KR20140037716A - 소포를 분리하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용하여 소포를 분리하는 방법 - Google Patents

소포를 분리하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용하여 소포를 분리하는 방법 Download PDF

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KR20140037716A
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Abstract

소포를 분리하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용한 방법을 이용하면, 적은 양의 시료로부터 타겟에 비의존적으로 소포를 분리할 수 있고, 소포, 그것의 단백질, 당단백질, 지질, 또는 핵산을 분석하는데 이용할 수 있고, 및 소포에 결합 친화도가 있는 리간드를 스크리닝하는데 이용할 수 있다.

Description

소포를 분리하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용하여 소포를 분리하는 방법{Compositions and kits for detecting a vesicle, and methods for analyzing the vesicle using the same}
소포를 분리하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용하여 소포를 분리하는 방법에 관한 것이다.
생체 내 마이크로베지클은 여러 종류의 세포들에 존재하거나 세포로부터 분비되는 막 구조의 작은 소포이다. 세포 외로 분비되는 마이크로베지클은 (ⅰ)엑소좀: 식균 기원의 직경 30 내지 100 ㎚의 막성 소포, (ⅱ)엑토좀(쉐딩 마이크로베지클(shedding microvesicles, SMVs)이라고도 함): 원형질막으로부터 직접 흘려지고 직경 50 내지 1000 ㎚의 큰 막성 소포, (ⅲ) 세포자살성 수포(apoptotic blebs): 죽어가는 세포에 의해 유출된 직경 50 내지 5000 ㎚의 소포를 포함한다.
그 중 엑소좀 (exosome)은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소포이다. 엑소좀의 직경은 대략 30-100 nm일 수 있다. 엑소좀은 전자 현미경을 통한 연구에서 원형질막(plasma membrane)으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포내 특정 구획에서 기원하며 세포밖으로 방출, 분비되는 것으로 관찰되었다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면, 그러한 소포들은 세포 밖 환경으로 방출되는데, 이것을 엑소좀이라고 부른다. 이러한 엑소좀이 어떤 분자적 기작에 의해 만들어지는지 확실히 밝혀진 바가 없으나, 적혈구뿐만 아니라, B-림프구, T-림프구, 수지상 세포, 혈소판, 대식 세포 등을 포함한 다양한 종류의 면역 세포들과 종양 세포 등도 살아 있는 상태에서 엑소좀을 생산하여 분비한다고 알려져 있다. 엑소좀은 정상 상태, 병적 상태, 또는 이 두 상태하에서 다수의 다른 세포 유형으로부터 분리되어 방출된다고 알려져 있다.
또한, 엑소좀은 마이크로 RNA (microRNA, miRNA)를 포함할 수 있다. miRNA는 그를 포함하는 세포 또는 개체의 상태를 확인하는데 사용될 수 있다. 상기 상태는 질병, 예를 들면 암, 유전병, 심장병, 또는 정신분열과 같은 신경성 질환일 수 있다.
기존 마이크로베지클을 분리하는 방법은 마이크로베지클과 항체를 결합시켜 마이크로베지클을 면역-캡쳐하여 분리하는 방법이다. 이러한 방법은 단백질 구조 변화 등에 의한 항체 인식 부위의 마스킹(masking), 마이크로베지클 이질성(heterogeneity), 단백질 상호 작용 등에 의해 분리 또는 검출 타겟에 따라 편향(bias)이 발생할 수 있다. 분리 또는 검출을 위해 복잡한 프로세스나 고가의 장비가 필요할 수 있고, 시료의 소모량이 높을 수 있다.
따라서, 적은 양의 시료로부터 타겟에 비의존적으로 마이크로베지클을 분리하고, 마이크로베지클을 분석하며, 마이크로베지클에 결합 친화도를 갖는 리간드를 선별하는 것이 필요하다.
소포를 분리하기 위한 조성물을 제공한다.
소포를 분리하기 위한 키트를 제공한다.
소포를 분리하는 방법을 제공한다.
