JP6006244B2 - 多重抗原糖ペプチド炭水化物コンジュゲートの調製方法 - Google Patents

多重抗原糖ペプチド炭水化物コンジュゲートの調製方法 Download PDF

Info

Publication number
JP6006244B2
JP6006244B2 JP2013558565A JP2013558565A JP6006244B2 JP 6006244 B2 JP6006244 B2 JP 6006244B2 JP 2013558565 A JP2013558565 A JP 2013558565A JP 2013558565 A JP2013558565 A JP 2013558565A JP 6006244 B2 JP6006244 B2 JP 6006244B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
carbohydrate
cell epitope
galnac
conjugate
protected
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2013558565A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2014510083A (ja
Inventor
ベイ，シルヴィ
ルクレール，クロード
ロ−マン，リヒャール
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Pasteur de Lille
Original Assignee
Institut Pasteur de Lille
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Pasteur de Lille filed Critical Institut Pasteur de Lille
Publication of JP2014510083A publication Critical patent/JP2014510083A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6006244B2 publication Critical patent/JP6006244B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K9/001—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence having less than 12 amino acids and not being part of a ring structure

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Container Filling Or Packaging Operations (AREA)

Description

本発明は、式(I)の炭水化物T細胞エピトープコンジュゲートの調製方法、及び前記方法による有用な、式(II)の炭水化物T細胞エピトープ中間体に関する。
過去10年間、腫瘍に関連するTn抗原を提示する新しい種類の合成免疫源であるMAG-Tn3が開発されてきた。MAG-Tn3は、炭水化物Tn抗原(トリ-Tnクラスタとして)を、四価の主鎖上のペプチド性CD4+T細胞エピトープへ関連付ける、完全に合成的な糖ペプチド(分子量=10,897Da)である[5、9]。
MAG-Tn3は、以下の構造:
[S(α-D-GalNAc)-T(α-D-GalNAc)-T(α-D-GalNAc)-QY5IKANS10KFIGI15TEL]4-K2-K-β-Ala:
Figure 0006006244
に対応する。
MAGは、多重抗原糖ペプチドを指す。
したがって、MAG-Tn3は、以下の式:
Figure 0006006244
(式中、
-KKKは、樹枝状ポリリシンコア(M)であり、
-Tは、以下の配列:QYIKANSKFIGITEL
を有するペプチド性CD4+T細胞エピトープであり、
-Tn3は、以下の配列: (α-GalNAc)Ser-(α-GalNAc)Thr-(α-GalNAc)Thr
を有するトリ-Tn B細胞エピトープである)
の炭水化物ペプチドコンジュゲートB4-T4-Mに対応する。
マウス及び霊長類で得られた、成功したin vivoでの結果に基づき[8、9]、MAG-Tn3は、第I/II相臨床試験へ進むべき、癌腫を治療するための優れた治療ワクチン候補である。
特にMAG-Tn3などの、ペプチド炭水化物コンジュゲートを調製するための合成経路は、国際特許出願WO98/43677号及び米国特許第6,676,946号に開示されている。小規模(1〜10mgの最終化合物)で実施されたこのプロセスにおいて、炭水化物Tn3抗原は、樹枝状ペプチドM(T)4ビルディングブロックへ組み込まれる。Tn3抗原の組み込みは、完全に非保護の糖を用いて達成され、最終的な脱保護ステップを回避するため、これは有利であるように思われ得ることに留意すべきである。
しかしながら、発明者らは、スケールアップした場合、そのような方法はうまくいかないことを示した。実際、Tn残基の余分な組み込みは、制御困難であり、粗製物の純度及び全体収率に影響を及ぼす。更に、そのような高分子量糖ペプチドの精製は、複雑である。
したがって、従来技術の欠点を克服する、特により大規模で、反復可能に、より優れた収率及び純度を得ることができる、MAG-Tn3を調製するための改良された方法が必要である。
したがって、本発明は、一態様において、より優れた収率及び純度で大規模生産を可能にする、MAG-Tn3、より一般的には、式(I)(M(T-B)n)の炭水化物T細胞エピトープコンジュゲートを調製するための新規な方法:
nBPr+M(T)n→M(T-BPr)n (II)→M(T-B)n (I)
を提供する。
本発明による方法は、有利には、合成的副生成物を最小限とし、プロセスの頑強性を向上し、反復可能な方法で合成をスケールアップすることができる。
より具体的には、M(T)nビルディングブロックへB細胞エピトープを組み込む前に炭水化物B細胞エピトープのヒドロキシル基を適切な保護基(Pr)で保護することによって、B細胞エピトープの組み込みのよりよい制御を可能にし、したがって、特に大規模での、収率及び純度の両方を向上できることが明らかにされた。
本発明の別の目的は、式(II)(M(T-BPr)n)の新規の炭水化物T細胞エピトープコンジュゲートを提供することであり、この化合物は、高い収率及び純度での式M(T-B)nの炭水化物T細胞エピトープコンジュゲートの調製に有用である。
本発明の更なる目的は、本発明の方法によって得ることができる、95%より優れた純度グレードを有する、式(I)(M(T-B)n)の炭水化物T細胞エピトープコンジュゲートを提供することである。
本発明による方法の、これらの及び他の目的、特徴及び利点を、特許開示の以下の詳細な説明において開示する。
したがって、一態様において、本発明は、式(I):
M(T-B)n (I)
(式中、
Mは、樹枝状(dendrimeric)ポリリシンコアであり;
Tは、ペプチドを含むT細胞エピトープであり;
Bは、少なくとも一つの炭水化物残基(b)を含む炭水化物B細胞エピトープであり;
nは、整数であり、共有結合的にMに結合した-T-B基の数を表す)
の炭水化物T細胞エピトープコンジュゲートを調製するための方法であって;
以下のステップ:
i)炭水化物残基(b)のヒドロキシル基が保護基(Pr)で保護されている、保護炭水化物B細胞エピトープ(BPr)を、化合物M(T)nと結合し、それにより、炭水化物T細胞エピトープコンジュゲートM(T-BPr)nを形成するステップであって、
前記保護基(Pr)が、アリル、p-メトキシベンジル(PMB)、t-ブチルジメチルシリル(TBDMS)、ベンジルオキシメチル(BOM)、レブリニル(Lev)、ベンゾイル(Bz)、2,5-ジフルオロベンゾイル、クロロアセチル、ベンジル(Bn)又はアセチル(Ac)から成る群から選択されるか、
又は、それが結合している二つのヒドロキシル基と共に、C5〜C6イソプロピリデンケタール又はC5〜C6環状アルキルカーボネートを形成する、ステップと、
ii)得られたコンジュゲートM(T-BPr)nから保護基Prを除去し、これにより炭水化物T細胞エピトープコンジュゲートM(T-B)nを得るステップと
を含む、方法に関する。
樹枝状ポリリシンコア(M)
式(I)のコンジュゲートのポリリシンコアは、同一又は異なっていてもよい複数の分岐(-T-B)を有する、星状と表すことができる樹枝状構造である。
そのような分岐は、樹枝状コアの各リシン残基のNH2末端へ、特にペプチド結合-NH-C(=O)-により共有結合的に結合している。
樹枝状ポリリシンコア(M)の価数m、即ち、各リシン残基のNH2末端の数は、m≧nであるようなものであり、好ましくはm=nであり、nはMへ共有結合的に結合している(-T-B)分岐の数を示す。
他の態様において、(-T-B)分岐の数nは4〜16、特に4〜8の範囲である。
更なる態様において、樹枝状ポリリシンコアMは、少なくとも三つのリシン残基、特に3〜15個のリシン残基、より具体的には3〜7個のリシン残基を含む。
