BR112013023599B1 - Método para preparar um conjugado de carboidrato-epítopo de célula-t, conjugado de carboidrato-epítopo de célula-t, e, uso de um conjugado de carboidrato-epítopo de célula-t - Google Patents

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Abstract

MÉTODO PARA PREPARAR UM CONJUGADO DE CARBOIDRATO-EPÍTOPO DE CÉLULA-T, CONJUGADO DE CARBOIDRATO-EPÍTOPO DE CÉLULA-T, E, USO DE UM CONJUGADO DE CARBOIDRATO- EPÍTOPO DE CÉLULA-T. A presente invenção se refere a um método para preparar conjugados de carboidrato-epítopo de célula-T de fórmula (I): M(T-B)n (I) na qual: M, T, B e n são como definidos na reivindicação 1.

Description

[001] A presente invenção se refere a um método para preparar conjugados de carboidrato-epítopo de célula-T de fórmula (I), e aos intermediários de carboidrato-epítopo de célula-T de fórmula (II) úteis de acordo com dito método.
[002] Durante a última década, o MAG-Tn3, tem sido desenvolvido como um tipo novo de imunógeno que exibe o antígeno Tn associado com tumor. O MAG-Tn3 é um glicopeptídeo totalmente sintético (PM = 10.897Da) que se associa com o antígeno carboidrato Tn (como um agrupamento tri-Tn) em um epítopo de célula-T CD4- peptídico em uma cadeia principal tetravalente [5, 9].
[003] MAG-Tn3 corresponde à seguinte estrutura
Figure img0001
Figure img0002
Figure img0003
MAG se refere ao Glicopeptídeo Multiantigênico (Multiple Antigen Glycopeptide).
[004] Desta forma, MAG-Tn3 corresponde a um conjugado de carboidrato-peptídeo B4-T4-M da seguinte fórmula:
Figure img0004
e - KKK é o núcleo de poli-Lisina dendrítico (M), - T é o epítopo de célula-T CD4+ peptídico tendo a seguinte sequência: QYIKANSKFIGITEL - Tn3 é o epítopo de célula-B tri-Tn tendo a seguinte sequência: (α-GalNAc)Ser-(α-GalNAc)Thr-(α-GalNAc)Thr.
[005] Com base em resultados in vivo bem sucedidos obtidos em camundongos e primatas [8, 9], o MAG-Tn3 é um bom candidato para vacina terapêutica para tratar carcinomas que deve avançar para um teste clínico de fases I/II.
[006] Uma rota sintética para preparar os conjugados de peptídeo- carboidrato, como notavelmente MAG-Tn3 tem sido descrita em Pedido de Patente Internacional de número WO 98/43677 e em Patente US de número 6.676.946. Neste processo, implementado em escala pequena (1-10 mg de composto final), o antígeno carboidrato Tn3 é incorporado no bloco de construção de peptídeo dendrimérico M(T)4. É para ser observado que a incorporação do antígeno Tn3 é realizada com o açúcar totalmente desprotegido, o que pode parecer vantajoso porque evita uma etapa de desproteção final.
[007] Entretanto, os inventores têm mostrado que tal método falha quando sua escala é aumentada. De fato, a incorporação extra de resíduos Tn é difícil de controlar e afeta a pureza bruta e o rendimento total. Ademais, a purificação de tal glicopeptídeo de peso molecular alto é complexa.
[008] Desta forma, há uma necessidade de um método aperfeiçoado para preparar MAG-Tn3 que suplante as desvantagens da técnica anterior, em particular que permita obter pureza e rendimento melhores, notavelmente em uma escala mais alta e em uma maneira repetível.
[009] Desta forma, a presente invenção, em um aspecto, fornece um carboidrato-epítopo de célula-T de fórmula (I) (M(T-B)n), que permite a produção em grande escala, com rendimentos e pureza melhores:
Figure img0005
[0010] O método de acordo com a invenção vantajosamente permite minimizar os produtos secundários da síntese, aperfeiçoar a robustez do processo, e aumentar a escala da síntese em uma maneira repetível.
[0011] Mais especificamente, tem sido descoberto que a proteção de grupos hidroxila do epítopo de célula T-carboidrato com um grupo protetor (Pr) adequado, antes da incorporação do epítopo de célula-B no bloco de construção M(T)n, permite um controle melhor da incorporação de epítopo de célula-B, e desta forma melhora os rendimentos e a pureza, em especial em uma escala grande.
[0012] Outro objetivo da presente invenção é fornecer novos conjugados de carboidrato-epítopo de célula-T de fórmula (II) (M(T-BPr)n), cujos compostos são úteis para a preparação de conjugados de carboidrato- epítopo de célula-T de fórmula M(T-B)n com rendimentos e pureza altos.
[0013] Outro objetivo da presente invenção é fornecer conjugados de carboidrato-epítopo de célula-T de fórmula (I) (M(T-B)n) que têm um grau de pureza maior do que 95%, obtenível pelo processo de acordo com a invenção.
[0014] Estes e outros objetivos, aspectos e vantagens do método de acordo com a invenção serão descritos na seguinte descrição detalhada da divulgação da patente.
[0015] Desta forma, em um aspecto, a presente invenção se refere a um método para preparar um conjugado de carboidrato-epítopo de célula-T de fórmula (I):
Figure img0006
na qual: M é um núcleo de poli-Lisina dendrimérico; T é um epítopo de célula-T compreendendo um peptídeo; B é um carboidrato-epítopo de célula-B compreendendo pelo menos um resíduo de carboidrato (b); n é um número inteiro e representa o número de grupos -T-B covalentemente ligados em M;
[0016] Dito método compreendendo as etapas de: i) acoplar um carboidrato-epítopo de célula-B (BPr) cujos grupos hidroxila do resíduo de carboidrato (b) estão protegidos com um grupo protetor (Pr), com um composto M(T)n formando deste modo um conjugado de carboidrato-epítopo de célula-T M(T- BPr)n, dito grupo protetor (Pr) sendo selecionado dentre o grupo consistindo em alila, p-metoxibenzila (PMB), t-butildimetilsilila (TBDMS), benziloximetila (BOM), levulinila (Lev), benzoíla (Bz), 2,5-difluorobenzoíla, cloroacetila, benzila (Bn) ou uma acetila (Ac), ou formar com dois grupos hidroxila no qual está ligado um C5-C6 isopropilideno-cetal ou um carbonato de C5-C6 alquila cíclica; e ii) remover os grupos protetores Pr do conjugado obtido M(T-BPr)n para obter deste modo o conjugado de carboidrato epítopo de célula-T M(T-B)n. Núcleo de poli-Lisina dendrimérico (M)
[0017] O núcleo de poli-Lisina do conjugado de fórmula (I) é uma estrutura dendrimérica, que pode ser representada como uma estrela, tendo múltiplas ramificações (-T-B), que podem ou não ser idênticas.
[0018] Tais ramificações estão aleatoriamente ligadas na extremidade NH2 de cada resíduo de lisina do núcleo dendrimérico, notavelmente por uma ligação peptídica -NH-C(=O)-.
[0019] A valência m do núcleo de poli-Lisina dendrimérico (M), i.e. o número de extremidade NH2 de cada resíduo de lisina é tal que m - n, preferencialmente m = n, n designando o número de ramificações (-T-B) covalentemente ligadas em M.
[0020] Em outro aspecto, o número de ramificações (-T-B) n varia de 4 a 16, notavelmente de 4 a 8.
[0021] Em outro aspecto, o núcleo de poli-Lisina dendrimérico M compreende pelo menos 3 resíduos de lisina, em particular 3 a 15 resíduos de lisina, mais particularmente 3 a 7 resíduos de lisina.