제1 성분이 접합되고 지질 이중층에 끼어드는 성질을 갖는 친지성 분자; 및
제1 성분에 결합하는 제2 성분을 포함하는, 소포를 분리하기 위한 조성물이 제공된다.
친지성(liphophilic) 분자는 지방, 오일, 지질, 및 비극성 용매에 용해되는 특성을 갖는 물질을 말한다. 예를 들면, 친지성 분자는 지방산, 스테롤, 글리세리드 또는 인지질을 포함할 수 있다. 인지질은 분자 안에 인산 에스테르를 가지고 있는 지질로서, 세포막의 주요 성분이다. 예를 들면, 인지질은 포스파티드산, 세팔린, 레시틴, 포스파티딜세린, 포스포이노시티드, 스핑고미엘린, 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DHPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(2,4-디니트로페닐), 또는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[6-[(2,4-디니트로페닐)아미노]헥사노일]일 수 있다.
제1 성분은 제2 성분과 결합 친화도를 갖는 물질을 말한다. 제1 성분은 예를 들면 항체, 항원, 효소, 효소의 기질, 효소의 저해제, 비오틴, 또는 스트렙타비딘일 수 있다. 제1 성분은 친지성 분자에 접합될 수 있다. 제1 성분이 친수성 물질인 경우에는 제1 성분이 접합된 친지성 분자는 친수성 특성과 친지성 특성을 하나의 분자에서 갖는 양친매성 분자일 수 있다.
제1 성분이 접합된 친지성 분자는 지질 이중층에 끼어들 수 있다. 지질 이중층은 예를 들면, 리포좀, 세포막, 소포, 마이크로베지클, 또는 엑소좀일 수 있다.
제2 성분은 제1 성분에 결합 친화도를 갖는 물질을 말한다. 예를 들면, 제1 성분이 항체이면, 제2 성분은 항체에 대한 항원일 수 있다. 제1 성분이 항원이면, 제2 성분은 항원에 대한 항체일 수 있다. 제1 성분이 효소이면, 제2 성분은 효소의 기질 또는 저해제일 수 있다. 제1 성분이 효소의 기질 또는 효소의 저해제이면, 제2 성분은 효소일 수 있다. 제1 성분이 비오틴이면, 제2 성분은 스트렙타비딘일 수 있다. 제1 성분이 스트렙타비딘이면, 제2 성분은 비오틴일 수 있다.
소포(vesicle) 또는 소낭은 지질 이중층으로 둘러싸인 막 구조를 말한다. 예를 들면, 소포는 리포좀 또는 마이크로베지클일 수 있다. 마이크로베지클(microvesicle)은 세포로부터 유래한 막 구조의 작은 소포을 말한다. 마이크로베지클은 순환 마이크로베지클 (circulating microvesicle) 또는 마이크로입자 (microparticles)와 교환가능하게 사용된다. 마이크로베지클은 세포에 존재하거나 세포로부터 분비될 수 있다. 세포 외로 분비되는 마이크로베지클은 엑소좀 (exosome), 엑토좀 (쉐딩 마이크로베지클(shedding microvesicles, SMVs)이라고도 함), 세포자살성 수포(apoptotic blebs), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 엑소좀은 식균 기원의 직경 30 내지 100㎚의 막성 베지클일 수 있다. 엑토좀은 원형질막으로부터 직접 흘려지고 직경 50 내지 1,000㎚의 큰 막성 베지클일 수 있다. 세포자살성 수포는 죽어가는 세포에 의해 유출된 직경 50 내지 5,000㎚의 베지클일 수 있다. 생체 내 마이크로베지클은 마이크로RNA(miRNA) 또는 mRNA(messenger RNA)를 포함할 수 있다. 마이크로베지클의 표면 단백질은 질병 특이적 마커일 수 있다.
제1 성분이 접합되고 지질 이중층에 끼어드는 성질을 갖는 친지성 분자; 및
제1 성분에 결합하는 제2 성분을 포함하는 소포를 분리하기 위한 키트가 제공된다.
