL) 중에 용해시킨 다음, NBS (10.3 g, 57.7 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. LC-MS는 출발 물질 피크를 나타내지 않았다. 반응 혼합물을 얼음에 붓고, DCM으로 2회 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켰다. 잔기를 330g 레디-셉 칼럼을 통해 10%에서 50% EtOAc/헥산 용매계로 용리시키면서 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 B: 3-에테닐-6-플루오로-2-메톡시벤조니트릴: 3-브로모-6-플루오로-2-메톡시벤조니트릴 (4.40 g, 19.1 mmol), 포타슘 비닐 트리플루오로보레이트 (5.12 g, 38.3 mmol), PdCl2(dppf)-CH2Cl2 부가물 (0.7 g, 1 mmol) 및 TEA (5.33 mL, 38.3 mmol)를 200 mL 플라스크에 들은 80 mL 에탄올에 첨가하였다. 반응 혼합물을 탈기하고, 환류 하에 4시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각시킨 다음, 대부분의 EtOH를 제거하였다. 잔기를 에틸 아세테이트로 희석하였다. 혼합물을 염수로 2회 세척하였다. 유기 층을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켰다. 잔기를 330g 레디셉 칼럼을 통해 10% EtOAc/헥산 용매계로 용리시키면서 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 C: 6-플루오로-2-메톡시-3-(옥시란-2-일)벤조니트릴: 3-에테닐-6-플루오로-2-메톡시벤조니트릴 (1.67 g, 9.43 mmol)을 DCM (50 mL)에 0℃에서 첨가한 다음, mCPBA (4.88 g, 28.3 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 수성 Na2S2O3에 이어 1N NaOH에 이어 염수로 세척하였다. 유기 층을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켰다. 조 생성물을 120g 레디-셉 칼럼을 통해 0-100% EtOAc/헥산 용매계로 용리시키면서 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 6-플루오로-2-메톡시-3-(옥시란-2-일)벤조니트릴을 단리시켰다.
단계 D: tert-부틸 (3S)-4-[2-(3-시아노-4-플루오로-2-메톡시페닐)-2-히드록시에틸]-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트: 6-플루오로-2-메톡시-3-(옥시란-2-일)벤조니트릴 (1.4 g, 7.3 mmol) 및 (S)-4-N-BOC-2-히드록시메틸피페라진 (3.13 g, 14.5 mmol)을 에탄올 (15 mL) 중에 현탁시킨 다음, 마이크로웨이브 장치에서 150℃로 60분 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 증발 건조시켰다. 잔기를 40g 레디-셉 칼럼을 통해 5% MeOH/95% EtOAc로 용리시키면서 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다:
단계 E: tert-부틸 (9aS)-3-(3-시아노-4-플루오로-2-메톡시페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: tert-부틸 (3S)-4-[2-(3-시아노-4-플루오로-2-메톡시페닐)-2-히드록시에틸]-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (2 g, 4.88 mmol) 및 시아노메틸렌트리-n-부틸포스포란 (2.122g, 8.79mmol)을 15 mL 벤젠 중에 용해시켰다. 반응 혼합물을 탈기하고, 100℃로 16시간 동안 가열하였다. LC-MS는 2.07 (M+1= 380)에서 생성물 피크를 나타내었다. 반응물을 냉각시키고, 증발 건조시켰다. 잔기를 80g 레디-셉 칼럼을 통해 크로마토그래피하고, 40% EtOAc/60% 헥산 혼합물로 용리시켜 표제 화합물의 시스-트랜스 혼합물을 수득하였다.
단계 F: 트랜스 이성질체 (3R,9aS) 23A 및 시스 이성질체 (3S,9aS) 23B: 이성질체를 85% SFC CO2 및 15% EtOH를 사용하여 키랄팩 AD-H 250mm X 30 mm I.D.에 의해 분리하였다. 트랜스-이성질체가 먼저 용리되었고, 이어서 시스-이성질체가 용리되었다.
3-브로모-6-플루오로-2-메톡시벤조니트릴 제조에 대한 방법 2:
단계 A: 1-브로모-4-플루오로-2-메톡시벤젠: 무수 DMF 125 mL 중 2-브로모-5-플루오로페놀 (15 g, 79 mmol)의 용액을 냉각 하에 K2CO3 (17.0 g, 138 mmol) 및 MeI (14.0 g, 102 mmol)에 첨가하고, 이어서 반응물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물에 붓고, 디에틸 에테르로 추출하고, 물 및 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켜 1-브로모-4-플루오로-2-메톡시벤젠을 수득하였다.
단계 B: 3-브로모-6-플루오로-2-메톡시벤조산 : 질소 하에 건조 THF 중 건조 디이소프로필아민 (10 g, 99 mmol)의 용액을 -78℃ 조로 냉각시키고, n-부틸 리튬 (헥산 중 2.50 M, 40 mL, 99 mmol)을 첨가하고, 용액을 -78℃에서 20분 동안 교반하였다. 1-브로모-4-플루오로-2-메톡시벤젠 (17.0 g, 82.5 mmol)을 첨가하였다. -78℃에서 2시간 동안 교반한 후, 용액을 CO2로 버블링하고, 이어서 0℃로 가온하였다. 이어서, 1 N HCl을 pH=3-4가 될 때까지 첨가하고, 혼합물을 AcOEt로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시켜 3-브로모-6-플루오로-2-메톡시벤조산을 수득하였다.
단계 C: 3-브로모-6-플루오로-2-메톡시벤즈아미드: 옥살릴 클로라이드 (15 mL)를 DMF 0.5 mL를 포함하는 DCM 100 mL 중 3-브로모-6-플루오로-2-메톡시벤조산 (15 g, 60 mmol)의 현탁액에 0℃에서 적가하였다. 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반하고, 투명한 용액을 감압 하에 농축 건조시켰다. 무수 아세토니트릴 60 mL 중에 용해된 잔기를 수성 NH3.H2O 600 mL에 0℃에서 첨가하고, 2시간 동안 교반한 다음, 여과하여 3-브로모-6-플루오로-2-메톡시벤즈아미드를 수득하였다.
단계 D: 3-브로모-6-플루오로-2-메톡시벤조니트릴: DMF 100 mL 중 3-브로모-6-플루오로-2-메톡시벤즈아미드 (14 g, 61 mmol)의 용액을 2,4,6-트리클로로-[1,3,5]트리아진 (12.3 g, 67.0 mmol)에 0℃에서 조금씩 첨가하고, 2시간 동안 교반한 후, 얼음/물에 부었다. 백색 고체를 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하고, DCM 중에 용해시키고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켜 3-브로모-6-플루오로-2-메톡시벤조니트릴을 수득하였다.
중간체 24A 및 24B
tert-부틸 (3R,9aS)-3-(3-시아노-2-메틸페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 및 tert-부틸 (3S,9aS)-3-(3-시아노-2-메틸페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: 파트 A: 상업적으로 입수가능한 3-브로모-2-메틸벤조산으로부터 출발하여 3-브로모-6-플루오로-2-메톡시벤조니트릴을 제조하기 위한 방법 2, 단계 C 및 D에 기재된 것과 유사한 순서를 사용하여 3-브로모-2-메틸벤조니트릴을 제조하였다.
파트 B: 표제 화합물의 제조는 3-브로모-6-플루오로-2-메톡시벤조니트릴 대신 3-브로모-2-메틸벤조니트릴로 출발하여 중간체 17A 및 중간체 17B (방법 1)의 제조에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 달성하였다. 트랜스 및 시스를 AD-H 칼럼, 30 x 250mm, 25% IPA (0.2% DEA)/CO2, 70 mL/분, 100bar, MeOH 중 50, 35C, 220nm를 사용하여 분리하였다.
중간체 24C 및 24D
tert-부틸 (3S,9aR)-3-(3-시아노-2-메틸페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 및 tert-부틸(3R,9aR)-3-(3-시아노-2-메틸페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트:
단계 A: 3-(2-클로로아세틸)-2-메틸벤조니트릴
-78℃에서 THF (100 mL) 중 3-아이오도-2-메틸벤조니트릴 (7.71 g, 31.7 mmol) 및 2-클로로-N-메톡시-N-메틸아세트아미드 (6.55 g, 47.6 mmol)의 용액에 n-부틸리튬 (헥산 중 2.5 M, 14.0 mL, 34.9 mmol)을 적가하였다. 첨가가 완결된 후, 혼합물을 -78℃에서 15분 동안 교반한 다음, 1 N HCl의 적가로 켄칭하였다. 혼합물을 EtOAc/물 사이에 분배하고, 층을 분리하였다. 수층을 EtOAc (2x)로 추출하고, 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 건조 (황산마그네슘)시키고, 여과하고, 농축시켰다. 헥산으로부터 생성된 잔류물을 재결정화하여 3-(2-클로로아세틸)-2-메틸벤조니트릴을 수득하였다:
단계 B: tert-부틸 (3R)-4-[2-(3-시아노-2-메틸페닐)-2-옥소에틸]-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트: THF (17.6 mL) 중 3-(클로로아세틸)-2-메틸벤조니트릴 (1.7 g, 8.8 mmol)의 용액에 실온에서 (R)-4-N-boc-2-히드록시메틸-피페라진 (2.279 g, 10.54 mmol) 및 DIPEA (3.07 mL, 17.56 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 주말 동안 교반하였다. 농축시킨 후, 잔기를 EtOAc와 수성 NaHCO3 (포화) 사이에 분배하였다. 수성 층을 EtOAc (2x)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수로 세척하고, 무수 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하였다. 농축에 이어서 정제용 TLC (실리카 겔; 10% MeOH/DCM)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다:
단계 C: 2-메틸-3-[(3S,9aR)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴 및 2-메틸-3-[(3R,9aR)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴: DCM (21.24 mL) 및 트리에틸실란 (5.09 mL, 31.9 mmol) 중 tert-부틸 (3R)-4-[2-(3-시아노-2-메틸페닐)-2-옥소에틸]-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (2.38 g, 6.37 mmol)의 용액에 TFA (10.62 mL)를 실온에서 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 농축시킨 후, 잔기를 DCM과 포화 수성 NaHCO3 사이에 분배하였다. 수성 층을 DCM (2x)으로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수로 세척하고, 무수 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하였다. 농축시킨 후, 잔기를 DCM 20 mL 중에 재용해시키고, BOC2O (3.70 mL, 15.9 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반되도록 두었다. 농축시킨 후, 잔기를 EtOAc와 포화 수성 NaHCO3 사이에 분배하였다. 수성 층을 EtOAc (2x)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수로 세척하고, 무수 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하였다. 농축시킨 후, 혼합물을 정제용 TLC (실리카 겔; 10% MeOH/DCM)에 의해 정제하여 시스 및 트랜스 생성물의 혼합물을 수득하였다. 혼합물을 OD-H 칼럼 상 35℃에서 15% MeOH:MeCN을 사용하여 정제용 SFC에 의해 분해하여 2개의 단일 부분입체이성질체를 수득하였다.
중간체 25A 및 25B
tert-부틸(3R,9aS)-3-(5-시아노-4-메틸티오펜-3-일)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 및 tert-부틸(3S,9aS)-3-(5-시아노-4-메틸티오펜-3-일)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트
단계 A: 2,4-디브로모-3-메틸티오펜: THF 500 mL 중 2,3,5-트리브로모-4-메틸티오펜 (46.2 g, 138 mmol)의 용액에 n-BuLi (55.2 mL, 138.0 mmol)를 -70℃에서 적가하였다. 혼합물을 -70℃에서 15분 동안 교반하고, 물 50 mL를 천천히 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 10분 동안 교반하고, EtOAc로 추출하였다. 유기 층을 물 및 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켜 조 2,4-디브로모-3-메틸티오펜을 수득하였다.
단계 B: 4-브로모-3-메틸티오펜-2-카르보니트릴: DMF 150 mL 중 2,4-디브로모-3-메틸티오펜 (20.0 g, 78.1 mmol) 및 CuCN (6.30 g, 70.3 mmol)의 혼합물을 환류 하에 4시간 동안 교반한 후 냉각시켰다. 반응 혼합물을 교반하면서 에테르 1 L에 붓고, 침전물을 여과에 의해 제거하였다. 여과물을 물 (3x 100 mL), 염수 (100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔기를 실리카 칼럼 크로마토그래피 (석유 에테르:EtOAc = 50:1)에 의해 정제하여 4-브로모-3-메틸티오펜-2-카르보니트릴을 수득하였다.
단계 C: 4-에테닐-3-메틸티오펜-2-카르보니트릴: EtOH 30 mL 및 TEA 30 mL 중 4-브로모-3-메틸티오펜-2-카르보니트릴 (3.00 g, 14.8 mmol), 포타슘 비닐트리플루오로보레이트 (2.40 g, 17.8 mmol) 및 Pd(dppf)Cl2 (0.5 g)의 혼합물을 Ar 하에 4시간 동안 환류하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔기를 칼럼 크로마토그래피 (석유 에테르:EtOAc = 50:1)에 의해 정제하여 4-에테닐-3-메틸티오펜-2-카르보니트릴을 수득하였다.
단계 D: 3-메틸-4-(옥시란-2-일)티오펜-2-카르보니트릴: t-Bu-OH 30 mL 및 물 60 mL 중 4-에테닐-3-메틸티오펜-2-카르보니트릴 (1.70 g, 11.4 mmol)의 현탁액을 NBS (2.40 g, 13.7 mmol)에 조금씩 첨가하였다. 혼합물을 90℃에서 1시간 동안 교반한 다음, 10℃로 냉각시켰다. 이어서, NaOH의 용액 (10 mL 물 중 0.7 g, 17.5 mmol)을 적가하고, 15분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc로 2회 추출하고, 농축시켰다. 잔기를 실리카 칼럼 크로마토그래피 (석유 에테르:EtOAc = 20:1)에 의해 정제하여 3-메틸-4-(옥시란-2-일)티오펜-2-카르보니트릴을 수득하였다.
단계 E: tert-부틸(3S)-4-[2-(5-시아노-4-메틸티오펜-3-일)-2-히드록시에틸]-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트: EtOH 5 mL 중 3-메틸-4-(옥시란-2-일) 티오펜-2-카르보니트릴 (1.3 g, 7.9 mmol) 및 tert-부틸 (3S)-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (2.0 g, 9.5 mmol)의 혼합물을 마이크로웨이브 장치에서 140℃로 90분 동안 가열한 다음 냉각시켰다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔기를 칼럼 크로마토그래피 (DCM:MeOH = 10:1)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 F: tert-부틸(3R,9aS)-3-(5-시아노-4-메틸티오펜-3-일)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 및 tert-부틸(3S,9aS)-3-(5-시아노-4-메틸티오펜-3-일)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: tert-부틸 (3S)-4-[2-(5-시아노-4-메틸티오펜-3-일)-2-히드록시에틸]-3-(히드록시메틸) 피페라진-1-카르복실레이트 (1.40 g, 3.67 mmol) 및 시아노메틸렌 트리부틸포스포란 (1.59 g, 6.61 mmol)을 마이크로웨이브 튜브에서 벤젠 (15 mL) 중에 용해시킨 다음 밀봉하고, 탈기하고, 100℃로 밤새 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 벤젠을 증발시켰다. 이어서, 잔기를 80g 레디-셉 칼럼을 통해 아세톤:DCM (5:95)으로 용리시키면서 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 시스-이성질체 tert-부틸 (3S,9aS)은 첫 번째로 용리되었고; 트랜스-이성질체 (3R,9aS)는 두 번째로 용리되었다:
중간체 26A
(3S,9aS)-tert-부틸 3-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로이소벤조푸란-5-일)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]티아진-8(1H)-카르복실레이트
단계 A: (S)-tert-부틸 4-((R)-2-히드록시-2-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로이소벤조푸란-5-일)에틸)-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트: 4-메틸-5-[(2R)-옥시란-2-일]-2-벤조푸란-1(3H)-온으로부터 출발하여 (S)-tert-부틸 4-(2-히드록시-2-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로이소벤조푸란-5-일)에틸)-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트의 합성에 대해 상기 기재된 것과 유사한 방식으로 (S)-tert-부틸 4-((R)-2-히드록시-2-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로이소벤조푸란-5-일)에틸)-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트를 제조하였다.
