KR20140048107A - 다중 항원 글리코펩티드 탄수화물 접합체를 제조하는 방법 - Google Patents

다중 항원 글리코펩티드 탄수화물 접합체를 제조하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 화학식 (I)의 탄수화물 T 세포 에피톱 접합체를 제조하기 위한 방법에 관한 것으로:
M(T-B)n (I)
상기 화학식에서, M, T, B 및 n은 제1항에 정의된 바와 같다.

Description

다중 항원 글리코펩티드 탄수화물 접합체를 제조하는 방법{METHOD FOR PREPARING MULTIPLE ANTIGEN GLYCOPEPTIDE CARBOHYDRATE CONJUGATES}
본 발명은 화학식 (I)의 탄수화물 T 세포 에피톱(epitope) 접합체를 제조하는 방법, 및 상기 방법에 따라 유용한 화학식 (II)의 탄수화물 T 세포 항원결정부 중간체에 관한 것이다.
지난 10년 동안, 종양-관련 Tn 항원을 제시하는, 새로운 종류의 합성 면역원인 MAG-Tn3이 개발되어 왔다. MAG-Tn3은 탄수화물 Tn 항원(트리-Tn 클러스터로서)을 4가의 백본(tetravalent backbone) 상의 펩티드 CD4+ T 세포 에피톱에 결합시킨, 완전한 합성 글리코펩티드(MW = 10'897Da)이다 [5, 9].
MAG-Tn3은 하기의 구조 [S(α-D-GalNAc)-T(α-D-GalNAc)-T(α-D-GalNAc)-QY5IKANS10KFIGI15TEL]4-K2-K-β-Ala와 일치한다:
Figure pct00001
MAG는 다중 항원 글리코펩티드(Multiple Antigen Glycopeptide)를 의미한다.
따라서, MAG-Tn3은 하기의 화학식과 일치하는 탄수화물 펩티드 접합체 B4-T4-M로서:
Figure pct00002
상기 화학식에서,
- KKK는 덴드리머 폴리라이신 중심부(dendritic polyLysine core)(M)이고,
- T는 QYIKANSKFIGITEL의 서열을 가지는 펩티드 CD4+ T 세포 에피톱이며,
- Tn3은 (α-GalNAc)Ser-(α-GalNAc)Thr-(α-GalNAc)Thr의 서열을 가지는 트리-Tn B 세포 에피톱이다.
마우스 및 영장류에서 얻어진 성공적인 생체내(in vivo) 결과에 기초하여[8, 9], MAG-Tn3은 I/II 상 임상 시험에 진입해야 하는 암종을 치료하는 우수한 치료 백신 후보이다.
WO9843677 - Multiple antigen glycopeptide carbohydrate, vaccine comprising the same and use thereof
Kaiser, E., R.L. Colescott, C.D. Bossinger, and P.I. Cook, Anal Biochem (1970). 34: 595-8. Maemura, M., A. Ohgaki, Y. Nakahara, H. Hojo, and Y. Nakahara, Bioscience Biotechnology and Biochemistry (2005). 69: 1575-1583. Tam, J.P., W.F. Heath, and R.B. Merrifield, J Am Chem Soc (1986). 108: 5242-5251. Tanaka, E., Y. Nakahara, Y. Kuroda, Y. Takano, N. Kojima, H. Hojo, and Y. Nakahara, Bioscience Biotechnology and Biochemistry (2006). 70: 2515-2522. Bay, S., R. Lo-Man, E. Osinaga, H. Nakada, C. Leclerc, and D. Cantacuzene, J. Peptide Res. (1997). 49: 620-625 ; Fmoc solid phase peptide synthesis, A practical approach, Edited by W.C. Chan and P. D. White, Oxford University Press. Sander, J. and H. Waldmann, Chem Eur J (2000). 6: 1564-1577. Lo-Man, R., S. Vichier-Guerre, S. Bay, E. Deriaud, D. Cantacuzene, and C. Leclerc, J. Immunol. (2001). 166: 2849-2854. Lo-Man, R., S. Vichier-Guerre, R. Perraut, E. Deriaud, V. Huteau, L. BenMohamed, O.M. Diop, P.O. Livingston, S. Bay, and C. Leclerc, Cancer Res (2004). 64: 4987-4994 Babino, A., D. Tello, A. Rojas, S. Bay, E. Osinaga, and P.M. Alzari, FEBS Lett. (2003). 536: 106-110.
펩티드 탄수화물 접합체, 예컨대 특히 MAG-Tn3을 제조하기 위한 합성 경로는 국제 특허 출원 WO 98/43677호 및 미국 특허 번호 제 6,676,946호에 개시되어있다. 소규모(small-scale)(1-10㎎의 최종 화합물)로 시행되는, 이러한 공정에서, 탄수화물 Tn3 항원은 덴드리머 펩티드 M(T)4 구성 블록(building block)에 포함된다. Tn3 항원의 포함은, 최종 탈보호(deprotection) 단계를 회피하기에 유리한 것으로 보일 수 있는 완전히 보호되지 않은 당질에 의하여 달성된다는 것이 주목될 필요가 있다.
그러나, 발명자들은 이러한 방법이 규모 확대(scale-up)되는 경우 실패함을 보였다. 사실, Tn 잔기의 초과-포함(extra-incorporation)은 제어하기 어려우며 미정제 순도(crude purity) 및 전체 수율에 영향을 준다. 나아가, 그런 고분자량의 글리코펩티드의 정제는 복잡하다.
따라서, 종래 기술의 문제점을 극복하는, 특히 보다 나은 수율 및 순도를 얻는 것을 가능하게 하는, 특히 보다 확대된 규모로 반복할 수 있는 방식으로 MAG-Tn3을 제조하는 개선된 방법의 필요가 존재한다.
따라서, 일 측면에서, 본 발명은 보다 나은 수율 및 순도로, 대규모 생산을 가능하게 하는, MAG-Tn3, 및 보다 일반적으로는 하기 화학식 (I) (M(T-B)n)의 탄수화물 T 세포 에피톱 접합체를 제조하기 위한 신규한 공정을 제공한다:
nBPr + M(T)n
Figure pct00003
M(T-BPr)n, (II)
Figure pct00004
M(T-B)n, (I)
본 발명에 따른 방법은 유리하게 부산물 합성을 최소화하게끔 하여, 공정의 견고성(robustness)을 개선하고, 반복할 수 있는 방식으로 합성을 규모 확대시키는 것을 가능하게 한다.
보다 구체적으로는, B 세포 에피톱을 M(T)n 구성 블록에 포함시키기 전에 적절한 보호기(Pr)로 탄수화물 B 세포 에피톱의 히드록실기를 보호하는 것이, B 세포 에피톱 포함의 보다 나은 제어를 가능하게 하여, 따라서 특히 대규모에서, 수율 및 순도 모두를 개선시킴이 발견되었다.
본 발명의 다른 목적은 높은 수율 및 순도로 화학식 M(T-B)n의 탄수화물 T 세포 에피톱 접합체의 제조에 유용한 화합물인, 화학식 (II) (M(T-BPr)n)의 신규한 탄수화물 T 세포 에피톱 접합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적인 목적은 본 발명에 따른 공정에 의해 수득가능한, 95%보다 우수한 순도 등급을 가지는 화학식 (I) (M(T-B)n)의 탄수화물 T 세포 에피톱 접합체를 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 방법의 상기 및 기타의 목표, 특징 및 이점이 하기의 특허 공개의 상세한 설명에서 개시될 것이다.
따라서, 일 측면에서, 본 발명은 화학식 (I)의 탄수화물 T 세포 에피톱 접합체를 제조하는 방법에 관한 것으로서:
M(T-B)n (I)
상기 화학식에서,
M은 덴드리머 폴리라이신 중심부이고;
T는 펩티드를 포함하는 T 세포 에피톱이며;
B는 하나 이상의 탄수화물 잔기 (b)를 포함하는 탄수화물 B 세포 에피톱이고;
n은 M에 공유결합한 -T-B 기의 수를 나타내는 정수이며;
상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
i) 탄수화물 잔기(b)의 히드록실기가 보호기(Pr)로 보호된 것인, 보호된 탄수화물 B 세포 에피톱(BPr)을 화합물 M(T)n과 결합시켜 탄수화물 T 세포 에피톱 접합체 M(T- BPr)n를 형성하는 단계로서,
상기 보호기(Pr)가 알릴, p-메톡시벤질(PMB), t-부틸디메틸실릴(TBDMS), 벤질옥시메틸(BOM), 레불리닐(levulinyl, Lev), 벤조일(Bz), 2,5-디플루오로벤조일, 클로로아세틸, 벤질(Bn) 또는 아세틸(Ac)로 이루어진 군으로부터 선택되거나, C5-C6 아이소프로필리덴 케탈(isopropylidene ketal) 또는 C5-C6 사이클릭 알킬카보네이트에 부착된 두 히드록실기로 형성되는 단계
및
ii) 수득된 접합체 M(T-BPr)n으로부터 보호기 Pr을 제거하여 탄수화물 T 세포 에피톱 접합체 M(T-B)n을 수득하는 단계.