更なる態様において、コンジュゲートM(T-B)nは、以下の式(Ia)又は(Ib):
Figure 0006006244
(式中、
Kは、リシン残基であり、
T及びBは、上記で定義した通りである)
から選択される。
有利なことに、樹枝状構造(Ia)及び(Ib)は、樹枝状ポリリシンコアMの表面において、高密度の抗原を提供する。
更なる態様において、Mは以下の式:
Figure 0006006244
の(K)2K-βAla-OHである。
(T-B)分岐
式(I)のコンジュゲート上に炭水化物B細胞エピトープとT細胞エピトープの両方が存在することによって、後者が効率的な免疫源になる。
T細胞エピトープ
本明細書で使用する場合、T細胞エピトープは、T細胞応答を誘発することができる抗原、特に、ペプチドの性質の抗原を意味する。
そのようなエピトープは、特に、S. Stevanovic, “Identification of Tumour-associated T-cell epitopes for vaccine development", Nature Reviews, Vol. 2, July 2002,1〜7ページ; J.H. Kessler, C.J.M. Melief, “Identification of T-cell epitopes for cancer immunotherapy", Leukemia (2007) 21, 1859-1874、又はがん免疫/ペプチドデータベースのウェブサイト:http://www.cancerimmunity.org/peptide database/tumorspecific.htm.に記載されている。
式(I)のコンジュゲートに組み込まれるT細胞エピトープは、同一又は異なり、ペプチド性又はそれ以外であり得る。
特定の態様において、炭水化物T細胞エピトープコンジュゲートは、炭水化物ペプチドコンジュゲートである。ペプチド性T細胞エピトープは、2〜50個のアミノ酸を含むことができる。
T細胞エピトープは、特に、CD8+又はCD4+T細胞エピトープの中から選択することができる。
腫瘍マーカーとして認識されているCD8+T細胞エピトープは、以下:
- MUC-1ペプチド(膵臓、乳房)
- MAGE1及び3(黒色腫、肺)(T.Boonら(1995)、Immunology Today, vol. 16 n°7, 334〜336ページ)
- pme117/gp100(黒色腫)
- チロシナーゼ(黒色腫)BAGE(黒色腫)
- GAGE(黒色腫)LB-33-B(黒色腫)
- CDK4
- P185HER(乳房、卵巣)
- CEA MART1/Melan-A(黒色腫)
から成る群から選択することができ、
- 又は、A. Van Pelら(1995) Immunological. Reviews n°145, 229〜250ページ、又は、P. G. Coulie (1995), Stem Cells, 13, 393〜403ページに記述される腫瘍抗原の群から選択することができる。
特定の態様において、Tは、CD4+T細胞エピトープであるか又はそれを含み、これは特に、ポリオウイルス(PV)タンパク質フラグメント、破傷風毒素フラグメント又はPADREペプチドであり得る。
ポリオウイルス(PV)タンパク質フラグメントの中から選択されるCD4+T細胞エピトープの一例として、ポリオウイルス1型由来のVP1タンパク質の103〜115配列(KLFAVWKITYKDT)(配列番号4)に対応する合成ペプチドを挙げることができる。
破傷風毒素フラグメントの中から選択されるCD4+T細胞エピトープの一例として、以下のフラグメント:
- 破傷風毒素の830〜844配列(QYIKANSKFIGITEL)(配列番号1)
- 破傷風毒素の947〜967配列(FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE)(配列番号2)
- 破傷風毒素の1273〜1284配列(GQIGNDPNRDIL)(配列番号3)
を挙げることができる。
これらのペプチド性T細胞エピトープは、典型的にクラスIIの複数種のMHC(主要組織適合遺伝子複合体)ヒト及びマウス分子に結合し、その結果、個体間に存在するMHC分子の多型性に関連付けられている、CD4NT細胞応答に伴って遭遇する制限の問題を結果として回避する。更に、破傷風毒素ペプチドの使用は、破傷風毒素の多数の個人へのワクチン摂取の結果として、本発明のコンジュゲート上に存在する抗原の免疫原性を増大するはずである。
ペプチドT-細胞エピトープの更なる例として、参照は、S. Stevanovic, “Identification of Tumour-associated T-cell epitopes for vaccine development", Nature Reviews, Vol. 2, July 2002, 1〜7ページ; J.H. Kessler, C.J.M. Melief, “Identification of T-cell epitopes for cancer immunotherapy", Leukemia (2007) 21, 1859-1874について、又は、がん免疫/ペプチドデータベースウェブサイト:http://www.cancerimmunity.org/peptide database/tumorspecific.htm.について成され得る。
非ペプチド性T細胞エピトープの例は、特に:
- C. C. A. M. Peeters (1991)により、The Journal of Immunology, 146,4309-4314において記述された、肺炎球菌型4多糖類のフラグメント、及びオリゴ糖破傷風トキソイドコンジュゲート、
- A. F. M. Verheul (1991)により、Detection and Immunity, vol. 59, n°10, 3566〜3573ページにおいて記述された、髄膜炎菌リポ糖類
を含む。
B細胞エピトープ
本明細書で使用する場合、B細胞エピトープは、B細胞応答を誘発することができる抗原を意味する。
本明細書で使用する場合、炭水化物は、糖類、特にモノ-、ジ-、オリゴ-及び多糖類を意味する。
好ましい態様において、式(I)のコンジュゲートのB細胞エピトープを形成する炭水化物残基(b)は、N-アセチルガラクトピラノシル残基又はその誘導体である。
特定の態様において、炭水化物残基(b)は、アミノ酸、ペプチド又は脂質残基に結合している。更に別の態様において、炭水化物残基は、O-グリコシルアミノ酸又はペプチドである。別の態様において、B細胞エピトープは、前記アミノ酸又はペプチドを介して、樹枝状構造M(T)nに結合している。
B細胞エピトープは、一つ以上の炭水化物残基(b)、特に1〜10個、特に1〜6個の炭水化物残基を含み得る。
そのようなB細胞エピトープは、腫瘍(がん)グリコシド抗原から選択することができ、特に:
- 例えばガングリオシドGD2、GD3及びGM3(黒色腫)などの酸性糖脂質、並びに、例えばLewisy(Ley)(乳房、前立腺、卵巣)、及びGlobo H(乳房、前立腺、卵巣)抗原などの中性糖脂質を含む糖脂質クラス;
- 例えばTn抗原(α-GalNAc-Ser又はα-GalNAc-Thr)、TF抗原(β-Gal-(1-3)-α-GalNAc-Ser又はβ-Gal-(1-3)-α-GalNAc-Thr)、頻繁に癌腫中に存在するが、通常は正常組織中に存在しない二種の腫瘍マーカー[Springer G. F. Science 224,1198-1206 (1984)](卵巣、乳房、肺)、又は、ジ-Tn(α-GalNAc-Ser/Thr)2、トリ-Tn(α-GalNAc-Ser/Thr)3又はヘキサ-Tn(α-GalNAc-Ser/Thr)6などのO-グリコシルペプチド(又はアミノ酸)クラス
から選択することができる。
本発明によるコンジュゲートのB細胞エピトープはまた、例えば、髄膜炎菌、インフルエンザ菌、肺炎球菌、及び連鎖球菌群の莢膜細菌多糖類に由来し得る。
多糖類は、合成プロセスによって得られた炭水化物残基である。
本コンジュゲートのB細胞エピトープはまた、例えば、酵母サッカロミセスから単離したものなどの、真菌由来であり得る。
好ましい態様において、式(I)のコンジュゲートのB細胞エピトープは、優先的には、例えばTn及びTF抗原などの腫瘍マーカーである。
これは、Tn、ジ-Tn、トリ-Tn(Tn3)、ヘキサ-Tn(Tn6)、又はTF抗原を含む群から選択することができる。
更なる態様において、Bは以下から成る群:
- α-GalNAc
- α-GalNAc-Ser
- α-GalNAc-Thr
- β-GalNAc
- β-GalNAc-Ser
- β-GalNAc-Thr
- β-Gal-(1-3)-α-GalNAc-Ser
- β-Gal-(1-3)-α-GalNAc-Thr
- (α-GalNAc-Ser/Thr)2
- (α-GalNAc-Ser/Thr)3、及び
- (α-GalNAc-Ser/Thr)6
から選択される炭水化物残基であるか又はそれを含む。
好ましい態様において、Bは、残基(α-GalNAc-Ser/Thr)3、最も好ましくは、(α-GalNAc)Ser-(α-GalNAc)Thr-(α-GalNAc)Thrであるか、又はそれを含む。