단계 B: (S)-tert-부틸 3-(아세틸티오메틸)-4-((R)-2-히드록시-2-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로이소벤조푸란-5-일)에틸)피페라진-1-카르복실레이트: 0℃에서 질소 분위기 하에 무수 THF (20 mL) 중 (S)-tert-부틸 4-((R)-2-히드록시-2-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로이소벤조푸란-5-일)에틸)-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (817 mg, 2.01 mmol)의 용액에 무수 트리에틸아민 (0.560 mL, 4.02mmol)을 첨가하고, 이어서 메탄술포닐 클로라이드 (0.234 mL, 3.01 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘 (24.6 mg, 0.201 mmol)을 첨가하였다. 빙조를 제거하고, 반응 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 생성된 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 생성된 오일을 무수 DMSO (13 mL) 중에 재용해시키고, 티오아세트산칼륨 (1235 mg, 10.81 mmol)으로 처리하였다. 반응 혼합물을 질소 하에 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 물 (3회), 염수로 세척하고, 건조 (MgSO4)시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 생성물을 바이오타지 SP1 (40+M 평형) 상에서 20-80% 에틸 아세테이트/헥산, 20 CV로 용리시키면서 정제하였다.
단계 C: (3S)-tert-부틸 3-(아세틸티오메틸)-4-(2-클로로-2-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로이소벤조푸란-5-일)에틸)피페라진-1-카르복실레이트: 빙조로 냉각시킨 무수 톨루엔 (12.3 mL) 중 (S)-tert-부틸 3-(아세틸티오메틸)-4-((R)-2-히드록시-2-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로이소벤조푸란-5-일)에틸)피페라진-1-카르복실레이트 (573 mg, 1.233 mmol)의 용액에 티오닐 클로라이드 (0.268 mL, 3.70 mmol)를 첨가하였다. 이어서, 무수 피리딘 (0.399 mL, 4.93 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 20분 동안 유지한 다음, 실온으로 가온하고, 3시간 동안 교반하였다. TLC는 출발 물질의 소모를 나타내었다. 반응물을 감압 하에 농축시키고, 고진공 하에 밤새 건조시켰다. 후속 단계에 바로 사용하였다.
단계 D: (3S,9aS)-tert-부틸 3-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로이소벤조푸란-5-일)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]티아진-8(1H)-카르복실레이트: 무수 THF (20 mL) 중 (3S)-tert-부틸 3-(아세틸티오메틸)-4-(2-클로로-2-(4-메틸-1-옥소-1,3-디히드로이소벤조푸란-5-일)에틸)피페라진-1-카르복실레이트 (596 mg, 1.234 mmol)의 용액을 메탄올 중 소듐 메톡시드 25% 용액 (0.846 mL, 3.70 mmol)으로 적가 처리하였다. 반응 혼합물을 질소 하에 실온에서 2시간 동안 교반하였다. LCMS는 목적 생성물의 형성을 나타내었다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔기를 디클로로메탄 중에 재용해시키고, 염수로 세척하였다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔기를 바이오타지 SP1 상에서 20 - 80% 에틸 아세테이트/헥산, 16 CV로 용리시키면서 정제하였다:
중간체 27A 및 27B
27A: tert-부틸 (3S,9aR)-3-(2-클로로-3-시아노-4-플루오로페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 및 27B: tert-부틸 (3R,9aR)-3-(2-클로로-3-시아노-4-플루오로페닐)헥사히드로-피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트
단계 A: 3-브로모-2-클로로-6-플루오로벤조니트릴: 2-클로로-6-플루오로벤조니트릴 (15.6 g, 100 mmol)을 0℃에서 트리프산 (75 mL) 중에 용해시킨 다음, NBS (17.8 g, 100 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가온하고, 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음에 붓고, DCM (2x)으로 추출하였다. DCM 층을 NaHCO3 및 염수로 세척하였다. DCM을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 이어서 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 330g 이스코 레디-셉 칼럼을 통해 10-20% 에틸 아세테이트/헥산 용매계를 사용하여 크로마토그래피에 의해 정제하여 3-브로모-2-클로로-6-플루오로벤조니트릴을 수득하였다.
단계 B: 2-클로로-6-플루오로-3-비닐벤조니트릴: 3-브로모-2-클로로-6-플루오로벤조니트릴 (15.4 g, 65.6 mmol), 포타슘 비닐 트리플루오로보레이트 (17.6 g, 131 mmol), 트리에틸아민 (18.3 mL, 131 mmol) 및 PdCl2(dppf)-CH2Cl2 부가물 (2.68 g, 3.28 mmol)을 에탄올 (75 mL)에 첨가하고, 이어서 탈기하고, 환류 하에 3시간 동안 가열하였다. 반응물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 염수로 세척하고, 건조시키고, 증발 건조시켰다. 생성물을 330g 이스코 레디-셉 칼럼에 통해 10% 에틸 아세테이트/헥산 용매계를 사용하여 크로마토그래피에 의해 정제하여 2-클로로-6-플루오로-3-비닐벤조니트릴을 수득하였다.
단계 C: 2-클로로-6-플루오로-3-(옥시란-2-일)벤조니트릴: 2-클로로-6-플루오로-3-비닐벤조니트릴을 CHCl3 (300 mL) 중에 용해시키고, 이어서 mCPBA (29.4 g, 171 mmol)을 첨가하고, 실온에서 16시간 동안 교반하였다. TLC가 출발 물질의 소모를 나타내었을 때, 혼합물을 Na2S2O3 (1x), 1N NaOH (1x), 염수 (2x)로 세척한 다음, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 이를 여과하고, 농축시킨 다음, 330g 이스코 레디-셉 칼럼을 사용하여 20% 에틸 아세테이트/헥산 용매계로 용리시키면서 MPLC 크로마토그래피에 의해 정제하여 2-클로로-6-플루오로-3-(옥시란-2-일)벤조니트릴을 수득하였다.
단계 D: (3R)-tert-부틸 4-(2-(2-클로로-3-시아노-4-플루오로페닐)-2-히드록시에틸)-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트: 2-클로로-6-플루오로-3-(옥시란-2-일)벤조니트릴 (9.1 g, 46 mmol) 및 (R)-tert-부틸 3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (14.9 g, 69.1 mmol)를 에탄올 (105 mL) 중에 용해시키고, 9개의 밀봉된 튜브에 분배하고, 이어서 140℃로 1시간 동안 마이크로웨이브 처리하였다. 합한 반응 혼합물을 농축시키고, 330g 이스코 레디-셉 칼럼을 통해 50%-100 에틸 아세테이트/헥산 용매계를 사용하여 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 E: (9aR)-tert-부틸 3-(2-클로로-3-시아노-4-플루오로페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: (3R)-tert-부틸 4-(2-(2-클로로-3-시아노-4-플루오로페닐)-2-히드록시에틸)-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (15.6 g, 37.3 mmol) 및 시아노메틸렌 트리-n-부틸 포스포란 (16.4 g, 67.8 mmol)을 벤젠 (90 mL) 중에 용해시키고, 탈기하고, 100℃에서 16시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 330g 이스코 레디-셉 칼럼을 통해 크로마토그래피하고 35% EtOAc/헥산으로 용리시켜 표제 화합물 (시스-트랜스 부분입체이성질체 혼합물)을 수득하였다.
시스-트랜스 부분입체이성질체 혼합물은 다음의 조건을 이용하여 SFC-HPLC에 의해 분리하였다: 키랄팩 AD 21 x 250mm, 20% IPA, 50ml/분, 1:1 MeOH/MeCN 중 ~85mg/mL, 100 bar, 220nm, 35℃.
중간체 27C 및 27D
tert-부틸 (3R,9aS)-3-(2-클로로-3-시아노-4-플루오로페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 및 tert-부틸 (3S,9aS)-3-(2-클로로-3-시아노-4-플루오로페닐)헥사히드로-피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: 단계 D에서 (S)-tert-부틸 3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트를 사용하고, 다음에 기재된 바와 같이 마지막 단계에서 약간의 변화가 있는 것을 제외하고는 27A 및 27B에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 표제 화합물을 제조하였다.
tert-부틸 (3S)-4-[2-(2-클로로-3-시아노-4-플루오로페닐)-2-히드록시에틸]-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (4.00 g, 9.66 mmol) 및 시아노메틸렌 트리-n-부틸포스포란 (4.20 g, 517 mmol)을 60 mL 벤젠 중에 용해시켰다. 반응 혼합물을 탈기하고, 100℃로 3시간 동안 가열하였다. 반응물을 냉각시키고, 증발 건조시켰다. 잔기를 330g 레디-셉 칼럼을 통해 33% EtOAc/67% 헥산으로 용리시키면서 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
중간체 28
2-메톡시-4-(옥시란-2-일)벤조니트릴
단계 A: 4-포르밀-2-메톡시페닐 트리플루오로메탄술포네이트: 실온에서 DMF (200 mL) 중 바닐린 (20 g, 131 mmol)의 용액에 탄산칼륨 (36.30 g, 263 mmol) 및 4-니트로페닐 트리플루오로메탄술포네이트 (53.5 g, 197 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 8시간 동안 교반하였다. EtOAc (600 mL)를 반응 혼합물에 첨가하고, 유기 층을 물로 3회 세척하고, 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 이어서, 조 화합물을 플래쉬 크로마토그래피 (에틸아세테이트/헥산 1:9 → 3:7)에 의해 정제하여 술포네이트를 수득하였다.
단계 B: 4-포르밀-2-메톡시벤조니트릴: DMF (300 mL) 중 술포네이트 (37.0 g, 130 mmol), 시안화아연 (61.1 g, 521 mmol) 및 테트라키스 트리페닐포스핀 팔라듐 (0) (22.57 g, 19.53 mmol)의 혼합물을 110℃에서 8시간 동안 교반하였다. EtOAc를 반응 혼합물에 첨가하고, 유기 층을 물로 2회 세척하고, 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 이어서, 조 생성물을 칼럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 에틸아세테이트/헥산 3:7)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다:
단계 C: 2-메톡시-4-(옥시란-2-일)벤조니트릴: THF (40 mL) 중 NaH (0.16 g, 3.9 mmol)의 차가운 용액에 DMSO (20 mL) 중 트리메틸술포늄 아이오다이드 (0.91 g, 4.5 mmol)의 용액을 적가하였다. 생성된 혼합물을 N2 하에 0℃에서 20분 동안 교반하였다. THF (20 mL) 중 4-포르밀-2-메톡시벤조니트릴 (0.60 g, 3.72 mmol)의 용액을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 N2 하에 0℃에서 1시간 동안 교반한 다음, 이것을 서서히 실온으로 가온하고, 그 온도에서 12시간 동안 교반하였다. TLC (25% 에틸 아세테이트/헥산)에 의해 나타난 바와 같이 출발 물질이 소모되었다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 물을 적가하여 켄칭하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트 (2 x 70 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 물, 염수로 세척하고, 이어서 건조 (MgSO4)시키고, 여과하였다. 여과물을 진공 하에 농축시켰다. 잔기를 칼럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 10-30% EtOAc-헥산)에 의해 정제하여 2-메톡시-4-(옥시란-2-일)벤조니트릴을 수득하였다:
중간체 29A 및 29B
29A: tert-부틸 (3S,9aR)-3-(4-시아노-3-메톡시페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 및 29B: tert-부틸 (3R,9aR)-3-(4-시아노-3-메톡시페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트
단계 A: tert-부틸 (3R)-4-[2-(4-시아노-3-메톡시페닐)-2-히드록시에틸]-3 (히드록시메틸) 피페라진1-카르복실레이트: 파이렉스(Pyrex) 용기에 자기 교반 막대, 2-메톡시-4-(옥시란-2-일) 벤조니트릴 (2.0 g, 11.42 mmol), tert-부틸 (3R)-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (3.70g, 17.12 mmol) 및 EtOH 6 mL를 채웠다. 이어서, 이것을 마이크로웨이브 반응기에 도입하고, 150℃에서 3시간 동안 조사하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 용매를 증발시키고, 생성된 잔기를 칼럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 1- 20% 디클로로메탄/MeOH)에 의해 정제하여 생성물을 2개 부분입체이성질체 (1:1)의 혼합물로서 수득하였다
단계 B: tert-부틸 (9aR)-3-(4-시아노-3-메톡시페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: 벤젠 중 이전 단계의 이성질체 혼합물 (3.48 g, 8.89 mmol, 1:1)을 (트리부틸-λ5-포스파닐리덴) 아세토니트릴 (3.22 g, 13.3 mmol)로 처리하였다. 반응 혼합물을 바이오타지 장치에서 3시간 동안 135℃로 마이크로웨이브 처리하였다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 용매를 제거하여 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 크로마토그래피 (실리카 겔, 용리액으로서 헥산/EtOAc 9:1 → 3:7)하여 비시클릭 표제 화합물의 이성질체 혼합물을 수득하였다.
단계 C: tert-부틸(3S,9aR)-3-(4-시아노-3-메톡시페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 및 tert-부틸(3R,9aR)-3-(4-시아노-3-메톡시페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: 21 x 250 mm 키랄셀 OJ-H 칼럼을 사용하여, 유량 50 mL/분, 100 bar, MeOH 중 59 mg/mL, 35C, 220 nm, Thr = 200의 15% MeOH/CO2로 용리시키면서 이성질체 혼합물을 그의 거울상이성질체로 추가로 분리하였다:
중간체 30 및 31
30: tert-부틸 (3R,9aS)-3-(4-시아노-3-메톡시페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 및 31: tert-부틸 (3S,9aS)-3-(4-시아노-3-메톡시페닐)헥사히드로피라지노[2,1- c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트
단계 A: tert-부틸 (3S)-4-[2-(4-시아노-3-메톡시페닐)-2-히드록시에틸]-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트: 파이렉스 용기에 자기 교반 막대, 2-메톡시-4-(옥시란-2-일) 벤조니트릴 (0.350 g, 2.00 mmol), tert-부틸 (3S)-3-(히드록시메틸)피페라진-1-카르복실레이트 (0.457 g, 2.20 mmol) 및 EtOH 6 mL를 채웠다. 이어서, 이것을 마이크로웨이브 반응기에 도입하고, 150℃로 3시간 동안 조사하였다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 용매를 증발시키고, 생성된 잔기를 칼럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 1-20% 디클로로메탄/MeOH)에 의해 정제하여 표제 화합물을 2개 부분입체이성질체 (1:1)의 혼합물로서 수득하였다.
단계 B: tert-부틸 (9aS)-3-(4-시아노-3-메톡시페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트: 벤젠 중 이전 단계의 이성질체 혼합물 (0.55 g, 1.40 mmol, 1:1)을 (트리부틸-λ5-포스파닐리덴) 아세토니트릴 (0.678 g, 2.81 mmol)로 처리하였다. 반응 혼합물을 바이오타지 장치에서 3시간 동안 135℃로 마이크로웨이브 처리하였다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 용매를 제거하여 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 크로마토그래피 (실리카 겔, 용리액으로서 헥산/EtOAc 9:1 → 3:7)하여 비시클릭 표제 화합물의 이성질체 혼합물을 수득하였다
단계 C: 29C: 및 29D: 21 x 250 mm 키랄셀 OJ-H 칼럼을 사용하여, 유량 50 mL/분, 100 bar, MeOH 중 59 mg/mL, 35C, 220 nm, Thr = 200의 15% MeOH/CO2로 용리시키면서 tert-부틸 (9aS)-3-(4-시아노-3-메톡시페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트를 그의 거울상이성질체로 추가로 분리하였다:
중간체 32
2-플루오로-3-메틸-4-(옥시란-2-일)벤조니트릴
단계 A: 4-에테닐-2-플루오로-3-메틸벤조니트릴: EtOH 70 mL 및 TEA 30 mL 중 4-브로모-2-플루오로-3-메틸벤조니트릴 (7.00 g, 32.7 mmol), 포타슘 비닐트리플루오로보레이트 (5.3 g, 39 mmol) 및 Pd(dppf)Cl2 (0.5 g, 0.7 mmol)의 혼합물을 Ar 하에 4시간 동안 환류하였다. 이를 농축시키고, 잔기를 칼럼 크로마토그래피 (석유 에테르:EtOAc = 10:1)에 의해 정제하여 4-에테닐-2-플루오로-3-메틸벤조니트릴을 수득하였다.
