CN103874493A - 肾外髓质钾通道的抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供式Ia的化合物

Description

肾外髓质钾通道的抑制剂
发明背景
肾外髓质钾(ROMK)通道(Kir1.1)(参见例如Ho, K.等人, Cloning and expression of an inwardly rectifying ATP-regulated potassium channel, Nature, 1993, 362(6415): p. 31-8.1, 2；和Shuck, M.E.等人, Cloning and characterization of multiple forms of the human kidney ROM-K potassium channel, J Biol Chem, 1994, 269(39): 第24261-70页)是在肾的两个区域：髓袢升支粗段(TALH)和皮质集合管(CCD)中表达的钾通道的内向整流家族的成员(参见Hebert, S.C.等人, Molecular diversity and regulation of renal potassium channels, Physiol Rev, 2005, 85(1): 第319-713页)。在TALH处，ROMK参与穿过腔膜的钾再循环，这对Na+/K+/2Cl-共转运子的功能至关重要，是肾单位的这一部分中的盐再摄取的速率决定步骤。在CCD处，ROMK提供钾分泌路径，其通过阿米洛利-敏感的钠通道与钠摄取紧密偶联(参见Reinalter, S.C.等人, Pharmacotyping of hypokalaemic salt-losing tubular disorders, Acta Physiol Scand, 2004, 181(4): 第513-21页；和Wang, W., Renal potassium channels: recent developments, Curr Opin Nephrol Hypertens, 2004, 13(5): 第549-55页)。ROMK通道的选择性抑制剂(在本文中也称作ROMK的抑制剂或ROMK抑制剂)预计代表与目前使用的临床药剂相比具有潜在降低的不利(即低-或高钾血、糖尿病的新发病、血脂异常)的用于治疗高血压和可获益于利尿剂治疗的其它症状的新型利尿剂(参见Lifton, R.P., A.G. Gharavi, 和D.S. Geller, Molecular mechanisms of human hypertension, Cell, 2001, 104(4): 第545-56页)。人类遗传学(Ji, W.等人, Rare independent mutations in renal salt handling genes contribute to blood pressure variation, Nat Genet, 2008, 40(5): 第592-9页；和Tobin, M.D.等人, Common variants in genes underlying monogenic hypertension and hypotension and blood pressure in the general population, Hypertension, 2008, 51(6): 第1658-64页)和啮齿动物中的ROMK基因切除(参见Lorenz, J.N.等人, Impaired renal NaCl absorption in mice lacking the ROMK potassium channel, a model for type II Bartter's syndrome, J Biol Chem, 2002, 277(40): 第37871-80页和Lu, M.等人, Absence of small conductance K+ channel (SK) activity in apical membranes of thick ascending limb and cortical collecting duct in ROMK (Bartter's) knockout mice, J Biol Chem, 2002, 277(40): 第37881-7页)支持这些预期。就我们所知，由Lewis, L.M.等人, High-Throughput Screening Reveals a Small-Molecule Inhibitor of the Renal Outer Medullary Potassium Channel and Kir7.1, Mol Pharmacol, 2009, 76(5): 第1094–1103页中描述的在Vanderbilt University进行的研究工作报道了最初的小分子选择性ROMK抑制剂(包括VU590)。化合物VU591后来报道于Bhave, G.等人, Development of a Selective Small-Molecule Inhibitor of Kir1.1,the Renal Outer Medullary Potassium Channel, Mol Pharmacol, 2011, 79(1), 第42–50页，其文本指出，“ROMK (Kir1.1)是一类新型袢利尿剂的推定药物靶点，其可以降低血压而不引起低钾血症。”
Figure 25219DEST_PATH_IMAGE001
然而， ROMK的选择性小分子抑制剂的持续发现对于开发高血压和相关病症的新治疗仍然是需要的。本发明的式Ia化合物是ROMK通道的选择性抑制剂，并且可以用于治疗高血压、心脏衰竭和其中用利尿剂或促尿钠排泄剂治疗是有益的其它病况。
发明概述
本发明提供了式Ia的化合物
及其药学可接受的盐。式Ia的化合物是ROMK(Kir1.1)通道的抑制剂。因此，式Ia的化合物可以用于一种或多种疾病状态的治疗、抑制或改进的方法中，所述一种或多种疾病状态可得益于ROMK的抑制。本发明的化合物可用于治疗方法，所述方法包括向需要利尿剂和/或促尿钠排泄剂的患者施用治疗或预防有效量的式Ia的化合物。因此，式Ia的化合物可以是用于治疗、预防、或治疗和预防医疗病况，包括但不限于，心血管病诸如高血压、心力衰竭和与过量的盐和水潴留有关的病况的有价值的药物活性化合物。本发明的化合物可进一步与其它治疗有效剂，包括但不限于，可用于治疗高血压、心力衰竭和与过量的盐和水潴留有关的病况的其它药物的组合使用。本发明还涉及制备式Ia的化合物的方法和包含式Ia的化合物的药物组合物。从本文所含的描述中将明显看出本发明的这些和其它方面。
发明详述
本发明涉及具有结构式 Ia的化合物：
Figure 282949DEST_PATH_IMAGE003
及其药学可接受的盐，其中：
Z 是
Figure 740475DEST_PATH_IMAGE004
R 1  是
Figure 617164DEST_PATH_IMAGE005
其中，***表明连接至式Ia中的羰基碳且**表示连接至式Ia中的四唑基环；
X是O、NH或S；
m是选自1或2的整数；
n是选自1或2的整数；
X 1 、X 2  和X 3 各自独立地选自C(R7) 或N，条件是X1、X2 和X3中的至少一个必须是N且X1、X2 和X3中的至多两个是N；
R a 是–CN；
R b 是–H 或-C1-6烷基；
R 2 是–H、–F、-Cl、-C1-6烷基、-C3-6环烷基或-OC1-6烷基；
R 3 是–H、-F、-Cl、-CN、-C1-6烷基、-C3-6环烷基或–OC1-6烷基；
R 4 是-F、-Cl、-CN、-C1-6烷基、-C3-6环烷基、–OC1-4烷基或N-四唑基；
或者R 3  和R 4 与它们所连接的苯环中的碳原子连接在一起形成：
Figure 439627DEST_PATH_IMAGE006
其中 R是–H 或–C1-4烷基；
R 5 是–H、-Cl、-F、-CN、-C1-4烷基、-C3-6环烷基或-OC1-4烷基；
条件是当R 3 和R 4  不连接在一起时，则R 3 、R 4 或R 5 中的一个且仅仅一个是–CN；
R 6 是–H 或- C1-4烷基；且
R 7 是–H、-F、-Cl 或- C1-4烷基。
在本发明的一个实施方案中是具有结构式I的式Ia的化合物：
Figure 768977DEST_PATH_IMAGE007
及其药学可接受的盐，其中变量X、m、n、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7的每一个和其中所有其它变量如式Ia中所定义。
在实施方案A中是式Ia或I的化合物及其药学可接受的盐，其中：
X是O、NH 或S；
R 1 是
其中，***表示连接至式Ia中的羰基碳且**表示连接至式Ia中的四唑基环；
m是选自1或2的整数；
n是选自1或2的整数；
X 1 、X 2  和X 3 各自独立地选自CH或N，条件是X1、X2 和X3中的至少一个必须是N且X1、X2 和X3中的至多两个是N；
当式Ia中Z是噻吩基时，则R a  是–CN, 且R b  是 –H 或-C1-3烷基，并且更特别地R b 为-CH3；
R 2 是–H 或–F；
R 3 是–H、-F、-CN 或-OCH3；
R 4 是-F、-CN 或-OCH3；
或者R 3 和R 4 与它们所连接的苯环中的碳原子连接在一起形成：
Figure 262854DEST_PATH_IMAGE009
其中R是–H 或-CH3；
R 5 是–H、-Cl、-F、-CN、-CH3、-CH2CH3、环丙基或-OCH3；
条件是当R 3 和R 4  不连接在一起时，则R 3 、R 4 或R 5 中的一个且仅仅一个是–CN；且进一步条件是当R 3 和R 4  连接在一起时，则R 5 是-H、-Cl、-F、-CH3或-CH2CH3；
R 6 是–H 或-C1-4烷基；且
R 7 是–H、-F、-Cl 或-C1-4烷基。
本发明进一步涉及具有结构式II的式Ia或I的化合物：
Figure 318535DEST_PATH_IMAGE010
及其药学可接受的盐，其中变量X、R1、R3、R4、R5中的每一个和其中所有其它变量如式Ia中所定义。式II范围内的化合物和其盐包括如下化合物和盐，其中：
X是O 或NH；
R 1  是：
Figure 135181DEST_PATH_IMAGE011
其中，***表示连接至式Ia中的羰基碳 且**表示连接至式Ia中的四唑基环；和
R 3 是–F, R 4 是-CN 且R 5 是-CH3；或
R 3  和R 4 与它们所连接的苯环中的碳原子连接在一起形成：
Figure 872193DEST_PATH_IMAGE012
其中 R是–H 或-CH3，且 R 5 是–H。
本发明进一步涉及具有结构式III的式Ia、I 或II的化合物：
及其药学可接受的盐，其中R2、R3、R4、和R5和其中所有其它变量如式Ia中所定义。
在本发明的一个实施方案中是式Ia、式I、实施方案A或式 II的化合物，其中X 是 O。在另一个实施方案中是式Ia、式I、实施方案A或式 II的化合物，其中X 是 NH。在另一个实施方案中是式Ia、式I、实施方案A或式 II的化合物，其中X 是 S。
在一个实施方案中是式Ia、式I、实施方案A或式 II的化合物，其中R 1  是 ：
Figure 505049DEST_PATH_IMAGE014
在另一个实施方案中是式Ia、式I、实施方案A或式 II的化合物，其中R 1  是 ：
Figure 808991DEST_PATH_IMAGE015
。
在另一个实施方案中是式Ia、式I、实施方案A或式 II的化合物，其中R 1  是 ：
Figure 84115DEST_PATH_IMAGE016
。
在另一个实施方案中是式Ia、式I、实施方案A或式 II的化合物，其中R 1  是 ：
Figure 291368DEST_PATH_IMAGE017
其中 n是1或2，并且更特别是 
Figure 626534DEST_PATH_IMAGE018
。
在另一个实施方案中是式Ia、式I、实施方案A或式 II的化合物，其中R 1  是 ：
Figure 417773DEST_PATH_IMAGE019
。
在另一个实施方案中是式Ia、式I、实施方案A或式 II的化合物，其中R 1  是 ：
Figure 496587DEST_PATH_IMAGE020
。
在一个实施方案中是式Ia、式I或实施方案A的化合物，其中m是 1。在另一个实施方案中是式Ia、式I或实施方案A的化合物，其中m是2。
在一个实施方案中是式Ia、式I、实施方案A或式 II的化合物，其中n 是 1。在另一个实施方案中是式I、实施方案A或式II的化合物，其中 n是 2。在一类这种实施方案中是其中m 和n都是1的化合物。
在另一个实施方案中是式Ia、式I、实施方案A、式 II或式III的化合物，其中R 2  是 –H 或-F；R 3 是 –H、-F、-CN 或-OCH3；R 4 是 -F、-CN 或-OCH3；且R 5  是 –H、-Cl、-F、-CN、-CH3、-CH2CH3、环丙基或-OCH3；条件是R 3 、R 4  或R 5 中的一个且仅仅一个是-CN。在一类这种实施方案中是其中R 3  或R 4 中的一个是–CN的化合物。在这种实施方案的子类中是其中 R 4 是-CN的化合物。在这种实施方案的进一步子类中是其中 R 2  是 –H；R 3 是 -F；R 4 是 -CN；且R 5  是 -CH3的化合物。
在一个实施方案中是式Ia、式I、实施方案A、式 II或式III的化合物，其中R 3  和R 4 与它们所连接的苯环中的碳原子连接在一起形成：
Figure 56881DEST_PATH_IMAGE021
其中 R 是 –H 或-CH3；R 2  是 –H；且R 5  是 –H、-Cl、-F、-CN、-C1-4烷基、-C3-6环烷基或-OC1-4烷基。在一类这种实施方案中是其中R3 和R4 连接形成 5元环且R5 是 –H、-CH3 或–CH2CH3的化合物。在另一类这种实施方案中是其中R 3  和R 4  连接形成 6元环且R 5  是 –H 或–F的化合物。
在一个实施方案中是式Ia、式I或实施方案A的化合物，其中R 6  是–H。在另一个实施方案中是式Ia或式I的化合物，其中R 6  是甲基、乙基、-C3烷基或-C4烷基。
在一个实施方案中是式Ia、式I、实施方案A或式 II的化合物，其中R 7  是–H。在另一个实施方案中是式Ia、式I、实施方案A或式II的化合物，其中R 7  是–F、-Cl、甲基或乙基、-C3烷基或-C4烷基，并且更特别是 –F、-Cl、甲基或乙基。
在一个实施方案中是式Ia和实施方案A的化合物，其中R b  是 -CH3。
上述所有结构式、实施方案A和其它实施方案包括其中定义的化合物的药学可接受的盐。
如本文所用，除非另有指明，“烷基”意在包括具有规定的碳原子数的支链和直链饱和脂族烃基。在本说明书通篇中使用烷基的常用缩写。例如，术语“C1-6烷基”(或“C1-C6烷基”)是指具有规定的碳原子数的直链或支链烷基，包括所有异构体，并包括所有己基和戊基异构体以及正-、异-、仲-和叔-丁基(丁基、仲-丁基、异-丁基、叔-丁基；Bu =丁基)、正-和异-丙基(Pr =丙基)、乙基(Et)和甲基(Me)。
“环烷基”是具有指定碳原子数的环化烷基环。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
除非明确地另行描绘或描述，结构式中用“浮动”键描绘的变量，诸如R2允许在变量所连接的环中的任何可用碳原子上。
本发明包括式Ia的化合物的所有立体异构形式。式Ia的化合物中存在的不对称中心可以都彼此独立地具有(R)或(S)构型。当连向手性碳的键在本发明的结构式中被描绘为直线时，或当列举的化合物名称不含手性碳的手性名称时，应当理解的是，该式中或名称包括手性碳的(R)和(S)构型两者和因此包括它们的全部对映异构体和混合物。在获得此类立体异构体或混合物的实施例中可能规定具体立体异构体或其混合物的制造，但这决不限制在本发明的范围内包括所有立体异构体及其混合物。
本发明包括所有可能的对映异构体和非对映异构体和两种或更多种立体异构体的混合物，例如对映异构体和/或非对映异构体的所有比率的混合物。因此，对映异构体是对映异构体纯的形式(左旋和右旋对映体形式)、外消旋物形式和两种对映异构体的所有比率的混合物形式的本发明的主题。在顺式/反式异构的情况下，本发明包括顺式形式和反式形式以及这些形式的所有比率的混合物。如果需要，可以通过经常规方法(例如层析分离或结晶、使用立体化学一致的起始材料进行合成或立体有择合成)分离混合物来进行独立的立体异构体的制备。任选地，可以在分离立体异构体之前进行衍生化。可以在式Ia的化合物合成过程中的中间步骤中进行立体异构体的混合物的分离，或其可以在最终外消旋产物上进行。可以通过结晶产物或结晶中间体(如果必要，其用含有已知构型的手性中心的试剂衍生化)的X-射线晶体学测定绝对立体化学。如果本发明的化合物能够互变异构化，所有独立的互变异构体及其混合物都包含在本发明的范围内。本发明包括所有这样的异构体，以及此类外消旋物、对映异构体、非对映异构体和互变异构体的盐、溶剂合物(其包括水合物)和溶剂化盐，和它们的混合物。
本发明的化合物具有来自式Ia的中心稠合双环的至少两个手性(即，不对称)中心，如由实施例A中每个手性中心的星号所示。还有，在式Ia中的羰基碳的α位的R1(如式Ia中定义)的非芳族环中的碳是手性中心，并且在本文中被简称为“氮杂-茚满”手性中心或其类似意义的变体。氮杂-茚满手性中心的说明性示例由实施例B中的星号表示：
Figure 890845DEST_PATH_IMAGE022
。
如本文中所使用的术语氮杂-茚满可以是由式Ia中的R1定义涵盖的任何结构，包括其中非芳族环是5或6元并且其中稠合芳族环含有一个或两个氮的任何结构。在一些实施例中，诸如实施例2A和2B中，进行立体化学指定，其将每种分离的异构体鉴定为在氮杂-茚满手性中心为S或R。在一些实施例中，并没有进行指定，但是由氮杂-茚满手性中心产生的异构体仍然进行分离，且被称为氮杂-茚满非对映异构体或表达化合物中该特定手性中心的类似语言。
额外的手性中心可以取决于分子上的各种取代基的性质而存在。在实施例中显示的一些化学结构中，使用星号来鉴定一个或多个手性中心。
本文中提到式Ia的化合物涵盖式I 、II和III的化合物及其所有实施方案。在将本发明的化合物描述为特定式或实施方案，例如式Ia、I、II 或III或其实施方案，或本文中描述或要求保护的任何其它通用结构式或具体化合物时，意在包括落在该式或实施方案的范围内的具体化合物，包括其盐，特别是药学可接受的盐、此类化合物的溶剂合物及其溶剂化盐形式，其中除非另行规定，这些形式是可行的。
在式Ia的化合物中，原子可能表现出它们的天然同位素丰度，或一个或多个原子可能人为富集成具有相同原子序数但原子质量或质量数不同于自然界中主要发现的原子质量或质量数的特定同位素。本发明意在包括式Ia的化合物的所有合适的同位素变体。例如，氢(H)的不同同位素形式包括氕(1H)和氘(2H)。氕是自然界中发现的主要氢同位素。富集氘可提供某些治疗优点，如提高体内半衰期或降低剂量要求，或可提供可用作生物样品的表征标样的化合物。无需过度实验，可通过本领域技术人员公知的常规技术或通过与本文方案和实施例中描述的那些类似的方法使用适当的同位素富集试剂和/或中间体制备式Ia内的同位素富集化合物。
当式Ia的化合物含有一个或多个酸性或碱性基团时，本发明还包括相应的药学可接受的盐。因此，可以根据本发明使用含有酸性基团的式Ia的化合物，例如，作为碱金属盐、碱土金属盐或作为铵盐。此类盐的实例包括但不限于，钠盐、钾盐、钙盐、镁盐或与氨或有机胺，如乙胺、乙醇胺、三乙醇胺或氨基酸的盐。含有一个或多个碱性基团，即可以质子化的基团的式Ia的化合物可根据本发明以它们的与无机或有机酸的酸加成盐形式使用，例如但不限于，与氯化氢、溴化氢、磷酸、硫酸、硝酸、苯磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、草酸、乙酸、三氟乙酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、甲酸、丙酸、特戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、丁二酸、庚二酸、富马酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯基丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、异烟酸、柠檬酸、己二酸等的盐。如果式Ia的化合物在分子中同时含有酸性和碱性基团，本发明除所提到的盐形式外还包括内盐或内铵盐(两性离子)。可以由式Ia的化合物通过本领域技术人员已知的常规方法，例如通过在溶剂或分散剂中与有机或无机酸或碱合并，或通过与其它盐的阴离子交换或阳离子交换获得盐。本发明还包括式Ia的化合物的所有盐，其由于低生理学相容性而不直接适用于药物，但可用作例如化学反应或制备药学可接受的盐用的中间体。
此外，本发明的化合物可以以非晶形式和/或一种或多种结晶形式存在，因此式Ia的化合物的所有非晶和结晶形式及其混合物都旨在包含在本发明的范围内。此外，本发明的一些化合物可以与水形成溶剂合物(即水合物)或与普通有机溶剂形成溶剂合物。本化合物的这样的溶剂合物和水合物，特别是药学可接受的溶剂合物和水合物同样与未溶剂化和无水的形式一起包含在本发明的范围内。
体内转化成在本发明的范围内的化合物的本发明的化合物的任何药学可接受的前药变型也在本发明的范围内。例如，可任选通过可用羧酸基的酯化或通过在化合物中的可用羟基上形成酯来制造酯。类似地，可以制造不稳定酰胺。可以制备本发明的化合物的药学可接受的酯或酰胺以充当前药，其可特别在体内水解回酸(或-COO-，取决于在其中发生转化的流体或组织的pH)或羟基形式，因此包含在本发明的范围内。药学可接受的前药变型的实例包括但不限于，-C1-6烷基酯和被苯基酯取代的-C1-6烷基。
因此，除非另行规定，在本文中描述和要求保护的通用结构式、实施方案和具体化合物内的化合物包括它们的盐、所有可能的立体异构体和互变异构体、物理形式(例如非晶和结晶形式)、溶剂合物和水合物形式和这些形式的任何组合，以及其盐、其前药形式及其前药形式的盐，只要这些形式可行。
本发明的式Ia的化合物是ROMK抑制剂，因此可以用作利尿剂和/或促尿钠排泄剂。ROMK抑制剂可以用来有助于增加排尿和增加尿量，以及防止或降低肾中的钠再吸收，导致提高钠和水的排泄。因此，该化合物可以用于治疗或预防或治疗和预防获益于提高的从体内排泄水和钠的病症。因此，本发明的化合物可以用于抑制ROMK的方法，包括以ROMK抑制有效量将式Ia的化合物施用于需要其的患者。可以例如在下述铊通量测定和/或电生理测定中检查式Ia的化合物对ROMK的抑制。此外，本发明还涉及用式Ia的化合物或其盐验证体外测定，例如但不限于本文所述的铊通量和电生理学测定的用途。
本发明的化合物可以用于引起利尿、促尿钠排泄或这两者的方法，所述方法包括以治疗有效量将式Ia的化合物施用于需要其的患者。因此，本发明式Ia的化合物可用于治疗、预防或降低获益于提高的水和钠排泄的医学病况，诸如但不限于高血压、心力衰竭(急性和慢性，也称作充血性心力衰竭)和/或与过量的盐和水潴留相关的其它病况中的一种或多种的发生危险的方法中。此外，式Ia的化合物可以用于治疗、预防或降低一种或多种病症，诸如肺动脉高血压(PAH)、心血管病、糖尿病、内皮功能障碍、舒张期功能障碍、稳定型和不稳定型心绞痛、血栓形成、再狭窄、心肌梗死、中风、心功能不全、肺张力过强、动脉粥样硬化、肝硬化、腹水、子痫前期、脑水肿、肾病、肾病综合征、急性和慢性肾功能不全(也称为慢性肾病，或更通常称为肾功能受损)、高钙血症、Dent病、美尼尔氏病、水肿状态和利尿剂或促尿钠排泄或这两者对其具有治疗或预防益处的其它病况的发生危险的方法中。本发明的化合物可施用于患有或处于患有利尿剂、或促尿钠排泄或这两者对其具有治疗或预防益处的一种或多种病况(如本文描述的那些)的风险中的患者。
式Ia的化合物相比于目前使用的临床药剂可以潜在地减少负担(例如，低或高钾血症、糖尿病的新发作、血脂异常等)。还有，化合物可以具有降低的利尿耐受性的风险，这可以是长期使用袢利尿剂的一个问题。
通常，作为ROMK抑制剂的化合物可以被确定为是在测试时在至少一个下列测定法中具有5 μM或更小，优选1 μM或更小，更优选0.25 μM或更小的IC50的那些化合物：1) 铊通量测定，2) 电生理学测定。在下文中更详细描述这些测定。
待施用的化合物的剂量取决于个案，并照惯例根据个体情况调节以实现最佳作用。因此，其取决于待治疗的病症的性质和严重性，也取决于待治疗的人或动物的性别、年龄、体重和个体响应，取决于所用化合物的效力和作用持续时间，取决于该治疗是急性还是慢性还是预防性的，或取决于除式Ia的化合物外是否施用其它活性化合物。为了确定预防、逆转或阻止病况进展所需的治疗有效或预防有效剂量，这些因素的考虑完全在普通技术的临床医师的技术范围内。预计该化合物在每日基础上长期给药适合治疗或预防与患者相关的医学病况的时长，包括持续数天、数月、数年或患者一生的治疗过程。
通常，大约0.001至100 mg/kg，优选0.001至30 mg/kg，特别是0.001至10 mg/kg(在每种情况下为mg/kg体重)的日剂量适合给药于体重大约75公斤的成年人以获得所需结果。该日剂量优选单剂给药，或可分成数个，例如2个、3个或4个分剂量并基于每日计可以是例如但不限于，0.1 mg、0.25 mg、0.5 mg、0.75 mg、1 mg、1.25 mg、2 mg、2.5 mg、5 mg、10 mg、20 mg、40 mg、50 mg、75 mg、100 mg、125 mg、150 mg、175 mg、200 mg等。在一些情况下，根据化合物的效力或个体响应，可能必须向上或向下偏离给定的日剂量。此外，该化合物可以配制成速释或经调节的释放，如延长或受控释放。
术语“患者”包括使用本活性剂预防或治疗医学病况的动物，优选哺乳动物，尤其是人。对患者给药包括自身给药和由另一人向患者给药。患者可能需要治疗现有疾病或医学病况，或可能需要预防疗法以预防或降低发生所述疾病或医学病况或由疾病或医学病况发生长期并发症的危险。
术语治疗有效量意在表示引起研究人员、兽医、医生或其它临床医师追求的组织、系统、动物或人的生物学或医学响应的药物或药剂的量。预防有效量意在表示预防或降低研究人员、兽医、医生或其它临床医师追求在组织、系统、动物或人中预防生物学或医学事件的发生危险的药物量。如本文中所使用，术语“预防”(“preventing”、“prevention”、 “prophylactic”)和这些术语的变体是指尚未存在于患者中病况的临床症状出现之前将化合物施用于患者。应当理解为，具体的日剂量可以同时是例如用于治疗高血压的治疗有效量和例如用于预防或降低心肌梗死危险或预防和降低与高血压相关的并发症危险的预防有效量。
在本发明的治疗方法中，该ROMK抑制剂可以在含有常规无毒药学可接受载体、辅助剂和赋形剂的剂量单位制剂中通过任何合适的给药途径，例如口服、非肠道或经直肠给药。本文所用的术语非肠道包括皮下注射、静脉内(IV)、肌肉内、胸骨内注射或输液技术。对于慢性适应症诸如高血压或慢性心脏衰竭的治疗，口服制剂是优选的，特别是固体口服剂量单元，诸如丸剂、片剂或胶囊剂，更特别是片剂。对于急性治疗，例如对于急性心脏衰竭的治疗，IV给药是优选的。
本发明还提供了包括式Ia的化合物和药学可接受的载体(包括一种或多种赋形剂或添加剂)的药物组合物。赋形剂或添加剂是用于配制活性药物成分的惰性物质。为了口服使用，含有活性成分的本发明的药物组合物可以是如丸剂、片剂、糖锭、锭剂、水或油悬浮液、可分散粉剂或颗粒、乳剂、硬或软胶囊、或糖浆或酏剂之类的形式。口服使用的组合物可以根据本领域已知的制造药物组合物的任何方法制备。片剂含有与适合制造片剂的无毒药学可接受的赋形剂混合的活性成分。赋形剂可以是例如惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、甘露糖醇、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，例如，玉米淀粉或藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶和润滑剂，例如，硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
药物组合物还可含有其它常规添加剂，例如但不限于，润湿剂、稳定剂、乳化剂、分散剂、防腐剂、增甜剂、着色剂、调味剂、香料、增稠剂、缓冲物质、溶剂、增溶剂、实现药物持久(depot)效果的试剂、改变渗透压的盐、包衣剂或抗氧化剂。
可以使用口服速释和时控缓释剂型，以及肠溶包衣口服剂型。片剂可以未包衣或它们可通过已知技术包衣以起到美观作用，掩蔽味道或用于其它原因。包衣也可用于延迟在胃肠道中的崩解和吸收并由此提供在更长时期内的持续作用。例如，可以使用延时材料，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
口服用制剂也可以呈硬明胶胶囊形式，其中活性成分与惰性固体稀释剂，例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或呈软明胶胶囊形式，其中活性成分与水或混溶溶剂，如丙二醇、PEG和乙醇，或油介质，例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。
水悬浮液含有与适合制造水悬浮液的赋形剂混合的活性材料。可通过将活性成分悬浮在植物油，例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油，或矿物油，如液体石蜡中来配制油悬浮液。油悬浮液可含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加增甜剂和调味剂以提供可口的口服制剂。可通过添加抗氧化剂，如抗坏血酸来保存这些组合物。可以用增甜剂，例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖配制糖浆和酏剂。
本发明还包括制备药物组合物的方法，包括将式Ia的化合物与药学可接受的载体合并。还包括通过将式Ia的化合物与药学可接受的载体合并制成的药物组合物。此外，治疗有效量的本发明的化合物可用于制备在本文所述的剂量下可用于抑制ROMK、用于引起利尿和/或促尿钠排泄和/或用于治疗、预防或降低本文所述的任何医学病况的危险的药物。
式Ia的活性化合物和/或其可药学可接受的盐在该药物组合物中的量可以例如但不限于，基于游离酸/游离碱重量计每剂0.1至200mg，特别地0.1至100 mg，更特别地0.1至50 mg，但根据药物组合物的类型、活性成分的效力和/或治疗的医疗状况，其也可以更低或更高。基于游离酸/游离碱重量计，药物组合物通常包含0.5至90重量%活性化合物。
式Ia的化合物抑制ROMK。由于这种性质，除用作人用药和兽药中的制药活性化合物外，它们还可用作科学工具或用作生物化学研究(其中期望对ROMK的这种作用)的辅助，还可用于诊断用途，例如在细胞样品或组织样品的体外诊断中。式Ia的化合物也可用作制备其它制药活性化合物的中间体。
一种或多种额外药物活性剂可以与式Ia的化合物联合给药。一种或多种额外活性剂是指不同于式Ia的化合物且是在体内具有活性的药物活性剂的化合物，当商购或其他化学方式可得时，其包括在施用后转换为药学活性形式的前药，并且还包括所述额外活性剂的游离酸、游离碱和药学可接受的盐。通常，任何合适的额外活性剂，包括但不限于，抗高血压药、额外的利尿剂、抗动脉粥样硬化药，诸如调脂化合物、抗糖尿病药和/或抗肥胖药可以与式Ia的化合物以任何组合用在单剂制剂(固定剂量药物组合)中，或可以在一个或多个单独制剂中给于患者以便活性剂同时或相继给药(单独活性剂共同给药)。可用的额外活性剂的实例包括但不限于血管紧张素转化酶抑制剂(例如，阿拉普利、贝那普利、卡托普利、西罗普利、西拉普利、地拉普利、依那普利、依那普利拉、福辛普利、咪达普利、赖诺普利、莫维普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、螺普利、替莫普利或群多普利)、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，也称作血管紧张素受体阻滞剂或ARB(例如氯沙坦，即COZAAR?、缬沙坦、坎地沙坦、奥美沙坦、替米沙坦(telmesartan)、依普沙坦、厄贝沙坦和与氢氯噻嗪联合使用的任何这些药物，诸如HYZAAR?)；利尿剂，例如氢氯噻嗪(HCTZ)；保钾利尿剂，诸如盐酸阿米洛利、安体舒通、依普利酮(epleranone)、氨苯蝶啶，各自组合或不组合HCTZ; 中性内肽酶抑制剂(例如塞奥芬和磷酰二肽)、醛固酮拮抗剂；醛固酮合酶抑制剂; 肾素抑制剂(例如二-和三肽的脲衍生物(参见美国专利号5,116,835)、氨基酸和衍生物(美国专利5,095,119和5,104,869)、通过非肽键连接的氨基酸链(美国专利5,114,937)、二-和三-肽衍生物(美国专利5,106,835)、肽基氨基二醇(美国专利5,063,208和4,845,079)和肽基β-氨基酰基氨基二醇氨基甲酸酯(美国专利5,089,471)；以及如下列美国专利5,071,837；5,064,965；5,063,207；5,036,054；5,036,053；5,034,512和4,894,437中公开的各种其它肽类似物和小分子肾素抑制剂(包括二醇磺酰胺和亚磺酰(美国专利5,098,924)、N-吗啉代衍生物(美国专利5,055,466)、N-杂环醇(美国专利4,885,292)和吡咯咪唑酮(pyrolimidazolones)(美国专利5,075,451)；以及胃酶抑素衍生物(美国专利4,980,283)和含statone的肽的氟-和氯-衍生物(美国专利5,066,643)；enalkrein; RO 42-5892; A 65317; CP 80794; ES 1005; ES 8891; SQ 34017;阿利克仑(2(S),4(S),5(S),7(S)-N-(2-氨基甲酰基-2-甲基丙基)-5-氨基-4-羟基-2,7-二异丙基-8-[4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)-苯基]-辛酰胺半富马酸盐)、SPP600、SPP630和SPP635、内皮素受体拮抗剂、血管扩张剂(例如硝普盐)、钙通道阻滞剂(例如氨氯地平、硝苯地平、维拉帕米、地尔硫?、非洛地平、加洛帕米、尼鲁地平、尼莫地平、尼卡地平)；钾通道活化剂(例如尼可地尔、吡那地尔、克罗卡林、米诺地尔、aprilkalim、氯普唑仑)；交感神经阻滞剂、β-肾上腺素能阻断药(例如 醋丁洛尔，阿替洛尔，倍他洛尔，比索洛尔，卡维地洛，美托洛尔，美托洛尔酒石酸盐，纳多洛尔，普萘洛尔，索他洛尔，噻吗洛尔)；α肾上腺素能阻断药(例如doxazocin、prazocin或α甲基多巴)；中央α肾上腺素能激动剂；外周血管扩张剂(例如肼酞嗪)；降脂剂，例如HMG-CoA还原酶抑制剂，如辛伐他汀和洛伐他汀，其呈内酯前体药物形式作为ZOCOR?和MEVACOR?销售并且在施用后作为抑制剂起作用，和二羟基开环酸HMG-CoA还原酶抑制剂的药学可接受的盐，诸如阿托伐他汀（特别是以LIPITOR?销售的钙盐）、罗苏伐他汀（特别是以CRESTOR?销售的钙盐）、普伐他汀（特别是以PRAVACHOL?销售的钠盐）、和氟伐他汀（特别是以LESCOL?销售的钠盐）；胆固醇吸收抑制剂，诸如依泽替米贝(ZETIA?)和依泽替米贝与任何其它降脂剂的组合，诸如上述HMG-CoA还原酶抑制剂，和特别是与辛伐他汀(VYTORIN?)或与阿托伐他汀钙的组合；速释或控释形式的烟酸，特别是与DP拮抗剂组合的烟酸，诸如拉罗皮兰(laropiprant)(TREDAPTIVE?)和/或与HMG-CoA还原酶抑制剂组合的烟酸；速释或控释形式的烟酸，特别是与DP拮抗剂组合的烟酸，诸如拉罗皮兰(TREDAPTIVE?)和/或与HMG-CoA还原酶抑制剂组合的烟酸；烟酸受体激动剂，如阿昔莫司和阿昔呋喃以及烟酸受体部分激动剂；代谢改变剂，包括胰岛素增敏剂和用于治疗糖尿病的相关化合物，如双胍(例如二甲双胍)、氯茴苯酸类(例如瑞格列奈、那格列奈)、磺酰脲(例如氯磺丙脲、格列美脲、格列吡嗪、格列本脲、妥拉磺脲、甲苯磺丁脲)、噻唑烷二酮，也称作格列酮类(例如吡格列酮、罗格列酮)、α葡糖苷酶抑制剂(例如阿卡波糖、米格列醇)、二肽基肽酶抑制剂(例如西格列汀(JANUVIA?)、阿格列汀、维格列汀、沙格列汀、利拉利汀、度格列汀(dutogliptin)、吉格列汀)、麦角生物碱(例如溴隐亭)、联合药物，如JANUMET?(含二甲双胍的西他列汀)和可注射糖尿病药，如艾塞那肽和醋酸普兰林肽；或有益于预防或治疗上述疾病的其它药物，包括但不限于二氮嗪；且包括化学方式可得的上述活性剂的游离酸、游离碱和药学可接受的盐形式。
在实施例中描述了制备本发明的化合物的几种方法。原材料和中间体是购买的、由已知程序制备或如另外所示制备。如下方案还描述了式Ia化合物的一些经常应用的途径。在一些情况下，实施反应方案的步骤的顺序可能变化以促进反应或避免不需要的反应产物。
如方案1所示，通过适当取代的哌嗪1与结构2的羧酸偶联以形成酰胺而制备本发明的化合物。这可以通过许多化学家众所周知的方式，包括通过在HOBt和碱诸如三乙胺存在或不存在下使用EDC或通过各种其它酰胺偶联试剂诸如HATU来完成。
方案1
Figure 841484DEST_PATH_IMAGE023
哌嗪1可以根据方案2来制备。环氧化物3可以通过在溶剂诸如乙醇、DMSO或甲苯中加热而与适当保护的羟基烷基哌嗪4偶联，以得到二醇5(Nomura, Y. 等人.Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 1995, 43(2), 241-6)。加热可以通过常规热浴或通过微波照射。可以通过多种途径，包括通过在合适溶剂诸如苯或甲苯中与试剂氰基亚甲基三正丁基正膦加热而将二醇5环化以得到6或7元环6。加热可以通过常规热浴或通过微波照射。所得化合物6通常是顺式和反式异构体的混合物。然后可以去除保护基团(Greene, T.; Wuts, P. G. M. protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Inc., New York, NY 1991)。例如，当保护基团是如方案2中显示的Boc时，可以通过用酸诸如TFA或HCl处理而实现去除以得到哌嗪1A。或者，化合物6可以借助硅硅胶层析法或制备型高压液相色谱法采用手性柱来分离，以得到分离的顺式6 (顺式)和反式6(反式)异构体。纯顺式和反式异构体的保护基团可以通过用酸诸如TFA或HCl(在Boc基团的情况下)处理而去除，以得到作为纯顺式和反式异构体1A(顺式)和1A (反式)的哌嗪1A。如果采用羟基烷基哌嗪4的单一对映异构体，则可以获得单一对映异构体的顺式和反式异构体1A(顺式)和1A(反式)。
方案2
Figure 284841DEST_PATH_IMAGE024
保护的哌嗪6也可以根据方案3通过最初偶联羟基烷基哌嗪4与溴甲基酮(或氯甲基酮)7来制备，以得到半缩酮8。这通常在碱诸如三乙胺或二乙基异丙胺存在下完成。可以在酸催化剂诸如三氟乙酸存在下使用例如三乙基硅烷通过还原将所得半缩酮8直接转化为哌嗪1A。如果期望分离顺式和反式异构体，则可以使用例如Boc2O来安装保护基团诸如Boc，以得到中间体6，可以如方案2中所述将中间体6分离成顺式和反式异构体。或者，半缩酮8可以通过三个步骤顺序(涉及与甲磺酰氯和碱诸如三乙胺形成甲磺酸盐，随后在碱存在下去除)来还原，以得到烯醇醚9。烯醇醚9然后可以通过在催化剂诸如碳载钯存在下氢化而还原，以得到受保护的哌嗪6，哌嗪6可如方案2中所述被分离成顺式和反式异构体。然后可以如方案2中所述将这些转化为哌嗪中间体1A(顺式)和1A(反式)。
方案3
Figure 699642DEST_PATH_IMAGE025
或者，中间体1的亚类，哌嗪1B可以如方案4中所述制备。将中间体5的Boc保护基团(如方案2中所述制备)通过最初用酸诸如TFA或HCl处理，随后在碱诸如三乙胺的存在下与氯甲酸苄酯偶联，而转换至氨基甲酸苄酯(Cbz)基团。所得Cbz-哌嗪二醇5A通过与亚硫酰氯加热而转化成相应的二氯中间体；然后，将二氯化物在碘化钠的存在下与烯丙胺加热，以得到烯丙基取代的稠合(fised)哌嗪10。烯丙基基团可以以几种方式去除，包括通过在催化剂诸如四三苯基膦钯的存在下与1,3-二甲基嘧啶-2,4,6(1H,3H,5H)-三酮升温。然后将所示胺通过在胺诸如三乙胺的存在下用Boc2O处理而用叔丁氧基氨基甲酸酯基团重新保护，以提供通常作为顺式和反式异构体的混合物的中间体6B。顺式和反式异构体可以通过硅胶层析法或通过手性制备型HPLC如方案2中所述进行分离。如果从4的单一对映异构体制备中间体5(如方案2中所述)，则所得中间体6B(顺式)和6B(反式)也是单一异构体。或者，可以在较早阶段通过分离中间体10的顺式/反式异构体而进行顺式和反式异构体的分离。中间体6B(顺式)和6B(反式)的Cbz保护基团可以进行去除，例如，通过在催化剂诸如碳载钯的存在下的氢解作用来去除，以得到中间体1B (顺式)和1B(反式)。
方案4
Figure 642190DEST_PATH_IMAGE026
或者，中间体1的亚类(1C)可以根据方案5来制备。二醇5通过用甲磺酰氯、碱诸如三乙胺和催化剂诸如4-二甲基氨基吡啶处理来初始转化为它们相应的单甲磺酸盐。随后在溶剂诸如二甲亚砜(DMSO)中与硫代乙酸钾的反应提供了中间体11。然后将11的剩余羟基通过用(例如)亚硫酰氯处理，随后添加碱诸如吡啶，而转化为相应的氯代中间体。然后将所得氯代中间体用甲醇钠处理，以得到环化的硫化物6C。当所用的起始二醇5是单一异构体(从对映异构化纯的环氧化物3和对映异构化纯的羟基烷基哌嗪4 (方案2)开始)时，所得中间体6C可以作为单一异构体获得。或者，当采用外消旋环氧化物3和单一对映异构体羟基烷基哌嗪4时，所得中间体6C作为两种异构体(顺式和反式)的混合物获得，然后其可以通过硅胶层析法或通过手性制备型HPLC 而分离为单一异构体6C(顺式)和6C (反式)。然后可以通过用酸诸如TFA或HCl处理而实现氨基甲酸叔丁酯保护基团的去除，以提供哌嗪1C (顺式)和1C (反式)。