덴드리머 폴리라이신 중심부 (M)
화학식 (I)의 접합체의 폴리라이신 중심부는 서로 동일하거나 다를 수 있는, 복수의 가지(-T-B)를 가지는, 별 모양으로 표현될 수 있는 덴드리머 구조이다.
이러한 가지는, 특히 펩티드 결합 -NH-C(=O)-에 의해 덴드리머 중심부의 각각의 라이신 잔기의 NH2 말단에 공유결합된다.
덴드리머 폴리라이신 중심부 (M)의 원자가 m, 즉 각각의 라이신 잔기의 NH2 말단의 수는 m ≥ n이고, 바람직하게는 m = n이 되며, n은 M에 공유결합한 (-T-B) 가지의 수를 지정한다.
다른 측면에서, (-T-B) 가지의 수 n은 4 내지 16, 특히 4 내지 8에 이른다.
추가적인 측면에서, 덴드리머 폴리라이신 중심부 M은 3 개 이상의 라이신 잔기, 특히 3 내지 15 개의 라이신 잔기, 더욱 특히 3 내지 7 개의 라이신 잔기를 포함한다.
추가적인 측면에서, M(T-B)n 접합체는 하기의 화학식 (Ia) 또는 (Ib)로부터 선택되며:
Figure pct00005
상기 화학식에서,
K는 라이신 잔기이고,
T 및 B는 상기에 정의된 바와 같다.
유리하게는, 덴드리머 구조 (Ia) 및 (Ib)는 덴드리머 폴리라이신 중심부 M의 표면에 고밀도의 항원을 제공한다.
추가적인 측면에서, M은 하기의 화학식의 (K)2K-βAla-OH이다:
Figure pct00006
(T-B) 가지
화학식 (I)의 접합체 상의 탄수화물 B 세포 에피톱 및 T 세포 에피톱 모두의 존재는 화학식 (I)의 접합체를 효율적인 면역원으로 만든다.
T 세포 에피톱
본원에 사용된 바와 같이, T 세포 에피톱은 항원, 특히 T 세포 반응을 유도할 수 있는 펩티드 특성을 의미한다.
이러한 에피톱은 특히 문헌[S. Stevanovic, "Identification of Tumour-associated T-cell epitopes for vaccine development", Nature Reviews, Vol. 2, July 2002, p. 1 내지 7]; 문헌 [J.H. Kessler, C.J.M. Melief, "Identification of T-cell epitopes for cancer immunotherapy", Leukemia (2007) 21, 1859-1874], 또는 암 면역력 / 펩티드 데이터베이스(Cancer immunity / peptide database) 웹사이트 [http://www.cancerimmunity.org/peptide database/tumorspecific.htm]에 기술되어 있다.
화학식 (I)의 접합체에 포함된 T 세포 에피톱은 동일 또는 상이할 수 있으며, 펩티드 또는 펩티드가 아닐 수 있다.
특정 측면에서, 탄수화물 T 세포 에피톱 접합체는 탄수화물 펩티드 접합체이다. 펩티드 T 세포 에피톱은 2 내지 50 개의 아미노산을 포함할 수 있다.
T 세포 에피톱은 특히 CD8+, 또는 CD4+ T 세포 에피톱 중에서 선택될 수 있다.
종양 표지자로 인식되는 CD8+ T 세포 에피톱은, 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있거나:
- MUC-1 펩티드 (췌장, 유방)
- MAGE 1 및 3 (흑색종, 폐) (T. Boon et al. (1995), Immunology Today, vol. 16 n°7, pp 334-336)
- pme117/gp 100 (흑색종)
- 티로시나아제(Tyrosinase) (흑색종) BAGE (흑색종)
- GAGE (흑색종) LB-33-B (흑색종)
- CDK4
- p185HER (유방, 난소)
- CEA MART1/Melan-A (흑색종)
- 또는 A. Van Pel et al. (1995) Immunological. Reviews n°145, pp 229-250 또는 P. G. Coulie (1995), Stem Cells, 13, pp 393-403에 기술된 종양 항원으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 측면에서, T는 특히 폴리오바이러스(PV) 단백질 단편, 파상풍 독소 단편 또는 PADRE 펩티드일 수 있는, CD4+ T 세포 에피톱이거나 이를 포함할 수 있다.
폴리오바이러스(PV) 단백질 단편 중에서 선택된 CD4+ T 세포 에피톱의 예시로서, 폴리오바이러스 타입 1으로부터의 VP1 단백질의 103-115 서열에 일치하는 합성 펩티드(KLFAVWKITYKDT) (SEQ ID N°4)가 언급될 수 있다.
파상풍 독소 단편 중에서 선택된 CD4+ T 세포 에피톱의 예시로서, 하기의 단편이 언급될 수 있다:
- 파상풍 독소의 830-844 서열(QYIKANSKFIGITEL) (SEQ ID N°1)
- 파상풍 독소의 947-967 서열(FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE) (SEQ ID N°2)
- 파상풍 독소의 1273-1284 서열(GQIGNDPNRDIL) (SEQ ID N°3).
이러한 펩티드 T 세포 에피톱은 일반적으로 복수의 클래스 II 인간 및 쥐과 MHC(주조직적합성 복합체, Major Histocompatibility Complex) 분자에 결합하여 그 결과 개인 간에 존재하는 MHC 분자의 다형성과 관련된, CD4+ T 세포 반응이 접하게 되는 제약 문제(restriction problem)를 회피한다. 더욱이 파상풍 독소 펩티드의 사용은, 파상풍 변독소(toxoid)를 이용한 많은 개인의 백신 접종(vaccination)의 결과로서, 본 발명의 접합체에 존재하는 항원의 면역원성을 증가시킬 것이다.
펩티드 T 세포 에피톱의 추가적인 예시로서, 문헌[S. Stevanovic, "Identification of Tumour-associated T-cell epitopes for vaccine development", Nature Reviews, Vol. 2, July 2002, p. 1 내지 7 ; J.H. Kessler, C.J.M. Melief, "Identification of T-cell epitopes for cancer immunotherapy", Leukemia (2007) 21, 1859-1874], 또는 암 면역력 / 펩티드 데이터베이스 웹사이트: http://www.cancerimmunity.org/peptide database/tumorspecific.htm가 참조될 수 있다.
비펩티드 T 세포 에피톱의 예시는 특히 하기를 포함할 수 있다:
- 문헌[C. C. A. M. Peeters (1991), The Journal of Immunology, 146, 4309-4314]에 기술된 폐렴구균성(pneumococcal) 타입 4 다당류의 단편, 및 올리고당류 파상풍 변독소 접합체,
- 문헌[A. F. M. Verheul (1991), Detection and Immunity, vol. 59, n°10, pp. 3566-3573]에 기술된 수막구균성(meningococcal) 지질당류(liposaccharides).
B 세포 에피톱
본원에 사용된 바와 같이, B 세포 에피톱은 B 세포 반응을 유발할 수 있는 항원을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 탄수화물은 당류, 특히 단당류, 이당류, 올리고당류, 및 다당류를 의미한다.
바람직한 측면에서, 화학식 (I)의 접합체의 B 세포 에피톱을 형성하는 탄수화물 잔기 (b)는 N-아세틸갈락토피라노실(N-acetylgalactopyranosyl) 잔기, 또는 이의 유도체이다.
특정 측면에서, 탄수화물 잔기 (b)는 아미노산, 펩티드, 또는 지질 잔기에 부착되어 있다. 보다 추가적인 측면에서, 탄수화물 잔기는 O-글리코실 아미노산 또는 펩티드이다. 추가적인 측면에서, B 세포 에피톱은 덴드리머 구조 M(T)n에 상기 아미노산 또는 펩티드를 통하여 부착되어 있다.
B 세포 에피톱은 하나 이상의 탄수화물 잔기 (b), 특히 1 내지 10 개, 특히 1 내지 6 개의 탄수화물 잔기를 포함할 수 있다.
이러한 B 세포 에피톱은 종양(암) 글리코시드 항원(glycosidic antigen), 특히 하기로부터 선택될 수 있다:
- 예를 들어, 강글리오사이드(ganglioside) GD2, GD3 및 GM3(흑색종)과 같은 산성 당지질(glycolipid) 및 예를 들어, 루이시(Lewisy, Ley)(유방, 전립선, 난소) 및 글로보 H(Globo H)(유방, 전립선, 난소) 항원과 같은 중성 당지질을 포함하는, 당지질 클래스;
- 예를 들어, 암종에 흔히 존재하나 보통 정상 조직에는 없는 두 종양 마커인 Tn 항원(α-GalNAc-Ser 또는 α-GalNAc-Thr), TF 항원(β-Gal-(1-3)-α-GalNAc-Ser 또는 β-Gal-(1-3)-α-GalNAc-Thr)[Springer G. F. Science 224,1198-1206 (1984)] (난소, 유방, 폐), 또는 디(di)-Tn (α-GalNAc-Ser/Thr)2, 트리-Tn (α- GalNAc-Ser/Thr)3 또는 헥사-Tn (α-GalNAc-Ser/Thr)6과 같은 O-글리코실 펩티드 (또는 아미노산) 클래스.