단계 B: 2-플루오로-3-메틸-4-(옥시란-2-일)벤조니트릴: DCM 300 mL 중 4-에테닐-2-플루오로-3-메틸벤조니트릴 (4.60 g, 28.5 mmol) 및 mCPBA (85%, 12.3 g, 71.4 mmol)의 혼합물을 실온에서 120시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 포화 NaHCO3 (50 mL), 포화 Na2SO3 (50 mL), 5% NaOH (2X 50 mL) 및 염수 (50 mL)로 후속적으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔기를 칼럼 크로마토그래피 (석유 에테르:EtOAc = 20:1)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다:
중간체 33
2-플루오로-3-메톡시-4-(옥시란-2-일)벤조니트릴
단계 A: 2-플루오로-6-니트로페놀: 진한 HNO3 (95%, 44 g, 0.62 mol)을 DCM 1 L 중 2-플루오로페놀 (64.6 g, 0.58 mol)의 용액에 0-5℃에서 적가하였다. 혼합물을 0℃에서 1시간 교반한 후 여과하였다. 여과물을 물 및 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔기를 칼럼 크로마토그래피 (DCM:PE = 1:2)에 의해 정제하여 2-플루오로-6-니트로페놀을 수득하였다.
단계 B: 1-플루오로-2-메톡시-3-니트로벤젠: MeI (27.1 g, 191 mmol)를 DMF 200 mL 중 2-플루오로-6-니트로페놀 (25.0 g, 159 mmol) 및 K2CO3 (44.0 g, 318 mmol)의 현탁액에 적가하였다. 혼합물을 25℃에서 밤새 교반한 다음, 60℃로 가온하고, 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 EtOAc 1 L로 희석하고, 물 (3 X 100 mL) 및 염수 (100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다.
단계 C: 3-플루오로-2-메톡시아닐린: MeOH 500 mL 중 1-플루오로-2-메톡시-3-니트로벤젠 (25.0 g, 146 mmol) 및 Pd/C (10%, 7.5 g)의 혼합물을 55 psi의 H2 하에 실온에서 4시간 동안 교반한 후, 여과하였다. 여과물을 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다.
단계 D: 1-브로모-3-플루오로-2-메톡시벤젠: NaNO2 (물 40 mL 중 12.0 g, 173 mmol) 용액을 브로민화수소산 (47%) 200 mL 및 물 100 mL 중 3-플루오로-2-메톡시아닐린 (20.0 g, 158 mmol)의 혼합물에 -5 ~ 0℃에서 적가하고, 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 이 용액을 0℃에서 브로민화수소산 (47%) 50 mL 중 CuBr (45.2 g, 315 mmol)의 현탁액에 천천히 첨가하였다. 생성된 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반한 다음, 50℃로 가온하고, 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음 물에 붓고, 에테르 (2 X 500 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켜 1-브로모-3-플루오로-2-메톡시벤젠을 수득하였다.
단계 E: 4-브로모-2-플루오로-3-메톡시벤조산: n-BuLi (17.0 mL, 42.5 mmol)를 THF 70 mL 중 NH(i-Pr)2 (4.50 g, 44.5 mmol)의 용액에 -70℃에서 적가하였다. 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반한 다음, 다시 -70℃로 냉각시켰다. 1-브로모-3-플루오로-2-메톡시벤젠의 용액 (THF 30 mL 중 8.30 g, 40.5 mmol)을 적가하였다. 생성된 혼합물을 -70℃에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 새로운 드라이아이스에 붓고, 밤새 교반하였다. 혼합물을 에테르 1 L로 희석하고, 물로 2회 세척하였다. 합한 수층을 에테르로 세척한 다음, 염산으로 pH = 2까지 산성화시키고, EtOAc로 2회 추출하였다. 합한 EtOAc 층을 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켜 4-브로모-2-플루오로-3-메톡시벤조산을 수득하였다.
단계 F: 4-브로모-2-플루오로-3-메톡시벤조니트릴: 옥살릴 클로라이드 (20 mL)를 DMF 0.5 mL를 포함하는 DCM 100 mL 중 4-브로모-2-플루오로-3-메톡시벤조산 (8.30 g, 33.3 mmol)의 현탁액에 0℃에서 적가하였다. 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반하고, 투명한 용액을 감압 하에 농축 건조시켰다. 무수 아세토니트릴 60 mL 중에 용해된 잔기를 수성 NH3.H2O 600 mL에 0℃에서 첨가하고, 2시간 동안 교반한 다음, EtOAc로 2회 추출하였다. 합한 EtOAc 층을 물 및 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔기 (6.9 g)를 DMF 60 mL 중에 용해시키고, 얼음/수조를 사용하여 0℃로 냉각시켰다. 시아누르산 클로라이드 (7.70 g, 41.7 mmol)를 첨가하고, 2시간 동안 0℃에서 교반한 후, 얼음/물에 부었다. 고체를 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하고, DCM 중에 용해시키고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켜 4-브로모-2-플루오로-3-메톡시벤조니트릴을 수득하였다.
단계 G: 2-플루오로-3-메톡시-4-비닐벤조니트릴: EtOH 60 mL 및 TEA 60 mL 중 4-브로모-2-플루오로-3-메톡시벤조니트릴 (6.0 g, 26 mmol), 포타슘 비닐트리플루오로보레이트 (4.20 g, 31.3 mmol) 및 Pd(dppf)Cl2 (0.8 g)의 혼합물을 Ar 하에 4시간 동안 환류하였다. 생성된 혼합물을 농축시키고, 잔기를 칼럼 크로마토그래피 (PE:EtOAc = 20:1)에 의해 정제하여 2-플루오로-3-메톡시-4-비닐벤조니트릴을 수득하였다.
단계 H: 2-플루오로-3-메톡시-4-(옥시란-2-일)벤조니트릴: mCPBA (85%, 9.9 g, 48.9 mmol)를 0℃에서 DCM 160 mL 중 2-플루오로-3-메톡시-4-비닐벤조니트릴 (3.4 g, 19.2 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 60시간 동안 교반한 다음, DCM 300 mL로 희석하고, 0℃로 냉각시켰다. 혼합물을 포화 NaHCO3 (50 mL), 수성 Na2SO3 (2 X 50 mL), 5% NaOH (50 mL) 및 염수로 후속적으로 세척하였다. 유기 층을 농축시키고, 잔기를 칼럼 크로마토그래피 (PE:EtOAc = 5:1)에 의해 정제하여 2-플루오로-3-메톡시-4-(옥시란-2-일)벤조니트릴을 수득하였다:
중간체 34
4-시클로프로필-5-옥시란-2-일-2-벤조푸란-1(3H)-온
단계 A: 5-브로모-4-아이오도-2-벤조푸란-1(3H)-온: 트리플루오로메탄술폰산 (400 mL) 중 5-브로모-2-벤조푸란-1(3H)-온 (50 g, 0.235 mol)의 냉각된 (0℃) 용액에 N-아이오도숙신이미드 (55.5 g, 0.247 mol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 천천히 얼음물 (2 L)에 붓고, 여과하고, 여과물을 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기 층을 물 및 염수로 세척하고, 건조시키고, 농축시켜 5-브로모-4-아이오도-2-벤조푸란-1(3H)-온을 수득하였다.
단계 B: 5-브로모-4-비닐-2-벤조푸란-1(3H)-온: TEA 20 mL 및 EtOH 20 mL 중 5-브로모-4-아이오도-2-벤조푸란-1(3H)-온 (1 g, 2.95 mmol), 포타슘 비닐트리플루오로보레이트 (474 mg, 3.54 mmol) 및 Pd(dppf)Cl2 (200 mg)의 혼합물을 N2 하에 환류 하에 2시간 동안 가열하였다. 대부분의 용매를 제거하고, 잔기를 EtOAc (100 mL) 중에 용해시켰다. 용액을 0.1 N HCl, 중탄산나트륨 및 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다.
단계 C: 5-브로모-4-시클로프로필-2-벤조푸란-1(3H)-온: EtOAc (50 mL) 중 5-브로모-4-비닐-2-벤조푸란-1(3H)-온 (2.2 g, 9.21 mol) 및 Pd(OAc)2 (100 mg)의 냉각된 (0℃) 혼합물에 에테르 (100 mL) 중 CH2N2의 용액을 천천히 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 이어서 아세트산으로 켄칭하고, 여과하고, 여과물을 물 및 염수로 세척하고, 건조시키고, 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다.
단계 D: 4-시클로프로필-5-비닐-2-벤조푸란-1(3H)-온: TEA 20 mL 및 EtOH 20 mL 중 5-브로모-4-시클로프로필-2-벤조푸란-1(3H)-온 (760 mg, 3.004 mmol), 포타슘 비닐트리플루오로보레이트 (805 mg, 6.008 mmol) 및 Pd(dppf)Cl2 (100 mg)의 혼합물을 N2 하에 8시간 동안 가열하여 환류시켰다. TLC가 완전한 반응을 나타내면, 대부분의 용매를 제거하고, 잔기를 EtOAc (100 mL) 중에 용해시켰다. 용액을 0.1 N HCl, 중탄산나트륨 및 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성된 오일을 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 4-시클로프로필-5-비닐-2-벤조푸란-1(3H)-온을 수득하였다.
단계 E: 4-시클로프로필-5-옥시란-2-일-2-벤조푸란-1(3H)-온: DCM 50 mL 중 4-시클로프로필-5-비닐-2-벤조푸란-1(3H)-온 (440 mg, 2.2 mmol)의 용액에 0℃에서 DCM 50 mL 중 mCPBA (1.14 g, 6.6 mmol)를 천천히 첨가하였다. 실온으로 가온한 후, 혼합물을 12시간 동안 교반하였다. 혼합물을 아이오딘화칼륨 (KI) 지시약 종이의 색상이 변하지 않을 때까지 수성 Na2SO3로 세척하였다. 유기 층을 합하고, 염수로 세척한 다음, 농축시켰다. 잔기를 정제용-TLC에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다:
중간체 35
4-에틸-5-옥시란-2-일-2-벤조푸란-1(3H)-온
단계 A: 5-브로모-4-에틸-2-벤조푸란-1(3H)-온: MeOH 50 mL 중 5-브로모-4-비닐-2-벤조푸란-1(3H)-온 (2.0 g, 8.37 mmol) 및 Pd/C (400 mg)의 혼합물을 H2 (1 atm) 하에 실온에서 밤새 교반한 다음, 여과하였다. 여과물을 농축시켰다. 생성된 물질을 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 5-브로모-4-에틸-2-벤조푸란-1(3H)-온을 수득하였다.
단계 B: 4-에틸-5-비닐-2-벤조푸란-1(3H)-온: TEA 20 mL 및 EtOH 20 mL 중 5-브로모-4-에틸-2-벤조푸란-1(3H)-온 (1.81 g, 7.51 mmol), 포타슘 비닐트리플루오로보레이트 (1.21 g, 9.01 mmol) 및 Pd(dppf)Cl2 (200 mg)의 혼합물을 N2 하에 밤새 가열하여 환류시킨 다음, 농축시켰다. 생성된 물질을 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 4-에틸-5-비닐-2-벤조푸란-1(3H)-온을 수득하였다.
단계 C: 4-에틸-5-옥시란-2-일-2-벤조푸란-1(3H)-온: DCM 50 mL 중 4-에틸-5-비닐-2-벤조푸란-1(3H)-온 (1.1 g, 5.85 mmol)의 용액을 DCM 50 mL 중 mCPBA (3.60 g, 85% 순도, 17.6 mmol)에 0℃에서 천천히 첨가하였다. 실온으로 가온하고, 혼합물을 3일 동안 교반하였다. 혼합물을 KI 종이의 색상이 변하지 않을 때까지 수성 Na2SO3로 세척하였다. 유기 층을 합하고, 염수로 세척하고, 농축시켰다. 잔기를 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다:
하기 표 1에 기재된 Boc-피페라진 중간체를 명시된 에폭시드 (상기 기재된 바와 같이 제조함) 및 (S)-4-N-BOC-2-히드록시메틸피페라진 또는 (R)-4-N-BOC-2-히드록시메틸피페라진으로부터 tert-부틸 (3S,9aR)-3-(4-시아노-3-메톡시페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 제조하였다.
표 1
중간체 40A
6-플루오로-2-메틸-3-[(3S,9aS)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴 2,2,2-트리플루오로아세테이트: tert-부틸 (3S,9aS)-3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 (1.88g, 5.01 mmol)를 10 mL TFA로 실온에서 1시간 동안 처리하였다. 이어서, TFA를 감압 하에 제거하여 표제 화합물을 수득하였다.
중간체 40B
6-플루오로-2-메틸-3-[(3R,9aS)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴 2,2,2-트리플루오로아세테이트: tert-부틸 (3R,9aS)-3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 (1.73 g, 4.61 mmol)를 10 mL TFA로 실온에서 1시간 동안 처리하였다. 이어서, 트리플루오로아세트산을 감압 하에 제거하여 표제 화합물을 수득하였다.
중간체 40C-1 (방법 1)
6-플루오로-2-메틸-3-[(3S,9aR)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴: tert-부틸(3S,9aR)-3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 (I-17C) (3.00 g, 7.99 mmol)를 TFA (10 mL) 중에 용해시키고, 1시간 동안 교반하였다. 트리플루오로아세트산을 감압 하에 제거하고, 디클로로에탄 (3X)과 공비혼합한 다음, 고진공 상에서 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다:
중간체 40C-2 (방법 2)
6-플루오로-2-메틸-3-[(3S,9aR)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴 히드로클로라이드: tert-부틸(3S,9aR)-3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 (I-17C) (158.8 g, 423.0 mmol)를 2-프로판올 318 mL로 현탁시켰다. 생성된 슬러리를 2-프로판올 (5.5 M, 1000 mL, 5499 mmol) 중 HCl 용액으로 처리하고, 혼합물을 50℃로 2시간 동안 가열하였다. 혼합물을 농축시켜 대략 400 mL의 2-프로판올을 제거하고, 이어서 실온으로 냉각시키고, 밤새 교반하였다. 혼합물을 여과하여 고체 생성물을 수집하였고, 습윤 케이크를 2-프로판올 50 mL로 세척하였다. 필터 케이크를 진공 하에 2일 동안 40℃에서 질소 방출로 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다.
중간체 40D
6-플루오로-2-메틸-3-[(3R,9aR)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴 2,2,2-트리플루오로아세테이트: (3R,9aR)-tert-부틸 3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 (1.09 g, 2.90 mmol)를 트리플루오로아세트산 (10 mL) 중에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 농축시키고, 디클로로에탄 (3X)과 공비혼합하여 표제 화합물을 수득하였다.
중간체 41B
2-메톡시-4-[(3R, 9aR)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1, 4]옥사진-3-일]벤조니트릴 히드로클로라이드
tert-부틸 (3R,9aR)-3-(4-시아노-3-메톡시페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 (120 mg, 0.321 mmol)를 디옥산 중 4 M HCl 10 mL 중에 용해시키고, 실온에서 8시간 동안 교반하였다. 혼합물을 원래 부피의 ¼까지 농축시키고, 디에틸 에테르 10 mL로 희석하였다. 침전물을 여과하고, 고진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다:
중간체 41D
2-메톡시-4-[(3S,9aS)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴 히드로클로라이드
tert-부틸 (3S,9aS)-3-(4-시아노-3-메톡시페닐)헥사히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-8(1H)-카르복실레이트 (38.0 mg, 0.102 mmol)를 디옥산 중 4 M HCl 10 mL 중에 용해시키고, 실온에서 8시간 동안 교반하였다. 혼합물을 원래 부피의 ¼까지 농축시키고, 디에틸 에테르 5 mL로 희석하였다. 침전물을 여과하고, 고진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다:
하기 표 2에 나타낸 중간체를 중간체 40A: 6-플루오로-2-메틸-3-[(3S,9aS)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴 2,2,2-트리플루오로아세테이트 및 41D: 2-메톡시-4-[(3S,9aS)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴 히드로클로라이드의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로, HCl 또는 TFA를 사용하여 상응하는 Boc-피페라진 전구체에 존재하는 Boc 보호기를 제거하여 제조하였다 (반응에서 사용한 산 및 질량 스펙트럼 데이터는 하기 표 2의 각각의 구조에 제공함). 생성된 중간체는 TFA 또는 HCl 염일 수 있거나, 또는 이들은 유기 용매 및 염기성 수용액, 예컨대 포화 중탄산나트륨 용액에 의한 생성물의 통상적 분할 및 생성된 유기 용액의 농축에 의해 유리 염기 아민으로서 수득할 수 있는 것으로 이해된다.