別の好ましい実施形態において、式(I)のコンジュゲートは、MAG-Tn3である。
ステップi)
本発明による方法は、i)炭水化物残基(b)のヒドロキシル基が保護基(Pr)で保護されている保護炭水化物B細胞エピトープ(BPr)と、化合物M(T)nとを結合し、それによって炭水化物T細胞エピトープコンジュゲートM(T-BPr)nを形成するステップであって、
前記保護基(Pr)は、アリル、p-メトキシベンジル(PMB)、t-ブチルジメチルシリル(TBDMS)、ベンジルオキシメチル(BOM)、レブリニル(Lev)、ベンゾイル(Bz)、2,5-ジフルオロベンゾイル、クロロアセチル、ベンジル(Bn)又はアセチル(Ac)から成る群から選択されるか、
又は、それが結合している二つのヒドロキシル基と共に、C5〜C6イソプロピリデンケタール又はC5〜C6環状アルキルカルボネートを形成する、ステップを含む。
好ましい態様において、Prはベンジル(Bn)又はアセチル(Ac)である。
特定の態様において、ステップi)は、以下:
a)ヒドロキシル基が、特にベンジル(Bn)又はアセチル(Ac)から選択される保護基(Pr)で保護されている、第一の保護炭水化物残基(BPr)と、化合物M(T)nとを結合し、それによって、炭水化物T細胞エピトープコンジュゲートM(T-BPr)nを形成するステップ;及び、任意選択で、
b)式(II)M(T-BPr)nの保護炭水化物コンジュゲートが得られるまで、更に保護炭水化物残基(bPr)を用いてステップa)を繰り返すステップ
を含む。
有利なことに、そのような保護基Prは、ステップi)において、炭水化物残基bのそれぞれ又はB細胞エピトープBの、M(T)nとの結合を制御できることが実証されている。更に、これらの保護基の除去によって、収率及び純度の間の改善された妥協点で、所望の生成物を得ることができることが示された。
従来の方法によると、炭水化物残基のヒドロキシル基は、上記の保護基(Pr)、特に、ベンジル又はアセチル基によって、保護することができる。
保護B細胞エピトープBPr又は炭水化物残基(bPr)は、商業的に入手可能であるか、又は、市販されている出発物質から、及び/又は、従来の方法に従って、調製することができる。
好ましい態様において、樹枝状ポリリシンコアM、及び結果として後続のM(T)nビルディングブロックは、固体支持体上に固定され、したがって、反復可能な固相ペプチド合成を可能にする。
固体支持体の例として、p-ベンジルオキシベンジルアルコール(ワング樹脂)で官能化され、その上においてFmoc-β-Ala-基が次いでグラフト化され得るポリスチレン樹脂又は商品名Fmoc-β-Ala-TentaGel R Trtで販売されているものを挙げることができる。Mコアは、特に、β-Ala-OH残基を介して結合させることができる。Fmoc-β-Ala-基による樹脂置換率、即ち、樹脂のグラフト率は、0.2〜0.05mmol/g、好ましくは0.10〜0.13mmol/gの範囲であり得る。
特定の態様において、bPrは保護O-グリコシルアミノ酸又はペプチドである。保護O-グリコシルペプチドは、保護された構成的O-グリコシルアミノ酸残基bPrを連続して導入することによって、M(T)nビルディングブロックへカップリングすることができる。
この点において、固相ペプチド及び糖ペプチド合成は、標準Fmoc化学的プロトコル[5]及び[6]を用いて行うことができる。N-α-Fmocアミノ酸及びグリコシル化アミノ酸又はペプチドは、ペプチド鎖中に段階的に組み込まれる。
したがって、ステップi)は、第一の保護N-α-Fmoc O-グリコシルアミノ酸bPrと、M(T)nビルディングブロックとを反応させることによって行うことができる。より具体的には、第一のO-グリコシルアミノ酸bPrのカルボキシル基(COOH)を、T分岐のそれぞれのNH2末端と反応させ、それによって、ペプチド共有結合(-C(=O)NH-)を形成する。
Fmocは、例えば、DMF中又はNMP中の20%のピペリジンの存在下で切断される。次に、第二の保護N-α-Fmoc O-グリコシルアミノ酸bPrは、同様に、第一の保護アミノ酸残基などのNH2基と反応し得る。
したがって、B細胞エピトープがいくつかの炭水化物残基(b)を含む場合、本発明による方法のステップi)は、炭水化物T細胞エピトープコンジュゲートM(T-BPr)nが得られるまで、ステップa)に従って結合を繰り返すステップを含み得る。
これらのペプチド結合は、HATU及びDIPEA又はDIC/HOBt及びPyBOPなどのカップリング試薬の存在下で、DMF又はNMPなどの極性非プロトン性溶媒中で行うことができる。
ステップii)
特定の態様において、Prはベンジルである。その場合、脱保護ステップii)を、TfOHの存在下又は触媒水素化によって行うことができる。
特定の態様において、ステップii)は、触媒水素化である。
好ましい態様において、触媒水素化は、触媒としてPd/Cの存在下、特に10%Pd/C(%w/w)の存在下で行う。式(II)のコンジュゲート/触媒の重量比率は、10/2〜10/10で変わり得、好ましくは約10/8である。触媒は、長期間にわたって少しずつ添加してもよい。
触媒水素化は、好ましくは、溶媒として、NMP/H2O中、特に、87.5/12.5の体積率で行う。
触媒水素化反応は、好ましくは、20〜40℃の範囲の温度で、特に約37℃で行う。
触媒水素化反応は、好ましくは、1〜10barの範囲の圧力で、より好ましくは約5barで行う。
別の態様において、ステップii)は、TfOHの存在下で行う。
好ましくは、式(II)のコンジュゲートを、TFA、DMS及びm-クレゾールの存在下でTfOHと反応させる。TfOH/TFA/DMF/m-クレゾールの相対比は、1/5/3/1 v/v/v/vであり得る。
別の態様において、保護基Prはアセチルである。
ステップii)におけるアセチル保護基の脱保護は、好ましくは、例えばメタノールなどのアルコールなどのプロトン性極性溶媒中で、ヒドラジンの存在下で行う。この反応は、室温、即ち、15〜25℃の間で行うことができる。
式(II)の化合物に対するヒドラジンのモル比は、100〜1500モル当量で変化し得る。
アセチルの脱保護は、MeONaの存在下で、特に溶媒としてのMeOH中で、室温、即ち15〜25℃の間で行うことができる。
特定の態様において、固体支持体に固定化された場合、i)の最後に得られた式(II)のコンジュゲートは、脱保護ステップii)の実施前に、固体支持体から予備的に切断される。そのような切断は、例えば、以下の体積率95/2.5/2.5 v/v/vで、水中においてTFA及びTISの存在下で行うことができる。
ステップiii)
本発明による方法は、更に、特に逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)による一つ以上の精製ステップで構成される、ステップii)以降のステップiii)を含み得る。
ステップiv)
本発明による方法は、更に、生成物を回収するその後のステップiv)を含み得る。
M(T) n 合成
特定の態様において、本発明による方法は、更に、コンジュゲートM(T)nを調製するステップを含む。
特定の実施形態において、コンジュゲートM(T)nは、樹枝状ポリリシンコアから開始し、ペプチドT細胞エピトープを構成しているN-保護アミノ酸残基を段階的に導入することにより調製する。N-保護アミノ酸残基は、特にFmocアミノ酸残基である。
アミノ酸カップリングは、DIC、HOBt、PyBOP、HATU又はDIPEAなどの一つ以上のペプチドカップリング試薬の存在下で、DMFなどの極性非プロトン性溶媒中で行うことができる。組み合わせ(DIC/HOBt及びPyBOP)又は代替(HATU/DIPEA)が特に好ましい。代替的なカップリング試薬はまた、E. Valeur; M. Bradley, Chem Soc Rev (2009) 38, 606 ; A. El-Fahamら、Chem Eur J (2009) 15, 9404又はR. Subiros-Funosasら、Org Biomol Chem (2010) 8, 3665に開示されている。
各ペプチドのカップリングに続き、N-アミノ酸保護基を除去する。例として、Fmoc保護基は、DMFなどの極性非プロトン性溶媒中で、ピペリジンの存在下で除去することができる。
ペプチドフラグメント（配列番号1）の合成に関して、アミノ酸残基AA9-10及びAA15-16を、擬似プロリンジペプチドとして組み込むことができる。有利なことに、そのようなジペプチドの組み込みは、製品の粗品質へ大きな影響を与えることを実証した。
M合成
特定の態様において、本発明による方法は更に、樹枝状ポリリシンコアMを調製するステップを含む。
樹枝状ポリリシンコアMは、米国特許第6,676,946号に開示された方法に従って調製することができる。
炭水化物T細胞エピトープコンジュゲートM(T-B) n
別の態様において、本発明は、有利には、本発明の方法により得られることができる純度グレード≧95%を有する、炭水化物T細胞エピトープコンジュゲートM(T-B)nを提供する。