본 발명에 따른 접합체의 B 세포 에피톱은 또한 예를 들어, 임질균(Neisseria meningitis), 인플루엔자균(Haemophilus influenzae), 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae) 및 연쇄상구균 군(Streptococcus group)의 협막 세균 다당류(capsular bacterial polysaccharide)으로부터 기원할 수 있다.
다당류는 합성 공정으로부터 수득된 탄수화물 잔기이다.
본 접합체의 B 세포 에피톱은 또한 예를 들어, 효모 사카로미세스(Saccharomyces)로부터 분리된 것과 같이 진균 기원일 수 있다.
바람직한 측면에서, 화학식 (I)의 접합체의 B 세포 에피톱은 바람직하게는, 예를 들어, Tn 및 TF 항원과 같은 종양 마커이다.
상기 종양 마커는 Tn, 디-Tn, 트리-Tn (Tn3), 헥사-Tn (Tn6), 또는 TF 항원을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
추가적인 측면에서 B는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된 탄수화물 잔기이거나 이를 포함한다:
- α-GalNAc,
- α-GalNAc-Ser,
- α-GalNAc-Thr,
- β-GalNAc,
- β-GalNAc-Ser,
- β-GalNAc-Thr,
- β-Gal-(1-3)-α-GalNAc-Ser,
- β-Gal-(1-3)-α-GalNAc-Thr,
- (α-GalNAc-Ser/Thr)2,
- (α-GalNAc-Ser/Thr)3, 및
- (α-GalNAc-Ser/Thr)6,
바람직한 측면에서, B는 (α-GalNAc-Ser/Thr)3, 가장 바람직하게는 (α-GalNAc)Ser-(α-GalNAc)Thr-(α-GalNAc)Thr 잔기이거나 이를 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서, 화학식 (I)의 접합체는 MAG-Tn3이다.
i) 단계
본 발명에 따른 방법은, i) 탄수화물 잔기 (b)의 히드록실기가 보호기(Pr)로 보호된 것인 보호된 탄수화물 B 세포 에피톱(BPr)을 화합물 M(T)n과 결합시켜 탄수화물 T 세포 에피톱 접합체 M(T- BPr)n를 형성시키는 단계로서,
상기 보호기(Pr)는 알릴, p-메톡시벤질(PMB), t-부틸디메틸실릴(TBDMS), 벤질옥시메틸(BOM), 레불리닐(Lev), 벤조일(Bz), 2,5-디플루오로벤조일, 클로로아세틸, 벤질(Bn) 또는 아세틸(Ac)로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
C5-C6 아이소프로필리덴 케탈 또는 C5-C6 사이클릭 알킬카보네이트에 부착된 두 히드록실기로 형성되는 것인 단계를 포함한다.
바람직한 측면에서, Pr은 벤질(Bn) 또는 아세틸(Ac)이다.
바람직한 측면에서, i) 단계는 하기의 단계를 포함한다:
a) 특히 벤질(Bn) 또는 아세틸(Ac)로부터 선택된 보호기(Pr)로 히드록실기가 보호된 것인 제1 보호된 탄수화물 잔기(bPr)를 화합물 M(T)n과 결합시켜 탄수화물 T 세포 에피톱 접합체 M(T-bPr)n를 형성시키는 단계; 및 선택적으로
b) 화학식 (II) M(T-BPr)n의 보호된 탄수화물 접합체를 수득할 때까지 추가적인 보호된 탄수화물 잔기 (bPr)로 a) 단계를 반복하는 단계.
유리하게는, 이러한 보호기 Pr이 i) 단계에서 M(T)n과 함께 각각의 탄수화물 잔기 b, 또는 B 세포 에피톱 B의 결합 제어를 가능하게 함이 입증되었다. 추가적으로, 이러한 보호기의 제거가 바람직한 산물을, 수율 및 순도 간에 개선된 절충으로 수득할 수 있게 함이 나타났다.
탄수화물 잔기의 히드록실기는 상기 언급된 보호기(Pr), 특히 벤질 또는 아세틸기로, 종래의 방법에 따라 보호될 수 있다.
보호된 B 세포 에피톱 BPr 또는 탄수화물 잔기(bPr)는 상업적으로 이용가능하거나 상업적으로 이용가능한 출발물질로부터 및/또는 종래의 방법에 따라 제조될 수 있다.
바람직한 측면에서, 덴드리머 폴리라이신 중심부 M 및 그에 따른 차후의 M(T)n 구성 블록은 고체 지지체에 고정됨에 따라, 반복적 고체상 펩티드 합성을 가능하게 한다.
고체 지지체의 예시로서, 이후 Fmoc-β-Ala- 기로 접합되는 것인 p-벤질옥시벤질 알콜(왕 합성수지(Wang resin))로 기능화된 폴리스티렌 수지 또는 Fmoc-β-Ala-TentaGel R Trt의 상표명 하에 판매되는 것들이 언급될 수 있다. M 중심부는 특히 β-Ala-OH 잔기를 통해 부착될 수 있다. 수지 치환 비율, 즉 Fmoc-β-Ala- 기에 의한 수지의 접합 비율은 0.2 내지 0.05 mmol/g, 바람직하게는 0.10 내지 0.13 mmol/g에 이를 수 있다.
특정 측면에서, bPr은 보호된 O-글리코실 아미노산 또는 펩티드이다. 보호된 O-글리코실 펩티드는 M(T)n 구성 블록에 보호된 구조성 O-글리코실 아미노산 잔기 bPr를 연속적으로 도입하여 결합될 수 있다.
이와 관련하여, 고체상 펩티드 및 글리코펩티드 합성은 표준 Fmoc 화학 물질 프로토콜(chemistry protocol) [5] 및 [6]을 사용하여 수행될 수 있다. N-α-Fmoc 아미노산 및 글리코실화된 아미노산 또는 펩티드는 펩티드 사슬에 단계적으로 포함된다.
따라서, i) 단계는 제1 보호된 N-α-Fmoc O-글리코실 아미노산 bPr을 M(T)n 구성 블록과 함께 반응시켜 수행될 수 있다. 보다 구체적으로는, 제1 O-글리코실 아미노산 bPr의 카르복시기(COOH)가 각각의 T 가지의 NH2 말단과 반응하여, 펩티드 공유결합 (-C(=O)NH-)을 형성한다.
Fmoc는 예를 들어, DMF 또는 NMP 내의 20%의 피페리딘의 존재 하에서 절단된다. 이후 제2 보호된 N-α-Fmoc O-글리코실 아미노산 bPr이 제1 보호된 아미노산 잔기의 NH2기 등과 유사하게 반응할 수 있다.
따라서, B 세포 에피톱이 다수의 탄수화물 잔기 (b)를 포함하면, 본 발명에 따른 방법의 i) 단계가 a) 단계에 따른 결합을 탄수화물 T 세포 에피톱 접합체 M(T-BPr)n를 수득할 때까지 반복하는 단계를 포함할 수 있다.
이들 펩티드 결합은 극성 비양성자성 용매(polar aprotic solvent), 예컨대 DMF 또는 NMP에서 결합 시약 예컨대 HATU 및 DIPEA 또는 DIC/HOBt, 및 PyBOP의 존재 하에서 수행될 수 있다.
ii) 단계
특정 측면에서, Pr은 벤질이다. 이러한 경우, 탈보호 단계 ii)는 TfOH의 존재 하에서 또는 촉매 수소화(catalytic hydrogenation)에 의하여 수행될 수 있다.
특정 측면에서, ii) 단계는 촉매 수소화이다.
바람직한 측면에서, 촉매 수소화는 촉매로서, Pd/C, 특히 10%의 Pd/C (% w/w)의 존재 하에서 수행된다. 화학식 (II)의 접합체/촉매의 중량 비율은 10/2 내지 10/10로 다양할 수 있으며, 바람직하게는 약 10/8이다. 촉매는 장기간에 걸쳐 소량씩 첨가될 수 있다.
촉매 수소화는 바람직하게는 용매로서 NMP/H2O에서, 특히 87.5/12.5의 부피 비율로 수행된다.
촉매 수소화 반응은 바람직하게는 20 내지 40℃에 이르는 온도, 특히 약 37℃에서 수행된다.
촉매 수소화 반응은 바람직하게는 1 내지 10 바(bar)에 이르는 압력, 보다 바람직하게는 약 5바 하에서 수행된다.
다른 측면에서, ii) 단계는 TfOH의 존재 하에서 수행된다.