표 2
중간체 61
6-메톡시-2-메틸-3-[(3S,9aR)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴
마이크로웨이브 바이알에 6-플루오로-2-메틸-3-[(3S,9aR)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴 트리플루오로아세테이트 (110 mg, 0.290 mmol), 탄산나트륨 (30 mg, 0.290 mmol), 및 메탄올 (2 mL)을 채웠다. 혼합물을 마이크로웨이브 장치에서 2시간 동안 150℃로 가열하고, 이어서 주위 온도로 냉각시키고, 여과하고 농축시켜 표제 화합물을 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.
중간체 62
2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-카르복실산
단계 A: 6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-올: 아세톤 (250 mL) 중 6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘 (5.0 g, 42 mmol) 및 MgSO4 (10 g, 84 mmol)의 용액에 60℃에서 물 (500 mL) 중 KMnO4 (13 g, 84 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 30분 동안 교반되도록 하였다. IPA를 천천히 첨가하여 과량의 KMnO4를 켄칭하였다. 반응물을 셀라이트의 패드를 통해 여과하였다. 여과물을 감압 하에 농축시키고, 고진공 펌프 상에서 펌핑하여 물의 완전한 제거를 확실히 하였다. 잔기를 에탄올 (200 mL) 중에 용해시키고 빙조로 냉각시켰다. 이 용액에 NaBH4 (3.2 g, 84 mmol)를 천천히 첨가하였다. TLC가 완전한 환원을 나타내면, 물을 첨가하여 과량의 NaBH4를 켄칭하였다. 에탄올을 회전증발기 상에서 제거하였다. 조 물질을 EtOAc 중에 용해시키고, 수성 NaHCO3로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, MPLC (MeOH - DCM: 0-7%)에 의해 정제하였다. 표제 화합물을 수집하였다.
단계 B: 6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-카르보니트릴: CHCl3 (30 mL) 중 6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-올 (2.7 g, 20 mmol)의 용액에 티오닐 클로라이드 (4.4 mL, 60 mmol)를 0℃에서 천천히 적가하였다. 첨가를 행할 때, 혼합물이 0℃에서 추가 3시간 동안 교반되도록 하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 잔기를 고진공 하에 추가 15분 동안 펌핑하였다. 조 물질을 CHCl3 (300 mL) 중에 용해시키고, pH = 7 완충제 (200 mL)로 세척하였다. 완충제를 IPA-CHCl3 (1:3, 100 mL)로 1회 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 플라스크에 테트라부틸암모늄 시아나이드 (6.4 g, 24 mmol) 및 아세토니트릴 (40 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 50℃로 16시간 동안 가열하였다. 회전 증발기 상에서 아세토니트릴을 제거한 후, 잔기를 물 중에 용해시키고, IPA-CHCl3 (1:3, 각각 100 mL)로 3회 추출하였다. 추출물을 합하고, MPLC (DCM - MeOH)에 의해 정제하였다. 표제 화합물을 용매의 제거 후에 수집하였다.
단계 C: 메틸 6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-카르복실레이트 1-옥시드: 6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-카르보니트릴 (2.6 g, 18 mmol)이 채워지고 교반 막대가 구비된 플라스크에 진한 HCl (5 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 70℃로 15분 동안 가열하였다. 휘발성 물질을 감압 하에 제거하고, 잔기를 고진공 하에 15분 동안 펌핑하였다. 플라스크에 MeOH (20 mL) 및 톨루엔 (40 mL)을 첨가하였다. 용액을 빙조로 0℃로 냉각시키고, 이어서 TMS-디아조메탄 (36 mL, 72 mmol)을 첨가하였다. LC가 완전한 반응을 나타내면, HOAc로 과량의 TMS-디아조메탄을 분해시키고, 조 생성물을 MPLC에 의해 정제하였다.
수득한 부가물을 CHCl3 (50 mL) 중에 용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. 용액에 mCPBA (3.1 g, 18 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 3시간 동안 교반되도록 하였다. 티오황산나트륨 용액을 첨가하여 과량의 mCPBA를 소모시키고, 조 생성물을 IPA-CHCl3 (1:3, 100 mL)로 3회 추출하였다. 추출물을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 실리카 겔 상에 흡착시키고, MPLC (DCM:MeOH, 10% 수성 NH4OH 포함)에 의해 정제하였다. 용매를 제거한 후, 메틸 6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-카르복실레이트 1-옥시드를 수집하였다:
단계 D: 메틸 2-아미노-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-카르복실레이트: CF3-톨루엔 (20 mL) 및 CHCl3 (20 mL) 중 메틸 6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-카르복실레이트 1-옥시드 (700 mg, 3.6 mmol)의 용액에 tert-부틸아민 (3.8 mL, 36 mmol)을 첨가하였다. 용액을 빙조에서 0℃로 냉각시켰다. 용액에 p-톨루엔술폰산 무수물 (3.5 g, 10.9 mmol)을 모든 SM이 LC-MS에 따라 소모될 때까지 소량씩 첨가하였다. 휘발성 물질을 감압 하에 제거하고, 잔기를 TFA (20 mL) 중에 재용해시켰다. 용액을 70℃로 2시간 동안 가열하였다. 이 시점에 반응을 중지시켰다. TFA를 회전증발기 상에서 제거하고, 잔기를 포화 탄산나트륨에 녹이고, IPA-CHCl3 (1:3, 각각 50 mL)로 3회 추출하였다. 추출물을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 실리카 겔 상에 흡착시키고, MPLC (DCM:MeOH, 10% 수성 NH4OH 포함)에 의해 정제하였다. 용매를 제거한 후, 표제 화합물을 수집하였다:
단계 E: 메틸 2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-카르복실레이트
메틸 2-아미노-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-카르복실레이트 (500 mg, 2.6 mmol)가 채워지고 교반 막대가 구비된 플라스크에 아지드화나트륨 (340 mg, 5.2 mmol), 트리에틸 오르토포르메이트 (2.2 mL, 13 mmol), 및 HOAc (10 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 100℃로 2시간 동안 가열하였다. 용매를 회전증발기 상에서 제거하고, 잔기를 수성 탄산나트륨 중에 녹이고, EtOAc (50 mL X 3)로 추출하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, MPLC (DCM-MeOH)에 의해 정제하였다. 용매를 제거한 후, 표제 화합물을 수집하였다.
단계 F: 2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-카르복실산
THF (6 mL) 중 메틸 2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-카르복실레이트 (460 mg, 1.9 mmol)의 용액에 수산화리튬 (1.0 N 수성 3.8 mL, 3.8 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 물 (10 mL)로 희석하였다. 1N HCl로 pH를 조심스럽게 약 5로 조정하였다. 이어서, 용액을 EtOAc (30 mL X 3)로 추출하였다. 추출물을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다:
중간체 63
2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-6-카르복실산
단계 A: 메틸 3-옥소시클로펜탄카르복실레이트: 3-옥소시클로펜탄카르복실산 (342 mg, 2.67 mmol) 및 촉매 앰버리스트-15 (30 mg, 2.67 mmol)를 밀봉된 튜브에서 합하고, 100℃로 밤새 가열하였다. 반응물을 여과하고, 메탄올으로 잘 세척하였다. 여과물을 진공 하에 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다.
단계 B: 메틸 2-[(디메틸아미노)메틸리덴]-3-옥소시클로펜탄카르복실레이트 및 메틸 3-[(디메틸아미노)메틸리덴]-4-옥소시클로펜탄카르복실레이트: 메틸 3-옥소시클로펜탄카르복실레이트 (364 mg, 2.56 mmol) 및 1-tert-부톡시-N,N,N',N'-테트라메틸메탄디아민 (447 mg, 2.56 mmol)을 합하고, 110℃에서 1.5시간 동안 가열하였다. 반응물을 이스코 콤비플래쉬 (12 g 실리카 겔, 30 mL/분, 254 nM, 0%에서 100% (디클로로메탄 중 10% 메탄올) / 디클로로메탄)에 의해 정제하였다. 표제 화합물을 53% (디클로로메탄 중 10% 메탄올) / 디클로로메탄에서 2개 위치이성질체의 혼합물로서 용리시켰다. 혼합물을 정제용 SFC에 의해 IA 칼럼 (30 x 250 mm) 상 40% 메탄올/이산화탄소, 70 mL/분, 35℃, 220 nM, 메탄올 중 140 mg/mL로 분리하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 C: 메틸 2-아미노-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-6-카르복실레이트: 무수 메탄올 (2.5 mL) 중 메틸 3-[(디메틸아미노)메틸리덴]-4-옥소시클로펜탄카르복실레이트 (71.7 mg, 0.36 mmol)의 용액에 구아니딘 히드로클로라이드 (124.7 mg, 1.3 mmol)에 이어서 메탄올 중 소듐 메톡시드 (0.24 mL, 1.27 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 밀봉된 튜브에서 90℃로 밤새 가열하였다. 조 반응물을 2 N HCl로 켄칭하고, 진공 하에 농축시켰다. 수성 잔기를 HPLC (30X100 mm 워터스 선파이어 칼럼; 5 마이크로미터; 35 mL/분; 210 nM; 15분에 걸쳐 0%에서 40% CH3CN + 0.05% TFA / 물 + 0.05% TFA; 화합물은 10% CH3CN + 0.05% TFA / 물 + 0.05% TFA에서 용리됨)에 의해 정제하여 표제 화합물을 동결건조 후에 수득하였다.
단계 D: 메틸 2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-6-카르복실레이트
에틸 아세테이트 (5 mL) 중 메틸 2-아미노-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-6-카르복실레이트 (65.2 mg, 0.364 mmol)의 혼합물에 실온에서 트리메틸실릴 트리플루오로아세테이트 (0.107 mL, 0.619 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 교반한 다음, 트리에틸 오르토포르메이트 (0.103 mL, 0.619 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 추가로 5분 동안 교반한 다음, 아지도트리메틸실란 (0.081 mL, 0.619 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하고, 이어서 진공 하에 농축시키고, 잔기를 디클로로메탄으로 2회 연화처리하였다. 생성된 고체를 원심분리에 의해 수집하고, 진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다:
단계 E: 2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-6-카르복실산
표제 화합물을 2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-카르복실산의 합성에 대해 단계 F에 기재된 것과 유사한 방식으로 메틸 2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-6-카르복실레이트로부터 제조하였다.
중간체 64
2-(1H-테트라졸-1-일)-5,6,7,8-테트라히드로퀴놀린-5-카르복실산
단계 A: 메틸 5,6,7,8-테트라히드로퀴놀린-5-카르복실레이트: 메틸 퀴놀린-5-카르복실레이트 (3.67g, 19.61 mmol)를 TFA (60 mL) 중에 용해시키고, 산화백금 (0.49g, 2.16mmol)을 첨가한 다음, 실온에서 밤새 수소화시켰다. 촉매를 여과하고, 여과물을 증발 건조시켰다. 잔기를 120g 이스코 레디-셉 칼럼을 통해 크로마토그래피하고 DCM 중 (MeOH 중 10% NH4OH) 5%로 용리시켜 메틸 5,6,7,8-테트라히드로퀴놀린-5-카르복실레이트를 수득하였다:
단계 B: 메틸 5,6,7,8-테트라히드로퀴놀린-5-카르복실레이트-1-옥시드: 5,6,7,8-테트라히드로퀴놀린-5-카르복실레이트 (2.05g, 10.72 mmol)를 클로로포름 (100ml) 중에 용해시키고, m-클로로퍼벤조산 (2.77g, 16.08 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 11/2시간 동안 교반하였다. 반응물을 NaHCO3 2x, 염수 1x로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 이어서 여과하고 증발 건조시켰다. 잔기를 120g 이스코 레디-셉 칼럼을 통해 크로마토그래피하고 100% 에틸 아세테이트에서 10% MeOH/90% EtOAc의 구배 용매계로 용리시켜 표제 화합물을 수득하였다:
단계 C: 메틸 2-아미노-5,6,7,8-테트라히드로퀴놀린-5-카르복실레이트: 메틸 5,6,7,8-테트라히드로퀴놀린-5-카르복실레이트-1-옥시드 (2.05 g, 9.89 mmol) 및 t-부틸 아민 (5.22 mL, 49.5 mmol)을 벤조트리플루오라이드 (50ml) 중에 용해시키고 빙조로 냉각시켰다. 반응물의 내부 온도를 5℃ 미만으로 유지하면서 p-톨루엔술폰산 무수물 (6.46 g, 19.79 mmol)을 조금씩 첨가하였다. 반응을 모니터링하였고, 10분 후 LC-MS가 1.20에서 M+1 = 263 및 207 (M-56)을 나타내었을 때, 이는 중간체 메틸 2-(tert-부틸아미노)-5,6,7,8-테트라히드로퀴놀린-5-카르복실레이트의 형성을 가리켰다. 이어서, TFA (10 mL)를 반응 혼합물에 첨가하고, 70℃에서 5시간 동안 가열하였다. 반응물을 냉각시키고, 증발 건조시켰다. 잔기를 물로 녹이고, pH를 5N NaOH를 사용하여 ~8로 조정하였다. 반응물을 DCM으로 2회 추출하였다. 합한 DCM 층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켰다. 잔기를 80g 이스코 레디-셉 칼럼을 통해 크로마토그래피하고 5% (MeOH 중 10% NH4OH)/DCM의 용매계로 용리시켜 표제 화합물을 수득하였다:
단계 D: 메틸 2-(1H-테트라졸-1-일)-5,6,7,8-테트라히드로퀴놀린-5-카르복실레이트: 메틸 2-아미노-5,6,7,8-테트라히드로퀴놀린-5-카르복실레이트 (850 mg, 4.12mmol)를 아세트산 (15 mL) 및 트리-에틸 오르토포르메이트 (1.373 mL, 8.24 mmol)에 이어서 아지드화나트륨 (482 mg, 7.42 mmol) 중에서 교반한 다음 80℃로 3시간 동안 가열하였다. 반응물을 냉각시키고, 증발 건조시켰다. 혼합물을 DCM에 녹이고, 포화 NaHCO3 용액에 이어서 염수로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켰다. 잔기를 40g 이스코 레디-셉 칼럼을 통해 크로마토그래피하고 에틸 아세테이트:헥산 (2:3)으로 용리시켜 메틸 2-(1H-테트라졸-1-일)-5,6,7,8-테트라히드로퀴놀린-5-카르복실레이트를 수득하였다.