方案5
Figure 142442DEST_PATH_IMAGE027
中间体2 (在方案1中)可以根据2的结构以多种方法来制备；几种方法显示于下面的实验部分中。
环氧化物3可以通过各种方法来制备。一种方法由方案6描述。可以以多种方式将芳基或杂环卤化物(所示溴化物12)偶联以形成烯烃产物13，例如，在钯催化的偶联条件下通过Heck反应或通过与乙烯四氟硼酸盐的反应(Molander, G.; Luciana, A. Journal of Organic Chemistry, 2005, 70(10), 3950-3956)用适当的膦配体(Molander, G.; Brown, A. Journal of Organic Chemistry, 2006, 71(26), 9681-9686)来实现。然后将烯烃13通过几种方法，包括用间-氯过氧苯甲酸(Fringuelli, F.等人.Organic Preparations and Procedures International, 1989, 21(6), 757-761)处理而转化为相应的环氧化物3。
方案6
溴甲基酮7可以以各种方法来制备；一种途径描述于方案7中。根据该方案，芳基或杂环卤化物(所示溴化物12)可以在金属催化剂诸如PdCl2(PPh3)2的存在下与三丁基(1-乙氧基乙烯基)锡反应，以提供中间体乙烯醇醚。这随后在相同反应容器中用N-溴代琥珀酰亚胺 (NBS)和添加的四氢呋喃和水来处理，以提供溴甲基酮7。氯甲基酮可以类似地通过采用N-氯代琥珀酰亚胺代替N-溴代琥珀酰亚胺来制备。
方案7
Figure 97945DEST_PATH_IMAGE029
非对映异构体和对映异构体的独立合成或它们的层析分离可以通过本文公开的方法的适当改变如本领域已知地实现。通过晶体产物或衍生的晶体中间体，如果有必要，以及包含已知绝对立体化学的不对称中心的试剂的X射线晶体学确定它们的绝对立体化学。
可以适当地通过实施例中公开的程序的改变来制备主题化合物。起始材料可商业获得或通过已知程序或如所示进行制备。提供以下实施例仅仅为了进一步说明的目的，并不解释为对本公开发明进行限制。
在氮气或氩气下使用无水溶剂和试剂进行对水分或空气敏感的反应。通过通常用E. Merck预涂布TLC板、硅胶60F-254、层厚度0.25 mm进行的分析薄层层析法(TLC)或液相色谱-质谱法(LC-MS)测定反应进程。
通常，所用分析型LC-MS系统由具有在正离子检测模式下的电喷雾电离的Waters ZQ平台以及具有自动取样器的Agilent 1100系列HPLC组成。柱通常是Water Xterra MS C18, 3.0 × 50 mm, 5 μm。流速为1 mL/min，且注射体积为10 μL。UV检测在210–400 nm范围内。流动相由溶剂A(水+0.06% TFA)和溶剂B(乙腈+0.05% TFA)构成，梯度为100%溶剂A 0.7 min，经3.75 min变成100%溶剂B，保持1.1 min，随后经0.2 min回到100%溶剂A。
通常使用质谱定向系统进行制备型HPLC纯化。通常它们在用配置LC-MS System的Waters Chromatography Workstation上进行，其组成为：具有电喷雾电离的Waters ZQ单quad MS系统、Waters 2525梯度泵、Waters 2767注射器/收集器、Waters 996 PDA检测器，MS条件为：150-750 amu，正电喷雾，MS触发的收集和Waters Sunfire C-18 5微米，30 mm (id) x 100 mm柱。流动相由在含有0.1%TFA的水中的乙腈(10-100%)的混合物组成。流速保持在50 mL/min，注射体积为1800 μL，UV检测范围为210–400 nm。针对各化合物优化流动相梯度。
使用微波辐射进行的反应通常使用Personal Chemistry制造的Emrys Optimizer或Biotage制造的Initiator进行。
在旋转蒸发器上在减压下进行溶液浓缩。通常使用Biotage快速层析装置(Dyax Corp.)在硅胶(32-63 mM, 60 ?孔径)上在所示尺寸的预填药筒中进行快速层析法。除非另行指明，否则在CDCl3溶液中在500 MHz光谱仪上采集1H NMR波谱。以百万分之份数(ppm)报道化学位移。使用四甲基硅烷(TMS)作为CD3Cl溶液中的内标，并且使用残留CH3OH峰或TMS作为CD3OD溶液中的内标。以赫兹(Hz)为单位报道偶联常数(J)。
通常在Chiralpak AS、Chiralpak AD、Chiralcel OD、Chiralcel IA或Chiralcel OJ柱之一(250 x 4.6 mm) (Daicel Chemical Industries, Ltd.)上用所示百分比的在乙醇/己烷(%Et/Hex)或在异丙醇/庚烷(%IPA/Hep)作为等度溶剂系统进行手性分析色谱法。有时在Chiralpak AS、Chiralpak AD、Chiralcel OD、Ciralcel IA或Chiralcel OJ柱之一(20 x 250 mm) (Daicel Chemical Industries, Ltd.)上用与手性分析层析法上确定的所需等度溶剂系统进行手性制备型色谱法。或者，使用Chiralpak AS、Chiralpak AD-H、Chiralcel OD-H、Chiralpak IC或Chiralcel OJ-H柱之一(250 x 21.2 mm) (Daicel Chemical Industries, Ltd.)通过超临界流体(SFC)条件进行手性制备型色谱法。当实施例和表格中提供保留时间时，它们无意作为特定化合物的限定性特征，因为如本领域技术人员所知，根据色谱条件，如所用柱、柱的条件和所用溶剂系统和设备，保留时间将变化，并且峰洗脱的时机和/或顺序可以变化。
快速层析法在硅胶(230-400目)上实施。除非另行指明，在CDCl3溶液中获得NMR波谱。偶联常数(J)以赫兹(Hz)为单位。本文中使用的缩写：乙酸乙酯(EtOAc)，二氯甲烷(DCM)，起始材料(SM)，乙醚(乙醚)，三氟乙酸(TFA)，三乙胺(TEA)，N,N-二异丙基乙胺(DIEA，Hunig氏碱，DIPEA)，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)，碳二亚胺(EDC，EDAC，或EDCI)，2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)，1-羟基苯并三唑水合物(HOBt)，甲基叔丁基醚(MTBE)，环戊基甲基醚(CPME)，1,3-双(二苯基膦基)丙烷 (DPPP)，2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基联苯(X-Phos)，1,2-二氯乙烷 (DCE)，N-溴代琥珀酰亚胺 (NBS)，N-碘代琥珀酰亚胺 (NIS)，二异丙基氨基锂 (LDA)，四氢呋喃 (THF)，二甲亚砜(DMSO)，异丙醇(IPA)，叔丁氧基羰基(Boc或BOC)，二碳酸二叔丁酯(BOC2O，Boc2O)，乙酸(AcOH；HOAc)，N;N-二甲基甲酰胺 (DMF)，4-二甲基氨基吡啶 (DMAP)，mCPBA (3-氯过氧苯甲酸)，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，石油醚(PE)，氢化铝锂(LAH)，二异丙胺(DIPA)，羰基二咪唑(CDI)，对-甲苯磺酸(TsOH)，对-甲苯-SO2- (对甲苯磺酰基或Ts)，甲烷磺酰氯或甲磺酰氯(Ms-Cl)，甲磺酸(MsOH)，CH3SO2- (甲磺酰基或Ms)，二甲氧基乙烷(DME)，Pd(dppf)Cl2或PdCl2(dppf)是可以与CH2Cl2络合的1,1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)，六甲基磷酰胺(HMPA)，乙酸异丙酯(IPAC)，圆底烧瓶(RB或RBF)，饱和水溶液(sat’d)，中压液相色谱(MPLC) ，高压液相色谱(HPLC)，液相色谱(LC)，薄层层析(TLC)，液相色谱-质谱(LC-MS或LC/MS)，柱体积(CV)，室温(rt，r.t.或RT)，小时(h或hr)，分钟(min)。Celite是硅藻土的商标名称， Solka Floc是粉末纤维素的商标名称。X或x可以用来表示重复动作的次数(例如，用2 x 200 mL 1N HCl洗涤)，或表达尺寸(例如，柱的尺寸为30 x 250mm) 。
下面是用于制备用来制备随后的实施例中描述的最终产物的中间体的代表性程序。提供这些实施例仅仅为了进一步说明的目的，并不解释为对本公开发明进行限制。
中间体1A和1B
1A: (3R,9aS)-3-(1-氧代-1,3-二氢-2-苯并呋喃-5-基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯; 1B: (3S,9aS)-3-(1-氧代-1,3-二氢-2-苯并呋喃-5-基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯
步骤A: 5-乙烯基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮: 将5-溴苯酞 (50g, 235 mmol)、乙烯三氟硼酸钾 (62.9 g, 469 mmol)和PdCl2(dppf)-CH2Cl2 加合物 (9.58 g, 11.7 mmol)添加到乙醇 (500 mL)中，然后添加TEA (65.4 mL, 469 mmol)。将反应混合物脱气，然后在回流下加热8 h。将反应通过用乙酸乙酯稀释和用盐水洗涤两次而处理。将有机层干燥并蒸发至干燥。粗产物通过用25% EtOAc/己烷 (3 L)且然后用30% EtOAc/己烷 (2 L)的MPLC (硅胶, 600g柱)纯化，以得到标题化合物。
步骤B: 5-(环氧乙烷-2-基)-2-苯并呋喃-1(3H)-酮: 将5-乙烯基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮 (28.4 g , 177 mmol)溶解于DCM ( 400 mL)中，然后添加mCPBA (47.7g, 213 mmol)。该混合物在室温下搅拌过夜。一些起始烯烃仍然存在。再添加25 g mCPBA，将混合物搅拌过夜。将混合物倒入冰冷的Na2SO3溶液(饱和的)。分离各层，将有机层用5% NaOH溶液、盐水洗涤，然后干燥(MgSO4)。粗产物通过MPLC (330 g柱，用40% EtOAc/己烷, 2 L洗脱，然后用45% EtOAc/己烷, 2 L洗脱)纯化，以提供5-(环氧乙烷-2-基)-2-苯并呋喃-1(3H)-酮。LC-MS: M+1= 177。
步骤C: (3S)-3-(羟基甲基)-4-[2-羟基-2-(1-氧代-1,3-二氢-2-苯并呋喃-5-基)乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯:  在微波管中将5-(环氧乙烷-2-基)-2-苯并呋喃-1(3H)-酮 (1.5 g, 8.5 mmol)和商售(S)-4-N-BOC-2-羟基甲基哌嗪 (2.394 g, 11.07 mmol)混合在乙醇 (10 mL)中。将混合物脱气，然后在150℃下加热60 min。LC-MS显示产物峰。将反应通过添加乙酸乙酯和用盐水洗涤一次而处理。将有机层分离、干燥并浓缩至干燥。将粗产物通过使用80g Redi-sep柱，并用50%-100% EtOAc/ 己烷洗脱来纯化，以提供标题化合物。
步骤D: (9aS)-3-(1-氧代-1,3-二氢-2-苯并呋喃-5-基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  将(3S)-3-(羟基甲基)-4-[2-羟基-2-(1-氧代-1,3-二氢-2-苯并呋喃-5-基)乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (3.3g, 8.4 mmol)和氰基亚甲基三正丁基膦 (3.65 g, 15.1 mmol)溶解于30 mL苯中，将该溶液脱气，然后加热至100℃，持续3 h。LC-MS显示产物峰(M+1= 389)。将反应混合物冷却并蒸发至干燥。将残留物通过330g Redi-sep柱，并用15% 丙酮/ 85% 己烷混合物洗脱的MPLC纯化，以提供标题化合物的顺-反混合物。
步骤E: (3R,9aS)-3-(1-氧代-1,3-二氢-2-苯并呋喃-5-基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯和(3S,9aS)-3-(1-氧代-1,3-二氢-2-苯并呋喃-5-基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  使用ChiralCEL OD 4.6 x 250mm 10μ柱用45%IPA/55% 庚烷溶剂系统洗脱来分离来自前面步骤的顺式/反式异构体混合物。反式异构体1A在11.46 min第一个洗脱出来，顺式异构体1B在17.43 min第二个洗脱出来。
Figure 700407DEST_PATH_IMAGE031
中间体2
Figure 987032DEST_PATH_IMAGE032
5-溴-4-甲基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮
步骤A:  (3-溴-2-甲基苯基)甲醇:  向THF (200 mL)中3-溴-2-甲基苯甲酸(35.0 g, 163 mmol)的溶液中添加硼烷THF络合物(1.0 M, 212 mL, 212 mmol)。使该混合物搅拌24 h。TLC显示一个单产物点。用水淬灭该反应。在减压下除去溶剂THF。将所得固体溶解于乙酸乙酯(500 mL)中，用1N HCl、碳酸钠和盐水洗涤。有机层经硫酸钠干燥并浓缩以提供(3-溴-2-甲基苯基)甲醇。
步骤B:  5-溴-4-甲基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮:  向装有(3-溴-2-甲基苯基)甲醇(6.0 g, 30 mmol)的烧瓶中添加三氟乙酸铊(16.2 g, 29.8 mmol)的1M TFA溶液。该混合物在RT下搅拌过夜。通过TLC分析显示没有留下起始材料。在真空下除去溶剂，并且残留物在高真空下泵抽30 min以确保完全除去TFA。随后向该残留物中添加氯化钯(II)(529 mg, 2.98 mmol)、氯化锂(2.53 g, 59.7 mmol)、氧化镁(2.41 g, 59.7 mmol)和MeOH(150 mL)。该反应用CO吹扫两次并在室温下保持在CO下。通过LC分析在2小时内显示大的产物点。向这种溶液中添加乙酸乙酯以使盐沉淀。该溶液经硅藻土垫过滤，用EtOAc洗涤，吸附到硅胶上并通过硅胶层析法纯化以提供标题化合物。
Figure 48529DEST_PATH_IMAGE033
中间体3
Figure 395197DEST_PATH_IMAGE034
4-甲基-5-环氧乙烷-2-基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮
步骤A:  5-乙烯基-4-甲基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮: 在20 mL微波管中将5-溴-4-甲基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮(598 mg, 4.47 mmol)、乙烯三氟硼酸钾(507 mg, 2.23 mmmol)、PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(182 mg, 0.223 mmmol)和TEA(0.622 mL, 4.47 mmol)添加到10 mL乙醇中。密封该管并脱气，随后加热至140℃ 持续20 min。通过LC-MS分析显示产物峰。反应混合物用乙酸乙酯稀释，用盐水洗涤两次，干燥并蒸发至干。粗产物通过使用120g Redi-sep柱和0-80% ETOAC/己烷溶剂系统的MPLC层析法纯化以产生5-乙烯基-4-甲基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮。LC-MS: M+1= 175。
步骤B:  4-甲基-5-环氧乙烷-2-基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮:  在0℃下将5-乙烯基-4-甲基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮 (1.46 g, 8.38 mmol)添加到DCM (25 mL)中，随后添加mCPBA (2.89 g, 16.8 mmol)并将该混合物在RT下搅拌过夜。反应混合物用饱和Na2S2O3、NaHCO3水溶液和盐水各洗涤一次。有机层经Na2SO4干燥，过滤并蒸发至干燥。粗制材料通过MPLC经由用0-80% EtOAc/己烷溶剂系统洗脱的120g Redi-sep柱纯化以产生目标4-甲基-5-环氧乙烷-2-基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮。
Figure 870040DEST_PATH_IMAGE035
中间体3A和3B (方法1)
Figure 898039DEST_PATH_IMAGE036
3A:  4-甲基-5-[(2S)-环氧乙烷-2-基]-2-苯并呋喃-1(3H)-酮和3B:  4-甲基-5-[(2R)-环氧乙烷-2-基]-2-苯并呋喃-1(3H)-酮: 外消旋4-甲基-5-环氧乙烷-2-基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮在Berger MGIII制备型SFC仪器上在ChiralPak? AD-H柱 (5x25cm)上在超临界流体色谱法(SFC)条件下拆分。外消旋物在1:1 DCM:MeOH中稀释至50 mg/mL。使用10% EtOH/ CO2、流速200 ml/min、100巴、25℃完成分离。每隔2.12 min注射500ul。较快洗脱的环氧化物3B在5.2 min洗脱出来，较慢洗脱的环氧化物3A在5.6 min洗脱出来。
或者，也可以使用8%MeOH / 98% CO2的流动相以100ml/min的流速实现拆分。在这种情况下，通过溶解于甲醇中20mg/ml且每次注射使用1 mL体积而制备样品。分离后，级分经由旋转蒸发器在40℃浴温下干燥。
基于用3B制成的最终化合物的X-射线晶体结构测定和通过从3B开始制成的酯的Mosher酯和Trost酯HNMR分析(使用4-[(2R-2-羟基-2-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢-2-苯并呋喃-5-基)乙基}哌嗪-1-甲酸叔丁酯)推断各对映异构体3A和3B的绝对立体化学。
中间体3B(方法2)
步骤A:  3-羟基甲基-2-甲基苯酚:  向配有置顶搅拌器的5L 3颈RB中加入NaBH4 (87.0 g, 2.30 mol)和THF (3.0 L)并将所得浆料冷却至10℃。随后经20min向该浆料中逐份添加3-羟基-2-甲基苯甲酸(175 g, 1.15 mol)(Tmax 17℃)。形成可搅拌浆料并在10-15℃下陈化另外45min，此后经1.5小时缓慢添加BF3-OEt2 (321 mL, 2.53 mol)。该浆料在10℃-15℃下陈化2 h，随后测定反应完成(98.5%转化率)。将该浆料冷却至< 10℃并用931 mL MeOH经1.5 h缓慢淬灭(气体释放)。所得浆料在RT下陈化过夜。将该批料冷却至< 10℃，随后用1 N HCl (1.5 L)淬灭以产生均匀溶液(pH溶液约1)，其陈化30 min，随后通过旋转蒸发除去有机溶剂至大约1.8 L总反应体积(将浴温设定至50℃；旋转蒸发后的浓缩物的内部温度约40℃)。该浆料在45℃下保持30 min，随后缓慢冷却至15℃。过滤固体并用冷(15℃)水(2 x 300 mL)洗涤，提供3-羟基甲基-2-甲基苯酚。
步骤B:  4-溴-3-羟基甲基-2-甲基苯酚:  在3颈5-L烧瓶中在氮气下将3-羟基甲基-2-甲基苯酚(113.9 g, 824.0 mmol) 溶解于乙腈(850 mL)和三氟乙酸(750.0 mL, 9,735 mmol)的混合物中。将反应混合物冷却至-33℃。经15分钟添加N-溴代琥珀酰亚胺(141 g, 791 mmol)，添加过程中的温度为-35至-33℃的范围内。使反应混合物搅拌另外15 min，在此过程中温度降至-40℃。移除冷却浴并添加用水稀释的碳酸钾(741.0 g, 5,358 mmol)至总共1.0 L。观察到释气且温度升至25℃。添加MTBE (1.5 L)并将反应混合物转移至分液漏斗中。分离各层。水层用水(500 mL)稀释并用MTBE (1 L) + EtOAc (500 mL)和随后MTBE (500 mL) + EtOAc (250 mL)萃取。合并的有机层用水 (240 mL)洗涤并经硫酸钠干燥。过滤除去硫酸钠，用额外的MTBE洗涤并减压浓缩。添加MTBE (684 mL, 2体积)并将该悬浮液加热至40℃以产生均匀溶液。使该溶液冷却至室温。添加6体积的庚烷并将该悬浮液搅拌过夜。过滤该悬浮液，用4:1庚烷:MTBE (500 mL)，随后庚烷(500 mL)洗涤固体。固体在真空下干燥，提供4-溴-3-羟基甲基-2-甲基苯酚。
步骤C:  5-羟基-4-甲基-3H-异苯并呋喃-1-酮：向配有置顶搅拌器、N2入口和冷凝器的2 L 3颈烧瓶中加入4-溴-3-羟基甲基-2-甲基苯酚(100 g, 461 mmol)、CuCN (83.0 g, 921 mmol)和DMF (500 mL)。该溶液用N2吹扫 15 min，随后加热至145℃以获得均匀溶液。该溶液在145℃下陈化2h，随后将反应混合物冷却至95℃。添加41.5 mL水(用N2吹扫)并将反应陈化20 h。将该反应冷却至RT，随后经solka flok过滤固体，用50 mL DMF洗涤滤饼。向含有1 L EtOAc的3 L烧瓶中添加DMF滤液。在烧瓶底部形成沉淀物涂层。DMF/EtOAc悬浮液经solka flok过滤，用250 mL EtOAc洗涤滤饼。所得滤液用5%盐水溶液 (3 x 500 mL)洗涤。水层用500 mL EtOAc萃取，合并的有机物经MgSO4干燥，过滤并蒸发。固体在RT下在250 mL MTBE中成浆，随后过滤并用100 mL MTBE洗涤。固体在RT下在真空下干燥，提供5-羟基-4-甲基-3H-异苯并呋喃-1-酮。
步骤D:  三氟甲磺酸 4-甲基-1-氧代-1,3-二氢-异苯并呋喃-5-基酯
在配有置顶搅拌器的2-L圆底烧瓶中在氮气下将5-羟基-4-甲基-3H-异苯并呋喃-1-酮(46.8 g, 285 mmol)悬浮在二氯甲烷(935 mL)中。添加三乙胺(59.5 mL, 427 mmol)并将反应混合物在冰浴中冷却至3.8℃。经由加料漏斗经50 min添加三氟甲磺酸酐(67.4 mL, 399 mmol)，使温度保持< 10℃。在将反应混合物搅拌另外15 min后，用水(200 mL)淬灭反应混合物，随后用DARCO? KB(活性炭，25 g)搅拌15 min。该双相混合物经Solka floc过滤，用另外的二氯甲烷洗涤并转移至分液漏斗，此后其用额外的水(300 mL)稀释。分离各层，有机层用水(500 mL)和10%盐水(200 mL)洗涤。该二氯甲烷溶液经硫酸钠干燥，过滤和蒸发。该固体吸附到硅胶(27.5 g)上并经硅胶垫(271 g)用25%乙酸乙酯/己烷洗脱。所得溶液在真空下浓缩，产物在浓缩过程中沉淀。过滤该悬浮液，固体用庚烷洗涤并在真空和氮气下干燥，提供标题化合物。
步骤E:  5-(1-丁氧基-乙烯基)-4-甲基-3H-异苯并呋喃-1-酮: 向1 L 3颈烧瓶中加入三氟甲磺酸4-甲基-1-氧代-1,3-二氢-异苯并呋喃-5-基酯(63.0 g, 213 mmol)、DMF (315 mL)、丁基乙烯基醚(138 mL, 1063 mmol)，随后加入Et3N (35.6 mL, 255 mmol)。该溶液用N2吹扫20 min。向该溶液中添加Pd(OAc)2 (1.19 g., 5.32 mmol)和DPPP (2.41 g., 5.85 mmol)并吹扫另外10 min，随后加热至80℃。在1 hr陈化后，将该溶液冷却至<10℃，随后用630 mL EtOAc淬灭和用5 % NH4Cl (2 x 315 mL)、10 %盐水(2 x 315 mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，通过旋转蒸发浓缩并用EtOAc (3 x 100 mL)冲洗以除去过量丁基乙烯基醚，提供粗制5-(1-丁氧基-乙烯基)-4-甲基-3H-异苯并呋喃-1-酮。
步骤F:  5-(2-溴-乙酰基)-4-甲基-3H-异苯并呋喃-1-酮:  向配有置顶搅拌器的1 L 3颈烧瓶中添加粗制5-(1-丁氧基-乙烯基)-4-甲基-3H-异苯并呋喃-1-酮(55.8 g)和THF(315 mL)。将该溶液冷却至<5℃，此后添加水(79 mL)并使该溶液保持在< 5℃。随后逐份添加NBS (41.6 g)，同时保持Tmax = 19℃。随后将该溶液升温至RT，保持30分钟。添加HBr (48 %, 0.241 mL)并使反应在RT下陈化大约1 h，此后向该批料中添加236 mL水。使用水浴使温度保持在20℃。添加另外315 mL水(溶剂组成1:2 THF:水)并将该浆料冷却至15℃。过滤所得固体并用冷1:2 THF:水(15℃)洗涤：150 mL置换洗涤，随后100 mL浆液洗涤。固体在真空下在RT下干燥以提供5-(2-溴-乙酰基)-4-甲基-3H-异苯并呋喃-1-酮。
步骤G:  4-甲基-5-[(2R)-环氧乙烷-2-基]-2-苯并呋喃-1(3H)-酮:  将5-(2-溴-乙酰基)-4-甲基-3H-异苯并呋喃-1-酮(48.8 g., 181 mmol)加入配有置顶搅拌器、热电偶和加热罩的5 L  3颈圆底烧瓶中。添加2-丙醇(1.22 L)，随后610 mL pH 7  0.1M 磷酸钾缓冲液。将缓冲液(610 mL)加入1.0L锥形瓶，将2.44 g  NADP添加到该锥形瓶中并涡旋以溶解。将还原酶KRED MIF-20 (2.44 g)(可获自Codexis, Inc., 200 Penobscot Drive, Redwood City, CA 94063, www.codexis.com, tel.1-650-421-8100)添加到该锥形烧瓶中并涡旋该混合物以溶解固体。将所得溶液添加到5 L圆底烧瓶中，其随后加热至28℃并陈化6小时，此时反应冷却至RT并添加三乙胺(50.2 mL, 360 mmol)。所得溶液在40℃下陈化1 h。将该稀浆溶液冷却至RT，此后添加122 g NaCl。该溶液在RT下陈化，随后用1.22 L乙酸异丙酯(IPAc)萃取。水层用400 mL IPAc再萃取，合并的有机物用400 mL 20 %盐水溶液洗涤，经MgSO4干燥，过滤并通过旋转蒸发浓缩。将所得固体溶解于100 mL IPAc中(稠浆)。添加己烷(400 mL)，该悬浮液在RT下陈化，随后过滤和用w/ 5:1 己烷:IPAc溶液(150 mL)洗涤。该固体在真空下在RT下干燥以提供4-甲基-5-[(2R)-环氧乙烷-2-基]-2-苯并呋喃-1(3H)-酮。
Figure 646333DEST_PATH_IMAGE037
中间体4A和4B
Figure 836006DEST_PATH_IMAGE038
4A: (3R,9aS)-3-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢-2-苯并呋喃-5-基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯和
4B: (3S,9aS)-3-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢-2-苯并呋喃-5-基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯
步骤A: (3S)-3-(羟基甲基)-4-[2-羟基-2-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢-2-苯并呋喃-5-基)乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯：在20 mL微波管中将4-甲基-5-环氧乙烷-2-基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮 (3.00 g, 15.8 mmol)和(S)-4-N-BOC-2-羟基甲基哌嗪 (5.12 g. 23.7 mmol)悬浮在乙醇(10 mL)中。将反应混合物脱气，并在微波装置中在150℃加热30 min。将反应混合物蒸发至干燥，然后通过330g Redi-sep柱层析，并用1:1 EtOAc/ 己烷至100% EtOAc的溶剂系统洗脱，以得到标题化合物。LC-MS : M+1= 407。
步骤B: (9aS)-3-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢-2-苯并呋喃-5-基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  在密封和脱气管中将(3S)-3-(羟基甲基)-4-[2-羟基-2-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢-2-苯并呋喃-5-基)乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (3.3g, 8.2 mmol) 和氰基亚甲基三正丁基膦(两个当量)溶解于45 mL苯中。使该混合物加热至100℃持续3h。将反应混合物冷却并蒸发至干燥。将残留物通过330g Redi-sep柱层析，并用30% 丙酮/ 70% 己烷混合物洗脱来分离，以得到作为顺-反混合物的标题化合物。LC-MS: M+1= 389。
步骤C: 中间体4A和4B:  使用Chiralpak AD 4.6 x 250 mm 10μ柱用30%IPA/70% 庚烷溶剂系统分离步骤B的产物的顺式/反式混合物。反式异构体4A在15.7 min第一个洗脱出来，顺式异构体4B在24.9 min第二个洗脱出来。
中间体4C和4D
Figure 426573DEST_PATH_IMAGE040
4C: (3S,9aR)-3-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢-2-苯并呋喃-5-基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯
4D: (3R,9aR)-3-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢-2-苯并呋喃-5-基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯
与上述对于4A和4B所述类似的方式制备中间体4C和4D，除了使用(R)-4-N-BOC-2-羟基甲基哌嗪替代(S)-4-N-BOC-2-羟基甲基哌嗪。使用ChiralCEL OD 4.6 x 250mm 10μ柱用20%IPA/80% 庚烷溶剂系统分离顺式-反式异构体4C和4D。反式异构体4C在22.8 min第一个洗脱出来，顺式异构体4D在37.8 min第二个洗脱出来。
Figure 728242DEST_PATH_IMAGE041
中间体5
Figure 151133DEST_PATH_IMAGE042
6-溴-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮
方法A:  将二异丙胺(3.10 g, 30.6 mmol)和30 mL THF加入配有隔膜、氮入口针和热电偶的250-mL 3颈圆底烧瓶中。将反应混合物冷却在-20℃，同时经由注射器逐滴添加n-BuLi (2.5 M, 12.2 mL, 30.6 mmol)，保持内部温度低于0℃。将所得反应混合物在0 ℃下搅拌15 min。然后将反应混合物在-40 ℃冷却，同时经1 h经由注射器逐滴添加10 mL THF中的4-溴-2-甲基苯甲腈(4.00 g, 20.4 mmol)。在添加过程中保持约-40 ℃的内部温度。将所得反应混合物在-40 ℃下搅拌30 min，然后以一份加入DMF (2.98 g, 40.8 mmol, 约50 ppm水)。将反应混合物在-40 ℃下搅拌15 min。将反应混合物用MeOH (5体积，20mL)淬灭，然后以1份加入NaBH4 (0.770 g, 20.4 mmol)并使之升温至室温。中间体醛完全还原(如通过HPLC分析判断)后，将反应混合物小心地用5 M HCl(伴随冷却)淬灭，以将pH调整至2-3。将反应混合物用EtOAc萃取，然后溶剂交换至EtOH (40 mL)。以一份添加H2SO4 (98%, 20.0 g, 204 mmol)，并将所得反应混合物在回流下搅拌24 h。完全环化(通过HPLC分析监测)后，将反应混合物冷却至室温，然后溶剂交换至EtOAc。所得有机层用水、盐水洗涤，溶剂交换至MTBE。从1:1 MTBE:庚烷沉淀提供6-溴-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮。
方法B:  将THF (900 mL)中DIPA (4 M, 270 mL, 1080 mmol)的溶液冷却至-65℃，并且经15 min逐滴添加己基锂(2.1 M, 505 mL, 1060 mmol)，保持内部温度<-55℃。添加完成后，将反应混合物升温至-40℃，其中将其搅拌30 min。向所得LDA溶液缓慢添加作为THF (400 mL)中溶液的4-溴-2-甲基苯甲酸(90 g, 419 mmol)(经15 min)。将反应混合物在-40℃下搅拌30 min，然后升温至15℃，在该点以3份添加作为固体的多聚甲醛(50.30 g, 1674 mmol)，保持内部温度(冰水浴)低于<18℃。然后在室温下继续搅拌1小时。搅拌的第二个小时后，将容器浸入冰水浴中，以使得保持内部温度低于30℃的速率添加3N HCl (650 mL)。随后将反应容器的内容物转移至分液漏斗中，其中其用3x 400 mL EtOAc萃取，然后将合并的有机相浓缩至约800 mL总体积。向其添加Amberlyst 15树脂 (12 g)，并且将所得混合物在48℃下搅拌过夜(约14 h)。第二天早晨的HPLC分析表明环化为所需的6-溴-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮接近完成。通过过滤去除树脂，将溶液浓缩至约200 mL总体积，在该点所需产物开始沉淀，然后通过过滤收集固体。随后用MTBE (2 x 80 mL)洗涤滤饼，以得到产物的第一批收获物。额外材料通过用200 mL 10% K2CO3水溶液和随后的200 mL 1M H3PO4洗涤收集的上清液2次而回收。浓缩至约100 mL后，沉淀材料通过过滤收集，用MTBE洗涤，然后与6-溴-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮的第一批收获物合并，并干燥。
中间体6A和6B
6A : 6-[(3R,9aS)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮
步骤A: 6-(溴乙酰基)-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮:  将6-溴-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮 (6.90 g, 30.4 mmol)、三丁基(1-乙氧基乙烯基)锡烷 (10.8 mL, 31.9 mmol, 1.05当量)和PdCl2(PPh3)2 (1.07 g, 1.52 mmol, 0.05当量)称重至250 mL圆底烧瓶中。向其添加二氧杂环己烷 (70 mL)，并且将所得混合物在80℃下搅拌4 h。HPLC表明该反应不完全，因此再添加0.1当量的锡试剂。30 min后，如HPLC表明，6-溴-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮已经完全消耗。将反应混合物冷却至0 ℃，添加35 mL THF和随后的14 mL H2O。向其引入固体N-溴代琥珀酰亚胺 (5.68 g, 31.9 mmol, 1.05当量)，经5 min分份添加。搅拌30 min后，仍有剩余烯醇醚的证据，因此分小份添加NBS(再添加约300mg)，直到如HPLC所证实其被消耗。然后添加水，并用EtOAc萃取混合物。水层再用EtOAc萃取2次，合并的有机物经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。将其用EtOAc转移至100 mL圆底烧瓶，将所得溶液浓缩至约25 mL总体积，在该点逐滴添加己烷(50 mL)。当完成时，将非均相混合物搅拌30 min，然后冷却至0 ℃并搅拌10 min，然后过滤并用己烷洗涤两次。所需产物在氮气袋下干燥，然后通过快速层析法(12至100％ EtOAc/己烷)纯化，以提供标题化合物。
步骤B: (9aS)-3-羟基-3-(1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  将6-(溴乙酰基)-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮 (约1.54 g, 约5.72 mmol, 注意存在α-氯代酮d, 约10%)和商售(S)-4-N-BOC-2-羟基甲基哌嗪 (1.24 g, 5.72 mmol)添加至圆底烧瓶，并用THF (50 mL)稀释。然后引入二异丙基乙胺 (1.30 mL, 7.44 mmol)，并将混合物在RT下保持搅拌14 h，在该时间期间已经形成相当大量的固体(推测是DIPEA的HBr盐)。反应混合物用EtOAc稀释，然后用饱和NH4Cl水溶液和随后的H2O洗涤。两者水层依次用另一部分的EtOAc回萃取一次，然后将有机物合并，经MgSO4干燥，过滤，并真空浓缩。将回收的粗产物通过快速层析(Biotage, 50% EtOAc/己烷)进行纯化，以提供标题化合物。
步骤C: 6-[(3R,9aS)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮:  将(9aS)-3-羟基-3-(1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯 (1.84 g, 4.55 mmol)用TFA (18 mL, 234 mmol)稀释，并冷却至0℃。明显有一些废气产生(off gassing)，并且几分钟后已形成均匀溶液。添加TFA后约5分钟，添加Et3SiH (5.09 mL, 31.8 mmol)，并使反应混合物缓慢升温至RT(允许在冰浴中自然升温)，其中将其搅拌18 h。反式：顺式非对映异构体比率似乎是约95:5。将反应容器转移至旋转蒸发器并真空浓缩为两相液体。将该粗物质用CH2Cl2稀释，用NaHCO3水溶液洗涤，然后用水洗涤。随后分开存放的水层依次用相同部分的CH2Cl2萃取一次，合并的有机物经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。粗残留物在室内真空下干燥，然后将混合物进一步通过快速层析(2% MeOH 2% Et3N在CH2Cl2中)中纯化，以提供标题化合物。
6B : 6-[(3S,9aR)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮
使用与上述制备6-[(3R,9aS)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮的相同程序从6-(溴乙酰基)-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮和商售(R)-4-N-BOC-2-羟基甲基哌嗪开始来制备标题化合物；LC-MS (IE, m/z): 289.1 [M + 1]+。
中间体7和异构体7A和7B
6-溴-3-甲基-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮和单个异构体(3R)-6-溴-3-甲基-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮和(3S)-6-溴-3-甲基-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮:  将THF (155 mL)中二异丙胺 (13.3 mL, 93.0 mmol)的-78℃溶液经15分钟使用注射泵用n-BuLi (己烷中1.6 M; 58 mL, 93 mmol)处理。在单独的烧瓶中，使THF (155 mL)中2-甲基-4-溴苯甲酸 (10.0 g, 46.5 mmol)和HMPA (8.33 mL, 46.5 mmol)的溶液冷却至-78℃。将甲基锂 (29.1 mL, 46.5 mmol)经由注射器缓慢添加至冷却的溶液中。将所得溶液搅拌10分钟，然后经由套管转移至-78℃的LDA溶液。将所得溶液在-78 ℃下再搅拌1小时，然后用无水乙醛(7.88 mL, 140 mmol)淬灭，然后将反应取出干冰丙酮浴，并再搅拌1小时。然后将含有反应混合物的烧瓶在干冰丙酮浴中再次浸没，然后将其用4M HCl/二氧杂环己烷 (50mL)中和随后的25mL MeOH淬灭。该反应在室温下再搅拌1 h。将粗反应混合物在200 mL乙酸乙酯和200 mL水之间分配。将有机层用水、盐水洗涤，用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。经由MPLC (30-70% DCM/己烷)纯化得到作为外消旋混合物的 7 ，其通过使用例如Chiralpak AS柱的手性SFC HPLC是可分离的，以获得 7A 和 7B 。