친지성(liphophilic) 분자는 지방, 오일, 지질, 및 비극성 용매에 용해되는 특성을 갖는 물질을 말한다. 예를 들면, 친지성 분자는 지방산, 스테롤, 글리세리드 또는 인지질을 포함할 수 있다. 인지질은 분자 안에 인산 에스테르를 가지고 있는 지질로서, 세포막의 주요 성분이다. 예를 들면, 인지질은 포스파티드산, 세팔린, 레시틴, 포스파티딜세린, 포스포이노시티드, 스핑고미엘린, 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DHPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(2,4-디니트로페닐), 또는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[6-[(2,4-디니트로페닐)아미노]헥사노일]일 수 있다.
제1 성분은 제2 성분과 결합 친화도를 갖는 물질을 말한다. 제1 성분은 예를 들면 항체, 항원, 효소, 효소의 기질, 효소의 저해제, 비오틴, 또는 스트렙타비딘일 수 있다. 제1 성분은 친지성 분자에 접합될 수 있다. 제1 성분이 친수성 물질인 경우에는 제1 성분이 접합된 친지성 분자는 친수성 특성과 친지성 특성을 하나의 분자에서 갖는 양친매성 분자일 수 있다.
제1 성분이 접합된 친지성 분자는 지질 이중층에 끼어들 수 있다. 지질 이중층은 예를 들면, 리포좀, 세포막, 소포, 마이크로베지클, 또는 엑소좀일 수 있다.
제2 성분은 제1 성분에 결합 친화도를 갖는 물질을 말한다. 예를 들면, 제1 성분이 항체이면, 제2 성분은 항체에 대한 항원일 수 있다. 제1 성분이 항원이면, 제2 성분은 항원에 대한 항체일 수 있다. 제1 성분이 효소이면, 제2 성분은 효소의 기질 또는 저해제일 수 있다. 제1 성분이 효소의 기질 또는 효소의 저해제이면, 제2 성분은 효소일 수 있다. 제1 성분이 비오틴이면, 제2 성분은 스트렙타비딘일 수 있다. 제1 성분이 스트렙타비딘이면, 제2 성분은 비오틴일 수 있다.
소포(vesicle) 또는 소낭은 지질 이중층으로 둘러싸인 막 구조를 말한다. 예를 들면, 소포는 리포좀 또는 마이크로베지클일 수 있다. 마이크로베지클(microvesicle)은 세포로부터 유래한 막 구조의 작은 소포을 말한다. 마이크로베지클은 순환 마이크로베지클 (circulating microvesicle) 또는 마이크로입자 (microparticles)와 교환가능하게 사용된다. 마이크로베지클은 세포에 존재하거나 세포로부터 분비될 수 있다. 세포 외로 분비되는 마이크로베지클은 엑소좀 (exosome), 엑토좀 (쉐딩 마이크로베지클(shedding microvesicles, SMVs)이라고도 함), 세포자살성 수포(apoptotic blebs), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 엑소좀은 식균 기원의 직경 30 내지 100㎚의 막성 베지클일 수 있다. 엑토좀은 원형질막으로부터 직접 흘려지고 직경 50 내지 1,000㎚의 큰 막성 소포일 수 있다. 세포자살성 수포는 죽어가는 세포에 의해 유출된 직경 50 내지 5,000㎚의 소포일 수 있다. 생체 내 마이크로베지클은 마이크로RNA(miRNA) 또는 mRNA(messenger RNA)를 포함할 수 있다. 마이크로베지클의 표면 단백질은 질병 특이적 마커일 수 있다.
제1 성분이 접합되고 지질 이중층에 끼어드는 성질을 갖는 친지성 분자를 소포를 포함하는 시료와 인큐베이션하여 상기 친지성 분자를 소포에 결합시키는 단계;
반응 혼합물을 제1 성분에 결합하는 제2 성분과 인큐베이션하여 제2 성분을 소포에 결합된 친지성 분자의 제1 성분에 결합시키는 단계; 및
반응 혼합물로부터 소포를 분리하는 단계를 포함하는 시료 중 소포를 분리하는 방법이 제공된다.