そのような純度グレードは、ステップ(ii)の後に、精製ステップ(iii)、特に、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)を実施することにより得ることができる。例として、RP-HPLCは、特に15μm未満、特に約10μm又は5μ未満の粒度を有する、及び/又は、約300Å以下、特に200Å未満、特に100Å未満の孔径を有する、低粒度カラムを用いて行うことができる。固定相は、オクタデシル基(C18シリカとも呼ばれる)によりグラフトされたシリカゲルに基づいて逆相であり得る。溶出は、例えば、約20分間にわたって70/30〜60/40などの浅い勾配で、水(0.1%、TFA)/アセトニトリルを用いて行うことができる。
式(I)のコンジュゲートの純度グレードを、特にRP-HPLCにより、任意の従来の方法によって決定することができる。
純度は、好ましくは≧96%、特に≧98%、及び有利には≧99%である。
炭水化物T細胞エピトープコンジュゲートM(T-B Pr ) n
別の態様において、本発明は式(II):
M(T-BPr)n (II)
(式中、
- Mは樹枝状ポリリシンコアであり;
- TはT細胞エピトープであり、好ましくはペプチド残基を含み;
- BPrは、ヒドロキシル基がPr基により保護された少なくとも一つの炭水化物残基(b)を含む、保護炭水化物B細胞エピトープであり;
前記Pr基は、アリル、p-メトキシベンジル(PMB)、t-ブチルジメチルシリル(TBDMS)、ベンジルオキシメチル(BOM)、レブリニル(Lev)、ベンゾイル(Bz)、2,5-ジフルオロベンゾイル、クロロアセチル、ベンジル(Bn)又はアセチル(Ac)から成る群から選択されるか、又は、それが結合している二つのヒドロキシル基と共に、C5〜C6イソプロピリデンケタール又はC5〜C6環状アルキルカルボネートを形成し;
- nは整数であり、共有結合的にMに結合したT-B基の数を表す)
の炭水化物T細胞エピトープコンジュゲートを提供する。
特定の態様において、BPrは保護(α-GalNAc-Ser/Thr)3である。
別の態様において、Prはベンジル又はアセチルである。
更なる態様において、MはHO-βAla-K(K)2である。
別の態様において、TはQYIKANSKFIGITEL(配列番号1)である。
別の目的において、本発明は、炭水化物ペプチドコンジュゲートM(T-B)nを調製するための、炭水化物ペプチドコンジュゲートM(T-BPr)nの使用を提供し、M(T-BPr)n及びM(T-B)nは、上記に定義されている通りである。
本発明の他の特性は、例示的な実施形態の以下の説明の過程で明らかになるであろう。これらの例は、本発明を説明するために与えられるものであり、何らそれらの限定を意図するものではない。
本発明の方法のプロトコルAに従ったMAG-Tn3合成。モル当量は、アミノ基に対して示されている。AA9-10及びAA15-16は、擬似Proジペプチドとして組み込まれる。 本発明の方法のプロトコルBに従ったMAG-Tn3合成。モル当量は、アミノ基に対して示されている。AA9-10及びAA15-16は、擬似Proジペプチドとして組み込まれている。
略記
AA アミノ酸
Ac アセチル
AcOH 酢酸
Bn ベンジル
Boc tert-ブトキシカルボニル
tBu tert-ブチル
DIC N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA ジイソプロピルエチルアミン
DIPE ジイソプロピルエーテル
DMAP 4-ジメチルアミノピリジン
DMF ジメチルホルムアミド
DMS ジメチルスルフィド
DVB ジビニルベンゼン
EtOH エタノール
FA ギ酸
Fmoc 9-フルオレニルメトキシカルボニル
HATU 2-(1H-9-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
HOBt N-ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC/MS 高速液体クロマトグラフィー/質量分析
MAG 多重抗原糖ペプチド
MeOH メタノール
MeONa ナトリウムメチラート
ESMS エレクトロスプレー質量分析法
MW 分子量
NMP N-メチルピロリドン
NMR 核磁気共鳴
PyBOP ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
RP-HPLC 逆相高速液体クロマトグラフィー
RT 室温
SELDI-TOF MS 表面エンハンス型レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析
TBS tert-ブチルジメチルシリル
TFA トリフルオロ酢酸
TfOH トリフルオロメタンスルホン酸
THF テトラヒドロフラン
TIS トリイソプロピルシラン
TMSBr トリメチルシリルブロマイド
Trt トリチル
[実施例1]
プロトコルA及びBによる、MAG-Tn3の調製
一般的な方法
6の合成を、Fmoc化学を用いて、固相上で段階的に実施した。使用したアミノ酸側鎖保護基は、Gln及びAsn上のTrt、Lys7及びLys11上のBoc、Tyr、Ser及びThr上のtBu、Glu上のOtBuであった。Lys19及びLys20について、保護基はFmocであった。
20時間110℃で、6N HClを用いた化合物の加水分解後、ベックマン6300アナライザを使用して、窒素分析又は定量的アミノ酸分析により、正味のペプチド含有量を決定した。
エレクトロスプレーイオン化(ポジティブモード)源(ウォーターズ)を備える、UV検出器2487(220nm)及びQ-Tofmicro(商標)分析計(マイクロマス(Micromass))に結合された、アライアンス2695システムによって、HPLC/MS分析を行った。サンプルをオートサンプラー上で4℃まで冷却した。線形勾配を、20分間にわたって、アセトニトリル+0.025%FA(A)/水+0.04%TFA+0.05%FA(B)を用いて行った。カラムは、Zorbax300SB C18(3.5μ、3×150mm)(アジレント)(勾配13〜53% A)又はXBridge(商標)BEH130 C18(3.5μ、2.1×150mm)(ウォーターズ)(勾配15〜40% A)であった。供給源の温度は、120℃に維持し、脱溶媒和温度は400℃に維持した。コーン電圧は、40Vであった。
ESMS分析は、同じ質量分析計において、直接注入によるポジティブモードで記録した。サンプルを、0.1%ギ酸を含む、水/アセトニトリル(1/1)中に約5μMの濃度で溶解させた。
SELDI-TOF分析を、PCS4000質量分析計(バイオ・ラッド・ラボラトリーズ)で行った。H4プロテインチップアレイ表面を、1μL CH3CNを用いて活性化した。スポットを、20分間室温でボックス内において、反応混合物(2.5μL、1mg/mL)を用いてインキュベートした。それらを次に、反応バッファ(3×1分)及びH2O(3×1分)で洗浄した。マトリックス(50%CH3CN/0.5%TFA中、2×0.6μLの飽和シナピン酸)を、各スポットに塗布し、空気乾燥させた。スペクトルは、約3μJのレーザー設定により、各アレイスポットから生成した。測定器は、上述のマトリックス及び設定から、ウシユビキチン、ウシシトクロムC、β-ラクトグロブリンを用いて外部較正した。
6の純度を、220nmで、UV検出器を備えたアジレント1200ポンプシステムを用いて、RP-HPLCにより分析した。カラムは、Zorbax300SB C18(3.5μ、3×150mm)(アジレント)であり、勾配は、40分に渡って、13〜53%A(0.8mL/分、保持時間20.5分)、アセトニトリル+0.1% TFA(A)/水+0.1%TFA(B)を用いて行った。
全ての試薬のモル当量は、アミノ基に対して示されている。保護中間体4及び5のモル量は、出発Fmoc-β-Ala-樹脂1置換に基づいて算出した。全体的な収率(表)は、1からの全ての合成ステップを含む。それらは、Fmoc-β-Ala-樹脂1置換から、最終生成物6の正味のペプチド含有量により計算した。
プロトコルA(図1)
Fmoc-β-Ala-樹脂(低置換樹脂)1
2gのp-ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂(ワング樹脂、0.91mmol/g、100〜200メッシュ、ポリマーマトリックス:コポリ(スチレン-1%DVB)、ノババイオケム(Novabiochem))を、乾燥した丸底フラスコ中で、1時間DMF(アプライドバイオシステムズ)中で膨潤させた。311mg(1mmol)の乾燥Fmoc-β-Ala-OH(ノババイオケム(Novabiochem)、メルクケミカルズ)を、8mLの無水CH2Cl2(アクロス)中に溶解した。4滴のDMFを、完全に溶解させるために加えた。77μL(0.5mmol)のDIC(フルカ(Fluka))を加えた後、反応混合物を室温で、アルゴン下において20分間撹拌した。反応混合物を蒸発乾固させ、ロータリーエバポレータをアルゴン下で開いた。残渣を最小量のDMF(6mL)中に溶解し、この溶液を樹脂へ加えた。0.5mLのDMF中に溶解した6mg(0.05mmol)のDMAP(アクロス)を加え、懸濁液を室温で2時間穏やかに撹拌した。