Figure 362431DEST_PATH_IMAGE045
中间体7A (方法2)
(3R)-6-溴-3-甲基-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮
步骤A:  4-溴-N,N-二乙基-2-甲基苯甲酰胺:  将DCM (400mL)中的4-溴-2-甲基苯甲酸 (25.0g, 116 mmol)的溶液用草酰氯 (11.7mL, 134 mmol)和催化量的干燥DMF(0.1mL)处理。使该反应在室温下在氮气下搅拌2小时。去除过量溶剂得到粗酸性氯化物，将该粗酸性氯化物再溶解于DCM (400mL)中。然后将混合物冷却至0 ℃，添加三乙胺 (40.5mL, 291 mmol)，随后缓慢添加二乙胺 (24.3mL, 233 mmol)。然后使该反应升温至室温过夜。然后将粗混合物用400mL水稀释，并用DCM (3 x 500mL)萃取。然后将合并的有机层用盐水(200mL)洗涤，经硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩。将粗产物经由MPLC (10% EtOAc/己烷)纯化，以得到4-溴-N,N-二乙基-2-甲基苯甲酰胺：LC-MS: (M+H)+ 270。
步骤B:  4-溴-N,N-二乙基-2-(2-氧代丙基)苯甲酰胺:  将冷却至-78℃的THF (176 mL)中的LDA (35.2 mL, 70.3 mmol)的2M溶液用缓慢添加干燥THF (176 mL)中的4-溴-N,N-二乙基-2-甲基苯甲酰胺 (19 g, 70.3 mmol)来处理。使反应在-78℃搅拌1小时，然后将其用N-甲氧基-N-甲基乙酰胺 (22.43 mL, 211 mmol)淬灭，并使其缓慢升温至室温。将反应搅拌过夜，然后在1N HCl (200mL)和EtOAc (400mL)之间分配。将水层进一步用EtOAc (2x150 mL)萃取。将合并的有机层用盐水(150mL)洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。粗材料是油状物，其中沉淀出产物。将该油状物倾出，固体用己烷洗涤并使用布氏漏斗干燥，以得到4-溴-N,N-二乙基-2-(2-氧代丙基)苯甲酰胺：LC-MS: (M+H)+ 312。
步骤C:  4-溴-N,N-二乙基-2-[(2R)-2-羟基丙基]苯甲酰胺:  配有顶置式搅拌器的烧瓶中加入pH=8磷酸盐缓冲液(156 mL, 31.2 mmol)，随后加入D-葡萄糖(1.298 g, 7.21 mmol)，然后升温至30℃。接下来，立刻将135 mg葡萄糖脱氢酶和270 mg NADP+二钠添加至葡萄糖/缓冲溶液，搅动1min后获得均匀溶液。接下来，将577 mg酮还原酶KRED P1B2(从Codexis, Inc.获得，200 Penobscot Drive, Redwood City, CA 94063, www.codexis.com, tel.1-650-421-8100)添加反应容器中，并在30℃下以500 rpm搅拌，直至酶变湿(约40 min)。最后，经约3min将溶于DMSO (14.56 mL)中4-溴-N,N-二乙基-2-(2-氧代丙基)苯甲酰胺 (1.5 g, 4.80 mmol)的溶液(在搅拌板上预热至30 ℃)添加至反应，并在30℃搅拌(400 rpm)过夜。
48小时后，将反应冷却至室温，然后将75 g碳酸钾分批添加至反应，搅拌15 分钟，直至当停止搅拌时酶团块在一起。然后，将乙腈(50 mL)倒入反应烧瓶中，将各层彻底混合。15-20分钟后停止搅拌，使各层分离并倾出上层。用额外50mL乙腈将其再重复两次。然后将合并的有机层过滤通过中孔漏斗，浓缩，然后将50ml MTBE添加至浓缩物，并搅拌5 min，然后转移至分液漏斗中，并分离各层。将水层用另外50 mL MTBE进一步萃取。将合并的有机萃取物用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。经由MPLC (30-70% EtOAc/己烷)纯化得到4-溴-N,N-二乙基-2-[(2R)-2-羟基丙基]苯甲酰胺。
步骤D:  (3R)-6-溴-3-甲基-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮:  将溶于二氧杂环己烷 (200mL)中4N HCl 中4-溴-N,N-二乙基-2-[(2R)-2-羟基丙基]苯甲酰胺 (12.2 g, 38.8 mmol)的溶液在室温下搅拌并通过TLC监测。3天后，反应在EtOAc (300mL)和水(300mL)之间分配。将水相用EtOAc (2 x 250mL)进一步萃取。然后将合并的有机层用水(200mL)、盐水(200mL)洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。然后将粗产物经由MPLC (15-30% EtOAc/己烷)纯化，以得到(3R)-6-溴-3-甲基-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮：
Figure 221802DEST_PATH_IMAGE046
中间体7B (方法2)
Figure 892955DEST_PATH_IMAGE047
(3S)-6-溴-3-甲基-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮:  以与(3R)-6-溴-3-甲基-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮类似的方式制备(3S)-6-溴-3-甲基-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮，除了在步骤C中使用酮还原酶KRED P1H9 (可获自Codexis, Inc., 200 Penobscot Drive, Redwood City, CA 94063, www.codexis.com, tel.1-650-421-8100) ，这得到所得醇的相反对映异构体。
中间体8A和8B
Figure 66447DEST_PATH_IMAGE048
8A :(3R,9aS)-3-[(3R)-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯
8B : (3S,9aS)-3-[(3R)-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯
步骤A: (3R)-6-乙烯基-3-甲基-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮:  将EtOH (39.8 mL)中(3R)-6-溴-3-甲基-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮 (2.4 g, 9.96 mmol)和三乙胺 (2.78 mL, 19.91 mmol)的溶液添加至含有PdCl2(dppf)-CH2Cl2,  (0.406 g, 0.498 mmol)和乙烯三氟硼酸钾 (2.000 g, 14.93 mmol)的微波小瓶中。将小瓶的内容物加热至100 ℃持续1小时，然后将混合物冷却，用氯仿 (50mL)稀释，并用氯化铵水溶液(25mL)洗涤。然后将有机层用硫酸镁干燥，过滤，并将溶剂减压蒸发。MPLC纯化(15-60% EtOAc/己烷)得到标题化合物。
步骤B: (3R)-3-甲基-6-(环氧乙烷-2-基)-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮:  在室温以mCPBA (3.100 g, 17.96 mmol)处理DCM (60 mL)中6-乙烯基-3-甲基-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮 (1.69 g, 8.98 mmol)的溶液过夜。然后将反应用水(50 mL)和DCM (50 mL)稀释。将有机层进一步依次用饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)、水(30mL)和盐水(30mL)洗涤。然后将有机层用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。将残留物经由MPLC (15-40% EtOAc/己烷)纯化，以得到标题化合物。
步骤C:  (3S)-3-(羟基甲基)-4-{2-羟基-2-[(3R)-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]乙基}哌嗪-1-甲酸叔丁酯:  在微波炉中将溶于EtOH (7mL)中(3R)-3-甲基-6-(环氧乙烷-2-基)-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮 (325 mg, 1.59 mmol)和(3S)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (345 mg, 1.59 mmol)的溶液在密封管中加热至155℃持续3小时。将反应冷却并浓缩，以得到粗产物，将所述粗产物经由MPLC (40-100% EtOAc/己烷)纯化，以得到作为非对映异构体的混合物的标题化合物。
步骤D:  (3R,9aS)-3-[(3R)-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯和(3S,9aS)-3-[(3R)-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  用氮气将含有溶于无水苯(8mL)的作为非对映异构体 (530mg, 1.26 mmol)和氰基亚甲基三丁基膦 (304 mg, 1.26 mmol)的混合物的(3S)-3-(羟基甲基)-4-{2-羟基-2-[(3R)-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]乙基}哌嗪-1-甲酸叔丁酯的密封瓶脱气两次，然后使用微波加热至135℃持续2.5小时。使反应冷却，将粗混合物浓缩，并在MPLC (20-65% EtOAc/己烷)上纯化，以得到非对映异构体以及回收的起始材料的混合物。将顺式/反式混合物使用AS柱经由手性HPLC (10% EtOH/庚烷)纯化，以得到作为较快洗脱峰的反式异构体和作为较慢洗脱峰的顺式异构体。或者，该混合物可以使用IC柱通过手性SFC-HPLC (40% 2:1MeOH:MeCN/CO2)进行分离。
Figure 139445DEST_PATH_IMAGE049
中间体8C 和8D
Figure 107401DEST_PATH_IMAGE050
8C : (3R,9aS)-3-[(3S)-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯
8D : (3S,9aS)-3-[(3S)-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯: 以与中间体8A和8B类似的方式制备8C和8D，除了使用(3S)-6-溴-3-甲基-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮作为起始材料。在AD柱上经由手性HPLC (30% 2:1 MeOH:MeCN/ CO2)纯化顺式/反式混合物。较快洗脱的非对映异构体是反式异构体。
Figure 826702DEST_PATH_IMAGE051
中间体8E 和8F
Figure 538306DEST_PATH_IMAGE052
8E : (3S,9aR)-3-[(3S)-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:
8F : (3R,9aR)-3-[(3S)-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  以与中间体8A和8B类似的方式制备中间体8E和8F，除了使用(3S)-6-溴-3-甲基-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮和(3R)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯作为起始材料。将顺式/反式混合物经由MPLC (20-65% EtOAc/己烷)纯化。较快洗脱的非对映异构体是反式异构体：
Figure 465811DEST_PATH_IMAGE053
Figure 604668DEST_PATH_IMAGE054
。
中间体8G 和8H
Figure 250413DEST_PATH_IMAGE055
8G :  (3S,9aR)-3-[(3R)-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯
8H : (3R,9aR)-3-[(3R)-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  以与8A和8B类似的方式制备8G和8H，除了使用(3R)-6-溴-3-甲基-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮和(3R)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯作为起始材料。在OJ柱上经由手性HPLC (20% 2:1 MeOH:MeCN/ CO2)纯化顺式/反式混合物。较慢洗脱的非对映异构体是反式异构体：8G LC-MS: (M+1)+ 403; 8H: LC-MS: (M+1)+ 403。
中间体9
Figure 63911DEST_PATH_IMAGE056
(3S)-3-甲基-6-(9a-甲基八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基)异色满-1-酮
步骤A: 4-(2-羟基-2-((S)-3-甲基-1-氧代异色满-6-基)乙基)-3-(羟基甲基)-3-甲基哌嗪-1-甲酸苄酯:  向EtOH (13 mL)中外消旋3-(羟基甲基)-3-甲基哌嗪-1-甲酸苄酯 (1.0 g, 3.8 mmol)(根据美国专利申请公开号US2007/0088039A1实施例10中所述制备)的溶液中添加(3S)-3-甲基-6-(环氧乙烷-2-基) 异色满-1-酮 (773 mg, 3.80 mmol)，将所得混合物在80℃下加热16 h，将反应混合物浓缩至干燥，在硅胶上纯化以得到标题化合物：LC/MS: m/e 469.2 (M+H)+。
步骤B: 9a-甲基-3-((S)-3-甲基-1-氧代异色满-6-基) 六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸苄酯:  将干燥苯中4-(2-羟基-2-((S)-3-甲基-1-氧代异色满-6-基)乙基)-3-(羟基甲基)-3-甲基哌嗪-1-甲酸苄酯 (762 mg, 1.60 mmol)和氰基亚甲基三丁基膦 (471mg, 1.90 mmol)的混合物脱气，并在微波反应器中加热至135℃，持续3.5 h。该点之后，将反应混合物冷却至室温，浓缩至干燥，在硅胶上纯化，以得到标题化合物(顺式或反式)：MS: m/e 451.2(M+H)+。
步骤C: (3S)-3-甲基-6-(9a-甲基八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基)异色满-1-酮
将MeOH (10 mL)中9a-甲基-3-((S)-3-甲基-1-氧代异色满-6-基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸苄酯 (215 mg, 0.500 mmol)和10% Pd-C (56 mg, 0.05 mmol)的混合物在氢气球下搅拌16 h。该点之后，将溶液通过硅藻土过滤，将所得滤液浓缩，以得到标题化合物：LC/MS: m/e 317.2(M+H)+。
中间体10
Figure 49185DEST_PATH_IMAGE057
6-溴-5-氟-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮
步骤A:  4-溴-N-叔丁基-3-氟-2-(2-羟基乙基)苯甲酰胺: 在0℃下将THF (200 mL)中二异丙胺 (6.2 mL, 44 mmol)的溶液用正丁基锂(17.4 mL, 44.0 mmol)处理。将溶液搅拌30 min，然后冷却至-78℃。接下来，添加THF (100 mL)中4-溴-N-叔丁基-3-氟苯甲酰胺 (4.8 g, 17 mmol)的溶液。然后将溶液升温至-40℃，并保持1 h。接下来，添加环氧乙烷 (10 mL, 200 mmol)并将溶液升温至0℃。1h后，去除冰浴，使溶液升温至rt。LC/MS表明存在所需产物。将溶液用MeOH淬灭，用盐水(200 mL)稀释，并用EtOAc (300 mL)萃取。去除有机层，经MgSO4干燥，过滤并浓缩。将粗产物使用340 g Biotage SNAP (0-60%己烷:EtOAc)药筒纯化，以得到标题化合物：LC-MS: m/z 319.98 (M+H)+。
步骤B:  6-溴-5-氟-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮:  将甲苯 (100 mL)/THF (10 mL)中4-溴-N-叔丁基-3-氟-2-(2-羟基乙基) 苯甲酰胺(1.8 g, 5.7 mmol)和TsOH (1.3 g, 6.9 mmol)的溶液加热至回流。1h后，TLC和LC/MS分析表明完全转化。将溶液浓缩至干燥，随后用Et2O (150 mL)稀释。将有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到标题化合物：LC-MS: m/z 246.92 (M+H)+。
中间体11A (反式)
(3R,9aS)-3-(5-氟-1-氧代异色满-6-基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  使用与上述对于(3R,9aS)-3-[(3R)-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯的程序类似的程序来从6-溴-5-氟-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮制备标题化合物。将主要反式异构体经由MPLC (30-100% EtOAc/己烷)纯化为较快洗脱的异构体：
Figure 491984DEST_PATH_IMAGE059
Figure 607708DEST_PATH_IMAGE060
。
中间体12A
Figure 509805DEST_PATH_IMAGE061
3-(R)-6-溴-5-氟-3-甲基-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮
步骤A:  4-溴-N-叔丁基-3-氟苯甲酰胺:  向DCM (200 mL)中4-溴-3-氟苯甲酸 (19 g, 87 mmol)的悬浮液添加草酰氯 (9.10 mL, 104 mmol)和随后1滴DMF。使混合物在rt搅拌2 h。澄清悬浮液后，将溶液浓缩至干燥。将残留物重新溶解于DCM (200 mL)中，并冷却至0℃。接下来，溶液用TEA (30.2 mL, 217 mmol)和随后的叔丁胺 (12.0 mL, 113 mmol)处理。使溶液搅拌12 h。将反应用1N HCl (200 mL)稀释。然后将有机层取出，并用1N NaOH洗涤。将有机层经MgSO4干燥，过滤并浓缩，以得到标题化合物。
步骤B:  4-溴-N-叔丁基-3-氟-2-[(2R)-2-羟基丙基]苯甲酰胺:  在0℃下将THF (200 mL)中二异丙胺(11.7 mL, 82.0 mmol)的溶液用正丁基锂(33 mL, 82 mmol)处理。将溶液搅拌30 min，然后冷却至-78℃。接下来，添加THF (100 mL)中4-溴-N-叔丁基-3-氟苯甲酰胺 (9.0 g, 33 mmol)的溶液。然后将溶液升温至-40℃，并保持1 h。接下来，添加(R)-(+)–环氧丙烷 (6.9 mL, 98 mmol)并将溶液升温至0℃。1h后，去除冰浴，使溶液升温至rt。LC/MS表明存在所需产物。将溶液用MeOH淬灭，用盐水(200 mL)稀释，并用EtOAc (300 mL)萃取。去除有机层，经MgSO4干燥，过滤并浓缩。将粗材料使用340 g Biotage SNAP (0-60%己烷:EtOAc)药筒纯化，以得到标题化合物。LC-MS: m/z 332.08 (M+H)+。
步骤C:  3-(R)-6-溴-5-氟-3-甲基-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮:  将甲苯 (100 mL)中4-溴-N-叔丁基-3-氟-2-[(2R)-2-羟基丙基]苯甲酰胺 (4.60 g, 13.8 mmol)和TsOH (2.60 g, 13.8 mmol)的溶液加热至回流。1h后，TLC和LC/MS分析表明完全转化。将溶液浓缩至干燥，随后用Et2O (150 mL)稀释。将有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到标题化合物：
Figure 990465DEST_PATH_IMAGE062
Figure 861336DEST_PATH_IMAGE063
。
中间体12B
Figure 780750DEST_PATH_IMAGE064
3-(S)-6-溴-5-氟-3-甲基-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮:  根据对于3-(R)-6-溴-5-氟-3-甲基-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮所述的程序制备标题化合物，除了在步骤B中使用(S)-(+)– 环氧丙烷：
Figure 188915DEST_PATH_IMAGE066
。
中间体13A (反式)
Figure 296548DEST_PATH_IMAGE067
(3R,9aS)-3-[(3R)-5-氟-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  使用与对于(3R,9aS)-3-[(3R)-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯(上述)所述的程序类似的程序来从3-(R)-6-溴-5-氟-3-甲基-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮制备标题化合物。在AD柱上经由手性HPLC (30% 2:1 MeOH:MeCN/ CO2)纯化顺式/反式混合物。较慢洗脱的非对映异构体是反式异构体。LC-MS: (M+1)+ 421。
中间体13B (顺式)
Figure 691757DEST_PATH_IMAGE068
(3S,9aS)-3-[(3R)-5-氟-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  在(3R,9aS)-3-[(3R)-5-氟-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯的手性HPLC纯化过程中将标题化合物分离为较快洗脱峰。LC-MS: (M+1)+ 421。
中间体13C (反式)
Figure 804332DEST_PATH_IMAGE069
(3R,9aS)-3-[(3S)-5-氟-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  使用与对于(3R,9aS)-3-[(3R)-5-氟-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯(上述)所述的程序类似的程序来从3-(S)-6-溴-5-氟-3-甲基-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮制备标题化合物。在OJ柱上经由手性SFC-HPLC (30% 2:1 MeOH:MeCN/CO2)纯化顺式/反式混合物。较快洗脱的非对映异构体是反式异构体。LC-MS: (M+1)+ 421。
中间体13D (顺式)
Figure 892374DEST_PATH_IMAGE070
(3S,9aS)-3-[(3S)-5-氟-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  标题化合物在(3R,9aS)-3-[(3S)-5-氟-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯的手性SFC-HPLC纯化过程中作为较慢洗脱峰被分离。LC-MS: (M+1)+ 421。
中间体13E (反式)
Figure 221724DEST_PATH_IMAGE071
(3S,9aR)-3-[(3R)-5-氟-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯: 使用与对于(3R,9aS)-3-[(3R)-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯(上述)所述的程序类似的程序来从3-(R)-6-溴-5-氟-3-甲基-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮制备标题化合物，在步骤C中取代(3R)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯作为氨基醇。在AD柱上经由手性HPLC (40% 2:1 MeOH:MeCN/ CO2)纯化顺式/反式混合物。较快洗脱的非对映异构体是反式异构体。LC-MS: (M+1)+ 421。
中间体13F (顺式)
Figure 420624DEST_PATH_IMAGE072
(3R,9aR)-3-[(3R)-5-氟-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  标题化合物在(3S,9aR)-3-[(3R)-5-氟-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯的手性SFC-HPLC纯化过程中作为较慢洗脱峰被分离。LC-MS: (M+1)+ 421。
中间体13G (反式)
Figure 886241DEST_PATH_IMAGE073
(3S,9aR)-3-[(3S)-5-氟-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  使用与对于(3R,9aS)-3-[(3R)-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯(上述)所述的程序类似的程序来从3-(S)-6-溴-5-氟-3-甲基-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮制备标题化合物，在步骤C中取代(3R)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯作为氨基醇。在OJ柱上经由手性SFC-HPLC (30% 2:1 MeOH:MeCN/CO2)纯化顺式/反式混合物。较快洗脱的非对映异构体是反式异构体。LC-MS: (M+1)+ 421。
中间体13H (顺式)
Figure 207501DEST_PATH_IMAGE074
(3R,9aR)-3-[(3S)-5-氟-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  标题化合物在(3S,9aR)-3-[(3S)-5-氟-3-甲基-1-氧代-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-6-基]六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯(上述)的SFC-HPLC纯化过程中作为较慢洗脱峰被分离。LC-MS: (M+1)+ 421。
中间体14B (顺式)
Figure 961830DEST_PATH_IMAGE075
(3S,9aS)-3-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢异苯并呋喃-5-基)六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-甲酸叔丁酯
步骤A: (S)-4-((S)-2-羟基-2-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢异苯并呋喃-5-基)乙基)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯: 在微波中在150℃将乙醇 (12 mL)中的(S)-4-甲基-5-(环氧乙烷-2-基)异苯并呋喃-1(3H)-酮 (0.75g, 3.95 mmol)和(S)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (1.02 g, 4.73 mmol)加热1.5 h。将反应溶液浓缩，将残留物在Biotage系统上使用40-100% 乙酸乙酯/己烷通过MPLC进行纯化，以得到标题化合物。LC/MS: (M+1)+: 407.15。
步骤B: (S)-4-((S)-2-羟基-2-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢异苯并呋喃-5-基)乙基)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸苄酯: 在rt向二氯甲烷(3 mL)中(S)-4-((S)-2-羟基-2-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢异苯并呋喃-5-基)乙基)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (2.57 g, 6.32 mmol)的溶液添加三氟乙酸 (10 mL, 130 mmol)，持续1 h。在减压下去除挥发物后，将残留物溶于二氯甲烷(100 mL)中。在0℃下向上述溶液中添加三乙胺 (4.40 mL, 31.6 mmol)和氯甲酸苄酯 (0.95 mL, 6.64 mmol)，持续0.5 h。将反应用水淬灭，然后添加饱和碳酸钠。将混合物用二氯甲烷萃取，经硫酸钠干燥，浓缩，将残留物在Biotage系统上使用40-100%EtOAc/己烷通过MPLC进行纯化，以得到标题化合物。LC/MS: (M+1)+: 441.11。
步骤C: (9aR)-8-烯丙基-7-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢异苯并呋喃-5-基)六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-甲酸苄酯: 在回流下将亚硫酰氯 (20 mL, 274 mmol)中(S)-4-((S)-2-羟基-2-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢异苯并呋喃-5-基)乙基)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸苄酯 (1.4 g, 3.2 mmol)的溶液加热1 h。去除挥发物后，将残留物溶于N,N-二甲基甲酰胺 (20 mL)中，并在0℃下用烯丙胺 (1.31 mL, 17.48 mmol)处理。将所得溶液用碘化钠 (0.088 g, 0.318 mmol)处理，并在90℃下加热1 h。将溶液稀释在乙酸乙酯 (300 mL)中，并用饱和碳酸氢钠洗涤三次，经硫酸钠干燥，浓缩，并残留物在Biotage系统上使用40-100% 乙酸乙酯/己烷通过MPLC进行纯化，以得到标题化合物。LC/MS: (M+1)+: 462.12。
步骤D:  (3S,9aS)-3-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢异苯并呋喃-5-基)四氢-1H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-2,8(9H,9aH)-二甲酸8-苄酯2-叔丁酯: 在35 ℃下将二氯甲烷(10 mL)中(9aR)-8-烯丙基-7-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢异苯并呋喃-5-基)六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-甲酸苄酯 (0.98 g, 2.12 mmol)、1,3-二甲基嘧啶-2,4,6(1H,3H,5H)-三酮 (0.995 g, 6.37 mmol)和四(三苯基膦)钯 (0) (123 mg, 0.106 mmol)的混合物加热4 h。冷却至rt后，添加二碳酸二-叔丁酯 (556 mg, 2.55 mmol)和三乙胺 (1194 μl, 8.49 mmol)，并将所得溶液在rt搅拌过夜。浓缩后，将残留物在Biotage系统上使用20-100% EtOAc/己烷通过MPLC进行纯化和拆分，以得到标题化合物(较弱极性)。LC/MS: (M+1)+: 522.12; 和标题化合物的相应(3R,9aS)异构体(较高极性)。LC/MS: (M+1)+: 522.12。
步骤E: (3S,9aS)-3-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢异苯并呋喃-5-基)六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-甲酸叔丁酯: 向甲醇 (30 mL)中步骤D的标题化合物(0.46 g, 0.88 mmol)的溶液中添加碳载钯(10%, 0.094 g, 0.088 mmol)，并在rt下使混合物进行加氢过夜。过滤后，将滤液浓缩，以得到标题化合物。LC/MS: (M+1)+: 388.10。
中间体15
Figure 259694DEST_PATH_IMAGE076
7-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢-2-苯并呋喃-5-基)八氢-2H-吡嗪并[1,2-d][1,4]氧氮杂?-2-甲酸叔丁酯和和四种分离的异构体
步骤A: 3-(2-羟基乙基) 哌嗪-1-甲酸叔丁酯:   在0℃下将3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (7.28 g, 28.2 mmol)溶解于THF (100 mL)中，然后添加LAH (21.14 mL, 21.14 mmol)。通过TLC监测反应。30 min后，将反应首先用0.8 mL水淬灭，然后添加1.6 mL 2N NaOH，随后添加4 mL水。上述浆状物用乙酸乙酯稀释，并添加MgSO4。将混合物在RT下搅拌1/2 h，然后过滤并浓缩，以得到标题化合物：LC-MS (IE, m/z): 231 [M + 1]+ 。
步骤B:3-(2-羟基乙基)-4-(2-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢异苯并呋喃-5-基)-2-氧代乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯:  将3-(2-羟基乙基) 哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (6.91 g, 30.0 mmol)和5-(2-溴乙酰基)-4-甲基异苯并呋喃-1(3H)-酮 (6.73 g, 25 mmol)溶解于四氢呋喃 (100 mL)中，然后添加Hunig氏碱 (8.73 mL, 50.0 mmol)，并在RT下搅拌过夜。将反应倒入盐水中，并用EtOAc (2x)萃取。将合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并蒸发至干燥。将粗产物通过ISCO Redi-Sep 330g柱层析，并用5% MeOH /DCM溶剂系统洗脱，以得到标题化合物。LC-MS (IE, m/z): 419 [M + 1]+ 。
步骤C:  4-(2-羟基-2-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢异苯并呋喃-5-基)乙基)-3-(2-羟基乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯:  在0℃下将3-(2-羟基乙基)-4-(2-(4-甲基-1-氧代-1, 3-二氢异苯并呋喃-5-基)-2-氧代乙基) 哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (6.16 g, 14.7 mmol)溶解于甲醇 (100mL)，然后添加NaBH4 (1.67 g, 44.2 mmol)。将反应混合物升温至RT。十分钟后，TLC显示没有SM剩下。蒸发甲醇，将残留物用盐水溶取，并用乙酸乙酯萃取两次。将合并的有机层经MgSO4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过ISCO 330g Redi-sep柱层析，并用5% MeOH /DCM洗脱，以得到标题化合物：LC-MS (IE, m/z): 421[M + 1]+ 。
步骤D: 7-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢-2-苯并呋喃-5-基)八氢-2H-吡嗪并[1,2-d][1,4]氧氮杂?-2-甲酸叔丁酯:  将4-(2-羟基-2-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢异苯并呋喃-5-基)乙基)-3-(2-羟基乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (2.22 g, 5.30 mmol)溶解于苯 (30mL)中，然后添加氰基亚甲基三丁基膦 (2.31 g, 9.55 mmol)，然后将其加热至100℃，保持过夜。通过旋转蒸发去除苯，并将残留物通过ISCO redi-sep 330g柱层析，并用15% 丙酮:85%DCM洗脱。这将标题化合物的顺式非对映异构体与反式非对映异构体分离。使用以下条件将顺式非对映异构体进一步分离为S,S和R,R非对映异构体：Chiralpak AD柱: 30 x 250 mm, 30% (2:1 MeOH: CH3CN)/CO2, 70mL/min, 100巴,  MeOH/MeCN/DCM中41mg/mL , 35℃, 254 nm:  顺式非对映异构体A (保留时间3.2 min): 
Figure 783079DEST_PATH_IMAGE077
使用以下条件将反式非对映异构体进一步分离为S,R和R,S非对映异构体：Chiralpak AD柱: 30 x 250 mm, 20% (2:1 MeOH: CH3CN)/CO2, 70ml/min, 100巴,  MeOH/MeCN/DCM中33mg/mL , 35℃ , 254 nm。在分析柱Chiralpak AD上反式非对映异构体A和反式非对映异构体B的保留时间分别为6.68 min和8.08 min：4.6 x 250 mm ,15% (2:1 MeOH: CH3CN)/CO2, 2.1ml/min, 100巴, 35℃ 254 nm:  反式非对映异构体A: 
Figure 275240DEST_PATH_IMAGE078
Figure 313603DEST_PATH_IMAGE079
。
中间体16 (异构体混合物), 16A和16B
(3R,9aS)-3-(3-氰基-4-氟苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯和(3S,9aS)-3-(3-氰基-4-氟苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯
