KR20140037031A - 피리미딘 자이라제 및 토포이소머라제 ｉｖ 억제제 - Google Patents

피리미딘 자이라제 및 토포이소머라제 ｉｖ 억제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것이다:
[화학식 I]
Figure pct00135

상기 화학식 I에서,
X 및 R은 본원에 정의된 바와 같다. 화학식 I의 화합물은 세균 감염을 치료하기 위한 자이라제 및/또는 토포이소머라제 IV 억제제로서 유용하다. 화학식 I의 화합물은 광범위한 항-세균 활성 및 유리한 독성학적 특성을 지니거나 상기 활성을 갖는 화합물의 프로드럭이다.

Description

피리미딘 자이라제 및 토포이소머라제 ＩＶ 억제제{PYRIMIDINE GYRASE AND TOPOISOMERASE IV INHIBITORS}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2011년 1월 14일자로 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 제61/432,965호; 2011년 8월 4일자로 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 제61/515,174호; 2011년 8월 4일자로 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 제61/515,249호; 및 2011년 6월 20일자로 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 제61/499,134호의 35 U.S.C. §119하의 이익을 주장하며; 각각의 출원의 전문은 본원에 참조로 인용된다.
항생제에 대한 세균 내성은 오랫동안 인지되어 왔으며, 오늘날 전세계적으로 심각한 보건 문제인 것으로 간주되고 있다. 내성으로 인해, 일부 세균 감염은 항생제로 치료하기가 곤란하거나 심지어 치료가 불가능하기도 하다. 이러한 문제는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)(SP), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 및 엔테로코쿠스(Enterococcus)와 같은 특정 세균 균주에서의 다중 약물 내성이 최근 발달함에 따라 특히 심각해지고 있다. 반코마이신에 내성인 엔테로코쿠스의 출현은, 반코마이신이 종전에는 이러한 감염을 치료하는데 유일하게 효과적인 항생제였으며 다수의 감염에 대해 "최후 수단"의 약물인 것으로 간주되어 왔기 때문에, 특히 놀랍다. 엔테로코쿠스와 같은 다수의 기타 약물-내성 세균이 생명을 위협하는 질환을 유발하지는 않으나, 내성을 유도하는 유전자가, 메티실린 내성이 이미 우세한 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 같은 보다 치명적인 유기체로 확산되지 않을까 우려된다[참조: De Clerq, et al., Current Opinion in Anti-infective Investigational Drugs, 1999, 1, 1; Levy, "The Challenge of Antibiotic Resistance", Scientific American, March, 1998].
항생제 내성이 얼마나 신속하게 확산될 수 있을까 하는 것이 또다른 관심사이다. 예를 들어, 1960년대까지 SP는 세계적으로 페니실린에 민감하였고, 1987년대에 미국에서는 SP 균주의 0.02%만이 내성이었다. 그러나, 1995년까지, 페니실린에 대한 SP 내성은 약 7%이었고, 미국 일부에서는 30% 정도로 높은 것으로 보고되었다[참조: Lewis, FDA Consumer magazine (September, 1995); Gershman in The Medical Reporter, 1997].
특히, 병원은 약물-내성 유기체를 형성하고 전달하는 중심으로서 작용한다. 병원성 감염으로 알려진, 병원에서 발생하는 감염은 심각한 문제점으로 급증하고 있다. 매년 병원에서 감염된 2백만 명의 미국인들 중에서, 이들 감염 중 절반 이상이 하나 이상의 항생제에 내성이다. 질병 관리 센터(Center for Disease Control)의 보고에 따르면, 1992년 세균 감염으로 사망한 병원 환자 13,000명 이상이 항생제 치료에 내성이었다[참조: Lewis, "The Rise of Antibiotic-Resistant Infections", FDA Consumer magazine, Sept, 1995].
약물-내성 세균에 대한 퇴치 필요성 및 구입 가능한 약물에 있어서의 실패 증가로 인해, 새로운 항생제를 발견하고자 하는 관심이 다시 생겨났다. 새로운 항생제를 개발하기 위한 흥미로운 전략 중의 하나는, DNA 복제에 필요하고, 이에 따라, 세균 세포 증식 및 분열에 필요한 세균 효소인 DNA 자이라제 및/또는 토포이소머라제 IV를 억제하는 것이다. 또한, 자이라제 및/또는 토포이소머라제 IV 활성은 또한 DNA 전사, 수복 및 재조합과 관련되어 있다.
자이라제는 DNA의 위상적 이성체의 상호전환을 촉매하는 효소 그룹인 토포이소머라제 중의 하나이다[참조: Kornberg and Baker, DNA Replication, 2d Ed., Chapter 12, 1992, W.H. Freeman and Co.; Drlica, Molecular Microbiology, 1992, 6, 425; Drlica and Zhao, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 1997, 61, pp. 377-392]. 자이라제 자체는 DNA 수퍼코일링(supercoiling)을 조절하고, 모체 이중체(parental duplex)의 DNA 가닥이 복제 과정 동안 꼬이지 않을 경우에 발생하는 위상적 응력을 경감시킨다. 또한, 자이라제는 이완되고 밀폐된 환형 이중체 DNA의, 재조합에 보다 유리한 네가티브성 초나선형으로의 전환을 촉매한다. 수퍼코일링 반응의 메카니즘은 DNA 영역 주변을 자이라제로 둘러싸고, 상기 영역에서 이중 가닥이 분해되고, DNA의 제2 영역을 통과하여 분해되고, 분해된 가닥들을 재결합시킴을 포함한다. 이러한 절단 메카니즘은 II형 토포이소머라제의 특성이다. 수퍼코일링 반응은, ATP가 자이라제와 결합함으로써 유도된다. 이어서, ATP는 반응 동안 가수분해된다. 이러한 ATP 결합 및 후속적인 가수분해는 이의 활성에 필요한 DNA-결합된 자이라제에서의 형태 변화를 일으킨다. 또한, DNA 수퍼코일링(또는 이완)의 수준은 ATP/ADP 비율에 의존적인 것으로 밝혀졌다. ATP 부재시, 자이라제가 단지 수퍼코일링된 DNA를 이완시킬 수 있을 뿐이다.
세균 DNA 자이라제는 A 서브유닛(GyrA) 2개와 B 서브유닛(GyrB) 2개로 이루어진 400kDa의 단백질 사량체이다. DNA의 결합 및 절단은 GyrA와 관련이 있는 반면, ATP는 GyrB 단백질에 의해 결합되고 가수분해된다. GyrB는 ATPase 활성을 갖는 아미노-말단 도메인과 GyrA 및 DNA와 상호작용하는 카복시-말단 도메인으로 이루어져 있다. 이에 반해, 진핵성 II형 토포이소머라제는, 네가티브 및 포지티브 수퍼코일을 이완시킬 수 있으나 네가티브 수퍼코일을 도입할 수는 없는 동종이량체이다. 이상적으로, 세균성 DNA 자이라제 및/또는 토포이소머라제 IV의 억제를 기본으로 하는 항생제는 이 효소에 대해 선택적일 수 있으며, 진핵성 II형 토포이소머라제에 대해 상대적으로 불활성일 수 있다.
토포이소머라제 IV는 주로 DNA 복제의 종결시 연결된 염색체 이량체를 분해한다.
널리 사용되는 퀴놀론 항생제는 세균성 DNA 자이라제(GyrA) 및/또는 토포이소머라제 IV(ParC)를 억제한다. 퀴놀론의 예는, 초기 화합물, 예를 들어, 날리딕산 및 옥솔린산 뿐만 아니라, 이후의 보다 강력한 플루오로퀴놀론, 예를 들어, 노르플록사신, 시프로플록사신 및 트로바플록사신을 포함한다. 이들 화합물은 GyrA 및/또는 ParC에 결합하고 절단된 착물을 안정화시켜, 전체적인 자이라제 기능을 억제하여 세포사를 야기한다. 플루오로퀴놀론은 자이라제(GyrA) 및/또는 토포이소머라제 IV(Par C)의 촉매적 서브유닛을 억제한다[참조: Drlica and Zhao, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 1997, 61, 377-392]. 그러나, 이들 부류의 화합물에 있어서도 약물 내성이 또한 문제점으로서 인지되고 있다[참조: WHO Report, "Use of Quinolones in Food Animals and Potential Impact on Human Health", 1998]. 다른 부류의 항생제의 경우처럼 퀴놀론을 사용할 경우, 초기 화합물에 노출된 세균은 종종 동일 부류의 보다 강력한 화합물에 대해 교차 내성을 신속하게 발달시키기도 한다.
ATP 가수분해를 통한 효소의 촉매적 교체(catalytic turnover)/재세팅에 필요한 에너지를 공급할 책임이 있는 관련 서브유닛은 각각 GyrB(자이라제) 및 ParE(토포이소머라제 IV)이다[참조: Champoux, J.J., Annu. Rev. Biochem., 2001, 70, pp. 369-413]. GyrB 및 ParE 서브유닛의 이러한 동일한 ATP 결합 부위를 표적으로 하는 화합물이 각종 세균 감염을 치료하는데 유용할 것이다[참조: Charifson et al., J. Med. Chem., 2008, 51, pp. 5243-5263].
GyrB에 결합하는 것으로 공지되어 있는 억제제는 거의 없다. 예는 쿠마린, 노보바이오신 및 쿠메르마이신 A1, 사이클로티알리딘, 시노딘 및 클레로시딘을 포함한다. 쿠마린은 GyrB에 매우 단단하게 결합하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 노보바이오신은 단백질과의 수소결합 및 몇몇 소수성 접촉의 망상구조를 생성한다. 노보바이오신 및 ATP는 ATP 결합 부위내에서 결합하는 것으로 보이는 반면, 두 가지 화합물의 결합 방향에서 극소하게 중첩된다. 중첩 부분은 노보바이오신의 당 단위 및 ATP 아데닌이다[참조: Maxwell, Trends in Microbiology, 1997, 5, 102].
쿠마린-내성 세균의 경우, 가장 우세한 점 돌연변이는 쿠마린 환의 카보닐에 결합하는 표면 아르기닌 잔기[이. 콜리(E. coli) GyrB 중의 Arg136]에서 이다. 이러한 돌연변이를 갖는 효소는 보다 낮은 수퍼코일링 및 ATPase 활성을 나타내지만, 쿠마린 약물에 의한 억제에 덜 민감하기도 하다[참조: Maxwell, Mol. Microbiol., 1993, 9, 681].
자이라제 수퍼코일링의 강력한 억제제임에도 불구하고, 쿠마린은 항생제로서 널리 사용되지 않는다. 이들은 세균에서의 낮은 투과도, 진핵 독성 및 불량한 수용성으로 인해 일반적으로 적합하지 않다[참조: Maxwell, Trends in Microbiology, 1997, 5, 102]. 이러한 결점을 극복하고, 바람직하게는 활성을 위해 Arg136으로의 결합에 의존하지 않는 신규하고 효과적인 GyrB 및 ParE 억제제를 갖는 것이 바람직하다. 이러한 억제제는 다른 부류의 항생제를 간섭하지 않는 내성 문제에 대한 이력이 없는 경우, 흥미로운 항생제 후보물질일 수 있다.
항생제에 대한 세균 내성이 중요한 공중보건 문제가 되었기 때문에, 보다 신규하고 보다 강력한 항생제를 개발하는 것이 계속 요구되고 있다. 보다 특히, 세균 감염을 치료하기 위해 종전에는 사용되지 않았던 신규한 부류의 화합물을 나타내는 항생제가 필요하다. GyrB(자이라제) 및 ParE(토포이소머라제 IV) 서브유닛 둘 다에서 ATP 결합 부위를 표적으로 하는 화합물이 각종 세균 감염을 치료하는데 유용할 것이다. 이러한 화합물은, 내성 세균의 형성 및 전달이 우세하게 급증하는 병원에서의 병원성 감염을 치료하는데 특히 유용할 것이다. 또한, 이로운 독성학적 특성을 지닌 광범위한 활성을 갖는 새로운 항생제가 요구되고 있다.
본 발명은 자이라제 및/또는 토포이소머라제 IV 억제제로서 유용한 화합물 및 이의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것이다. 본 발명의 자이라제 및/또는 토포이소머라제 IV 억제제는 화학식 I의 화합물 또는 이의 염으로 나타낼 수 있다:
[화학식 I]
Figure pct00001
상기 화학식 I에서,
R은 수소 또는 불소이고;
X는 수소, -PO(OH)2, -PO(OH)O-M+, -PO(O-)2·2M+, 또는 -PO(O-)2·D2 +이며;
M+는 약제학적으로 허용되는 1가 양이온이고;
D2 +는 약제학적으로 허용되는 2가 양이온이다. 화학식 I의 화합물은 광범위한 항-세균 활성 및 유리한 독성 특성을 지니거나 당해 활성을 갖는 화합물의 프로드럭(prodrug)이다.
본 발명은 또한 자이라제 및/또는 토포이소머라제 IV 억제제로서 유용한, 화학식 IA의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것이다. 화학식 IA의 화합물은 화학식 I의 화합물에 포함된다. 화학식 IA의 화합물은 다음 화학식으로 나타낼 수 있다:
[화학식 IA]
Figure pct00002
상기 화학식 IA에서,
R은 수소 또는 불소이다. 화학식 IA의 화합물은 광범위한 항-세균 활성 및 유리한 독성학적 특성을 지닌다.
본 발명은 또한 자이라제 및/또는 토포이소머라제 IV 억제제에 대한 프로드럭으로서 유용한, 화학식 IB의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것이다. 화학식 IB의 화합물은 화학식 I의 화합물에 포함된다. 화학식 IB의 화합물은 다음 화학식으로 나타낼 수 있다:
[화학식 IB]
Figure pct00003
상기 화학식 IB에서,
X는 is -PO(OH)2, -PO(OH)O-M+, -PO(O-)2·2M+, 또는 -PO(O-)2·D2 +이고;
M+은 약제학적으로 허용되는 1가 양이온이며;
D2 +는 약제학적으로 허용되는 2가 양이온이다. 화학식 IB의 화합물은 화합물 (R)-1-에틸-3-(6-플루오로-5-(2-(2-하이드록시프로판-2-일)피리미딘-5-일)-7-(테트라하이드로푸란-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)우레아의 포스페이트 에스테르 프로드럭이며, 이는 광범위한 항-세균 활성 및 유리한 독성학적 특성을 지닌다. 본원에 제공된 화합물 외에, 본 발명은 추가로 화학식 I의 화합물(이는 화학식 IA, IB, IC 및 ID와 같이 화학식 I에 포함되는 다른 화학식들을 포함한다) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 약제학적으로 허용되는 담체, 및 항생제, 소염제, 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제, 리폭시게나제 억제제, 사이토킨 길항제, 면역저해제, 항암제, 항바이러스제, 사이토킨, 성장 인자, 면역조절인자, 프로스타글란딘 또는 항-혈관 과증식 화합물로부터 선택된 추가의 치료제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 포유동물에게 치료학적 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 투여함을 포함하는, 당해 포유동물에서 세균 감염을 치료하는 방법에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 포유동물에게 치료학적 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 항생제, 소염제, 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제, 리폭시게나제 억제제, 사이토킨 길항제, 면역저해제, 항암제, 항-바이러스제, 사이토킨, 성장 인자, 면역조절제, 프로스타글란딘 또는 항-혈관 과증식 화합물을 상기 화합물과 함께 다중 용량 형태의 일부로서 또는 별도의 용량 형태로서 투여함을 포함하는, 상기 포유동물에서 세균 감염을 치료하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 화합물 12의 2개의 대칭 독립성 분자의 열 타원체 플롯(thermal ellipsoid plot)이다.
도 2는 화합물 23의 2개의 대칭 독립성 분자의 열 타원체 플롯이다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "할로겐"은 F, Cl, Br, 또는 I를 의미한다.
달리 기술하지 않는 한, 본원에 나타낸 구조는 또한 구조의 모든 입체화학적 형태; 즉, 각각의 비대칭 중심에 대한 R 및 S 구조를 포함함을 의미한다. 따라서, 본 발명의 단일 입체화학적 이성체 및 거울상이성체 및 부분입체이성체 혼합물은 본 발명의 영역내에 있다.
하나 이상의 원자가 천연에서 일반적으로 발견된 원자 질량 또는 질량수와 상이한 원자 질량 또는 질량수를 갖는 원자로 대체된 화학식 I의 화합물의 동위원소-표지된 형태가 또한 본원에 포함된다. 본 발명의 화합물내로 혼입될 수 있는 동위원소의 예로는 수소, 탄소, 질소, 산소, 및 불소의 동위원소, 예를 들면, 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18O, 및 17O가 포함된다. 이러한 방사선-표지되고 안정한-동위원소 표지된 화합물은 예를 들면, 조사 또는 진단 도구 또는 개선된 치료학적 프로파일을 갖는 자이라제 및/또는 토포이소머라제 IV 억제제로서 유용하다. 구조는 또한 적절한 경우, 화합물의 양쪽성이온 형태 또는 염을 포함한다.
하나의 양태에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 IC의 화합물을 포함한다.