樹脂の置換率を、以下の手順に従って樹脂サンプルのUV分析により測定した。2〜6mgの樹脂を、小さい焼結ガラス漏斗へパスツールピペットを用いて移した。樹脂を、DMF、CH2Cl2(カルロエルバー)を用いて洗浄し、乾燥させた。樹脂をUVセルへ移し、正確に秤量し、次に、DMF中の2.8mLの20%ピペリジン(アルドリッチ)を加えた。この懸濁液を、パスツールピペットを助けとして用いて2分間撹拌した。吸光度を、DMF中20%のピペリジンを含む参照セルを用いて、300.5nm(ε=7800)で読み取った。負荷の限度は0.1mmol/gであることがわかった。
樹脂をDMFを用いて三回洗浄した。残留ヒドロキシル基を、以下のプロトコルを用いてキャップした。樹脂を、13mLのDMF中に再懸濁した。1mLのDMF中の1.55mL(16.4mmol)のAc2O(シグマ)、及び次に、1mLのDMF中660mg(5.41mmol)のDMAPを加えた。穏やかに室温で30分間撹拌した後、懸濁液を焼結ガラス漏斗で濾過し、連続的にDMFにより三回、CH2Cl2により三回洗浄し、次に、デシケーター中で一晩乾燥させた。樹脂1を4℃で保存した。
[QYIKANSKFIGITEL] 4 -K 2 -K-β-Ala-樹脂(保護ペプチド)2
四価ペプチドを、Fmoc化学を用いて、アプライドバイオシステムズのペプチドシンセサイザー433Aを用いて、250mg(25μmol)のFmoc-β-Ala-樹脂1から合成した。各カップリングステップの後に更に洗浄ステップを行う以外は、アプライドの標準合成プロトコルに従った。簡潔には、Fmoc基を、NMP中22%のピペリジン(アプライドバイオシステム)を用いて除去し、脱保護を導電性により監視した。カップリング試薬としてHATU(アプライドバイオシステムズ)(第一サイクル:40当量、第二サイクル:20当量)/DIPEA(アプライドバイオシステムズ)(第一サイクル:80当量、第二サイクル:40当量)を、溶媒としてNMPを用いて、連続的に二つのレベルのFmoc-Lys(Fmoc)-OH(アプライドバイオシステムズ)(第一サイクル:40当量、第二サイクル:20当量)をカップリングすることにより、リシンコアを構築した(注:試薬のこの非常に大過剰の使用は、反応の効率のために必要でないはずであり、予充填カートリッジが、1mmolのアミノ酸で充填されているという事実のみによるものである)。標準的な側鎖の保護基を有する、後続のFmoc保護アミノ酸(アプライドバイオシステムズ、10当量/アミン)の段階的な導入を、NMP中のHATU(10当量/アミン)/DIPEA(20当量/アミン)を用いて行った。位置15〜16及び9〜10におけるAAを、それぞれ、HATU(10当量/アミン)及びDIPEA(20当量/アミン)を用いて、Fmoc-Ile-Thr(ΨMe、Mepro)-OH、及びFmoc-Asn(Trt)-Ser(ΨMe、Mepro)-OH(10当量/アミン)(ノババイオケム(Novabiochem)、メルク・ケミカル・ラボラトリーズ)として、組み込んだ。
[S(α-D-GalNAc(OBn) 3 )-T(α-D-GalNAc(OBn) 3 )-T(α-D-GalNAc(OBn) 3 )-QYIKANSKFIGITEL] 4 -K 2 -K-β-Ala 5
2(25μmol)から開始し、グリコシル化されたビルディングブロックを手動で組み込んだ:Fmoc-T(α-D-GalNAc(OBn)3)-OH (フィッシャーケミカルズAG(Ficher Chemicals AG)) (第一サイクル)、Fmoc-T(α-D-GalNAc(OBn)3)-OH (第二サイクル)、及びFmoc-S(α-D-GalNAc(OBn)3)-OH (フィッシャーケミカルズAG(Ficher Chemicals AG)) (第三サイクル)。簡潔には、乾燥ビルディングブロック(0.3mmol、3当量/遊離アミノ基)を、最小量のDMF(約2mL)中に溶解した。0.5mLのDMF中の、55mg(0.145mmol)のHATU(ノババイオケム(Novabiochem))の溶液を加え、得られた混合物を樹脂へ加えた。52μL(0.3mmol)のDIPEA(アルドリッチ)を加えた後、懸濁液を機械的に撹拌した。三つのカップリングステップは、Kaiser試験[1]により監視し、それぞれ、1時間、1時間及び1時間で完了した。各カップリングステップの後、樹脂を、DMFを用いて洗浄した(四回)。全てのFmoc切断は、DMF中の20%ピペリジンを用いて、樹脂を処理することによって行った。それぞれ脱保護の後、樹脂を、順次、DMF(六回)、CH2Cl2(六回)、及びDMF(六回)により洗浄した。合成の終了時に、樹脂を、広く、DMF及びCH2Cl2を用いて洗浄し、デシケーター中で乾燥させた。10mLのTFA(アプライドバイオシステムズ)/水/TIS(アクロス)(95/2.5/2.5 v/v/v)を4℃で樹脂へ加え、混合物を室温で1時間30分撹拌した。樹脂の濾過の後、溶液を濃縮し、粗生成物をジエチルエーテルで沈殿させた。遠心分離後、ペレットを水へ溶解し、凍結乾燥させて、229mgの粗糖ペプチド5を得た。
[S(α-D-GalNAc)-T(α-D-GalNac)-T(α-D-GalNAc)-QYIKANSKFIGITEL] 4 -K 2 -K-β-Ala又はMAG-Tn3 6
5から、
- TfOH[2〜4]を用いて、
200mg(0.014mmol)の5を、室温で、2.96mLのTFA、1.78mLのDMS(シグマ-アルドリッチ)及び587μLのメタクレゾール(シグマ-アルドリッチ)中へ溶解した。溶液を-10℃まで冷却し、587μLのTfOH(フルカ(Fluka))を加え、混合物を-10℃で1時間15分撹拌した(TfOH/TFA/DMS/m-クレゾール 1/5/3/1 v/v/v/v)。生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、遠心分離の後、ペレットを水中に溶解し、凍結乾燥させて、372mgの粗糖ペプチドを得た。生成物を、7.7mLの0.05Mの酢酸アンモニウムバッファ中に溶解し、pHを1Mのアンモニアを用いて7へ調整した。室温で1時間後、溶液を凍結乾燥させ、412mgの粗生成物を得た。生成物を、230nmでUV検出器を備えるアジレント1200ポンプシステムを用いて、RP-HPLCにより精製した。カラムは、Zorbax C18(5μ、300Å、9.4×250mm)(アジレント)であり、勾配は、水(0.1%TFA)/アセトニトリルを用いて、73/27〜60/40で、20分間にわたって行った。精製により、3.9mg(正味のペプチド含有量)の6を、95.90%の純度で得られた。全体的な収率は、1.6%である。
プロトコルB(図2)
[QYIKANSKFIGITEL] 4 -K 2 -K-β-Ala-樹脂(保護ペプチド)2
Tyr5の組み込みまで、四価ペプチドを、36.9g(4.8mmol)のFmoc-β-Ala-Tentagel R Trt樹脂1(0.13mmol/g)(ラップポリメール(Rapp Polymere))から、Schmizo反応器を備えた手動のペプチドシンセサイザーにより合成した。伸長プロセスの前に、樹脂を2〜3時間DMF中で膨潤し、240mLのDMFで洗浄した(三回、2分/サイクル)。それぞれのカップリングの後、Fmoc基を、240mLのDMF中の20%ピペリジンを用いて除去した(三つのステップ、それぞれ20分)。Glu17、Asn9及びGln4の場合において、2%のHOBtを脱保護溶液へ加えた。それぞれの脱保護の後、樹脂を順次、240mLのDMF(四回、2分/サイクル)、DMF中の240mLの2%HOBt(二回、5分/サイクル)、及び240mLのDMF(二回、2分/サイクル)により洗浄した。
アミノ酸カップリング(1.5〜2当量/アミン)を、DIC/HOBT(それぞれ1.5〜2当量/アミン)を用いて、室温で、DMF(111mL)中で行った(詳細は以下を参照)。位置15〜16及び9〜10におけるAAを、それぞれ、Fmoc-Ile-Thr(ΨMe,Mepro)-OH及びFmoc-Asn(Trt)-Ser(ΨMe,Mepro)-OHとして組み込んだ。30分後、DIC(1.5〜2当量)の新鮮な部分を、反応混合物へ加えた。カップリングステップは、Kaiser試験[1]により監視した。Leu18からSer1まで、DIC/HOBT(同じ量)を用いたカップリングの1時間後、PyBOP試薬を加え(詳細は、以下を参照)、pHをDIPEAを滴下して加えることにより7へ調整した。30分後、樹脂を240mLのDMFで洗浄し(5回、2分/サイクル)、アセチル化ステップを、Leu18からThr2まで行った。アセチル化を、室温で111mLのDMF中で、ピリシン(1当量/アミン)の存在下で、無水酢酸(1当量/アミン)を用いて行った。20分後、樹脂を、240mLのDMFで洗浄した(六回、2分/サイクル)。Tyr5の組み込み後、樹脂を、乾燥前に、240mLのDMF(八回、2分/サイクル)及び240mLのCH2Cl2(八回、2分/サイクル)を用いて十分洗浄した。
Tyr5の組み込み後、アセンブリを、同じプロトコルを用いて0.15mmol規模又は4.65mmol規模で遂行し、ペプチド樹脂4及び5のそれぞれのためのペプチド樹脂2を得た。
Figure 0006006244