步骤A: 2-氟-5-(1-羟基乙基)苯甲腈:  将3-氰基-4-氟苯甲醛 (2.17 g, 14.7 mmol)溶解于THF (50 mL)中，然后冷却至-70℃。向该混合物中添加甲基溴化镁(5.34 mL, 16.0 mmol)。将混合物搅拌1 h，然后用盐水淬灭，并用乙醚萃取。将醚层分离，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干燥。将残留物通过120g Redi-sep柱使用0-50% EtOAc/己烷洗脱液的MPLC层析纯化以得到2-氟-5-(1-羟基乙基)苯甲腈：LC-MS: M+1=166。
步骤B: 5-乙酰基-2-氟苯甲腈:   将2-氟-5-(1-羟基乙基)苯甲腈 (0.80 g, 4.8 mmol)溶解于DCM (50 mL)中。向该混合物中添加重铬酸吡啶鎓盐(2.73 g, 7.27 mmol)，并将混合物在RT下搅拌过夜。Florisil(26 g)添加至反应混合物，然后将其用50 mL乙醚稀释，并过滤通过硅藻土垫。将滤液蒸发至干燥，并将残留物通过120g Redi-sep柱，用0-100% EtOAc/己烷洗脱来通过MPLC纯化以得到5-乙酰基-2-氟苯甲腈。
步骤C: 5-(溴乙酰基)-2-氟苯甲腈:  将5-乙酰基-2-氟苯甲腈 (400 mg, 2.45 mmol)溶解于THF ( 20 mL)中，然后添加溴化铜(II)(1.10 g, 4.90 mmol)，并将混合物在RT下搅拌48 h。将反应混合物用20 mL乙醚稀释，然后用水洗涤，随后用盐水洗涤。将有机层分离，用Na2SO4干燥，并过滤。将滤液蒸发至干燥，然后通过80g Redi-sep柱用0-50% 乙酸乙酯/ 己烷洗脱液通过MPLC层析纯化，以得到5-(溴乙酰基)-2-氟苯甲腈：LC-MS: M+1= 244。
步骤D: (3S)-4-[2-(3-氰基-4-氟苯基)-2-氧代乙基]-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯:  在0℃下将5-(溴乙酰基)-2-氟苯甲腈 (590 mg, 2.44 mmol)和(S)-4-N-BOC-2-羟基甲基-哌嗪 (527 mg, 2.44 mmol)溶解于THF (40 mL)中，然后添加TEA (247 mg, 2.44 mmol)。将反应混合物在RT下搅拌16 h，然后倒入水中，并用乙酸乙酯萃取。有机层经Na2SO4干燥，过滤并蒸发至干燥。将粗产物通过80g Redi-sep柱使用0-100% EtOAc/己烷通过MPLC纯化，以得到标题化合物。
步骤E: (3S)-4-[2-(3-氰基-4-氟苯基)-2-羟基乙基]-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯:  将(3S)-4-[2-(3-氰基-4-氟苯基)-2-氧代乙基]-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (800 mg, 2.12 mmol)溶解于乙醇 (50 mL)中，然后添加硼氢化钠(321 mg, 8.48 mmol)，并将混合物在RT下搅拌16 h。LC-MS分析显示产物存在。去除乙醇，并将残留物再溶解于EtOAc中，并用1N HCl搅拌5 min。然后将混合物用饱和NaHCO3水溶液中和，并用EtOAc萃取两次。将有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并蒸发至干燥，以得到标题化合物。LC-MS: M+1= 280。
步骤F: (9aS)-3-(3-氰基-4-氟苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  将(3S)-4-[2-(3-氰基-4-氟苯基)-2-羟基乙基]-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (358 mg, 0.944 mmol)溶解于DCM (25 mL)中，并冷却至0℃。向该混合物中添加TEA (0.197 mL, 1.42 mmol)，随后添加甲磺酰氯(0.096 mL, 1.2 mmol)。将混合物升温至RT并搅拌过夜。将反应混合物用盐水洗涤两次，干燥，并蒸发至干燥。将残留物通过40g Redi-sep柱，用EtOAc/己烷 0-100%洗脱来通过层析纯化，以得到中间体氯化物(470mg, 1.81 mmol)。然后将该氯化物溶解于THF (25 mL)中，并在0℃下添加四丁基氯化铵(436 mg, 1.18 mmol)，随后添加NaH (47.2 mg, 1.18 mmol)，然后将混合物在回流下搅拌过夜。将反应混合物用EtOAc稀释，并用盐水洗涤。将有机层用Na2SO4干燥，过滤并蒸发至干燥。将粗残留物通过40g Redi-sep柱，用0-100 % 乙酸乙酯洗脱来通过MPLC层析纯化，以得到作为两种异构体的混合物的标题化合物：
Figure 560094DEST_PATH_IMAGE081
Figure 895260DEST_PATH_IMAGE082
。
步骤G:  (3R,9aS)-3-(3-氰基-4-氟苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯和(3S,9aS)-3-(3-氰基-4-氟苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  通过在先前步骤中获得的异构体的混合物的制备型HPLC分离而获得标题化合物。
中间体 16C和16D
Figure 187964DEST_PATH_IMAGE083
(3S,9aR)-3-(3-氰基-4-氟苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯和(3R,9aR)-3-(3-氰基-4-氟苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯
步骤A: 3-溴-4-氟-N-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺:  将1L干燥DCM中的3-溴-4-氟苯甲酸 (100 g, 0.456 mol)和CDI (77.2 g, 0.547 mol)的溶液在室温下搅拌30 min，然后添加O,N-二甲基-羟胺 (53.4 g, 0.547 mol) 。将所得混合物搅拌过夜。在真空下除去溶剂，并且将残留物经柱层析纯化以得到3-溴-4-氟-N-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺。
步骤B：1-(3-溴-4-氟苯基)乙酮:   将500 mL THF中的3-溴-4-氟-N-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺 (50 g, 0.19 mol)的溶液在冰浴中冷却至0℃，然后向混合物中逐滴添加MeMgCl (27.3 g, 0.21 mol)。将反应混合物在N2下搅拌1 h。将反应混合物用饱和NH4Cl淬灭，并用EtOAc萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。将残留物用硅胶柱层析纯化以得到1-(3-溴-4-氟苯基)乙酮。
步骤C：5-乙酰基-2-氟苯甲腈：向300 mL DMF中1-(3-溴-4-氟苯基)乙酮 (81.3 g, 0.344 mol)的溶液中添加CuCN (67.4 g, 0.749 mol)，并将该混合物加热至回流，并在N2下搅拌10 h。将反应混合物用水淬灭，并用乙醚萃取。将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。将残留物用硅胶柱层析纯化以获得产物5-乙酰基-2-氟苯甲腈。
步骤D: 5-(溴乙酰基)-2-氟苯甲腈:  将500 mL DCM中5-乙酰基-2-氟苯甲腈 (20.0 g, 0.123 mol)的溶液加热至回流，持续2h，然后将300 mL DCM中溴溶液逐滴添加至沸腾混合物。将反应混合物加热至回流，并在N2保护下搅拌过夜。将反应混合物用水洗涤，并用DCM萃取。将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。将残留物用硅胶柱层析纯化以得到5-(溴乙酰基)-2-氟苯甲腈。
步骤D:  (3R)-4-[2-(3-氰基-4-氟苯基)-2-氧代乙基]-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯:   向DMF (160 mL)中5-(溴乙酰基)-2-氟苯甲腈 (13.1 g, 0.054 mol)的溶液添加(3R)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (13.1 g, 0.065 mol)和K2CO3 (11.77 g, 0.075mol)，并将混合物在室温下搅拌3 h。将反应混合物用水洗涤，并用EtOAc萃取。将有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并在真空中浓缩以得到标题化合物，其无需进一步纯化即用于下一步骤。
步骤E:  (3R)-4-[2-(3-氰基-4-氟苯基)-2-羟基乙基]-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯:  在0℃下向MeOH (400 mL)中(3R)-4-[2-(3-氰基-4-氟苯基)-2-氧代乙基]-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (20 g, 0.053 mol)的溶液逐份添加NaBH4 (15.6 g, 0.424 mol) ，并将混合物在室温下搅拌过夜。向反应混合物添加水，用EtOAc萃取。将有机层合并，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。将残留物用硅胶柱层析纯化以得到标题化合物。
步骤F:  (9aR)-3-(3-氰基-4-氟苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  在0℃下将100 mL THF中(3R)-4-[2-(3-氰基-4-氟苯基)-2-羟基乙基]-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (5.0 g, 13.2 mmol)的溶液搅拌10 min，然后在0℃下添加NaH (60%) (1.32 g, 33.0 mmol)。将所得白色悬浮液在0℃下剧烈搅拌5 min，然后在室温下搅拌1h。然后将所得悬浮液再次冷却至0℃，添加N-甲苯磺酰基咪唑，并所得溶液在0℃下再搅拌10 min，然后再次升温至室温并搅拌1h。然后将反应溶液再一次冷却至0℃，并通过缓慢添加饱和NH4Cl溶液小心淬灭过量氢化钠。所得双相溶液在饱和NH4Cl和EtOAc之间分配。将有机层用水和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。将残留物用硅胶柱层析纯化以得到标题化合物：
Figure 827073DEST_PATH_IMAGE085
。
步骤G:  (3S,9aR)-3-(3-氰基-4-氟苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯和(3R,9aR)-3-(3-氰基-4-氟苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  通过在先前步骤中获得的异构体的混合物的制备型HPLC分离而获得单一异构体。
中间体17A和17B (方法1)
Figure 395457DEST_PATH_IMAGE086
17A : (3R,9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯
17B : (3S,9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯
步骤A: 3-溴-6-氟-2-甲基苯甲腈 (方法A):  在0℃下将商售2-氟-6-甲基苯甲腈 (Apollo Scientific, 15.0 g, 111 mmol)溶解于三氟甲磺酸 (75 mL)中，然后添加NBS (20.7 g, 117 mmol)。将反应混合物在RT下搅拌1 h，然后倒入冰水中，并用DCM萃取两次。将有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，然后过滤，并蒸发至干燥，以得到3-溴-6-氟-2-甲基苯甲腈：LC-MS: M+1= 214, 216。
替代步骤 A (方法B):   向配有置顶搅拌器的3 L 3颈RB中加入2-氟-6-甲基-苯甲腈 (191.8 g., 1419 mmol)和MsOH (563 mL, 8516 mmol)。经30分钟逐份添加NBS (265 g., 1490 mmol)至该搅拌溶液，并将混合物在50 ℃下搅拌33小时。此时， HPLC显示反应大部分完成，因此将反应倒入1L冰中(记录为放热反应) ，用700 mL 30% EtOAc/己烷稀释并搅拌。分割出水层，并将有机层用1N NaOH和水洗涤2次。观察到水性取出物明显富含杂质。将有机物经MgSO4干燥、浓缩并在-10 ℃冰箱中储存过夜。沉淀在该时间形成，过滤并用5％ EtOAc /己烷洗涤。将沉淀物的第二批收获物与第一批收获物合并以提供3-溴-6-氟-2-甲基-苯甲腈。
步骤B: 3-乙烯基-6-氟-2-甲基苯甲腈:   将3-溴-6-氟-2-甲基苯甲腈 (23.6 g, 110 mmol)、乙烯三氟硼酸钾 (29.5 g, 221 mmol)、PdCl2(dppf)-CH2Cl2 加合物 (4.03 g, 5.51 mmol)和TEA (30.7 mL, 221 mmol)添加到250 mL乙醇中。将反应混合物脱气，然后在回流下搅拌4 h。LC-MS确认产物的存在。反应混合物用乙酸乙酯稀释，用盐水洗涤两次，干燥并蒸发至干。然后将粗制材料通过使用330g Redi-sep柱和10% ETOAC/己烷溶剂系统洗脱的MPLC层析纯化以得到3-乙烯基-6-氟-2-甲基苯甲腈。
步骤C: 6-氟-2-甲基-3-(环氧乙烷-2-基)苯甲腈:  在0℃下将3-乙烯基-6-氟-2-甲基苯甲腈 (14.9 g, 92.0 mmol)添加至DCM (400 mL)中，随后添加mCPBA (47.85 g , 277.5 mmol)并将该混合物在RT下搅拌72 h。反应混合物用饱和Na2S2O3水溶液洗涤，然后用1N NaOH和盐水洗涤。将有机层分离，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干燥。将粗产物通过330g Redi-sep柱、用0-100%己烷/DCM溶剂系统洗脱的层析纯化以得到6-氟-2-甲基-3-(环氧乙烷-2-基)苯甲腈。LC-MS: M+1= 178。
步骤D:  (3S)-4-[2-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)-2-羟基乙基]-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯:  将6-氟-2-甲基-3-(环氧乙烷-2-基)苯甲腈 (12.0 g, 67.7 mmol)和(S)-4-N-BOC-2-羟基甲基哌嗪 (22.0 g. 102 mmol)悬浮在乙醇(100 mL)中，然后在150℃下在微波装置中加热30分钟。将反应混合物冷却并蒸发至干燥。将残留物通过330g Redi-sep柱、用5%MeOH/95% EtOAc溶剂系统洗脱的MPLC层析纯化，以得到标题化合物。LC-MS : M+1= 394。
步骤E:  (9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  将(3S)-4-[2-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)-2-羟基乙基]-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (18.5 g, 47.0 mmol)和氰基亚甲基三正丁基膦 (20.4 g, 85.0 mmol)溶解于180 mL苯中。将反应混合物脱气，然后在100℃下加热16 h。LC-MS分析表明产物峰(M+1= 376)。将反应冷却并蒸发至干燥。将残留物通过330g Redi-sep柱、用20% 丙酮/ 80% 己烷混合物洗脱的层析纯化，以得到标题化合物的顺-反混合物。
步骤F: (3R,9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯和(3S,9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  使用Chiralpak AD  4.6 x 250mm 10μ柱用20%IPA/ 80% 庚烷溶剂系统分离步骤E的产物的顺-反异构体。17A(反式-第一个洗脱的异构体): 
Figure 673992DEST_PATH_IMAGE087
Figure 556497DEST_PATH_IMAGE088
。
中间体17B (方法2)
步骤A: 2-氟-6-甲基-苯甲腈:  向配有适配器、热电偶和搅拌棒的10 L 圆底烧瓶中加入DMA (6 L)，并在真空下脱气和用N2吹扫三次。向混合物中加入四(三苯基膦)钯(87.5 g, 72.0 mmol)，并将混合物在真空下脱气和用N2吹扫三次。将反应加热至80 oC，持续30 min。加入3-氟-2-碘甲苯 (575 g, 2.4 mol)和氰化锌(171.7 g, 1.46 mol)，并将混合物在真空下脱气和用N2吹扫三次。将反应混合物加热至80℃持续16小时，然后冷却至室温。将溶液加入1N NH4OH的2.0 L水溶液，并用1.5 L EtOAc萃取三次。用2 L盐水洗涤提取物，用Na2SO4干燥、过滤并浓缩。将粗产物在冷却的DCM中用mCPBA处理，然后通过层析纯化(PE/EA = 10:1)以得到标题化合物。
步骤B: 3-溴-6-氟-2-甲基-苯甲腈:   向配有置顶搅拌器的3 L 3颈圆底烧瓶中加入2-氟-6-甲基-苯甲腈 (191.8 g., 1419 mmol)和MsOH (563 mL, 8516 mmol)。经30分钟逐份添加NBS (265 g., 1490 mmol)至该搅拌溶液，并将混合物在50 ℃下搅拌33小时。此时，HPLC显示反应大部分完成，因此将反应倒入1L冰中(记录为放热反应) ，用700 mL 30% EtOAc/己烷稀释并搅拌。分割出水层，并将有机层用1N NaOH和水洗涤2次。观察到水性取出物明显富含杂质。将有机物经MgSO4干燥、浓缩并在-10 ℃冰箱中储存过夜。沉淀在该时间形成，过滤并用5％ EtOAc /己烷洗涤，提供第一批收获物。沉淀物的第二批收获物进一步提供3-溴-6-氟-2-甲基-苯甲腈。
步骤C: 3-(2-溴-乙酰基)-6-氟-2-甲基-苯甲腈:  将脱气三丁基(1-乙氧基乙烯基)锡 (200 mL, 591 mmol)添加至在脱气二氧杂环己烷 (1149 mL)中3-溴-6-氟-2-甲基-苯甲腈 (115 g, 537 mmol)和顺式-PdCl2(PPh3)2 (18.9 g, 26.9 mmol)的搅拌、室温混合物中，并将混合物在100 ℃搅拌22小时。到此时，HPLC显示起始材料完全转化(需要至少12小时)，可以通过钯金属镀覆到烧瓶侧面看到反应完成。此时将反应冷却至0℃，并添加THF (575 mL)和水(230 mL)，随后添加NBS (110 g, 618 mmol)(经15 min逐份添加，保持内部温度< 5℃)。30分钟后，HPLC显示中间体烯醇醚的完全消耗。将该溶液用MTBE (1000 mL)稀释，并用0.5% HBr水溶液 (3x 500 mL)洗涤，然后用水洗涤。将有机物经MgSO4干燥，过滤并浓缩。产生沉淀物，过滤该固体，并用己烷洗涤几次。将它通过氮吹扫干燥，提供3-(2-溴-乙酰基)-6-氟-2-甲基-苯甲腈。
步骤D: (3R,9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基-苯基)-3-羟基-六氢-吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8-甲酸叔丁酯: 将二异丙基乙胺 (44.0 mL, 252 mmol)添加至在THF (1000 mL)中72 wt% 3-(2-溴-乙酰基)-6-氟-2-甲基-苯甲腈 (69 g, 194 mmol)和(S)-4-N-Boc-2-羟基甲基-哌嗪 (42.0 g, 194 mmol)的搅拌、室温混合物中，并将混合物在室温下搅拌18小时。将反应用1 L EtOAc稀释，用500 mL 10% w/w NaHCO3水溶液洗涤两次，经MgSO4干燥，过滤并浓缩。将残留物通过硅胶上的柱层析(40-80% EtOAc/己烷, 线性梯度)纯化，以得到标题化合物。
步骤E: (S)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基-苯基)-6,7,9,9a-四氢-1H-吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8-甲酸叔丁酯:  将甲磺酰基-Cl (17.2 mL, 221 mmol)逐滴添加至搅拌的< 5℃内部温度的CH2Cl2 (1000 mL)中(3R,9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基-苯基)-3-羟基-六氢-吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8-甲酸叔丁酯 (66.6 g, 170 mmol)和三乙胺 (71.1 mL, 510 mmol)的混合物中(发生放热，所以必须保持添加缓慢)，并将反应升温至室温并保持30分钟，到此时反应完成。将溶液用500 mL 10% w/w NaHCO3水溶液洗涤。将有机物经MgSO4干燥，过滤并浓缩。将所得材料在一段时间加热(溶液保持<50℃)的情况下溶于最小量的EtOAc (125 mL)中，直到所有固体溶解。将溶液搅拌冷却，然后将350 mL己烷逐滴添加过夜。到第二天早上，溶液已经澄清，并存在相当多粉末。通过过滤收集固体，并用20% EtOAc/己烷洗涤，提供产物。将母液浓缩，直至出现沉淀，将其过滤，以得到额外的(S)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基-苯基)-6,7,9,9a-四氢-1H-吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8-甲酸叔丁酯。
步骤F: (3S,9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基-苯基)-六氢-吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8-甲酸叔丁酯:   向1 L 3颈RB中加入5% Pd/CaCO3 (10.0 g., 4.02 mmol)、MeOH (405 mL)和(S)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基-苯基)-6,7,9,9a-四氢-1H-吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8-甲酸叔丁酯(15.0 g., 40.2 mmol)。将溶液用N2吹扫5 min，然后用气球压力置于氢气气氛下，并在搅拌的情况下升温至40℃。38 h后，HPLC显示烯烃的完全转化，其中非对映异构体的顺式:反式比率为5:1。将悬浮液冷却至室温，经硅藻土垫过滤并浓缩。将残留物经由柱层析(60-100% EtOAc/己烷, 线性梯度)纯化，以得到标题化合物。
Figure 475692DEST_PATH_IMAGE089
中间体17A (方法2)
向配有氮入口适配器、热电偶和隔膜的3颈圆底烧瓶中加入(3R,9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基-苯基)-3-羟基-六氢-吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8-甲酸叔丁酯(330 g, 840 mmol)、TFA (1.65 L, 21 mol)和3300 mL DCM。以一份添加Et3SiH (292 g, 2.52 mol, 3 当量)，并将反应混合物在室温下搅拌24 h。将反应混合物浓缩，并用甲苯(100 mL)共沸以去除TFA。将所得材料溶解于DCM (1.7 L)中，并小心加入2.5 M Na2CO3 (pH 应为碱性)。以一份添加Boc2O (218 g, 1.2 当量)，并将反应混合物在室温下搅拌2 h。将有机层分离、浓缩并经由柱层析(0-30% 丙酮-己烷)纯化以得到顺式/反式异构体产物的混合物。手性SFC纯化(Berger MultiGramTM SFC, Mettler Toledo Co, Ltd, AD 250mm*50mm, 5 um柱, A: 超临界CO2, B:甲醇, A:B = 85:15，150 mL/min)得到主要反式非对映异构体17A以及顺式非对映异构体17B 。
中间体17C 和17D (方法1)
Figure 418241DEST_PATH_IMAGE090
17C : (3S,9aR)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯
17D : (3R,9aR)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯
步骤A: (3R)-4-[2-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)-2-羟基乙基]-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯: 将6-氟-2-甲基-3-(环氧乙烷-2-基)苯甲腈 (如上述I-17A和I-17B, 方法1, 步骤 A-C制备) (4.80 g, 27.1 mmol )和(R)-4-N-BOC-2-羟基甲基-哌嗪 (商售，例如来自Acesys Pharmatech, catalog # A1612R;以及也描述于 J. Org. Chem, 2007, 72(22), 第8591-8592页) (8.79g. 40.6 mmol)悬浮在EtOH (30mL)中，并在150℃下在微波装置中加热1 h。将反应混合物冷却并蒸发至干燥。将残留物通过330 g ISCO Redi-sep柱、用乙酸乙酯至5% MeOH/ 乙酸乙酯梯度洗脱的层析纯化，以得到标题化合物。LC-MS: M+1= 394;
步骤B: (3S,9aR)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯和(3R,9aR)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  (3R)-4-[2-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)-2-羟基乙基]-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (7.14 g, 18.2 mmol)和氰基亚甲基三丁基膦 (7.88 g, 32.7 mmol)溶解于苯 (60.0 mL)中，然后在100℃加热过夜。将反应混合物冷却并蒸发至干燥。将残留物通过330g ISCO Redi-sep柱、用10% 丙酮 /DCM –至 20% 丙酮/DCM梯度洗脱的层析纯化，以得到反-顺混合物。将异构体通过手性HPLC (70mL/min，15% 2:1 MeOH:MeCN:CO2，在30x 250mm Chiralpak IC柱(Diacel Chemical Industries, LTD.)，以100巴，35℃, 230nM)来拆分。
中间体17C和17D (方法2)
步骤A: 2-氟-6-甲基-苯甲腈:  向配有适配器、热电偶和搅拌棒的10 L 圆底烧瓶中加入DMA (6 L)，并在真空下脱气和用N2吹扫三次。向混合物中加入四(三苯基膦)钯 (87.5 g, 72.0 mmol)，并将混合物在真空下脱气和用N2吹扫三次。将反应加热至80℃持续30 min。加入3-氟-2-碘甲苯 (575 g, 2.4 mol)和氰化锌(171.7 g, 1.46 mol)，并将混合物在真空下脱气和用N2吹扫三次。将反应混合物加热至80℃持续16小时，然后冷却至室温。将溶液加入1N NH4OH的2.0 L水溶液，其用1.5 L EtOAc萃取三次，用2 L盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗产物在冷却的DCM中用mCPBA(约0.2当量)处理以氧化三苯基膦和促进纯化，然后通过层析(PE/EA = 10:1)纯化以得到标题化合物。
步骤B: 3-溴-6-氟-2-甲基-苯甲腈:  向配有置顶搅拌器的3 L 3颈圆底烧瓶中加入2-氟-6-甲基-苯甲腈 (191.8 g., 1419 mmol)和MsOH (563 mL, 8516 mmol)。经30分钟逐份添加NBS (265 g., 1490 mmol)至该搅拌溶液，并将混合物在50 ℃下搅拌33小时。将反应倒入1L冰中，用700 mL 30% EtOAc/己烷稀释并搅拌。分割出水层，并将有机层用1N NaOH洗涤2次，然后用水洗涤。将有机物经MgSO4干燥、浓缩并在-10 ℃冰箱中储存过夜。沉淀在该时间形成，过滤并用5％ EtOAc /己烷洗涤，提供产物的第一批收获物。沉淀物的第二批收获物提供额外的3-溴-6-氟-2-甲基-苯甲腈。
步骤C: 3-(2-溴-乙酰基)-6-氟-2-甲基-苯甲腈:   将脱气的三丁基(1-乙氧基乙烯基)锡 (200 mL, 591 mmol)添加至在脱气的二氧杂环己烷 (1149 mL)中3-溴-6-氟-2-甲基-苯甲腈 (115 g, 537 mmol)和顺式-PdCl2(PPh3)2 (18.9 g, 26.9 mmol)的搅拌、室温混合物中，并将混合物在100 ℃搅拌22小时。可以通过钯金属镀覆到烧瓶侧面看到反应完成。将反应冷却至0℃，并添加THF (575 mL)和水(230 mL)，随后添加NBS (110 g, 618 mmol)(经15 min逐份添加，保持内部温度< 5℃)。30分钟后，HPLC显示中间体烯醇醚的完全消耗。将该溶液用MTBE (1000 mL)稀释，并用0.5% HBr水溶液 (3x 500 mL)洗涤，然后用水洗涤。将有机物经MgSO4干燥，过滤并浓缩。产生沉淀物，过滤该固体，并用己烷洗涤几次。将它通过氮吹扫干燥，提供3-(2-溴-乙酰基)-6-氟-2-甲基-苯甲腈。
步骤D: (3S,9aR)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基-苯基)-3-羟基-六氢-吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8-甲酸叔丁酯:  将二异丙基乙胺 (156 mL, 894 mmol)添加至在THF (3500 mL)中3-(2-溴-乙酰基)-6-氟-2-甲基-苯甲腈 (176 g, 688 mmol)和(R)-4-N-Boc-2-羟基甲基-哌嗪 (149 g, 688 mmol)的搅拌、室温混合物中，并将混合物在室温下搅拌18小时。将反应用3 L EtOAc稀释，用1500 mL 10% NaHCO3水溶液洗涤两次，经MgSO4干燥，过滤并浓缩。将残留物通过硅胶上的柱层析(40-80% EtOAc/己烷, 线性梯度)纯化，以提供标题化合物。
步骤E: 17C和17D:  向配有氮入口适配器、热电偶和隔膜的5000-mL 3颈圆底烧瓶中加入步骤D的产物(273 g, 696.2 mmol), TFA (1340 mL, 17.45 mol, 25 当量), 和1300 mL DCM。以一份添加Et3SiH(333 mL, 2.1 mol, 3 当量)，并将反应混合物在室温下搅拌12 h。将反应混合物浓缩以去除TFA。将所得材料溶解于DCM (600 L)中，并小心加入2.5 M Na2CO3 (1400 mL, 3.5 mol, 5当量)  (pH 应为碱性)。以一份添加Boc2O (243 mL, 1.05 mol, 1.5 当量) ，并将反应混合物在室温下搅拌2 h。将有机层分离，浓缩，并经由柱层析(0-30% 丙酮-己烷)纯化，以得到产物(约2:1 反式:顺式)，将其通过手性SFC分离，以得到两种单一异构体：手性SFC HPLC分离条件: 仪器:Berger MultiGram SFC , Mettler Toledo Co, Ltd.;  柱:Chiralpak AD柱(Diacel Chemical Industries, LTD.) 250mm X 50mm, 5um.;  流动相:A: 超临界CO2, B:MeOH, A:B =85:15，150mL/min.; 柱温:38℃; 喷嘴压力:100Bar;  喷嘴温度:60℃; 蒸发器温度:20℃; 微调器温度(Trimmer Temp):25℃ .; 波长:235 nm。
Figure 401426DEST_PATH_IMAGE092
中间体18A
Figure 873996DEST_PATH_IMAGE093
(3R,9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-甲酸叔丁酯
步骤A:  (3S)-4-(2-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)-2-羟基乙基)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯:    在微波中在150℃将乙醇(10mL)中的6-氟-2-甲基-3-(环氧乙烷-2-基)苯甲腈 (785 mg, 4.43 mmol)和(S)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (1340 mg, 6.2 mmol)的混合物加热3h。将挥发物蒸发并将残留物在Biotage上使用40-100% 乙酸乙酯/己烷纯化，以得到标题化合物。LC/MS: (M+1)+: 394.19。
步骤B:  (3S)-4-(2-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)-2-羟基乙基)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸苄酯:  在rt向二氯甲烷 (20 mL)中(3S)-4-(2-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)-2-羟基乙基)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (2.87 g, 7.32 mmol)的溶液添加三氟乙酸 (20 mL)，并将所得溶液在rt下搅拌1 h。去除挥发性溶剂后，将残留物溶解于二氯甲烷 (50 mL)中。在0 ℃下向上述溶液中逐滴添加三乙胺 (6.12 mL, 43.9 mmol)和氯甲酸苄酯 (1.1 mL, 7.3 mmol)。将反应溶液在0 ℃下搅拌1 h，然后用饱和碳酸氢钠溶液(200 mL)淬灭。然后将混合物用二氯甲烷 (3x100 mL)萃取。将合并的有机层经硫酸钠干燥并浓缩，以得到标题化合物。LC/MS: (M+1)+:428.18。
步骤C:  (7R,9aR)-8-烯丙基-7-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-甲酸苄酯和(7S,9aR)-8-烯丙基-7-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-甲酸苄酯:  在90 ℃下将磺酰氯(14.0 g, 118 mmol)中 (3S)-4-(2-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)-2-羟基乙基)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸苄酯 (1.68 g, 3.93 mmol)的溶液加热1 h。去除挥发物后，将残留物溶于DMF (16 mL)中，在0℃下在密封管中用烯丙胺 (1.726 mL, 23.58 mmol)和碘化钠 (0.059 g, 0.39 mmol) 处理，并将所得混合物在90℃下加热1 h。将混合物稀释在乙酸乙酯 (300 mL)中，用饱和碳酸氢钠 (3 x 200 mL)洗涤，经硫酸钠干燥，浓缩，并将残留物在Biotage上使用40-80% 乙酸乙酯/己烷进行纯化，以得到标题化合物(在TLC上较高极性)。LC/MS: (M+1)+: 449.24。
步骤D:  (3R,9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)四氢-1H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-2,8(9H,9aH)-二甲酸8-苄酯2-叔丁酯:  在35℃下将二氯甲烷 (10 mL)中 (7R,9aR)-8-烯丙基-7-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-甲酸苄酯 (1260 mg, 2.81 mmol), 1,3-二甲基嘧啶-2,4,6(1H,3H,5H)-三酮 (1316 mg, 8.430 mmol)和四(三苯基膦)钯(0) (162 mg, 0.140 mmol)的混合物加热4 h。冷却至rt后，添加二碳酸二-叔丁酯 (736 mg, 3.37 mmol)和三乙胺 (1579 μL, 11.24 mmol)，并将所得溶液在rt搅拌过夜。浓缩后，将残留物在Biotage上使用40% EtOAc/己烷进行纯化，以得到标题化合物。LC/MS: (M+1)+: 509.32。
步骤E:  (3R,9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-甲酸叔丁酯:  向MeOH (100 mL)中(3R,9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)四氢-1H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-2,8(9H,9aH)-二甲酸8-苄酯2-叔丁酯 (600 mg, 1.180 mmol)的溶液添加碳载钯 (10%,126 mg, 0.118 mmol)，并将所得混合物在rt下进行加氢过夜。将反应混合物通过硅藻土过滤，用甲醇和二氯甲烷 (1:1)的混合物洗涤并将滤液浓缩，以得到标题化合物：LC/MS: (M+1)+: 375.28。
中间体18B
Figure 784183DEST_PATH_IMAGE094
(3S,9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-甲酸叔丁酯
步骤A:  (3S,9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)四氢-1H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-2,8(9H,9Ah)-二甲酸8-苄酯2-叔丁酯:  在35 ℃下将二氯甲烷 (10 mL)中 (7S,9aR)-8-烯丙基-7-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-甲酸苄酯 (518 mg, 1.155 mmol), 1,3-二甲基嘧啶-2,4,6(1H,3H,5H)-三酮(518 mg, 1.16 mmol)和四(三苯基膦)钯(0) (66.7 mg, 0.058 mmol)的混合物加热4 h。冷却至rt后，添加二碳酸二-叔丁酯 (302 mg, 1.39 mmol)和三乙胺 (649 μL, 4.62 mmol)，并将所得溶液在rt搅拌过夜。浓缩后，将残留物在Biotage上使用40% EtOAc/己烷进行纯化，以得到标题化合物：LC/MS: (M+1)+: 509.26。
步骤B:  (3S,9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-甲酸叔丁酯:    向MeOH (100 Ml)中(3S,9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)四氢-1H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-2,8(9H,9Ah)-二甲酸8-苄酯2-叔丁酯 (0.78 g, 1.534 mmol)的溶液添加碳载钯 (10%,0.163 g, 0.153 mmol)，并将所得混合物在rt下进行加氢过夜。将反应混合物通过硅藻土过滤，用甲醇和二氯甲烷 (1:1)的混合物洗涤并将滤液浓缩，以得到标题化合物：LC/MS: (M+1)+: 375.28。
中间体18C
(3S,9aR)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-甲酸叔丁酯: 从6-氟-2-甲基-3-(环氧乙烷-2-基)苯甲腈和(R)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯开始，以与对于合成(3R,9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-甲酸叔丁酯所述方式类似的方式制备标题化合物。LC/MS: 375.16 (M+1)+。