바람직하게는, 화학식(II)의 접합체는 TFA, DMS 및 m-크레졸의 존재 하에서 TfOH와 반응한다. TfOH/TFA/DMF/m-크레졸의 상대적 비율은 1/5/3/1 v/v/v/v일 수 있다.
다른 측면에서, 보호기 Pr은 아세틸이다.
ii) 단계에서 아세틸 보호기의 탈보호는 바람직하게는 히드라진(hydrazine)의 존재 하에서, 양자성 극성 용매에서, 예를 들어 알코올 예컨대 메탄올에서 수행된다. 이러한 반응은 실온, 즉 15 내지 25℃ 사이에서 수행될 수 있다.
화학식 (II)의 화합물에 대한 상대적인 히드라진의 몰비는 100 내지 1500 몰당량으로 다양할 수 있다.
아세틸의 탈보호는 대안적으로 용매로서 MeONa의 존재 하에서, 특히 MeOH에서, 실온, 즉 15 내지 25℃ 사이에서 수행될 수 있다.
특정 측면에서, 고체 지지체에 고정되면, i)의 말미에서 수득된 화학식 (II)의 접합체는, ii) 탈보호 단계가 수행되기 전에 예비적으로 고체 지지체로부터 절단된다. 이러한 절단은 수중에서 TFA 및 TIS의 존재 하에서, 예를 들어 하기의 부피 비율 95/2.5/2.5 v/v/v로 수행될 수 있다.
iii) 단계
본 발명에 따른 방법은 추가적으로, 하나 이상의 정제 단계, 특히 역상 고성능액체 크로마토그래피(RP-HPLC)로 이루어진, ii) 단계 다음의 iii) 단계를 포함할 수 있다.
iv) 단계
본 발명에 따른 방법은 추가적으로 산물을 회수하는 차후의 iv) 단계를 포함할 수 있다.
M(T) n 합성
특정 측면에서, 본 발명에 따른 방법은 추가적으로 접합체 M(T)n를 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 접합체 M(T)n는 덴드리머 폴리라이신 중심부로부터 출발하여 펩티드 T 세포 에피톱을 구성하는 N-보호된 아미노산 잔기를 단계적으로 도입하여 제조된다. N-보호된 아미노산 잔기는 특히 Fmoc 아미노산 잔기이다.
아미노산 결합은 극성 비양성자성 용매, 예컨대 DMF에서, 하나 이상의 펩티드 결합 시약 예컨대 DIC, HOBt, PyBOP, HATU 또는 DIPEA의 존재 하에서 수행될 수 있다. 조합 (DIC/HOBt 및 PyBOP) 또는 대안적인 (HATU/DIPEA)가 특히 바람직하다. 대안적인 결합 시약은 또한 문헌[E. Valeur; M. Bradley, Chem Soc Rev(2009) 38, 606 ; A. El-Faham et al. Chem Eur J (2009) 15, 9404 또는 R. Subiros-Funosas et al. Org Biomol Chem (2010) 8, 3665]에 개시되어 있다.
각각의 펩티드 결합에 뒤이어, N-아미노산 보호기는 제거된다. 예시로써, Fmoc 보호기는 극성 비양성자성 용매 예컨대 DMF에서 피페리딘의 존재 하에서 제거될 수 있다.
펩티드 단편 SEQ ID n°1의 합성과 관련하여 아미노산 잔기 AA9-10 및 AA15-16은 유사-프롤린 디펩티드(pseudo-proline dipeptide)로써 포함될 수 있다. 유리하게는, 이러한 디펩티드의 포함은 산물의 미정제 품질에 대한 현저한 영향을 입증하였다.
M 합성
특정 측면에서, 본 발명에 따른 방법은 추가적으로 덴드리머 폴리라이신 중심부 M을 제조하는 단계를 포함한다.
덴드리머 폴리라이신 중심부 M은 미국 특허 번호 US 6,676,946호에 개시된 방법에 따라 제조될 수 있다.
탄수화물 T 세포 에피톱 접합체 M(T-B) n
다른 측면에서, 본 발명은 유리하게는 본 발명의 방법에 따라 수득가능한 순도 ≥ 95% 등급을 가지는 탄수화물 T 세포 에피톱 접합체 M(T-B)n를 제공한다.
이러한 순도 등급은 단계 (ii) 이후 정제 단계 (iii), 특히 역상 고성능 액체크로마토그래피(RP-HPLC)를 수행하여 수득될 수 있다. 예시로써, RP-HPLC는 저입도 컬럼(low-granulometry column), 특히 15 ㎛ 미만, 특히 약 10 ㎛ 또는 5 μ 미만의 입도(granulometry)를 가지고/가지거나 약 300Å 이하, 특히 200Å 미만, 특히 100Å 미만의 공극(pore size)을 가지는 것으로 수행될 수 있다. 고정상은 옥타데실기로 접합된 실리카 겔(또한 C18 실리카로도 불림)에 기초한 역상일 수 있다. 용출은 얕은 구배(shallow gradient)로, 예를 들어 약 20분의 기간에 걸친 70/30에서부터 60/40까지, 정제수(0.1% TFA)/아세토니트릴로 수행될 수 있다.
화학식 (I)의 접합체의 순도 등급은 임의의 종래의 방법으로, 특히 RP-HPLC에 의하여 결정될 수 있다.
순도는 바람직하게는 ≥96%, 특히 ≥98%, 유리하게는 ≥99%이다.
탄수화물 T 세포 에피톱 접합체 M(T-B Pr ) n
추가적인 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 (II)의 탄수화물 T 세포 에피톱 접합체를 제공하며:
M(T-BPr)n (II)
상기 화학식에서,
- M은 덴드리머 폴리라이신 중심부이고;
- T는 바람직하게는 펩티드 잔기를 포함하는, T 세포 에피톱이며;
- BPr은 Pr기에 의하여 히드록실기가 보호되는 하나 이상의 탄수화물 잔기 (b)를 포함하는 보호된 탄수화물 B 세포 에피톱이고,
상기 Pr기는 알릴, p-메톡시벤질(PMB), t-부틸디메틸실릴(TBDMS), 벤질옥시메틸(BOM), 레불리닐(Lev), 벤조일(Bz), 2,5-디플루오로벤조일, 클로로아세틸, 벤질(Bn) 또는 아세틸(Ac)로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
C5-C6 아이소프로필리덴 케탈 또는 C5-C6 사이클릭 알킬카보네이트에 부착된 두 히드록실기로 형성되고
- n은 M에 공유결합한 -T-B 기의 수를 나타내는 정수이다.
특정 측면에서, BPr은 보호된 (α-GalNAc-Ser/Thr)3이다.
추가적인 측면에서, Pr은 벤질 또는 아세틸이다.
추가적인 측면에서, M은 HO-βAla-K(K)2이다.
다른 측면에서, T는 QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID N°1)이다.
다른 목적에서, 본 발명은 접합체 M(T-B)n를 제조하기 위한 탄수화물 펩티드 접합체 M(T-BPr)n의 용도를 제공하며, M(T-BPr)n 및 M(T-B)n은 상기 정의된 바와 같다.
본 발명의 다른 특징은 하기의 예시적 구체예의 설명 동안 명백해질 것이다. 이러한 실시예들은 본 발명의 예증을 위하여 제시되며 이들을 제한하려는 의도가 아니다.
본 발명에 따른 방법은 유리하게 부산물 합성을 최소화하게끔 하여, 공정의 견고성(robustness)을 개선하고, 반복할 수 있는 방식으로 합성을 규모 확대한다.
보다 구체적으로는, B 세포 에피톱을 M(T)n 구성 블록에 포함시키기 전에 적절한 보호기(Pr)로 탄수화물 B 세포 에피톱의 히드록실기를 보호하는 것이, B 세포 에피톱 포함의 보다 나은 제어를 가능하게 하여, 따라서 특히 대규모에서, 수율 및 순도 모두를 개선시킴이 발견되었다.
도면
도 1 : 본 발명의 방법의 프로토콜 A에 따른 MAG-Tn3 합성. 몰당량은 아미노기에 관하여 표시되었다. AA9-10 및 AA15-16은 유사-프롤린 디펩티드로서 포함되었다.
도 2 : 본 발명의 방법의 프로토콜 B에 따른 MAG-Tn3 합성. 몰당량은 아미노기에 관하여 표시되었다. AA9-10 및 AA15-16은 유사-프롤린 디펩티드로서 포함되었다.
실시예 :
실시예 1 : 프로토콜 A 및 B를 통한 MAG-Tn3의 제조
일반적인 방법
화합물 ( 6 )의 합성은 고체상에서 Fmoc 화학반응을 사용하여 단계적으로 수행하였다. 사용된 아미노산 측쇄 보호기는 Gln 및 Asn에서 Trt, Lys7 및 Lys11에서 Boc, Tyr, Ser 및 Thr에서 tBu, Glu에서 OtBu였다. Lys19 및 Lys20에서는, 보호기는 Fmoc였다.