[S(α-D-GalNAc(OAc) 3 )-T(α-D-GalNAc(OAc) 3 )-T(α-D-GalNAc(OAc) 3 )-QYIKANSKFIGITEL] 4 -K 2 -K-β-Ala 4
合成は、2について前述したように、2(0.15mmol)から行った。カップリングステップを、以下のAAビルディングブロック[5]及び試薬を用いて行った。
Figure 0006006244
合成の終了時、糖ペプチド樹脂(0.15mmol)を、TFA/TIS/H2O(95/2.5/2.5 v/v/v)(10mL/gの糖ペプチド樹脂)中に懸濁させ、1時間20℃±2℃で撹拌した。濾過後、樹脂を同じTFA混合物(洗浄ごとに、2mL/gの糖ペプチド樹脂)で二回洗浄した。濾液及び洗浄液を集め、20℃±2℃で、更に30分間撹拌した。濃縮後(槽温度≦35℃)、粗生成物をDIPE(約35mL/gの糖ペプチド樹脂)を用いて沈殿させた。濾過及びDIPEでの洗浄の後、固体を乾燥させ(t°≦30℃)、750mgの粗製4を得た。
ESMS: 12409.589 (C553H855N107O213 計算値 12410,465)
[S(α-D-GalNAc(OBn) 3 )-T(α-D-GalNAc(OBn) 3 )-T(α-D-GalNAc(OBn) 3 )-QYIKANSKFIGITEL] 4 -K 2 -K-β-Ala 5
合成を、2について前述したように、2(4.65mmol)から行った。カップリングステップを、以下のAAビルディングブロック(フィッシャーケミカルズAG(Ficher Chemicals AG))及び試薬を用いて行った。合成の終了時、84.87gの糖ペプチド樹脂を得た。
Figure 0006006244
糖ペプチド樹脂(20g、1.096mmol)を、4について前述したように処理し、9.95gの粗製5を得た。
ESMS: 14141.433 (C733H999N107O177 計算値 14141,610)
注:このプロトコルによって、プロトコルAに従って、即ち、Fmoc-β-Ala-p-ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂(ワング樹脂)(上記を参照)から開始して得られたものと同等の粗化合物を得た。
[S(α-D-GalNAc(OH) 3 )-T(α-D-GalNAc(OH) 3 )-T(α-D-GalNAc(OH) 3 )-QYIKANSKFIGITEL] 4 -K 2 -K-β-Ala又はMAG-Tn3 6
4から
- ヒドラジン[7]を用いて
100mg(20μmol)の4を、3.2mLのMeOH中に溶解した。567μL(11.3mmol)のヒドラジン一水和物を加え、溶液を室温で撹拌した。2時間30分後、溶液を0℃まで冷却し、3.2mLのアセトンを加えた。1時間後、溶液を濃縮し、アセトンを用いて五回共蒸留した。粗糖ペプチドを凍結乾燥させ、117mgを得た。生成物を、230nmでUV検出器を備えたアジレント1200ポンプシステムを用いて、RP-HPLCにより精製した。カラムは、Zorbax C18(5μ、300Å、9.4×250mm)(アジレント)であり、勾配は、水(0.1%TFA)/アセトニトリルを用いて20分にわたり、72/28〜62/38で行った。精製することにより、96.4%の純度で5.8mg(正味のペプチド含有量)の6を得た。全体的な収率は、2.7%である。
- MeONaを用いて
24mg(4.8μmol)の4を、3.2mLのMeOH中に溶解させた。pHを、MeOH中の1%MeONaを用いて14へ調整し(pHメーター、湿性pH試験紙約10.5)、溶液を室温で撹拌した。反応を、RP-HPLCにより監視した。2時間後、反応物をドライアイスで中和し、蒸発乾固した。粗ペプチドを、1%TFA水溶液へ溶解し、凍結乾燥した。生成物を、230nmで、UV検出器を備えるアジレント1200ポンプシステムを用いて、RP-HPLCにより精製した。カラムは、Kromasil C4(5μ、100Å、10×250mm)(AIT)であり、勾配を、73/27〜62/38で、0.1%TFA水溶液(VWR)/アセトニトリル(カルロエルバー)を用いて30分にわたり行った。精製することによって、91.4%の純度で、754μg(正味のペプチド含有量)の6を得た。全体的な収率は、1.4%である。
5から
- H2を用いて
10g(1.1mmol)の5を、800mLのNMP/H2O 87.5/12.5中に溶解した。4gの10%Pd/Cタイプ39(Johnson Matthey)を加えた後、反応物を170時間5barで37℃で撹拌した。二つの追加の量の触媒を、72時間(2g)及び120時間(2g)後に少量ずつ加えた。反応の終了時に、触媒をセライトで濾過し、NMP/H2O 87.5/12.5で洗浄した。同様の反応から生じた他の濾液を用いて得られた濾液を集めた(総量1.35mmol)。H2Oで希釈した後(NMP/H2O 10/90まで)、濾液は、二つのステップでRP-HPLCにより精製した。一次精製は、TFA/H2O/CH3CN 0.1/94.9/5.0 v/v/v(A)、及びTFA/H2O/CH3CN 0.1/49.9/50.0 v/v/vを用いた、Vydac C18カラム(300Å、10〜15μm、50mL/mn)で行った。勾配は、15分にわたって0%B、5分にわたって0〜40%B、60分にわたって40〜80%Bであった。第二の精製を、AcOH/H2O/CH3CN 0.5/94.5/5.0 v/v/v(A)、及びAcOH/H2O/CH3CN 0.5/49.5/50.0 v/v/v(B)を用いたVydac C18カラム(300Å、10〜15μm、50mL/mn)で行った。勾配は、15分にわたって0%B、5分にわたって0〜20%B、60分にわたって20〜60%Bであった。Daisogel SP-300-10-ODS-APカラム(20mL/mn、等張のTFA/H2O/CH3CN 0.1/49.9/50.0 v/v/v)を用いてRP-HPLCにより濃縮し、溶液をロータリーエバポレータにより蒸発させ、凍結乾燥して、95.3%の純度で225mg(正味のペプチド含有量)の6を得た。全体的な収率は、1.5%である。 ESMS: 10897.387 (C481H783N107O177 計算値 10897,123)
結論
得られた結果を、以下の表にまとめた:
Figure 0006006244
保護されていない炭水化物シントン(図1及び2)を用いる初期の合成と比較すると、新プロセス(保護炭水化物を含む、II、図1及び2)は、以下の:
- 合成副生成物を最小限に抑えること
- プロセスの再現性を向上させること
- 反復可能な方法でのスケールアップ合成
を可能にする。
新プロセスにおける試験プロトコルの中で(表、図1及び2)、三つが最善の戦略として浮上する:Ac/ヒドラジン、Bn/TfOH、及びBn/H2(保護基/脱保護方法)(表)。それらは全て、反復可能な方法で、純度≧95%で、MAG-Tn3をもたらした。
Bn/TfOH法は、全体収率1.6%で、MAG-Tn3を得た。この方法は、完全な脱保護と分解との間の妥協点に依存する。或いは、Bn/H2法は、同様の収率(1.5%)でMAG-Tn3を得、そして最も重要なことに、プロセスは225mgのスケールで検証した。最終的に、Ac/ヒドラジン法により、最高の全体収率が得られた(1.6%及び1.5%に比較して、2.7%)。
別のペプチド(PV=KLFAVWKITYKDT)(配列番号4)に基づくMAG-Tn3もまた、本発明の方法に従って調製した(Ac/ヒドラジン、Bn/TfOH)。
[実施例2]
樹脂置換率及びMAG-Tn3の精製に使用される固定相の性質の影響
MAG-Tn3を、プロトコルBに従って、Fmoc-β-Ala(Fmoc-β-Ala-TentaGel R Trtの商品名で販売されている)で官能化され、二つの異なる置換率:0.13又は0.1mmol/g(即ち、非グラフト化樹脂の重量に対しての、Fmoc-β-Alaグラフト基の数)を有するポリスチレン樹脂から調製した。
粗製MAG-Tn3の精製を、次に、オクタデシル基によりグラフト化したシリカゲルに基づく三つの異なる固定相(逆相)、即ち、Vydac(登録商標)、Jupiter(登録商標)、及びDaisogel(登録商標)によって、RP-HPLCにより行った。一次精製は、TFA/H2O/CH3CN 0.1/94.9/5.0 v/v/v(A)及びTFA/H2O/CH3CN 0.1/49.9/50.0 v/v/v(B)を用いて行った。勾配は、15分にわたって0%B、5分にわたって0〜40%B、60分にわたって40〜80%Bであった。第二の精製を、AcOH/H2O/CH3CN 0.5/94.5/5.0 v/v/v(A)及びAcOH/H2O/CH3CN 0.5/49.5/50.0 v/v/v(B)を用いて行った。勾配は、15分にわたり0%B、5分にわたり0〜20%B、60分にわたり20〜60%Bであった。
結果を以下の表において報告する。
Figure 0006006244
これらの結果は、本発明によるコンジュゲートの調製プロセスの収率、及び得られたコンジュゲートの純度の両方を、樹脂の置換率を低減することによって、及び/又は適切な固定相を使用することにより、大きく改善できることを実証している。
参考文献
Figure 0006006244