中间体18D
Figure 497503DEST_PATH_IMAGE096
(3R,9aR)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-甲酸叔丁酯: 从(7R,9aS)-8-烯丙基-7-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-甲酸苄酯 (获自合成(3S,9aR)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-甲酸叔丁酯)开始，以与对于合成(3S,9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-甲酸叔丁酯所述方式类似的方式制备标题化合物。LC/MS: 375.14 (M+1)+。
中间体19A和19B
Figure 886896DEST_PATH_IMAGE097
(3S,9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噻嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯和(3R,9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噻嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯
步骤A:  (3S)-3-(乙酰基硫代甲基)-4-(2-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)-2-羟基乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯:   将(3S)-4-(2-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)-2-羟基乙基)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (上述合成, 0.090 g, 0.23 mmol)溶解于THF (2.3 mL)中，并冷却至0℃。添加三乙胺 (0.038 mL, 0.274 mmol)，随后添加Ms-Cl (0.020 mL, 0.252 mmol)和DMAP (2.79 mg, 0.023 mmol)。去除冰浴并继续搅拌2小时。然后将反应混合物在减压下浓缩。将所得残留物再溶于DMSO (2 mL)中，并用硫代乙酸钾 (0.035 g, 0.306 mmol)处理。将反应混合物在室温下在氮气下搅拌过夜，然后在45℃下加热2 h。将混合物用乙酸乙酯稀释，并用水(3次)和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。粗产物通过柱层析 (100% 己烷至80% EtOAc/己烷)进行纯化，以得到所需产物LC/MS：M+1 = 452.3。
步骤B:   (3S)-3-(乙酰基硫代甲基)-4-(2-氯-2-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯:   向甲苯 (0.62 mL)中(3S)-3-(乙酰基硫代甲基)-4-(2-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)-2-羟基乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (30.8 mg, 0.0680 mmol)的溶液添加亚硫酰氯 (14.9 μL, 0.205 mmol)。将混合物用冰浴冷却，然后逐滴添加吡啶(22.1 μL, 0.273 mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌20 min，然后用1小时使之升温至室温，最后在70℃下加热30 min。将反应混合物浓缩并将残留物用乙酸乙酯稀释，用最少量饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，然后用盐水洗涤。将有机层分离，经无水硫酸钠垫过滤并浓缩。直接用于下一步骤。
步骤C:   (3S,9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噻嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯和(3R,9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噻嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:   将THF (34 mL)中(3S)-3-(乙酰基硫代甲基)-4-(2-氯-2-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (320 mg, 0.681 mmol)用甲醇钠(441 mg, 2.04 mmol)处理。将混合物在N2下在室温下搅拌3 h。LC-MS显示形成作为一对非对映异构体的所需产物。将反应混合物浓缩并在乙酸乙酯和水之间分配。将有机层分离，并用盐水洗涤，干燥，并蒸发至干燥。将粗产物通过柱层析法(100%己烷，持续2 CV, 100%己烷至35% EtOAc/己烷，持续4 CV，然后保持在35%，持续4 CV，然后通过4 CV 增加至80% EtOAc/己烷(CV =柱体积))纯化，以得到标题化合物。
中间体20A 和20B
Figure 646091DEST_PATH_IMAGE099
20A :   (3R,9aS)-3-(3-氰基-2,4-二氟苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  20B:  (3S,9aS)-3-(3-氰基-2,4-二氟苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯
步骤A: 2,6-二氟-3-羟基苯甲腈: 在0℃下将2,6-二氟-3-甲氧基苯甲腈 (4.42 g, 26.1 mmol)溶解于DCM (10 mL)，然后添加1 M BBr3 (52.2 mL, 52.2 mmol)。然后将反应混合物升温至RT并搅拌过夜。将反应混合物倒入冰水中，并用更多的DCM萃取。将有机层分离，用Na2SO4干燥，过滤并蒸发至干燥，以得到2,6-二氟-3-羟基苯甲腈：LC-MS: M+1= 156。
步骤B: 三氟甲磺酸3-氰基-2,4-二氟苯基酯:  将2,6-二氟-3-羟基苯甲腈 (3.50 g, 22.6 mmol)溶解于DCM (50 mL)中，冷却至0℃，添加TEA(7.87 mL, 56.4 mmol)，随后添加三氟甲磺酸酐(7.63 mL, 45.1 mmol)。将反应混合物搅拌1小时，然后倒入冰水中，并用更多DCM萃取。将有机层分离，并用NaHCO3饱和水溶液洗涤，然后用盐水洗涤，然后经MgSO4干燥，过滤并蒸发至干燥。将粗材料通过330 g Redi-sep柱，用0-80% EtOAc/己烷洗脱来通过MPLC层析纯化，以得到三氟甲磺酸3-氰基-2,4-二氟苯基酯。
步骤C: 3-乙烯基-2,6-二氟苯甲腈:  将三氟甲磺酸3-氰基-2,4-二氟苯基酯 (5.20 g, 18.1 mmol)、乙烯三氟硼酸钾 (4.85 g, 36.2 mmol), PdCl2(dppf)-CH2Cl2 加合物 (0.662 g, 0.905 mmol),和TEA (5.05mL, 36.2 mmol)添加到75 mL乙醇中。将反应混合物脱气，然后在回流下加热4 h。LC-MS分析确认产物峰。反应混合物用乙酸乙酯稀释，用盐水洗涤两次，干燥并蒸发至干。然后将粗材料通过330g Redi-sep柱，用10% EtOAc/己烷溶剂系统洗脱来通过MPLC层析纯化，以得到3-乙烯基-2,6-二氟苯甲腈。
步骤D: 2,6-二氟-3-(环氧乙烷-2-基)苯甲腈:  在0℃下将 3-乙烯基-2,6-二氟苯甲腈 (1.70 g, 10.3 mmol) 添加至DCM (10 mL)。然后添加mCPBA (5.33 g, 30.9 mmol)，并将混合物在RT搅拌48 h。反应混合物用饱和Na2S2O3水溶液洗涤，然后用1N NaOH和盐水洗涤。将有机层分离，并用Na2SO4干燥，过滤并蒸发至干燥。将粗产物通过120 g Redi-sep柱，用0-100% EtOAc/己烷溶剂系统洗脱来通过MPLC层析纯化。分离2,6-二氟-3-(环氧乙烷-2-基)苯甲腈。
步骤E:  (3S)-4-[2-(3-氰基-2,4-二氟苯基)-2-羟基乙基]-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯:  将 2,6-二氟-3-(环氧乙烷-2-基)苯甲腈 (1.50 g, 8.28 mmol)和(S)-4-N-BOC-2-羟基甲基哌嗪 (2.40 g, 11.1 mmol)悬浮在乙醇(15 mL)中，然后在150℃下在微波装置中加热30 min。将反应混合物冷却并蒸发至干燥。将残留物通过120g Redi-sep柱、用5%MeOH/95% EtOAc洗脱的层析纯化，以得到标题化合物 LC-MS: M+1= 398。
步骤F: (9aS)-3-(3-氰基-2,4-二氟苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  将(3S)-4-[2-(3-氰基-2,4-二氟苯基)-2-羟基乙基]-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (1.2 g, 3.0 mmol)和氰基亚甲基三正丁基膦 (1.31 g, 5.44 mmol)溶解于5 mL苯中。将反应混合物脱气，并加热至100℃持续16 h。LC-MS分析显示在2.07 min产物峰(M+1= 380)。将反应冷却并蒸发至干燥。将残留物通过80g Redi-sep柱、用40% EtOAc/60% 己烷混合物洗脱的MPLC层析纯化，以得到标题化合物的顺-反混合物。
步骤G：异构体20A和20B :  步骤F的产物的异构体使用Chirapak AD 4.6x 250 mm 10μ柱和用25%IPA/75%庚烷洗脱的手性HPLC来分离。(3R,9aS) 反式-异构体20A第一个洗脱出来，(3S,9aS) 顺式-异构体20B第二个洗脱出来：
Figure 470827DEST_PATH_IMAGE100
。
中间体20C和20D
Figure 668514DEST_PATH_IMAGE102
20C :  (3S,9aR)-3-(3-氰基-2,4-二氟苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯和 20D :  (3R,9aR)-3-(3-氰基-2,4-二氟苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯
步骤A: (3R)-4-(2-(3-氰基-2,4-二氟苯基)-2-羟基乙基)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯:  2,6-二氟-3-(环氧乙烷-2-基)苯甲腈 (3.70 g, 20.4 mmol)和(R)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (6.63 g, 30.6 mmol)溶解于乙醇 (36.0 mL)中，然后放置于3-20mL密封管中并在140℃下微波处理1 h。将溶剂蒸发并将合并的残留物通过120g ISCO Redi-sep柱、用50% 至100%乙酸乙酯/己烷溶剂系统的层析纯化，以得到标题化合物 LC-MS (IE, m/z): 398 [M + 1]+。
步骤B:  (9aR)-3-(3-氰基-2,4-二氟苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯和(3S,9aR)-3-(3-氰基-2,4-二氟苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  将(3R)-4-(2-(3-氰基-2,4-二氟苯基)-2-羟基乙基)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (7.30 g, 18.4 mmol)溶解于苯 (90 mL)中，并添加氰基亚甲基三丁基膦  (7.98 g, 33.1 mmol)。将混合物置于五个独立的20 mL微波管中，脱气并在100℃加热过夜。LC-MS显示产物峰。合并所有反应混合物并浓缩。将粗产物通过330g ISCO Redi-Sep柱使用10% 丙酮/己烷溶剂系统层析纯化，以得到标题化合物。将非对映异构体通过使用以下条件的制备型SFC拆分：含0.2% DEA的15% MeOH)/CO2，在手性OJ 21 x 250 mm柱，50ml/min, 191mg/mL，在MeOH/MeCN中, 35℃, 220nm。
Figure 568337DEST_PATH_IMAGE103
中间体21A和21B
21A : 2,4-二氟-5-[(3S,9aS)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈和
21B : 2,4-二氟-5-[(3R,9aS)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈
步骤A: 5-氰基-2,4-二氟苯甲酸:  向80 mL THF和20 mL水中5-溴-2,4-二氟苯甲腈 (6.00 g, 27.5 mmol)的溶液添加TEA (3.00 g, 29.7 mmol)和Pd(dppf)Cl2 (0.8 g)。将反应在2 MPa的CO下加热至100 ℃持续18小时。冷却至室温后，将反应倒入500 mL水。过滤沉淀出的棕色固体。将滤饼用水洗涤，然后通过硅胶柱纯化以得到5-氰基-2,4-二氟苯甲酸。
步骤B: 5-(溴乙酰基)-2,4-二氟苯甲腈:  在0℃下将草酰氯 (5 mL)逐滴添加至具有0.5 mL DMF的30 mL DCM中5-氰基-2,4-二氟苯甲酸 (2.00 g, 10.9 mmol)的悬浮液。将混合物在25 ℃下搅拌45分钟，并将透明溶液在减压下浓缩至干燥。将酸性氯化物溶解在70 mL THF中，并用冰/水冷却至0 ℃。逐滴添加CH2N2溶液(在约150 mL乙醚中70 mmol)，并在0 ℃下搅拌2小时，然后添加15 mL 浓缩(47 %) HBr。将混合物在0℃下搅拌20分钟，然后用600 mL EtOAc稀释。随后将混合物随后用水(30 mL)、饱和NaHCO3(30 mL)和盐水(30 mL)洗涤。将EtOAc层用无水Na2SO4干燥并浓缩，以得到5-(溴乙酰基)-2,4-二氟苯甲腈。
步骤C: (3S)-4-[2-(5-氰基-2,4-二氟苯基)-2-氧代乙基]-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯:  在20 ℃下将50 mL THF中5-(溴乙酰基)-2,4-二氟苯甲腈 (2.5 g, 9.6 mmol),  (3S)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (2.1 g, 9.6 mmol)和DIEA (1.90 g, 14.4 mmol)的悬浮液搅拌10小时。将反应混合物倒入冰水中，并用EtOAc (3x 200 mL)萃取。合并的有机层用水和盐水洗涤，干燥并浓缩。将残留物用5 % MeOH/DCM洗脱的柱层析纯化，以提供标题化合物。
步骤D: 21B: 2,4-二氟-5-[(3R,9aS)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈和21A: 2,4-二氟-5-[(3S,9aS)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈:  向50 mL TFA中 (3S)-4-[2-(5-氰基-2,4-二氟苯基)-2-氧代乙基]-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (3.1 g, 7.8 mmol)的溶液添加Et3SiH (10.4 g, 89.0 mmol)。将混合物在50 ℃下搅拌90分钟，并在减压下浓缩至干燥。将残留物用乙醚洗涤，纯化所得油状物，并通过SFC (柱:Chiralpak AD-H 100×4.6mm I.D., 5um; 流动相:乙醇(0.05% DEA)/CO2，5 %至40%; 流速:4.5mL/min; 波长:220nm; 温度:40. 梯度:0 min 5%, 0.5 min 5%, 2.25 min 40%, 3.65 min 40%, 4.0 min 5%, 5.0 min 5%)分离异构体以得到标题化合物：
Figure 295170DEST_PATH_IMAGE105
Figure 983641DEST_PATH_IMAGE106
。
中间体 22
(3S, 9aR)-3-(5-氰基-2-氟-4-甲氧基苯基) 六氢吡嗪并 [2, 1-c] [1, 4] 噁嗪-8 (1H)-甲酸叔丁酯
步骤A: 1-溴-4-氟-2-甲氧基苯:以一份向300 mL DMF中2-溴-5-氟苯酚 (50 g, 0.26 mol)的溶液添加K2CO3 (72.8 g, 0.520 mol)，并在0 ℃下逐滴添加MeI (44.6 g, 0.310 mol)。在室温下将混合物搅拌3小时后，将反应倒入1L水中并用EtOAc (300 mL X 3)萃取。合并的有机层用水、盐水洗涤，干燥并浓缩以得到1-溴-4-氟-2-甲氧基苯。
步骤B: 4-氟-2-甲氧基苯甲腈:  以一份向250 mL DMF中1-溴-4-氟-2-甲氧基苯 (25 g, 0.12 mol)的溶液添加Zn(CN)2 (28.6 g, 0.240 mol)和Pd(PPh3)4 (7.05 g, 6.10 mmol)，并将反应充满Ar并加热至100 ℃持续10小时。然后将反应倒入1L EtOAc中，并通过硅藻土垫过滤。将滤液用水、盐水洗涤，干燥并浓缩至固体，其通过硅胶柱纯化以得到4-氟-2-甲氧基苯甲腈。
步骤C: 5-溴-4-氟-2-甲氧基苯甲腈: 在-10℃下向300 mL浓缩H2SO4中4-氟-2-甲氧基苯甲腈 (35 g, 0.23 mol)的溶液逐份滴加NBS (42 g, 0.23 mol)，并将反应在室温下搅拌2小时。然后将反应逐份倒入2 L冰中，并过滤沉淀出的固体。将滤饼用水洗涤，然后将固体真空干燥，以得到5-溴-4-氟-2-甲氧基苯甲腈。
步骤D: 5-(溴乙酰基)-4-氟-2-甲氧基苯甲腈: 向500 mL烧瓶中添加5-溴-4-氟-2-甲氧基苯甲腈 (4.00 g, 17.4 mmol), 二(三苯基膦)氯化钯(II)(0.61 g, 0.87 mmol), 三丁基(1-乙氧基-乙烯基)锡 (9.42 mL, 26.1 mmol)，随后添加 1, 4-二氧杂环己烷 (40 mL)。将所得混合物在95℃搅拌3 h；将烧瓶取出油浴并冷却至室温，随后用THF/H2O (50/25 mL)的混合物处理并置于冰浴中。以小份向烧瓶添加NBS (6.19 g, 34.8 mmol)；在0℃下搅拌0.5 h后，LC表明期望产物的形成。将反应混合物取出冰浴并缓慢升温至rt。将反应混合物用EtOAc (3 X 100 mL)萃取，用盐水和水洗涤，然后干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩至干燥，随后经硅胶用己烷/EtOAc (1/0.5)的溶剂系统分离，以得到期望产物。LC/MS: [(M+2)]+ =274。
步骤E:  (3R)-4-[5-氰基-2-氟-4-甲氧基苯基)-2-氧代乙基]-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯:  向250 mL烧瓶中添加5-(溴乙酰基)-4-氟-2-甲氧基苯甲腈 (2.00 g, 7.35 mmol), (R)-N-Boc-2-羟基甲基-哌嗪 (3.18 g, 14.7 mmol), DIEA (2.57 mL, 14.7 mmol)和THF (50 mL)，并在rt搅拌1h；反应混合物的LC分析表明反应的完成。将溶液用EtOAc (100 mL)处理，用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩至干燥。然后将残留物在硅胶上用5% MeOH/DCM的溶剂系统洗脱纯化，以提供所需产物。LC/MS: [(M+1)]+ =408。
步骤F:   (3S, 9aR)-3-(5-氰基-2-氟-4-甲氧基苯基) 六氢吡嗪并 [2, 1-c] [1, 4] 噁嗪-8 (1H)-甲酸叔丁酯: 向500 mL 烧瓶中添加(3R)-4-[5-氰基-2-氟-4-甲氧基苯基)-2-氧代乙基]-3-(羟基甲基) 哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (2.20 g, 5.40 mmol), 三乙基硅烷 (4.31 mL, 27.0 mmol),和DCM/TFA (50/20 mL)的混合物。然后将所得混合物在rt搅拌过夜。反应混合物的LC分析表明还原的完成。将反应混合物浓缩至干燥，并将获得的残留物溶解于DCM (20 mL)和NaHCO3水溶液和BOC2O (1.2 g, 5.4 mmol)，并在rt搅拌2h。通过LC对反应混合物的分析表明反应完成。将反应混合物用DCM (50 mL)进一步稀释，并将混合物转移至分液漏斗中，并分离各层。将有机层用盐水、水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并用5 % MeOH/DCM的溶剂系统经硅胶纯化，以提供标题化合物。注：只形成反式异构体。
Figure 38764DEST_PATH_IMAGE108
中间体23A和23B
Figure 257255DEST_PATH_IMAGE109
23A:  (3R,9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲氧基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯和23B:  (3S,9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲氧基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯
步骤A: 3-溴-6-氟-2-甲氧基苯甲腈 (方法1):  在0℃下将2-氟-6-甲氧基苯甲腈 (8.30 g, 54.9 mmol )溶解于三氟甲磺酸 (75 mL)中，然后添加NBS (10.3 g, 57.7 mmol )。将反应混合物在RT搅拌1 h。LC-MS显示没有起始材料峰。将反应混合物倒入冰中，并用DCM萃取两次。将合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并蒸发至干燥。将残留物通过330g Redi-sep柱并用10% 至50% EtOAc / 己烷溶剂系统洗脱来层析纯化，以得到标题化合物。
步骤B: 3-乙烯基-6-氟-2-甲氧基苯甲腈:  在200 mL烧瓶中将3-溴-6-氟-2-甲氧基苯甲腈 (4.40 g, 19.1 mmol),  乙烯三氟硼酸钾 (5.12 g, 38.3 mmol), PdCl2(dppf)-CH2Cl2 加合物 (0.7 g, 1 mmol)和TEA (5.33 mL, 38.3 mmol)添加至80 mL乙醇中。将反应混合物脱气，并加热至回流持续4 h。将反应混合物冷却，然后去除大部分EtOH。将残留物用乙酸乙酯淬灭。将混合物用盐水洗涤两次。将有机层分离，并用Na2SO4干燥，过滤并蒸发至干燥。将残留物通过330g RediSep柱并用10% EtOAc/己烷溶剂系统洗脱来纯化，以得到标题化合物。
步骤C: 6-氟-2-甲氧基-3-(环氧乙烷-2-基)苯甲腈:  在0 ℃下将3-乙烯基-6-氟-2-甲氧基苯甲腈 (1.67 g, 9.43 mmol)添加至DCM (50 mL)中，随后添加mCPBA (4.88 g , 28.3 mmol)并将反应混合物在RT下搅拌16 h。反应混合物用饱和Na2S2O3水溶液洗涤，然后用1N NaOH洗涤，随后用盐水洗涤。将有机层分离，并用Na2SO4干燥，过滤并蒸发至干燥。将粗产物通过120g Redi-sep柱，用0-100% EtOAc/己烷溶剂系统洗脱来层析纯化。分离6-氟-2-甲氧基-3-(环氧乙烷-2-基)苯甲腈。
步骤D:  (3S)-4-[2-(3-氰基-4-氟-2-甲氧基苯基)-2-羟基乙基]-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯:  将 6-氟-2-甲氧基-3-(环氧乙烷-2-基)苯甲腈 (1.4 g, 7.3 mmol)和(S)-4-N-BOC-2-羟基甲基哌嗪 (3.13 g, 14.5 mmol)悬浮在乙醇(15 mL)中，然后在150℃下在微波装置中加热60分钟。将反应混合物冷却并蒸发至干燥。将残留物通过40g Redi-sep柱并用5%MeOH/95% EtOAc洗脱来层析纯化，以得到标题化合物：LC-MS: M+1= 410;
步骤E:  (9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲氧基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  将(3S)-4-[2-(3-氰基-4-氟-2-甲氧基苯基)-2-羟基乙基]-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (2g , 4.88 mmol) 和氰基亚甲基三正丁基膦 ( 2.122g, 8.79mmol)溶解于15 mL苯中。将反应混合物脱气，并加热至100℃持续16 小时。LC-MS显示在2.07 产物峰(M+1= 380)。将反应冷却并蒸发至干燥。将残留物通过80g Redi-sep柱层析，并用40% EtOAc/60% 己烷混合物洗脱，以得到标题化合物的顺-反混合物。
步骤F: 反式异构体(3R,9aS) 23A和顺式异构体 (3S,9aS) 23B: 将异构体通过Chirapak AD-H 250mm X 30 mm I.D.用85 %SFC CO2和15%EtOH来分离。第一个洗脱出反式-异构体，然后是顺式-异构体。
制备3-溴-6-氟-2-甲氧基苯甲腈的方法2:
步骤A: 1-溴-4-氟-2-甲氧基苯:  在冷却下向125 mL无水DMF中2-溴-5-氟苯酚 (15 g, 79 mmol)的溶液添加K2CO3 (17.0 g, 138 mmol)和MeI (14.0 g, 102 mmol)，然后在室温下将反应搅拌3小时。将混合物倒入水，用乙醚萃取，用水和盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥并浓缩以得到1-溴-4-氟-2-甲氧基苯。
步骤B: 3-溴-6-氟-2-甲氧基苯甲酸:  在氮气下将干THF中干二异丙胺 (10 g, 99 mmol)的溶液用-78℃浴冷却，添加正丁基锂 (己烷中2.50 M , 40 mL, 99 mmol)并将溶液在-78℃下搅拌20分钟。添加1-溴-4-氟-2-甲氧基苯 (17.0 g, 82.5 mmol)。在-78 ℃下搅拌2小时后，将溶液通入CO2 然后加热至0℃。然后添加1 N HCl直到pH=3-4，并将混合物用AcOEt萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥并浓缩，以提供3-溴-6-氟-2-甲氧基苯甲酸。
步骤C: 3-溴-6-氟-2-甲氧基苯甲酰胺:  在0℃下将草酰氯 (15 mL)逐滴添加至具有0.5 mL DMF的100 mL DCM中的3-溴-6-氟-2-甲氧基苯甲酸 (15 g, 60 mmol)悬浮液。将混合物在25 ℃下搅拌2小时，并将透明溶液在减压下浓缩至干燥。在0 ℃下将溶解于60 mL无水乙腈的残留物添加至600 mL NH3.H2O 水溶液，并搅拌2小时，然后过滤以得到3-溴-6-氟-2-甲氧基苯甲酰胺。
步骤D: 3-溴-6-氟-2-甲氧基苯甲腈:  在0 ℃下向100 mL DMF中3-溴-6-氟-2-甲氧基苯甲酰胺 (14 g, 61 mmol) 的溶液逐份添加2,4,6-三氯-[1,3,5]三嗪 (12.3 g, 67.0 mmol)，并搅拌2小时，然后倒入冰/水中。将白色固体通过过滤收集，用水洗涤，溶解于DCM，用无水Na2SO4干燥并浓缩以提供3-溴-6-氟-2-甲氧基苯甲腈。
中间体24A和24B
Figure 898955DEST_PATH_IMAGE112
(3R,9aS)-3-(3-氰基-2-甲基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯和(3S,9aS)-3-(3-氰基-2-甲基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:   部分A：使用与方法2步骤C和D中所述用于制备3-溴-6-氟-2-甲氧基苯甲腈的顺序类似的顺序从商售3-溴-2-甲基苯甲酸开始制备3-溴-2-甲基苯甲腈。
部分B:  从3-溴-2-甲基苯甲腈取代3-溴-6-氟-2-甲基苯甲腈开始，以与对于制备中间体17A 和17B (方法1)所述方式类似的方式完成标题化合物的制备。将反式和顺式通过AD-H柱, 30 x 250mm, 25% IPA (0.2% DEA)/ CO2, 70 mL/min, 100bar, 50/MeOH, 35C, 220nm来分离。
Figure 971954DEST_PATH_IMAGE113
中间体24C和24D
(3S,9aR)-3-(3-氰基-2-甲基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯和(3R,9aR)-3-(3-氰基-2-甲基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:
步骤A: 3-(2-氯乙酰基)-2-甲基苯甲腈
在-78 ℃下向THF (100 mL)中3-碘-2-甲基苯甲腈 (7.71 g, 31.7 mmol)和2-氯-N-甲氧基-N-甲基乙酰胺 (6.55 g, 47.6 mmol)的溶液逐滴加入正丁基锂(己烷中2.5 M , 14.0 mL, 34.9 mmol)。完全添加后，将混合物在-78 ℃下搅拌15 min，然后用逐滴添加1 N HCl淬灭。将混合物在EtOAc/水之间分配并分离各层。将水层用EtOAc (2x)萃取，并将合并的有机层用盐水洗涤，干燥(硫酸镁)，过滤并浓缩。从己烷重结晶所得残留物提供3-(2-氯乙酰基)-2-甲基苯甲腈：1H NMR (500 MHz, CDCl3), δ 7.76 (m, 2H), 7.41 (m, 1H), 4.55 (s, 2H), 2.68 (s, 3H)。
步骤B:  (3R)-4-[2-(3-氰基-2-甲基苯基)-2-氧代乙基]-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯:  在 rt下向THF (17.6 mL)中3-(氯乙酰基)-2-甲基苯甲腈 (1.7 g, 8.8 mmol)的溶液添加(R)-4-N-boc-2-羟基甲基-哌嗪 (2.279 g, 10.54 mmol)和DIPEA (3.07 mL, 17.56 mmol)。将反应混合物在RT搅拌整个周末。浓缩后，将残留物在EtOAc 和NaHCO3水溶液(饱和)之间分配。将水层用EtOAc (2x)萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，用无水MgSO4干燥和过滤。浓缩随后为通过制备型TLC (硅胶; 10% MeOH/DCM)纯化以得到标题化合物：LC/MS (M+1)+ =  374.14
步骤C: 2-甲基-3-[(3S,9aR)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈和2-甲基-3-[(3R,9aR)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈: 在室温下向DCM (21.24 mL)和三乙基硅烷 (5.09 mL, 31.9 mmol)中 (3R)-4-[2-(3-氰基-2-甲基苯基)-2-氧代乙基]-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (2.38 g, 6.37 mmol)的溶液逐滴添加TFA (10.62 mL)。将反应混合物在RT搅拌5 h。浓缩后，将残留物在DCM和饱和NaHCO3水溶液之间分配。将水层用DCM (2x)萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，用无水MgSO4干燥并过滤。浓缩后，在rt下将残留物重新溶解在20 mL DCM中，并添加BOC2O (3.70 mL, 15.9 mmol)。使混合物在rt搅拌2 h。浓缩后，将残留物在EtOAc 和饱和NaHCO3水溶液之间分配。将水层用EtOAc (2x)萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，用无水MgSO4干燥并过滤。浓缩后，将混合物通过制备型TLC(硅胶; 10% MeOH/DCM)纯化，以得到顺式和反式产物的混合物。将混合物通过OD-H柱上在35℃下15% MeOH:MeCN的制备型SFC拆分以得到两种单一非对映异构体。
中间体25A和25B
(3R,9aS)-3-(5-氰基-4-甲基噻吩-3-基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯和(3S,9aS)-3-(5-氰基-4-甲基噻吩-3-基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯
步骤 A: 2,4-二溴-3-甲基噻吩:  在-70 ℃下向500 mL THF中2,3,5-三溴-4-甲基噻吩 (46.2 g, 138 mmol)的溶液逐滴添加n-BuLi (55.2 mL, 138.0 mmol)。将混合物在-70℃下搅拌15分钟，并缓慢添加50 mL水。将所得混合物升温至室温并搅拌10分钟，并用EtOAc萃取。将有机层用水和盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩，以得到粗制2,4-二溴-3-甲基噻吩。
步骤B: 4-溴-3-甲基噻吩-2-甲腈:  将150 mL DMF中2,4-二溴-3-甲基噻吩 (20.0 g, 78.1 mmol)和CuCN (6.30 g, 70.3 mmol)的混合物在回流下搅拌4小时，然后降温。将反应混合物搅拌倒入1 L乙醚中，并将沉淀物通过过滤去除。将滤液用水(3x 100 mL)、盐水(100 mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥并浓缩。将残留物通过硅胶柱层析纯化(石油醚:EtOAc = 50 :1)以提供4-溴-3-甲基噻吩-2-甲腈。
步骤C: 4-乙烯基-3-甲基噻吩-2-甲腈:   在Ar下将30 mL EtOH和30 mL TEA中4-溴-3-甲基噻吩-2-甲腈 (3.00 g, 14.8 mmol), 乙烯三氟硼酸钾 (2.40 g, 17.8 mmol)和Pd(dppf)Cl2 (0.5 g)的混合物回流4小时。将反应混合物浓缩，并将残留物通过柱层析纯化(石油醚:EtOAc = 50 :1)以提供4-乙烯基-3-甲基噻吩-2-甲腈。
步骤D: 3-甲基-4-(环氧乙烷-2-基)噻吩-2-甲腈: 向30 mL t-Bu-OH和60 mL水中4-乙烯基-3-甲基噻吩-2-甲腈 (1.70 g, 11.4 mmol)的悬浮液逐份添加NBS (2.40 g, 13.7 mmol)。将混合物在90 ℃搅拌1小时，然后冷却至10 ℃。然后逐滴添加NaOH (0.7 g在10 mL水中, 17.5 mmol)的溶液并搅拌15分钟。将反应混合物用EtOAc萃取两次并浓缩。将残留物通过硅胶柱层析纯化(石油醚:EtOAc = 20 :1)以提供3-甲基-4-(环氧乙烷-2-基)噻吩-2-甲腈。
步骤E: (3S)-4-[2-(5-氰基-4-甲基噻吩-3-基)-2-羟基乙基]-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯:   在微波装置中在140℃下将5 mL EtOH中3-甲基-4-(环氧乙烷-2-基) 噻吩-2-甲腈 (1.3 g, 7.9 mmol)和(3S)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (2.0 g, 9.5 mmol)的混合物加热90分钟，然后冷却。将反应混合物浓缩，并将残留物通过柱层析纯化(DCM :MeOH = 10 :1)以提供标题化合物。
步骤F: (3R,9aS)-3-(5-氰基-4-甲基噻吩-3-基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯和(3S,9aS)-3-(5-氰基-4-甲基噻吩-3-基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:    在微波管中将(3S)-4-[2-(5-氰基-4-甲基噻吩-3-基)-2-羟基乙基]-3-(羟基甲基) 哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (1.40 g, 3.67 mmol)和氰基亚甲基三丁基膦 ( 1.59 g, 6.61 mmol)溶解于苯 (15 mL)中，然后密封、脱气并加热至100℃过夜。将反应混合物冷却并将苯蒸发掉。然后将残留物通过80g Redi-sep柱、用丙酮:DCM  (5:95)洗脱层析纯化。顺式异构体叔丁基(3S, 9aS)第一个洗脱出来；反式异构体(3R, 9aS)第二个洗脱出来：
。
中间体26A
Figure 431317DEST_PATH_IMAGE118
(3S,9aS)-3-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢异苯并呋喃-5-基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噻嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯
步骤A:  (S)-4-((R)-2-羟基-2-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢异苯并呋喃-5-基)乙基)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯:  以上述对于(S)-4-(2-羟基-2-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢异苯并呋喃-5-基)乙基)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯的合成所述的方式类似的方式从4-甲基-5-[(2R)-环氧乙烷-2-基]-2-苯并呋喃-1(3H)-酮开始制备(S)-4-((R)-2-羟基-2-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢异苯并呋喃-5-基)乙基)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。
步骤B:  (S)-3-(乙酰基硫代甲基)-4-((R)-2-羟基-2-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢异苯并呋喃-5-基)乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯:  在氮气气氛下在0℃下向无水THF (20 mL)中(S)-4-((R)-2-羟基-2-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢异苯并呋喃-5-基)乙基)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (817 mg, 2.01 mmol)的溶液添加无水三乙胺 (0.560 mL, 4.02 mmol)，随后添加甲磺酰氯(0.234 mL, 3.01 mmol)和4-二甲基氨基吡啶 (24.6 mg, 0.201 mmol)。去除冰浴并将反应混合物搅拌2小时。然后将所得混合物在减压下浓缩。将所得油再溶于无水DMSO (13 mL)中，并用硫代乙酸钾(1235 mg, 10.81 mmol)处理。将反应混合物在室温下在氮气下搅拌2小时。将混合物用乙酸乙酯稀释，用水(3次)、盐水洗涤，并干燥(MgSO4)，过滤并浓缩。将粗产物在Biotage SP1 (40+M平衡的)上用20-80% 乙酸乙酯/己烷，20 CV洗脱而纯化。LC/MS: [(M+1)]+ = 465.2;.