[화학식 IC]
Figure pct00004
상기 화학식 IC에서,
R은 상기 정의한 바와 같다.
다른 양태에서, 화학식 I의 화합물은 하기 제시된 바와 같은 화학식 ID 및 IE의 화합물을 포함한다:
[화학식 ID]
Figure pct00005
(R)-1-에틸-3-(5-(2-(2-하이드록시프로판-2-일)피리미딘-5-일)-7-(테트라하이드로푸란-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)우레아, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염; 및
[화학식 IE]
Figure pct00006
(R)-1-에틸-3-(6-플루오로-5-(2-(2-하이드록시프로판-2-일)피리미딘-5-일)-7-(테트라하이드로푸란-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)우레아, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염. 달리 기술하지 않는 한, 어구, "화학식 I의 화합물"은 화학식 IA, IB, IC, ID, 및 IE를 포함하는 화학식 I에 포함된 본원에 제시된 다른 화학식을 포함하는 것으로 의도된다.
화학식 IB의 화합물은 이들의 모 화합물, 1-에틸-3-[6-플루오로-5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5-일]-7-[(2R)-테트라하이드로푸란-2-일]-1H-벤즈이미다졸-2-일]우레아의 프로드럭이다. 따라서, 당해 프로드럭의 투여시 나타난 활성은 근본적으로 프로드럭의 분해로부터 생성되는 모 화합물의 존재에 기인한다.
용어 "프로드럭"은 투여 및 흡수 후 일부 대사 과정을 통해 생체내에서 약물을 방출하는 약물 전구체인 화합물을 말한다. 일반적으로, 프로드럭은 이의 모 약물보다 생물학적 활성을 덜 소유한다. 프로드럭은 또한 모 약물의 물리적 특성을 개선시키고/시키거나 이는 또한 예를 들면, 약물의 흡수, 혈액 수준, 대사 분포 및 세포 흡수를 조절함으로써 약물의 원치않는 효과 및 독성의 감소를 통해, 전체 약물 효능을 개선시킬 수 있다.
용어 "모 화합물" 또는 "모 약물"은 프로드럭의 투여 후 대사 또는 이화 과정의 효소적 작용을 통해, 또는 화학적 과정을 통해 방출되는 생물학적으로 활성인 실체를 말한다. 모 화합물은 또한 이의 상응하는 프로드럭의 제조를 위한 출발 물질일 수 있다.
M+로 정의된 1가 양이온은 암모늄, 나트륨, 리튬 및 칼륨 이온과 같은 알칼리 금속 이온, 디사이클로헥실아민 이온, 및 N-메틸-D-글루카민 이온을 포함한다. D2+로 정의된 2가 양이온은 알루미늄, 칼슘 및 마그네슘 이온과 같은 알칼리 토 금속 이온을 포함한다. 또한, 아르기닌, 라이신, 오르니틴의 이온 등과 같은 아미노산 양이온이 포함된다. M+가 1가 양이온인 경우, 정의 2M+가 존재하면, M+ 각각은 동일하거나 상이할 수 있음이 인식된다. 또한, 정의 2M+가 존재하는 경우, 2가 양이온 D2+가 대신 존재할 수 있음이 유사하게 인식된다. 또한, 염기성 질소-함유 그룹은 메틸, 에틸, 프로필 및 부틸 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드와 같은 저급 알킬 할라이드; 디메틸, 디에틸, 디부틸과 같은 디알킬 설페이트; 디아밀 설페이트; 데실, 라우릴, 미리스틸 및 스테아릴 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드와 같은 장쇄 할라이드; 벤질 브로마이드와 같은 아랄킬 할라이드 및 기타와 같은 제제로 4급화될 수 있다.
본 발명의 각종 양태는 하기 제시된 바와 같이 화학식 IB의 화합물 또는 염을 포함한다:
(1) X가
(a) -PO(OH)O-M+;
(b) -PO(O-)2·2M+; 또는
(c) -PO(O-)2·D2 +인 화합물;
(2) M+가
(a) Li+, Na+, K+, N-메틸-D-글루카민, 또는 N(R9)4 +-; 또는
(b) Na+이고;
(c) 각각의 R9가 독립적으로 수소 또는 C1-C4 알킬 그룹인 화합물;
(3) D2 +가
(a) Mg2 +, Ca2 +, 및 Ba2 +; 또는
(b) Ca2 +인 화합물;
(4) 화합물 (R)-2-(5-(2-(3-에틸우레이도)-6-플루오로-7-(테트라하이드로푸란-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-5-일)피리미딘-2-일)프로판-2-일 포스페이트; 및
(5) 화합물 이나트륨 (R)-2-(5-(2-(3-에틸우레이도)-6-플루오로-7-(테트라하이드로푸란-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-5-일)피리미딘-2-일)프로판-2-일 포스페이트.
화학식 IB의 화합물 또는 염의 각종의 대안적인 양태는 상기 (1) 내지 (3)에 나열된 대안적인 양태 중 하나 이상을 요구함으로써 선택될 수 있음이 이해된다. 예를 들면, 본 발명의 추가의 양태는 (1)(a) 및 (2)(a); (1)(a) 및 (2)(b); (1)(c) 및 (3)(a); (1)(c) 및 (3)(b); (1)(b) 및 (2)(a); (1)(b) 및 (2)(b) 등을 결합함으로써 수득될 수 있다.
본 발명의 프로드럭은 예상치않은 높은 수 용해도를 특징으로 한다. 이러한 용해도는 전구약물의 보다 높은 용량의 투여를 촉진하여 단위 용량당 보다 큰 약물 부하를 초래한다.
본 발명의 하나의 양태는 이를 필요로 하는 포유동물에게 치료학적 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 투여함을 포함하는, 상기 포유동물에서 세균 감염을 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 양태에 따라서, 본 발명은 생물학적 시료에서 세균 양을 감소시키거나 억제하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 상기 생물학적 시료를 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 접촉시킴을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 시료"는 세포 배양물 또는 이의 추출물; 포유동물로부터 수득된 생검 물질 또는 이의 추출물; 및 혈액, 타액, 뇨, 대변, 정액, 눈물, 또는 다른 체액 또는 이의 추출물을 포함한다. 용어 "생물학적 시료"는 또한 살아있는 유기체를 포함하며, 이 경우 "본 발명의 화합물을 생물학적 시료와 접촉시킴"은 용어 "상기 화합물 또는 상기 화합물을 포함하는 조성물을 포유동물에게 투여함"과 동의어이다.
하나의 양태는 상기 생물학적 시료를 (R)-1-에틸-3-(5-(2-(2-하이드록시프로판-2-일)피리미딘-5-일)-7-(테트라하이드로푸란-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)우레아 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염; 및 (R)-1-에틸-3-(6-플루오로-5-(2-(2-하이드록시프로판-2-일)피리미딘-5-일)-7-(테트라하이드로푸란-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)우레아 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물과 접촉시킴을 포함한다. 이러한 방법에 유용한 약제학적 조성물은 하기 기술되어 있다.
하나의 양태는 상기 생물학적 시료를 화학식 IB의 화합물로 정의된 바와 같은 (R)-1-에틸-3-(6-플루오로-5-(2-(2-하이드록시프로판-2-일)피리미딘-5-일)-7-(테트라하이드로푸란-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)우레아의 포스페이트 에스테르 프로드럭과 접촉시킴을 포함한다. 이러한 방법에 유용한 약제학적 조성물은 하기 기술되어 있다.
화학식 I의 화합물의 항미생물 활성은 항미생물 민감성 검정에서 입증될 수 있다. 항미생물 민감성 검정에 사용된 조건의 세부사항은 하기 실시예에 제시되어 있다.
본 발명의 자이라제 및/또는 토포이소머라제 IV 억제제, 또는 이의 약제학적 염은 동물 또는 사람에게 투여하기 위한 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 세균 양을 측정가능하게 감소시키기에 충분한 양으로의 자이라제 및/또는 토포이소머라제 IV 억제제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 세균 감염을 치료하거나 예방하는데 효과적인 이들 약제학적 조성물은 본 발명의 다른 양태이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "세균 양을 측정가능하게 감소시킨다"는 세균만을 함유하는 시료 및 상기 억제제를 함유하는 시료 사이에 세균의 수에 있어서 측정가능한 변화를 의미한다.
항생제에 대한 세균 유기체의 민감성을 증가시키는 제제는 공지되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,523,288호, 미국 특허 제5,783,561호 및 미국 특허 제6,140,306호는 그람-양성 및 그람-음성 세균의 항생제 민감성을 증가시키기 위한 살세균/투과성-증가 단백질(BPI)의 사용 방법을 기술하고 있다. 세균 유기체의 외막의 투과성을 증가시키는 제제는 문헌[참조: Vaara, M. in Microbiological Reviews (1992) pp. 395-411]에 기술되어 있고, 그람-음성 세균의 민감화는 문헌[참조: Tsubery, H., et al, in J. Med. Chem. (2000) pp. 3085-3092]에 기술되어 있다.
본 발명의 다른 양태는, 이를 필요로하는 포유동물에서 세균 감염의 진전, 중증도 또는 효과를 예방하거나, 억제하거나, 치료하거나 감소시키는, 상기 기술한 바와 같은, 방법에 관한 것이지만, 상기 포유동물에게 항생제에 대한 세균 유기체의 민감성을 증가시키는 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 양태에 따르면, 본 발명의 방법은 동물원, 실험실, 반려 동물, 및 영장류, 설치류, 파충류 및 조류를 포함하는 농장 동물을 포함하나 이에 한정되지 않는 수의사 영역에서 환자를 치료하는데 유용하다. 상기 동물의 예로는 기니아 피그, 햄스터, 게르빌루스쥐(gerbil), 래트, 마우스, 토끼, 개, 고양이, 말, 돼지, 양, 소, 염소, 사슴, 레서스 원숭이, 원숭이, 타마린드(tamarind), 유인원, 개코원숭이, 고릴라, 침팬지, 오랑우탄, 긴팔원숭이, 타조, 닭, 칠면조, 오리 및 거위가 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 약제학적 조성물 및 방법은 일반적으로 생체내에서 세균 감염을 조절하는데 유용할 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법으로 조절될 수 있는 세균 유기체의 예는 다음 유기체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 파이오게네스(Streptococcus pyogenes), 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코쿠스 파에시움(Enterococcus faecium), 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 엔테로박터 아종(Enterobacter spp.), 프로테우스 아종(Proteus spp.), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 이. 콜라이(E. coli), 세라티아 마르케센스(Serratia marcescens), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 코아그. 네그. 스타필로코시(Coag. Neg. Staphylococci), 해모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae), 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis), 클라미도필라 뉴모니아에(Chlamydophila pneumoniae), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 스타필로코쿠스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 스타필로코쿠스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 나이세리아 고노르호에아에(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 마이코박테리움 아비움 복합체(Mycobacterium avium complex), 마이코박테리움아브세수스(Mycobacteriumabscessus), 마이코박테리움 칸사시이(Mycobacterium kansasii) 및 마이코박테리움 울세란스(Mycobacterium ulcerans).
따라서, 조성물 및 방법은 병원내 또는 비-병원내 감염의 진전, 중증도 또는 효과를 억제하거나, 치료하거나 감소시키는데 유용할 것이다. 병원내 및 비-병원내 감염의 예로는 상기도 감염, 하기도 감염, 귀 감염, 흉막폐 및 기관지 감염, 합병 요로 감염, 비합병 요로 감염, 복강내 감염, 심혈관 감염, 혈류 감염, 패혈증, 균혈증, CNS 감염, 피부 및 연조직 감염, GI 감염, 골 및 관절 감염, 생식기 감염, 눈 감염 또는 육아종 감염이 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다. 구체적인 세균 감염의 예로는 비합병 피부 및 피부 구조 감염(uSSSI), 합병 피부 및 피부 구조 감염(cSSSI), 카테터 감염, 인두염, 부비동염, 외이염, 중이염, 기관지염, 농흉, 폐렴, 지역사회-획득 세균성 폐렴(CABP), 병원-획득성 폐렴(HAP), 병원-획득성 세균성 폐렴, 인공호흡기-관련 폐렴(VAP), 당뇨병성 발 감염, 반코마이신 내성 장구균 감염, 방광염 및 신우신염, 신장 결석, 전립샘염, 복막염, 합병 복강내 감염(cIAI) 및 기타 복강간 감염(inter-abdominal infection), 투석-관련 복막염, 내장 농양, 심장내막염, 심근염, 심장막염, 수혈-관련 패혈증, 수막염, 뇌염, 뇌 농양, 골수염, 관절염, 생식기 궤양, 요도염, 질염, 자궁경부염, 치은염, 결막염, 각막염, 안구내염, 낭성 섬유증 환자에서의 감염 또는 발열성 중성구 감소증 환자의 감염이 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다.
용어 "비-병원내 감염"은 또한 지역사회-획득 감염(community acquired infection)으로 언급된다.
따라서, 하나의 양태에서, 조성물 및 방법은 지역사회-획득 세균성 폐렴(CABP), 병원-획득성 폐렴(HAP), 병원-획득성 세균성 폐렴, 인공호흡기-관련 폐렴(VAP), 균혈증, 당뇨병성 발 감염, 카테터 감염, 비합병 피부 및 피부 구조 감염(uSSSI), 합병 피부 및 피부 구조 감염(cSSSI), 반코마이신 내성 엔테로코쿠스 감염 또는 골수염을 억제하거나, 치료하거나 감소시키는데 유용할 것이다.
따라서, 다른 양태에서, 조성물 및 방법은 상기도 감염, 하기도 감염, 귀 감염, 흉막폐 및 기관지 감염, 합병 요로 감염, 비합병 요로 감염, 복강내 감염, 심혈관 감염, 혈류 감염, 패혈증, 균혈증, CNS 감염, 피부 및 연조직 감염, GI 감염, 골 및 관절 감염, 생식기 감염, 눈 감염 또는 육아종 감염, 비합병 피부 및 피부 구조 감염(uSSSI), 합병 피부 및 피부 구조 감염(cSSSI), 카테터 감염, 인두염, 부비동염, 외이염, 중이염, 기관지염, 농흉, 폐렴, 지역사회-획득 세균성 폐렴(CABP), 병원-획득성 폐렴, 병원-획득성 세균성 폐렴, 인공호흡기-관련 폐렴(VAP), 당뇨병성 발 감염, 반코마이신 내성 장구균 감염, 방광염 및 신우신염, 신장 결석, 전립샘염, 복막염, 합병 복강내 감염(cIAI) 및 기타 복강간 감염, 투석-관련 복막염, 내장 농양, 심장내막염, 심근염, 심장막염, 수혈-관련 패혈증, 수막염, 뇌염, 뇌 농양, 골수염, 관절염, 생식기 궤양, 요도염, 질염, 자궁경부염, 치은염, 결막염, 각막염, 안구내염, 낭성 섬유증 환자에서의 감염 또는 발열성 중성구 감소증 환자의 감염의 진전, 중증도 또는 효과를 억제하거나, 치료하거나 감소시키는데 유용할 것이다.
다른 양태에서, 세균 감염은 스트렙토코수스 뉴모니아에, 스트렙토코쿠스 피오게네스, 엔테로코쿠스 파에칼리스, 엔테로코쿠스 파에시움, 스타필로코쿠스 아우레우스, 코아그. 네그. 스타필로코시, 바실루스 안트라시스, 스타필로코쿠스 에피데르미디스, 스타필로코쿠스 사프로피티쿠스, 또는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 중 하나 이상의 존재를 특징으로 한다.
또다른 양태에서, 세균 감염은 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 엔테로코쿠스 파에칼리스 또는 스타필로코쿠스 아우레우스 중의 하나 이상의 존재를 특징으로 한다.
또다른 양태에서, 세균 감염은 이. 콜리, 모락셀라 카타랄리스 또는 헤모필루스 인플루엔자에 중의 하나 이상의 존재를 특징으로 한다.
또다른 양태에서, 세균 감염은 클로스트리디움 디피실레, 나이세리아 고노로에아에, 네이세리아 메닝기티디스, 마이코박테리움 아비움 콤플렉스, 마이코박테리움 아브세수스, 마이코박테리움 칸사시, 마이코박테리움 울세란스, 클라미도필라 뉴모니아에 및 클라미디아 트라코마티스 중의 하나 이상의 존재를 특징으로 한다.
또다른 양태에서, 세균 감염은 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 스타필로코쿠스 에피데르미디스, 엔테로코쿠스 파에칼리스, 스타필로코쿠스 아우레우스, 클로스트리디움 디피실레, 모락셀라 카타랄리스, 나이세리아 고노로에아에, 네이세리아 메닝기티디스, 마이코박테리움 아비움 콤플렉스, 마이코박테리움 아브세수스, 마이코박테리움 칸사시, 마이코박테리움 울세란스, 클라미도필라 뉴모니아에, 클라미디아 트라코마티스, 헤모필루스 인플루엔자에, 스트렙토코쿠스 피오게네스 또는 β-용혈성 스트렙토코쿠스 중의 하나 이상의 존재를 특징으로 한다.