Claims (24)

  1. 式(I):
    M(T-B)n (I)
    (式中:
    - Mは、樹枝状ポリリシンコアであり;
    - Tは、T細胞エピトープであり;
    - Bは、少なくとも一つの炭水化物残基(b)を含む、炭水化物B細胞エピトープであり;
    - nは、整数であり、共有結合的にMに結合したT-B基の数を表す)
    の炭水化物T細胞エピトープコンジュゲートを調製するための方法であって;
    以下:
    i)炭水化物残基(b)のヒドロキシル基が保護基(Pr)で保護されている、保護炭水化物B細胞エピトープ(BPr)を、化合物M(T)nと結合し、それによって炭水化物T細胞エピトープコンジュゲートM(T-BPr)nを形成するステップであって、前記保護基(Pr)は、アリル、p-メトキシベンジル(PMB)、t-ブチルジメチルシリル(TBDMS)、ベンジルオキシメチル(BOM)、レブリニル(Lev)、ベンゾイル(Bz)、2,5-ジフルオロベンゾイル、クロロアセチル、ベンジル(Bn)又はアセチル(Ac)から成る群から選択されるか、又は、それが結合している二つのヒドロキシル基と共に、C5〜C6イソプロピリデンケタール又はC5〜C6環状アルキルカーボネートを形成する、ステップと;
    ii)得られたコンジュゲートM(T-BPr)nから保護基Prを除去し、それによって、炭水化物T細胞エピトープコンジュゲートM(T-B)nを得るステップと
    を含む、方法。
  2. M(T-B)nが、以下の式(Ia)又は(Ib):
    Figure 0006006244
     (式中、Kはリシン残基であり、
    T及びBは、請求項1で定義した通りである)
    から選択される、請求項1に記載の方法。
  3. Mが式:
    Figure 0006006244
     の(K)2K-βAla-OHである、請求項1又は2のいずれかに記載の方法。
  4. Tがペプチドを含むT細胞エピトープである、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
  5. TがCD8+又はCD4+T細胞エピトープであるか、又は、それを含む、請求項4に記載の方法。
  6. Tが、CD4+T細胞エピトープであるか、又は、それを含む、請求項5に記載の方法。
  7. Tが、ポリオウイルス(PV)フラグメントタンパク質、破傷風毒素フラグメント又はPADREペプチドであるか、又はそれを含む、請求項6に記載の方法。
  8. Tが、QYIKANSKFIGITEL(配列番号1)から成るペプチドである、請求項7に記載の方法。
  9. 炭水化物残基(b)が、アミノ酸、ペプチド又は脂質残基に結合している、請求項1から8のいずれかに記載の方法。
  10. Bが、以下から成る群:
    - α-GalNAc-Ser
    - α-GalNAc-Thr
    - β-GalNAc-Ser
    - β-GalNAc-Thr
    - β-Gal-(1-3)-α-GalNAc-Ser
    - β-Gal-(1-3)-α-GalNAc-Thr
    - (α-GalNAc-Ser/Thr)2
    - (α-GalNAc-Ser/Thr)3、及び、
    - (α-GalNAc-Ser/Thr)6
    から選択される炭水化物残基であるか、又はそれを含む、請求項1から9のいずれかに記載の方法。
  11. Bが、残基(α-GalNAc-Ser/Thr)3であるか、又は、それを含む、請求項10に記載の方法。
  12. 保護基Prが、ベンジル(Bn)又はアセチル(Ac)である、請求項1から11のいずれかに記載の方法。
  13. ステップi)が、以下:
    a)ヒドロキシル基が請求項1から12のいずれかに記載の保護基(Pr)により保護されている第一の保護炭水化物残基(bPr)を、化合物M(T)nと結合し、それによって炭水化物T細胞エピトープコンジュゲートM(T-bPr)nを形成するステップと;
    b)式(II)M(T-BPr)nの保護炭水化物コンジュゲートを得るまで、更に保護炭水化物残基(bPr)を用いてステップa)を繰り返すステップと
    を含む、請求項1から12のいずれかに記載の方法。
  14. Prがベンジルである、請求項1から13のいずれかに記載の方法。
  15. ベンジル基が、TfOH又はH2の存在下で除去される、請求項14に記載の方法。
  16. Prがアセチルである、請求項1から13のいずれかに記載の方法。
  17. アセチル基が、ヒドラジン又はMeONaの存在下で除去される、請求項16に記載の方法。
  18. 式(II):
    M(T-BPr)n (II)
    (式中、
    - Mは、樹枝状ポリリシンコアであり;
    - Tは、T細胞エピトープであり;
    - BPrは、ヒドロキシル基が請求項1に記載のPr基により保護されている少なくとも一つの炭水化物残基(b)を含む、保護炭水化物B細胞エピトープであり;
    - nは、整数であり、共有結合的にMに結合した-T-B基の数を表す)
    の炭水化物T細胞エピトープコンジュゲート。
  19. Tがペプチドであるか、又は、それを含む、請求項18に記載の炭水化物T細胞エピトープコンジュゲート。
  20. Prがベンジル(Bn)又はアセチル(Ac)である、請求項18又は19のいずれかに記載の炭水化物T細胞エピトープコンジュゲート。
  21. BPrが、保護(α-GalNAc-Ser/Thr)3である、請求項18から20のいずれかに記載の炭水化物T細胞エピトープコンジュゲート。
  22. Mが、HO-βAla-K(K)2である、請求項18から21のいずれかに記載の炭水化物T細胞エピトープコンジュゲート。
  23. Tが、QYIKANSKFIGITEL(配列番号1)である、請求項18から22のいずれかに記載の炭水化物T細胞エピトープコンジュゲート。
  24. 請求項1から17のいずれかに記載の炭水化物T細胞エピトープコンジュゲートM(T-B)nを調製するための、請求項18から23のいずれかに記載の炭水化物T細胞エピトープコンジュゲートM(T-BPr)nの使用。
JP2013558565A 2011-03-17 2012-03-16 多重抗原糖ペプチド炭水化物コンジュゲートの調製方法 Active JP6006244B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11290138A EP2500033A1 (en) 2011-03-17 2011-03-17 Method for preparing muliple antigen glycopeptide carbohydrate conjugates
EP11290138.4 2011-03-17
PCT/IB2012/051285 WO2012123926A1 (en) 2011-03-17 2012-03-16 Method for preparing multiple antigen glycopeptide carbohydrate conjugates