상기 방법은 제1 성분이 접합되고 지질 이중층에 끼어드는 성질을 갖는 친지성 분자를 소포를 포함하는 시료와 인큐베이션하여 상기 친지성 분자를 소포에 결합시키는 단계를 포함한다.
친지성(liphophilic) 분자는 지방, 오일, 지질, 및 비극성 용매에 용해되는 특성을 갖는 물질을 말한다. 예를 들면, 친지성 분자는 지방산, 스테롤, 글리세리드 또는 인지질을 포함할 수 있다. 인지질은 분자 안에 인산 에스테르를 가지고 있는 지질로서, 세포막의 주요 성분이다. 예를 들면, 인지질은 포스파티드산, 세팔린, 레시틴, 포스파티딜세린, 포스포이노시티드, 스핑고미엘린, 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DHPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(2,4-디니트로페닐), 또는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[6-[(2,4-디니트로페닐)아미노]헥사노일]일 수 있다.
제1 성분은 제2 성분과 결합 친화도를 갖는 물질을 말한다. 제1 성분은 예를 들면 항체, 항원, 효소, 효소의 기질, 효소의 저해제, 비오틴, 또는 스트렙타비딘일 수 있다. 제1 성분은 친지성 분자에 접합될 수 있다. 제1 성분이 친수성 물질인 경우에는 제1 성분이 접합된 친지성 분자는 친수성 특성과 친지성 특성을 하나의 분자에서 갖는 양친매성 분자일 수 있다.
제1 성분이 접합된 친지성 분자는 지질 이중층에 끼어들 수 있다. 지질 이중층은 예를 들면, 리포좀, 세포막, 소포, 마이크로베지클, 또는 엑소좀일 수 있다.
시료는 체액 또는 세포 배양액일 수 있다. 상기 체액은 예를 들면, 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈장, 혈청, 뇨, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 그의 조합일 수 있다.
시료는 온전한 세포, 죽은 세포, 또는 세포 잔해가 제거된 시료일 수 있다. 예를 들면, 시료는 원심분리, 여과 또는 이들의 조합을 수행하여 전처리된 것일 수 있다.
소포(vesicle) 또는 소낭은 지질 이중층으로 둘러싸인 막 구조를 말한다. 예를 들면, 소포는 리포좀 또는 마이크로베지클일 수 있다. 마이크로베지클(microvesicle)은 세포로부터 유래한 막 구조의 작은 소포을 말한다. 마이크로베지클은 순환 마이크로베지클 (circulating microvesicle) 또는 마이크로입자 (microparticles)와 교환가능하게 사용된다. 마이크로베지클은 세포에 존재하거나 세포로부터 분비될 수 있다. 세포 외로 분비되는 마이크로베지클은 엑소좀 (exosome), 엑토좀 (쉐딩 마이크로베지클(shedding microvesicles, SMVs)이라고도 함), 세포자살성 수포(apoptotic blebs), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 엑소좀은 식균 기원의 직경 30 내지 100㎚의 막성 소포일 수 있다. 엑토좀은 원형질막으로부터 직접 흘려지고 직경 50 내지 1,000㎚의 큰 막성 소포일 수 있다. 세포자살성 수포는 죽어가는 세포에 의해 유출된 직경 50 내지 5,000㎚의 베지클일 수 있다. 생체 내 마이크로베지클은 마이크로RNA(miRNA) 또는 mRNA(messenger RNA)를 포함할 수 있다. 마이크로베지클의 표면 단백질은 질병 특이적 마커일 수 있다.
인큐베이션은 인 비트로에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 상온에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 인큐베이션은 반응물을 혼합하면서 수행될 수 있다.
친지성 분자는 소포의 지질 이중층에 끼어들어 소포에 결합할 수 있다. 상기 결합은 예를 들면 소수성 상호작용일 수 있다. 예를 들면, 친지성 분자의 제1 성분은 지질 이중층의 친수성 영역으로 배열되고 친지성 분자의 친지성 영역은 지질 이중층의 소수성 영역으로 배열될 수 있다.