[0022] Em um aspecto adicional, o conjugado M(T-B)n é selecionado dentre as seguintes fórmulas (Ia) ou (Ib):
Figure img0007
em que: K é um resíduo de lisina, e T e B são como definidos acima.
[0023] Vantajosamente, estruturas dendriméricas (Ia) e (Ib) fornecem uma densidade alta de antígenos na superfície do núcleo de poli-Lisina dendrimérico M.
[0024] Em outro aspecto, M é (K)2K-βAla-OH da seguinte fórmula:
Figure img0008
Ramificações (T-B)
[0025] A presença de ambos os carboidrato-epítopos de célula-B e epítopos de célula-T no conjugado de fórmula (I) torna o último imunógeno eficiente. Epítopos de célula-T
[0026] Como aqui usado, o epítopo de célula-T significa um antígeno, em particular de natureza peptídica, capaz de induzir uma reposta de célula-T.
[0027] Tais epítopos são notavelmente descritos em S. Stevanovic, “Identification of Tumour-associated T-cell epitopes for vaccine development”, Nature Reviews, Vol. 2, July 2002, p. 1 a 7; J.H. Kessler, C.J.M. Melief, “Identification of T-cell epitopes for cancer immunotherapy”, Leukemia (2007) 21, 1859-1874, ou no sítio da internet do banco de dados "Cancer immunity/peptide": http://www.cancerimmunity.org/peptide database/tumorspecific.htm.
[0028] Os epítopos de célula-T incorporados no conjugado de fórmula (I) podem ser iguais ou diferentes, peptídicos ou não.
[0029] Em um aspecto específico, os conjugados de carboidrato- epítopo de célula-T são conjugados de carboidrato-peptídeo. Os epítopos de célula-T peptídicos podem compreender 2 a 50 aminoácidos.
[0030] Os epítopos de célula-T podem ser notavelmente selecionados dentre os epítopos de células-T CD8+, ou CD4+.
[0031] Os epítopos de célula-T CD8+, reconhecidos como marcadores tumorais, podem ser selecionados dentre o grupo consistindo em: - peptídeos MUC-1 (pâncreas, mama) - MAGE 1 e 3 (melanoma, pulmão) (T. Boon et al. (1995), Immunology Today, vol. 16 n°7, pp 334-336) - pme117/gp 100 (melanoma) - Tirosinase (melanoma) BAGE (melanoma) - GAGE (melanoma) LB-33-B (melanoma) - CDK4 - p185HER (mama, ovário) - CEA MART1/Melan-A (melanoma) - ou selecionados dentre o grupo consistindo em antígenos de tumor descritos em A. Van Pel et al. (1995) Immunological. Reviews n° 145, pp 229-250 ou em P. G. Coulie (1995), Stem Cells, 13, pp 393-403.
[0032] Em um aspecto específico, T é ou compreende um epítopo de célula-T CD4+ T, que pode ser notavelmente um fragmento de proteína do vírus da poliomielite (PV, poliovirus), um fragmento da toxina do tétano, ou um peptídeo PADRE.
[0033] Como um exemplo de epítopo de célula-T CD4+ selecionado dentre fragmento do vírus da poliomielite (PV), menção pode ser feita ao peptídeo sintético que corresponde à sequência 103-115 da proteína VP1 do vírus da poliomielite de tipo 1 (KLFAVWKITYKDT) (SEQ ID N°4).
[0034] Como exemplo de epítopo de célula-T CD4+ selecionado dentre a toxina do tétano, menção pode ser feita aos seguintes fragmentos: - sequência 830-844 da toxina do tétano (QYIKANSKFIGITEL) (SEQ ID N°1) - sequência 947-967 da toxina do tétano (FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE) (SEQ ID N°2) - sequência 1273-1284 da toxina do tétano (GQIGNDPNRDIL) (SEQ ID N°3).
[0035] Estes epítopos de célula-T peptídicos tipicamente se ligam em uma pluralidade de moléculas de MHC (Major Histocompatibility Complex, Complexo de Histocompatibilidade Maior) de humano e murino de classe II evitando a consequência dos problemas de restrição encontrados com a resposta de célula-T CD4+, associados com o polimorfismo das moléculas de MHC existente entre indivíduos. Além disso, o uso de peptídeos da toxina do tétano deve aumentar a imunogenicidade de antígenos presentes no conjugado da presente invenção, como resultado da vacinação de numerosos indivíduos com o toxóide do tétano.
[0036] Como outros exemplos de epítopos de célula-T peptídicos, referência pode ser feita a S. Stevanovic, “Identification of Tumour- associated T-cell epitopes for vaccine development”, Nature Reviews, Vol. 2, July 2002, p. 1 a 7; J.H. Kessler, C.J.M. Melief, “Identification of T-cell epitopes for cancer immunotherapy”, Leukemia (2007) 21, 1859-1874, ou no sítio da internet do banco de dados "Cancer immunity/peptide": http://www.cancerimmunity.org/peptide database/tumorspecific.htm.
[0037] Exemplos de epítopos de célula-T não peptídicos incluem notavelmente: - fragmentos de polissacarídeo pneumocócico de tipo 4, conjugados de oligossacarídeo-toxóide do tétano como descritos por C. C. A. M. Peeters (1991), em The Journal of Immunology, 146,4309-4314, - lipossacarídeos meningococais como descritos por A. F. M. Verheul (1991) em Detection and Immunity, vol. 59, n°10, pp. 3566-3573. Epítopos de célula-B
[0038] Como aqui usado, epítopo de célula-B significa antígenos capazes de induzir uma resposta de célula-B.
[0039] Como aqui usado, um carboidrato significa um sacarídeo, notavelmente mono-, di-, oligo-, e polissacarídeos.
[0040] Em um aspecto preferido, o resíduo de carboidrato (b) formando o epítopo de célula-B do conjugado de fórmula (I) é um resíduo de N-acetilgalactopiranosila, ou um seu derivado.
[0041] Em um aspecto específico, o resíduo de carboidrato (b) está ligado em um resíduo de aminoácido, peptídeo, ou lipídeo. Em ainda outro aspecto, o resíduo de carboidrato é um O-glicosil-aminoácido ou peptídeo. Em outro aspecto, o epítopo de célula-B está ligado na estrutura dendrimérica M(T)n via dito aminoácido ou peptídeo.
[0042] O epítopo de célula-B pode compreender um ou mais resíduos de carboidrato (b), notavelmente 1 a 10, em particular 1 a 6 resíduos de carboidrato.
[0043] Tal epítopo de célula-B pode ser selecionado dentre antígenos glicosídicos de tumor (câncer), notavelmente dentre: - a classe de glicolipídeos, incluindo glicolipídeo ácido como, por exemplo, gangliosídeos GD2, GD3 e GM3 (melanoma) e glicolipídeos neutros como, por exemplo, os antígenos Lewisy (Ley) (mama, próstata, ovário) e Globo H (mama, próstata, ovário); - a classe dos O-glicosil-peptídeos (ou aminoácidos) como, por exemplo, o antígeno Tn (a-GalNAc-ser ou a-GalNAc-Thr), o antígeno TF (β-Gal-(1-3)-α-GalNAc-ser ou β-Gal-(1-3)-α-GalNAc-Thr), dois marcadores de tumor frequentemente presentes em carcinomas mas não habitualmente em tecidos normais [Springer G. F. Science 224,1198-1206 (1984)] (ovário, mama, pulmão), ou di-Tn (a-GalNAc-ser/Thr)2, tri-Tn (a- GalNAc-ser/Thr)s ou hexa- Tn (a-GalNAc-ser/Thr)6
[0044] O epítopo de célula-B do conjugado de acordo com a presente invenção também pode se originar de polissacarídeos bacterianos capsulares de, por exemplo, Neisseria meningitis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, e do grupo Streptococcus.