步骤C:  (3S)-3-(乙酰基硫代甲基)-4-(2-氯-2-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢异苯并呋喃-5-基)乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯:  向无水甲苯 (12.3 mL)中用冰浴冷却的(S)-3-(乙酰基硫代甲基)-4-((R)-2-羟基-2-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢异苯并呋喃-5-基)乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (573 mg, 1.233 mmol)的溶液添加亚硫酰氯 (0.268 mL, 3.70 mmol)。然后逐滴添加无水吡啶(0.399 mL, 4.93 mmol)。将反应混合物保持在0℃，持续20分钟，然后升温至室温并搅拌3小时。TLC显示起始材料的消耗。在减压下将反应浓缩并在高真空下干燥过夜。直接用于下一步骤。
步骤D:  (3S,9aS)-3-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢异苯并呋喃-5-基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噻嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  将无水THF (20 mL)中(3S)-3-(乙酰基硫代甲基)-4-(2-氯-2-(4-甲基-1-氧代-1,3-二氢异苯并呋喃-5-基)乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(596 mg, 1.234 mmol)的溶液用甲醇钠，甲醇中的25% 溶液 (0.846 mL, 3.70 mmol)逐滴处理。将反应混合物在氮气下在室温下搅拌2小时。LCMS显示期望产物的形成。在减压下除去溶剂。将残留物再溶于二氯甲烷并用盐水洗涤。将有机层经MgSO4干燥，过滤并浓缩。将残留物在Biotage SP1上用20 - 80% 乙酸乙酯/己烷, 16 CV洗脱而纯化。
Figure 77062DEST_PATH_IMAGE119
中间体27A和27B
27A :  (3S,9aR)-3-(2-氯-3-氰基-4-氟苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1, 4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯和 27B :  (3R,9aR)-3-(2-氯-3-氰基-4-氟苯基)六氢-吡嗪并[2,1-c][1, 4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯
步骤A:  3-溴-2-氯-6-氟苯甲腈:  在0℃下将 2-氯-6-氟苯甲腈 (15.6 g, 100 mmol)溶解于三氟甲磺酸  (75 mL)中，然后添加NBS (17.8 g, 100 mmol )。将反应升温至室温并搅拌过夜。将反应混合物倒入冰中，并用DCM (2x)萃取。DCM层用NaHCO3和盐水洗涤。将DCM用Na2SO4干燥，然后过滤并浓缩。将产物通过330g ISCO Redi-Sep柱、用10-20%乙酸乙酯 /己烷溶剂系统层析纯化，以得到3-溴-2-氯-6-氟苯甲腈。
步骤B:  2-氯-6-氟-3-乙烯基苯甲腈:  将 3-溴-2-氯-6-氟苯甲腈 (15.4 g, 65.6 mmol)、乙烯三氟硼酸钾 (17.6 g, 131 mmol)、三乙胺 (18.3 mL, 131 mmol)和PdCl2(dppf)-CH2Cl2 加合物 (2.68 g, 3.28 mmol)添加至乙醇(75 mL)中，然后脱气并在回流下加热3 h。将反应用乙酸乙酯稀释，用盐水洗涤，干燥并蒸发至干。将产物通过330g ISCO Redi-Sep柱、用10% 乙酸乙酯 /己烷溶剂系统层析纯化，以得到2-氯-6-氟-3-乙烯基苯甲腈。
步骤C: 2-氯-6-氟-3-(环氧乙烷-2-基)苯甲腈:  将 2-氯-6-氟-3-乙烯基苯甲腈溶解于CHCl3 (300 mL)中，然后添加mCPBA (29.4 g, 171 mmol)并在RT搅拌16 h。当TLC显示起始材料消耗时，将混合物用Na2S2O3 (1x)、1N NaOH (1x)、盐水(2x)洗涤，然后在Na2SO4上干燥。过滤并浓缩，然后通过使用330g ISCO Redi-sep柱，并用20% 乙酸乙酯/己烷溶剂系统洗脱的MPLC层析纯化，以得到2-氯-6-氟-3-(环氧乙烷-2-基)苯甲腈。
步骤D:  (3R)-4-(2-(2-氯-3-氰基-4-氟苯基)-2-羟基乙基)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯: 将2-氯-6-氟-3-(环氧乙烷-2-基)苯甲腈 (9.1 g, 46 mmol)和(R)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (14.9 g, 69.1 mmol) 溶解于乙醇 (105 mL)中，并分装至9个密封管中然后在140℃下微波处理1 h。将合并的反应混合物浓缩并通过330g ISCO Redi-sep柱、用50%-100 乙酸乙酯/己烷溶剂系统纯化，以得到标题化合物。
步骤E:  (9aR)-3-(2-氯-3-氰基-4-氟苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  将 (3R)-4-(2-(2-氯-3-氰基-4-氟苯基)-2-羟基乙基)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (15.6 g, 37.3 mmol)和氰基亚甲基三正丁基膦 (16.4 g, 67.8 mmol)溶解于苯 (90 mL)中，脱气并在100℃下加热16 h。将反应混合物浓缩并通过330g ISCO Redi-sep柱层析，并用 35% EtOAc/己烷洗脱，以得到标题化合物(顺-反非对映异构体混合物)。LC-MS (IE, m/z): 396 [M + 1]+;  将顺式-反式非对映异构体通过使用以下条件的SFC-HPLC分离：Chiralpak AD 21 x 250mm, 20%IPA, 50ml/min, 1:1 MeOH/MeCN 中约85mg/mL, 100巴, 220nm, 35℃。
Figure 875833DEST_PATH_IMAGE121
中间体27C 和27D
Figure 185592DEST_PATH_IMAGE122
(3R,9aS)-3-(2-氯-3-氰基-4-氟苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1, 4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯和(3S,9aS)-3-(2-氯-3-氰基-4-氟苯基)六氢-吡嗪并[2,1-c][1, 4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:  以与27A和27B所述的方式类似的方式制备标题混合物，除了在步骤D中使用(S)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯和如下所述在最后步骤的小改变：
将 (3S)-4-[2-(2-氯-3-氰基-4-氟苯基)-2-羟基乙基]-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (4.00 g, 9.66 mmol)和氰基亚甲基三正丁基膦 (4.20 g, 517 mmol)溶解于60 mL苯中。将反应混合物脱气，并加热至100℃持续3 h。将反应冷却并蒸发至干燥。将残留物通过330g Redi-sep柱、用33% EtOAc/67% 己烷洗脱层析纯化。
中间体 28
Figure 372040DEST_PATH_IMAGE124
2-甲氧基-4-(环氧乙烷-2-基)苯甲腈
步骤A: 三氟甲磺酸4-甲酰基-2-甲氧基苯基酯: 在室温下向DMF (200 mL)中香草醛(20 g, 131 mmol)的溶液添加碳酸钾(36.30 g, 263 mmol)和三氟甲磺酸4-硝基苯基酯 (53.5 g, 197 mmol)并将反应混合物搅拌8 hr。将EtOAc (600 mL)添加到反应混合物中，有机层用水洗涤三次，干燥，过滤并浓缩。粗制化合物随后通过快速层析纯化(乙酸乙酯/己烷1:9 → 3:7)以提供磺酸酯。
步骤B: 4-甲酰基-2-甲氧基苯甲腈:将DMF (300 mL)中磺酸酯(37.0 g, 130 mmol)、氰化锌(61.1 g, 521 mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(22.57 g, 19.53 mmol)的混合物在110℃下搅拌8 hr。将EtOAc 添加到反应混合物中，有机层用水洗涤两次，干燥，过滤并浓缩。粗产物随后通过柱层析纯化(硅胶，乙酸乙酯/己烷3:7)，这提供了标题化合物：LC/MS: (IE, m/z) [M + 1]+ = 162.34。
步骤C: 2-甲氧基-4-(环氧乙烷-2-基)苯甲腈: 向THF (40 mL)中NaH (0.16 g, 3.9 mmol)的冷溶液中逐滴添加DMSO (20 mL)中三甲基碘化锍(0.91 g, 4.5 mmol)的溶液。所得混合物在N2下在0℃下搅拌20 min。添加THF (20 mL)中4-甲酰基-2-甲氧基苯甲腈(0.60 g, 3.72 mmol)的溶液。所得反应混合物在N2下在0℃下搅拌1 hr，随后将其逐渐升温至室温并在此温度下搅拌12 hr。如TLC(25%乙酸乙酯/己烷)所示起始材料耗尽。将反应混合物冷却至0℃并通过逐滴添加水来淬灭。该混合物用乙酸乙酯(2 x 70 mL)萃取。合并的有机层用水、盐水洗涤，随后干燥(MgSO4)并过滤。真空浓缩滤液。残留物经由柱层析纯化(硅胶，10-30% EtOAc-己烷)以提供2-甲氧基-4-(环氧乙烷-2-基)苯甲腈：
Figure 274136DEST_PATH_IMAGE125
Figure 817113DEST_PATH_IMAGE126
。
中间体29A和29B
Figure 109554DEST_PATH_IMAGE127
29A:  (3S,9aR)-3-(4-氰基-3-甲氧基苯基)六氢吡嗪并[2,1- c][1, 4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯和29B:  (3R,9aR)-3-(4-氰基-3-甲氧基苯基)六氢吡嗪并[2,1- c][1, 4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯
步骤A:  (3R)-4-[2-(4-氰基-3-甲氧基苯基)-2-羟基乙基]-3 (羟基甲基) 哌嗪1-甲酸叔丁酯:  向Pyrex 容器中加入磁力搅拌棒，(2.0 g, 11.42 mmol)的2-甲氧基-4-(环氧乙烷-2-基) 苯甲腈, (3.70 g, 17.12 mmol)的(3R)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯和6 mL EtOH。然后将其引入微波反应器中，并在150℃下辐射3 h。将混合物冷却至室温，并将溶剂蒸发，并将所得残留物通过柱层析纯化(硅胶, 1- 20% 二氯甲烷/MeOH)，其提供作为两个非对映异构体(1:1)的混合物的产物 LC/MS: (IE, m/z) [(M + 1)- t-Bu]+ = 336.41。
步骤B:  (9aR)-3-(4-氰基-3-甲氧基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1, 4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯: 将苯中先前步骤的异构体混合物(3.48 g, 8.89 mmol, 1:1)用(三丁基-λ5-磷烷叉基(phosphanylidene)) 乙腈 (3.22 g, 13.3 mmol)处理。将反应混合物在135℃下在Biotage装置中微波处理3 hr。然后将混合物冷却至室温并除去溶剂得到粗产物。将粗产物层析(硅胶, 己烷/EtOAc 9:1 → 3:7, 作为洗脱液)，以得到双环标题化合物的异构体混合物。
步骤C: (3S, 9aR)-3-(4-氰基-3-甲氧基苯基)六氢吡嗪并[2,1- c][1, 4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯和(3R, 9aR)-3-(4-氰基-3-甲氧基苯基)六氢吡嗪并[2,1- c][1, 4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯:   将异构混合物使用21 x 250 mm ChiralCel OJ-H柱(用15% MeOH/CO2洗脱，流速为50 mL/min，100巴，MeOH 中59 mg/mL, 35C, 220 nm, Thr = 200)进一步分离为其对映异构体：
Figure 527504DEST_PATH_IMAGE128
Figure 221790DEST_PATH_IMAGE129
。
中间体30 和31
Figure 935669DEST_PATH_IMAGE130
30:  (3R, 9aS)-3-(4-氰基-3-甲氧基苯基)六氢吡嗪并[2,1- c][1, 4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯和31:  (3S, 9aS)-3-(4-氰基-3-甲氧基苯基)六氢吡嗪并[2,1- c][1, 4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯
步骤A:  (3S)-4-[2-(4-氰基-3-甲氧基苯基)-2-羟基乙基]-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯:  向Pyrex 容器中加入磁力搅拌棒，(0.350 g, 2.00 mmol)  2-甲氧基-4-(环氧乙烷-2-基) 苯甲腈, (0.457 g, 2.20 mmol)的(3S)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯,和6 mL EtOH。然后将其引入微波反应器中，并在150℃下辐射3 hr。然后将混合物冷却至室温，并将溶剂蒸发，并将所得残留物通过柱层析纯化(硅胶, 1- 20% 二氯甲烷/MeOH)，其提供作为两个非对映异构体(1:1)的混合物的标题化合物。LC/MS: (IE, m/z) [(M + 1)- t-Bu]+ = 336.1。
步骤B:  (9aS)-3-(4-氰基-3-甲氧基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯: 将苯中先前步骤的异构体混合物(0.55 g, 1.40 mmol, 1:1)用(三丁基-λ5-磷烷叉基) 乙腈 (0.678 g, 2.81 mmol)处理。将反应混合物在135℃下在Biotage装置中微波处理3 hr。然后将混合物冷却至室温并除去溶剂得到粗产物。将粗产物层析(硅胶, 己烷/EtOAc 9:1 → 3:7, 作为洗脱液)，以得到双环标题化合物的异构体混合物LC/MS: (IE, m/z) [(M + 1)- t-Bu]+ = 318.06。
步骤C: 29C:和29D:  将(9aS)-3-(4-氰基-3-甲氧基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯使用21 x 250 mm ChiralCel OJ-H柱(用15% MeOH/CO2洗脱，流速为50 mL/min，100巴，MeOH 中59 mg/mL, 35C, 220 nm, Thr = 200)进一步分离为其对映异构体：
Figure 980985DEST_PATH_IMAGE131
Figure 438511DEST_PATH_IMAGE132
。
中间体32
Figure 49621DEST_PATH_IMAGE133
2-氟-3-甲基-4-(环氧乙烷-2-基)苯甲腈
步骤A: 4-乙烯基-2-氟-3-甲基苯甲腈: 在Ar下将70 mL EtOH和30 mL TEA中4-溴-2-氟-3-甲基苯甲腈 (7.00 g, 32.7 mmol), 乙烯三氟硼酸钾 (5.3 g, 39 mmol)和Pd(dppf)Cl2 (0.5 g, 0.7 mmol)的混合物回流4小时。浓缩，将残留物通过柱层析纯化(石油醚:EtOAc = 10 :1)以提供4-乙烯基-2-氟-3-甲基苯甲腈。
步骤B: 2-氟-3-甲基-4-(环氧乙烷-2-基)苯甲腈: 将300 mL DCM中4-乙烯基-2-氟-3-甲基苯甲腈 (4.60 g, 28.5 mmol)和mCPBA (85 %, 12.3 g, 71.4 mmol)的混合物在室温下搅拌120小时。将反应混合物冷却至0℃，随后用饱和NaHCO3 (50 mL)、饱和Na2SO3 (50 mL)、5 % NaOH (2X 50 mL)和盐水(50 mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥并浓缩。将残留物通过柱层析纯化(石油醚:EtOAc = 20 :1)以提供标题化合物：
Figure 968478DEST_PATH_IMAGE135
。
中间体33
Figure 901799DEST_PATH_IMAGE136
2-氟-3-甲氧基-4-(环氧乙烷-2-基)苯甲腈
步骤A: 2-氟-6-硝基苯酚:  在0-5℃下将浓缩HNO3 (95 %, 44 g, 0.62 mol)逐滴添加至1 L DCM中2-氟苯酚(64.6 g, 0.58 mol)的溶液。将混合物在0℃下搅拌1 h，然后过滤。将滤液用水和盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥并浓缩。将残留物通过柱层析纯化(DCM :PE = 1 :2)以提供2-氟-6-硝基苯酚。
步骤B: 1-氟-2-甲氧基-3-硝基苯:  将MeI (27.1 g, 191 mmol)逐滴添加至200 mL DMF中2-氟-6-硝基苯酚 (25.0 g, 159 mmol)和K2CO3 (44.0 g, 318 mmol)的悬浮液。将混合物在25℃下搅拌过夜，然后升温至60℃并搅拌3小时。将混合物用1 L EtOAc稀释，并用水(3 X 100 mL)和盐水(100 mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥并浓缩，以提供标题化合物。
步骤C: 3-氟-2-甲氧基苯胺:  在55 psi的H2下，将500 mL MeOH中1-氟-2-甲氧基-3-硝基苯 (25.0 g, 146 mmol)和Pd/C (10 %,7.5 g)的混合物在室温下搅拌4小时，然后过滤。将滤液浓缩以得到标题化合物。
步骤D: 1-溴-3-氟-2-甲氧基苯:  在-5 ~ 0℃下将NaNO2 (12.0 g, 173 mmol,在40 mL 水中)溶液逐滴添加至200 mL 氢溴酸 (47 %)和100 mL水中3-氟-2-甲氧基苯胺 (20.0 g, 158 mmol)的混合物，并搅拌1小时。然后在0℃下将溶液缓慢添加至50 mL氢溴酸 (47 %) 中CuBr (45.2 g, 315 mmol)的悬浮液。将所得混合物在0℃下搅拌1小时，然后升温至50℃并搅拌1小时。将反应混合物倒入冰水中，并用乙醚 (2 X 500 mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥并浓缩以得到1-溴-3-氟-2-甲氧基苯。
步骤E: 4-溴-2-氟-3-甲氧基苯甲酸:  在-70 ℃下将n-BuLi (17.0 mL, 42.5 mmol)逐滴添加至70 mL THF中NH(i-Pr)2 (4.50 g, 44.5 mmol)的溶液。将混合物在0 ℃搅拌15分钟，然后再次冷却至-70 ℃。逐滴添加1-溴-3-氟-2-甲氧基苯 (8.30 g, 40.5 mmol, 在30 mL THF中)的溶液。将所得混合物在-70℃下搅拌1小时，然后倒入新鲜的干冰中并搅拌过夜。将混合物用1 L乙醚稀释，并用水洗涤两次。将合并的水层用乙醚洗涤，然后用盐酸酸化至pH = 2并用EtOAc萃取两次。将合并的 EtOAc层用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥并浓缩以得到4-溴-2-氟-3-甲氧基苯甲酸。
步骤F: 4-溴-2-氟-3-甲氧基苯甲腈:  在0℃下将草酰氯 (20 mL)逐滴添加至具有0.5 mL DMF的100 mL DCM中4-溴-2-氟-3-甲氧基苯甲酸 (8.30 g, 33.3 mmol)的悬浮液。将混合物在25 ℃下搅拌2小时，并将透明溶液在减压下浓缩至干燥。在0 ℃下将溶解于60 mL无水乙腈的残留物添加至600 mL NH3.H2O 水溶液，并搅拌2小时，然后用EtOAc萃取两次。将合并的EtOAc层用水和盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥并浓缩。将残留物(6.9 g)溶解在60 mL DMF中，并用冰浴/水浴冷却至0 ℃。添加氰尿酰氯(Cyanuric chloride) (7.70 g, 41.7 mmol)，并在0 ℃下搅拌2小时，然后倒入冰/水中。将固体通过过滤收集，用水洗涤，溶解于DCM，用无水Na2SO4干燥并浓缩以提供4-溴-2-氟-3-甲氧基苯甲腈。
步骤G: 2-氟-3-甲氧基-4-乙烯基苯甲腈:  在Ar下将60 mL EtOH和60 mL TEA中4-溴-2-氟-3-甲氧基苯甲腈 (6.0 g, 26 mmol), 乙烯三氟硼酸钾 (4.20 g, 31.3 mmol)和Pd(dppf)Cl2 (0.8 g)的混合物回流4小时。将所得混合物浓缩，并将残留物通过柱层析纯化(PE :EtOAc = 20 :1)以提供2-氟-3-甲氧基-4-乙烯基苯甲腈。
步骤H: 2-氟-3-甲氧基-4-(环氧乙烷-2-基)苯甲腈:  在0 ℃下将mCPBA (85 %, 9.9 g, 48.9 mmol)添加至160 mL DCM中2-氟-3-甲氧基-4-乙烯基苯甲腈 (3.4 g, 19.2 mmol)的溶液。将混合物在室温下搅拌60小时，然后用300 mL DCM稀释并冷却至0℃。将混合物随后用饱和NaHCO3 (50 mL)、Na2SO3 水溶液(2 X 50 mL)、5% NaOH (50 mL)和盐水洗涤。将有机层浓缩，并将残留物通过柱层析纯化(PE :EtOAc = 5 :1)以提供2-氟-3-甲氧基-4-(环氧乙烷-2-基)苯甲腈：
Figure 632994DEST_PATH_IMAGE137
Figure 891937DEST_PATH_IMAGE138
。
中间体34
Figure 443004DEST_PATH_IMAGE139
4-环丙基-5-环氧乙烷-2-基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮
步骤A: 5-溴-4-碘-2-苯并呋喃-1(3H)-酮:  向三氟甲磺酸(400 mL)中5-溴-2-苯并呋喃-1(3H)-酮 (50 g, 0.235 mol)的冷(0 ℃)溶液添加N-碘代琥珀酰亚胺(55.5 g, 0.247 mol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜，然后缓慢倒入冰水(2 L)中，过滤并将滤液用 EtOAc萃取。合并的有机层用水和盐水洗涤，干燥并浓缩以得到5-溴-4-碘-2-苯并呋喃-1(3H)-酮。
步骤B: 5-溴-4-乙烯基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮:  在N2下将20 mL TEA和20 mL EtOH中5-溴-4-碘-2-苯并呋喃-1(3H)-酮 (1 g, 2.95 mmol), 乙烯三氟硼酸钾 (474 mg, 3.54 mmol)和Pd(dppf)Cl2 (200 mg)的混合物加热至回流持续2小时。将大部分溶剂去除，并将残留物溶解于EtOAc (100 mL)中。将溶液用0.1 N HCl、碳酸氢钠和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩，以得到标题化合物。
步骤C: 5-溴-4-环丙基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮:  向EtOAc (50 mL) 中5-溴-4-乙烯基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮 (2.2 g, 9.21 mol)和Pd(OAc)2 (100 mg)的冷(0 ℃)混合物缓慢添加乙醚(100 mL)中CH2N2的溶液。将所得混合物在室温下搅拌过夜，然后用乙酸淬灭，过滤并将滤液用水和盐水洗涤，干燥并浓缩，以提供标题化合物。
步骤D: 4-环丙基-5-乙烯基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮:  在N2下将20 mL TEA和20 mL EtOH中5-溴-4-环丙基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮 (760 mg, 3.004 mmol), 乙烯三氟硼酸钾 (805 mg, 6.008 mmol)和Pd(dppf)Cl2 (100 mg)的混合物加热至回流持续8小时。当TLC显示完全反应，将大部分溶剂去除，并将残留物溶解于EtOAc (100 mL)中。将溶液用0.1 N HCl、碳酸氢钠和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将所得油通过柱层析纯化，以得到4-环丙基-5-乙烯基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮。
步骤E: 4-环丙基-5-环氧乙烷-2-基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮:  在0 ℃下向50 mL DCM中 4-环丙基-5-乙烯基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮 (440 mg, 2.2 mmol)的溶液缓慢添加50 mL DCM中mCPBA (1.14 g, 6.6 mmol)。升温至室温后，将混合物搅拌12小时。将混合物用Na2SO3水溶液洗涤，直到碘化钾(KI)试纸不改变颜色。将有机层合并，用盐水洗涤然后浓缩。将残留物经由制备型TLC纯化以得到标题化合物：
Figure 507912DEST_PATH_IMAGE140
Figure 31298DEST_PATH_IMAGE141
。
中间体35
Figure 762274DEST_PATH_IMAGE142
4-乙基-5-环氧乙烷-2-基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮
步骤A: 5-溴-4-乙基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮:  在rt在H2 (1 atm)下将50 mL MeOH中5-溴-4-乙烯基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮 (2.0 g, 8.37 mmol)和Pd/C (400 mg)的混合物搅拌过夜，然后过滤。浓缩滤液。将所得材料通过柱层析纯化，以得到5-溴-4-乙基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮。
步骤B: 4-乙基-5-乙烯基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮:  在N2下将20 mL TEA和20 mL EtOH中5-溴-4-乙基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮 (1.81 g, 7.51 mmol), 乙烯三氟硼酸钾 (1.21 g, 9.01 mmol)和Pd(dppf)Cl2 (200 mg)的混合物加热至回流过夜，然后浓缩。将所得材料通过柱层析纯化，以得到4-乙基-5-乙烯基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮。
步骤C: 4-乙基-5-环氧乙烷-2-基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮:  在0 ℃下向50 mL DCM中 4-乙基-5-乙烯基-2-苯并呋喃-1(3H)-酮 (1.1 g, 5.85 mmol)的溶液缓慢添加50 mL DCM中mCPBA (3.60 g, 85% 纯度, 17.6 mmol)。升温至室温，将混合物搅拌3天。将混合物用Na2SO3水溶液洗涤，直到KI纸不改变颜色。将有机层合并，用盐水洗涤并浓缩。将残留物通过柱层析纯化以得到标题化合物：
Figure 3900DEST_PATH_IMAGE143
Figure 606919DEST_PATH_IMAGE144
。
以与对于(3S, 9aR)-3-(4-氰基-3-甲氧基苯基)六氢吡嗪并[2,1- c][1, 4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯所述的方式类似的方式来从所示环氧化物(如上所述制备)和(S)-4-N-BOC-2-羟基甲基哌嗪或(R)-4-N-BOC-2-羟基甲基哌嗪制备下表1中所述的Boc-哌嗪中间体。
表1
Figure 984811DEST_PATH_IMAGE145
OD 柱上用10% IPA/CO2的制备型SFC；LC/MS: (IE, m/z) [(M + 1) - t-Bu]+ = 320.04。
Figure 647874DEST_PATH_IMAGE146
反式和顺式异构体在OD柱上通过用15% (2:1 MeOH :MeCN)/CO2的制备型SFC分离。反式异构体首先洗脱出来;
Figure 173533DEST_PATH_IMAGE147
Figure 517926DEST_PATH_IMAGE148
反式和顺式通过OJ柱(21 x 250mm, 15% 2:1 MeOH: MeCN/ CO2, 60ml/min, 100巴, MeCN/MeOH 中40 mg/mL, 35C, 220 nm)手性拆分。LC/MS: [(M+1)]+ = 415
Figure 579686DEST_PATH_IMAGE149
反式和顺式通过AD柱(21 x 250mm,和30% 2:1 MeOH: MeCN/ CO2, 50ml/min, 100巴, MeCN/MeOH中80 mg/mL, 35C, 220 nm)拆分。LC/MS: [(M+1)]+ = 403。
中间体40A
Figure 364288DEST_PATH_IMAGE151
6-氟-2-甲基-3-[(3S,9aS)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈 2,2,2-三氟乙酸盐:  在室温将(3S,9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯 (1.88g, 5.01 mmol)用10 mL TFA处理1小时。然后在减压下将TFA除去以得到标题化合物。
Figure 246793DEST_PATH_IMAGE152
中间体40B
Figure 661594DEST_PATH_IMAGE153
6-氟-2-甲基-3-[(3R,9aS)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈 2,2,2三氟乙酸盐:   在室温将(3R,9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯 (1.73 g, 4.61 mmol)用10 mL TFA处理1小时。然后在减压下将三氟乙酸除去以得到标题化合物。
Figure 400880DEST_PATH_IMAGE154
中间体40C-1 (方法1)
Figure 838815DEST_PATH_IMAGE155
6-氟-2-甲基-3-[(3S,9aR)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈:  将(3S,9aR)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯 (I-17C) (3.00 g, 7.99 mmol)溶解于TFA (10 mL)中并搅拌1hr。在减压下将三氟乙酸除去并用二氯乙烷(3X)共沸，然后在高真空下干燥以得到标题化合物：
Figure 85863DEST_PATH_IMAGE156
Figure 292853DEST_PATH_IMAGE157
。
中间体40C-2 (方法2)
Figure 468620DEST_PATH_IMAGE158
6-氟-2-甲基-3-[(3S,9aR)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈盐酸盐:  将(3S,9aR)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯 (I-17C)  (158.8 g, 423.0 mmol)悬浮于318 mL 2-丙醇。将所得浆料用2-丙醇 (5.5 M, 1000 mL, 5499 mmol)中HCl溶液处理，并将混合物加热至50 ℃持续2小时。将混合物浓缩以去除约400 mL 2-丙醇，然后冷却至 rt并搅拌过夜。将混合物过滤以收集固体产物，并将湿滤饼用50 mL 2-丙醇洗涤。将滤饼在40℃下用氮气流在真空下干燥两天，以得到标题化合物。
中间体 40D
Figure 456167DEST_PATH_IMAGE159
6-氟-2-甲基-3-[(3R,9aR)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈 2,2,2-三氟乙酸盐: 将(3R,9aR)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯 (1.09 g, 2.90 mmol)在三氟乙酸 (10 mL)中搅拌1h，然后浓缩并用二氯乙烷(3X)共沸以得到标题化合物。
Figure 680475DEST_PATH_IMAGE160
中间体41B
Figure 758284DEST_PATH_IMAGE161
2-甲氧基-4-[(3R, 9aR)-八氢吡嗪并[2,1-c][1, 4]噁嗪-3-基]苯甲腈盐酸盐
将  (3R,9aR)-3-(4-氰基-3-甲氧基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯 (120 mg, 0.321 mmol)溶解于10 mL 4 M HCl/二氧杂环己烷中，并在室温下搅拌8h。将混合物浓缩至?初始体积，并用10 mL乙醚稀释。将沉淀物过滤，并在高真空下干燥以得到标题化合物：
Figure 42635DEST_PATH_IMAGE162
。
中间体41D
2-甲氧基-4-[(3S, 9aS)-八氢吡嗪并[2,1-c][1, 4]噁嗪-3-基]苯甲腈盐酸盐
将 (3S,9aS)-3-(4-氰基-3-甲氧基苯基)六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-8(1H)-甲酸叔丁酯 (38.0 mg, 0.102 mmol)溶解于10 mL 4 M HCl/二氧杂环己烷中，并在室温下搅拌8h。将混合物浓缩至?初始体积，并用5 mL乙醚稀释。将沉淀物过滤，并在高真空下干燥以得到标题化合物：
Figure 619797DEST_PATH_IMAGE166
。
以对于中间体40A: 6-氟-2-甲基-3-[(3S,9aS)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈 2,2,2-三氟乙酸盐,和41D: 2-甲氧基-4-[(3S, 9aS)-八氢吡嗪并[2,1-c][1, 4]噁嗪-3-基]苯甲腈盐酸盐的合成所述的方式类似的方式制备下表2中显示的中间体，其使用HCl或TFA，以去除相应的Boc-哌嗪前体中存在的Boc保护基团(下面表2中提供了每个结构的反应中使用的酸和质谱数据)。应当理解，所得中间体可以是TFA或HCl盐，或者它们可以通过用有机溶剂和碱性水溶液诸如饱和碳酸氢钠溶液常规分配产物并浓缩所得有机溶液而作为游离碱胺获得。
Figure 581936DEST_PATH_IMAGE167
Figure 810235DEST_PATH_IMAGE169
Figure 561022DEST_PATH_IMAGE170
Figure 243414DEST_PATH_IMAGE171
中间体61
Figure 675532DEST_PATH_IMAGE172
6-甲氧基-2-甲基-3-[(3S,9aR)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈
向微波小瓶中加入6-氟-2-甲基-3-[(3S,9aR)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈三氟乙酸盐(110 mg, 0.290 mmol), 碳酸钠(30 mg, 0.290 mmol)和甲醇 (2 mL)。将混合物在微波装置中加热至150 ℃持续2h，然后冷却至室温，过滤并浓缩，以得到标题化合物，其无需进一步纯化即可使用。LC-MS (IE, m/z): 288 [M + 1]+。
中间体62
Figure 894024DEST_PATH_IMAGE173
2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-甲酸
步骤A: 6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-醇:  在60度下向丙酮 (250 mL)中6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶 (5.0 g, 42 mmol)和MgSO4 (10 g, 84 mmol)的溶液添加水(500 mL)中KMnO4 (13 g, 84 mmol)的溶液。将混合物在60 ℃下搅拌30分钟。缓慢添加IPA以淬灭过量KMnO4。通过硅藻土垫过滤反应。在减压下将滤液浓缩并用高真空泵泵抽以确保完全除去水。将残留物溶解于乙醇(200 mL)中，并用冰浴冷却。向这个溶液缓慢添加NaBH4 (3.2 g, 84 mmol)。当TLC显示完全还原后，添加水以淬灭过量NaBH4。在旋转蒸发器上去除乙醇。将粗制材料溶解于EtOAc中，用NaHCO3水溶液洗涤，经硫酸钠干燥，并通过MPLC (MeOH – DCM:0-7 %)纯化。收集标题化合物。LC-MS (IE, m/z): 136 [M + 1]+。