단계 E: 2-(1H-테트라졸-1-일)-5,6,7,8-테트라히드로퀴놀린-5-카르복실산: 메틸 2-(1H-테트라졸-1-일)-5,6,7,8-테트라히드로퀴놀린-5-카르복실레이트 (1.04 g, 4.01 mmol) 및 수산화리튬 (0.202 g, 4.81 mmol)을 테트라히드로푸란 (10mL)/물 (10.00 mL)의 혼합물 중에서 75분 동안 교반하였다. TLC가 일부 20% 출발 물질을 나타내면, LiOH (50mg, 1.19mmol)를 더 첨가하고, 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 2N HCl (3 mL, 6 mmol)을 사용하여 pH 4-5로 조정한 다음, 에틸 아세테이트 2x로 추출하였다. 에틸 아세테이트 층을 합하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다:
중간체 65
3-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[c]피리딘-7-카르복실산
단계 A: N-(5-브로모-4-메틸피리딘-2-일)-2,2-디메틸프로판아미드: 피리딘 80 mL 중 5-브로모-4-메틸피리딘-2-아민 (20.6 g, 110 mmol)의 용액에 트리메틸아세틸 클로라이드 (19.9g, 165 mmol)를 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반되도록 하였다. 혼합물을 물로 희석하고, 디클로로메탄 (3x)으로 추출하였다. 유기 층을 물 (2x), 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시킨 다음, 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 2->20% EtOAc / 헥산으로 용리시켜 표제 화합물을 수득하였다:
단계 B: N-[5-브로모-4-(2-히드록시에틸)피리딘-2-일]-2,2-디메틸프로판아미드: THF (80 mL) 중 N-(5-브로모-4-메틸피리딘-2-일)-2,2-디메틸프로판아미드 (30.0 g, 111 mmol)의 용액을 빙조에서 냉각시키고, 헵탄/THF/에틸벤젠 중 리튬 디이소프로필아민의 용액 (2.0 M, 138 mL)으로 적가 처리하였다. 1시간 교반한 후, 용액을 파라포름알데히드 (24.9 g, 277 mmol)로 처리하고 12시간 동안 교반하면서 서서히 실온으로 가온되도록 하였다. 혼합물을 포화 중탄산나트륨 용액으로 희석하고, 에틸 아세테이트 (3x)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 여과하고, 농축시켰다. MPLC (용리액 6-50% 에틸 아세테이트 / 헥산)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다:
단계 C: tert-부틸{6-[(2,2-디메틸프로파노일)아미노]-4-(2-히드록시에틸)피리딘-3-일}아세테이트
250 mL 둥근 바닥 플라스크에 N-[5-브로모-4-(2-히드록시에틸) 피리딘-2-일]-2,2-디메틸프로판아미드 (1.9 g, 6.31 mmol), 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0) (0.173 g, 0.189 mmol), 및 2-(디시클로헥실포스피노)-2',4',6'-트리이소프로필비페닐 (0.180 g, 0.379)을 채우고, 혼합물을 질소로 30분 동안 플러싱하고, 테트라히드로푸란을 첨가하고, 이어서 디에틸 에테르 중 2-tert-부톡시-2-옥소에틸아연 클로라이드의 용액 (0.5 M, 47.9 mL)을 첨가하고, 혼합물을 45℃로 유지시킨 오일조에 넣었다. 12시간 후, 반응물에 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0) (0.173 g, 0.189 mmol) 및 2-(디시클로헥실포스피노)-2',4',6'-트리이소프로필비페닐 (0.180 g, 0.379)을 다시 채우고, 추가량의 디에틸 에테르 중 2-tert-부톡시-2- 옥소에틸아연 클로라이드 (0.5 M, 12.6 mL)를 첨가하였다. 45℃ 조에서 추가 2시간 교반 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 및 10% 수산화암모늄 용액으로 희석하고, 여과하여 고체를 제거하고, 층을 분리하였다. 유기 층을 물 및 염수로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 여과하고, 농축시켰다. MPLC (용리액 9-90% 에틸 아세테이트 / 헥산)에 의해 정제하여 tert-부틸{6-[(2,2-디메틸프로파노일)아미노]-4-(2-히드록시에틸)피리딘-3-일}아세테이트를 수득하였다:
단계 D: tert-부틸{4-(2-브로모에틸)-6-[(2,2-디메틸프로파노일)아미노]피리딘-3-일}아세테이트
디클로로메탄 (50 mL) 중 tert-부틸{6-[(2,2-디메틸프로파노일)아미노]-4-(2-히드록시에틸)피리딘-3-일}아세테이트 (2.30 g, 6.84 mmol)와 이미다졸 (0.558 g, 8.20 mmol)의 혼합물을 트리페닐포스핀 (1.79 g, 6.84 mmol) 및 사브로민화탄소 (2.72 g, 8.20 mmol)로 처리하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반되도록 한 다음, 물로 희석하고, 층을 분리하였다. 유기 층을 5% 염산, 포화 중탄산나트륨 용액, 및 염수로 연속적으로 세척하고, 이어서 건조 (Na2SO4)시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔기를 짧은 실리카 플러그 (20% EtOAc:헥산 용리액)를 통해 여과하여 표제 화합물을 수득하였고, 이를 후속 단계에 바로 사용하였다:
단계 E: tert-부틸 3-[(2,2-디메틸프로파노일)아미노]-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[c]피리딘-7-카르복실레이트: 테트라히드로푸란 (50 mL) 중 tert-부틸 {4-(2-브로모에틸)-6-[(2,2-디메틸프로파노일)아미노]피리딘-3-일}아세테이트 (6.5 g, 16.3 mmol)의 용액을 드라이아이스-아세톤조에서 냉각시키고, 테트라히드로푸란 중 리튬 디이소프로필아미드의 용액 (50 mL) (디이소프로필아민 (3.79 g, 34.7 mmol) 및 n-부틸리튬 (2.5 M, 13.7 mL)으로부터 제조함)으로 첨가 깔때기를 통해 1시간 동안 적가 처리하였다. 첨가가 완료된 후, 반응물을 추가로 1시간 동안 교반하고, 이어서 포화 중탄산나트륨 용액으로 켄칭하고, 실온으로 가온되도록 하였다. 생성된 혼합물을 에틸 아세테이트 및 물로 희석하고, 분리 깔때기로 옮겼다. 층을 분리하고, 수층을 에틸 아세테이트 (2x)로 추출하였다. 합한 유기부를 염수로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성된 잔류물을 정제하여 (2->25% EtOAc / 헥산 용리액) 표제 화합물을 수득하였다.
단계 F: 3-아미노-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[c]피리딘-7-카르복실산: 6N 염산 (25 mL) 중 3-[(2,2-디메틸프로파노일)아미노]-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[c]피리딘-7-카르복실레이트 (0.624 mg, 1.96 mmol)의 용액을 환류 하에 24시간 동안 가열하였다. 용액을 냉각시키고, 농축시켜 표제 화합물을 수득하였으며, 이를 후속 단계에 추가의 정제 없이 사용하였다:
단계 G: 메틸 3-아미노-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[c]피리딘-7-카르복실레이트: 메탄올 중 단계 F로부터의 3-아미노-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[c]피리딘-7-카르복실산의 용액 (10 mL)을 디에틸 에테르 중 트리메틸실릴 디아조메탄의 용액 (2.0 M, 1.96 mL)으로 0℃에서 적가 처리하였다. 첨가가 완료된 후, 반응물을 실온으로 가온하고, 30분 동안 교반한 다음, 농축시켰다. 생성된 잔류물을 고진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다.
단계 H: 메틸 3-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[c]피리딘-7-카르복실레이트
아세트산 (8 mL) 중 메틸 3-아미노-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[c]피리딘-7-카르복실레이트 (365 mg, 1.90 mmol), 트리에틸 오르토포르메이트 (451 mg, 3.04 mmol), 및 아지드화나트륨 (185 mg, 2.85 mmol)의 혼합물을 80℃로 가열된 오일조 내에 3시간 동안 유지하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 혼합물을 물 및 에틸 아세테이트로 희석하고, 층을 분리하였다. 수층을 에틸 아세테이트 (2x)로 추출하고, 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성된 잔류물을 정제하여 (8->80% EtOAc / 헥산 용리액) 표제 화합물을 수득하였다.
단계 I: 3-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[c]피리딘-7-카르복실산: 실온에서 테트라히드로푸란 (5 mL) 및 물 (1.5 mL) 중 3-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[c]피리딘-7-카르복실레이트 (235 mg, 0.958 mmol)의 용액을 수산화리튬 용액 (1 M, 1.44 mL)으로 처리하였다. 30분 후, 용액을 농축시켜 테트라히드로푸란을 제거하고, 나머지 수성 층을 1 N 염산 용액으로 (pH ~4까지) 산성화시키고, 에틸 아세테이트 (3x)로 추출하였다. 합한 유기부를 염수로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 여과하고, 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다:
중간체 66
리튬 3-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-7-카르복실레이트
단계 A: 부트-3-인-1-일 메탄술포네이트: DCM 600 mL 중 부트-3-인-1-올 (45.0 g, 0.64 mol) 및 메탄술포닐 클로라이드 (81.0 g, 0.71 mol)의 용액을 TEA (78.0 g, 0.77 mol)에 0℃에서 적가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 농축 건조시켰다. 잔기를 EtOAc 1 L 중에 용해시키고, 이어서 1N HCl (2 x 200 mL), 염수 (200 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켜 부트-3-인-1-일 메탄술포네이트를 수득하였다.
단계 B: 4-아이오도부트-1-인: 아세톤 450 mL 중 부트-3-인-1-일 메탄술포네이트 (90.0 g, 0.608 mol) 및 NaI (137 g, 0.912 mol)의 현탁액을 N2 하에 4시간 동안 환류한 다음 냉각시켰다. 이 반응 혼합물에 에테르 450 mL를 첨가하고, 여과하였다. 고체를 또 다른 에테르 300 mL로 세척하고, 여과물을 증류시켰다. 70℃/20 mmHg의 분획을 수집하였다.
단계 C: tert-부틸 에틸 부트-3-인-1-일프로판디오에이트: DMF 200 mL 중 NaH (60%, 8.50 g, 213 mmol)의 현탁액을 tert-부틸 에틸 말로네이트 (36.3 g, 193 mmol)에 25℃에서 적가하였다. 혼합물을 1시간 동안 교반하고, 4-아이오도부트-1-인 (38.2 g, 212.2 g)을 적가하였다. 생성된 현탁액을 밤새 교반하고, 에테르 1 L로 희석하고, 물 (3 x 200 mL), 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켜 tert-부틸 에틸 부트-3-인-1-일프로판디오에이트를 수득하였으며, 이를 직접 후속 단계에 사용하였다.
단계 D: tert-부틸 에틸 부트-3-인-1-일(5-니트로피리미딘-2-일)프로판디오에이트: DMF 100 mL 중 NaH (60%, 2.5 g, 62.4 mmol)의 현탁액을 tert-부틸 에틸 부트-3-인-1-일프로판디오에이트 (15 g, 62.4 mmol)에 25℃에서 적가하였다. 혼합물을 40℃에서 30분 동안 교반하고, DMF 50 mL 중 2-클로로-5-니트로피리미딘 (10.0 g, 62.4 mmol)을 적가하였다. 생성된 현탁액을 50℃에서 2시간 동안 교반하고, EtOAc 500 mL로 희석하였다. 혼합물을 물 (3 x 100 mL), 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔기를 칼럼 크로마토그래피 (석유 에테르:EtOAc = 10:1)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다;
단계 E: 7-tert-부틸 7-에틸 3-니트로-5,6-디히드로-7H-시클로펜타[b]피리딘-7,7-디카르복실레이트
니트로벤젠 100 mL 중 tert-부틸 에틸 부트-3-인-1-일(5-니트로피리미딘-2-일)프로판디오에이트 (10.2 g, 28.1 mmol)의 용액을 150℃로 4시간 동안 가열하였다. 니트로벤젠을 진공에 의해 제거하고, 잔기를 칼럼 크로마토그래피 (석유 에테르:EtOAc = 10:1)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다;
단계 F: 에틸 3-니트로-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-7-카르복실레이트: TFA 30 mL 및 DCM 30 mL 중 7-tert-부틸 7-에틸 3-니트로-5,6-디히드로-7H-시클로펜타[b]피리딘-7,7-디카르복실레이트 (6.2 g, 18.4 mmol)의 혼합물을 35℃에서 3시간 동안 교반한 다음, 농축 건조시켰다. 잔기를 EtOAc 200 mL 중에 용해시키고, 포화 NaHCO3 (2 x 25 mL) 및 염수 (25 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다.
단계 G: 에틸 3-아미노-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-7-카르복실레이트: 에탄올 80 mL 중 에틸 3-니트로-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-7-카르복실레이트 (4.2 g, 17.8 mmol) 및 Pd/C (0.5 g, 10%)의 혼합물을 50 psi의 수소 하에 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 여과하였다. 여과물을 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다.
단계 H: 에틸 3-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-7-카르복실레이트
아세트산 50 mL 중 에틸 3-아미노-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-7-카르복실레이트 (3.0 g, 14.6 mmol) 및 트리에틸 오르토포르메이트 (6.5 g, 43.6 mmol)의 용액에 아지드화나트륨 (1.0 g, 16.0 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 100℃로 3시간 동안 가열하였다. 반응이 완결되었음을 TLC에 의해 확인하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 용매를 진공 하에 제거하였다. 잔기를 EtOAc 중에 용해시키고, 물로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔기를 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 I: 리튬 3-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-7-카르복실레이트
THF/MeOH/H2O (2:2:1) 50 mL 중 에틸 3-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-7-카르복실레이트 (1.5 g, 5.8 mmol)의 혼합물에 LiOH·H2O (242.8 mg, 5.8 mmol)를 조금씩 첨가하였다. 생성된 혼합물을 30분 동안 교반한 다음, 물 200 mL로 희석하고, 에테르 (3 x 30 mL)로 세척하였다. 수층을 동결건조시켜 표제 화합물을 수득하였다:
중간체 67
2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-5-카르복실산
단계 A: 트리메틸 부탄-1,2,4-트리카르복실레이트: 황산 (0.620 mL, 11.6 mmol)을 메탄올 (50 mL)/1,2-디클로로에탄 (140 mL) 중 1,2,4-부탄트리카르복실산 (30.0 g, 158 mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 환류 하에 6.5시간 동안 가열한 다음, 실온에서 밤새 정치하였다. 용매를 증발시켰다. 이어서, 200 mL 벤젠을 잔기에 첨가하고, 이어서 격렬히 교반하면서 냉각된 포화 NaHCO3 용액을 천천히 첨가하였다. 상을 분리하였다. 수성 상을 벤젠 (1x100mL)으로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 염수로 세척하고, 건조 (MgSO4)시키고, 여과하고, 용매를 증발시켜 표제 화합물을 수득하였다.
단계 B: 디메틸 2-옥소시클로펜탄-1,3-디카르복실레이트 및 디메틸 3-옥소시클로펜탄-1,2-디카르복실레이트: 수소화나트륨 (6.19 g, 155 mmol)을 톨루엔 (94 mL)에 첨가하고 5℃ (반응 온도)로 냉각시켰다. 톨루엔 (26 mL)/메탄올 (0.22 mL) 중 트리메틸 부탄-1,2,4-트리카르복실레이트 (29.9 g, 129 mmol)의 용액을 1 3/4시간에 걸쳐 5-10℃의 온도를 유지하면서 적가하였다. 생성된 혼합물을 5-10℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 물 40 mL를 첨가하였다. 층을 분리하였다. 유기 상을 물로 추출하였다. 수성 추출물을 합하고, 1.7 M 시트르산을 첨가하여 산성화시키고, EtOAc (200mL, 100mL x 2)로 추출하였다. 합한 EtOAc 추출물을 염수로 세척하고, 건조 (MgSO4)시키고, 여과하고, 용매를 증발시켜 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 이스코 콤비플래쉬 (330g 실리카 겔, 100mL/분, 254nM, 12 칼럼 부피에 걸쳐 0%에서 100% EtOAc/헥산; 목적 생성물은 50% EtOAc에서 용리됨; 위치이성질체는 65% EtOAc에서 용리됨)에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 C: 메틸 2-아미노-4-히드록시-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-5-카르복실레이트
재밀봉가능한 튜브에 디메틸 3-옥소시클로펜탄-1,2-디카르복실레이트 (6.04 g, 30.2 mmol)를 채웠다. 디옥산 (86 mL)을 첨가하고, 이어서 구아니딘 히드로클로라이드 (3.83 g, 40.1 mmol) 및 포타슘 tert-부톡시드 (40 mL, 40 mmol)를 첨가하였다. 튜브를 밀봉하고, 130℃에서 18시간 동안 가열하였다. 용매를 증발시켰다. 메탄올 (86 mL)을 잔기에 첨가하고, 이어서 티오닐 클로라이드 (2.2 mL, 30 mmol)를 천천히 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 증발시켰다. 잔기를 실리카 겔 상에서 크로마토그래피에 의해 14분에 걸쳐 0에서 20%의 DCM:메탄올 구배로 용리시키면서 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. 이 물질을 후속 단계에 추가의 정제 없이 사용하였다:
단계 D: 메틸 2-아미노-4-클로로-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-5-카르복실레이트
옥시염화인 (16.0 mL, 172 mmol)을 메틸 2-아미노-4-히드록시-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-5-카르복실레이트 (5.84 g, 27.9 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 마이크로웨이브 중 밀봉된 튜브에서 100℃로 3시간 동안 가열하였다. 용매를 증발시켰다. 잔기를 6 mL 아세토니트릴 중에 용해시키고, 6 mL 얼음/물을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하고, 10분 (11회 주입)에 걸쳐 0에서 100% 아세토니트릴의 구배를 사용하여 선파이어 칼럼 상에서 역상 정제용 HPLC에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. 혼합된 분획의 재정제에 의해 추가의 생성물을 수득하였다:
단계 E: 메틸 2-아미노-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-5-카르복실레이트:
트리에틸아민 (3.20 mL, 23.0 mmol)을 디옥산 (42 mL) 중 메틸 2-아미노-4-클로로-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-5-카르복실레이트 (2.11 g, 9.27 mmol)의 용액에 첨가하고, 이어서 포름산 (0.89 mL, 22.28 mmol) 및 [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]-디클로로팔라듐(II) (660 mg, 0.902 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 밀봉된 튜브에서 100℃로 밤새 가열하였다. 용매를 증발시켰다. 잔기를 CH2Cl2:MeOH 95:5를 사용하여 실리카 (220 g + 125 g 카트리지) 상에서 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 수득하였으며, 이를 후속 단계에 추가의 정제 없이 사용하였다.