몇몇 양태에서, 세균 감염은 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 플루오로퀴놀론 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 반코마이신 중간체 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 리네졸리드 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 페니실린 내성 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 매크롤라이드 내성 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 플루오로퀴놀론 내성 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 반코마이신 내성 엔테로코쿠스 파에칼리스, 리네졸리드 내성 엔테로코쿠스 파에칼리스, 플루오로퀴놀론 내성 엔테로코쿠스 파에칼리스, 반코마이신 내성 엔테로코쿠스 파에시움, 리네졸리드 내성 엔테로코쿠스 파에시움, 플루오로퀴놀론 내성 엔테로코쿠스 파에시움, 암피실린 내성 엔테로코쿠스 파에시움, 매크롤라이드 내성 헤모필루스 인플루엔자에, β-락탐 내성 헤모필루스 인플루엔자에, 플루오로퀴놀론 내성 헤모필루스 인플루엔자에, β-락탐 내성 모락셀라 카타랄리스, 메티실린 내성 스타필로코쿠스 에피데르미디스, 메티실린 내성 스타필로코쿠스 에피데르미디스, 반코마이신 내성 스타필로코쿠스 에피데르미디스, 플루오로퀴놀론 내성 스타필로코쿠스 에피데르미디스, 매크롤라이드 내성 마이코플라스마 뉴모니아에, 이소니아지드 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 리팜핀 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 메티실린 내성 코아굴라제 음성 스타필로코쿠스, 플루오로퀴놀론 내성 코아굴라제 음성 스타필로코쿠스, 글리코펩타이드 중간체 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 반코마이신 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 헤테로 반코마이신 중간체 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 헤테로 반코마이신 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 매크롤라이드-린코사미드-스트렙토그라민 내성 스타필로코쿠스, β-락탐 내성 엔테로코쿠스 파에칼리스, β-락탐 내성 엔테로코쿠스 파에시움, 케톨리드 내성 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 케톨리드 내성 스트렙토코쿠스 피오게네스, 매크롤라이드 내성 스트렙토코쿠스 피오게네스, 반코마이신 내성 스타필로코쿠스 에피데르미디스, 플루오로퀴놀론 내성 나이세리아 고노로에아에, 다중약물 내성 수도모나스 아에루기노사 또는 세팔로스포린 내성 나이세리아 고노로에아에 중의 하나 이상의 존재를 특징으로 한다.
또다른 양태에 따르면, 메티실린 내성 스타필로코쿠스는 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 메티실린 내성 스타필로코쿠스 에피데르미디스 또는 메티실린 내성 코아굴라제 음성 스타필로코쿠스로부터 선택된다.
몇몇 양태에서, 화학식 I의 화합물의 형태는 지역사회 획득성 MRSA(즉, cMRSA)를 치료하는데 사용된다.
또다른 양태에서, 화학식 I의 화합물의 형태는 답토마이신 내성 엔테로코쿠스 파에시움 및 답토마이신 내성 스타필로코쿠스 아우레우스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 답토마이신 내성 유기체를 치료하는데 사용된다.
또다른 양태에 따르면, 플루오로퀴놀론 내성 스타필로코쿠스는 플루오로퀴놀론 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 플루오로퀴놀론 내성 스타필로코쿠스 에피데르미디스 또는 플루오로퀴놀론 내성 코아굴라제 음성 스타필로코쿠스로부터 선택된다.
또다른 양태에 따르면, 글리코펩타이드 내성 스타필로코쿠스는 글리코펩타이드 중간체 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 반코마이신 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 반코마이신 중간체 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 헤테로 반코마이신 중간체 내성 스타필로코쿠스 아우레우스 또는 헤테로 반코마이신 내성 스타필로코쿠스 아우레우스로부터 선택된다.
또다른 양태에 따르면, 매크롤라이드-린코사미드-스트렙토그라민 내성 스타필로코쿠스는 매크롤라이드-린코사미드-스트렙토그라민 내성 스타필로코쿠스 아우레우스이다.
또다른 양태에 따르면, 리네졸리드 내성 엔테로코쿠스는 리네졸리드 내성 엔테로코쿠스 파에칼리스 또는 리네졸리드 내성 엔테로코쿠스 파에시움으로부터 선택된다.
또다른 양태에 따르면, 글리코펩타이드 내성 엔테로코쿠스는 반코마이신 내성 엔테로코쿠스 파에시움 또는 반코마이신 내성 엔테로코쿠스 파에칼리스로부터 선택된다.
또다른 양태에 따르면, β-락탐 내성 엔테로코쿠스 파에칼리스는 β-락탐 내성 엔테로코쿠스 파에시움이다.
또다른 양태에 따르면, 페니실린 내성 스트렙토코쿠스는 페니실린 내성 스트렙토코쿠스 뉴모니아에이다.
또다른 양태에 따르면, 매크롤라이드 내성 스트렙토코쿠스는 매크롤라이드 내성 스트렙토코쿠스 뉴모니아이다.
또다른 양태에 따르면, 케톨리드 내성 스트렙토코쿠스는 매크롤라이드 내성 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 및 케톨리드 내성 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터 선택된다.
또다른 양태에 따르면, 플루오로퀴놀론 내성 스트렙토코쿠스는 플루오로퀴놀론 내성 스트렙토코쿠스 뉴모니아에이다.
또다른 양태에 따르면, β-락탐 내성 헤모필루스는 β-락탐 내성 헤모필루스 인플루엔자에이다.
또다른 양태에 따르면, 플루오로퀴놀론 내성 헤모필루스는 플루오로퀴놀론 내성 헤모필루스 인플루엔자에이다.
또다른 양태에 따르면, 매크롤라이드 내성 헤모필루스는 매크롤라이드 내성 헤모필루스 인플루엔자에이다.
또다른 양태에 따르면, 매크롤라이드 내성 마이코플라스마는 매크롤라이드 내성 마이코플라스마 뉴모니아에이다.
또다른 양태에 따르면, 이소니아지드 내성 마이코박테리움은 이소니아지드 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스이다.
또다른 양태에 따르면, 리팜핀 내성 마이코박테리움은 리팜핀 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스이다.
또다른 양태에 따르면, β-락탐 내성 모락셀라는 β-락탐 내성 모락셀라 카타랄리스이다.
또다른 양태에 따르면, 세균 감염은 다음 중의 하나 이상의 존재를 특징으로 한다: 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 플루오로퀴놀론 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 반코마이신 중간체 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 리네졸리드 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 페니실린 내성 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 매크롤라이드 내성 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 플루오로퀴놀론 내성 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 반코마이신 내성 엔테로코쿠스 파에칼리스, 리네졸리드 내성 엔테로코쿠스 파에칼리스, 플루오로퀴놀론 내성 엔테로코쿠스 파에칼리스, 반코마이신 내성 엔테로코쿠스 파에시움, 리네졸리드 내성 엔테로코쿠스 파에시움, 플루오로퀴놀론 내성 엔테로코쿠스 파에시움, 암피실린 내성 엔테로코쿠스 파에시움, 매크롤라이드 내성 헤모필루스 인플루엔자에, β-락탐 내성 헤모필루스 인플루엔자에, 플루오로퀴놀론 내성 헤모필루스 인플루엔자에, β-락탐 내성 모락셀라 카타랄리스, 메티실린 내성 스타필로코쿠스 에피데르미디스, 메티실린 내성 스타필로코쿠스 에피데르미디스, 반코마이신 내성 스타필로코쿠스 에피데르미디스, 플루오로퀴놀론 내성 스타필로코쿠스 에피데르미디스, 매크롤라이드 내성 마이코플라스마 뉴모니아에, 이소니아지드 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 리팜핀 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 플루오로퀴놀론 내성 나이세리아 고노로에아에 또는 세팔로스포린 내성 나이세리아 고노로에아에.
또다른 양태에 따르면, 세균 감염은 다음 중의 하나 이상의 존재를 특징으로 한다: 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 메티실린 내성 스타필로코쿠스 에피데르미디스, 메티실린 내성 코아굴라제 음성 스타필로코쿠스, 플루오로퀴놀론 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 플루오로퀴놀론 내성 스타필로코쿠스 에피데르미디스, 플루오로퀴놀론 내성 코아굴라제 음성 스타필로코쿠스, 반코마이신 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 글리코펩타이드 중간체 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 반코마이신 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 반코마이신 중간체 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 헤테로 반코마이신 중간체 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 헤테로 반코마이신 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 반코마이신 내성 엔테로코쿠스 파에시움, 반코마이신 내성 엔테로코쿠스 파에칼리스, 페니실린 내성 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 매크롤라이드 내성 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 플루오로퀴놀론 내성 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 매크롤라이드 내성 스트렙토코쿠스 피오게네스 또는 β-락탐 내성 헤모필루스 인플루엔자에.
또다른 양태에 따르면, 세균 감염은 다음 중의 하나 이상의 존재를 특징으로 한다: 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 반코마이신 내성 엔테로코쿠스 파에시움, 반코마이신 내성 엔테로코쿠스 파에칼리스, 반코마이신 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 반코마이신 중간체 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 헤테로 반코마이신 중간체 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 헤테로 반코마이신 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 다중약물 내성 수도모나스 아에루기노사, 이소니아지드 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스 및 리팜핀 내성 마이코박테리움 투베르쿨로시스.
본 발명의 화합물외에, 본 발명의 화합물의 약제학적으로 허용되는 유도체 또는 프로드럭도 상기 확인된 장애를 치료하거나 예방하기 위한 조성물에 사용될 수 있다.
"약제학적으로 허용되는 유도체 또는 프로드럭"은 수용체에게 투여시 본 발명의 화합물 또는 이의 억제 활성 대사물질 또는 잔기를 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 본 발명의 화합물의 임의의 약제학적으로 허용되는 염, 에스테르, 에스테르의 염 또는 다른 유도체도 의미한다. 특히 양호한 유도체 또는 프로드럭은, 이러한 화합물을 포유동물에게 투여시(예를 들면, 경구 투여된 화합물이 혈액내로 보다 용이하게 흡수되도록 함으로써) 본 발명의 화합물의 생체이용률을 증가시키거나 모 종에 대한 생물학적 구획(예를 들면, 뇌 또는 림프계)으로의 모 화합물의 전달을 향상시키는 것들이다.
본 발명의 화합물의 약제학적으로 허용되는 프로드럭은 에스테르, 아미노산 에스테르, 포스페이트 에스테르, 금속 염 및 설포네이트 에스테르를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염은 약제학적으로 허용되는 무기 산 및 염기 및 유기 산 및 염기로부터 유도된 것들을 포함한다. 적합한 산 염의 예는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 비설페이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 글리콜레이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시에탄설포네이트, 락테이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 옥살레이트, 팔모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 살리실레이트, 석시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 토실레이트 및 운데카노에이트를 포함한다. 옥살산과 같은 기타 산은 그 자체로는 약제학적으로 허용되지 않지만, 본 발명의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용되는 산 부가염을 수득하는데 있어서 중간체로서 유용한 염을 제조하는데 사용될 수 있다.
적합한 염기로부터 유도된 염은 알칼리 금속(예를 들면, 나트륨 및 칼륨), 알칼리 토금속(예를 들면, 마그네슘), 암모늄 및 N+(C1 -4 알킬)4 염을 포함한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 화합물의 임의의 염기성 질소 함유 그룹의 4급화를 포함한다. 수용성 또는 유용성 또는 분산성 생성물이 이러한 4급화로 수득될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 이러한 조성물은 추가의 치료제를 임의로 포함할 수 있다. 이러한 제제는 항생제, 소염제, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제, 리폭시게나제 억제제, 사이토킨 길항제, 면역억제제, 항암제, 항바이러스제, 사이토킨, 성장 인자, 면역조절제, 프로스타글란딘 또는 항혈관 과증식 화합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 본 발명의 화합물과 함께 환자에게 투여할 수 있고 이의 약리학적 활성을 파괴하지 않는 비-독성 담체를 나타낸다.
본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체는 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예를 들어, 사람 혈청 알부민, 완충 물질, 예를 들어, 포스페이트, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 식물성 포화 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예를 들어, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스계 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 양모지 및 자가-유화성 약물 전달 시스템(SEDDS), 예를 들어, 알파-토코페롤, 폴리에틸렌글리콜 1000 석시네이트, 또는 기타의 유사한 중합체 전달 매트릭스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "약제학적 유효량"은 환자에서 세균 감염을 치료하거나 완화시키는데 효과적인 양을 나타낸다. 용어 "예방학적 유효량"은 환자에서 세균 감염을 예방하거나 실질적으로 경감시키는데 효과적인 양을 나타낸다.
치료되거나 예방되는 특정 상태 또는 질환 상태에 따라, 상기 상태를 치료하거나 예방하기 위해 통상적으로 투여되는 추가의 치료제를 본 발명의 억제제와 함께 투여할 수 있다. 이러한 치료제는 항생제, 소염제, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제, 리폭시게나제 억제제, 사이토킨 길항제, 면역억제제, 항암제, 항바이러스제, 사이토킨, 성장 인자, 면역조절제, 프로스타글란딘 또는 항혈관 과증식 화합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 화합물은 생체내 세균 감염 수준을 조절하고 세균에 의해 매개되는 효과의 진전 또는 중증도를 감소시키거나 질환을 치료하기 위해 통상적인 방식으로 사용될 수 있다. 이러한 치료방법, 이의 용량 수준 및 요구사항은 당업계의 통상의 숙련가들에 의해 이용 가능한 방법 및 기술로부터 선택될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 화합물은 세균 감염 또는 질환을 앓고 있는 환자에게 감염 또는 질환의 중증도를 경감시키기에 효과적인 양으로 약제학적으로 허용되는 방식으로 투여하기 위한 약제학적으로 허용되는 보조제와 배합될 수 있다.
또는, 본 발명의 화합물은 세균 감염 또는 질환으로부터 개체를 연장된 시간 동안 치료 또는 보호하기 위한 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 화합물은 세균 감염 또는 질환으로부터 개체를 1-2주에 걸쳐 치료 또는 보호하기 위한 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 또다른 양태에서, 본 발명의 화합물은 세균 감염 또는 질환으로부터 개체를 4-8주에 걸쳐 치료 또는 보호하기 위한 조성물 및 방법에(예를 들면, 심내막염 또는 골수염이 있거나 발병할 위험이 있는 환자를 치료하는데) 사용될 수 있다. 또다른 양태에서, 본 발명의 화합물은 세균 감염 또는 질환으로부터 개체를 8-12주에 걸쳐 치료 또는 보호하기 위한 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 화합물은 단독으로 또는 본 발명의 기타의 화합물과 함께 약제학적 조성물 중의 효소 억제제의 통상적인 이용과 일치되는 방식으로 이러한 조성물에 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 백신에 통상적으로 사용되는 약제학적으로 허용되는 보조제와 배합될 수 있고, 세균 감염 또는 질환으로부터 연장된 시간에 걸쳐 개체를 보호하기 위해 예방학적 유효량으로 투여될 수 있다.
몇몇 양태에서, 화학식 I의 화합물은 세균 감염을 방지하기 위해 예방학적으로 사용될 수 있다. 몇몇 양태에서, 화학식 I의 화합물은, 세균성 심내막염에서 직면하는 것과 같은 기회 감염을 방지하기 위해 치과 또는 외과 치료 전, 동안 또는 후에 사용될 수 있다. 또 다른 양태에서, 화학식 I의 화합물은 적출, 치주 치료, 치과 임플란트 식립 및 근관치료 수술을 포함하지만 이에 제한되지 않는 치과 치료에서 예방적으로 사용될 수 있다. 또다른 양태에서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 일반 수술, 호흡기 수술(편도선 수술/아데노이드 절제술), 위장관 수술(상부 GI 및 대기 소장 수술, 식도 경화요법 및 확장술, 대장 절제술, 급성 맹장수술), 외상 수술(천공성 복부 수술), 비뇨생식관 수술(전립선 절제술, 요도 확장술, 방광내시경, 질 또는 복부 자궁절제술, 제왕절개술), 이식 수술(신장, 간, 췌장 또는 신장 이식), 두경부 수술(피부 절제, 경부청소술, 후두적출, 두경부 암 수술, 하악 골절), 졍형외과 수술(인공관절 치환술, 외상성 개방성 골절), 혈관 수루(말초 혈관 치료), 흉부외과 수술, 관상 동맥 바이패스 수술, 폐 절제술 및 신경외과 수술을 포함하지만 이에 제한되지 않는 수술 과정에서 예방학적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "세균 감염을 방지하는"은, 달리 나타내지 않는 한, 세균 감염을 방지하기 위한, 본 발명의 자이라제 및/또는 토포이소머라제 IV 억제제와 같은 항생제의 예방학적 사용을 의미한다. 자이라제 및/또는 토포이소머라제 IV 억제제로의 치료는 자이라제 및/또는 토포이소머라제 IV 억제제에 감수성인 유기체에 의해 야기되는 감염을 방지하기 위해 예방학적으로 수행될 수 있다. 예방적 치료가 고려될 수 있는 일반적인 세트의 상태 중의 하나는 개체가, 예를 들면, 면역력 약화, 수술, 외상, 체내의 인공 장치의 존재(일시적 또는 영구적), 해부학적 결함, 높은 수준의 세균 노출 또는 질환-유발 병원균에 대한 가능한 노출로 인한 감염에 더욱 취약한 경우이다. 면역력 약화를 야기할 수 있는 요인의 예는 화학요법, 방사선 요법, 당뇨병, 노령, HIV 감염 및 이식을 포함한다. 해부학적 결함의 예는 세균성 심내막염의 위험을 증가시키는 심장 판막의 결함일 수 있다. 인공 장치의 예는 인공 관절, 수술용 핀, 카테터 등을 포함한다. 자이라제 및/또는 토포이소머라제 IV 억제제의 예방학적 사용이 적절할 수 있는 또다른 세트의 상황은 개체간의 병원균의 확산을 방지하기 위한 것일 수 있다(직접 또는 간접). 병원균의 확산을 방지하기 위한 예방학적 사용의 구체적인 예는 의료 기관(예를 들면, 병원 또는 양로원)에서 개인들에 의한 자이라제 및/또는 토포이소머라제 IV 억제제의 사용이다.