步骤B:6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-甲腈:  在0 ℃下向CHCl3 (30 mL)中6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-醇 (2.7 g, 20 mmol)的溶液缓慢滴入亚硫酰氯 (4.4 mL, 60 mmol)。当完成添加，将混合物在0 ℃下搅拌额外的3小时。将溶剂在减压下去除，并将残留物在高真空下多泵抽15分钟。将粗材料溶解于CHCl3 (300 mL)中，并用pH = 7 缓冲液 (200 mL)洗涤。将缓冲液用IPA-CHCl3 (1:3, 100 mL)萃取一次。将有机萃取物合并，经硫酸钠干燥并浓缩。向该烧瓶中添加四丁基氰化铵 (6.4 g, 24 mmol)和乙腈(40 mL)。将混合物加热至50  ℃持续16小时。在旋转蒸发器上去除乙腈后，将残留物溶于水中，用IPA-CHCl3 (1:3, 各100 mL )萃取三次。将萃取物合并并通过MPLC (DCM – MeOH)纯化。去除溶剂后，收集标题化合物。LC-MS (IE, m/z): 154 [M + 1]+。
步骤C: 6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-甲酸甲酯 1-氧化物: 向加入6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-甲腈 (2.6 g, 18 mmol)和搅拌棒的烧瓶中添加浓缩HCl (5 mL)。将混合物加热至70  ℃持续15分钟。将挥发物在减压下去除，并将残留物在高真空下泵抽15分钟。向该烧瓶中添加MeOH (20 mL) 和甲苯(40 mL)。将溶液用冰浴冷却至0 ℃，其随后添加TMS-重氮甲烷 (36 mL, 72 mmol)。当LC显示完全反应，用HOAc分解过量TMS-重氮甲烷，并通过MPLC纯化粗产物。LC-MS (IE, m/z): 179 [M + 1]+。将获得的加合物溶解于CHCl3 (50 mL)中，并冷却至0℃。向该溶液添加mCPBA (3.1 g, 18 mmol)。将混合物搅拌3 小时。添加硫代硫酸钠溶液以消耗过量mCPBA，并将粗产物用IPA-CHCl3 (1 :3, 100 mL)萃取三次。将萃取物合并，经硫酸钠干燥，吸附至硅胶，并通过MPLC (DCM :MeOH，10% NH4OH水溶液)纯化。去除溶剂后，收集6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-甲酸甲酯 1-氧化物：LC-MS (IE, m/z): 194 [M + 1]+。
步骤D: 2-氨基-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-甲酸甲酯:  向CF3-甲苯 (20 mL)和CHCl3 (20 mL)中6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-甲酸甲酯 1-氧化物 (700 mg, 3.6 mmol)的溶液添加叔丁胺 (3.8 mL, 36 mmol)。将溶液在冰浴中冷却至0 ℃。向溶液中以小份添加对甲苯磺酸酐 (3.5 g, 10.9 mmol)，直到根据LC-MS消耗所有SM。将挥发物在减压下去除，并将残留物再溶于TFA (20 mL)中。将溶液加热至70 ℃持续2小时。在那时终止反应。在旋转蒸发器上去除TFA，并将残留物溶解在饱和碳酸钠中，用IPA-CHCl3 (1:3, 各50 mL )萃取三次。将萃取物合并，经硫酸钠干燥，吸附至硅胶，并通过MPLC (DCM :MeOH，10% NH4OH水溶液)纯化。去除溶剂后，收集标题化合物：LC-MS (IE, m/z): 193 [M + 1]+。
步骤E: 2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-甲酸甲酯
向加入2-氨基-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-甲酸甲酯 (500 mg, 2.6 mmol)和搅拌棒的烧瓶中添加叠氮化钠 (340 mg, 5.2 mmol), 原甲酸三乙酯 (2.2 mL, 13 mmol),和HOAc (10 mL)。将混合物加热至100  ℃持续2小时。在旋转蒸发器上去除溶剂，并将残留物溶解在饱和碳酸钠中，用EtOAc (50 mL X 3)萃取，经硫酸钠干燥，并通过MPLC (DCM-MeOH)纯化。去除溶剂后，收集标题化合物。LC-MS (IE, m/z): 248 [M + 1]+。
步骤F: 2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-甲酸
向THF (6 mL)中2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-甲酸甲酯 (460 mg, 1.9 mmol)的溶液添加氢氧化锂 (1.0 N水溶液. 3.8 mL, 3.8 mmol)。将混合物在0 ℃下搅拌2小时。将反应用水(10 mL)稀释。将pH用1N HCl小心调整至约5。然后将溶液用EtOAc (30 mL X 3)萃取。将萃取物合并，经硫酸钠干燥并浓缩，以提供标题化合物：
。
中间体63
2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-6-甲酸
步骤A: 3-氧代环戊烷甲酸甲酯:  在密封管中将3-氧代环戊烷甲酸 (342 mg, 2.67 mmol)和催化剂Amberlyst-15 (30 mg, 2.67 mmol)合并并加热至100  ℃过夜。将反应过滤并用甲醇充分洗涤。将滤液在真空中浓缩以得到标题化合物。
步骤B: 2-[(二甲基氨基)甲叉基]-3-氧代环戊烷甲酸甲酯和3-[(二甲基氨基)甲叉基]-4-氧代环戊烷甲酸甲酯:  将3-氧代环戊烷甲酸甲酯 (364 mg, 2.56 mmol)和1-叔丁氧基-N,N,N',N'-四甲基甲二胺 (447 mg, 2.56 mmol)合并并在110  ℃加热1.5 h。将反应通过Isco Combiflash纯化(12 g 硅胶, 30 mL/min, 254 nM, 0%至100% (二氯甲烷中10% 甲醇) / 二氯甲烷。标题化合物作为两种位置异构体的混合物在53％(二氯甲烷中10％甲醇)/ 二氯甲烷洗脱。将混合物通过在IA柱(30 x 250 mm，70 mL/min., 35℃, 220 nM, 甲醇中140 mg/mL)上用40％甲醇/二氧化碳通过制备型SFC分离以得到标题化合物。
步骤C: 2-氨基-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-6-甲酸甲酯:  向无水甲醇 (2.5 mL)中3-[(二甲基氨基)甲叉基]-4-氧代环戊烷甲酸甲酯 (71.7 mg, 0.36 mmol)的溶液添加盐酸胍 (124.7 mg, 1.3 mmol)，随后添加甲醇中甲醇钠(0.24 mL, 1.27 mmol)。在密封管中将混合物加热至90℃过夜。将粗反应物用2 N HCl淬灭，并在真空中浓缩。水性残留物通过HPLC (30X100 mm Waters Sunfire柱; 5微米; 35 mL/min.; 210 nM; 0%至40% CH3CN + 0.05% TFA /水 + 0.05% TFA，经15 min.; 化合物在10% CH3CN + 0.05% TFA / 水 + 0.05% TFA洗脱)纯化，以便在冻干后得到标题化合物。
步骤D:  2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-6-甲酸甲酯
在室温下向乙酸乙酯 (5 mL)中2-氨基-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-6-甲酸甲酯 (65.2 mg, 0.364 mmol)的混合物添加三氟乙酸三甲基甲硅烷基酯 (0.107 mL, 0.619 mmol)。在室温下搅拌混合物，然后添加原甲酸三乙酯 (0.103 mL, 0.619 mmol)。将混合物再搅拌5分钟，然后添加叠氮基三甲基硅烷(0.081 mL, 0.619 mmol)。在室温下将反应搅拌过夜，然后在真空中浓缩并将残留物用二氯甲烷磨碎两次。将所得固体通过离心收集，并在真空下干燥以得到标题化合物：LC/MS: [(M+1)]+ = 233。
步骤E: 2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-6-甲酸
以与步骤F中对于合成2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-甲酸的方式类似的方式来从2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-6-甲酸甲酯制备标题化合物。
中间体64
Figure 844608DEST_PATH_IMAGE177
2-(1H-四唑-1-基)- 5,6,7,8-四氢喹啉-5-甲酸
步骤A: 5,6,7,8-四氢喹啉-5-甲酸甲酯:  将喹啉-5-甲酸甲酯 (3.67g, 19.61 mmol)溶解于TFA (60 mL)中并添加氧化铂 (0.49g, 2.16mmol)，然后在室温下氢化过夜。将催化剂滤出并将滤液蒸发至干燥。将残留物通过120g ISCO Redi-sep柱层析，并用5%的(MeOH中10% NH4OH)/DCM洗脱，以得到5,6,7,8-四氢喹啉-5-甲酸甲酯：LC-MS: M+1= 192。
步骤B: 5,6,7,8-四氢喹啉-5-甲酸甲酯-1-氧化物:  将5,6,7,8-四氢喹啉-5-甲酸酯  (2.05g, 10.72 mmol)溶解于氯仿 (100ml)中并添加间氯过氧苯甲酸 ( 2.77g, 16.08 mmol)。将反应在室温下搅拌11/2 hr。将反应用NaHCO3洗涤2次，用盐水洗涤1次，用Na2SO4干燥，然后过滤并蒸发至干燥。将残留物通过120g ISCO Redi-sep柱层析，并用100% 乙酸乙酯至10% MeOH/90%EtOAc梯度溶剂系统洗脱，以得到标题化合物：LC-MS: M+1= 208
步骤C: 2-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-5-甲酸甲酯:  将5,6,7,8-四氢喹啉-5-甲酸甲酯-1-氧化物 (2.05 g, 9.89 mmol) 和叔丁胺 (5.22 mL, 49.5 mmol)溶解于三氟甲苯 (50ml)中并用冰浴冷却。逐份添加对甲苯磺酸酐 (6.46 g, 19.79 mmol)，使反应的内部温度保持低于 5℃。监测反应，并且10 min后，当LC-MS在1.20时显示M+1 = 263和207 (M-56)时，表明中间体2-(叔丁基氨基)-5,6,7,8-四氢喹啉-5-甲酸甲酯形成。然后将TFA (10 mL)添加至反应混合物，并在70℃加热5 小时。将反应冷却并蒸发至干燥。将残留物用水溶取，并用5N NaOH将pH调节至约8。将反应用DCM 萃取两次。将合并的DCM层用盐水洗涤，并用Na2SO4干燥，过滤并蒸发至干燥。将残留物通过80g ISCO Redi-sep柱层析，并用5%( 10%NH4OH在MeOH中 ) /DCM的溶剂系统洗脱，以得到标题化合物：LC-MS: M+1= 207。
步骤D: 2- (1H-四唑-1-基)- 5,6,7,8-四氢喹啉-5-甲酸甲酯: 将2- 氨基- 5, 6, 7, 8-四氢喹啉-5-甲酸甲酯 (850 mg, 4.12mmol)在乙酸 (15 mL)和原甲酸三乙酯 (1.373 mL, 8.24 mmol)中搅拌，随后加入叠氮化钠 (482 mg, 7.42 mmol)，然后加热至80℃，持续3小时。将反应冷却并蒸发至干燥。将混合物溶解在DCM中，并用饱和NaHCO3溶液洗涤，然后用盐水洗涤。有机层经Na2SO4干燥，过滤并蒸发至干燥。将残留物通过40g ISCO Redi-sep柱层析，并用乙酸乙酯:己烷 (2:3)洗脱，以得到2- (1H-四唑-1-基)- 5,6,7,8-四氢喹啉-5-甲酸甲酯。
步骤E: 2-(1H-四唑-1-基)- 5,6,7,8-四氢喹啉-5-甲酸:  将2-(1H-四唑-1-基)- 5,6,7,8-四氢喹啉-5-甲酸甲酯 (1.04 g, 4.01 mmol) 和氢氧化锂 (0.202 g, 4.81 mmol)在四氢呋喃 (10mL)/ 水(10.00 mL)的混合物中搅拌75 min。TLC显示一些20%起始材料，所以添加更多LiOH (50mg, 1.19mmol)，并再搅拌1小时。用2N HCl (3 mL, 6 mmol)将反应调整至pH 4-5，然后用乙酸乙酯萃取两次。将乙酸乙酯层合并，并用Na2SO4干燥，过滤并蒸发至干燥，以得到标题化合物：LC-MS: (M+1)-28= 218。
中间体65
Figure 874880DEST_PATH_IMAGE178
3-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[c]吡啶-7-甲酸
步骤A:  N-(5-溴-4-甲基吡啶-2-基)-2,2-二甲基丙酰胺:  向80 mL 吡啶中5-溴-4-甲基吡啶-2-胺 (20.6 g, 110 mmol)的溶液逐滴添加三甲基乙酰氯 (19.9g, 165 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌12小时。将混合物用水稀释并用二氯甲烷 (3x)萃取。将有机层用水(2x)和盐水洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩，然后通过层析纯化。用2->20% EtOAc /己烷洗脱后，获得标题化合物：LC/MS (M+1)+ = 270.9。
步骤B:  N-[5-溴-4-(2-羟基乙基)吡啶-2-基]-2,2-二甲基丙酰胺:  将THF (80 mL) 中N-(5-溴-4-甲基吡啶-2-基)-2,2-二甲基丙酰胺 (30.0 g, 111 mmol)的溶液在冰浴中冷却，并用庚烷/THF/乙基苯 (2.0 M, 138 mL)中二异丙基胺锂的溶液逐滴处理。搅拌1h后，将溶液用多聚甲醛 (24.9 g, 277 mmol)处理并逐渐升温至室温同时搅拌12 h。将混合物用饱和碳酸氢钠溶液稀释并用乙酸乙酯 (3x)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。通过MPLC纯化(洗脱液 6-50% 乙酸乙酯 / 己烷)得到标题化合物：LC/MS (M+1)+ = 300.87。
步骤C:  {6-[(2,2-二甲基丙酰基)氨基]-4-(2-羟基乙基)吡啶-3-基}乙酸叔丁酯
向250 mL圆底烧瓶中加入N-[5-溴-4-(2-羟基乙基) 吡啶-2-基]-2,2-二甲基丙酰胺 (1.9 g, 6.31 mmol)、三(二苄叉基丙酮)二钯(0) (0.173 g, 0.189 mmol)和2-(二环己基膦基)-2',4',6'-三异丙基联苯(0.180 g, 0.379)，并将混合物在氮气下冲洗30 min。添加四氢呋喃，随后添加乙醚 (0.5 M, 47.9 mL)中2-叔丁氧基-2-氧代乙基氯化锌的溶液并将混合物放置于油浴中，保持在45℃。12h后，向反应再加入三(二苄叉基丙酮)二钯(0) (0.173 g, 0.189 mmol)和2-(二环己基膦基)-2',4',6'-三异丙基联苯(0.180 g, 0.379)，并添加额外量的2-叔丁氧基-2-氧代乙基氯化锌/乙醚 (0.5 M, 12.6 mL)。在45℃浴中再搅拌2h后，将反应混合物用乙酸乙酯和10% 氢氧化铵溶液稀释，过滤以去除固体，并分离各层。将有机层用水和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。通过MPLC纯化(洗脱液 9-90% 乙酸乙酯 / 己烷)得到{6-[(2,2-二甲基丙酰基)氨基]-4-(2-羟基乙基)吡啶 -3-基}乙酸叔丁酯：LC/MS (M+1)+ = 337.0。
步骤D:  {4-(2-溴乙基)-6-[(2,2-二甲基丙酰基)氨基]吡啶-3-基}乙酸叔丁酯
将二氯甲烷 (50 mL)中{6-[(2,2-二甲基丙酰基)氨基]-4-(2-羟基乙基)吡啶-3-基}乙酸叔丁酯 (2.30 g, 6.84 mmol)与咪唑 (0.558 g, 8.20 mmol)的混合物用三苯基膦 (1.79 g, 6.84 mmol)和四溴化碳 (2.72 g, 8.20 mmol)处理。将反应混合物在室温下搅拌2 h，然后用水稀释并分离各层。将有机层依次用 5% 盐酸，饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤，然后干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。将残留物通过短的硅胶塞过滤 (20% EtOAc:己烷洗脱液)以得到标题化合物，其立即用于下一步骤：LC/MS (M+1)+ = 398.9。
步骤E:  3-[(2,2-二甲基丙酰基)氨基]-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[c]吡啶-7-甲酸叔丁酯:  经1 h经由加料漏斗用四氢呋喃 (50 mL) 中二异丙基氨基锂的溶液(从二异丙胺 (3.79 g, 34.7 mmol)和正丁基锂 (2.5 M, 13.7 mL)制备)逐滴处理在干冰-丙酮浴中冷却的四氢呋喃 (50 mL)中{4-(2-溴乙基)-6-[(2,2-二甲基丙酰基)氨基]吡啶-3-基}乙酸叔丁酯 (6.5 g, 16.3 mmol)的溶液。完全添加后，将反应再搅拌1 h。然后用饱和碳酸氢钠溶液淬灭并升温至室温。将所得混合物用乙酸乙酯和水稀释，并转移至分液漏斗中。分离各层并将水层用乙酸乙酯 (2x)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。所得残留物的纯化(2->25% EtOAc /己烷洗脱液)提供标题化合物。LC/MS (M+1)+ = 319.0。
步骤F: 3-氨基-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[c]吡啶-7-甲酸:  将6N 盐酸 (25 mL)中3-[(2,2-二甲基丙酰基)氨基]-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[c]吡啶-7-甲酸酯 (0.624 mg, 1.96 mmol)的溶液加热至回流持续24 h。将溶液冷却并浓缩以提供标题化合物，其无需进一步纯化即用于下一步骤：LC/MS (M+1)+ = 179.0。
步骤G: 3-氨基-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[c]吡啶-7-甲酸甲酯:  在0℃下将甲醇 (10 mL)中来自步骤F的3-氨基-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[c]吡啶-7-甲酸的溶液用乙醚 (2.0 M, 1.96 mL)中三甲基甲硅烷基重氮甲烷的溶液逐滴处理。完全添加后，将反应升温至室温并搅拌30 min，然后浓缩。在高真空下将所得残留物干燥以得到标题化合物LC/MS (M+1)+ = 193.0;
步骤H: 3-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[c]吡啶-7-甲酸甲酯
将乙酸 (8 mL)中3-氨基-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[c]吡啶-7-甲酸甲酯 (365 mg, 1.90 mmol)、原甲酸三乙酯 (451 mg, 3.04 mmol)和叠氮化钠 (185 mg, 2.85 mmol)的溶液在80℃加热的油浴中维持3 h。冷却至室温后，将混合物用水和乙酸乙酯稀释，并分离各层。将水层用乙酸乙酯 (2x)萃取，并将合并的有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。所得残留物的纯化(8->80% EtOAc /己烷洗脱液)提供标题化合物。LC/MS (M+1)+ = 193.0。
步骤I: 3-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[c]吡啶-7-甲酸:  在室温下将四氢呋喃 (5 mL)和水(1.5 mL)中3-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[c]吡啶-7-甲酸酯 (235 mg, 0.958 mmol)的溶液用氢氧化锂溶液 (1 M, 1.44 mL)处理。30 min后，将溶液浓缩以去除四氢呋喃，并将剩余的水溶液用1 N 盐酸溶液酸化 (至 pH约4)，并用乙酸乙酯 (3x)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩，以提供标题化合物：
Figure 971012DEST_PATH_IMAGE179
。
中间体66
Figure 938017DEST_PATH_IMAGE181
3-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-7-甲酸锂
步骤A: 甲磺酸丁-3-炔-1-基酯:  在0℃下向600 mL DCM中丁-3-炔-1-醇 (45.0 g, 0.64 mol)和甲磺酰氯(81.0 g, 0.71 mol)的溶液逐滴添加TEA (78.0 g, 0.77 mol)。将所得混合物在室温下搅拌2小时，然后浓缩至干燥。将残留物溶解于1 L EtOAc中，然后用1N HCl (2 x 200 mL)、盐水(200 mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥并浓缩，以提供甲磺酸丁-3-炔-1-基酯。
步骤B: 4-碘代丁-1-炔:  在N2下将450 mL 丙酮中甲磺酸丁-3-炔-1-基酯 (90.0 g, 0.608 mol)和NaI (137 g, 0.912 mol)的悬浮液回流4小时，然后冷却。向该反应混合物中添加450 mL 乙醚并过滤。将固体用另一份300 L乙醚洗涤，并将滤液蒸馏。收集70℃/20 mmHg的部分。
步骤C:丁-3-炔-1-基丙二酸叔丁酯乙酯:  在25℃下向200 mL DMF中NaH (60 %, 8.50 g, 213 mmol)的悬浮液逐滴添加丙二酸叔丁酯乙酯 (36.3 g, 193 mmol)。将混合物搅拌1小时，并逐滴添加4-碘代丁-1-炔 (38.2 g, 212.2 g)。将所得悬浮液搅拌过夜并用1 L乙醚稀释，用(3 x 200 mL)、盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥并浓缩，以提供丁-3-炔-1-基丙二酸叔丁酯乙酯，其直接用于下一步骤。
步骤D:丁-3-炔-1-基(5-硝基嘧啶-2-基)丙二酸叔丁酯乙酯:  在25℃下向100 mL DMF中NaH (60 %, 2.5 g, 62.4 mmol)的悬浮液逐滴添加丁-3-炔-1-基丙二酸叔丁酯乙酯 (15 g, 62.4 mmol)。将混合物在40℃下搅拌30分钟，并逐滴添加50 mL DMF中2-氯-5-硝基嘧啶 (10.0 g, 62.4 mmol)。将所得悬浮液在50℃下搅拌2小时并用500 mL EtOAc稀释。将混合物用水(3x 100 mL)、盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥并浓缩。将残留物通过柱层析纯化(石油醚:EtOAc = 10 :1)以提供标题化合物；MS m/z 364 (M+1)+。
步骤E:  3-硝基-5,6-二氢-7H-环戊二烯并[b]吡啶-7,7-二甲酸7-叔丁酯7-乙酯
将100 mL 硝基苯中丁-3-炔-1-基(5-硝基嘧啶-2-基)丙二酸叔丁酯乙酯 (10.2 g, 28.1 mmol)的溶液加热至150℃持续4小时。将硝基苯通过真空去除并将残留物通过柱层析纯化(石油醚:EtOAc = 10 :1)以提供标题化合物；MS m/z 337 (M+1)+。
步骤F: 3-硝基-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-7-甲酸乙酯:  在35℃下将30 mL TFA和30 mL DCM中3-硝基-5,6-二氢-7H-环戊二烯并[b]吡啶-7,7-二甲酸7-叔丁酯7-乙酯 (6.2 g, 18.4 mmol)的混合物搅拌3小时，然后浓缩至干燥。将残留物溶解于200 L EtOAc中，并用饱和NaHCO3 (2 x 25 mL)和盐水(25 mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥并浓缩，以提供标题化合物。
步骤G: 3-氨基-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-7-甲酸乙酯:   在50 psi的氢气下，将80 mL 乙醇中3-硝基-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-7-甲酸乙酯 (4.2 g, 17.8 mmol)和Pd/C (0.5 g, 10 %)的混合物在室温下搅拌2小时，然后过滤。将滤液浓缩以提供标题化合物。
步骤H: 3-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-7-甲酸乙酯
向50 mL 乙酸中3-氨基-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-7-甲酸乙酯 (3.0 g, 14.6 mmol)和原甲酸三乙酯 (6.5 g, 43.6 mmol)的溶液添加叠氮化钠 (1.0 g, 16.0 mmol)。将混合物加热至100  ℃持续3小时。通过TLC完成反应。将反应混合物冷却至室温。在真空下除去溶剂。将残留物溶解于EtOAc，用水洗涤，用无水硫酸钠干燥并浓缩。将残留物通过柱层析纯化以提供标题化合物。
步骤I:  3-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-7-甲酸锂
向50 mL THF/MeOH/H2O (2 : 2 : 1)中3-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-7-甲酸乙酯 (1.5 g, 5.8 mmol)的混合物逐份添加 LiOH·H2O (242.8 mg, 5.8 mmol)。将所得混合物搅拌30分钟，然后用20 mL水稀释并用乙醚(3 x 30 mL)洗涤。将水层冰冻干燥以提供标题化合物：
Figure 76875DEST_PATH_IMAGE182
Figure 961435DEST_PATH_IMAGE183
。
中间体67
Figure 539047DEST_PATH_IMAGE184
2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-5-甲酸
步骤A: 丁烷-1,2,4-三甲酸三甲酯:  将硫酸(0.620 mL, 11.6 mmol)添加至甲醇 (50 mL)/1,2-二氯乙烷(140 mL)中1,2,4-丁烷三甲酸 (30.0 g, 158 mmol)的混合物。将混合物在回流下加热6.5小时，然后在室温下放置过夜。蒸发溶剂。然后将200 mL 苯添加至残留物，随后在剧烈搅拌下缓慢添加冰冷的饱和NaHCO3 溶液。分离各相。将水相用苯 (1x100mL)萃取。将有机萃取物合并，用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并将滤液蒸发，以提供标题化合物。
步骤B: 2-氧代环戊烷-1,3-二甲酸二甲酯和3-氧代环戊烷-1,2-二甲酸二甲酯:  将氢化钠 (6.19 g, 155 mmol)添加至甲苯 (94 mL)并冷却至5℃(反应温度)。经1 3/4小时逐滴添加甲苯 (26 mL)/甲醇 (0.22 mL)中丁烷-1,2,4-三甲酸三甲酯 (29.9 g, 129 mmol)的溶液，同时将温度保持在5-10℃。将所得混合物在5-10 ℃下搅拌2小时。然后添加40 mL水。分离各层。用水萃取有机相。将水性萃取物合并，通过添加 1.7 M柠檬酸酸化并用EtOAc (200mL, 100mL x 2)萃取。将合并的EtOAc萃取物用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并将溶剂蒸发，以提供产物。将粗产物通过Isco Combiflash (330g硅胶, 100mL/min., 254nM, 经12个柱体积，0%至100%EtOAc/己烷;所需产物在50% EtOAc洗脱; (位置异构体在65% EtOAc洗脱)纯化，以得到标题化合物。
步骤C: 2-氨基-4-羟基-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-5-甲酸甲酯
向可重封的管中加入3-氧代环戊烷-1,2-二甲酸二甲酯  (6.04 g, 30.2 mmol)。添加二氧杂环己烷 (86 mL)，随后添加盐酸胍 (3.83 g, 40.1 mmol)和叔丁醇钾 (40 mL, 40 mmol)。将管密封并在130 ℃下加热18小时。蒸发溶剂。将甲醇 (86 mL)添加至残留物，随后缓慢添加亚硫酰氯 (2.2 mL, 30 mmol)。该混合物在RT下搅拌过夜。蒸发溶剂。在硅胶上通过层析(用0至20%的DCM:甲醇经14分钟梯度洗脱)纯化残留物以提供标题化合物。无需进一步纯化，该材料用于下一步骤：LC/MS (M+H)+ = 210。
步骤D: 2-氨基-4-氯-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-5-甲酸甲酯
将磷酰氯 (16.0 mL, 172 mmol) 添加至2-氨基-4-羟基-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-5-甲酸甲酯 (5.84 g, 27.9 mmol)。在100 ℃下在微波中将所得混合物在密封管中加热3小时。蒸发溶剂。将残留物溶解于6 mL乙腈中，并添加6 mL冰/水。将所得混合物在RT下搅拌15分钟，并经10分钟(11次注射)在SunFire柱上使用0至100%乙腈梯度通过反向制备型HPLC纯化以得到标题化合物。通过重新纯化混合级分获得额外产物：LC/MS (M+H) = 228, 230。
步骤E: 2-氨基-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-5-甲酸甲酯:
将三乙胺 (3.20 mL, 23.0 mmol)添加至二氧杂环己烷 (42 mL)中2-氨基-4-氯-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-5-甲酸甲酯 (2.11 g, 9.27 mmol)的溶液，随后添加甲酸 (0.89 mL, 22.28 mmol)和[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]-二氯化钯(II) (660 mg, 0.902 mmol)。在密封管中将反应混合物在100 ℃下加热过夜。蒸发溶剂。在硅胶(220 g + 125 g药筒)上通过层析使用CH 2 Cl2 :MeOH 95 :5纯化残留物，以提供标题化合物，其无需进一步纯化即用于下一步骤。
步骤F: 2-氨基-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-5-甲酸:   将氢氧化钠 (13.0 mL, 13.0 mmol)添加至甲醇 (21 mL)中2-氨基-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-5-甲酸甲酯 (1.10 g, 5.69 mmol)的溶液。将所得混合物在RT搅拌1.5 小时。添加盐酸 (13 mL, 13.00 mmol)。蒸发溶剂。在硅胶(24g药筒)上通过层析(用CH2Cl2:MeOH 95:5 (150 mL)和CH2Cl2:MeOH:AcOH 90:10:1洗脱)纯化残留物以得到标题化合物。
步骤G: 2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-5-甲酸
将三氟乙酸三甲基甲硅烷基酯 (1.5 mL, 8.7 mmol) 添加至乙酸乙酯 (10 mL)中2-氨基-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-5-甲酸 (845 mg, 4.72 mmol)的悬浮液。获得溶液，但在5分钟内形成沉淀。在RT下将反应混合物搅拌5分钟，并添加原甲酸三乙酯 (1.4 mL, 8.4 mmol)。在RT下将混合物搅拌5分钟，并添加叠氮基三甲基硅烷(1.1 mL, 8.4 mmol)。将所得悬浮液在RT下搅拌过夜。蒸发溶剂。在硅胶(80 g药筒)上使用CH2Cl2 (A)和CH2Cl2:MeOH:AcOH 90:10:1 (B)用梯度洗脱(经16个柱体积，100% A至100% B)通过层析纯化残留物以得到粗产物，其通过制备型HPLC进一步纯化以得到标题混合物：
Figure 524320DEST_PATH_IMAGE185
Figure 896396DEST_PATH_IMAGE186
。
上述中间体可通过在其数字前置“I-”而被提及。例如，中间体44A简称为I-44A。仅对于实施例2A和2B测定在氮杂-茚满手性中心的绝对立体化学。
实施例1AB异构混合物, 1A和1B
Figure 763858DEST_PATH_IMAGE187
(3R)-3-甲基-6-[(3R,9aS)-8-{[2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-基]羰基}八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮
将2 mL 干DMF中2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-甲酸 [I-62] (200mg, 0.86 mmol) 的溶液在室温下用HATU (362 mg, 0.95 mmol)处理。5分钟后，添加2 mL 干DMF中(R)-3-甲基-6-((3R,9aS)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基)异色满-1-酮 二盐酸盐 [I-44A] (325 mg, 0.86 mmol)和DIEA (0.23 mL, 1.3 mmol)的溶液，并将反应在室温下搅拌过夜。将混合物用10 mL水淬灭，用EtOAc萃取并将有机层浓缩。粗产物经由MPLC纯化[10-60% (80:10:8:2 EtOAc:乙腈-IPA:MeOH)/己烷混合物]，以得到作为非对映异构体的混合物的标题化合物：LC-MS: (M+1)+ 516。通过在OD柱上使用45% 2:1 MeOH:MeCN的手性制备型SFC，实现两种氮杂-茚满非对映异构体的手性拆分。较快洗脱异构体是更有效的ROMK抑制剂：1A: 较快洗脱的氮杂-茚满非对映异构体: 
Figure 817264DEST_PATH_IMAGE188
1B: 较慢洗脱的氮杂-茚满非对映异构体 (在铊通量和电生理学测定中大于1μM的IC50):  LC-MS: (M+1)+ 516。
实施例1CD异构混合物, 1C和1D
Figure 220826DEST_PATH_IMAGE189
(3R)-3-甲基-6-[(3S,9aS)-8-{[2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-基]羰基}八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮
以与上述对于合成实施例1A和1B中的异构体混合物所述的方式类似的方式制备标题化合物(作为两种异构体的混合物)，但以(R)-3-甲基-6-((3S,9aS)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基)异色满-1-酮 二盐酸盐 [I-44B]开始。通过在Chiralcel OD柱上使用40% 2:1 MeOH:MeCN的手性制备型SFC，实现标题化合物的两种氮杂-茚满非对映异构体的手性拆分。较快洗脱异构体是更有效的ROMK抑制剂。1C:  较快洗脱的氮杂-茚满非对映异构体:  LC-MS: (M+1)+ 516:   1D: 较慢洗脱的氮杂-茚满非对映异构体 (在铊通量和电生理学测定中大于1μM的IC50):  LC-MS: (M+1)+ 516。
实施例1EF异构混合物, 1E 和1F
Figure 763803DEST_PATH_IMAGE190
(3R)-3-甲基-6-[(3S,9aR)-8-{[2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-基]羰基}八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮:
以与上述对于合成实施例1A和1B中的异构体混合物所述的方式类似的方式制备标题化合物(作为两种异构体的混合物)，但以(R)-3-甲基-6-(3S,9aR)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基)异色满-1-酮 二盐酸盐 [I-44G]开始。通过在Chiralpak AS柱上使用50% 2:1 MeOH:MeCN的手性制备型SFC，实现标题化合物的两种氮杂-茚满非对映异构体的手性拆分。1E: 较快洗脱的氮杂-茚满非对映异构体:  LC-MS: (M+1)+ 516. 1F: 较慢洗脱的氮杂-茚满非对映异构体:   LC-MS: (M+1)+ 516。
实施例1GH异构混合物, 1G和1H
Figure 321823DEST_PATH_IMAGE191
(3S)-3-甲基-6-[(3R,9aS)-8-{[2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-基]羰基}八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮
以与上述对于合成实施例1A和1B中的异构体混合物所述的方式类似的方式制备标题化合物(作为两种异构体的混合物)，但以(S)-3-甲基-6-((3R,9aS)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基)异色满-1-酮 二盐酸盐 [I-44C]开始。通过在ChiralpakAD柱上使用70% 2:1 MeOH:MeCN的手性制备型SFC，实现标题化合物的两种氮杂-茚满非对映异构体的手性拆分。较快洗脱异构体是更有效的ROMK抑制剂。1G: 较快洗脱的氮杂-茚满非对映异构体: 
Figure 975658DEST_PATH_IMAGE192
1H: 较慢洗脱的氮杂-茚满非对映异构体 (在铊通量和电生理学测定中大于1μM的IC50): LC-MS: (M+1)+ 516。
实施例1IJ异构混合物, 1I 和1J
Figure 997841DEST_PATH_IMAGE193
(3S)-3-甲基-6-[(3R,9aR)-8-{[2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-基]羰基}八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮: 以与上述对于合成实施例1A和1B中的异构体混合物所述的方式类似的方式制备标题化合物(作为两种异构体的混合物)，但以(S)-3-甲基-6-((3R,9aR)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基)异色满-1-酮 二盐酸盐 [I-44F]开始。通过在Chiralpak AS-H柱上使用50% MeOH (0.2% DEA)的手性制备型SFC，实现标题化合物的两种氮杂-茚满非对映异构体的手性拆分。1I: 较快洗脱的氮杂-茚满非对映异构体:  LC-MS: (M+1)+ 516，1J: 较慢洗脱的氮杂-茚满非对映异构体:  LC-MS: (M+1)+ 516。