[0045] Os polissacarídeos são resíduos de carboidrato obtidos por um processo sintético.
[0046] O epítopo de célula-B do presente conjugado também pode ser de origem fúngica, como por exemplo, um isolado da levedura Saccharomyces.
[0047] Em um aspecto preferido, os epítopos de célula-B do conjugado de fórmula (I) são preferencialmente marcadores de tumor, como, por exemplo, antígenos Tn e TF.
[0048] Pode ser selecionado dentre o grupo compreendendo antígenos Tn, di-Tn, tri-Tn (Tn3), hexa- Tn (Tn6), ou TF.
[0049] Em outro aspecto, B é ou compreende os resíduos de carboidrato selecionados do grupo consistindo em: - α-GalNAc, - α-GalNAc-ser, - α-GalNAc-Thr, - β-GalNAc, - β-GalNAc-ser, - β-GalNAc-Thr, - β-Gal-(1-3)-α-GalNAc-ser, - β-Gal-(1-3)-α-GalNAc-Thr, - (α-GalNAc-ser/Thr)2, - (α-GalNAc-ser/Thr)3, e - (α-GalNAc-ser/Thr)6,
[0050] Em um aspecto preferido, B é ou compreende o resíduo (α- GalNAc-ser/Thr)3, mais preferencialmente (α-GalNAc)Ser-(α-GalNAc)Thr- (α-GalNAc)Thr.
[0051] Em outra modalidade preferida, o conjugado de fórmula (I) é MAG-Tn3.
Etapa i)
[0052] O método de acordo com a presente invenção, compreende a etapa i) de acoplar um carboidrato-epítopo de célula-B (BPr) cujos grupos hidroxila do resíduo de carboidrato (b) estão protegidos com um grupo protetor (Pr), com um composto M(T)n formando deste modo um conjugado de carboidrato-epítopo de célula-T M(T- BPr)n, dito grupo protetor (Pr) sendo selecionado dentre o grupo consistindo em alila, p-metoxibenzila (PMB), t-butildimetilsilila (TBDMS), benziloximetila (BOM), levulinila (Lev), benzoíla (Bz), 2,5-difluorobenzoíla, cloroacetila, benzila (Bn) ou uma acetila (Ac), ou formar com dois grupos hidroxila no qual está ligado um C5-C6 isopropilideno-cetal ou um carbonato de C5-C6 alquila cíclica.
[0053] Em um aspecto preferido, Pr é benzila (Bn) ou acetila (Ac).
[0054] Em um aspecto específico, a etapa i) compreende as etapas de: a) Acoplar um primeiro resíduo de carboidrato protegido (bPr) cujos grupos hidroxila estão protegidos com um grupo protetor (Pr), notavelmente selecionado de benzila (Bn) ou acetila (Ac), com um composto M(T)n formando deste modo um conjugado de carboidrato-epítopo de célula- T M(T-bPr)n; e opcionalmente b) repetir a etapa a) com outros resíduos de carboidrato protegidos (bPr) até obter um conjugado de carboidrato protegido de fórmula (II) M(T-BPr)n.
[0055] Vantajosamente, tem sido demonstrado que tais grupos protetores Pr permitem o controle do acoplamento de cada um dos resíduos de carboidrato b, ou do epítopo B de célula-B, com M(T)n em etapa i). Ademais, tem sido mostrado que a remoção destes grupos protetores permite obter o produto desejado, com um ajuste melhorado entre rendimento e pureza.
[0056] Os grupos hidroxila do resíduo de carboidrato podem ser protegidos pelos grupos protetores (Pr) supracitados, notavelmente pelos grupos benzila ou acetila, de acordo com métodos convencionais.
[0057] Os epítopos de célula-B protegidos BPr ou resíduos de carboidrato protegidos (bPr) podem estar comercialmente disponíveis ou podem ser preparados a partir de matérias-primas comercialmente disponíveis e/ou de acordo com métodos convencionais.
[0058] Em um aspecto preferido, o núcleo de poli-Lisina dendrimérico M e, portanto o bloco de construção M(T)n subsequente é imobilizado sobre um suporte sólido, permitindo desta forma a síntese iterativa de peptídeo em fase sólida.
[0059] Como um exemplo de suporte sólido, menção pode ser feita à resina de poliestireno funcionalizada com p-benziloxibenzil-álcool (resina Wang) na qual grupos Fmoc-β-Ala- podem ser então enxertados ou aqueles vendidos sob o nome comercial Fmoc-β-Ala-TentaGel R Trt. O núcleo M pode ser notavelmente ligado via um resíduo β-Ala-OH. A razão de substituição da resina, i.e. a razão de enxertadura da resina pelos grupos Fmoc-β-Ala- pode variar de 0,2 a 0,05 mmol/g, preferencialmente de 0,10 a 0,13 mmol/g.
[0060] Em um aspecto específico, bPr é um O-glicosil-aminoácido ou peptídeo protegido. O O-glicosil-peptídeo protegido pode ser acoplado no bloco de construção M(T)n por introdução sucessiva dos resíduos de O- glicosil-aminoácido constitutivos protegidos bPr.
[0061] Sob esse aspecto, a síntese de peptídeo e glicopeptídeo em fase sólida pode ser realizada usando o protocolo de química de Fmoc padrão [5] e [6]. N-a-Fmoc-aminoácidos e aminoácidos ou peptídeos glicosilados são incorporadas em etapas na cadeia peptídica.
[0062] Desta forma, a etapa i) pode ser realizada pela reação de um primeiro N-a-Fmoc-O-glicosil-aminoácido protegido bPr com o bloco de construção M(T)n. Mais especificamente, o grupo carboxílico (COOH) do primeiro O-glicosil-aminoácido bPr é reagido com a extremidade NH2 de cada uma das ramificações T, formando deste modo uma ligação peptídica covalente
Figure img0009
.
[0063] O Fmoc é clivado, por exemplo, na presença de 20% de piperidina em DMF ou NMP. Então um segundo N-α-Fmoc O-glicosil- aminoácido protegido bPr pode ser similarmente reagido com o grupo NH2 do primeiro resíduo de aminoácido protegido, e assim por diante.
[0064] Desta forma, quando o epítopo de célula-B compreende vários resíduos de carboidrato (b), a etapa i) do método, de acordo com a invenção, pode compreender a etapa de repetir o acoplamento de acordo com a etapa a) até obter o conjugado de carboidrato epítopo de célula-T M(T-BPr)n.
[0065] Estes acoplamentos de peptídeo podem ser realizadas em um solvente aprótico como DMF ou NMP, na presença de agentes de acoplamento como HATU e DIPEA ou DIC/HOBt, e PiBOP.
Etapa ii)
[0066] Em um aspecto específico, Pr é benzila. Neste caso, a etapa de desproteção ii) pode ser realizada na presença de TfOH ou por hidrogenação catalítica.
[0067] Em um aspecto específico, a etapa ii) é uma hidrogenação catalítica.
[0068] Em um aspecto preferido, a hidrogenação catalítica é realizada na presença de Pd/C, notavelmente de Pd 10%/C (% p/p), como um catalisador. A razão em peso do conjugado de fórmula (II)/catalisador pode variar de 10/2 a 10/10, e é preferencialmente de cerca de 10/8. O catalisador pode ser adicionado em etapas durante um período longo.
[0069] A hidrogenação catalítica é preferencialmente realizada em NMP/H2O, notavelmente em uma razão em volume de 87,5/12,5, como um solvente.
[0070] A reação de hidrogenação catalítica é preferencialmente realizada em uma temperatura variando de 20 a 40 °C, em particular a cerca de 37°C.
[0071] A reação de hidrogenação catalítica é preferencialmente realizada sob uma pressão variando de 100 kPa a 1.000 kPa, mais preferencialmente a cerca de 500 kPa.