네트 펩티드 함량(net peptide content)은 110℃에서 6N HCl로 20시간 동안 화합물을 가수 분해한 후에 Beckman 6300 분석기를 사용하여 질소 분석 또는 정량적 아미노산 분석으로 측정하였다.
HPLC/MS 분석은 자외선 검출기 2487(220 ㎚) 및 Q-TofmicroTM 분광기(Micromass)와 결합한 Alliance 2695 시스템에서 전자분무 이온화(electrospray ionisation)(포지티브 모드) 소스(Waters)로 수행하였다. 샘플들을 오토샘플러(autosampler)에서 4℃로 냉각하였다. 20분 동안 아세토니트릴+0.025%FA (A) / 정제수+0.04%TFA+0.05%FA (B)로 선형 구배(linear gradient)를 행하였다. 컬럼은 Zorbax 300SB C18(3.5μ, 3x150 ㎜)(Agilent)(구배 13-53% A) 또는 XBridgeTM BEH130 C18(3.5μ, 2.1x150 ㎜)(Waters)(구배 15-40% A)였다. 소스의 온도는 120℃로 그리고 탈용매화(desolvation) 온도는 400℃로 유지하였다. 콘 전압(cone voltage)은 40V 였다.
ESMS 분석은 동일한 질량 분광계에서 직접 주입(direct infusion)으로 포지티브 모드에서 기록하였다. 샘플들을 0.1% 포름산을 갖는 정제수 / 아세토니트릴 (1/1)에서 ~5μM 농도로 용해하였다.
SELDI-TOF 분석은 PCS 4000 질량분광계(Bio-Rad Labs)에서 수행하였다. H4 ProteinChip 어레이 표면을 1μL CH3CN으로 활성화하였다. 스폿들을 RT에서 20분 동안 박스 안에서 반응 혼합물(2.5μL, 1mg/mL)로 배양하였다. 이후 이들을 반응 버퍼(3x1분) 및 H2O (3x1분)로 세척하였다. 각각의 스폿에 매트릭스(50% CH3CN/0.5%TFA에 포화된 2x0.6μL의 시나핀산(sinapinic acid))를 적용하고 공기 건조하였다. 각각의 어레이 스폿으로부터 ~3μJ로 세팅된 레이저로 스펙트럼을 생성하였다. 기기는 상기 기술된 세팅으로 매트릭스와 우형(bovine) 유비퀴틴, 우형 시토크롬 C, β-락토글로불린으로 외부적으로 보정하였다.
화합물 ( 6 )의 순도를 220 ㎚의 자외선 검출기와 Agilent 1200 펌프 시스템을 사용하는 RP-HPLC로 분석하였다. 컬럼은 Zorbax 300SB C18(3.5μ, 3x150 ㎜)(Agilent)이었고 구배는 40분 동안 13%A부터 53%A까지(0.8mL/분, 머무름 시간 20.5분) 아세토니트릴+0.1% TFA (A) / 정제수+0.1%TFA (B)로 행하였다.
모든 시약의 몰당량은 아미노기에 대하여 표시하였다. 보호된 중간체 ( 4 ) 및 ( 5 )의 몰량(molar amount)은 출발물질 Fmoc-β-Ala-수지 ( 1 ) 치환체에 기초하여 계산하였다. 전체 수율(표)은 화합물 ( 1 )로부터의 모든 합성 단계를 포함한다. 이는 Fmoc-β-Ala-수지 ( 1 ) 치환체로부터 최종 산물 ( 6 )의 네트 펩티드 함량에서 계산하였다.
프로토콜 A (도 1)
Fmoc-β-Ala-수지 (저치환도(low-substituted) 수지) ( 1 )
p-벤질옥시벤질 알콜 수지 2g(왕(Wang) 합성수지, 0.91 mmol/g, 100-200 메시(mesh), 고분자 매트릭스: 코폴리(스티렌-1%DVB), Novabiochem)을 건조한 둥근바닥 플라스크 내의 DMF(Applied Biosystems)에서 1시간 동안 팽창시켰다. 건조 Fmoc-β-Ala-OH(Novabiochem, Merck Chemicals Ltd) 311㎎(1mmol)을 무수 CH2Cl2(Acros) 8mL에 용해하였다. 용해를 완성하기 위하여 4 방울의 DMF를 첨가하였다. DIC(Fluka) 77μL(0.5mmol)를 첨가한 후에, 반응 혼합물을 20분 동안 실온에서 아르곤 하에 교반하였다. 반응 혼합물이 건조될 때까지 증발시키고 회전 증발기(rotary evaporator)를 아르곤 하에서 열었다. 잔여물을 최소 부피의 DMF(6mL)에 용해하고 용액을 수지에 첨가하였다. DMF 0.5mL에 용해된 DMAP(Acros) 6mg(0.05mmol)를 첨가하고 현탁액을 2시간 동안 실온에서 약하게 교반하였다.
하기의 과정에 따라 수지 샘플의 수지 치환 비율을 자외선 분석으로 측정하였다. 2 내지 6mg의 수지를 파스퇴르 피펫으로 소형 신터드 유리 깔대기(sintered glass funnel)에 옮겼다. 수지를 DMF, CH2Cl2(Carlo Erba)로 세척 및 건조하였다. 수지를 UV 셀로 옮기고, 정밀하게 칭량한 후, 이에 DMF 중 20% 피페리딘(Aldrich) 2.8mL를 첨가하였다. 현탁액을 2분 동안 파스퇴르 피펫으로 휘저었다. DMF 중 20% 피페리딘을 함유하는 대조셀을 사용하여 흡광도를 300.5nm(e = 7800)에서 판독하였다. 로딩 정도는 0.1 mmol/g인 것으로 확인되었다.
수지를 DMF로 3회 세척하였다. 잔여 히드록실기를 하기의 프로토콜을 사용하여 캡(cap)하였다. 수지를 DMF 13 mL 내에 재현탁하였다. Ac2O(Sigma) 1.55mL(16.4mmol)를 DMF 1mL 내에, 이후 DMAP 660mg(5.41mmol)를 DMF 1mL 내에 첨가하였다. 30분 동안 실온에서 약하게 교반한 후, 현탁액을 신터드 유리 깔대기로 여과하고, 연속적으로 DMF로 3회, CH2Cl2로 3회 세척하고 이후 밤새 데시케이터에서 건조하였다. 수지 ( 1 )을 4℃에서 보관하였다.
[QYIKANSKFIGITEL] 4 -K 2 -K-β-Ala-수지 (보호된 펩티드) ( 2 )
4가 펩티드를 Fmoc 화학반응을 사용하는 Applied Biosystems 펩티드 합성기 433A에서 Fmoc-β-Ala-수지 ( 1 ) 250 mg(25μmol)로부터 합성하였다. 각각의 결합 단계 이후 추가적인 세척 단계를 제외하고는 Applied 표준 합성 프로토콜을 준수하였다. 간단히는, Fmoc 기를 NMP(Applied Biosystems) 중 22% 피페리딘으로 제거하였고 탈보호를 전도율(conductivity)로 모니터링하였다. 라이신 중심부는 HATU(Applied Biosystems)(제1 사이클: 40eq, 제2 사이클: 20eq) / DIPEA(Applied Biosystems)(제1 사이클: 80eq, 제2 사이클: 40eq)를 결합시약 및 NMP를 용매로 사용하는 두 단계의 Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(Applied Biosystems) (제1 사이클: 40eq, 제2 사이클: 20eq)의 연속적인 결합으로 구성하였다(주: 이 매우 큰 초과량의 시약 사용은 반응의 효율을 위하여 필수적이지 아니하며 단지 판매전 포장된 카트리지가 아미노산 1mmol으로 채워져있다는 사실에 기인하는 것임). 표준 측쇄 보호기를 가진 차후의 Fmoc-보호된 아미노산(Applied Biosystems, 10eq/아민)의 단계적인 주입을 NMP 중 HATU(10eq/아민) / DIPEA(20eq/아민)로 수행하였다. 위치 15-16 및 9-10의 AA는 HATU(10eq/아민) / DIPEA(20eq/아민)로 각각 Fmoc-Ile-Thr(ΨMe,Mepro)-OH 및 Fmoc-Asn(Trt)-Ser(ΨMe,Mepro)-OH (10eq/아민)(Novabiochem, Merck Chemicals Ltd)로서 포함되었다.