상기 방법은 반응 혼합물을 제1 성분에 결합하는 제2 성분과 인큐베이션하여 제2 성분을 소포에 결합된 친지성 분자의 제1 성분에 결합시키는 단계를 포함한다.
제2 성분은 제1 성분에 결합 친화도를 갖는 물질을 말한다. 예를 들면, 제1 성분이 항체이면, 제2 성분은 항체에 대한 항원일 수 있다. 제1 성분이 항원이면, 제2 성분은 항원에 대한 항체일 수 있다. 제1 성분이 효소이면, 제2 성분은 효소의 기질 또는 저해제일 수 있다. 제1 성분이 효소의 기질 또는 효소의 저해제이면, 제2 성분은 효소일 수 있다. 제1 성분이 비오틴이면, 제2 성분은 스트렙타비딘일 수 있다. 제1 성분이 스트렙타비딘이면, 제2 성분은 비오틴일 수 있다.
인큐베이션은 인 비트로에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 상온에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 인큐베이션은 반응물을 혼합하면서 수행될 수 있다.
제2 성분은 제1 성분에 결합 친화도를 갖는 물질일 수 있다. 예를 들면, 친지성 분자가 소포에 결합하면 친지성 분자의 제1 성분은 소포의 수용성 표면으로 배열될 수 있다. 소포의 수용성 표면에 배열된 제1 성분은 제2 성분과 결합함으로써, 소포, 제1 성분 및 제2 성분의 복합체가 형성될 수 있다.
제2 성분은 고체 지지체에 고정된 것일 수 있다. 고체 지지체는 예를 들면, 폴리스티렌 플레이트 또는 폴리스티렌 비드일 수 있다.
상기 방법은 반응 혼합물로부터 소포를 분리하는 단계를 포함한다.
분리하는 단계는 예를 들면, 반응 혼합물의 제거, 세척 또는 이들의 조합으로 수행될 수 있다. 분리하는 단계는 고체 지지체에 고정된 제2 성분으로부터 소포를 분리하는 것일 수 있다. 예를 들면, 고체 지지체에 고정되지 않은 제2 성분과 반응 혼합물을 인큐베이션하여 고체 지지체에 고정된 제2 성분으로부터 소포를 분리하는 것일 수 있다.
상기 방법은 분리된 소포를 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 검출은 당업계에 알려진 다양한 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 소포를 염색하거나, 전자현미경으로 확인하거나, 또는 형광 물질이 접합된 리간드를 이용하여 검출할 수 있다. 예를 들면, 형광 물질이 형광 단백질(fluorescent protein)일 경우, 자외선을 조사하여 발생하는 형광광도를 형광광독계(fluorophotometer)를 사용하여 검출할 수 있다.
상기 방법은 분리된 소포와 소포에 결합 친화도를 갖는 리간드를 접촉시키는 단계; 및 소포에 결합한 리간드를 검출하여 소포를 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다. 리간드(ligand)는 예를 들면, 단백질, 당단백질, 인지질, 콜레스테롤에 결합 친화도를 갖는 것일 수 있다. 상기 리간드는 예를 들면, 단백질에 결합 친화도를 갖는 물질, 효소의 기질, 조효소, 조절 인자, 수용체와 특이적으로 결합하는 물질, 렉틴, 항원, 항체, 호르몬, 신경 전달물질, 인지질-결합 단백질, 플렉스트린 상동성 (pleckstrin homology, PH) 도메인을 포함하는 단백질, 또는 콜레스테롤-결합 단백질일 수 있다. 리간드는 형광 물질이 접합된 것일 수 있다. 예를 들면, 형광 물질이 형광 단백질(fluorescent protein)일 경우, 자외선을 조사하여 발생하는 형광광도를 형광광독계(fluorophotometer)를 사용하여 검출할 수 있다. 소포에 결합한 리간드를 검출함으로써 소포를 분석할 수 있다.