[0072] Em outro aspecto, a etapa ii) é realizada na presença de TfOH.
[0073] Preferencialmente, o conjugado de fórmula (II) é reagido com TfOH, na presença de TFA, DMS e m-cresol. A razão relativa de TfOH/TFA/DMF/m-cresol pode ser de 1/5/3/1 v/v/v/v.
[0074] Em outro aspecto, o grupo protetor Pr é acetila.
[0075] A desproteção de grupos protetores acetila em etapa ii) é preferencialmente realizada na presença de hidrazina, em um solvente polar prótico, por exemplo um álcool como metanol. Esta reação pode ser realizada na temperatura ambiente, i.e. entre 15°C e 25°C.
[0076] A razão molar de hidrazina relativa ao composto de fórmula (II) pode variar de 100 a 1.500 equivalentes molares.
[0077] A desproteção de acetila pode ser alternativamente realizada na presença de MeONa, notavelmente em MeOH como um solvente, na temperatura ambiente, i.e. entre 15°C e 25°C.
[0078] Em um aspecto específico, quando imobilizado em um suporte sólido, o conjugado de fórmula (II) obtido no término de etapa i) é preliminarmente clivado do suporte sólido, antes da realização da desproteção na etapa ii). Tal clivagem pode ser realizada na presença de TFA e TIS em água, por exemplo, com a seguinte razão em volume 95/2,5/2,5 v/v/v.
Etapa iii)
[0079] O método de acordo com a invenção pode adicionalmente compreender uma etapa iii) subsequente à etapa ii) consistindo em uma ou mais etapas de purificação, notavelmente por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC, reverse phase high-performance liquid chromatography).
Etapa iv)
[0080] O método de acordo com a invenção pode adicionalmente compreender uma etapa iv) subsequente de recuperar o produto. Síntese de M(T)n
[0081] Em um aspecto específico, o método de acordo com a invenção adicionalmente compreende a etapa de preparar o conjugado M(T)n.
[0082] Em uma modalidade específica, o conjugado M(T)n é preparado partindo-se do núcleo de poli-Lisina dendrimérico e pela introdução em etapas de resíduos de aminoácido N-protegidos constituindo o epítopo de célula-T peptídico. Os resíduos de aminoácido N-protegidos são notavelmente resíduos de Fmoc-aminoácido.
[0083] Os acoplamentos de aminoácido podem ser realizadas em um solvente aprótico polar como DMF, na presença de um ou mais reagentes de acoplamento de peptídeo como DIC, HOBt, PiBOP, HATU ou DIPEA. As combinações (DIC/HOBt e PiBOP) ou alternativamente (HATU/DIPEA) são particularmente preferidas. Reagentes de acoplamento alternativos são descritos em E. Valeur; M. Bradley, Chem. Soc. Rev. (2009) 38, 606; A. El- Faham et al. Chem. Eur. J. (2009) 15, 9404 ou R. Subiros-Funosas et al. Org. Biomol. Chem. (2010) 8, 3665.
[0084] Após o acoplamento de cada peptídeo, os grupos protetores de N-aminoácido são removidos. Como um exemplo, os grupos protetores Fmoc podem ser removidos na presença de piperidina em um solvente polar aprótico como DMF.
[0085] No que diz respeito à síntese do fragmento de peptídeo SEQ ID n°1 os resíduos de aminoácido AA9-10 e AA15-16 podem ser incorporados como dipeptídeos de pseudo-prolina. Vantajosamente, a incorporação de tais dipeptídeos demonstrou uma influência significativa sobre a qualidade bruta do produto. Síntese de M
[0086] Em um aspecto específico, o método de acordo com a invenção adicionalmente compreende a etapa de preparar um núcleo de poli- Lisina dendrimérico M.
[0087] O núcleo de poli-Lisina dendrimérico M pode ser preparado de acordo com o método descrito em patente US de número US 6,676,946. Conjugado de carboidrato-epítopo de célula-T M(T-B)n
[0088] Em outro aspecto, a presente invenção vantajosamente fornece um conjugado de carboidrato-epítopo de célula-T M(T-B)n que tem um grau de pureza de > 95% obtenível de acordo como método da invenção.
[0089] Tal grau de pureza pode ser obtido pela realização de uma purificação em etapa (iii) após a etapa (ii), notavelmente uma cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC). Como um exemplo, RP-HPLC pode ser realizada com uma coluna de granulometria baixa, notavelmente tendo uma granulomeria inferior a 15 μm, notavelmente de cerca d 10 μm ou inferior a 5 μ e/ou tendo um tamanho de poro de cerca de 300 Â (30,0 nm) ou menor, notavelmente menor do que 200 Â (20,0 nm), em particular menor do que 100 Â (10,0 nm). A fase estacionária pode ser uma fase reversa à base de sílica enxertada com grupos octadecila (também chamada de sílica C18). A eluição pode ser realizada com água (0,1% de TFA)/acetonitrila com um gradiente raso, por exemplo de 70/30 a 60/40 durante um período de cerca de 20 minutos.
[0090] O grau de pureza do conjugado de fórmula (I) pode ser determinado por qualquer método convencional, notavelmente por RP-HPLC.
[0091] A pureza é preferencialmente > 96%, notavelmente > 98%, e vantajosamente > 99%. Conjugado de carboidrato-epítopo de célula-T M(T-Bpr)n
[0092] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um conjugado de carboidrato-epítopo de célula-T de fórmula (II):
Figure img0010
[0093] No qual: - M é um núcleo de poli-Lisina dendrimérico; - T é um epítopo de célula-T, preferencialmente compreendendo um resíduo de peptídeo; - BPr é um carboidrato- epítopo de célula-B protegido compreendendo pelo menos um resíduo de carboidrato (b) cujos grupos hidroxila estão protegidos por um grupo Pr, dito grupo Pr sendo selecionado dentre o grupo consistindo em alila, p-metoxibenzila (PMB), t-butildimetilsilila (TBDMS), benziloximetila (BOM), levulinila (Lev), benzoíla (Bz), 2,5-difluorobenzoíla, cloroacetila, benzila (Bn) ou uma acetila (Ac), - u formar com dois grupos hidroxila no qual está ligado um C5-C6 isopropilideno-cetal ou um carbonato de C5-C6 alquila cíclica; e - n é um número inteiro e representa o número de grupos - T-B covalentemente ligados em M.
[0094] Em um aspecto específico, BPr é um
Figure img0011
protegido.
[0095] Em um aspecto adicional, Pr é benzila ou acetila.
[0096] Em um outro aspecto,
Figure img0012
.
[0097] Em outro aspecto, T é QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID N°1).
[0098] Em outro objetivo, a invenção fornece o uso de um conjugado de carboidrato-peptídeo
Figure img0013
para preparar um conjugado de carboidrato-peptídeo
Figure img0014
sendo como definido acima.
[0099] Outros aspectos da invenção se tornarão evidentes no curso das seguintes descrições de modalidades exemplares. Estes exemplos são fornecidos para ilustração da invenção e não são intencionados para limitá-la. Figuras
[00100] Figura 1: Síntese de MAG-Tn3 de acordo com o protocolo A do método da invenção. Os equivalentes molares são indicados em relação ao grupo amino. Os AA9-10 e AA15-16 são incorporados como dipeptídeos de pseudo-Pro.
[00101] Figura 2: Síntese de MAG-Tn3 de acordo com o protocolo B do método da invenção. Os equivalentes molares são indicados em relação ao grupo amino. Os AA9-10 e AA15-16 são incorporados como dipeptídeos de pseudo-Pro.