화학식 I의 화합물은 또한 각종 세균 감염으로부터 치료 또는 예방 효과를 증가시키기 위해 다른 항생제와 동시-투여될 수 있다. 본 발명의 화합물을 기타 제제와 병용 요법으로 투여하는 경우, 이들은 환자에게 연속적으로 투여되거나 동시에 투여될 수 있다. 또는, 본 발명에 따르는 약제학적 또는 예방학적 조성물은 화학식 I의 화합물과 기타 치료학적 또는 예방학적 제제와의 배합물을 포함한다.
몇몇 양태에서, 추가의 치료제 또는 치료제들은 천연 페니실린, 페니실리나제-내성 페니실린, 항수도모나스 페니실린, 아미노페니실린, 1세대 세팔로스포린, 2세대 세팔로스포린, 3세대 세팔로스포린, 4세대 세팔로스포린, 카바페넴, 세파마이신, 퀴놀론, 플루오로퀴놀론, 아미노글리코시드, 매크롤라이드, 케톨리드, 폴리믹신, 테트라사이클린, 글리코펩타이드, 스트렙토그라민, 옥사졸리디논, 리파마이신 또는 설폰아미드로부터 선택되는 항생제이다.
몇몇 양태에서, 추가의 치료제 또는 치료제들은 페니실린, 세팔로스포린, 퀴놀론, 아미노글리코시드 또는 옥사졸리디논으로부터 선택되는 항생제이다.
또다른 양태에서, 추가의 치료제는 벤자틴 페니실린 G, 페니실린 G 및 페니실린 V을 포함하는 천연 페니실린, 클록사실린(Cloxacillin), 디클록사실린(Dicloxacillin), 나프실린(Nafcillin) 및 옥사실린(Oxacillin)을 포함하는 페니실리나제-내성 페니실린, 카베니실린(Carbenicillin), 메즐로실린(Mezlocillin), 피페르실린(Pipercillin), 피페르실린/타조박탐(Pipercillin/tazobactam), 티카리실린(Ticaricillin) 및 티카리실린/클라불라네이트(Ticaricillin/Clavulanate)를 포함하는 항수도모나스 페니실린, 아목시실린(Amoxicillin), 암피실린(Ampicillin) 및 암피실린/설박탐(Ampicillin/Sulbactam)을 포함하는 아미노페니실린, 세파졸린(Cefazolin), 세파드록실(Cefadroxil), 세팔렉신(Cephalexin) 및 세파드린(Cephadrine)을 포함하는 1세대 세팔로스포린, 세파클로르(Cefaclor), 세파클로르-CD, 세파만돌(Cefamandole), 세포나시드(Cefonacid), 세프프로질(Cefprozil), 로라카베르(Loracarbef) 및 세푸록심(Cefuroxime)을 포함하는 2세대 세팔로스포린, 세프디니르(Cefdinir), 세픽심(Cefixime), 세포페라존(Cefoperazone), 세포탁심(Cefotaxime), 세프포독심(Cefpodoxime), 세프타지딤(Ceftazidime), 세프티부텐(Ceftibuten), 세프티족심(Ceftizoxme) 및 세프트리악손(Ceftriaxone)을 포함하는 3세대 세팔로스포린, 세페핌(Cefepime), 세프타롤린(Ceftaroline) 및 세프토비프롤(Ceftobiprole)을 포함하는 4세대 세팔로스포린, 세포테탄(Cefotetan) 및 세폭시틴(Cefoxitin)을 포함하는 세파마이신, 도리페넴(Doripenem), 이미페넴(Imipenem) 및 메로페넴(Meropenem)을 포함하는 카바페넴, 아즈트레오남(Aztreonam)을 포함하는 모노박탐, 시녹사신(Cinoxacin), 날리딕산(Nalidixic acid), 옥솔리닌산(Oxolininc acid) 및 피페미드산(Pipemidic acid)을 포함하는 퀴놀론, 베시플록사신(Besifloxacin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 에녹사신(Enoxacin), 가티플록사신(Gatifloxacin), 그레파플록사신(Grepafloxacin), 레보플록사신(Levofloxacin), 로메플록사신(Lomefloxacin), 목시플록사신(Moxifloxacin), 노르플록사신(Norfloxacin), 오플록사신(Ofloxacin) 및 스파르플록사신(Sparfloxacin)을 포함하는 플루오로퀴놀론, 아미카신(Amikacin), 겐타마이신(Gentamicin), 카나마이신(Kanamycin), 네오마이신(Neomycin), 네틸마이신(Netilmicin), 스펙티노마이신(Spectinomycin), 스트렙토마이신(Streptomycin) 및 토브라마이신(Tobramycin)을 포함하는 아미노글리코시드, 아지트로마이신(Azithromycin), 클라리트로마이신(Clarithromycin) 및 에리트로마이신(Erythromycin)을 포함하는 매크롤라이드, 텔리트로마이신(Telithromycin)을 포함하는 케톨리드, 클로르테트라사이클린, 데메클로사이클린(Demeclocycline), 독시사이클린(Doxycycline), 미노사이클린(Minocycline) 및 테트라사이클린을 포함하는 테트라사이클린, 오리타반신(Oritavancin), 달바반신(Dalbavancin), 텔라반신(Telavancin), 테이코플라닌(Teicoplanin) 및 반코마이신(Vancomycin)을 포함하는 글리코펩타이드, 달포프리스틴/퀴누프리스틴(Dalfopristin/quinupristin)을 포함하는 스트렙토그라민, 리네졸리드(Linezolid)를 포함하는 옥사졸리돈, 리파부틴(Rifabutin) 및 리팜핀(Rifampin)을 포함하는 리파마이신 및 박티트라신(bactitracin), 콜리스틴(colistin), 티가실(Tygacil), 다프토마이신(Daptomycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), 클린다마이신(clindamycin), 이소니아지드(isoniazid), 메트로니다졸(metronidazole), 무피로신(mupirocin), 폴리믹신 B, 피라진아미드, 트리메토프림/설파메톡사졸(trimethoprim/sulfamethoxazole) 및 설프이속사졸을 포함하는 기타 항생제로부터 선택된다.
또다른 양태에서, 추가의 치료제는 페니실린 G를 포함하는 천연 페니실린, 나프실린 및 옥사실린을 포함하는 페니실리나제-내성 페니실린, 피페르실린/타조박탐을 포함하는 항수도모나스 페니실린, 아목시실린을 포함하는 아미노페니실린, 세팔렉신을 포함하는 1세대 세팔로스포린, 세파클로르, 세파클로르-CD 및 세푸록심을 포함하는 2세대 세팔로스포린, 세프타지딤 및 세프트리악손을 포함하는 3세대 세팔로스포린, 세페핌을 포함하는 4세대 세팔로스포린, 이메페넴, 메로페넴, 에르타페넴, 도리페넴, 파니페넴 및 비아페넴을 포함하는 카바페넴, 시프로플록사신, 가티플록사신, 레보플록사신 및 목시플록사신을 포함하는 플루오로퀴놀론, 토브라마이신을 포함하는 아미노글리코시드, 아지트로마이신 및 클라리트로마이신을 포함하는 매크롤라이드, 독시사이클린을 포함하는 테트라사이클린, 반코마이신을 포함하는 글리코펩타이드, 리팜핀을 포함하는 리파마이신 및 이소니아지드, 피라진아미드, 티가실, 다프토마이신 또는 트리메토프림/설파메톡사졸을 포함하는 기타 항생제로부터 선택된다.
몇몇 양태에서, 화학식 I의 화합물의 고체 형태는 그램 양성 감염의 치료를 위해 투여될 수 있다. 몇몇 양태에서, 조성물은 고체, 액체(예를 들면, 현탁액), 또는 iv(예를 들면, 화학식 I의 화합물의 형태를 액체에 용해시켜 iv 투여함) 조성물이다. 몇몇 양태에서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물을 추가의 항생제, 예를 들면, 천연 페니실린, 페니실리나제-내성 페니실린, 항수도모나스 페니실린, 아미노페니실린, 1세대 세팔로스포린, 2세대 세팔로스포린, 3세대 세팔로스포린, 4세대 세팔로스포린, 카바페넴, 세파마이신, 퀴놀론, 플루오로퀴놀론, 아미노글리코시드, 매크롤라이드, 케톨리드, 폴리믹신, 테트라사이클린, 글리코펩타이드, 스트렙토그라민, 옥사졸리디논, 리파마이신 또는 설폰아미드와 병용하여 투여한다. 몇몇 양태에서, 화학식 I의 화합물의 고체 형태를 포함하는 조성물은 경구 투여되고, 추가의 항생제, 예를 들면, 천연 페니실린, 페니실리나제-내성 페니실린, 항수도모나스 페니실린, 아미노페니실린, 1세대 세팔로스포린, 2세대 세팔로스포린, 3세대 세팔로스포린, 4세대 세팔로스포린, 카바페넴, 세파마이신, 퀴놀론, 플루오로퀴놀론, 아미노글리코시드, 매크롤라이드, 케톨리드, 폴리믹신, 테트라사이클린, 글리코펩타이드, 스트렙토그라민, 옥사졸리디논, 리파마이신 또는 설폰아미드는 iv 투여된다.
몇몇 양태에서, 화학식 I의 화합물의 고체 형태는 그램 음성 감염의 치료를 위해 투여될 수 있다. 몇몇 양태에서, 조성물은 고체, 액체(예를 들면, 현탁액), 또는 iv(예를 들면, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 형태를 액체에 용해시켜 iv 투여함) 조성물이다. 몇몇 양태에서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물을 천연 페니실린, 페니실리나제-내성 페니실린, 항수도모나스 페니실린, 아미노페니실린, 1세대 세팔로스포린, 2세대 세팔로스포린, 3세대 세팔로스포린, 4세대 세팔로스포린, 카바페넴, 세파마이신, 모노박탐, 퀴놀론, 플루오로퀴놀론, 아미노글리코시드, 매크롤라이드, 케톨리드, 폴리믹신, 테트라사이클린 또는 설폰아미드로부터 선택된 추가의 항생제와 병용하여 투여한다. 몇몇 양태에서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 고체 형태를 포함하는 조성물은 경구 투여되고, 추가의 항생제, 예를 들면, 천연 페니실린, 페니실리나제-내성 페니실린, 항수도모나스 페니실린, 아미노페니실린, 1세대 세팔로스포린, 2세대 세팔로스포린, 3세대 세팔로스포린, 4세대 세팔로스포린, 카바페넴, 세파마이신, 모노박탐, 퀴놀론, 플루오로퀴놀론, 아미노글리코시드, 매크롤라이드, 케톨리드, 폴리믹신, 테트라사이클린 또는 설폰아미드는 경구 투여된다. 몇몇 양태에서, 추가의 치료제는 iv 투여된다.
상기한 추가의 치료제는 억제제-함유 조성물로부터, 다중 용량 용법의 일부로서, 별도로 투여할 수 있다. 또는, 이러한 제제는 단일 조성물에 억제제와 함께 혼합된 단일 용량형의 일부일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구, 비경구, 흡입 스프레이, 국소, 직장, 비내, 구강내, 질내 또는 이식된 저장물을 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 통상의 약제학적으로 허용되는 비-독성 담체, 보조제 또는 비히클을 함유할 수 있다. 몇몇 경우에, 제형화된 화합물 또는 이의 전달형의 안정성을 증진시키기 위해 약제학적으로 허용되는 산, 염기 또는 완충제로 제형의 pH를 조절할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 비경구는 피하, 피부내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액내, 흉골내, 경막내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
약제학적 조성물은 멸균 주사 가능한 제제, 예를 들면, 멸균 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액의 형태일 수 있다. 이들 현탁액은 적합한 분산제나 습윤제(예를 들면, 트윈 80) 및 현탁제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사 가능한 제제는 또한 비경구로 허용되는 비독성 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 가능한 용액 또는 현탁액, 예를 들어, 1,3-부탄디올 중의 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매 중에는 만니톨, 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 고착유가 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디글리세라이드를 포함하는 임의의 무자극 고착유가 사용될 수 있다. 지방산, 예를 들어, 올레산 및 이의 글리세라이드 유도체가 주사용 제제에 유용하고, 이는 이것들이 특히 폴리옥시에틸화 버젼에서 올리브유 또는 피마자유와 같은 약제학적으로 허용되는 천연 오일이기 때문이다. 이들 오일 용액 또는 현탁액은 또한 장쇄 알콜 희석제 또는 분산제, 예를 들어, 약전 헬베티카(Pharmacopeia Helvetica)에 기재된 것들 또는 유사한 알콜을 함유할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 캡슐제, 정제, 수성 현탁액제 또는 용액제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 경구 허용되는 용량형으로 경구 투여될 수 있다. 경구용 정제의 경우, 통상적으로 사용된 담체는 락토스 및 옥수수 전분을 포함한다. 또한, 전형적으로 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제가 첨가된다. 캡슐제 형태의 경구 투여의 경우, 유용한 희석제는 락토스 및 건식 옥수수 전분을 포함한다. 수성 현탁액 및 용액 및 프로필렌 글리콜이 경구 투여되는 경우, 활성 성분을 유화제 및 현탁제와 배합한다. 경우에 따라, 특정 감미제 및/또는 풍미제 및/또는 착색제가 첨가될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 직장 투여용 좌제의 형태로 투여될 수 있다. 이들 조성물은 본 발명의 화합물을 실온에서는 고체이지만 직장 온도에서는 액체이어서 직장에서 융해되어 활성 성분을 방출하는 적합한 비자극성 부형제와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 이러한 물질은 코코아 버터, 밀랍 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약제학적 조성물의 국소 투여는 목적하는 치료가 국소 적용에 의해 용이하게 접근 가능한 영역 또는 기관을 포함하는 경우에 특히 유용하다. 피부에 국소 적용하기 위해서는, 약제학적 조성물을 담체에 현탁되거나 용해된 활성 성분을 함유하는 적합한 연고로 제형화해야 한다. 본 발명의 화합물의 국소 투여를 위한 담체는 광유, 액체 석유, 백색 석유, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌, 유화용 왁스 및 물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또는, 약제학적 조성물은 담체에 현탁되거나 용해되어 있는 활성 화합물을 함유하는 적합한 로션 또는 크림으로 제형화될 수 있다. 적합한 담체는 광유, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알콜, 2-옥틸도데칸올, 벤질 알콜 및 물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 직장 좌제 제형에 의해 또는 적합한 관장 제형으로 하부 장관에 국소 적용될 수 있다. 국소 투여된 경피 패치가 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비내 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 약제학적 제형의 당업계에 널리 공지된 기술에 따라 제조되며, 벤질 알콜 또는 기타 적합한 방부제, 생체이용율을 증강시키기 위한 흡수 촉진제, 플루오로카본 및/또는 당업계에 공지된 기타 가용화제 또는 분산제를 사용하여 염수 중의 용액으로서 제조될 수 있다.
또다른 양태에 따르면, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 또한 이식형 또는 유치형 장치(indwelling device)와 같이 이식(예를 들면, 수술에 의해)에 의해 전달될 수 있다. 이식형 또는 유치형 장치는 대상체에 영구적으로 또는 일시적으로 잔류하도록 설계될 수 있다. 이식형 및 유치형 장치의 예는 콘택트 렌즈, 중심 정맥 카테터 및 바늘없는 커넥터, 기관내 튜브, 자궁내 장치, 기계식 심장 판막, 심박 조율기, 복막 투석 카테터, 보철 관절, 예를 들면, 엉덩이 및 무릎 치환술, 고막천공술 튜브, 비뇨기 카테터, 음성 보철, 스텐트, 전달 펌프, 혈관 필터 및 이식 가능한 제어 방출 조성물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 생물막(biofilm)은 신체에 인공 기층을 도입하여 지속성 감염을 야기할 수 있기 때문에 이식형 또는 유치형 의료 장치를 갖는 환자의 건강에 해로울 수 있다. 따라서, 이식형 또는 유치형 장치 안에 또는 위에 화학식 I의 화합물을 제공하는 것이 생물막의 생성을 방지하거나 감소시킬 수 있다. 또한, 이식형 또는 유치형 장치는 화학식 I의 화합물의 데포트 또는 저장소로서 사용될 수 있다. 이식형 또는 유치형 장치는 화학식 I의 화합물을 전달하는데 사용될 수 있으며, 단 a) 장치, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 약제학적 조성물은 생체적합성이어야 하고, b) 장치는 치료되는 환자에서 치료학적 효과를 부여하도록 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 전달하거나 방출할 수 있어야 한다.