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2014510083A JP2014510083A (ja) 2014-04-24
JP6006244B2 true JP6006244B2 (ja) 2016-10-12

Family

ID=44512239

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013558565A Active JP6006244B2 (ja) 2011-03-17 2012-03-16 多重抗原糖ペプチド炭水化物コンジュゲートの調製方法

Country Status (16)

Country Link
US (2) US20140378652A9 (ja)
EP (2) EP2500033A1 (ja)
JP (1) JP6006244B2 (ja)
KR (1) KR20140048107A (ja)
CN (1) CN103732246B (ja)
AU (1) AU2012227940A1 (ja)
BR (1) BR112013023599B1 (ja)
CA (1) CA2828688C (ja)
DK (1) DK2686009T3 (ja)
EA (1) EA201391202A1 (ja)
ES (1) ES2537180T3 (ja)
IL (1) IL228384A0 (ja)
MX (1) MX354325B (ja)
SG (1) SG193433A1 (ja)
WO (1) WO2012123926A1 (ja)
ZA (1) ZA201306219B (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017134265A1 (en) 2016-02-05 2017-08-10 Institut Pasteur Use of inhibitors of adam12 as adjuvants in tumor therapies

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL105503A (en) 1992-04-28 1999-05-09 Astra Ab Carbon peptide couplets capable of eliciting an immune response of T cells
US6410690B1 (en) * 1995-06-07 2002-06-25 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies
CA2285018C (en) 1997-03-27 2011-01-04 Institut Pasteur Multiple antigen glycopeptide carbohydrate, vaccine comprising the same and use thereof
US6676946B2 (en) * 1997-03-27 2004-01-13 Institut Pasteur Multiple antigen glycopeptide carbohydrate vaccine comprising the same and use thereof
US6660714B1 (en) * 1997-04-16 2003-12-09 Sloan Kettering Institute For Cancer Research α-O-linked glycoconjugates, methods of preparation and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CA2828688C (en) 2021-08-03
EP2500033A1 (en) 2012-09-19
KR20140048107A (ko) 2014-04-23
WO2012123926A1 (en) 2012-09-20
US20140378652A9 (en) 2014-12-25
CN103732246B (zh) 2017-06-30
EP2686009B1 (en) 2015-04-29
DK2686009T3 (da) 2015-06-15
MX2013010618A (es) 2014-04-14
JP2014510083A (ja) 2014-04-24
EA201391202A1 (ru) 2014-03-31
US20140171618A1 (en) 2014-06-19
CN103732246A (zh) 2014-04-16
MX354325B (es) 2018-02-26
ES2537180T3 (es) 2015-06-03
CA2828688A1 (en) 2012-09-20
BR112013023599A2 (pt) 2019-05-07
AU2012227940A1 (en) 2013-09-05
SG193433A1 (en) 2013-10-30
ZA201306219B (en) 2014-05-28
BR112013023599B1 (pt) 2023-01-10
IL228384A0 (en) 2013-12-31
US20170283466A1 (en) 2017-10-05
US10899799B2 (en) 2021-01-26
EP2686009A1 (en) 2014-01-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wagner et al. Fluorinated glycosyl amino acids for mucin‐like glycopeptide antigen analogues
Miermont et al. Cowpea mosaic virus capsid: a promising carrier for the development of carbohydrate based antitumor vaccines
Chabre et al. Design and creativity in synthesis of multivalent neoglycoconjugates
Cai et al. Towards a fully synthetic MUC1‐based anticancer vaccine: Efficient conjugation of glycopeptides with mono‐, di‐, and tetravalent lipopeptides using click chemistry
WO2006017180A2 (en) Glycopeptide dimers and uses thereof
US10610576B2 (en) Precision glycoconjugates as therapeutic tools
US20210085781A1 (en) Neoglycoconjugates as vaccines and therapeutic tools
Xiao et al. Synthesis and immunological evaluation of MUC1 glycopeptide conjugates bearing N-acetyl modified STn derivatives as anticancer vaccines
JP5111705B2 (ja) 新規な複合多糖、グリコアミノ酸、これらへの中間体、及びこれらの使用
Wright et al. Preparation of synthetic glycoconjugates as potential vaccines against Shigella flexneri serotype 2a disease
Goyard et al. Multivalent glycocyclopeptides: conjugation methods and biological applications
JP6006244B2 (ja) 多重抗原糖ペプチド炭水化物コンジュゲートの調製方法
Pfister et al. Synthesis of glycocluster-containing conjugates for a vaccine against cholera
JPS6172799A (ja) グリコペプチドおよびそれらの製法
US20210260204A1 (en) Fluoro-tf-muc1 glycopeptide conjugate, preparation method and application thereof
Swarts et al. Synthesis and CD structural studies of CD52 peptides and glycopeptides
Simerska et al. Design, synthesis and characterisation of mannosylated ovalbumin lipid core peptide self-adjuvanting vaccine delivery system
JP2013231012A (ja) 糖ペプチド誘導体
JP4813838B2 (ja) コア６型構造を有するｏ−結合型糖アミノ酸誘導体およびその製造方法
Fiore et al. Chemical synthesis of carbohydrate-based vaccines against cancers
JP2024504658A (ja) 担体材料とコンジュゲートさせるための抗原前駆体を含む反応性炭水化物の合成プロセス
Mattson The Synthesis and Study of Tf Antigen Functionalized Dendrimers and Dendrimer End Group Characterization and Indium (III) Promoted Glycosylation
Miermont Syntheses and immunological studies of tumor associated carbohydrate antigens
Sarkar Synthesis and study of anti-tumor vaccines

Legal Events

Date Code Title Description
RD01 Notification of change of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426

Effective date: 20140623

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20140623

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20150223

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20160126

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20160420

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20160816

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20160908

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6006244

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250