Abreviações
[00102] AA aminoácido
[00103] Ac acetila
[00104] AcOH ácido acético
[00105] Bn benzila
[00106] Boc terc-butoxicarbonila
[00107] tBu terc-butila
[00108] DIC N,N’-diisopropilcarbodiimida
[00109] DIPEA diisopropiletilamina
[00110] DIPE diisopropiléter
[00111] DMAP 4-dimetilaminopiridina
[00112] DMF dimetilformamida
[00113] DMS sulfeto de dimetila
[00114] DVB divinilbenzeno
[00115] EtOH etanol
[00116] FA ácido fórmico
[00117] Fmoc 9-fluorenilmetoxicarbonila
[00118] HATU hexafluorofosfato de 2-(1H-9-azabenzotriazol-1-il)- 1,1,3,3-tetrametilurônio
[00119] HOBt N-hidroxibenzotriazol
[00120] HPLC/MS cromatografia líquida de alta eficiência/espectroscopia de massas
[00121] MAG glicopeptídeo multiantigênico
[00122] MeOH metanol
[00123] MeONa metilato de sódio
[00124] ESMS espectroscopia de massas com ionização por eletroaspersão
[00125] PM peso molecular
[00126] NMP N-metilpirrolidona
[00127] RMN ressonância magnética nuclear
[00128] PiBOP hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris- pirrolidino-fosfônio
[00129] RP-HPLC cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa
[00130] RT temperatura ambiente
[00131] SELDI-TOF MS "surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry", espectroscopia de massas de tempo-de-voo com ionização/dessorção a laser intensificada por superfície-com utilização de uma placa de afinidade bioquímica
[00132] TBS terc-butildimetilsilila
[00133] TFA acético trifluoroácido
[00134] TfOH ácido trifluorometanossulfônico
[00135] THF tetra-hidro-furano
[00136] TIS triisopropilsilano
[00137] TMSBr brometo trimetilsilila
[00138] Trt tritila
Exemplos: Exemplo 1: Preparação de MAG-Tn3 via protocolos A e B Métodos gerais
[00139] A síntese de 6 foi realizada em etapas em fase sólida usando química de Fmoc. Os grupos protetores de cadeia lateral de aminoácido usados foram Trt em Gln e Asn, Boc nas Lys7 e Lys11, tBu em Tyr, Ser e Thr, OtBu em Glu. Para as Lys19 e Lys20, os grupos protetores foram Fmoc.
[00140] Os teores de peptídeo puro foram determinados por análise de nitrogênio ou análise quantitativa de aminoácido usando um analisador Beckman 6300 após a hidrólise dos compostos com HCl 6N a 110°C durante 20h.
[00141] As análises por HPLC/MS foram realizadas em um sistema Alliance 2695 acoplado em um detector UV 2487 (220 nm) e em um espectrômetro Q-TofmicroTM (Micromass) com uma fonte de ionização por eletroaspersão (modo positivo) (Waters). As amostras foram esfriadas para 4°C no autoamostrador. O gradiente linear foi realizado com acetonitrila + 0,025% de FA (A)/água + 0,04% de TFA + 0,05% de FA (B) durante 20 min. A coluna foi uma coluna Zorbax 300SB C18 (3,5 μm, 3 mm x 150 mm) (Agilent) (gradiente 13-53% de A) ou uma coluna XBridgeTM BEH130 C18 (3,5 μm, 2,1 mm x 150 mm) (Waters) (gradiente 15-40% de A). A temperatura da fonte foi mantida a 120°C e a temperatura de desolvatação a 400°C. A voltagem de cone foi 40V.
[00142] As análises por ESMS foram registradas no modo positivo por infusão direta no mesmo espectrômetro de massas. As amostras foram dissolvidas em concentração de ~5μM em água/acetonitrila (1/1) com 0,1% de ácido fórmico.
[00143] As análises por SELDI-TOF foram realizadas em um espectrômetro de massas PCS 4000 (Bio-Rad Labs). As superfícies de arranjo de H4 ProteinChip foram ativadas com 1 μL de CH3CN. Manchas foram incubadas com a mistura de reação (2,5 μL, 1 mg/mL) em uma caixa na RT durante 20 min. Foram então lavadas com o tampão de reação (3x1min) e H2O (3x1min). A matriz (2 x 0,6μL de ácido sinapínico saturado em CH3CN 50%/TFA 0,5%) foi aplicada sobre cada mancha e permitida secar ao ar. Os espectros foram gerados de cada mancha de arranjo com um ajuste de laser de ~3 μJ. O instrumento foi externamente calibrado com ubiquina bovina, citocromo C bovino, β- lactoglobulina com a matriz e os ajustes como descrito acima.
[00144] A pureza de 6 foi analisada por RP-HPLC usando um sistema de bomba Agilent 1200 com um detector UV a 220 nm. A coluna foi uma coluna Zorbax 300SB C18 (3,5 μm, 3 mm x 150 mm) (Agilent) e o gradiente foi realizado com acetonitrila + 0,1% de TFA (A)/água + 0,1% de TFA (B) durante 40 min., de 13 a 53% de A (0,8 mL/min., tempo de retenção de 20,5 min.).
[00145] Os equivalentes molares de todos os reagentes são indicados em relação aos grupos amino. As quantidades molares dos intermediários protegidos 4 e 5 são calculadas com base na substituição de Fmoc-β-Ala- resina 1 inicial. Os rendimentos totais (Tabela) incluem todas as etapas de síntese a partir de 1. Foram calculados com base na quantidade de peptídeo puro do produto final 6 a partir da substituição em Fmoc-β-Ala-resina 1. Protocolo A (Figura 1) Fmoc-β-Ala-Resma (resina pouco substituída) 1
[00146] 2 g de p-benziloxibenzil-álcool-resina (resina Wang, 0,91 mmol/g, de granulometria (mesh) 100-200, matriz de polímero: copoli(estireno-1% de DVB), Novabiochem) foram inchados em DMF (Applied Biosystems) durante 1h em um frasco de fundo redondo seco. 311 mg (1 mmol) de Fmoc-β-Ala-OH seco (Novabiochem, Merck Chemicals Ltd) foram dissolvidos em 8 mL de CH2Cl2 anidro (Acros). Quatro gotas de DMF foram adicionadas para completar a dissolução. Após a adição de 77μL (0,5mmol) de DIC (Fluka), a mistura de reação foi agitada durante 20min sob argônio, na temperatura ambiente. A mistura de reação foi evaporada até a secura e o evaporador rotativo foi aberto sob argônio. O resíduo foi dissolvido no volume mínimo de DMF (6 mL) e a solução foi adicionada na resina. 6 mg (0,05 mmol) de DMAP (Acros) dissolvidos em 0,5 mL de DMF foram adicionados e a suspensão foi agitada cuidadosamente durante 2 h na temperatura ambiente.
[00147] A razão de substituição na resina foi medida por análise por UV de uma amostra de resina de acordo como seguinte procedimento. 2 a 6 mg de resina foram transferidos com uma pipeta Pasteur para um funil de vidro sinterizado pequeno. A resina foi lavada com DMF, CH2Cl2 (Carlo Erba) e seca. A resina foi transferida para uma célula de UV, precisamente pesada e então adicionada com 2,8 mL de piperidina 20% (Aldrich) em DMF. A suspensão foi agitada com o auxílio de uma pipeta Pasteur durante 2min. A absorbância foi lida a 300,5 nm (ε = 7.800) com a célula de referência contendo piperidina 20% em DMF. A extensão de carregamento verificada foi de 0,1 mmol/g.