단계 F: 2-아미노-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-5-카르복실산: 수산화나트륨 (13.0 mL, 13.0 mmol)을 메탄올 (21 mL) 중 메틸 2-아미노-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-5-카르복실레이트 (1.10 g, 5.69 mmol)의 용액에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 염산 (13 mL, 13.00 mmol)을 첨가하였다. 용매를 증발시켰다. 잔기를 실리카 (24g 카트리지) 상에서 크로마토그래피에 의해 CH2Cl2:MeOH 95:5 (150 mL) 및 CH2Cl2:MeOH:AcOH 90:10:1로 용리시키면서 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 G: 2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-5-카르복실산
트리메틸실릴 트리플루오로아세테이트 (1.5 mL, 8.7 mmol)를 에틸 아세테이트 (10 mL) 중 2-아미노-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-5-카르복실산 (845 mg, 4.72 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 용액이 수득되었지만 5분 내에 침전물이 형성되었다. 반응 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하고, 트리에틸 오르토포르메이트 (1.4 mL, 8.4 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하고, 아지도트리메틸실란 (1.1 mL, 8.4 mmol)을 첨가하였다. 생성된 현탁액을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 증발시켰다. 잔기를 CH2Cl2 (A) 및 CH2Cl2:MeOH:AcOH 90:10:1 (B)를 구배 용리 (16 칼럼 부피에 걸쳐 100% A에서 100% B)로 사용하여 실리카 겔 (80 g 카트리지) 상에서 크로마토그래피에 의해 정제하여 조 생성물을 수득하였으며, 이를 정제용 HPLC에 의해 추가로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다:
상기 기재된 중간체는 "I-" 뒤에 오는 그의 숫자로 지칭될 수 있다. 예를 들어, 중간체 44A는 I-44A로 단축된다. 아자-인단 키랄 중심에서의 절대 입체화학은 실시예 2A 및 2B에 대해서만 결정되었다.
실시예 1AB 이성질체 혼합물, 1A 및 1B
(3R)-3-메틸-6-[(3R,9aS)-8-{[2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-일]카르보닐}옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온
건조 DMF 2 mL 중 2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-카르복실산 [I-62] (200mg, 0.86 mmol)의 용액을 HATU (362 mg, 0.95 mmol)로 실온에서 처리하였다. 5분 후, 건조 DMF 2 mL 중 (R)-3-메틸-6-((3R,9aS)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일)이소크로만-1-온 디히드로클로라이드 [I-44A] (325 mg, 0.86 mmol) 및 DIEA (0.23 mL, 1.3 mmol)의 용액을 첨가하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반되도록 하였다. 반응물을 물 10 mL로 켄칭하고, EtOAc로 추출하고, 유기 층을 농축시켰다. 조 물질을 MPLC [10-60% (EtOAc:아세토니트릴-IPA:MeOH의 80:10:8:2 혼합물)/헥산]에 의해 정제하여 표제 화합물을 부분입체이성질체의 혼합물로서 수득하였다:
OD 칼럼 상에서 45% 2:1 MeOH:MeCN을 사용한 키랄 정제용 SFC에 의해 2개 아자-인단 부분입체이성질체의 키랄 분해를 달성하였다. 보다 빠르게 용리된 이성질체가 보다 강력한 ROMK 억제제였다:
실시예 1CD 이성질체 혼합물, 1C 및 1D
(3R)-3-메틸-6-[(3S,9aS)-8-{[2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-일]카르보닐}옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온
표제 화합물 (2개 이성질체의 혼합물로서임)을 (R)-3-메틸-6-((3S,9aS)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일)이소크로만-1-온 디히드로클로라이드 [I-44B]로부터 출발하여 실시예 1A 및 1B에서 이성질체 혼합물의 합성에 대해 상기 기재된 것과 유사한 방식으로 제조하였다. 키랄셀 OD 칼럼 상에서 40% 2:1 MeOH:MeCN을 사용한 키랄 정제용 SFC에 의해 표제 화합물의 2개 아자-인단 부분입체이성질체의 키랄 분해를 달성하였다. 보다 빠르게 용리된 이성질체가 보다 강력한 ROMK 억제제였다.
실시예 1EF 이성질체 혼합물, 1E 및 1F
(3R)-3-메틸-6-[(3S,9aR)-8-{[2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-일]카르보닐}옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온:
표제 화합물 (2개 이성질체의 혼합물로서임)을 (R)-3-메틸-6-(3S,9aR)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일)이소크로만-1-온 디히드로클로라이드 [I-44G]로부터 출발하여 실시예 1A 및 1B에서 이성질체 혼합물의 합성에 대해 상기 기재된 것과 유사한 방식으로 제조하였다. 키랄팩 AS 칼럼 상에서 50% 2:1 MeOH:MeCN을 사용한 키랄 정제용 SFC에 의해 표제 화합물의 2개 아자-인단 부분입체이성질체의 키랄 분해를 달성하였다.
실시예 1GH 이성질체 혼합물, 1G 및 1H
(3S)-3-메틸-6-[(3R,9aS)-8-{[2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-일]카르보닐}옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온
표제 화합물 (2개 이성질체의 혼합물로서임)을 (S)-3-메틸-6-((3R,9aS)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일)이소크로만-1-온 디히드로클로라이드 [I-44C]로부터 출발하여 실시예 1A 및 1B에서 이성질체 혼합물의 합성에 대해 상기 기재된 것과 유사한 방식으로 제조하였다. 키랄팩AD 칼럼 상에서 70% 2:1 MeOH:MeCN을 사용한 키랄 정제용 SFC에 의해 표제 화합물의 2개 아자-인단 부분입체이성질체의 키랄 분해를 달성하였다. 보다 빠르게 용리된 이성질체가 보다 강력한 ROMK 억제제였다.
실시예 1IJ 이성질체 혼합물, 1I 및 1J
(3S)-3-메틸-6-[(3R,9aR)-8-{[2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-일]카르보닐}옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온: 표제 화합물 (2개 이성질체의 혼합물로서임)을 (S)-3-메틸-6-((3R,9aR)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일)이소크로만-1-온 디히드로클로라이드 [I-44F]로부터 출발하여 실시예 1A 및 1B에서 이성질체 혼합물의 합성에 대해 상기 기재된 것과 유사한 방식으로 제조하였다. 키랄팩 AS-H 칼럼 상에서 50% MeOH (0.2% DEA)를 사용한 키랄 정제용 SFC에 의해 표제 화합물의 2개 아자-인단 부분입체이성질체의 키랄 분해를 달성하였다.
실시예 1KL 이성질체 혼합물, 1K 및 1L
(3S)-3-메틸-6-[(3S,9aR)-8-{[2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-일]카르보닐}옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]-3,4-디히드로-1H-이소크로멘-1-온:
표제 화합물 (2개 이성질체의 혼합물로서임)을 (S)-3-메틸-6-((3S,9aR)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일)이소크로만-1-온 디히드로클로라이드 [I-44E]로부터 출발하여 실시예 1A 및 1B에서 이성질체 혼합물의 합성에 대해 상기 기재된 것과 유사한 방식으로 제조하였다. 키랄셀 OD-H 칼럼 상에서 40% MeOH (0.2% DEA)를 사용한 키랄 정제용 SFC에 의해 표제 화합물의 2개 아자-인단 부분입체이성질체의 키랄 분해를 달성하였다. 보다 빠르게 용리된 이성질체가 보다 강력한 ROMK 억제제였다:
실시예 2AB 이성질체 혼합물, 2A 및 2B (방법 1)
2A: 6-플루오로-2-메틸-3-[(3S,9aR)-8-{[(5S)-2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-5-일]카르보닐}옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴 및 2B: 6-플루오로-2-메틸-3-[(3S,9aR)-8-{[(5R)-2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-5-일]카르보닐}옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴
EDC (2.24 g, 11.68 mmol)를 디클로로메탄 (25 mL) 중 2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-5-카르복실산 [I-67] (2.51 g, 9.73 mmol) 및 6-플루오로-2-메틸-3-[(3S,9aR)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴 [I-40C-1] (2.81 g, 10.21 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 대부분의 용매를 증발시켰다. 잔기를 EtOAc 중에 용해시키고, 물, NaHCO3 용액 및 염수로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 여과하고, 용매를 증발시켜 2개 부분입체이성질체의 조 혼합물을 수득하였다. 조 생성물을 CH2Cl2 (용매 A)에서 50% CH2Cl2:MeOH 90:10 (용매 B)의 구배 용리로 실리카 (220 g 카트리지) 상에서 정제하여 표제 부분입체이성질체의 혼합물을 수득하였으며, 이를 키랄 정제용 SFC HPLC (키랄팩 IC 칼럼 상 SFC, 디아셀 케미컬 인더스트리즈, 리미티드, 30 x 250mm, 60% 2:1 MeOH:MeCN/CO2, 70 mL/분, 100 bar, DCM/MeCN 중 샘플, 35C, 254 nm)로 분리하여 분리된 아자-인단 부분입체이성질체: 보다 빠르게 용리된 이성질체 2A 및 보다 느리게 용리된 이성질체 2B를 수득하였다. 보다 느리게 용리된 이성질체의 X-선 결정학에 의해 아자-인단 키랄 중심에서의 입체화학적 할당을 만들었다. 이성질체 A를 1 mL 아세토니트릴 중에 용해시키고, 에테르 중 1 당량의 1 M HCl을 첨가하고, 고체를 여과하여 히드로클로라이드 염을 수득하였다.
이성질체 2B의 HCl 염을 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 2A (방법 2)
5L 3구 둥근 바닥 플라스크에 오버헤드 교반기, N2 유입구 및 열전쌍을 구비하였다. 플라스크에 6-플루오로-2-메틸-3-[(3S,9aR)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴 [I-40C-2] (147.15 g, 423 mmol, 디-히드로클로라이드 염을 기준으로 함), 2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-5-카르복실산 [I-67] (95.7% 순도, 110 g, 452 mmol), EDCI·HCl (122 g, 634 mmol), 및 HOBt·H2O (6.47 g, 42.3 mmol)에 이어서 예비혼합된 테트라히드로푸란 (1472 mL) 및 물 (73.6 mL)을 채웠다. THF:물의 첨가는 23℃에서 31℃로의 온도 증가를 동반하였다. 온도를 35℃ 미만으로 유지하면서 4 당량의 DIPEA (300mL)를 첨가 깔때기를 통해 첨가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 밤새 교반하였다. 반응물을 500mL 물 중 염화암모늄 (90 g, 1690 mmol)으로 켄칭하였다. 생성물을 수성 상으로부터 EtOAc 500 mL에 이어서 EtOAc 200mL로 추출하고, 유기 층을 합하였다. 합한 유기 층을 수성 상의 pH가 6-7이 될 때까지 암모늄 클로라이드 용액으로 세척하였다. 고체가 침전된 것으로 관찰되었고, 이를 수성 및 유기 상 계면으로부터 여과하였다. 유기 상을 농축시켜 THF 및 EtOAc를 제거하였다. 아세토니트릴 약 200 mL를 첨가하고, 혼합물을 회전 증발에 적용시켜 물을 제거하였다. 더 많은 고체가 침전되었다. 고체를 여과하고, 여과물을 SFC 키랄 HPLC 분리 투입 스트림을 위해 1500 mL로 희석하였다. 분리는 하기 방법을 통해 달성하였다: 키라셀 AD-H 칼럼 (디아셀 케미컬 인더스트리즈, 리미티드, 250x50mm, 5um), 유량 250mL/분, 35℃, 220nm, 100bar, 50% MeOH:MeCN (2:1)/CO2, 260초 순환 시간, 1500mL MeCN 중 130g, 87mg/mL, 15mL/주입. 피크 1 (보다 빠르게 용리됨) 분획을 농축시키고, 750 mL ACN 중에 용해시키고, 활성 탄소 (노리트(Norit) SA3, 100 메쉬)로 처리하고, 약 15분 동안 교반하고, 솔카 플록 상에서 여과하고, 농축시켰다. 발포체 잔기를 40-50℃로 가열하면서 350 mL DME 중에 용해시켰다. 약 35-37℃에서 약 2-3분 후에 침전이 관찰되었고, 혼합물이 주위 조건으로 냉각되도록 하였다. 온도가 약 25℃에 도달하면, 250 mL 시클로헥산을 약 15 분에 걸쳐 첨가하고, 배치를 약 1시간 동안 교반하였다. 고체 생성물을 여과하고, 반응기 및 케이크를 시클로헥산 100 mL로 세척하고, 고체를 뽑아내어 N2 하에 거의 건조된 상태로 만들었다. 습윤 케이크를 진공 하에 60℃에서 약 18시간 동안 건조시켜 6-플루오로-2-메틸-3-[(3S,9aR)-8-{[(5S)-2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-5-일]카르보닐}옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴을 수득하였다.
실시예 2CD 이성질체 혼합물, 2C 및 2D
6-플루오로-2-메틸-3-[(3R,9aR)-8-{[2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-5-일]카르보닐}옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴 (이성질체 혼합물): 1-히드록시벤조트리아졸 (173 mg, 1.280 mmol)을 디클로로메탄 (2 mL) 중 2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-5-카르복실산 [I-67] (200 mg, 0.861 mmol)의 현탁액에 첨가하고, 이어서 EDC (331 mg, 1.73 mmol), 6-플루오로-2-메틸-3-[(3R,9aR)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴 [I-40D] (551 mg, 1.095 mmol) 및 트리에틸아민 (0.70 mL, 5.0 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc로 희석하고, 포화 NaHCO3 용액, 물 및 염수로 세척하고, 건조 (MgSO4)시키고, 여과하고, 용매를 증발시켜 표제 화합물을 2개 부분입체이성질체의 혼합물로서 수득하였다. 조 생성물을 12 CV에 걸쳐 100% A에서 100% B의 구배 용리로 CH2Cl2 (A) 및 CH2Cl2:MeOH 90:10 (B)을 사용하여 실리카 (24 g 카트리지) 상에서 MPLC에 의해 정제하여 표제 화합물을 2개 부분입체이성질체의 혼합물로서 수득하였다. LC/MS 490 (M+H). 부분입체이성질체의 혼합물을 키랄셀 AS 칼럼 상 정제용 키랄 HPLC (SFC), 100 bar, 40% MeOH (0.2% DEA)/CO2, 35℃에 의해 정제하여 표제 화합물의 2개의 분리된 아자-인단 부분입체이성질체: 이성질체 2C (보다 빠르게 용리됨) 및 이성질체 2D (보다 느리게 용리됨)를 수득하였다. 각각의 이성질체를 디클로로메탄 1 mL 중에 개별적으로 용해시키고, 에테르 중 1 당량의 1 M HCl을 첨가하였다. 용매를 증발시켜 각각의 이성질체의 히드로클로라이드 염을 수득하였다.