[S(α-D-GalNAc(OBn) 3 )-T(α-D-GalNAc(OBn) 3 )-T(α-D-GalNAc(OBn) 3 )-QYIKANSKFIGITEL] 4 -K 2 -K-β-Ala ( 5 )
화합물 ( 2 )(25μmol)로부터 출발하여, 글리코실화된 구성 블록을 수동으로 포함시켰다: Fmoc-T(α-D-GalNAc(OBn)3)-OH(Ficher Chemicals AG)(제1 사이클), Fmoc-T(α-D-GalNAc(OBn)3)-OH(제2 사이클) 및 Fmoc-S(α-D-GalNAc(OBn)3)-OH(Ficher Chemicals AG) (제3 사이클). 간단히, 건조 구성 블록(0.3mmol, 3eq / 자유 아미노기)을 최소량의 DMF (~2 mL)에 용해하였다. 0.5mL DMF 중 HATU(Novabiochem) 55mg(0.145mmol)의 용액을 첨가하였고 결과적인 혼합물을 수지에 첨가하였다. DIPEA(Aldrich) 52μL(0.3mmol)를 첨가한 후, 현탁액을 기계적으로 교반하였다. 세 결합 단계를 Kaiser 테스트 [1]로 모니터링하였고 이는 각각 1h, 1h 및 1h에 완료되었다. 각각의 결합 단계 후에, 수지를 DMF(4회)로 세척하였다. 모든 Fmoc 절단을 수지의 DMF 중 20% 피페리딘 처리로 수행하였다. 각각의 탈보호 이후, 수지를 DMF(6회), CH2Cl2(6회), 및 DMF(6회)로 연속적으로 세척하였다. 합성의 말미에서, 수지를 광범위하게 DMF 및 CH2Cl2로 세척하고, 데시케이터에서 건조하였다. TFA(Applied Biosystems) / 정제수 / TIS(Acros) (95/2.5/2.5 v/v/v) 10mL를 수지에 4℃에서 첨가하였고 혼합물을 1시간 30분 동안 실온에서 교반하였다. 수지의 여과 후, 용액을 농축하고 디에틸 에터로 미정제 산물을 침전시켰다. 원심분리 후, 펠렛을 정제수에 용해하고 동결건조하여 미정제 글리코펩티드 ( 5 ) 229mg을 수득하였다.
[S(α-D-GalNAc)-T(α-D-GalNAc)-T(α-D-GalNAc)-QYIKANSKFIGITEL] 4 -K 2 -K-β-Ala 또는 MAG-Tn3 ( 6 )
- TfOH [2-4]와 함께 화합물 ( 5 )로부터 출발,
실온에서 화합물 ( 5 ) 200mg(0.014mmol)을 TFA 2.96mL, DMS(Sigma-Aldrich) 1.78mL 및 메타크레졸(Sigma-Aldrich) 587μL에 용해하였다. 용액을 -10℃로 냉각하고 TfOH(Fluka) 587μL를 첨가한 후 혼합물을 1시간 15분 동안 -10℃ (TfOH/TFA/DMS/m-크레졸 1/5/3/1 v/v/v/v)에서 교반하였다. 디에틸 에터로 산물을 침전시키고, 원심분리 후, 펠렛을 정제수에 용해하고 동결건조하여 미정제 글리코펩티드 372 mg을 수득하였다. 산물을 0.05M 암모늄 아세테이트 버퍼 7.7mL에 용해하고 1M 암모니아로 pH를 7로 조정하였다. 실온에서 1시간 후, 용액을 동결건조하여 미정제 산물 412mg을 수득하였다. 230nm의 자외선 검출기와 Agilent 1200 펌프 시스템을 사용하는 RP-HPLC로 산물을 정제하였다. 컬럼은 Zorbax C18(5μ, 300Å, 9.4 x 250 mm)(Agilent)이었으며 정제수(0.1% TFA) / 아세토니트릴로 73/27부터 60/40까지 20분 동안 구배를 행하였다. 정제 결과 순도 95.90%의 화합물( 6 ) 3.9mg(네트 펩티드 함량)을 얻었다. 전체 수율은 1.6%였다.
프로토콜 B (도 2)
[QYIKANSKFIGITEL] 4 -K 2 -K-β-Ala-수지 (보호된 펩티드) ( 2 )
Tyr5이 포함될 때까지, Schmizo 반응기를 장착한 수동 펩티드 합성기에서 Fmoc-β-Ala-Tentagel R Trt 수지 ( 1 )(0.13mmol/g)(Rapp Polymere) 36.9 g(4.8mmol)으로부터 4가 펩티드를 합성하였다. 신장(elongation) 과정 전에, 수지를 DMF에서 2 내지 3시간 동안 팽창시키고 DMF 240mL(3회, 2 분/사이클)로 세척하였다. 각각의 결합 후에, Fmoc 기를 DMF 240 mL(3 단계, 각각 20분) 중 20% 피페리딘으로 제거하였다. Glu17, Asn9 및 Gln4의 경우에는, 탈보호 용액에 2% HOBt를 첨가하였다. 각각의 탈보호 후에, 수지를 DMF 240 mL(4회, 2분/사이클), DMF 중 2% HOBt 240m L(2회, 5분/사이클), 및 DMF 240 mL(2회, 2분/사이클)로 연속적으로 세척하였다.
아미노산 결합(1.5 내지 2eq / 아민)을 DMF(111mL)에서 실온에서 DIC/HOBT (각각 1.5 내지 2eq / 아민)로 수행하였다(하기 상세 참조). 15-16 및 9-10 위치의 AA를 각각, Fmoc-Ile-Thr(ΨMe,Mepro)-OH 및 Fmoc-Asn(Trt)-Ser(ΨMe,Mepro)-OH로서 포함시켰다. 30분 후에, DIC(1.5 내지 2eq)의 새로운 부분(fresh portion)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 결합 단계를 Kaiser 시험 [1]로 모니터링하였다. Leu18부터 Ser1까지, DIC/HOBT(동일한 양으로)로 1시간 동안 결합한 후에, PyBOP 시약을 첨가하고(하기 상세 참조) DIPEA의 적상 첨가(dropwise addition)로 pH를 7로 조정하였다. 30분 후에, 수지를 DMF 240mL(5회, 2분/사이클)로 세척하고 Leu18부터 Thr2까지 아세틸화 단계를 수행하였다. 아세틸화를 실온에서 피리딘(1eq/아민)의 존재 하에서 DMF 111mL 중에 무수아세트산(1eq/아민)으로 수행하였다. 20분 후에, 수지를 DMF 240mL(6회, 2분/사이클)로 세척하였다. Tyr5의 포함 후에, 건조 전에, DMF 240mL(8회, 2분/사이클) 및 CH2Cl2 240mL(8회, 2분/사이클)로 수지를 광범위하게 세척하였다.
Tyr5의 포함 후에, 0.15mmol 규모 또는 4.65mmol 규모로 동일한 프로토콜을 사용하여 어셈블리를 수행하였고 펩티드-수지 ( 2 )를 화합물 ( 4 ) 및 화합물 ( 5 ) 각각을 위하여 제공하였다.
Figure pct00007
[S(α-D-GalNAc(OAc) 3 )-T(α-D-GalNAc(OAc) 3 )-T(α-D-GalNAc(OAc) 3 )-QYIKANSKFIGITEL] 4 -K 2 -K-β-Ala ( 4 )
화합물 ( 2 )에 대하여 앞서 기술된 바와 같이 화합물 ( 2 )(0.15mmol)로부터 합성을 수행하였다. 결합 단계를 하기의 AA 구성 블록 [5] 및 시약을 이용하여 수행하였다.
Figure pct00008
합성의 말미에서, 글리코펩티드 수지(0.15mmol)를 TFA/TIS/H2O(95/2.5/2.5 v/v/v)(글리코펩티드 수지의 10mL/g)에 현탁하고 1시간 동안 20℃±2℃에서 교반하였다. 여과한 후에, 수지를 동일한 TFA 혼합물(세척 당 글리코펩티드 수지 2mL/g)로 2회 세척하였다. 여과액 및 세척액을 모아서 추가로 30분 동안 20℃±2℃에서 교반하였다. 농축한 후에(배스 온도 ≤35℃), 미정제 산물을 DIPE(글리코펩티드 수지 ~35mL/g)로 침전시켰다. DIPE를 이용한 여과 및 세척 후에, 고체를 건조(t°≤30℃)시켜 미정제 화합물 ( 4 ) 750mg를 수득하였다.
ESMS: 12409.589 (C553H855N107O213 산출(calcd) 12410,465)
[S(α-D-GalNAc(OBn) 3 )-T(α-D-GalNAc(OBn) 3 )-T(α-D-GalNAc(OBn) 3 )-QYIKANSKFIGITEL] 4 -K 2 -K-β-Ala ( 5 )
화합물 ( 2 )에 대하여 앞서 기술된 바와 같이 화합물 ( 2 )(4.65mmol)로부터 합성을 수행하였다. 하기의 AA 구성 블록(Ficher Chemicals AG) 및 시약을 사용하여 결합 단계를 수행하였다. 합성의 말미에서, 84.87g의 글리코펩티드 수지를 수득하였다.
Figure pct00009
화합물 ( 4 )에 대하여 앞서 기술된 바와 같이 글리코펩티드 수지(20g, 1.096mmol)를 처리하여 미정제 화합물( 5 ) 9.95g을 수득하였다.