[00148] A resina foi lavada três vezes com DMF. Os grupos hidroxila residuais foram bloqueados usando o seguinte protocolo. A resina foi ressuspensa em 13 mL de DMF. Foram adicionados 1,55 mL (16,4 mmols) de Ac2O (Sigma) em 1 mL de DMF, e então 660 mg (5,41 mmols) de DMAP em 1 mL de DMF. Após agitação suave durante 30 min. na temperatura ambiente, a suspensão foi filtrada em um funil de vidro sinterizado, sucessivamente lavada três vezes com DMF, três vezes com CH2Cl2 e então seca durante a noite em um dissecador. A resina 1 foi armazenada a 4°C.
Figure img0015
[00149] O peptídeo tetravalente foi sintetizado a partir de 250 mg (25 μmols) de Fmoc-β-Ala-resina 1 em um sintetizador de peptídeo Applied Biosystems sintetizador de peptídeo 433A usando a química de Fmoc. O protocolo de síntese padrão de Applied foi seguido exceto uma etapa adicional de lavagem após cada etapa de acoplamento. Resumidamente, os grupos Fmoc foram removidos com piperidina 22% em NMP (Applied Biosystems) e a desproteção foi monitorada por condutividade. O núcleo de lisina foi construído por acoplamento sucessiva de dois níveis de Fmoc- Lys(Fmoc)-OH (Applied Biosystems) (1o ciclo: 40eq, 2o ciclo: 20eq) usando HATU (Applied Biosystems) (1o ciclo: 40eq, 2o ciclo: 20eq)/DIPEA (Applied Biosystems) (1o ciclo: 80eq, 2o ciclo: 40eq) como reagentes de acoplamento e NMP como solvente (Nota: o uso deste excesso muito elevado de reagentes não deve ser necessário para a eficiência da reação e é apenas devido ao fato de que os cartuchos pré-empacotados estão cheios com 1 mmol de aminoácido). Uma introdução em etapas dos aminoácidos Fmoc-protegidos subsequentes (Applied Biosystems, 10eq/amina) trazendo os grupos protetores de cadeia lateral padrão foi realizada com HATU (10eq/amina)/DIPEA (20eq/amina) em NMP. Os AA em posições 15-16 e 910 foram incorporados como, respectivamente, Fmoc-Ile-Thr(¥Me,Mepro)-OH e Fmoc-Asn(Trt)-ser(¥Me,Mepro)-OH (10eq/amina) (Novabiochem, Merck Chemicals Ltd) com HATU (10eq/amina) e DIPEA (20eq/amina).
Figure img0016
[00150] Partindo-se de 2 (25 μmols), os blocos de construção glicosilados forma incorporados manualmente: Fmoc-T(α-D- GalNAc(OBn)3)-OH (Ficher Chemicals AG) (1o ciclo), Fmoc-T(α-D- GalNAc(OBn)3)-OH (2o ciclo) e Fmoc-S(α-D-GalNAc(OBn)3)-OH (Ficher Chemicals AG) (3o ciclo). Resumidamente, o bloco de construção seco (0,3 mmol, 3eq/grupo amino livre) foi dissolvido na quantidade mínima de DMF (~2 mL). Uma solução de 55 mg (0,145 mmol) de HATU (Novabiochem) em 0,5 mL DMF foi adicionada e a mistura resultante foi adicionada na resina. Após a adição de 52 μL (0,3 mmol) de DIPEA (Aldrich), a suspensão foi mecanicamente agitada. As três etapas de acoplamento foram monitoradas pelo teste de Kaiser [1] e foram completadas, respectivamente, em 1h, 1h e 1h. Após cada uma das etapas de acoplamento, a resina foi lavada com DMF (quatro vezes). Todas as clivagens de Fmoc foram realizadas pelo tratamento da resina com piperidina 20% em DMF. Após cada desproteção, a resina foi sucessivamente lavada com DMF (seis vezes), CH2Cl2 (seis vezes), e DMF (seis vezes). No final da síntese, a resina foi extensivamente lavada com DMF e CH2Cl2, e seca em um dessecador. 10mL de TFA (Applied Biosystems)/água/TIS (Acros) (95/2,5/2,5 v/v/v) foram adicionados na resina a 4°C e a mistura foi agitada durante 1h e 30 min. na temperatura ambiente. Após a filtração da resina, a solução foi concentrada e o produto bruto foi precipitado com dietil-éter. Após a centrifugação, a pelota foi dissolvida em água e liofilizada para dar 229 mg do glicopeptídeo 5 bruto.
Figure img0017
[00151] A partir de 5,
[00152] - Com TfOH [2-4] 200 mg (0,014 mmol) de 5 foram dissolvidos em 2,96 mL de TFA, 1,78 mL de DMS (Sigma-Aldrich) e 587μL de meta-cresol (Sigma- Aldrich) na RT. A solução foi esfriada para -10°C e 587μL de TfOH (Fluka) foram adicionados e a mistura foi agitada durante 1h e 15 min. a -10°C (TfOH/TFA/DMS/m-cresol 1/5/3/1 v/v/v/v). O produto foi precipitado com dietil-éter e, após a centrifugação, a pelota foi dissolvida em água e liofilizada para dar 372 mg do glicopeptídeo bruto. O produto foi dissolvido em 7,7 mL de tampão acetato de amônio 0,05 M e o pH foi ajustado para 7 com amônia 1 M. Após 1h na temperatura ambiente, a solução foi liofilizada para dar 412 mg do produto bruto. O produto foi purificado por RP-HPLC usando um sistema de bomba Agilent 1200 com um detector de UV a 230nm. A coluna foi uma coluna Zorbax C18 (5 μm, 300Â (30,0 nm), 9,4 mm x 250 mm) (Agilent) e o gradiente foi realizado com água (0,1% de TFA)/acetonitrila durante 20min, de 73/27 a 60/40. A purificação deu 3,9 mg (quantidade de peptídeo puro) de 6 com pureza de 95,90%. O rendimento total é 1,6%. Protocolo B (Figura 2)
Figure img0018
[00153] Até a incorporação de Tyr5, o peptídeo tetravalente foi sintetizado a partir de 36,9 g (4,8 mmols) de resina Fmoc-β-Ala-Tentagel R Trt 1 (0,13 mmol/g) (Rapp Polymere) em um sintetizador de peptídeo manual equipado com um reator Schmizo. Antes do processo de alongamento, a resina foi inchada em DMF durante 2 a 3 horas e foi lavada com 240 mL de DMF (três vezes, 2 min./ciclo). Após cada acoplamento, os grupos Fmoc foram removido com piperidina 20% em 240 mL de DMF (três etapas, 20 min. cada). No caso de Glu17, Asn9 e Gln4, 2% HOBt foi adicionado na solução de desproteção. Após cada desproteção, a resina foi sucessivamente lavada com 240 mL de DMF (4 vezes, 2min/ciclo), 240m L de HOBt 2% em DMF (duas vezes, 5min/ciclo), e 240 mL de DMF (duas vezes, 2min/ciclo).
[00154] Os acoplamentos de aminoácido (1,5 a 2eq/amina) foram realizadas em DMF (111 mL) na temperatura ambiente com DIC/HOBT (1,5 a 2eq cada/amina) (veja detalhes abaixo). Os AA em posições 15-16 e 9-10 foram incorporados como, respectivamente, Fmoc-Ile-Thr(¥Me,Mepro)-OH e Fmoc-Asn(Trt)-ser(¥Me,Mepro)-OH. Após 30min, uma porção nova de DIC (1,5 a 2eq) foi adicionada na mistura de reação. As etapas de acoplamento foram monitoradas pelo teste de Kaiser [1]. De Leu18 a Ser1, após acoplamento de 1h com DIC/HOBT (em quantidade igual), o reagente PiBOP foi adicionado (veja detalhes abaixo) e o pH foi ajustado para 7 por adição em gotas de DIPEA. Após 30 min., a resina foi lavada com 240 mL de DMF (5 vezes, 2 min./ciclo) e uma etapa de acetilação foi realizada de Leu18 a Thr2. A acetilação foi realizada na temperatura ambiente com anidrido acético (1eq/amina) na presença de piridina (1eq/amina) em 111 mL de DMF. Após 20 min., a resina foi lavada com 240 mL de DMF (6 vezes, 2 min./ciclo). Após a incorporação de Tyr5, a resina foi extensivamente lavada com 240 mL de DMF (8 vezes, 2 min./ciclo) e 240 mL de CH2Cl2 (8 vezes, 2 min./ciclo), antes da secagem.