상기 방법은 분리된 소포를 용해시켜 소포로부터 핵산을 분리하는 단계; 및 분리된 핵산을 증폭하여 소포의 핵산을 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다. 소포의 용해는 예를 들면, 카오트로픽 염(chaotropic salt), 유기 용매 또는 계면 활성제를 포함하는 용매의 존재 하에 수행될 수 있다. 소포의 용해는 예를 들면, 가열, 교반, 회전, 볼텍싱 또는 이들의 조합으로 수행될 수 있다. 핵산(nucleic acid)은 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기와, 당 및 인산으로 이루어진 고분자 물질을 말한다. 핵산은 예를 들면, mRNA(messenger RNA) 또는 마이크로RNA(microRNA, miRNA)일 수 있다. 예를 들면, 역전사-중합효소 연쇄 반응(reverse-transcription polymerase chain reaction)으로 핵산을 증폭할 수 있다. 증폭된 핵산을 분석함으로써 소포의 핵산을 분석할 수 있다.
상기 방법은 분리된 소포에 2 이상의 리간드를 접촉시키는 단계; 및 소포에 결합한 리간드를 검출하여 소포에 결합 친화도를 갖는 리간드를 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 리간드(ligand)는 예를 들면, 단백질, 당단백질, 인지질, 콜레스테롤에 결합 친화도를 갖는 것일 수 있다. 상기 리간드는 예를 들면, 단백질에 결합 친화도를 갖는 물질, 효소의 기질, 조효소, 조절 인자, 수용체와 특이적으로 결합하는 물질, 렉틴, 항원, 항체, 호르몬, 신경 전달물질, 인지질-결합 단백질, 플렉스트린 상동성 (pleckstrin homology, PH) 도메인을 포함하는 단백질, 또는 콜레스테롤-결합 단백질일 수 있다. 리간드는 형광 물질이 접합된 것일 수 있다. 리간드의 선별은 대조군에서 측정된 신호 또는 다른 종류의 리간드에 의해 측정된 신호의 값을 비교하는 것일 수 있다. 상기 방법은 소포에 2 이상의 리간드를 접촉시킨 후에 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다. 측정된 신호값을 비교함으로써 마이크로베지클에 결합 친화도를 갖는 리간드를 스크리닝할 수 있다.
제1 성분이 접합되고 지질 이중층에 끼어드는 성질을 갖는 친지성 분자; 및 제1 성분에 결합하는 제2 성분을 포함하는 소포를 분리하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용한 방법을 이용하면, 지질 이중층에 친지성 분자가 끼어듬으로써 적은 양의 시료로부터 타겟에 비의존적으로 소포를 분리할 수 있고, 소포, 그것의 단백질, 당단백질, 지질, 또는 핵산을 분석하는데 이용할 수 있고, 및 소포에 결합 친화도가 있는 리간드를 스크리닝하는데 이용할 수 있다.
도 1은 제1 성분이 접합되고 지질 이중층에 끼어드는 성질을 갖는 친지성 분자 및 제1 성분에 결합하는 제2 성분을 이용하여 소포를 분리하는 방법의 모식도이다(1; 소포, 2; 제1 성분이 접합된 친지성 분자, 3; 제2 성분, 4; 고체 지지체, 5; 소포의 표면 단백질, 6; 소포의 표면 단백질에 결합할 수 있는 리간드).
도 2a 및 도 2b는 혈장 중 마이크로베지클을 분리한 결과를 보여준다.
도 3은 마이크로베지클의 표면 단백질을 분석한 결과를 보여준다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 마이크로베지클의 분리
1 ul의 혈장(유방암 0기 환자의 혈장)과 비오틴-X DHPE(N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2- dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt)(제조사 기재 요망)를 섞고, 30분, 1시간 또는 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 스트렙타아비딘이 고정된 플레이트에 인큐베이션된 혈장과 비오틴-X DHPE를 넣어 인큐베이션시켰다. 그 후, 칼세인-AM(Calcein-acetoxymethyl ester)을 첨가하고, 형광광도계(fluorophotometer)(Perkin Elmer Envision) 이용하여 형광 강도를 측정하였다.