이식형 또는 유치형 장치를 통한 치료제의 전달은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌["Recent Developments in Coated Stents" by Hofma et al. published in Current Interventional Cardiology Reports 2001, 3:28-36]을 참고하며, 이에 인용된 참고문헌을 포함한 이의 전문은 본원에 참고로 인용되어 있다. 이식형 장치에 대한 기타의 설명은 미국 특허 제6,569,195호 및 제6,322,847호; 및 미국 특허원 제2004/0044405호, 제2004/0018228호, 제2003/0229390호, 제2003/0225450호, 제2003/0216699호 및 제2003/0204168호에서 찾아볼 수 있으며, 이들 각각은 전문이 본원에 참고로 인용되어 있다.
몇몇 양태에서, 이식형 장치는 스텐트이다. 한가지 특정 양태에서, 스텐트는 상호맞물린 망상 케이블(interlocked meshed cable)을 포함할 수 있다. 각각의 케이블은 구조적 지지를 위한 금속 와이어 및 치료제를 전달하기 위한 중합체성 와이어를 포함할 수 있다. 중합체성 와이어는 중합체를 치료제의 용액에 함침시킴으로써 투여할 수 있다. 또는, 치료제를 중합체성 전구체 용액으로부터 와이어의 형성 동안 중합체성 와이어에 매봉시킬 수 있다.
또다른 양태에서, 이식형 또는 유치형 장치는 치료제를 포함하는 중합체성 피막으로 피복될 수 있다. 중합체성 피막은 치료제의 방출 속도를 제어하도록 설계될 수 있다. 치료제의 제어 방출은 다양한 기술을 사용할 수 있다. 중합체성 물질 중의 활성제의 불균질 용액 및/또는 분산액을 함유하는 일체식(monolithic) 층 또는 피막을 갖는 장치가 공지되어 있으며, 여기서, 제제는 중합체를 통해 중합체-체액 경계면으로 확산되어 주변 체액으로 방출되기 때문에 제제의 확산은 속도 제한적이다. 몇몇 장치에서는, 물질이 용해된 후 추가의 기공 또는 채널이 남아있도록 가용성 물질이 또한 중합체성 물질에 용해되거나 분산된다. 매트릭스 장치도 마찬가지로 일반적으로 확산 제어되지만, 장치의 채널 또는 기타의 내부 기하구조가 또한 체액으로 제제를 방출시키는데 있어서 역할을 한다. 채널은 기존 채널이거나, 방출된 제제 또는 기타의 가용성 물질에 의해 남겨진 채널일 수 있다.
침식성 또는 분해성 장치는 전형적으로 중합체에 물리적으로 고정된 활성제를 갖는다. 활성제는 중합체성 물질 전반에 걸쳐 용해되고/되거나 분산될 수 있다. 중합체성 물질은 종종 불안정한 결합의 가수분해를 통해 시간 경과에 따라 가수분해에 의해 분해되어, 중합체를 체액으로 침식시키고, 활성제를 체액에 방출시킨다. 친수성 중합체는 소수성 중합체에 비해 일반적으로 보다 빠른 침식 속도를 갖는다. 소수성 중합체는 표면에서 안쪽으로의 침식을 갖는, 활성제의 거의 순수한 표면 확산을 갖는 것으로 믿어진다. 친수성 중합체는 물이 중합체의 표면을 침투하여, 표면 바로 아래의 불안정한 결합의 가수분해를 가능케 하여, 중합체의 균질 또는 벌크 침전을 야기할 수 있는 것으로 믿어진다.
이식형 또는 유치형 장치 피막은, 각각 상이한 치료제 방출 속도를 갖는 중합체의 블랜드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 피막은 폴리락트산/폴리에틸렌 옥사이드(PLA-PEO) 공중합체 및 폴리락트산/폴리카프로락톤(PLA-PCL) 공중합체를 포함할 수 있다. 폴리락트산/폴리에틸렌 옥사이드(PLA-PEO) 공중합체는 폴리락트산/폴리카프로락톤(PLA-PCL) 공중합체에 비해 보다 높은 치료제 방출 속도를 나타낼 수 있다. 시간 경과에 따라 전달되는 치료제의 상대적인 양 및 투여 속도는, 서방출 중합체에 비해 속방출 중합체의 상대적인 양을 조절함으로써 제어할 수 있다. 보다 높은 초기 방출 속도를 위해서는, 속방출 중합체의 비율을 서방출 중합체에 비해 증가시킬 수 있다. 용량의 대부분을 장시간에 걸쳐 방출시키고자 한다면, 중합체의 대부분은 서방출 중합체일 수 있다. 장치에 중합체의 용액 또는 분산액, 활성제 및 용매를 분무함으로써 장치를 피복시킬 수 있다. 용매를 증발시켜, 중합체의 피막 및 활성제를 잔류시킬 수 있다. 활성제를 중합체에 용해시키고/시키거나 분산시킬 수 있다. 몇몇 양태에서, 공중합체를 장치 상에서 압출시킬 수 있다.
1일 약 0.01 내지 약 100mg/체중 kg, 바람직하게는 1일 0.5 내지 약 75mg/체중 kg, 가장 바람직하게는 1일 약 1 내지 50mg/체중 kg의 활성 성분 화합물의 용량 수준이 세균 감염의 예방 및 치료를 위한 단일요법에서 유용하다.
전형적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 1일 약 1 내지 5회 또는 대안으로 연속 주입으로서 투여될 것이다. 또는, 본 발명의 조성물은 박동성 제형으로 투여될 수 있다. 이러한 투여는 만성 또는 급성 요법으로서 사용될 수 있다. 단일 용량형을 제조하기 위해 담체 물질과 배합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 전형적인 제제는 약 5% 내지 약 95%의 활성 화합물(w/w)을 함유할 것이다. 바람직하게는, 이러한 제제는 약 20% 내지 약 80%의 활성 화합물을 함유한다.
본 발명의 조성물이 화학식 I의 화합물과 하나 이상의 추가의 치료제 또는 예방제의 병용물을 포함하는 경우, 당해 화합물과 추가의 제제 둘 다는 단일요법 용법으로 통상적으로 투여되는 용량의 약 10% 내지 80%의 용량 수준으로 존재해야 한다.
환자의 상태가 개량될 경우, 본 발명의 화합물, 조성물 또는 병용물의 유지 용량이 필요에 따라 투여될 수 있다. 이어서, 용량이나 투여 빈도 또는 둘 다는, 증상의 함수로서, 증상이 목적하는 수준으로 완화되었을 경우에 개량된 상태가 유지되어 치료를 중단해야 되는 수준으로 감소될 수 있다. 그러나, 환자는 재발 또는 질환 증상에 대해 장기간에 걸친 간헐적인 치료를 필요로 할 수 있다.
당해 숙련가들이 인지하는 바와 같이, 상기 언급된 것보다 낮거나 높은 용량이 요구될 수 있다. 특정 환자에 대한 구체적인 용량 및 치료 용법은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별, 식이, 투여 시간, 배설 속도, 약물 병용, 질환의 중증도 및 경과, 질환에 대한 환자의 소인 및 담당의의 판단을 포함하는 각종 요인에 따라 좌우될 것이다.
또다른 양태에 따르면, 본 발명은 환자에게 본원에 기재된 화합물, 약제학적 조성물 또는 병용물을 투여하는 단계를 포함하여, 세균 감염 또는 질환 상태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "환자"는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 사람을 의미한다.
본 발명의 화합물은 또한 자이라제 B 및/또는 토포이소머라제 IV 효소에 효과적으로 결합하는 상업용 시약으로서 유용하다. 상업용 시약으로서, 본 발명의 화합물 및 이들의 유도체는 세균성 자이라제 B 및/또는 토포이소머라제 IV 또는 이들의 동족체에 대한 생화학적 또는 세포 검정에서 자이라제 B 및/또는 토포이소머라제 IV 활성을 차단하는데 사용될 수 있거나, 유도체화되어 친화력 크로마토그래피 분야를 위한 테터드 기질(tethered substrate)로서 안정한 수지에 결합될 수 있다. 시판 자이라제 B 및/또는 토포이소머라제 IV 억제제를 특징으로 하는 이러한 및 기타의 용도는 당업계의 통상의 숙련가들에게 자명할 것이다.
본 발명을 보다 충분히 이해하기 위해, 다음의 반응식 및 실시예가 기재되어 있다. 이들 실시예는 단지 예시를 위한 것이며, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
다음의 정의는 본 명세서에서 사용되는 용어 및 약어를 설명한다:
본 발명의 화합물은 미국 특허 제RE40245 E호; 미국 특허 제7,495,014 B2호; 미국 특허 제7,569,591 B2호; 미국 특허 제7,582,641 B2호; 미국 특허 제7,618,974 B2호; 및 미국 특허 제7,727,992 B2호에서 교시한 바와 같은, 유사한 화합물에 대해 당해 분야의 숙련가에게 공지된 일반적인 방법에 따라 제조할 수 있다. 상기 특허들 중 모든 6개는 본원에 완전히 제시된 바와 같이 참조로서 인용된다. 본 발명의 화합물을 제조하는데 사용된 조건의 세부사항은 실시예에서 추가로 제시된다.
본 발명을 보다 완전히 이해하도록 하기 위하여, 다음 실시예를 제시한다. 이들 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 어떠한 방식으로도 본 발명의 영역을 한정하는 것으로 고려되지 않아야 한다.
다음의 정의는 본원에 사용된 용어 및 약어를 기술한다:
Ac 아세틸
Bu 부틸
Et 에틸
Ph 페닐
Me 메틸
THF 테트라하이드로푸란
DCM 디클로로메탄
CH2Cl2 디클로로메탄
EtOAc 에틸 아세테이트
CH3CN 아세토니트릴
EtOH 에탄올
Et2O 디에틸 에테르
MeOH 메탄올
MTBE 메틸 3급-부틸 에테르
DMF N,N-디메틸포름아미드
DMA N,N-디메틸아세트아미드
DMSO 디메틸 설폭사이드
HOAc 아세트산
TEA 트리에틸아민
TFA 트리플루오로아세트산
TFAA 트리플루오로아세트산 무수물
Et3N 트리에틸아민
DIPEA 디이소프로필에틸아민
DIEA 디이소프로필에틸아민
K2CO3 탄산칼륨
Na2CO3 탄산나트륨
Na2S2O3 삼황산나트륨
Cs2CO3 탄산세슘
NaHCO3 중탄산나트륨
NaOH 수산화나트륨
Na2SO4 황산나트륨
MgSO4, 황산마그네슘
K3PO4 인산칼륨
NH4Cl 염화암모늄
LC/MS 액체 크로마토그래피//질량 스펙트럼
GCMS 가스 크로마토그래피 질량 스펙트럼
HPLC 고 성능 액체 크로마토그래피
GC 가스 크로마토그래피
LC 액체 크로마토그래피
IC 이온 크로마토그래피
IM 근육내
CFU/cfu 콜로니 형성 단위
MIC 최소 억제 농도
Hr 또는 h 시간
atm 대기
rt 또는 RT 실온
TLC 박층 크로마토그래피
HCl 염산
H2O 물
EtNCO 에틸 이소시아네이트
Pd/C 탄소 상의 팔라듐
NaOAc 아세트산나트륨
H2SO4 황산
N2 질소 가스
H2 수소 가스
n-BuLi n-부틸 리튬
DI 탈-이온화된
Pd(OAc)2 아세트산팔라듐(II)
PPh3 트리페닐포스핀
i-PrOH 이소프로필 알코올
NBS N-브로모숙신이미드
Pd[(Ph3)P]4 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)
PTFE 폴리테트라플루오로에틸렌
rpm 분당 회전수
SM 출발 물질
Equiv. 당량
1H-NMR 양성자 핵 자기 공명
HPMCAS 하이드록시프로필메틸셀룰로즈 아세테이
트
PVP 폴리비닐피롤리돈
EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산
K2EDTA 이염기성 칼륨 에틸렌디아민테트라아세
테이트
mCPBA 메타-클로로퍼옥시벤조산
aq 수성
Boc2O 디-3급-부틸 디카보네이트
DMAP N,N-디메틸아미노피리딘
mL 밀리리터
L 리터
mol 몰
g 그램
LCMS 액체 크로마토그래피-질량 분광법
MHz 메가헤르츠
CDCl3 듀테로클로로포름
NEt3 트리에틸아민
mmol 밀리몰
psi 평방인치당 파운드
iPrOH 이소프로필알코올
ppm 백만당 부
NH4NO3 질산암모늄
Hz 헤르츠
Pd(dppf)Cl2 [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]디클
로로팔라듐(II)
L 리터
MeOD 듀테로-메탄올
CD3OD 듀테로-메탄올
ee 거울상이성체 과량
min 분
Bn 벤질
RBF 환저 플라스크
MeCN 아세토니트릴
PES 폴리에테르설폰
mm 밀리미터
μm 마이크로미터
M 몰
N 노말
Boc 3급-부톡시카보닐
ESMS 전자스프레이 질량 분광법
CV 컬럼 용적
D2O 산화듀테륨
NH3 암모니아
OBD 최적 층 밀도
mg 밀리그램
CLSI 임상 및 실험실 표준 기관
ATCC 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American
Type Culture Collection)
MHII 뮐러 힌톤(Mueller Hinton) II
μL 마이크로리터
WT 야생형
CGSC 콜리 제네틱 스톡 센터(Coli Genetic
Stock Center)
MS 질량 분광법
IS 내부 표준물
APCI 대기압 화학 이온화
MRM 다중 반응 모니터링
m/z 질량-대-전하 비
LLOQ 정량의 하한
ng 나노그램
UV 자외선
SD 표준 편차
% CV 변이 계수
PO 구강주위
MC 미세결정성 셀룰로즈
EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산
또는 에틸렌디아민테트라아세테이트
PK 약동학적
IV 정맥내
D5W 수용액 중 5% 덱스트로즈
HPMC-AS 하이드록시프로필 메틸셀룰로즈 아세틸
숙시네이트
PVP 폴리비닐피롤리돈
CAPT 캅티솔
ATP 아데노신 트리포스페이트
ADP 아데노신 디포스페이트
NADH 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드
(환원형)
NAD+ 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드
(산화형)
TRIS 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄
mM 밀리몰
MgCl2 염화마그네슘
KCl 염화칼륨
μM 마이크로몰
DTT 디티오트레이톨
nM 나노몰
Ki 해리 상수
IC50 최대 억제 농도의 1/2
㎍ 마이크로그램
BSA 소 혈청 알부민
LDH 락테이트 데하이드로게나제
PVDF 폴리비닐리덴 플루오라이드
AcN 아세토니트릴
VMAX 최대 초기 속도 또는 반응 속도
실시예 1
2-(2-니트로페닐)-2,5-디하이드로푸란 및 2-(2-니트로페닐)-2,3-디하이드로푸란 (3a&3b)의 제조.
Figure pct00007
1-브로모-2-니트로-벤젠 (1) (600 g, 99%, 2.941 mol, Alfa Aesar A11686), l,3-비스(디페닐포스피노)프로판 (62.50 g, 97%, 147.0 mmol, Alfa Aesar A12931), 1,4-디옥산 (2.970 L, Sigma-Aldrich 360481), 탄산칼륨 (812.9 g, 5.882 mol, JT-Baker 301201), 및 2,3-디하이드로푸란 (2) (1.041 kg, 99%, 1.124 L, 14.70 mol, Aldrich 200018)을 혼합하였다. 질소의 스트림(stream)을 교반 혼합물을 통해 4시간 동안 버블링(bubbling)한 다음, 아세트산 팔라듐(II)(16.51 g, 73.52 mmol, Strem 461780)을 가하고 탈수소화를 또 다른 10분 동안 계속하였다. 반응 혼합물을 질소하에 환류에서 밤새 교반하였다(작업된 분취량(worked-up aliquot)의 NMR은 아릴브로마이드의 완전한 소비를 나타내었다). 이를 냉각시키고, 헥산(1 L)으로 희석시키고, 플로리실(Florisil)® (500 g, -200 메쉬)의 짧은 플러그(short plug)를 통해 여과한 다음, EtOAc로 용출시켰다. 여액을 감압(2-(2-니트로페닐)-2,3-디하이드로푸란은 고진공하에 휘발성이며 실온에서 다소 불안정할 수 있다)하에 농축시켜 (3a)와 (3b)의 혼합물을 암갈색 오일(654.0 g)로서 수득하였다. 조 물질(crude material)은 냉장고 속에 저장하고 추가로 정제하지 않고 전방으로 운반하였다.
실시예 2
2-테트라하이드로푸란-2-일-아닐린 (4)의 제조.