实施例1KL异构混合物, 1K 和1L
Figure 210254DEST_PATH_IMAGE194
(3S)-3-甲基-6-[(3S,9aR)-8-{[2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-基]羰基}八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮:
以与上述对于合成实施例1A和1B中的异构体混合物所述的方式类似的方式制备标题化合物(作为两种异构体的混合物)，但以(S)-3-甲基-6-((3S,9aR)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基)异色满-1-酮 二盐酸盐 [I-44E]开始。通过在Chiralcel OD-H柱上使用40% MeOH (0.2% DEA)的手性制备型SFC，实现标题化合物的两种氮杂-茚满非对映异构体的手性拆分。较快洗脱异构体是更有效的ROMK抑制剂：1K: 较快洗脱的氮杂-茚满非对映异构体: 
Figure 989991DEST_PATH_IMAGE195
1L: 较慢洗脱的氮杂-茚满非对映异构体 (在铊通量和电生理学测定中大于1μM的IC50):  LC-MS: (M+1)+ 516。
实施例2AB异构混合物, 2A和2B (方法1)
Figure 447518DEST_PATH_IMAGE196
2A: 6-氟-2-甲基-3-[(3S,9aR)-8-{[(5S)-2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-5-基]羰基}八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈 和2B: 6-氟-2-甲基-3-[(3S,9aR)-8-{[(5R)-2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-5-基]羰基}八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈
将EDC (2.24 g, 11.68 mmol)添加至二氯甲烷 (25 mL)中2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-5-甲酸 [I-67] (2.51 g, 9.73 mmol)和6-氟-2-甲基-3-[(3S,9aR)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈 [I-40C-1]  (2.81 g, 10.21 mmol)的悬浮液。将反应混合物在RT搅拌1.5 小时。蒸发大部分溶剂。将残留物溶解于EtOAc中，用水、NaHCO3溶液和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并将溶剂蒸发，以提供两种非对映异构体的粗混合物。在硅胶(220 g药筒)上用CH2Cl2 (溶剂A)至50% CH2Cl2:MeOH 90:10 (溶剂B)的梯度洗脱纯化粗产物以得到标题非对映异构体的混合物，其通过手性制备型SFC HPLC (在Chiralpak IC柱上的SFC, Diacel Chemical Industries, LTD., 30 x 250mm, 60% 2:1 MeOH:MeCN/ CO2, 70 mL/min., 100巴, DCM/MeCN中的样品, 35C, 254 nm)分离以得到分离的氮杂-茚满非对映异构体：异构体2A较快洗脱，异构体2B较慢洗脱。通过较慢洗脱异构体的X-射线结晶学进行氮杂-茚满手性中心的立体化学指定。异构体A溶解于1 mL乙腈，并添加1当量1 M HCl/乙醚，并将固体过滤以得到盐酸盐。
Figure 261890DEST_PATH_IMAGE197
实施例2A (方法2)
5L的3颈圆底烧瓶配有置顶搅拌器、N2入口和热电偶。向烧瓶中加入6-氟-2-甲基-3-[(3S,9aR)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈 [I-40C-2] (147.15 g, 423 mmol, 基于二-盐酸盐计), 2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-5-甲酸 [I-67] (95.7% 纯度, 110 g, 452 mmol), EDCI·HCl (122 g, 634 mmol),和HOBt·H2O (6.47 g, 42.3 mmol), 随后加入预先混合的四氢呋喃 (1472 mL)和水(73.6 mL)。通过温度从23℃增加至31℃完成THF:水的添加。经由加料漏斗添加四当量的DIPEA (300mL)，同时使温度保持< 35 ℃。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应物在500mL水中用氯化铵 (90 g, 1690 mmol)淬灭。将产物用500 mL EtOAc从水相中萃取，随后用200mL EtOAc萃取，并将有机层合并。将合并的有机层用氯化铵溶液洗涤，直到水相的pH为6-7。观察到固体已经沉淀，并将其从水相和有机相界面过滤出来。浓缩有机相以去除THF和EtOAc。添加约 200 mL 乙腈并将混合物经受旋转蒸发以除去水。更多的固体沉淀。将固体过滤，并将滤液稀释至1500 mL用于SFC手性HPLC分离输入流。分离经由以下方法来实现：Chiracel AD-H柱(Diacel Chemical Industries, LTD., 250x 50mm, 5um)，流速为250mL/min，35℃，220nm，100巴，50% MeOH:MeCN(2:1)/ CO2，260秒循环时间，1500mL MeCN中的130g，87mg/mL, 15mL/注射。将峰1 (较快洗脱)级分浓缩，溶解于750 mL ACN中，并用活性炭(Norit SA3, 100目)处理，搅拌约15min，过滤，在solka flok上过滤，并浓缩。将泡沫残留物在40-50℃加热下用350 mL DME溶解。在约35-37℃约2-3 min后观察到沉淀，并使混合物冷却至环境条件。当温度达到约25℃时，经约15 min添加250 mL环己烷，并将该批料搅拌约1h。将固体产物过滤，并将反应器和滤饼用100mL环己烷洗涤，并且使固体在N2下达到大多干燥状态。在真空下在60 ℃下将湿滤饼干燥约18h以得到6-氟-2-甲基-3-[(3S,9aR)-8-{[(5S)-2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-5-基]羰基}八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈。
实施例2CD异构混合物, 2C和2D
6-氟-2-甲基-3-[(3R,9aR)-8-{[2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-5-基]羰基}八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈 (异构体混合物): 将1-羟基苯并三唑 (173 mg, 1.280 mmol)添加至二氯甲烷 (2 mL)中2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-5-甲酸 [I-67] (200 mg, 0.861 mmol)的悬浮液，随后添加EDC (331 mg, 1.73 mmol), 6-氟-2-甲基-3-[(3R,9aR)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈 [I-40D] (551 mg, 1.095 mmol)和三乙胺 (0.70 mL, 5.0 mmol)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物用EtOAc稀释，并用饱和NaHCO3 溶液、水和盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并将溶剂蒸发，以提供作为两个非对映异构体的混合物的标题化合物。在硅胶(24 g药筒)上使用CH2Cl2 (A)和CH2Cl2:MeOH 90:10 (B)用经12 CV从100% A至100% B的梯度洗脱通过MPLC纯化粗产物以得到作为两种非对映异构体的混合物的标题化合物。LC/MS 490 (M+H)。通过在Chiralcel AS柱，100巴, 40% MeOH(0.2% DEA)/CO2, 35 oC上的制备型手性HPLC (SFC)纯化非对映异构体的混合物，以得到两个标题化合物的分离的氮杂-茚满非对映异构体：异构体2C (较快洗脱) 和异构体2D (较慢洗脱)。每个异构体分别溶解于1 mL二氯甲烷，并添加1当量1 M HCl/乙醚。将溶液蒸发以得到每个异构体的盐酸盐。
实施例2EF异构混合物, 2E 和2F
Figure 674920DEST_PATH_IMAGE200
6-氟-2-甲基-3-[(3R,9aS)-8-{[2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-5-基]羰基}八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈 (异构混合物):
以与上述对于合成实施例2C和2D中的异构体混合物所述的方式类似的方式制备标题化合物(作为两种异构体的混合物)，但以6-氟-2-甲基-3-[(3R,9aS)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈开始。通过在Chiralcel AS-H柱(100巴, 30% MeOH (0.2% 异丁胺)/ CO2, 35 oC)上的手性制备型SFC HPLC分离非对映异构体，随后通过在硅胶上的制备型TLC(用CH2Cl2:MeOH 95:5洗脱)进一步纯化，以得到标题化合物的分离的氮杂-茚满非对映异构体，异构体2E (较快洗脱) 和异构体2F (较慢洗脱)。每个异构体分别溶解于1 mL二氯甲烷，并添加1当量1 M HCl/乙醚中。将溶液蒸发以得到分离的非对映异构体的盐酸盐。
Figure 907580DEST_PATH_IMAGE201
实施例2GH异构混合物, 2G和2H
Figure 900944DEST_PATH_IMAGE202
6-氟-2-甲基-3-[(3S,9aS)-8-{[2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-5-基]羰基}八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈 (异构混合物):  将HATU (266 mg, 0.700 mmol)添加至DMF (1 mL)中2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-5-甲酸 [I-67] (148 mg, 0.637 mmol)的溶液。在RT下将混合物搅拌5分钟，并添加二氯甲烷 (1 mL)中6-氟-2-甲基-3-[(3S,9aS)-八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈 [I-40A] (411 mg, 0.817 mmol),和Hunig氏碱 (0.70 mL, 4.0 mmol)的溶液。将烧瓶用二氯甲烷 (0.3 mL)冲洗两次。将反应混合物在室温下搅拌2小时，然后用EtOAc稀释，并用饱和NaHCO3 溶液、水和盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并将溶剂蒸发，以提供作为两个非对映异构体的混合物的粗标题化合物。在硅胶(2000 μm，洗脱两次)上通过制备型TLC使用CH2Cl2:MeOH 95:5 (B)纯化该粗材料，以提供作为非对映异构体的混合物的标题化合物2GH：LC/MS 512 (M+Na), 490 (M+H).。通过手性制备型SFC HPLC(ChiralCel IC, 21 x 250mm, 60% MeOH:MeCN/ CO2, 50mL/min, 100巴, MeCN/MeOH中114 mg/mL , 35 oC, 220 nm)分离非对映异构体，以得到分离的氮杂-茚满非对映异构体，异构体2G (较快洗脱) 和异构体2H (较慢洗脱)。每个异构体分别溶解于1 mL二氯甲烷，并添加1当量1 M HCl/乙醚。将溶液蒸发以得到每个非对映异构体的HCL盐。
Figure 717590DEST_PATH_IMAGE203
以对于实施例1AB至1L和2AB至2H的合成所述的方式类似的方式使用酰胺偶联试剂EDC或HATU之一从适当的胺和羧酸中间体(如上所述制备)制备以下表3中的实施例。酰胺偶联提供了两种非对映异构产物，它们是在酰胺羰基的α位的手性中心的差向异构体(即，氮杂-茚满手性中心)。通常以上述实施例中所述类似的方式分离这种非对映异构产物。用于各实施例的手性HPLC柱以及观察到的洗脱顺序表示在表3中。对于表3中的几个实施例，不分离两种非对映异构体，并且包括两种所得非对映异构体的混合物。
在表3和表4中，较快洗脱和较慢洗脱是指在从其氮杂-茚满异构体混合物分离之后观察到的单个氮杂-茚满非对映异构体的洗脱顺序。各化合物中其它立体中心的绝对立体化学基于其相应的中间体合成已知的，并且如所绘制的。
Figure 782498DEST_PATH_IMAGE204
Figure 774091DEST_PATH_IMAGE207
Figure 869786DEST_PATH_IMAGE208
Figure 309995DEST_PATH_IMAGE209
Figure 436400DEST_PATH_IMAGE211
Figure 75509DEST_PATH_IMAGE213
Figure 410937DEST_PATH_IMAGE214
Figure 361576DEST_PATH_IMAGE215
Figure 306398DEST_PATH_IMAGE216
Figure 658882DEST_PATH_IMAGE217
Figure 663747DEST_PATH_IMAGE218
Figure 101682DEST_PATH_IMAGE219
Figure 850195DEST_PATH_IMAGE220
Figure 618037DEST_PATH_IMAGE221
Figure 731487DEST_PATH_IMAGE222
Figure 719034DEST_PATH_IMAGE223
实施例 96AB 异构体混合物,  96A和96B
Figure 943342DEST_PATH_IMAGE224
6-氟-2-甲基-3-[(3R,9aR)-8-{[3-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[c]吡啶-7-基]羰基}八氢-2H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-3-基]苯甲腈:
步骤A:   (3R,9aS)-8-(3-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[c]吡啶-7-羰基)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-甲酸叔丁酯:  向DMF (4 mL)中(3R,9aS)-3-(3-氰基-4-氟-2-甲基苯基)六氢-1H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-2(6H)-甲酸叔丁酯 [I-18A](250 mg, 0.668 mmol)和3-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[c]吡啶-7-甲酸 [I-65] (201 mg, 0.868 mmol)的溶液添加HATU (381 mg, 1.00 mmol)，随后添加二异丙基乙胺 (350 μL, 2.00 mmol)。将所得溶液在rt搅拌1 h。添加乙酸乙酯 (100 mL)，并将混合物用饱和碳酸氢钠 (3x100 mL)洗涤三次，经硫酸钠干燥，浓缩，并将残留物通过用10%甲醇/二氯甲烷洗脱的制备型TLC纯化，以得到标题化合物。LC/MS: (M+1)+: 588.2。
步骤B: 6-氟-2-甲基-3-[(3R,9aR)-8-{[3-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[c]吡啶-7-基]羰基}八氢-2H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-3-基]苯甲腈
在0℃下向二氯甲烷(3 mL)中步骤A 的化合物(393 mg, 0.668 mmol)和苯甲硫醚(316 μL, 2.67 mmol) 的溶液添加三氟乙酸 (3 mL) ，并将所得溶液在rt下搅拌1 h。去除挥发性物质后，在二氯甲烷和1N氢氧化钠之间分配残留物，用二氯甲烷萃取碱性相，将合并的有机相经硫酸钠干燥，浓缩，并通过制备型TLC(用10％甲醇/二氯甲烷洗脱)纯化残留物，以得到作为两种非对映异构体的混合物的标题化合物。在Chiralpak AS-H柱上使用50％甲醇(0.2％二乙胺)/CO2分离两种异构体。较快洗脱异构体(96A)是更有效的ROMK抑制剂。96A较快洗脱异构体: 
Figure 332735DEST_PATH_IMAGE225
较慢洗脱异构体(96B)具有在铊通量和电生理学测定中大于1μM的IC50。
以对于实施例96的合成所述的方式类似的方式从适当的胺和羧酸中间体(如上所述制备)制备以下表4中的实施例。提供的数据包括手性HPLC条件(如果适用)；和MS和/或HNMR表征。
Figure 351507DEST_PATH_IMAGE226
Figure 826351DEST_PATH_IMAGE227
对各实施例中的最终产物化合物进行以下铊通量测定和/或电生理学测定。
铊通量检测
细胞培养条件- 在10%CO2增湿培养器中在37℃下在完全培养基：补充了非基本氨基酸、青霉素/链霉素/谷氨酰胺、G418和FBS的Dulbecco氏改良Eagle培养基中培养稳定表达hROMK(hKir1.1)的HEK293细胞。在>80%汇合率下，从烧瓶中抽吸培养基并用10mL无钙/镁的PBS冲洗。向T-225烧瓶中添加5mL 1X胰蛋白酶(在无Ca/Mg的PBS中制备)并将烧瓶送回37℃/CO2培养器中2-3分钟。为了取出细胞，用手轻敲烧瓶侧面。完全研制细胞，随后将细胞转移到25mL完全培养基中。在1,500 rpm下离心6分钟，随后再悬浮在完全培养基中并测定细胞浓度。对典型再接种而言，4E6细胞/T-225烧瓶在4天中达到>80%汇合率。在理想生长条件和适当的组织培养实践下，这种细胞系稳定40-45代。
FluxOR试剂盒组分(Invitrogen F10017)
· FluxOR?试剂(组分A)
· FluxOR?测定缓冲液(组分B)- 10X浓缩物
· PowerLoad?浓缩物(组分C)- 100X浓缩物
· 丙磺舒(组分D)– 使冻干样品保持在-20℃。水溶性，在1 mL水中溶解后100X。储存在4℃。  
· FluxOR?无氯缓冲液(组分E)- 5X浓缩物
· 硫酸钾(K2SO4)浓缩物(组分F)- 125 mM在水中。储存在4℃。  
· 硫酸铊(Tl2SO4)浓缩物(组分G)- 50 mM在水中。储存在4℃。  
· DMSO(二甲亚砜，组分H)– 1mL(100%)
试剂制备：FluxOR工作溶液
· 1000X FluxOR?试剂：在100μl DMSO中重构一小瓶的组分A；充分混合；将10μl 等分试样储存在-20℃
· 1X FluxOR?测定缓冲液：组分B用水稀释10倍；用Hepes/NaOH将pH调节至7.4；过滤并储存在4℃
· 丙磺舒/测定缓冲液：100mL 1X FluxOR?测定缓冲液；1mL重构组分D；储存在4℃
· 上样缓冲液(每块微板)：10μl 1000X FluxOR?试剂；100μl组分C；10mL丙磺舒/测定缓冲液
· 化合物缓冲液(每块微板)：20mL丙磺舒/测定缓冲液；0.3 mM哇巴因(在水中的10 mM哇巴因可以在室温下储存在琥珀色瓶/铝箔中)；测试化合物
· 1X FluxOR?无氯缓冲液：在水中制备1X工作溶液。可以储存在室温下
· 刺激剂缓冲液(在1X FluxOR?无氯缓冲液中以5X最终浓度制备)：7.5 mM硫酸铊和0.75 mM硫酸钾(以产生3 mM铊/0.3 mM钾的最终测定浓度)。不用时储存在4℃。如果保持无菌，这种溶液可保持数月。
测定方案- 在384孔中使用FLIPR-Tetra仪器进行ROMK通道功能铊通量测定。将HEK-hKir1.1细胞接种在多聚-D-赖氨酸微板中并在37℃-10%CO2培养器中保持过夜。在实验当天，将培养基换成FluxOR?试剂上样缓冲液并避光在环境温度(23-25℃)下培养90分钟。将上样缓冲液换成测定缓冲液 ± 测试化合物，随后在环境温度下培养30分钟，其中将铊/钾刺激剂添加到微板中。
步骤方案
1. 在384-孔PDL涂布微板中接种HEK-hKir1.1细胞(50μl，20,000个细胞/孔)
2. 在增湿37℃/10%CO2培养器中使细胞附着过夜
3. 从微板中完全除去细胞培养基并换成25μl上样缓冲液
4. 在室温下避光培养微板90分钟
5. 除去上样缓冲液并换成25μl 1x 测定缓冲液 ± 测试化合物。  
6. 在室温下避光培养微板30分钟
7. 在FLIPR-Tetra 384：将刺激剂(铊/钾)溶液添加到微板中并监测荧光。激发 = 400 nm，发射 = 460 & 580 nm。收集数据约10分钟。
数据计算- 使用含有3 μM本发明的标准对照ROMK抑制剂的孔的荧光强度来限定铊通量的ROMK敏感分量。将在测试化合物存在下的荧光相对于对照值归一化以提供%荧光变化。IC50值代表抑制50%的ROMK铊通量信号的化合物浓度。
测定标准- 通常包括对照化合物以证实该测定与之前的测量相比给出一致结果，尽管对照不是获得测试化合物的结果所必需的。对照可以是本发明的式Ia的任何化合物，优选在此测定中具有小于1 μM的IC50效力。或者，该对照可以是在此测定中具有小于1 μM的IC50效力的另一种化合物(在式Ia的范围外)。
电生理学测定
通过全细胞电压钳(Hamill等人Pfluegers Archives 391：85-100 (1981))使用IonWorks Quattro自动化电生理学平台(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)检查Kir1.1 (ROMK1)流阻断。将稳定表达Kir1.1通道的中国仓鼠卵巢细胞保存在37℃的增湿10% CO2培养器中的T-75烧瓶中的细胞培养基中。在实验之前，通过用1 mM丁酸钠培养过夜，诱导Kir1.1表达。在实验当天，细胞用2.5mL Versene(Invitrogen 15040-066)在37℃离解大约6分钟并悬浮在含有(以mM计)：150 NaCl、10 KCl、2.7 CaCl2、0.5 MgCl2,、5 HEPES，pH 7.4的10mL 浴溶液中。在离心后，将细胞粒再悬浮在大约4.0mL 浴溶液中并置于IonWorks仪器中。细胞内溶液由(以mM计)：80 K葡萄糖酸盐、40 KCl、20 KF、3.2 MgCl2, 3 EGTA, 5 Hepes，pH 7.4构成。通过在0.13mg/mL 两性霉素B中穿孔4分钟，实现到细胞质的电通路。两性霉素B(Sigma A-4888)作为在DMSO中的40mg/mL 溶液制备。使用IonWorks HT软件/硬件系统进行电压程序和电流读数。电流在1 kHz下取样。不校正液体接界电势。在化合物培养期之前和6分钟后，施加试验脉冲—其构成为从-70 mV的钳制电位以100 ms步进至0 mV、随后从-70 mV以100ms电压上升至+70 mV。通过将DMSO储液以最终浓度的3x稀释到浴溶液中，制备测试化合物，并在96-孔聚丙烯板中置于该仪器中。使用IonWorks软件测量电流振幅。为了测定化合物效力，在Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, CA)中计算电压步进至0 mV的过程中的阻断分数(fractional block)，并用Igor Pro 4.0 (WaveMetrics, Lake Oswego, OR)拟合剂量响应曲线。通常包括对照化合物以证实该测定与之前的测量相比给出一致结果，尽管对照不是获得测试化合物的结果所必需的。对照可以是本发明的式 Ia的任何化合物，优选在此测定中具有小于1 μM的IC50效力。或者，该对照可以是在此测定中具有小于1 μM的IC50效力的另一种化合物(在式 Ia的范围外)。
使用铊通量测定和电生理学测定对于本发明实施例中的化合物收集的数据显示在下表5中。所有实施例中的最终产物化合物(非对映异构体混合物和单一非对映异构体)在实施例部分中的铊通量测定和电生理学测定之一或两者中具有1 μM或更小的IC50功效，除非另有说明。
表5
Figure 854349DEST_PATH_IMAGE228
Figure 599714DEST_PATH_IMAGE229
Figure 117283DEST_PATH_IMAGE230
Figure 751526DEST_PATH_IMAGE231
自发性高血压大鼠(SHR)测定
自发性高血压大鼠(SHR)表现出年龄依赖性高血压，其不需要施用外源性试剂来提高血压，也不需要使用高盐饮食来提高血压。因此其类似人原发性高血压并提供在其降低血压的能力方面评估新型制剂的剂量依赖性的可能性。
用于评测本发明的化合物在自发性高血压大鼠(SHR)中的降血压功效的实验方案：
自发性高血压大鼠(SHR，雄性，6个月，Charles River)在异氟烷或氯胺酮/美托咪啶(metomidine)麻醉下植入DSI TA11PA-C40遥测装置(Data Sciences, Inc., St. Paul, MN)。将该遥测装置导管经由股动脉插入降主动脉中并在左腰部皮下植入遥测装置。在开始任何研究之前，使动物术后恢复14天。每10分钟连续30秒记录来自有意识的自由活动大鼠的血压、心率和活动力信号。以在SHR中产生大致最大功效的剂量包括HCTZ(25 mg/kg/天, PO)作为参考利尿剂。在每天单次经口管饲3至14天的典型持续时间后评测与媒介物对照相比本发明的化合物的降血压效力。作为每小时平均数收集数据，并通过基于每小时计减去媒介物对照基线数据来计算血压变化。实施例编号1A、1G、2A、2H、17A、21、34、35、40、96A、97在3 mg/kg或10 mg/kg的PO, QD剂量下被评测，并且产生了每日(24小时)平均收缩血压从7 mmHg到该研究最后一天21 mmHg的典型降低。
所述自发性高血压大鼠测定是众所周知的，并且在本领域中经常用作模拟人高血压的实验模型(参见，例如，Lerman, L.O.,等人, J Lab Clin Med, 2005;146:160–173)。
尽管已参照其某些具体实施方案描述本发明，但本领域技术人员从本文描述的教导中可得到许多替代实施方案。权利要求的范围不应限于实施例中所述的优选实施方案，而是应给出与说明书一致的作为整体的最广泛解释。没有具体的立体构型名称或在并非所有手性中心上带有这种名称的权利要求中的具体化合物(即物类)的列举或描绘旨在包括该化合物的外消旋物、外消旋混合物、各独立对映异构体、非对映异构混合物和各独立的非对映异构体(其中由于存在一个或多个不对称中心，此类形式是可能的)。本文引用的所有专利、专利申请和公开文献全文并入本文作为参考。

Claims (16)

1.具有结构式Ia的化合物及其药学可接受的盐：
Figure 250363DEST_PATH_IMAGE001
其中：
Z 是
Figure 722496DEST_PATH_IMAGE002
R 1  是
Figure 502233DEST_PATH_IMAGE003
其中***表示连接至式Ia中的羰基碳 且**表示连接至式Ia中的四唑基环；
X 是 O、NH 或S；
m是选自1或2的整数；
n是选自1或2的整数；
X 1 、X 2  和X 3 各自独立地选自C(R7) 或N，条件是X1、X2 和X3中的至少一个必须是N且X1、X2 和X3中的至多两个是N；
R a  是 –CN；
R b  是 –H 或-C1-6烷基；
R 2  是 –H、–F、-Cl、-C1-6烷基、-C3-6环烷基或-OC1-6烷基；
R 3  是 –H、-F、-Cl、-CN、-C1-6烷基、-C3-6环烷基或–OC1-6烷基；
R 4 是 -F、-Cl、-CN、-C1-6烷基、-C3-6环烷基、–OC1-4烷基或N-四唑基；
或者R 3 和R 4 与它们所连接的苯环中的碳原子连接在一起形成：
Figure 959759DEST_PATH_IMAGE004
 其中 R 是 –H 或–C1-4烷基；
R 5  是 –H、-Cl、-F、-CN、-C1-4烷基、-C3-6环烷基或-OC1-4烷基；
条件是当R 3 和R 4  不连接在一起时，则R 3 、R 4 或R 5 中的一个且仅仅一个是–CN；
R 6  是 –H 或-C1-4烷基；且
R 7  是 –H、-F、-Cl 或-C1-4烷基。
2.权利要求1的化合物及其药学可接受的盐，该化合物具有结构式I：
Figure 774131DEST_PATH_IMAGE005
其中：
X 是 O、NH 或S；
R 1  是
Figure 658911DEST_PATH_IMAGE006
其中***表示连接至式I中的羰基碳且**表示连接至式I中的四唑基环；
m是选自1或2的整数；
n是选自1或2的整数；
X 1 、X 2  和X 3 各自独立地选自C(R7) 或N，条件是X1、X2 和X3中的至少一个必须是N且X1、X2 和X3中的至多两个是N；
R 2  是 –H、–F、-Cl、-C1-6烷基、-C3-6环烷基或-OC1-6烷基；
R 3 是 –H、-F、-Cl、-CN、-C1-6烷基、-C3-6环烷基或–OC1-6烷基；
R 4 是 -F、-Cl、-CN、-C1-6烷基、-C3-6环烷基、–OC1-4烷基或N-四唑基；
或者R 3 和R 4 与它们所连接的苯环中的碳原子连接在一起形成：
Figure 988261DEST_PATH_IMAGE007
 其中 R 是 –H 或–C1-4烷基；
R 5  是 –H、-Cl、-F、-CN、-C1-4烷基、-C3-6环烷基或-OC1-4烷基；
条件是当R 3 和R 4  不连接在一起时，则R 3 、R 4 或R 5 中的一个且仅仅一个是–CN；
R 6  是 –H 或-C1-4烷基；且
R 7  是 –H、-F、-Cl 或-C1-4烷基。
3.权利要求1的化合物或其药学可接受的盐，其中X 是 O。
4.权利要求3的化合物或其药学可接受的盐，其中m是 1且R6 是–H。
5.权利要求1的化合物或其药学可接受的盐，其中R 1  是 ：
Figure 187161DEST_PATH_IMAGE008
。
6.权利要求1的化合物或其药学可接受的盐，其中R 2  是 –H 或-F；R 3 是 –H、-F、-CN 或-OCH3；R 4 是 -F、-CN 或-OCH3；且 R 5  是 –H、-Cl、-F、-CN、-CH3、-CH2CH3、环丙基或-OCH3；条件是R 3 、R 4 或R 5 中的一个且仅仅一个是 –CN。
7.权利要求1的化合物或其药学可接受的盐，其中R 3 和R 4 与它们所连接的苯环中的碳原子连接在一起形成：
Figure 419821DEST_PATH_IMAGE009
 且R 是 –H 或-CH3。
8.权利要求1的化合物或其药学可接受的盐，其中：
X 是 O, NH 或S；
R 1  是
Figure 209923DEST_PATH_IMAGE010
其中，***表示连接至式I中的羰基碳 且**表示连接至式I中的四唑基环；
m是选自1或2的整数；
n是选自1或2的整数；
X 1 、X 2  和X 3 各自独立地选自CH或N，条件是X1、X2 和X3中的至少一个必须是N且X1、X2 和X3中的至多两个是N；
R a  是 –CN；
R b  是 –H 或-C1-3烷基；
R 2  是 –H 或–F；
R 3  是 –H、-F、-CN 或-OCH3；
R 4 是 -F、-CN 或-OCH3；
或者R 3 和R 4 与它们所连接的苯环中的碳原子连接在一起形成：
Figure 292148DEST_PATH_IMAGE011
 其中 R 是 –H 或-CH3；
R 5  是 –H、-Cl、-F、-CN、-CH3、-CH2CH3、环丙基或-OCH3；
条件是当R 3 和R 4  不连接在一起时，则R 3 、R 4 或R 5 中的一个且仅仅一个是–CN；且进一步条件是当R 3 和R 4  连接在一起时，则R 5 是-H、-Cl、-F、 -CH3 或-CH2CH3；
R 6  是 –H 或-C1-4烷基；且
R 7  是 –H、-F、-Cl 或-C1-4烷基。
9.权利要求1的化合物及其药学可接受的盐，该化合物具有结构式II：
Figure 29160DEST_PATH_IMAGE012
其中：
X 是 O 或NH；
R 1  是:
Figure 614862DEST_PATH_IMAGE013
R 3 是 –F, R 4 是 -CN 且 R 5  是 -CH3；或
R 3 和R 4 与它们所连接的苯环中的碳原子连接在一起形成：
Figure 605559DEST_PATH_IMAGE014
 其中 R 是 –H 或-CH3, 且 R 5  是 –H。
10.权利要求1的化合物及其药学可接受的盐，该化合物具有结构式III：
Figure 847184DEST_PATH_IMAGE015
。
11.权利要求1的化合物或其药学可接受的盐，该化合物是：
6-氟-2-甲基-3-[(3R,9aS)-8-{[2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-基]羰基}八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈；
6-氟-2-甲基-3-[(3S,9aR)-8-{[2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-基]羰基}八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈；
6-氟-2-甲基-3-[(3S,9aS)-8-{[3-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[c]吡啶-7-基]羰基}八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈；
6-氟-2-甲基-3-[(3S,9aR)-8-{[3-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[c]吡啶-7-基]羰基}八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈；
6-[(3R,9aS)-8-{[2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-基]羰基}八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮；
(3R)-3-甲基-6-[(3R,9aS)-8-{[2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-基]羰基}八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮；
(3S)-3-甲基-6-[(3R,9aS)-8-{[2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-基]羰基}八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮；
6-氟-2-甲基-3-[(3S,9aR)-8-{[(5S)-2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-5-基]羰基}八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈；
6-氟-2-甲基-3-[(3R,9aR)-8-{[3-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[c]吡啶-7-基]羰基}八氢-2H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-3-基]苯甲腈；
6-氟-2-甲基-3-[(3S,9aR)-8-{[3-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[c]吡啶-7-基]羰基}八氢-2H-吡嗪并[1,2-a]吡嗪-3-基]苯甲腈；
6-氟-2-甲基-3-[(3S,9aS)-8-{[2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[d]嘧啶-5-基]羰基}八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]苯甲腈；
(3S)-3-甲基-6-[(3R,9aR)-8-{[2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-基]羰基}八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮；
或者 (3S)-3-甲基-6-[(3S,9aR)-8-{[2-(1H-四唑-1-基)-6,7-二氢-5H-环戊二烯并[b]吡啶-5-基]羰基}八氢吡嗪并[2,1-c][1,4]噁嗪-3-基]-3,4-二氢-1H-异苯并吡喃-1-酮。
12.包含权利要求1的化合物和药学可接受的载体的药物组合物。
13.权利要求12的药物组合物，其进一步包含选自以下的其它活性剂或其药学可接受的盐：洛沙坦、缬沙坦、坎地沙坦、奥美沙坦、替米沙坦、依普罗沙坦、厄贝沙坦、氨氯地平、阿拉普利、贝那普利、卡托普利、西罗普利、西拉普利、地拉普利、依那普利、依那普利拉、福辛普利、咪达普利、赖诺普利、莫维普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、螺普利、替莫普利、或群多普利、阿米洛利、安体舒通、依普利酮或氨苯蝶啶。
14.抑制ROMK的方法，包括以ROMK抑制有效量将权利要求1的化合物施用于需要其的患者。
15.引起利尿、尿钠排泄或这两者的方法，包括以治疗有效量将权利要求1的化合物施用于需要其的患者。
16.一种或多种选自如下病症的治疗或预防方法：高血压、急性心脏衰竭、慢性心脏衰竭、肺动脉高血压、心血管病、糖尿病、内皮功能障碍、舒张期功能障碍、稳定型和不稳定型心绞痛、血栓形成、再狭窄、心肌梗死、中风、心功能不全、肺张力过强、动脉粥样硬化、肝硬化、腹水、子痫前期、脑水肿、肾病、肾病综合症、急性肾功能不全、慢性肾病、高钙血症、Dent病、美尼尔氏病或水肿状态，该方法包括适当时以治疗或预防有效量将权利要求1的化合物施用于需要其的患者。
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