실시예 2EF 이성질체 혼합물, 2E 및 2F
6-플루오로-2-메틸-3-[(3R,9aS)-8-{[2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-5-일]카르보닐}옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴 (이성질체 혼합물):
표제 화합물 (2개의 이성질체의 혼합물로서임)을 6-플루오로-2-메틸-3-[(3R,9aS)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴 [I-40B]로부터 출발하여 실시예 2C 및 2D에서 이성질체 혼합물의 합성에 대해 상기 기재된 것과 유사한 방식으로 제조하였다. 부분입체이성질체를 키랄셀 AS-H 칼럼 상 키랄 정제용 SFC HPLC, 100 bar, 30% MeOH (0.2% 이소부틸아민)/CO2, 35℃에 의해 분리하고, 이어서 실리카 겔 상 정제용 TLC (CH2Cl2:MeOH 95:5를 사용하여 용리시킴)에 의해 추가로 정제하여 표제 화합물의 분리된 아자-인단 부분입체이성질체, 이성질체 2E (보다 빠르게 용리됨) 및 이성질체 2F (보다 느리게 용리됨)를 수득하였다. 각각의 이성질체를 디클로로메탄 1 mL 중에 개별적으로 용해시키고, 에테르 중 1 당량의 1 M HCl을 첨가하였다. 용매를 증발시켜 분리된 부분입체이성질체의 히드로클로라이드 염을 수득하였다.
실시예 2GH 이성질체 혼합물, 2G 및 2H
6-플루오로-2-메틸-3-[(3S,9aS)-8-{[2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-5-일]카르보닐}옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴 (이성질체 혼합물): HATU (266 mg, 0.700 mmol)를 DMF (1 mL) 중 2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-5-카르복실산 [I-67] (148 mg, 0.637 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 5 분 동안 교반한 다음, 디클로로메탄 (1 mL) 중 6-플루오로-2-메틸-3-[(3S,9aS)-옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴 [I-40A] (411 mg, 0.817 mmol) 및 휘니그 염기 (0.70 mL, 4.0 mmol)의 용액을 첨가하였다. 플라스크를 디클로로메탄 (0.3 mL)으로 2회 헹구었다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, EtOAc로 희석하고, 포화 NaHCO3 용액, 물 및 염수로 세척하고, 건조 (MgSO4)시키고, 여과하고, 용매를 증발시켜 조 표제 화합물을 2개 부분입체이성질체의 혼합물로서 수득하였다. 이 조 물질을 CH2Cl2:MeOH 95:5 (B)를 사용하여 실리카 상 정제용 TLC (2000 μm, 2회 용리시킴)에 의해 정제하여 표제 화합물 2GH를 부분입체이성질체의 혼합물로서 수득하였다:
부분입체이성질체를 키랄 정제용 SFC HPLC (키랄셀 IC, 21 x 250mm, 60% MeOH:MeCN/CO2 , 50mL/min, 100 bar, MeCN/MeOH 중 114 mg/mL, 35℃, 220 nm)에 의해 분리하여 분리된 아자-인단 부분입체이성질체, 이성질체 2G (보다 빠르게 용리됨) 및 이성질체 2H (보다 느리게 용리됨)를 수득하였다. 각각의 이성질체를 디클로로메탄 1 mL 중에 개별적으로 용해시키고, 에테르 중 1 당량의 1 M HCl을 첨가하였다. 용매를 증발시켜 각각의 부분입체이성질체의 HCl 염을 수득하였다.
하기 표 3에서의 실시예를 아미드 커플링제 EDC 또는 HATU 중 하나를 사용하여 적절한 아민 및 카르복실산 중간체 (상기 기재된 바와 같이 제조함)로부터 실시예 1AB 내지 1L 및 2AB 내지 2H의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 제조하였다. 아미드 커플링은 아미드 카르보닐에 대해 알파인 키랄 중심 (즉, 아자-인단 키랄 중심)에서 에피머인 2개의 부분입체이성질체 생성물을 제공하였다. 2개의 부분입체이성질체 생성물을 전형적으로는 상기 실시예에 기재된 것과 유사한 방식으로 분리하였다. 각각의 실시예에 사용된 키랄 HPLC 칼럼, 뿐만 아니라 관찰된 용리 순서는 표 3에 표시되어 있다. 표 3의 몇몇 실시예에 대해서, 2개의 부분입체이성질체는 분리되지 않았으며, 2개의 생성된 부분입체이성질체의 혼합물을 포함시켰다.
표 3 및 4에서, 보다 빠른 용리 및 보다 느린 용리는 개별적 아자-인단 부분입체이성질체가 그의 아자-인단 이성질체 혼합물로부터 분리될 때 관찰된 용리 순서를 지칭한다. 각각의 화합물에서 다른 입체중심의 절대 입체화학은 그의 상응하는 중간체 합성에 기초하여 알려져 있으며, 도시된 바와 같다.
표 3
실시예 번호
실시예 96AB 이성질체 혼합물, 96A 및 96B
6-플루오로-2-메틸-3-[(3R,9aR)-8-{[3-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[c]피리딘-7-일]카르보닐}옥타히드로-2H-피라지노[1,2-a]피라진-3-일]벤조니트릴:
단계 A: (3R,9aS)-tert-부틸 8-(3-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[c]피리딘-7-카르보닐)-3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로-1H-피라지노[1,2-a]피라진-2(6H)-카르복실레이트: DMF (4 mL) 중 (3R,9aS)-tert-부틸 3-(3-시아노-4-플루오로-2-메틸페닐)헥사히드로-1H-피라지노[1,2-a]피라진-2(6H)-카르복실레이트 [I-18A] (250 mg, 0.668 mmol) 및 3-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[c]피리딘-7-카르복실산 [I-65] (201 mg, 0.868 mmol)의 용액에 HATU (381 mg, 1.00 mmol)를 첨가하고, 이어서 디이소프로필에틸아민 (350 μL, 2.00 mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트 (100 mL)를 첨가하고, 혼합물을 포화 중탄산나트륨 (3x100 mL)으로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시키고, 잔기를 정제용 TLC에 의해 10% 메탄올/메틸렌 클로라이드로 용리시키면서 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 B: 6-플루오로-2-메틸-3-[(3R,9aR)-8-{[3-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[c]피리딘-7-일]카르보닐}옥타히드로-2H-피라지노[1,2-a]피라진-3-일]벤조니트릴
메틸렌 클로라이드 (3 mL) 중 단계 A의 화합물 (393 mg, 0.668 mmol) 및 티오아니솔 (316 μL, 2.67 mmol)의 용액에 0℃에서 트리플루오로아세트산 (3 mL)을 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 제거한 후, 잔기를 메틸렌 클로라이드와 1N 수산화나트륨 사이에 분배하고, 알칼리 상을 메틸렌 클로라이드로 추출하고, 합한 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시키고, 잔기를 정제용 TLC에 의해 10% 메탄올/메틸렌 클로라이드로 용리시키면서 정제하여 표제 화합물을 2개 부분입체이성질체 혼합물로서 수득하였다. 2개의 이성질체를 키랄팩 AS-H 칼럼 상에서 50% 메탄올 (0.2%디에틸아민)/CO2를 사용하여 분리하였다. 보다 빠르게 용리된 이성질체 (96A)가 보다 강력한 ROMK 억제제였다. 96A 보다 빠르게 용리된 이성질체:
보다 느리게 용리된 이성질체 (96B)는 탈륨 플럭스 및 전기생리학 검정에서 1μM 초과의 IC50을 가졌다.
하기 표 4에서의 실시예를 적절한 아민 및 카르복실산 중간체 (상기 기재된 바와 같이 제조함)로부터 실시예 96의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 제조하였다. 제공된 데이터는 키랄 HPLC 조건 (적용가능한 경우); 및 MS 및/또는 HNMR 특성화를 포함한다.
표 4
실시예 번호
하기 탈륨 플럭스 검정 및/또는 전기생리학 검정을 실시예에서의 최종 생성물 화합물 각각에 대해 수행하였다.
탈륨 플럭스 검정
세포 배양 조건- hROMK (hKir1.1)를 안정하게 발현하는 HEK293 세포를 37℃에서 10% CO2 가습 인큐베이터 내 완전 성장 배지: 비-필수 아미노산, 페니실린/스트렙토마이신/글루타민, G418 및 FBS로 보충한 둘베코 변형 이글 배지 중에서 성장시켰다. 80% 초과의 전면생장률에서, 배지를 플라스크로부터 흡인하고 10 mL 칼슘/마그네슘-무함유 PBS로 헹구었다. 5 mL의 1X 트립신 (Ca/Mg 무함유 PBS 중에 제조함)을 T-225 플라스크에 첨가하고, 플라스크를 2-3분 동안 37℃/CO2 인큐베이터로 복귀시켰다. 세포를 제거하기 위해, 플라스크의 측면을 손가락으로 부드럽게 두드렸다. 세포를 완전히 연화시키고, 이어서 세포를 25 mL 완전 배지로 옮겼다. 6분 동안 1,500 rpm에서 원심분리한 다음, 완전 성장 배지 중에 재현탁시키고 세포 농도를 결정하였다. 전형적 재-시딩에 대해, 4E6 세포/T-225 플라스크는 4일 내에 80% 초과의 전면생장률에 도달할 것이다. 이상적 성장 조건 및 적절한 조직 배양 실행 하에, 이 세포주는 40-45 계대 동안 안정하다.
플럭스OR(FluxOR) 키트 성분 (인비트로젠(Invitrogen) F10017)
●플럭스OR™ 시약 (성분 A)
●플럭스OR™ 검정 완충제 (성분 B) - 10X 농축물
●파워로드(PowerLoad)™ 농축물 (성분 C) - 100X 농축물
●프로베네시드(Probenecid) (성분 D) - 동결건조 샘플을 -20℃에서 유지시킨다. 1 mL 물 중 가용화 후 수용성 100X. 4℃에서 보관한다.
●플럭스OR™ 클로라이드-무함유 완충제 (성분 E) - 5X 농축물
●황산칼륨 (K2SO4) 농축물 (성분 F) - 물 중 125 mM. 4℃에서 보관한다.
●황산탈륨 (Tl2SO4) 농축물 (성분 G) - 물 중 50 mM. 4℃에서 보관한다.
●DMSO (디메틸 술폭시드, 성분 H) - 1 mL (100%)
시약 제조: 플럭스OR 작업 용액
●1000X 플럭스OR™ 시약: 100 μl DMSO 중에 성분 A의 바이알을 재구성시키고; 잘 혼합하고; 10 μl 분취액을 -20℃에서 보관한다.
●1X 플럭스OR™ 검정 완충제: 성분 B를 물로 10배 희석하고; 헤페스/NaOH로 pH를 7.4로 조정하고; 여과하여 4℃에서 보관한다.
●프로베네시드/검정 완충제: 100 mL의 1X 플럭스OR™ 검정 완충제; 1 mL의 재구성한 성분 D; 4℃에서 보관한다.
●로딩 완충제 (마이크로플레이트당): 10 μl 1000X 플럭스OR™ 시약; 100 μl 성분 C; 10 mL 프로베네시드/검정 완충제
●화합물 완충제 (마이크로플레이트당): 20 mL 프로베네시드/검정 완충제; 0.3 mM 우아바인 (물 중 10 mM 우아바인은 실온에서 호박색 병/알루미늄 호일 내에 보관할 수 있음); 시험 화합물
●1X 플럭스OR™ 클로라이드-무함유 완충제: 물 중 1X 작업 용액을 제조한다. 실온에 보관할 수 있다.
●자극제 완충제 (1X 플럭스OR™ 클로라이드-무함유 완충제 중에 5X 최종 농도로 제조함): 7.5 mM 황산탈륨 및 0.75 mM 황산칼륨 (3 mM 탈륨/0.3 mM 칼륨의 최종 검정 농도 제공). 사용하지 않을 때에는 4℃에서 보관한다. 멸균으로 유지되는 경우, 이 용액은 수 개월 동안 양호하다.
검정 프로토콜- ROMK 채널 기능 탈륨 플럭스 검정은 FLIPR-테트라 기기를 이용하여 384 웰에서 수행하였다. HEK-hKir1.1 세포를 폴리-D-리신 마이크로플레이트에 시딩하고, 밤새 37℃-10% CO2 인큐베이터에서 유지시켰다. 실험일에, 성장 배지를 플럭스OR™ 시약 로딩 완충제로 대체하고, 주위 온도 (23-25℃)에서 90분 동안 차광상태로 인큐베이션하였다. 로딩 완충제를 검정 완충제 ± 시험 화합물로 대체한 다음, 주위 온도에 30분 인큐베이션하였고, 여기서 탈륨/칼륨 자극제를 마이크로플레이트에 첨가하였다.
단계 프로토콜
1. 384-웰 PDL 코팅된 마이크로플레이트에 HEK-hKir1.1 세포 (20,000개 세포/웰에서 50 μl)를 시딩하였다.
2. 세포가 밤새 가습 37℃/10% CO2 인큐베이터에 부착되도록 하였다.
3. 마이크로플레이트로부터 세포 성장 배지를 완전히 제거하고 25 μl 로딩 완충제로 대체하였다.
4. 마이크로플레이트를 실온에서 차광상태로 90분 동안 인큐베이션하였다.
5. 로딩 완충제를 제거하고 25 μl 1x 검정 완충제 ± 시험 화합물로 대체하였다.
6. 마이크로플레이트를 실온에서 차광상태로 30분 동안 인큐베이션하였다.
7. FLIPR-테트라 384에서: 마이크로플레이트에 자극제 (탈륨/칼륨) 용액을 첨가하고 형광을 모니터링하였다. 여기 = 400 nm, 방출 = 460 & 580 nm. ~10분 동안 데이터를 수집하였다.
데이터 계산- 본 발명의 표준 제어 ROMK 억제제 3 μM을 함유하는 웰의 형광 강도를 사용하여 탈륨 플럭스의 ROMK-감수성 성분을 규정하였다. 시험 화합물 존재 하의 형광을 대조군 값에 대해 정규화하여 % 형광 변화를 제공하였다. IC50 값은 ROMK 탈륨 플럭스 신호의 50%를 억제하는 화합물의 농도를 나타낸다.
검정 표준- 일반적으로, 대조군 화합물은 검정이 이전 측정값과 비교하여 일정한 결과를 제공한다는 것을 뒷받침하기 위해 포함되지만, 대조군이 시험 화합물에 대한 결과를 얻기 위해 요구되는 것은 아니다. 대조군은 바람직하게는 본 검정에서 1 μM 미만의 IC50 효력을 갖는 본 발명의 화학식 Ia의 임의의 화합물일 수 있다. 대안적으로, 대조군은 본 검정에서 1 μM 미만의 IC50 효력을 갖는 또 다른 화합물 (화학식 Ia의 범위 밖)일 수 있다.
전기생리학 검정
Kir1.1 (ROMK1) 전류의 차단을 이온웍스 쿼트로(IonWorks Quattro) 자동화 전기생리학 플랫폼 (캘리포니아주 서니베일 소재의 몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices))을 이용하여 전세포 전압 클램프 (문헌 [Hamill et. al. Pfluegers Archives 391:85-100 (1981)])에 의해 검사하였다. Kir1.1 채널을 안정하게 발현하는 차이니즈 햄스터 난소 세포를 37℃의 가습 10% CO2 인큐베이터 내 세포 배양 배지 중에서 T-75 플라스크 내에 유지시켰다. 실험 전에, 1 mM 부티르산나트륨과 함께 밤새 인큐베이션하여 Kir1.1 발현을 유도하였다. 실험일에, 세포를 37℃에서 대략 6분 동안 2.5 mL의 베르센(Versene) (인비트로젠 15040-066)에 의해 해리시키고, 하기를 (mM 단위로) 함유하는 10 mL의 조(bath) 용액 중에 현탁시켰다: 150 NaCl, 10 KCl, 2.7 CaCl2, 0.5 MgCl2, 5 헤페스, pH 7.4. 원심분리 후에, 세포 펠릿을 대략 4.0 mL의 조 용액 중에 재현탁시키고 이온웍스 기기에 넣었다. 세포내 용액은 하기와 같이 (mM 단위로) 이루어졌다: 80 K 글루코네이트, 40 KCl, 20 KF, 3.2 MgCl2, 3 EGTA, 5 헤페스, pH 7.4. 세포질에 대한 전기적 접근을 4분 동안 0.13 mg/ml 암포테리신 B 중 천공에 의해 달성하였다. 암포테리신 B (시그마 A-4888)는 DMSO 중 40 mg/ml 용액으로 제조하였다. 전압 프로토콜 및 전류 판독을 이온웍스 HT 소프트웨어/하드웨어 시스템을 사용하여 수행하였다. 전류를 1 kHz에서 샘플링하였다. 액간 접촉 전위에 대한 보정은 사용하지 않았다. -70 mV의 유지 전위로부터 0 mV로의 100 ms 스텝에 이어서 -70 mV로부터 +70 mV로의 100 ms 전압 스텝으로 이루어진 시험 펄스를 6분 화합물 인큐베이션 주기 전후에 적용하였다. 시험 화합물은 DMSO 원액을 조 용액에 3x 최종 농도로 희석함으로써 제조하여 기기 내 96-웰 폴리프로필렌 플레이트 내에 넣었다. 전류 진폭을 이온웍스 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. 화합물 효력을 평가하기 위해, 마이크로소프트 엑셀 (캘리포니아주 레드먼드 소재의 마이크로소프트(Microsoft))에서 0 mV로의 전압 스텝 동안의 분획 차단을 계산하였고, 이고르 프로(Igor Pro) 4.0 (오리건주 레이크 어스위고 소재의 웨이브 메트릭스(WaveMetrics))을 사용하여 용량-반응 곡선을 적합시켰다. 일반적으로, 대조군 화합물은 검정이 이전 측정값과 비교하여 일정한 결과를 제공한다는 것을 뒷받침하기 위해 포함되지만, 대조군이 시험 화합물에 대한 결과를 얻기 위해 요구되는 것은 아니다. 대조군은 바람직하게는 본 검정에서 1 μM 미만의 IC50 효력을 갖는 본 발명의 화학식 Ia의 임의의 화합물일 수 있다. 대안적으로, 대조군은 본 검정에서 1 μM 미만의 IC50 효력을 갖는 또 다른 화합물 (화학식 Ia의 범위 밖)일 수 있다.