ESMS: 14141.433 (C733H999N107O177 산출 14141,610)
[참고]: 본 프로토콜로 프로토콜 A에 따라, 즉 Fmoc-β-Ala-p-벤질옥시벤질 알콜 수지(왕 합성수지)로부터 수득된 것과 동등한 미정제 화합물을 수득하였다(상기 참조).
[S(α-D-GalNAc(OH) 3 )-T(α-D-GalNAc(OH) 3 )-T(α-D-GalNAc(OH) 3 )-QYIKANSKFIGITEL] 4 -K 2 -K-β-Ala 또는 MAG-Tn3 ( 6 )
- 히드라진 [7]과 함께 화합물 ( 4 )로부터 출발,
화합물 ( 4 ) 100mg (20μmol)을 MeOH 3.2mL에 용해하였다. 히드라진 일수화물 567μL (11.3mmol)을 첨가하고 용액을 실온에서 교반하였다. 2시간 30분 후에, 용액을 0℃로 냉각하고 아세톤 3.2mL를 첨가하였다. 1시간 후에, 용액을 농축하고 아세톤으로 5회 공동 증류(co-distill)하였다. 미정제 글리코펩티드를 동결건조하여 117mg을 수득하였다. 산물을 230 nm에서 자외선 검출기를 갖는 Agilent 1200 펌프 시스템을 사용하여 RP-HPLC로 정제하였다. 컬럼은 Zorbax C18(5μ, 300Å, 9.4 x 250 mm)(Agilent)였고 72/28부터 62/38까지 정제수(0.1% TFA) / 아세토니트릴로 20분 동안 구배를 수행하였다. 정제로 순도 96.4%의 화합물 ( 6 ) 5.8mg(네트 펩티드 함량)을 수득하였다. 전체 수율은 2.7%였다.
- MeONa와 함께 화합물 ( 4 )로부터 출발,
화합물 ( 4 ) 24mg(4.8μmol)을 MeOH 3.2mL에 용해하였다. MeOH 중 1% MeONa로 pH를 14로 조정하고(pH 미터, 습 pH 시험지(moist pH paper) ~10.5) 용액을 RT에서 교반하였다. 반응을 RP-HPLC로 모니터링하였다. 2시간 후에, 드라이아이스로 반응물을 중화시키고 건조될 때까지 증발시켰다. 미정제 펩티드를 1% 수성 TFA에 용해하고 동결건조하였다. 산물을 230 nm에서 자외선 검출기를 갖는 Agilent 1200 펌프 시스템을 사용하여 RP-HPLC로 정제하였다. 컬럼은 Kromasil C4(5μ, 100Å, 10x250 mm)(AIT)였고 73/27부터 62/38까지 0.1% 수성 TFA(VWR) / 아세토니트릴(Carlo Erba)로 30분 동안 구배를 수행하였다. 정제로 순도 91.4%의 화합물 ( 6 ) 754㎍(네트 펩티드 함량)을 수득하였다. 전체 수율은 1.4%였다.
- H2와 함께 화합물 ( 5 )로부터 출발,
화합물 ( 5 ) 10g(1.1mmol)을 NMP/H2O 87.5/12.5 800mL에 용해하였다. 10%Pd/C 타입 39 (Johnson Matthey) 4g을 첨가한 후, 반응물을 37℃ 및 5바에서 170시간 동안 교반하였다. 두 개의 추가적인 양의 촉매를 72시간(2g) 및 120시간(2g) 후에 부분적으로(portionwise) 첨가하였다. 반응의 말미에서, 촉매를 셀라이트에서 여과하고 NMP/H2O 87.5/12.5로 세척하였다. 결과적인 여과액을 유사한 반응에서 나온 다른 여과액과 수집하였다(총 1.35mmol). H2O로 희석한 후에(NMP/H2O 10/90이 될 때까지), 여과액을 RP-HPLC에 의하여 두 단계로 정제하였다. 제1 정제를 Vydac C18 컬럼(300Å, 10-15㎛, 50mL/mn)에서 TFA/H2O/CH3CN 0.1/94.9/5.0 v/v/v(A) 및 TFA/H2O/CH3CN 0.1/49.9/50.0 v/v/v(B)로 수행하였다. 구배는 15분 동안 0%B, 5분 동안 0-40%B, 60분 동안 40-80%B였다. 제2 정제를 Vydac C18 컬럼(300Å, 10-15㎛, 50mL/mn)에서 AcOH/H2O/CH3CN 0.5/94.5/5.0 v/v/v(A) 및 AcOH/H2O/CH3CN 0.5/49.5/50.0 v/v/v(B)로 수행하였다. 구배는 15분 동안 0%B, 5분 동안 0-20%B, 60분 동안 20-60%B였다. RP-HPLC로 Daisogel SP-300-10-ODS-AP 컬럼(20mL/mn, 등용매 TFA/H2O/CH3CN 0.1/49.9/50.0 v/v/v)에서 농축한 후에, 용액을 회전 증발기에서 증발시키고 동결건조하여 순도 95.3%의 화합물 ( 6 ) 225mg(네트 펩티드 함량)을 수득하였다. 전체 수율은 1.5%였다.
ESMS: 10897.387 (C481H783N107O177 산출 10897,123)
결론
수득된 결과는 하기의 표에서 요약된다:
Figure pct00010
1참고문헌 5 및 9, (WO 9843677 다중 항원 글리코펩티드 탄수화물, 이를 포함하는 백신 및 이의 용도, 참고문헌 11)
2Fmoc-βAla-수지 치환으로부터 네트 펩티드 함량에서 산출됨(화합물 ( 1 )로부터의 모든 합성 단계를 포함함)
3RP-HPLC에 의하여 측정됨: 컬럼 Zobrax 300SB C18(3.5μ, 3x150 mm)(Agilent), 0.8 mL/분, A: 아세토니트릴+0.1% TFA, B: 정제수+0.1% TFA, 40분 동안 13%부터 53%까지 A의 구배, 220 nm에서 검출.
4최종 산물에 관함(네트 펩티드 함량).
비보호된 탄수화물 신톤(synthon)을 사용하는 최초의 공정과 비교하여(도 1 및 2), 신규한 공정(보호된 탄수화물이 수반됨, II, 도 1 및 2)은 하기를 허용한다:
- 합성 부산물 최소화
- 공정 반복성 개선
- 반복가능한 방식으로 합성의 규모 확대
신규한 공정의 시험된 프로토콜 중에서(표, 도 1 및 2), 세 가지가 최고의 전략으로 드러난다: Ac/히드라진, Bn/TfOH 및 Bn/H2(보호기/탈보호 방법)(표). 이들 모두 순도 ≥95%의 MAG-Tn3를, 반복가능한 방식으로 얻게 하였다.
Bn/TfOH 방법으로 전체 수율 1.6%의 MAG-Tn3를 제공하였다. 이러한 방법은 완전한 탈보호 및 분해 간의 절충을 필요로 한다. 대안적으로, Bn/H2 방법은 유사한 수율(1.5%)로 MAG-Tn3를 제공하며, 가장 중요하게는, 공정이 225mg 규모로 인증되었다. 최종적으로 Ac/히드라진 방식은 가장 높은 전체 수율(1.6% 및 1.5%와 비교하여 2.7%)을 제공하였다.
다른 펩티드(PV=KLFAVWKITYKDT)(SEQ ID N°4)에 기초한 MAG-Tn3은 또한 본 발명의 방법(Ac/히드라진, Bn/TfOH)에 따라 제조되었다.
실시예 2 : 수지 치환 비율 및 MAG-Tn3의 정제에 사용되는 고정상의 특성의 영향
MAG-Tn3을 프로토콜 B에 따라 Fmoc-β-Ala로 기능화된 폴리스티렌 수지(Fmoc-β-Ala-TentaGel R Trt의 상표명 하에 판매되는)로부터, 상이한 두 치환 비율: 0.13 또는 0.1 mmol/g(즉 그래프팅되지 않은 수지의 중량에 대한 Fmoc-β-Ala로 그래프팅된 기의 수)로 제조하였다.
미정제 MAG-Tn3의 정제를 옥타데실기로 그래프팅된 실리카 겔, 즉 Vydac®, Jupiter® 및 Daisogel®에 기초한 세 개의 별개의 고정상(역상)에서 RP-HPLC에 의하여 수행하였다. 제1 정제를 TFA/H2O/CH3CN 0.1/94.9/5.0 v/v/v(A) 및 TFA/H2O/CH3CN 0.1/49.9/50.0 v/v/v(B)로 수행하였다. 구배는 15분 동안 0%B, 5분 동안 0-40%B, 60분 동안 40-80%B였다. 제2 정제를 AcOH/H2O/CH3CN 0.5/94.5/5.0 v/v/v (A) 및 AcOH/H2O/CH3CN 0.5/49.5/50.0 v/v/v (B)로 수행하였다. 구배는 15분 동안 0%B, 5분 동안 0-20%B, 60분 동안 20-60%B였다.