[00155] Após a incorporação de Tyr5, a montagem foi realizada em uma escala de 0,15 mmol ou em uma escala de 4,65 mmols usando o mesmo protocolo e deu a peptídeo-resina 2 para, respectivamente, 4 e 5.
Figure img0019
Figure img0020
[00156] A síntese foi realizada a partir de 2 (0,15 mmol) como previamente descrito para 2. As etapas de acoplamento foram realizadas com os seguintes blocos de construção de AA [5] e reagentes.
Figure img0021
[00157] No término da síntese, a glicopeptídeo-resina (0,15 mmol) foi suspensa em TFA/TIS/H2O (95/2,5/2,5 v/v/v) (10mL/g de glicopeptídeo- resina) e agitada durante 1h a 20°C ± 2°C. Após a filtração, a resina foi lavada duas vezes com a mesma mistura de TFA (2mL/g de glicopeptídeo-resina por lavagem). Os filtrados e as lavagens foram reunidos e agitados durante mais 30min a 20°C ± 2°C. Após a concentração (temperatura do banho < 35°C), o produto bruto foi precipitado com DIPE (~35mL/g de glicopeptídeo-resina). Após as filtração e lavagem com DIPE, o sólido foi seco (t°<30°C) e deu 750 mg de 4 bruto.
[00158] ESMS: 12.409,589 (C553H855N107O213 calculado 12.410,465)
Figure img0022
[00159] A síntese foi realizada a partir de 2 (4,65 mmols) como previamente descrito para 2. As etapas de acoplamento foram realizadas com os seguintes blocos de construção de AA (Ficher Chemicals AG) e reagentes. No término da síntese, foram obtidos 84,87 g de glicopeptídeo-resina.
Figure img0023
Figure img0024
[00160] A glicopeptídeo-resina (20 g, 1,096mmols) foi testada como previamente descrito para 4 e deu 9,95 g de 5 bruto.
[00161] ESMS: 14.141,433 (C733H999N107O177 calculado14.141,610)
[00162] Nota: Este protocolo deu um composto bruto comparável àquele obtido de acordo com protocolo A, i.e. partindo-se de Fmoc-β-Ala-p- benziloxibenzil-álcool-resina (resina Wang) (veja acima).
Figure img0025
[00163] A partir de 4
[00164] - Com Hidrazina [7] 100 mg (20 μmols) de 4 foram dissolvidos em 3,2 mL de MeOH. 567 μL (11,3 mmols) de hidrazina mono-hidratada foram adicionados e a solução foi agitada na temperatura ambiente. Após 2h e 30 min., a solução foi esfriada para 0°C e 3,2 mL de acetona foram adicionados. Após 1h, a solução foi concentrada e codestilada cinco vezes com acetona. O glicopeptídeo bruto foi liofilizado para dar 117 mg. O produto foi purificado por RP-HPLC usando um sistema de bomba Agilent 1200 com um detector de UV a 230 nm. A coluna foi uma coluna Zorbax C18 (5 μm, 300Â (30,0 nm), 9,4 mm x 250 mm) (Agilent) e o gradiente foi realizado com água (0,1% de TFA)/acetonitrila durante 20 min., de 72/28 a 62/38. A purificação deu 5,8 mg (quantidade de peptídeo puro) de 6 com pureza de 96,4%. O rendimento total é 2,7%.
[00165] - Com MeONa 24 mg (4,8 μmols) de 4 foram dissolvidos em 3,2 mL de MeOH. O pH foi ajustado para 14 (medidor de pH, papel de pH úmido ~10,5) com MeONa 1% em MeOH e a solução foi agitada na RT. A reação foi monitorada por RP-HPLC. Após 2h, a reação é inativada com gelo seco e evaporada até a secura. O peptídeo bruto foi dissolvido em TFA aquoso 1% e liofilizado. O produto foi purificado por RP-HPLC usando um sistema de bomba Agilent 1200 com um detector de UV a 230 nm. A coluna foi uma coluna Kromasil C4 (5 μm, 100Â (10,0 nm), 10 mm x 250 mm) (AIT) e o gradiente foi realizado com TFA aquoso 0,1% (VWR)/acetonitrila (Carlo Erba) durante 30 min, de 73/27 a 62/38. A purificação deu 754 μg (quantidade de peptídeo puro) de 6 com pureza de 91,4%. O rendimento total é 1,4%.
[00166] A partir de 5,
[00167] - Com H2 10g (1,1 mmols) de 5 foram dissolvidos em 800 mL de NMP/H2O 87,5/12,5. Após a adição de 4 g de Pd 10%/ C tipo 39 (Johnson Matthey), a reação foi agitada a 37°C e 500 kPa durante 170 h. Duas quantidades adicionais de catalisador foram adicionadas em porções após 7h (2g) e 120 h (2g). No término da reação, o catalisador foi filtrado sobre celite e lavado com NMP/H2O 87,5/12,5. O filtrado resultante foi reunido com os outros filtrados obtidos de reação similar (1,35 mmols no total). Após diluição com H2O (até NMP/H2O 10/90), os filtrados foram purificados por RP-HPLC em duas etapas. A purificação primária foi realizada em uma coluna Vydac C18(300Â (30,0 nm), 10-15 μm, 50 mL/min.) com TFA/H2O/CH3CN 0,1/94,9/5,0 v/v/v (A) e com TFA/H2O/CH3CN 0,1/49,9/50,0 v/v/v (B). O gradiente foi 0% de B durante 15min, 0-40% de B durante 5min, 40-80% de B durante 60 min. A purificação secundária foi realizada em uma coluna Vydac C18 (300Â (30,0 nm), 10-15 μm, 50 mL/min) com AcOH/H2O/CH3CN 0,5/94,5/5,0 v/v/v (A) e com AcOH/H2O/CH3CN 0,5/49,5/50,0 v/v/v (B). O gradiente foi 0% de B durante 15min, 0-20% de B durante 5min, 20-60% de B durante 60 min. Após a concentração por RP-HPLC em uma coluna Daisogel SP-300-10-ODS-AP (20 mL/min., isocrático TFA/H2O/CH3CN 0,1/49,9/50,0 v/v/v), a solução foi evaporada em um evaporador rotativo e liofilizada para dar 225 mg (quantidade de peptídeo puro) de 6 com pureza de 95,3%. O rendimento total é 1,5%.
[00168] ESMS: 10.897,387 (C481H783N107O177 calculado 10.897,123) Conclusão Os resultados obtidos são resumidos na tabela a seguir:
Figure img0026
[00169] Comparado com a síntese inicial usando blocos de construção em síntese (síntons) de carboidrato não protegidos (Figuras 1 e 2), o processo novo (envolvendo carboidratos protegidos, II, Figuras 1 e 2) permite: - minimizar a síntese de subprodutos - aperfeiçoar a repetibilidade de processo - aumentar a escala da síntese em uma maneira repetível
[00170] Dentre os protocolos testados no processo novo (Tabela, Figuras 1 e 2), surgem três estratégias melhores: Ac/Hidrazina, Bn/TfOH e Bn/H2 (método de grupo protetor/desproteção) (Tabela). Todas deram o MAG-Tn3 com uma pureza >95%, em uma maneira repetível.