탈륨 플럭스 검정 및 전기생리학 검정을 이용하여 본 발명의 실시예의 화합물에 대해 수집한 데이터를 하기 표 5에 나타내었다. 실시예의 모든 최종 생성물 화합물 (부분입체이성질체 혼합물 및 개별적 부분입체이성질체)은 실시예 섹션에서 달리 나타내지 않는 한 탈륨 플럭스 검정 및 전기생리학 검정 중 하나 또는 둘 다에서 1 μM 이하의 IC50 효력을 가졌다.
표 5
자발성 고혈압 래트 (SHR) 검정
자발성 고혈압 래트 (SHR)는 혈압을 상승시키기 위한 외인성 작용제의 투여를 필요로 하지도 않고 혈압을 상승시키기 위한 고염도 식이의 사용을 필요로 하지도 않는 연령-의존성 고혈압을 나타낸다. 따라서 이것은 인간 본태성 고혈압과 비슷하여, 신규 작용제의 혈압 강하 능력에 대한 용량-의존성을 평가하는 기회를 제공한다.
자발성 고혈압 래트 (SHR)에서 본 발명의 화합물의 혈압 강하 효능을 평가하기 위한 실험 프로토콜:
자발성 고혈압 래트 (SHR, 수컷, 6개월령, 챨스 리버(Charles River))에 이소플루란 또는 케타민/메토미딘 마취 하에서 DSI TA11PA-C40 원격측정 장치 (미네소타주 세인트폴 소재의 데이터 사이언시즈 인코포레이티드(Data Sciences, Inc.))를 이식하였다. 원격측정 유닛 카테터를 대퇴 동맥을 통해 하행 대동맥에 삽입하고, 원격측정 장치를 좌측 옆구리 부위에 피하 이식하였다. 임의의 연구를 시작하기 전에 동물을 14일 동안 수술로부터 회복되도록 하였다. 의식이 있는 자유롭게 움직이는 래트로부터 매 10분 마다 30초 동안 연속적으로 혈압, 심박수 및 활동 신호를 기록하였다. HCTZ (25 mg/kg/일, PO)를 기준 이뇨제로서 SHR에서 대략적인 최대 효력을 제공하는 용량으로 포함시켰다. 3 내지 14일의 전형적 지속기간 동안 매일 단일 경구 위관영양 후 비히클 대조군과 비교한 본 발명의 화합물의 혈압 강하 효력을 평가하였다. 데이터를 시간당 평균으로서 수집하고, 시간당 기준으로 비히클 대조군 기준선 데이터를 제함으로써 혈압 변화를 계산하였다. 실시예 번호 1A, 1G, 2A, 2H, 17A, 21, 34, 35, 40, 96A, 97을 3 mg/kg 또는 10 mg/kg의 PO, QD 용량에서 평가하였고, 그 결과 연구 마지막날까지 7 mmHg 내지 21 mmHg 범위의 하루 (24시간) 평균 수축기 혈압에서의 전형적 감소를 나타내었다.
기재된 자발성 고혈압 래트 검정은 인간 고혈압을 모의실험하는 실험 모델로서 당업계에 익히 공지되어 있으며 빈번하게 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Lerman, L.O., et al., J Lab Clin Med, 2005;146:160-173] 참조).
본 발명을 그의 특정한 구체적 실시양태와 관련하여 기재하였으나, 본원에 기재된 교시로부터 수많은 대안적 실시양태가 당업자에에 명백할 것이다. 특허청구범위는 실시예에서 설명된 바람직한 실시양태에 의해 제한되는 것이 아니라, 기재내용과 전체적으로 일치하는 가장 광범위한 해석을 받아야 하는 것이다. 특허청구범위에서 특정한 입체배위 지정 없이 또는 전부가 아닌 키랄 중심의 지정과 함께 특정한 화합물 (즉, 종)을 언급 또는 묘사한 것은 화합물의 라세미체, 라세미 혼합물, 각각의 개별 거울상이성질체, 부분입체이성질체 혼합물 및 각각의 개별 부분입체이성질체를 포함하는 것으로 의도되고, 여기서 이러한 형태들은 하나 이상의 비대칭 중심의 존재에 기인하여 가능한 것이다. 본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 공보는 그 전문이 참조로 포함된다.
Claims (16)
- 하기 구조 화학식 Ia를 갖는 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염.
<화학식 Ia>
상기 식에서,
Z는이고;
R1은이고,
여기서 ***는 카르보닐 탄소에 대한 부착을 나타내고 **는 화학식 Ia 내의 테트라졸릴 고리에 대한 부착을 나타내고;
X는 O, NH 또는 S이고;
m은 1 또는 2로부터 선택되는 정수이고;
n은 1 또는 2로부터 선택되는 정수이고;
X1, X2 및 X3은 C(R7) 또는 N으로부터 각각 독립적으로 선택되고, 단 X1, X2 및 X3 중 1개 이상은 N이어야만 하고 X1, X2 및 X3 중 2개 이하는 N이고;
Ra는 -CN이고;
Rb는 -H 또는 -C1 - 6알킬이고;
R2는 -H, -F, -Cl, -C1 - 6알킬, -C3 - 6시클로알킬 또는 -OC1 - 6알킬이고;
R3은 -H, -F, -Cl, -CN, -C1 - 6알킬, -C3 - 6시클로알킬 또는 -OC1 - 6알킬이고;
R4는 -F, -Cl, -CN, -C1 - 6알킬, -C3 - 6시클로알킬, -OC1 - 4알킬 또는 N-테트라졸릴이거나;
또는 R3 및 R4는 이들이 부착되어 있는 페닐 고리 내의 탄소 원자와 결합하여
을 형성하고, 여기서 R은 -H 또는 -C1 - 4알킬이고;
R5는 -H, -Cl, -F, -CN, -C1 - 4알킬, -C3 - 6시클로알킬 또는 -OC1 - 4알킬이고;
단 R3 및 R4가 결합하지 않는 경우, R3, R4 또는 R5 중 오직 1개만 -CN이고;
R6은 -H 또는 -C1 - 4알킬이고;
R7은 -H, -F, -Cl 또는 -C1 - 4알킬이다. - 제1항에 있어서, 하기 구조 화학식 I을 갖는 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염.
<화학식 I>
상기 식에서,
X는 O, NH 또는 S이고;
R1은이고,
여기서 ***는 카르보닐 탄소에 대한 부착을 나타내고 **는 화학식 I 내의 테트라졸릴 고리에 대한 부착을 나타내고;
m은 1 또는 2로부터 선택되는 정수이고;
n은 1 또는 2로부터 선택되는 정수이고;
X1, X2 및 X3은 C(R7) 또는 N으로부터 각각 독립적으로 선택되고, 단 X1, X2 및 X3 중 1개 이상은 N이어야만 하고 X1, X2 및 X3 중 2개 이하는 N이고;
R2는 -H, -F, -Cl, -C1 - 6알킬, -C3 - 6시클로알킬 또는 -OC1 - 6알킬이고;
R3은 -H, -F, -Cl, -CN, -C1 - 6알킬, -C3 - 6시클로알킬 또는 -OC1 - 6알킬이고;
R4는 -F, -Cl, -CN, -C1 - 6알킬, -C3 - 6시클로알킬, -OC1 - 4알킬 또는 N-테트라졸릴이거나;
또는 R3 및 R4는 이들이 부착되어 있는 페닐 고리 내의 탄소 원자와 결합하여
을 형성하고, 여기서 R은 -H 또는 -C1 - 4알킬이고;
R5는 -H, -Cl, -F, -CN, -C1 - 4알킬, -C3 - 6시클로알킬 또는 -OC1 - 4알킬이고;
단 R3 및 R4가 결합하지 않는 경우, R3, R4 또는 R5 중 오직 1개만 -CN이고;
R6은 -H 또는 -C1 - 4알킬이고;
R7은 -H, -F, -Cl 또는 -C1 - 4알킬이다. - 제1항에 있어서, X가 O인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
- 제3항에 있어서, m이 1이고 R6이 -H인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
- 제1항에 있어서, R1이
인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염. - 제1항에 있어서, R2가 -H 또는 -F이고; R3이 -H, -F, -CN 또는 -OCH3이고; R4가 -F, -CN 또는 -OCH3이고; R5가 -H, -Cl, -F, -CN, -CH3, -CH2CH3, 시클로프로필 또는 -OCH3이고; 단 R3, R4 또는 R5 중 오직 1개만 -CN인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
- 제1항에 있어서, R3 및 R4가 이들이 부착되어 있는 페닐 고리 내의 탄소 원자와 결합하여
을 형성하고,
R이 -H 또는 -CH3인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염. - 제1항에 있어서,
X가 O, NH 또는 S이고;
R1이이고,
여기서 ***가 카르보닐 탄소에 대한 부착을 나타내고 **가 화학식 Ia 내의 테트라졸릴 고리에 대한 부착을 나타내고;
m이 1 또는 2로부터 선택되는 정수이고;
n이 1 또는 2로부터 선택되는 정수이고;
X1, X2 및 X3이 CH 또는 N으로부터 각각 독립적으로 선택되고, 단 X1, X2 및 X3 중 1개 이상은 N이어야만 하고 X1, X2 및 X3 중 2개 이하는 N이고;
Ra가 -CN이고;
Rb가 -H 또는 -C1 - 3알킬이고;
R2가 -H 또는 -F이고;
R3이 -H, -F, -CN 또는 -OCH3이고;
R4가 -F, -CN 또는 -OCH3이거나;
또는 R3 및 R4가 이들이 부착되어 있는 페닐 고리 내의 탄소 원자와 결합하여
을 형성하고, 여기서 R이 -H 또는 -CH3이고;
R5가 -H, -Cl, -F, -CN, -CH3, -CH2CH3, 시클로프로필 또는 -OCH3이고;
단 R3 및 R4가 결합하지 않는 경우, R3, R4 또는 R5 중 오직 1개만 -CN이고;
추가로 R3 및 R4가 결합하는 경우에는, R5가 -H, -Cl, -F, -CH3 또는 -CH2CH3이고;
R6이 -H 또는 -C1 - 4알킬이고;
R7이 -H, -F, -Cl 또는 -C1 - 4알킬인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염. - 제1항에 있어서, 하기 구조 화학식 II를 갖는 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염.
<화학식 II>
상기 식에서,
X는 O 또는 NH이고;
R1은
이고;
R3은 -F이고, R4는 -CN이고, R5는 -CH3이거나; 또는
R3 및 R4는 이들이 부착되어 있는 페닐 고리 내의 탄소 원자와 결합하여
을 형성하고, 여기서 R은 -H 또는 -CH3이고,
R5는 -H이다. - 제1항에 있어서, 하기 구조 화학식 III을 갖는 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염.
<화학식 III>
- 제1항에 있어서,
6-플루오로-2-메틸-3-[(3R,9aS)-8-{[2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-일]카르보닐}옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴;
6-플루오로-2-메틸-3-[(3S,9aR)-8-{[2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-일]카르보닐}옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴;
6-플루오로-2-메틸-3-[(3S,9aS)-8-{[3-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[c]피리딘-7-일]카르보닐}옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴;
6-플루오로-2-메틸-3-[(3S,9aR)-8-{[3-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[c]피리딘-7-일]카르보닐}옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴;
6-[(3R,9aS)-8-{[2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-일]카르보닐}옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]-3,4-디히드로-1H-아이소크로멘-1-온;
(3R)-3-메틸-6-[(3R,9aS)-8-{[2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-일]카르보닐}옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]-3,4-디히드로-1H-아이소크로멘-1-온;
(3S)-3-메틸-6-[(3R,9aS)-8-{[2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-일]카르보닐}옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]-3,4-디히드로-1H-아이소크로멘-1-온;
6-플루오로-2-메틸-3-[(3S,9aR)-8-{[(5S)-2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-5-일]카르보닐}옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴;
6-플루오로-2-메틸-3-[(3R,9aR)-8-{[3-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[c]피리딘-7-일]카르보닐}옥타히드로-2H-피라지노[1,2-a]피라진-3-일]벤조니트릴;
6-플루오로-2-메틸-3-[(3S,9aR)-8-{[3-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[c]피리딘-7-일]카르보닐}옥타히드로-2H-피라지노[1,2-a]피라진-3-일]벤조니트릴;
6-플루오로-2-메틸-3-[(3S,9aS)-8-{[2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-5-일]카르보닐}옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]벤조니트릴;
(3S)-3-메틸-6-[(3R,9aR)-8-{[2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-일]카르보닐}옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]-3,4-디히드로-1H-아이소크로멘-1-온;
또는 (3S)-3-메틸-6-[(3S,9aR)-8-{[2-(1H-테트라졸-1-일)-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[b]피리딘-5-일]카르보닐}옥타히드로피라지노[2,1-c][1,4]옥사진-3-일]-3,4-디히드로-1H-아이소크로멘-1-온
인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염. - 제1항의 화합물 및 제약상 허용되는 담체로 구성되는 제약 조성물.
- 제12항에 있어서, 로사르탄, 발사르탄, 칸데사르탄, 올메사르탄, 텔메사르탄, 에프로사르탄, 이르베사르탄, 암로디핀, 알라세프릴, 베나제프릴, 캅토프릴, 세로나프릴, 실라자프릴, 델라프릴, 에날라프릴, 에날라프릴라트, 포시노프릴, 이미다프릴, 리시노프릴, 모벨티프릴, 페린도프릴, 퀴나프릴, 라미프릴, 스피라프릴, 테모카프릴 또는 트란돌라프릴, 아밀로리드, 스피로노락톤, 에플러라논 또는 트리암테렌으로부터 선택되는 추가의 활성제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 추가로 포함하는 제약 조성물.
- 제1항의 화합물을 ROMK의 억제를 필요로 하는 환자에게 ROMK-억제 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, ROMK를 억제하는 방법.
- 제1항의 화합물을 이뇨, 나트륨이뇨 또는 둘 다의 유발을 필요로 하는 환자에게 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 이뇨, 나트륨이뇨 또는 둘 다를 유발하는 방법.
- 제1항의 화합물을 고혈압, 급성 심부전, 만성 심부전, 폐동맥 고혈압, 심혈관 질환, 당뇨병, 내피 기능장애, 확장기 기능장애, 안정형 및 불안정형 협심증, 혈전증, 재협착, 심근경색, 졸중, 심기능부전, 폐 고긴장증, 아테롬성동맥경화증, 간 경변증, 복수, 자간전증, 뇌 부종, 신병증, 신증후군, 급성 신장 기능부전, 만성 신장 질환, 고칼슘혈증, 덴트병, 메니에르병 또는 부종성 상태로부터 선택되는 하나 이상의 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에게 적절한 경우 치료 또는 예방 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 상기 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
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