Figure pct00008
탄소 상의 5% 팔라듐(16.3 g, 50% 습윤(wet), 3.83 mmol, Aldrich 330116)을 질소하에 파르 병(Parr bottle) 속에 위치시킨 다음, MeOH (100 mL, JT-Baker 909333)를 가하였다. MeOH (389 mL)에 용해된 2-(2-니트로페닐)-2,5-디하이드로푸란 및 2-(2-니트로페닐)-2,3-디하이드로푸란 (3a&3b)(163 g)의 조 혼합물을 가한 다음, NEt3 (237.6 mL, 1.705 mol, Sigma-Aldrich 471283)를 가하였다. 용기를 파르 진탕기 위에 위치시키고 H2로 포화시켰다. 30 psi H2를 가하고 소비가 완결될 때까지 진탕시켰다(LCMS 및 NMR은 완전한 반응을 나타내었다). 반응 혼합물을 질소로 퍼징하고, 셀라이트(Celite)™를 통해 여과하고 EtOAc로 세정하였다. 여액을 회전 증발기 위에서 농축시켜서 갈색 오일을 수득하였다. 반응을 동일한 규모에서 3회 이상 반복하고 정제를 위해 뱃치(batch)를 합하였다. 조 생성물을 진공 증류(약 15 torr)시키고 증류물을 108 내지 129℃에서 수집하여 투명한 담황색 오일(427.9 g, 평균 수율은 84%이었다; 98% GCMS 순도)로서 (4)를 수득하였다. LCMS (포름산 개질제를 사용하여 5분에 걸쳐서 10 내지 90% CH3CN /물 구배로 용출하는 C18 컬럼) M+1: 163.95 (1.46 min).
Figure pct00009
실시예 2a
(R)-2-(테트라하이드로푸란-2-일)아닐린 (4a)의 제조.
Figure pct00010
33g의 화합물 (4)를, 대략 125mg/ml의 농도로 수득된 MeOH (265 ml) 내로 용해시켰다. 혼합물을 0.2 마이크론 막 필터(micron membrane filter)를 통해 여과한 다음 키랄팩(ChiralPak)® IC 컬럼 (30mm X 150mm, 컬럼 온도 35℃, Chiral Technologies) 위에서 100 bar에서 베르거 멀티그램 초임계 유체 크로마토그래피 시스템(Berger multigram supercritical fluid chromatographic system)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 이동 상은 220 나노미터에서 UV 모니터링하면서 350 ml/분으로 용출시키는 (90:10) C02:CH3OH이었다. 목적 생성물(4a) 15.64g을 녹색 오일로서 수득하였다. 분석 SFC ([90:10] C02:CH3OH, 35℃에서 유지되고 220nm에서 UV 모니터링하면서 100 bar 압력에서 수행된 키랄팩 IC 컬럼 (4.6 X 100mm) 위에서 5 ml/분으로)는 95% 전체 순도를 갖는 95.5%ee를 나타내었다.
실시예 3
4-브로모-2-테트라하이드로푸란-2-일-아닐린 (5)의 제조.
Figure pct00011
2℃로 냉각된 메틸 3급-부틸 에테르(MTBE, 641.4 mL) 및 아세토니트릴(213.8 mL) 중의 2-테트라하이드로푸란-2-일-아닐린 (4) (53.45 g, 327.5 mmol)의 교반 용액에 약 8℃ 이하로 내부 온도를 유지하는 4 부분으로 N-브로모석신이미드 (58.88 g, 99%, 327.5 mmol, Aldrich B81255)를 가하였다. 반응 혼합물을 빙수 욕으로 냉각시키면서 30분 동안 교반하였다(작업 분취량의 NMR은 출발 물질의 완전한 소비를 나타내었다). 수성 1 N Na2S203 (330 mL)를 가하고, 냉각 욕을 제거하고 20분 동안 교반하였다. 혼합물을 EtOAc로 희석시키고 층들을 분리하였다. 유기 상을 포화 수성 NaHC03 (2x), 물, 염수로 세척하고, MgSO4 위에서 건조시키고, 실리카의 짧은 플러그를 통해 여과하고, EtOAc로 용출시킨 다음, 감압하에 농축시켜 매우 어두운 호박색 오일(very dark amber oil)(82.25 g, 77 내지 94% HPLC 순도)로서 (5)를 수득하였다. 추가의 정제없이 전방으로 운반하였다. LCMS (포름산 개질제로 5분에 걸쳐 10 내지 90% CH3CN / 물 구배로 용출하는 C18 컬럼) M+1: 242.10 (2.89 min).
Figure pct00012
실시예 4
N-(4-브로모-2-니트로-6-테트라하이드로푸란-2-일-페닐)-2,2,2-트리플루오로-아세트아미드 (6)의 제조
Figure pct00013
2℃에서 교반하는 트리플루오아세트산 무수물 (455.3 mL, 3.275 mol, Sigma-Aldrich 106232)에 진한 오일로서 4-브로모-2-테트라하이드로푸란-2-일-아닐린 (5) (79.29 g, 327.5 mmol)를 부가 깔때기를 통해 15분에 걸쳐 서서히 가하였다(반응 온도는 14℃로 상승하였다). 나머지 오일을 무수 2-메틸테트라하이드로푸란 (39.6 mL, Sigma-Aldrich 414247)을 사용하여 반응 혼합물 내로 세정하였다. 냉각 욕을 제거하고 질산암모늄(34.08 g, 425.8 mmol, Aldrich 467758)을 가하였다. 반응 혼합물을 약 30분에 걸쳐서 40℃로 상승시키고, 이 시점에서 냉수 욕을 사용하여 발열을 조절하고 반응이 실온으로 되도록 하였다. 이어서, 냉각 욕을 제거하고 또 다른 40분 동안 교반을 계속하였다(HPLC는 아주 적은 양의 나머지 질산염화되지 않은 물질을 나타냈다). 반응 혼합물은 분쇄된 얼음(800 g)의 교반 혼합물 속으로 서서히 부어넣었다. 고체 침전물을 여과에 의해 수집하고, 물, 포화 수성 NaHCO3 (pH 8로 만듬), 다시 물 및 헥산으로 세척하였다. 습윤 고체를 우선 50℃에서 대류 오븐 속에서 수 시간 동안 건조시킨 다음 오븐 속에서 40℃에서 감압하에 밤새 건조시켜서 담갈색 고체(77.86 g, 62% 수율; 98% HPLC 순도)로서 (6)을 수득하였다. LCMS (포름산 개질제로 5분에 걸쳐 10 내지 90% CH3CN / 물 구배로 용출하는 C18 컬럼) M+1: 383.19 (3.27 min).
Figure pct00014
실시예 5
4-브로모-2-니트로-6-테트라하이드로푸란-2-일-아닐린(6a)의 제조
N-(4-브로모-2-니트로-6-테트라하이드로푸란-2-일-페닐)-2,2,2-트리플루오로-아세트아미드 (6) (54.00 g, 140.9 mmol)을 1,4-디옥산 (162 mL)에 용해시키고 수성 6M NaOH (70.45 mL, 422.7 mmol, JT-Baker 567202)를 가하였다. 반응 혼합물을 환류에서 2일 동안 교반하고(HPLC는 완전한 전환을 나타내었다), 냉각되도록 하고, MTBE (800 mL)로 희석시키고, 물(2 x 200 mL), 포화 수성 NH4Cl, 물 및 염수로 세척하였다. 혼합물을 MgSO4 위에서 건조시키고, 여과한 다음, 감압하에 농축시켜 진한 호박tor 오일(40.96 g, 93% 순도; 전체 92% HPLC 플러스 NMR 순도)로서 (6a)을 수득하였다. LCMS (포름산 개질제로 3분 내지 5분에 걸쳐 10 내지 90% CH3CN / 물 구배로 용출하는 C18 컬럼) M+1: 287.28 (3.44 min).
Figure pct00016
실시예 6
2-[5-(4-아미노-3-니트로-5-테트라하이드로푸란-2-일-페닐)피리미딘-2-일]프로프-2-올 (8)의 제조.
Figure pct00017
4-브로모-2-니트로-6-테트라하이드로푸란-2-일-아닐린 (6a) (40.40 g, 92%, 129.5 mmol), 1,4-디옥산 (260 mL, Sigma-Aldrich 360481), 2-[5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)피리미딘-2-일]프로판-2-올 (7) (41.05 g, 155.4 mmol), 및 수성 2.7M Na2C03 (143.9 mL, 388.5 mmol)을 혼합하였다. 질소의 스트림을 교반 혼합물을 통해 1시간 동안 버블링한 다음, 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (7.48 g, 6.47 mmol, Strem 462150)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류에서 2시간 동안 교반하고(HPLC는 완전한 반응을 나타내었다), 냉각시키고, EtOAc로 희석시키고, 물, 포화 수성 NH4Cl, 염수로 세척하고, MgSO4 위에서 건조시키고, EtOAc로 용출하는 Florisil®의 짧은 플러그를 통해 여과하였다. 여액을 감압하에 농축시켜 진한 갈색 오일을 수득하였다. CH2Cl2에 용해시키고 CH2C12 및 이후에 EtOAc를 사용하여 실리카 겔의 짧은 플러그를 통해 용출시켰다. 목적하는 분획을 회전 증발기에서 침전물이 형성될 때까지 농축시켜서 진한 갈색 슬러리를 수득하고, 이를 MTBE로 분쇄하였다. 고체를 여과하여 수집하고, MTBE로 세척하고, 고 진공하에 건조시켜 황색 고체(35.14 g, 99+% HPLC 순도)로서 (8)을 수득하였다. LCMS (포름산 개질제로 5분에 걸쳐 10 내지 90% CH3CN / 물 구배로 용출하는 C18 컬럼) M+1: 345.00 (2.69 min).
Figure pct00018
여액을 추가로 농축시키고 0 내지 80% EtOAc / 헥산으로 용출하는 ISCO 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 호박색 고체(4.46 g, 88% 전체 수율; 88 % HPLC 순도)로서 생성물 (8)의 제2 크롭(crop)을 수득하였다.
실시예 7
2-[5-(4-아미노-3-니트로-5-테트라하이드로푸란-2-일-페닐)피리미딘-2-일]프로판-2-올 (8)의 대안적 제조.
Figure pct00019
N-(4-브로모-2-니트로-6-테트라하이드로푸란-2-일-페닐)-2,2,2-트리플루오로-아세트아미드 (6) (19.00 g, 49.59 mmol), 2-[5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)피리미딘-2-일]프로판-2-올 (7) (14.41 g, 54.55 mmol), 수성 2.7 M 탄산나트륨 (73.48 mL, 198.4 mmol), 및 1,4-디옥산 (190 mL, Sigma-Aldrich 360481)을 혼합하였다. 질소의 스트림을 교반 혼합물을 통해 40분 동안 버블링한 다음, 1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센 디클로로팔라듐 디클로로메탄 부가물(2.025 g, 2.480 mmol, Strem 460450)을 가하였다. 반응 혼합물을 N2하에 7시간 동안 환류하에 교반하고, 또 다른 50 mL의 포화 수성 탄산나트륨을 가하고, 또 다른 16시간 동안 환류시켰다. 혼합물을 냉각시킨 다음, EtOAc (500 mL) 및 물 (200 mL)로 희석시켰다. 층들을 분리시키고 수성 상을 EtOAc (200 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 물(500 mL), 염수(500 mL)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, Florisil® 플러그를 통해 여과하고, 회전 증발기에서 농축시켜 오렌지색 오일로서 조 화합물 (8)을 수득하였다. 조 생성물을 20 내지 90% EtOAc / 헥산으로 용출하는 ISCO 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 오렌지색 고체(15.00 g, 87% 수율; 81 내지 88% 순도)로서 (8)을 수득하였다. LCMS (포름산 개질제로 5분에 걸쳐 10 내지 90% CH3CN / 물 구배로 용출하는 C18 컬럼) M+1: 345.35 (2.68 min).
Figure pct00020
실시예 8
2-[5-(3,4-디아미노-5-테트라하이드로푸란-2-일-페닐)피리미딘-2-일]프로판-2-올 (9)의 제조.
Figure pct00021
질소하의 파르 병 속의 2-[5-(4-아미노-3-니트로-5-테트라하이드로푸란-2-일-페닐)피리미딘-2-일]프로판-2-올 (8) (30.10 g, 87.41 mmol) 및 THF (90 mL)의 현탁액에 MeOH (90 mL, JT-Baker 909333) 중의 탄소 상의 5% 팔라듐의 슬러리(3.01 g, 50% 습윤, 0.707 mmol, Aldrich 330116)를 가한 다음, NEt3 (24.37 mL, 174.8 mmol, Sigma-Aldrich 471283)를 가하였다. 용기를 파르 진탕기 위에 위치시키고 H2로 포화시켰다. 45 psi H2를 가하고 완전히 소모될 때까지 진탕시켰다(HPLC는 완전한 전환을 나타내었다). 반응 혼합물을 질소로 퍼징하고, Celite™를 통해 여과하고 EtOAc로 세정하였다. 여액을 2개의 P5 페이퍼들 사이에 샌드위치된 0.5 마이크론 유리 섬유 필터 페이퍼를 통해 재여과하고, 감압하에 농축시켜서 담갈색 발포체(28.96 g, 98% 수율; 93% NMR 순도)로서 (9)를 수득하였다. LCMS (포름산 개질제로 5분에 걸쳐 10 내지 90% CH3CN / 물 구배로 용출하는 C18 컬럼) M+l: 315.32 (1.54 min).
Figure pct00022
실시예 9
1-에틸-3-[5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5-일]-7-테트라하이드로푸란-2-일-1H-벤즈이미다졸-2-일]우레아 (11)의 제조.
Figure pct00023
1,4-디옥산 (160.5 mL, Sigma-Aldrich 360481) 중의 2-[5-(3,4-디아미노-5-테트라하이드로푸란-2-일-페닐)피리미딘-2-일]프로판-2-올 (9) (32.10 g, 102.1 mmol)의 교반 용액에, NaOAc 삼수화물 (34.5 g)을 1N 수성 H2S04 (240 mL)에 용해시켜 제조한, pH 3.5 완충액(240.8 mL)을 가하였다. 1-에틸-3-(N-(에틸카바모일)-C-메틸설파닐-카본이미도일)우레아 (10) (28.46 g, 122.5 mmol, CB Research and Development)를 가하고 환류에서 밤새 교반하였다(HPLC는 출발 디아민의 99% 소모를 나타냈다). 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 수성 포화 NaHCO3 (480 mL) 및 물 (120 mL)의 교반 용액 내로 부분-방식으로(포말; frothing) 부어 넣어서 pH 8-9로 만들었다. 이를 30분 동안 교반하였고, 고체는 여과에 의해 수집하고, 물로 충분히 세척하여 중성 pH로 만든 다음, 아주 드물게는 EtOH로 세척하였다. 고체는 감압하에 건조시켜 회백색 고체(34.48 g, 82% 수율; 99.4% HPLC 순도)로서 (11)을 수득하였다. LCMS (포름산 개질제로 5분에 걸쳐 10 내지 90% CH3CN / 물 구배로 용출하는 C18 컬럼) M+1: 411.41 (1.73 min).
Figure pct00024
실시예 10
1-에틸-3-[5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5-일]-7-[(2R)-테트라하이드로푸란-2-일]-1H-벤즈이미다졸-2-일]우레아 (12)의 키랄 크로마토그래피적 분리.
Figure pct00025
1-에틸-3-[5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5-일]-7-테트라하이드로푸란-2-일-1H-벤즈이미다졸-2-일]우레아 (11) (24.60 g)의 라세미 샘플(racemic sample)을 35℃에서 DCM / MeOH / TEA (60 / 40 / 0.1)로 용출시키는 CHIRALPAK® IC® 컬럼 (제조원: Chiral Technologies) 위에서 용해시켜서 백색 고체(11.35 g, 45% 수율; 99+% HPLC 순도, 99+% ee)로서 목적하는 에난티오머 (12)를 수득하였다. 분석적 키랄 HPLC 보유 시간은 6.2분 이었다(CHIRALPAK® IC® 4.6 x 250 mm column, 1 mL/min 유동 속도, 30℃).
12의 구조와 절대 입체화학은 단결정 x-선 회절 분석으로 확인하였다. 단결정 회절 데이터는 밀봉된 튜브 Cu K-알파 공급원 (Cu Kα 방사선, γ = 1.54178 Å) 및 Apex II CCD 검출기가 구비된 Bruker Apex II 회절기에서 획득하였다. 치수가 l/2 x 0.05 x 0.05 mm인 결정을 선택하고, 무기 오일을 사용하여 세척하고, 마이크로마운트(MicroMount) 위에 올려놓고 Bruker APEXII 시스템에서 중앙에 두었다. 역격자 공간(reciprocal space)에서 분리된 40개의 프레임의 3개의 뱃치를 수득하여 배향 매트릭스 및 초기 셀 파라미터를 제공하였다. 데이터 수집이 전체 데이터 세트를 기준으로 하여 완결된 후에 최종 셀 파라미터를 수득하고 정제하였다. 체계적인 부재 및 강도 통계학을 근거로 하여, 구조를 해결하고 중심을 벗어난 P21 공간 그룹에서 정제하였다.