결과는 하기의 표에서 보고된다.
Figure pct00011
a 분말 중량
b RP-HPLC Zorbax 300SB C18(3.5μ, 3x150 mm, Agilent), A: 아세토니트릴+0.1% TFA, B: H2O+0.1% TFA, 15-53% A(40분)에 의한 분석.
c 수율은 Fmoc-β-Ala-수지로부터의 모든 합성 단계를 포함하며 최종 산물의 네트 펩티드 함량에서 산출되었다.
Vydac® C18, 300Å, 10-15㎛(Grace), ref 218MSB1015 또는 218TPB1015 또는 238TPB1015
Jupiter® C18, 300Å, 10㎛(Phenomenex), ref 04G-4055
Daisogel® C18, 300Å, 10㎛(Daiso), ref SP-300-10-ODS-RPS
이러한 결과는 본 발명에 따른 접합체 제조의 공정 수율, 및 수득된 접합체의 순도 모두가 수지의 치환 비율을 감소시키고/감소시키거나 적합한 고정상을 사용하여 고도로 개선될 수 있음을 입증한다.
약어
AA 아미노산
Ac 아세틸
AcOH 아세트산
Bn 벤질
Boc 터트(tert)-부톡시카보닐
tBu 터트-부틸
DIC N,N'-디아이소프로필카보다이이미드 (diisopropylcarbodiimide)
DIPEA 다이아이소프로필에틸아민(diisopropylethylamine)
DIPE 다이아이소프로필 에터(diisopropyl ether)
DMAP 4-디메틸아미노피리딘
DMF 디메틸포름아마이드
DMS 디메틸설파이드
DVB 디비닐벤젠
EtOH 에탄올
FA 포름산
Fmoc 9-플루오레닐메톡시카보닐(fluorenylmethoxycarbonyl)
HATU 2-(1H-9-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트
HOBt N-히드록시벤조트리아졸
HPLC/MS 고성능 액체크로마토그래피 / 질량분석법
MAG 다중 항원 글리코펩티드
MeOH 메탄올
MeONa 메틸화 나트륨(sodium methylate)
ESMS 전자분무(electrospray) 질량분광법
MW 분자량
NMP N-메틸피롤리돈
NMR 핵자기공명
PyBOP 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트
RP-HPLC 역상 고성능 액체크로마토그래피
RT 실온
SELDI-TOF MS 표면 증강 레이저 탈착/이온화 비행시간법 질량분광법(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry)
TBS 터트-부틸디메틸실릴
TFA 트리플루오로아세트산
TfOH 트리플로오로메탄설폰산
THF 테트라하이드로퓨란
TIS 트리아이소프로필실란
TMSBr 트리메틸실릴 브롬화물(trimethylsilyl bromide)
Trt 트리틸(trityl)
SEQUENCE LISTING <110> Institut Pasteur <120> METHOD FOR PREPARING MULTIPLE ANTIGEN GLYCOPEPTIDE CARBOHYDRATE CONJUGATES <130> F 226 CAS 188 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Tetanus toxin fragment <400> 1 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Tetanus toxin fragment <400> 2 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser His Leu Glu 20 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Tetanus toxin fragment <400> 3 Gly Gln Ile Gly Asn Asp Pro Asn Arg Asp Ile Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Poliovirus VP1 protein fragment <400> 4 Lys Leu Phe Ala Val Trp Lys Ile Thr Tyr Lys Asp Thr 1 5 10

Claims (24)

  1. 하기 화학식 (I)의 탄수화물 T 세포 에피톱 접합체를 제조하는 방법으로서:
    M(T-B)n (I)
    상기 화학식에서:
    - M은 덴드리머 폴리라이신 중심부이고;
    - T는 T 세포 에피톱이며;
    - B는 하나 이상의 탄수화물 잔기 (b)를 포함하는 탄수화물 B 세포 에피톱이고;
    - n은 M에 공유결합한 -T-B 기의 수를 나타내는 정수이며;
    하기의 단계를 포함하는 방법:
    i) 탄수화물 잔기 (b)의 히드록실기가 보호기(Pr)로 보호된 것인 보호된 탄수화물 B 세포 에피톱(BPr)을, 화합물 M(T)n에 결합시켜 탄수화물 T 세포 에피톱 접합체 M(T-BPr)n을 형성시키는 단계로서, 상기 보호기(Pr)는 알릴, p-메톡시벤질(PMB), t-부틸디메틸실릴(TBDMS), 벤질옥시메틸(BOM), 레불리닐(Lev), 벤조일(Bz), 2,5-디플루오로벤조일, 클로로아세틸, 벤질(Bn) 또는 아세틸(Ac)로 이루어진 군으로부터 선택되거나, C5-C6 아이소프로필리덴 케탈 또는 C5-C6 사이클릭 알킬카보네이트에 부착된 두 히드록실기로 형성되는 단계;
    및,
    ii) 보호기 Pr을 수득된 접합체 M(T-BPr)n으로부터 제거하여 탄수화물 T 세포 에피톱 접합체 M(T-B)n을 수득하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, M(T-B)n이 하기의 화학식 (Ia) 또는 (Ib)로부터 선택되는 방법으로:
    Figure pct00012

    상기 화학식에서, K는 라이신 잔기이며,
    T 및 B는 제1항에 정의된 바와 같은 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, M이 하기의 화학식의 (K)2K-βAla-OH인 방법:
    Figure pct00013
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, T가 펩티드를 포함하는 T 세포 에피톱인 방법.
  5. 제4항에 있어서, T가 CD8+ 또는 CD4+ T 세포 에피톱이거나 이를 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, T가 CD4+ T 세포 에피톱이거나 이를 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, T가 폴리오바이러스(PV) 단편 단백질, 파상풍 독소 단편 또는 PADRE 펩티드이거나 이를 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, T가 QYIKANSKFIGITEL(SEQ ID No 1)로 이루어진 펩티드인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 탄수화물 잔기 (b)가 아미노산, 펩티드 또는 지질 잔기에 부착된 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, B가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 탄수화물 잔기이거나 이를 포함하는 방법:
    - α-GalNAc-Ser,
    - α-GalNAc-Thr,
    - β-GalNAc-Ser,
    - β-GalNAc-Thr,
    - β-Gal-(1-3)-α-GalNAc-Ser,
    - β-Gal-(1-3)-α-GalNAc-Thr,
    - (α-GalNAc-Ser/Thr)2,
    - (α-GalNAc-Ser/Thr)3, 및
    - (α-GalNAc-Ser/Thr)6.
  11. 제10항에 있어서, B가 잔기 (α-GalNAc-Ser/Thr)3이거나 이를 포함하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 보호기 Pr이 벤질(Bn) 또는 아세틸(Ac)인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, i) 단계가 하기의 단계를 포함하는 방법:
    a) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같이 보호기(Pr)로 히드록실기가 보호된 것인 제1 보호된 탄수화물 잔기(bPr)를 화합물 M(T)n과 결합시켜 탄수화물 T 세포 에피톱 접합체 M(T-bPr)n을 형성시키는 단계; 및
    b) 추가의 보호된 탄수화물 잔기(bPr)로 화학식 (II)의 보호된 탄수화물 접합체 M(T-BPr)n을 수득할 때까지 a) 단계를 반복하는 단계.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, Pr이 벤질인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 벤질기가 TfOH 또는 H2 존재 하에서 제거되는 방법.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, Pr이 아세틸인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 아세틸기가 히드라진 또는 MeONa 존재 하에서 제거되는 방법.
  18. 하기 화학식 (II)의 탄수화물 T 세포 에피톱 접합체로서:
    M(T-BPr)n (II)
    상기 화학식에서,
    - M은 덴드리머 폴리라이신 중심부이고;
    - T는 T 세포 에피톱이며;
    - BPr은 제1항에 정의된 바와 같이 히드록실기가 Pr기로 보호된 하나 이상의 탄수화물 잔기(b)를 포함하는 보호된 탄수화물 B 세포 에피톱이고;
    - n은 M에 공유결합한 -T-B 기의 수를 나타내는 정수인, 탄수화물 T 세포 에피톱 접합체.
  19. 제18항에 있어서, T가 펩티드이거나 이를 포함하는 탄수화물 T 세포 에피톱 접합체.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, Pr이 벤질(Bn) 또는 아세틸(Ac)인 탄수화물 T 세포 에피톱 접합체.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, BPr이 보호된 (α-GalNAc-Ser/Thr)3인 탄수화물 T 세포 에피톱 접합체.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, M이 HO-βAla-K(K)2인 탄수화물 T 세포 에피톱 접합체.
  23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, T가 QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID N°1)인 탄수화물 T 세포 에피톱 접합체.
  24. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같이 탄수화물 펩티드 접합체 M(T-B)n을 제조하기 위한 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 탄수화물 T 세포 에피톱 접합체 M(T-BPr)n의 용도.
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