그 결과, 도 2a에서 나타낸 바와 같이 마이크로베지클이 분리됨을 확인하였다(■; 비오틴-X DHPE 없음, ◆; 비오틴-X DHPE 첨가).
한편, 칼세인-AM과 인큐베이션시킨 10 ul의 혈장(유방암 0기 환자의 혈장)을 비오틴-X DHPE(10 pmol 내지 320 pmol)와 인큐베이션시켰다. 그 후, 스트렙타비딘이 고정된 플레이트에 인큐베이션 시키고 형광광도계를 이용하여 형광 강도를 측정하였다.
그 결과, 도 2b에서 나타낸 바와 같이 마이크로베지클이 분리되는 것을 확인하였다.
실시예 2. 마이크로베지클에서 핵산의 검출
10 ul의 혈장(유방암 0기 환자의 혈장)과 250 pmol의 비오틴-X DHPE를 섞고, 4℃에서 4 시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 이것을 스트렙타비딘이 고정된 플레이트에 넣고 상온에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션시킨 용액을 제거하고 PBS로 5분 동안 3회 세척하였다. Invitrogen PureLink™ miRNA Isolation Kit을 사용하여 마이크로베지클로부터 miRNA를 추출하고 Exiqon Universal cDNA Synthesis Kit과 Exiqon microRNA Ready-to-Use PCR, Human panel I, V2.M으로 역전사 중합효소 연쇄 반응(Reverse transcription polymerase chain reaction)과 Real-time PCR을 수행하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
miRNA DHPE의 Cp 값 대조군의 Cp 값
hsa-miR-620 34.18 >50.00
hsa-miR-182 33.7 >50.00
hsa-miR-542-5p 32.51 41.2
hsa-miR-31 34.99 43.59
hsa-miR-886-5p 32.01 39.63
hsa-miR-19a 32.89 39.02
hsa-miR-491-5p 34.16 39.92
hsa-miR-584 33.52 38.9
hsa-miR-509-3p 33.48 38.07
hsa-miR-185* 34.79 38.83
hsa-miR-18b 30.71 34.43
hsa-miR-671-5p 32.67 35.66
hsa-miR-570 34.68 37.05
hsa-miR-125a-5p 32.89 35.22
hsa-miR-526b 33.73 35.96
hsa-miR-30b* 33.05 35.27
(*는 pre-miRNA hairpin의 두 개의 arm 중 비교적 높게 발현된다고 알려진 쪽 arm의 반대쪽 arm을 의미함)
분리된 마이크로베지클로부터 miRNA를 검출하였다. Exiqon microRNA Ready-to-Use PCR, Human panel I, V2.M 내 총 375개의 인간 miRNA 중 16종이 Cp<35 이하로 검출되었고, 이 중 miR-18b는 유방암에서 발현이 증가된다는 보고와 유사하다.
실시예 3. 마이크로베지클에서 표면 단백질의 검출
1 ul의 혈장과 비오틴-X DHPE 40 pmol 또는 250 pmol과 섞고, 4℃에서 4 시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 이것을 스트렙타비딘이 고정된 플레이트에 넣고 상온에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션시킨 용액을 제거하고 PBS로 5분 동안 3회 세척하였다. 각각 1 ug의 항-CD24 항체, 항-CD9 항체, 및 항-CD63 항체를 플레이트에 첨가하고 상온에서 16 시간 동안 반응시켰다. 항체 용액을 제거하고 PBS로 5 분 동안 3회 세척하였다. 1 ug의 알렉사 플루오르® 488 염소(goat) 항-마우스 IgG (Invitrogen)을 첨가하고 상온에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. IgG 용액을 제거하고 PBS로 5 분 동안 5회 세척한 후 형광광도계를 이용하여 형광 강도를 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다(◆; 항-CD24 항체, ■; 항-CD9 항체, ▲; 항-CD63 항체).