역격자 공간의 회절 데이터 세트를, 각각의 프레임에 대하여 60초 노출을 이용하여 0.5°단계를 이용하는 0.9Å의 분해능으로 수득하였다. 데이터를 100 (2) K에서 수집하였다. 셀 파라미터들의 강도 및 정제의 통합은 APEXII 소프트웨어를 사용하여 성취하였다. 데이터 수집 후의 결정을 관찰한 결과, 분해의 신호가 나타나지 않았다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 구조 내에 2개의 대칭 독립적인 분자들이 존재하고 두개의 대칭 독립적인 분자들은 R 이성체이다.
데이터를 Apex II 소프트웨어를 사용하여 수집하고, 정제하고 감소시켰다. 구조는 SHELXS97 (Sheldrick, 1990)을 사용하여 해결하였고; 프로그램(들) 및 구조는 SHELXL97 (Sheldrick, 1997) 프로그램을 사용하여 정제하였다. 결정은 P21 공간 그룹을 갖는 모노클리닉 셀(monoclinic cell)을 나타낸다. 격자 파라미터는 a = 9.8423(4) Å, b = 10.8426(3) Å, c = 19.4441 (7) Å, β= 102.966(3)°이다. 용적 = 2022.09(12) Å3.
실시예 11
1-에틸-3-[5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5-일]-7-[(2R)-테트라하이드로푸란-2-일]-1H-벤즈이미다졸-2-일]우레아 (13)의 제조.
Figure pct00026
무수 에탄올(93.2 mL) 중의 1-에틸-3-[5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5-일]-7-[(2R)-테트라하이드로푸란-2-일]-1H-벤즈이미다졸-2-일]우레아 (12) (9.32 g, 22.71 mmol)의 교반 현탁액을 빙수 욕으로 냉각시켰다. 메탄설폰산(1.548 mL, 23.85 mmol, Sigma-Aldrich 471356)을 가하고, 냉각 욕을 제거하고, 실온에서 20분 동안 교반하였다. 이를 35℃에서 회전 증발기 위에서 농축시켜 진한 슬러리를 수득하고, EtOAc로 희석하고, 여과하여 고체를 수집한 다음, EtOAc로 세척하고, 감압하에 건조시켜 백색 고체(8.10 g)로서 (13)의 초기 크롭을 수득하였다. 여액을 로타뱁(rotavap) 위에서 농축시켜 황색 유리질 발포체를 수득하고, 이를 EtOH에 용해시키고, 고체 슬러리로 농축시키고, EtOAc/Et20로 분쇄한 다음, 여과에 의해 수집하였다. 고체를 EtOAc/Et20로 세척하고, 제1 크롭과 합한 다음, 감압하에 건조시켜 백색 고체(9.89 g, 86% 수율; 99+% HPLC 순도, 99+% ee)로서 (13)을 수득하였다. 분석적 키랄 HPLC는 30℃에서 1 mL/min 유동속도로 CHIRALPAK® IC® 4.6 x 250 mm 컬럼 상에서 DCM/MeOH/TEA (60/40/0.1)로 용출하는 6.3 min의 보유시간을 갖는 하나의 에난티오머를 나타낸다. LCMS (포름산 개질제로 5분에 걸쳐 10 내지 90% CH3CN / 물 구배로 용출하는 C18 컬럼) M+1: 411.53 (1.74 min).
실시예 12
2-(2-플루오로-6-니트로-페닐)-2,3-디하이드로푸란 (15A) 및 2-(2-플루오로-6-니트로-페닐)-2,5-디하이드로푸란 (15B)의 제조.
Figure pct00028
2-브로모-1-플루오로-3-니트로-벤젠 (14)(200.3 g, 98%, 892.3 mmol, Bosche F6657), 1,4-디옥산(981.5 mL, Sigma-Aldrich 360481), 및 2,3-디하이드로푸란 (2) (341.1 mL, 99%, 4.462 mol, Aldrich 200018)를 반응 플라스크 속에 충전한 다음, N,N-디이소프로필에틸아민 (155.4 mL, 892.3 mmol, Sigma-Aldrich 550043) 및 브로모(트리-3급-부틸포스핀)팔라듐(I) 이량체 (6.936 g, 8.923 mmol, Johnson Matthey C4099)를 충전하였다. 혼합물을 환류에서 2시간 동안 교반하였다(HPLC는 출발 아릴브로마이드의 98% 소비를 나타내었다). 이는 실온으로 냉각시키고, 침전물을 여과에 의해 제거하고, EtOAc로 세정한 다음, 여액을 진공하에 어두운 적갈색 반고체 오일로 농축시켰다. 이를 CH2Cl2에 용해시키고, CH2Cl2를 사용하여 실리카의 플러그를 통해 용출시킨 다음, 진공하에 농축시켜 어두운 호박색 오일(291.3 g)로서 15A와 15B의 혼합물을 수득하였다. 조 생성물을 추가의 정제없이 전방으로 수행하였다. 주 생성물은 2-(2-플루오로-6-니트로-페닐)-2,3-디하이드로푸란 (15A) (96%)이었다: LCMS (포름산 개질제로 5분에 걸쳐 10 내지 90% CH3CN / 물 구배로 용출하는 C18 컬럼) M+1 : 210.23 (3.13 min);
Figure pct00029
부 생성물은 2-(2-플루오로-6-니트로-페닐)-2,5-디하이드로푸란 (15B) (4%)이었다: GCMS (1 mL/min 유동속도로 15분에 걸쳐 60℃에서 2분 동안 300℃로 가열하는 Agilent HP-5MS 30 m x 250 μm x 0.25 μm 컬럼) M+1: 210 (11.95 min).
Figure pct00030
실시예 13
3-플루오로-2-테트라하이드로푸란-2-일-아닐린 (16)의 제조.
Figure pct00031
탄소 상의 5% 팔라듐(37.3 g, 50% 습윤, 8.76 mmol, Aldrich 330116)을 질소하에 파르 병 속에 위치시킨 다음, MeOH (70 mL, JT-Baker 909333)를 위치시켰다. MeOH (117 mL)에 용해된 2-(2-플루오로-6-니트로-페닐)-2,3-디하이드로푸란 및 2-(2-플루오로-6-니트로-페닐)-2,5-디하이드로푸란 (15A&15B) (186.6 g, 892.1 mmol)의 조 혼합물을 가한 다음, NEt3 (124.3 mL, 892.1 mmol, Sigma-Aldrich 471283)을 가하였다. 용기를 파르 진탕기 위에 위치시키고 H2로 포화시켰다. 45 psi H2를 가한 후에, 반응 혼합물을 출발 물질의 소비가 완결될 때까지 진탕시켰다(HPLC 및 LCMS는 완전한 반응을 나타내었다). 반응 혼합물을 질소로 퍼징시키고, Celite™를 통해 여과하고 EtOAc로 세정하였다. 여액을 회전 증발기에서 농축시켜 갈색 오일을 수득하고, 이는 Et20에 용해시키고 물(2x)로 세척하였다. 에테르 상을 수성 1N HCl (5 x 250 mL)로 추출하고, 이를 Et20 (3x)로 세척한 다음 수성 6N NaOH를 사용하여 pH 12-14로 염기화하였다. 염기성 수성 상을 CH2Cl2(4x)로 추출하고, 합한 유기 추출물을 포화 수성 NH4C1로 세척하고, MgS04 위에서 건조시키고 CH2C12 내지 25% EtOAc/헥산으로 용출시키는 실리카의 패드를 통해 여과하였다. 목적하는 여액을 감압하에 농축시켜서 담갈색 오일(121.8 g, 84% GCMS 플러스 NMR 순도)로서 16을 수득하였다. GCMS (1 mL/min 유동속도로 15분에 걸쳐 60℃에서 2분 동안 300℃로 가열하는 Agilent HP-5MS 30 m x 250 μm x 0.25 μm 컬럼) M+1: 182.0 (11.44 min). LCMS (포름산 개질제로 5분에 걸쳐 10 내지 90% CH3CN / 물 구배로 용출하는 C18 컬럼) M+1: 182.10 (2.61 min).
Figure pct00032
추가의 크롭들을 다음과 같이 수득하였다: 합한 에테르 상을 포화 수성 NaHC03, 염수로 세척하고, Na2S04 위에서 건조시키고, 경사여과한 다음, 감압하에 농축시켰다. 오일을 진공 증류(ca. 15 torr)하여 증류물을 101 내지 108℃에서 수집하였다. 2℃에서 EtOH (1 용적) 중의 증류된 오일의 교반 용액에 iPrOH 중의 5M HCl (1 당량)을 서서히 가하였다. 수득한 현탁액을 실온으로 만들고, EtOAc (3개의 용적, vol/vol)로 희석시키고, 2시간 동안 교반하였다. 백색 고체를 여과로 수집하고, EtOAc로 세척한 다음, 감압하에 건조시켜 HCl 염으로서 생성물의 제2 크롭을 수득하였다. 모 액(mother liquor)을 슬러리로 농축시키고, EtOAc로 희석시키고, 고체를 여과에 의해 수집하고, EtOAc로 세척한 다음 진공하에 건조시켜 생성물의 제3 크롭으로서 HCl 염을 수득하였다. LCMS (포름산 개질제로 5분에 걸쳐 10 내지 90% CH3CN / 물 구배로 용출하는 C18 컬럼) M+1: 182.10 (2.58 min).
Figure pct00033
3개의 크롭으로부터의 전체 수율은 76%이었다.
실시예 14
4-브로모-3-플루오로-2-테트라하이드로푸란-2-일-아닐린 (17)의 제조.
Figure pct00034
-20℃로 냉각된 메틸 3급-부틸 에테르(1.456 L) 및 아세토니트릴(485 mL) 중의 3-플루오로-2-테트라하이드로푸란-2-일-아닐린 (16) (131.9 g, 92%, 669.7 mmol)의 교반 용액에 N-브로모석신이미드 (120.4 g, 99%, 669.7 mmol, Aldrich B81255)를 약 -15℃ 이하로 반응 온도를 유지시키면서 3 부분으로 가하였다. 첨가 완료 후에 교반을 -15 내지 -10℃에서 30분 동안 계속하였다. 작업된 분취량의 1H NMR은 출발 아닐린의 96% 소비를 나타내었고, 이에 따라 또 다른 4.82g NBS를 가하고 -10℃에서 또 다른 30분 동안 교반하였다. 수성 1N Na2S203 (670 mL)를 반응 혼합물에 가하였다. 냉각 욕을 제거하고, 혼합물을 20분 동안 교반한 다음, EtOAc로 희석하였다. 층들을 분리하고 유기 상을 포화 수성 NaHC03 (2x), 물, 염수로 세척하고, Na2S04 위에서 건조시키고, 경사여과한 다음, 감압하에 농축시켜 어두운 호박색 오일을 수득하였다. 잔사를 헥산으로 희석시키고 25% EtOAc/헥산 내지 50% EtOAc/헥산으로 용출하는 실리카의 짧은 플러그를 통해 용출시켰다. 목적하는 여액을 진공하에 농축시켜 어두운 호박색 오일(182.9 g, 90% 수율; 86% NMR 순도)로서 17을 수득하였다. LCMS (포름산 개질제로 5분에 걸쳐 10 내지 90% CH3CN / 물 구배로 용출하는 C18 컬럼) M+1: 260.12 (3.20 min).
Figure pct00035
실시예 15
N-(4-브로모-3-플루오로-6-니트로-2-테트라하이드로푸란-2-일-페닐)-2,2,2-트리플루오로-아세트아미드 (18)의 제조.
Figure pct00036
2℃에서 교반하는 트리플루오아세트산 무수물 (565.3 mL, 4.067 mol, Sigma-Aldrich 106232)에 순수한 4-브로모-3-플루오로-2-테트라하이드로푸란-2-일-아닐린 (17) (123.0 g, 86%, 406.7 mmol)을 부가 깔때기를 통해 진한 오일로서 약 20분에 걸쳐 서서히 가하였다(반응 온도는 13°C로 상승하였다). 나머지 오일을 무수 THF (35 mL)를 사용하여 반응 혼합물 내로 세정하였다. 냉각 욕을 제거하고 반응을 35℃로 가열한 다음, 발열을 조절하기 위해 단지 필요한 빙-수 욕을 사용하여 30 내지 41℃의 반응 온도를 유지시키면서 NH4NO3 (4.88 g x 20 부분, 1.22 mol, Sigma-Aldrich A7455)를 부분 방식으로 2.5 시간에 걸쳐 첨가하였다. 첨가 완료 후에, 반응 혼합물을 또 다른 10분 동안 교반하였다(HPLC는 반응 99% 완료를 나타내었다). 이는 분쇄된 얼음(1.23 kg) 속으로 서서히 부어넣고 1시간 동안 교반하여 여과가능한 고체 침전물이 형성되도록 하고, 이는 수집하고 물로 세척하고, 드물게는 포화 수성 NaHC03,로 세척하고, 물로 다시 세척하였다(pH 7로 만듬). 생성물을 대류 오븐 속에서 40℃에서 밤새 건조한 다음 감압하에 오븐 속에서 50℃에서 밤새 건조시켜 베이지색 고체(152.5 g, 90% 수율; 96% HPLC 순도)로서 18을 수득하였다. LCMS (포름산 개질제로 5분에 걸쳐 10 내지 90% CH3CN / 물 구배로 용출하는 C18 컬럼) M+1: 401.30 (3.41 min).
Figure pct00037
실시예 16
4-브로모-3-플루오로-6-니트로-2-테트라하이드로푸란-2-일-아닐린 (19)의 제조.
Figure pct00038
반응 플라스크에 N-(4-브로모-3-플루오로-6-니트로-2-테트라하이드로푸란-2-일-페닐)-2,2,2-트리플루오로-아세트아미드 (18) (242.3 g, 604.1 mmol), 1,4-디옥산 (1.212 L), 수성 2M 황산 (362.4 mL, 724.9 mmol)을 충전시키고, 환류에서 5일 동안 교반하였다 (HPL는 98% 전환률을 나타내었다). 실온으로 냉각시키고, EtOAc로 희석시키고, 포화 수성 NaHCO3로 중화시키고, 층들을 분리시키고, EtOAc (2x)를 사용하여 수성 상을 재추출하였다. 합한 유기 상을 염수(2x)로 세척하고, MgSO4 위에서 건조시킨 다음, 여과하고 진공하에 농축시켜 녹갈색 고체(181.7 g, 94% 수율; 95% HPLC 순도)로서 19를 수득하였다. 생성물을 추가의 정제없이 다음 단계로 운반하였다. LCMS (포름산 개질제로 5분에 걸쳐 10 내지 90% CH3CN / 물 구배로 용출하는 C18 컬럼) M+1: 305.20 (3.63 min).
Figure pct00039
실시예 17
2-[5-(4-아미노-2-플루오로-5-니트로-3-테트라하이드로푸란-2-일-페닐)피리미딘-2-일]프로판-2-올 (20)의 제조.
Figure pct00040
1,4-디옥산 (4.20 L, Sigma-Aldrich 360481) 중의 4-브로모-3-플루오로-6-니트로-2-테트라하이드로푸란-2-일-아닐린 (19) (525.0 g, 1.721 mol, Bridge Organics Co.)의 교반 용액에 NaHC03 (4.302 L, 5.163 mol)의 1.2M 수용액을 가하였다. 질소의 스트림을 교반 혼합물을 통해 2시간 동안 버블링한 다음, 2-[5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)피리미딘-2-일]프로판-2-올 (7) (545.4 g, 2.065 mol, Bridge Organics Co.) 및 1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센 디클로로팔라듐 디클로로메탄 부가물(42.16 g, 51.63 mmol, Strem 460450)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류에서 밤새 교반하고, 냉각시키고, EtOAc (8.4 L)로 희석한 다음, 층들을 분리시켰다. 유기 상을 포화 수성 NH4C1 및 이후에 염수로 세척하였다. 수성 상은 EtOAc (4 L)로 재추출하고 이러한 유기 추출물을 염수로 세척하였다. 합한 유기 상을 MgSO4 위에서 건조시키고, Florisil®의 짧은 플러그를 통해 여과하고, EtOAc로 용출시킨 다음, 여액을 회전 증발기 위에서 농축시켜 암갈색 습윤 고체를 수득하였다. 이는 CH2Cl2에 용해시키고, 실리카 겔의 패드 위에 로딩(loading)시키고, 헥산으로 용출시킨 다음, 25% EtOAc/헥산으로 용출시킨 후, 50% EtOAc/헥산으로 용출시켰다. 목적하는 여액을 회전 증발기 위에서 진한 현탁액으로 농축시키고, 고체를 여과로 수집하고, MTBE로 분쇄한 다음, 진공하에 건조시켜 밝은 황색 고체(55.8% 수율, 90-97% HPLC 순도)로서 20을 수득하였다. 여액을 농축시키고 상기한 정제를 반복하여 밝은 황색 고체(19.7% 수율)로서 20의 제2 크롭을 수득하였다. 여액을 다시 농축시켜 암갈색 오일을 수득하고 이는 톨루엔 및 최소 CH2Cl2를 갖는 실리카 컬럼 위에 로딩하였다. 이는 EtOAc/헥산(0% 내지 50%)으로 용출시켰다. 목적하는 분획을 슬러리로 농축시키고 MTBE/헥산으로 희석시켰다. 고체를 여과에 의해 수집하고 최소 MTBE로 세척하여 3개의 크롭으로부터 80%의 전체 수율을 갖는 밝은 황색 고체(4.9% 수율)로서 20의 제3의 크롭을 수득하였다. LCMS (포름산 개질제로 5분에 걸쳐 10 내지 90% CH3CN / 물 구배로 용출하는 C18 컬럼) M+1: 363.48 (2.95 min).