[00171] O método de Bn/TfOH deu o MAG-Tn3 com um rendimento total de 1,6%. Este método se baseia em um ajuste entre desproteção e degradação completas. Alternativamente, o método Bn/H2 deu o MAG-Tn3 com rendimento similar (1,5%) e, o mais importante, o processo tem sido validado em uma escala de 225 mg. Finalmente o método de Ac/hidrazina deu o rendimento mais alto (2,7%, em comparação com 1,6% e 1,5%).
[00172] Um MAG-Tn3 baseado em outro peptídeo (PV=KLFAVWKITYKDT) (SEQ ID N°4) também tem sido preparado de acordo com o método da invenção (Ac/Hidrazina, Bn/TfOH).) Exemplo 2: Influência da razão de substituição na resina e da natureza da fase estacionária usada para a purificação de MAG-Tn3
[00173] MAG-Tn3 foi preparado de acordo com protocolo B a partir de uma resina de poliestireno funcionalizada com Fmoc-β-Ala (vendida sob o nome comercial Fmoc-β-Ala-TentaGel R Trt), com duas razões de substituição diferentes: 0,13 ou 0,1 mmol/g (a saber o número de grupos Fmoc-β-Ala enxertados em relação ao peso da resina não enxertada).
[00174] A purificação do MAG-Tn3 bruto foi então realizada por RP- HPLC em três fases estacionárias distintas (fase reversas) com base em sílica- gel enxertada com grupos octadecila, a saber Vydac®, Jupiter® e Daisogel®. A purificação primária foi realizada com TFA/H2O/CH3CN 0,1/94,9/5,0 v/v/v (A) e com TFA/H2O/CH3CN 0,1/49,9/50,0 v/v/v (B). O gradiente foi 0% de B durante 15 min., 0-40% de B durante 5 min., 40-80% de B durante 60min. A purificação secundária foi realizada com AcOH/H2O/CH3CN 0,5/94,5/5,0 v/v/v (A) e com AcOH/H2O/CH3CN 0,5/49,5/50,0 v/v/v (B). O gradiente foi 0% de B durante 15 min., 0-20% de B durante 5min, 20-60% de B durante 60min.
[00175] Os resultados são relatados na tabela a seguir.
Figure img0027
a Peso de pó b Análise por RP-HPLC: Zorbax 300SB C18 (3,5 μm, 3 mm x 150 mm, Agilent), A: acetonitrila + 0,1% de TFA, B: H2O + 0,1% de TFA, 15-53% de A (40 min). c O rendimento inclui todas as etapas de síntese a partir de Fmoc-β-Ala-resina e foi calculado com base na quantidade de peptídeo puro do produto final.
[00176] Vydac® C18, 300À (30,0 nm), 10-15 μm (Grace), ref 218MSB1015 ou 218TPB1015 ou 238TPB1015
[00177] Jupiter® C18, 300 À (30,0 nm), 10 μm (Phenomenex), ref 04G-4055
[00178] Daisogel® C18, 300 À (30,0 nm), 10 μm (Daiso), ref SP-300- 10-ODS-RPS
[00179] Estes resultados demonstram que tanto os rendimentos do processo de preparação dos conjugados de acordo com a invenção, quanto à pureza dos conjugados obtidos podem ser elevadamente aperfeiçoados pela redução da razão de substituição da resina e/ou pelo uso de uma fase estacionária apropriada.
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Claims (24)

1. Método para preparar um conjugado de carboidrato-epítopo de célula-T de fórmula (I):
Figure img0028
na qual: - M é um núcleo de poli-Lisina dendrimérico; - T é um epítopo de célula-T; - B é um carboidrato-epítopo de célula-B compreendendo um resíduo de carboidrato (b); - n é um número inteiro e representa o número de grupos - T-B covalentemente ligados em M; caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: - ) acoplar um carboidrato-epítopo de célula-B (BPr) cujos grupos hidroxila do resíduo de carboidrato (b) estão protegidos com um grupo protetor (Pr), com um composto M(T)n formando deste modo um conjugado de carboidrato-epítopo de célula-T M(T- BPr)n, dito grupo protetor (Pr) sendo selecionado dentre o grupo consistindo em alila, p- metoxibenzila (PMB), t-butildimetilsilila (TBDMS), benziloximetila (BOM), levulinila (Lev), benzoíla (Bz), 2,5-difluorobenzoíla, cloroacetila, benzila (Bn) ou uma acetila (Ac), ou formar com dois grupos hidroxila no qual está ligado um C5-C6 isopropilideno-cetal ou um carbonato de C5-C6 alquila cíclica; e - i) remover os grupos protetores Pr do conjugado obtido M(T- BPr)n para obter deste modo o conjugado de carboidrato epítopo de célula-T M(T-B)n.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que M(T-B)n é selecionado dentre as seguintes fórmulas (Ia) ou (Ib):
Figure img0029
em que: K é um resíduo de lisina, e T e B são como definidos na reivindicação 1.
3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que M é (K)2K-βAla-OH de fórmula:
Figure img0030
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que T é um epítopo de célula-T compreendendo um peptídeo.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que T é ou compreende a CD8+ ou a epítopo de célula-T CD4+.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que T é ou compreende a epítopo de célula-T CD4+.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que T é ou compreende um fragmento de proteína do vírus da poliomielite (PV), um fragmento da toxina do tétano ou um peptídeo PADRE.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que T é um peptídeo consistindo em QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID No 1).
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o resíduo de carboidrato (b) é ligado em um resíduo de aminoácido, peptídeo ou lipídeo.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que B é ou compreende um resíduo de carboidrato selecionado do grupo consistindo em:
Figure img0031
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que B é ou compreende o resíduo (α-GalNAc-ser/Thr)3.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o grupo protetor Pr é benzila (Bn) ou acetila (Ac).
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a etapa i) compreende as etapas de: a) acoplar um primeiro resíduo de carboidrato protegido(bPr) cujos grupos hidroxila estão protegidos com um grupo protetor (Pr) como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores com um composto M(T)n formando deste modo um conjugado de carboidrato-epítopo de célula-
Figure img0032
b) repetir a etapa a) com outros resíduos de carboidrato protegidos (bPr) até obter um conjugado de carboidrato protegido de fórmula (II)
Figure img0033
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que Pr é benzila.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que grupos benzila são removidos na presença de TfOH ou H2.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que Pr é acetila.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que os grupos acetila são removidos na presença de hidrazina ou MeONa.
18. Conjugado de carboidrato-epítopo de célula-T, caracterizado pelo fato de ser de fórmula (II):
Figure img0034
na qual: - M é um núcleo de poli-Lisina dendrimérico; - T é um epítopo de célula-T; - BPr é um carboidrato-epítopo de célula-B protegido compreendendo um resíduo de carboidrato (b) cujos grupos hidroxila estão protegidos por um grupo protetor Pr como definido na reivindicação 1; e - n é um número inteiro e representa o número de grupos - T-B covalentemente ligados em M.
19. Conjugado de carboidrato-epítopo de célula-T de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que T é ou compreende um peptídeo.
20. Conjugado de carboidrato-epítopo de célula-T de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que Pr é benzila (Bn) ou acetila (Ac).
21. Conjugado de carboidrato-epítopo de célula-T de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizado pelo fato de que BPr é um (α-GalNAc-ser/Thr)3 protegido.
22. Conjugado de carboidrato-epítopo de célula-T de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, caracterizado pelo fato de que M é HO-βAla-K(K)2.
23. Conjugado de carboidrato-epítopo de célula-T de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, caracterizado pelo fato de que T é QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID N°1).
24. Uso de um conjugado de carboidrato-epítopo de célula-T M(T-BPr)n como definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 23, caracterizado pelo fato de ser para preparar um conjugado de carboidrato-peptídeo M(T-B)ncomo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.
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