비오틴-X DHPE의 양이 증가함에 따라 혈장으로부터 분리되는 마이크로베지클의 양이 늘어나고, 항체의 결합도 증가함을 확인하였다. 또한, 비오틴-X DHPE을 이용하여 분리된 마이크로베지클에서 마이크로베지클의 마커인 CD24, CD9, 및 CD63을 검출하였다.

Claims (21)

  1. 제1 성분이 접합되고 지질 이중층에 끼어드는 성질을 갖는 친지성 분자; 및
    제1 성분에 결합하는 제2 성분을 포함하는 소포를 분리하기 위한 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 친지성 분자는 지방산, 스테롤, 글리세리드 또는 인지질을 포함하는 것인 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 인지질은 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DHPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(2,4-디니트로페닐), 또는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[6-[(2,4-디니트로페닐)아미노]헥사노일]인 것인 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 제1 성분은 항체, 항원, 효소, 효소 기질, 효소 저해제, 비오틴 또는 스트렙타비딘인 것인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 제2 성분은 항체에 대한 항원, 항원에 대한 항체, 효소에 대한 효소 기질 또는 효소 저해제, 효소 기질 또는 효소 저해제에 대한 효소, 비오틴 또는 스트렙타비딘인 것인 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 소포는 리포좀 또는 마이크로베지클인 것인 조성물.
  7. 제1 성분이 접합되고 지질 이중층에 끼어드는 성질을 갖는 친지성 분자; 및
    제1 성분에 결합하는 제2 성분을 포함하는 소포를 분리하기 위한 키트.
  8. 청구항 7에 있어서, 친지성 분자는 지방산, 스테롤, 글리세리드 또는 인지질을 포함하는 것인 키트.
  9. 청구항 8에 있어서, 인지질은 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DHPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(2,4-디니트로페닐), 또는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[6-[(2,4-디니트로페닐)아미노]헥사노일]인 것인 키트.
  10. 청구항 7에 있어서, 제1 성분은 항체, 항원, 효소, 효소 기질, 효소 저해제, 비오틴 또는 스트렙타비딘인 것인 것인 키트.
  11. 청구항 7에 있어서, 제2 성분은 항체에 대한 항원, 항원에 대한 항체, 효소에 대한 효소 기질 또는 효소 저해제, 효소 기질 또는 효소 저해제에 대한 효소, 비오틴 또는 스트렙타비딘인 것인 키트.
  12. 청구항 1에 있어서, 소포는 리포좀 또는 마이크로베지클인 것인 키트.
  13. 제1 성분이 접합되고 지질 이중층에 끼어드는 성질을 갖는 친지성 분자를 소포를 포함하는 시료와 인큐베이션하여 상기 친지성 분자를 소포에 결합시키는 단계;
    반응 혼합물을 제1 성분에 결합하는 제2 성분과 인큐베이션하여 제2 성분을 소포에 결합된 친지성 분자의 제1 성분에 결합시키는 단계; 및
    반응 혼합물로부터 소포를 분리하는 단계를 포함하는 시료 중 소포를 분리하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 시료는 체액 또는 세포 배양액인 것인 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 체액은 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈장, 혈청, 뇨, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 그의 조합인 것인 방법.
  16. 청구항 13에 있어서, 시료는 세포 또는 세포 잔해가 제거된 것인 방법.
  17. 청구항 13에 있어서, 제2 성분은 고체 지지체에 고정된 것인 방법.
  18. 청구항 13에 있어서, 분리된 소포를 검출하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  19. 청구항 13에 있어서, 분리된 소포와 소포에 결합 친화도를 갖는 리간드를 접촉시키는 단계; 및
    소포에 결합한 리간드를 검출하여 소포를 분석하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  20. 청구항 13에 있어서, 분리된 소포를 용해시켜 소포로부터 핵산을 분리하는 단계; 및
    분리된 핵산을 증폭하여 소포의 핵산을 분석하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  21. 청구항 13에 있어서, 분리된 소포에 2 이상의 리간드를 접촉시키는 단계; 및
    소포에 결합한 리간드를 검출하여 소포에 결합 친화도를 갖는 리간드를 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
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