Figure pct00041
실시예 18
2-[5-(4,5-디아미노-2-플루오로-3-테트라하이드로푸란-2-일-페닐)피리미딘-2-일]프로판-2-올 (21)의 제조
Figure pct00042
탄소 상의 5% 팔라듐(14.21 g, 50% 습윤, 3.339 mmol, Aldrich 330116)을 질소 하의 파르 반응기 속에 위치시킨 다음, MeOH (242 mL, JT-Baker 909333) 및 NEt3 (46.54 mL, 333.9 mmol, Sigma-Aldrich 471283)를 위치시켰다. 2-[5-(4-아미노-2-플루오로-5-니트로-3-테트라하이드로푸란-2-일-페닐)피리미딘-2-일]프로판-2-올 (20) (121.0 g, 333.9 mmol)의 가열 THF (360 mL)에 용해시키고, 냉각시키고, 반응 혼합물에 가한 다음, 또 다른 부분의 THF (124 mL)로 세정하였다. 용기를 파르 진탕기 위에 두고 H2로 포화시켰다. 45 psi H2를 가하고 소비가 완료될 때까지 진탕시켰다(HPLC 및 LCMS는 완전한 반응을 나타내었다). 반응 혼합물은 질소로 퍼징하고, Celite™를 통해 여과하고 EtOAc로 세정하였다. 이는 페이퍼(유리 미세섬유)를 통해 여과하고 여액은 진공하에 농축시켰다. 반응을 동일한 규모로 3회 이상 반복하고, 뱃치를 합하여 갈색 고체(447 g, 99% 수율; 93% HPLC 순도)로서 21을 수득하였다. LCMS (포름산 개질제로 5분에 걸쳐 10 내지 90% CH3CN / 물 구배로 용출하는 C18 컬럼) M+1: 333.46 (1.79 min).
Figure pct00043
실시예 19
1-에틸-3-[6-플루오로-5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5-일]-7-테트라하이드로푸란-2-일-1H-벤즈이미다졸-2-일]우레아 (22)의 제조
Figure pct00044
2-[5-(4,5-디아미노-2-플루오로-3-테트라하이드로푸란-2-일-페닐)피리미딘-2-일]프로판-2-올 (21) (111.3 g, 334.9 mmol) 및 1,4-디옥산 (556.5 mL, Sigma-Aldrich 360481)의 교반 현탁액에 1-에틸-3-(N-(에틸카바모일)-C-메틸설파닐-카본이미도일)우레아 (10) (93.36 g, 401.9 mmol, CB Research and Development)를 가한 다음, 1N 수성 H2SO4 (1.100 L)에 NaOAc 삼수화물(158.1 g)을 용해시킴으로써 제조한, pH 3.5 완충액 (1.113 L)을 가하였다. 반응 혼합물을 환류에서 밤새 교반하고(HPLC는 완전한 전환을 나타내었다), 실온으로 냉각시킨 다음, 부분 방식으로(포말) 수성 포화 NaHCO3 (2.23 L)의 교반 용액 내로 부어 넣어서 pH 8 내지 9를 수득하였다. 이를 30분 동안 교반하고, 고체를 여과에 의해 수집하고, 물로 충분히 세척하여 중성 pH로 만든 다음, 보다 드물게는 EtOH로 세척하였다. 고체는 감압하에 건조시켜 회백 황색 고체(135.2 g, 94% 수율; 99% HPLC 순도)로서 22를 수득하였다. LCMS (포름산 개질제로 5분에 걸쳐 10 내지 90% CH3CN / 물 구배로 용출하는 C18 컬럼) M+1: 429.58 (2.03 min).
Figure pct00045
실시예 20
1-에틸-3-[6-플루오로-5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5-일]-7-[(2R)-테트라하이드로푸란-2-일]-1H-벤즈이미다졸-2-일]우레아 (23)의 키랄 크로마토그래피적 분리.
Figure pct00046
1-에틸-3-[6-플루오로-5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5-일]-7-테트라하이드로푸란-2-일-1H-벤즈이미다졸-2-일]우레아 (22) (133.60 g)의 라세미 샘플을 25℃에서 DCM/MeOH/TEA (60/40/0.1)로 용출시키는 CHIRALPAK® IC® 컬럼 (제조원: Chiral Technologies) 위에서 분해시켜서 회백색 고체(66.8 g, 45% 수율; 99.8% HPLC 순도, 99+% ee)로서 목적하는 에난티오머 23을 수득하였다. 분석적 키랄 HPLC 보유 시간은 7.7분이었다(CHIRALPAK® IC® 4.6 x 250 mm 컬럼, 1 mL/min 유동 속도, 30℃). 고체는 2:1 EtOH/Et20 (5개의 용적)에 용해시키고, 10분 동안 교반하고, 여과에 의해 수집하고, 2:1 EtOH/ Et20로 세척한 다음, 감압하에 건조시켜 백색 고체(60.6 g)를 수득하였다.
23의 구조 및 절대 입체화학은 단결정 x-선 회절 분석으로 확인하였다. 단결정 회절 데이터는 밀봉된 튜브 Cu K-알파 공급원 (Cu Kα 방사선, γ = 1.54178 Å) 및 Apex II CCD 검출기가 구비된 Bruker Apex II 회절기에서 획득하였다. 치수가 0.15 x 0.15 x 0.10 mm인 결정을 선택하고, 무기 오일을 사용하여 세척하고, MicroMount 위에 올려놓고 Bruker APEXII 시스템에서 중앙에 두었다. 역격자 공간에서 분리된 40개의 프레임의 3개의 뱃치를 수득하여 배향 매트릭스 및 초기 셀 파라미터를 제공하였다. 데이터 수집이 전체 데이터 세트를 기준으로 하여 완결된 후에 최종 셀 파라미터를 수득하고 정제하였다. 체계적인 부재 및 강도 통계학을 근거로 하여, 구조를 해결하고 중심을 벗어난 P21 공간 그룹에서 정제하였다.
역격자 공간의 회절 데이터 세트를, 각각의 프레임에 대하여 30초 노출을 이용하여 0.5°단계를 이용하는 0.85Å의 분해능으로 수득하였다. 데이터를 100 (2) K에서 수집하였다. 셀 파라미터들의 강도 및 정제의 통합은 APEXII 소프트웨어를 사용하여 성취하였다. 데이터 수집 후의 결정을 관찰한 결과, 분해의 신호가 나타나지 않았다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 구조 내에 2개의 대칭 독립적인 분자들이 존재하고 두개의 대칭 독립적인 분자들은 R 이성체이다.
데이터를 Apex II 소프트웨어를 사용하여 수집하고, 정제하고 감소시켰다. 구조는 SHELXS97 (Sheldrick, 1990)을 사용하여 해결하였고; 프로그램(들) 및 구조는 SHELXL97 (Sheldrick, 1997) 프로그램을 사용하여 정제하였다. 결정은 P21 공간 그룹을 갖는 모노클리닉 셀(monoclinic cell)을 나타낸다. 격자 파라미터는 a = 9.9016(2) Å, b = 10.9184(2) Å, c = 19.2975(4) Å, β= 102.826(1)°. 용적 = 2034.19(7) Å3.
실시예 21
1-에틸-3-[6-플루오로-5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5-일]-7-[(2R)-테트라하이드로푸란-2-일]-1H-벤즈이미다졸-2-일]우레아 (23A)의 제조.
Figure pct00047
디클로로메탄 (60 mL, J.T. Baker 931533) 및 무수 에탄올 (15 mL, Pharmco-AAPER 111000200) 중의 1-에틸-3-[6-플루오로-5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5-일]-7-[(2R)-테트라하이드로푸란-2-일]-1H-벤즈이미다졸-2-일]우레아 (23) (15.05 g, 35.13 mmol)의 교반 현탁액에 메탄설폰산(2.392 mL, 36.89 mmol, Sigma-Aldrich 471356)을 가하였다. 실온에서 투명한 용액이 관찰될 때까지 교반하였다. 헵탄(300 mL)을 약 1시간에 걸쳐 서서히 가하고 고체 침전물을 여과에 의해(Whatman GF/F 유리 미세섬유 페이퍼의 상부에 Whatman qualitative # 3 페이퍼를 사용함) 수집하였다. 진공 오븐(황산칼슘 및 수산화칼륨으로 건조시킴) 속에서 감압하에 40℃에서 밤새 건조시켜서 백색 고체(13.46 g, 99+% HPLC 순도, 99+% ee)로서 23A를 수득하였다. 분석적 키랄 HPLC는, 30℃에서 1mL/min 유동 속도로 CHIRALPAK® IC® 4.6 x 250 mm 컬럼 상에서 CH2C12/MeOH/TEA (60/40/0.1)로 용출하는 8.6분의 보유 시간을 갖는 하나의 에난티오머를 나타낸다. 백색 고체 생성물 23A (4.36 g, 98% HPLC 순도, 99+% ee)의 제2 크롭을 여액으로부터 수득하였다. LCMS (포름산 개질제로 5분에 걸쳐 10 내지 90% CH3CN / 물 구배로 용출하는 C18 컬럼) M+1: 429.58 (2.03 min).
Figure pct00048
(R)-1-에틸-3-(6-플루오로-5-(2-(2-하이드록시프로판-2-일)피리미딘-5-일)-7-(테트라하이드로푸란-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)우레아 23을 이후에 아래에 나타낸 반응식들에 따라 포스페이트 또는 포스페이트 염 프로드럭(prodrug)으로 전환시킬 수 있다.
[반응식 1]
Figure pct00049
시약 및 조건: (a) 디벤질 N,N-디이소프로필포스포르아미티트, 테트라졸, 23℃, DMF; (b) mCPBA, 0-23℃, DMF; (c) H2, Pd/C, M+OH- 또는 D2+(OH-)2, EtOH, H20; (d) 수성 H+; (e) 수성 M+OH_.
화학식(IB)의 화합물을 반응식 1에 나타내 바와 같은 화합물 23으로부터 제조할 수 있다. 단계 1에서, 화합물 23은 디벤질 N,N-디이소프로필포스포르아미디트 및 테트라졸로 처리한 다음, 메타-클로로퍼옥시벤조산(mCPBA)으로 처리하여 디벤질 포스페이트 24를 수득하였다. 단계 2에서, M+OH- 또는 D2+(OH-)2의 존재하에 24를 가수소분해하면 화학식 (IB) (X = -PO(0-)2·2M+ 또는 -PO(0-)22·D2 +)의 화합물의 2 음이온 형태를 제공한다. 화학식 (IB) (X = PO(OH)2)의 화합물의 유리 산 형태는, 2 음이온 형태를 수성 산으로 처리하여 수득할 수 있다. 화학식 (IB)(IB) (X = PO(OH)0_M+)의 화합물의 1 음이온 형태는 유리 산 형태를 1 당량의 M+OH-으로 처리하여 수득할 수 있다.
[반응식 2]
Figure pct00050
시약 및 조건: (a) Boc20, DMF, 23℃; (b) 디벤질 N,N-디이소프로필포스포르아미디트, 테트라졸, 23℃, DMF; (c) mCPBA, 0-23℃, DMF; (d) TFA, H20, MeOH, DCM, 23℃; (e) H2, Pd/C, M+OH- 또는 D2 +(OH)2, EtOH, H20; (f) 수성 H+; (g) 수성 M+OH_.
대안적으로, 화학식 (IB)의 화합물은 반응식 2에 나타낸 바와 같이 화합물 23으로부터 제조할 수 있다. 단계 1에서, 화합물 23은 디-3급-부틸 디카보네이트 (Boc20)로 처리하여 보호된 벤즈이미다졸 화합물 25를 제공한다. 단계 2에서, 화합물 25는 디벤질 N,N-디이소프로필포스포르아미디트 및 테트라졸로 처리한 다음, mCPBA로 처리하여 보호된 디벤질 포스페이트 26을 제공한다. 단계 3에서, 화합물 26은 트리플루오로아세트산(TFA)으로 처리하여 보호 그룹을 제거하고 디벤질 포스페이트 24를 제공한다. 단계 4에서, M+OH- 또는 D2 +(OH-)2의 존재하에 24를 가수소분해하여 화학식 (IB) (X = -PO(0-)2·2M+ 또는 -PO(0-)2·D2 +)의 화합물의 2 음이온 형태를 제공한다. 화학식 (IB) (X = PO(OH)2)의 화합물의 유리 산 형태는, 2 음이온 형태를 수성 산으로 처리하여 수득할 수 있다. 화학식 (I) (X = PO(OH)O-M+)의 화합물의 2 음이온 형태는, 유리산 형태를 1당량의 M+OH-로 처리하여 수득할 수 있다.
[반응식 3]
Figure pct00051
시약 및 조건: (a) Boc20, DMAP, DMF, 23℃; (b) 디벤질 N,N-디이소프로필포스포르아미디트, 테트라졸, 23℃, DMF; (c) mCPBA, 0-23℃, DMF; (d) TFA, DCM; (e) 수성 M+OH- 또는 D2+(OH-)2; (f) 수성 H+; (g) 수성 M+OH-.
화학식 (IB)의 화합물은 또한 반응식 3에 나타낸 바와 같이 화합물 23으로부터 제조할 수 있다. 단계 1에서, 화합물 23은 N,N-디메틸아미노피리딘 (DMAP)의 존재하에 2당량의 Boc20으로 처리하여 비스-보호된 벤즈이미다졸 화합물 28을 수득한다. 단계 2에서, 화합물 28을 디벤질 N,N-디이소프로필포스포르아미디트 및 테트라졸로 처리한 다음, mCPBA로 처리하여 비스-보호된 디벤질 포스페이트 29를 수득한다. 단계 3에서, 화합물 29를 TFA로 처리하여 보호 그룹을 제거한다. 수득한 중간체를 수성 M+OH- 또는 D2 +(OH-)2로 처리하여 화학식 (IB) (X = -PO(0-)2·2M+ 또는 -PO(0-)2·D2 +)의 화합물의 2 음이온 형태를 제공한다. 화학식 (IB) (X = PO(OH)2)의 화합물의 유리 산 형태는, 2 음이온 형태를 수성 산으로 처리하여 수득할 수 있다. 화학식(I) (X = PO(OH)0-M+)의 화합물의 2 음이온 형태는, 유리 산 형태를 1 당량의 M+OH-로 처리하여 수득할 수 있다.
실시예 22
(R)-디벤질 2-(5-(2-(3-에틸우레이도)-6-플루오로-7-(테트라하이드로푸란-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-5-일)피리미딘-2-일)프로판-2-일 포스페이트 (24)의 제조.
Figure pct00052
23℃에서 N2하에 1L들이 환저 플라스크 속의 1-에틸-3-[6-플루오로-5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5-일]-7-[(2R)-테트라하이드로푸란-2-일]-1H-벤즈이미다졸-2-일]우레아 (23) (10.24 g, 23.66 mmol)에 DMF (200 mL)를 가한 다음, 테트라졸 (MeCN 중의 105.2 mL의 0.45 M, 47.32 mmol)의 용액을 가한 후, N-디벤질옥시포스파닐-N-이소프로필-프로판-2-아민 (12.26 g, 11.93 mL, 35.49 mmol)을 가하였다. 4.5시간 후에, 더 많은 N-디벤질옥시포스파닐-N-이소프로필-프로판-2-아민 (4 mL)을 가하였다. 추가로 16시간 교반한 후에, 반응을 0℃로 냉각(빙수 욕)시킨 다음 mCPBA (15.17 g, 61.52 mmol)로 처리하였다. 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반한 다음 23℃에서 30분 동안 교반하고, 이후에 반응 혼합물을 물(400 mL)과 EtOAc(700 mL)로 분획하였다. 유기 층을 분리시키고, 포화 수성 중탄산나트륨(500 mL), 10% 수성 중아황산나트륨 (500 mL), 포화 수성 중탄산나트륨(500 mL), 및 염수(500 mL)로 세척한 다음, 건조(황산마그네슘)시키고, 여과하고 농축시켰다. 잔사를 200 mL/min 유동 속도에서 16.5 컬럼 용적 위에 DCM 선형 구배로 0-10% EtOH로 용출하는 ISCO COMBIFLASH 브랜드 플래쉬 크로마토그래피 정제 시스템(330 g 컬럼)을 이용하는 MPLC로 정제하였다. 진공하에 농축시킨 후에, (R)-디벤질 2-(5-(2-(3-에틸우레이도)-6-플루오로-7-(테트라하이드로푸란-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-5-일)피리미딘-2-일)프로판-2-일 포스페이트(24) (13.89 g, 20.17 mmol, 85.27%)를 백섹 고체로서 수득하였다. ESMS (M + 1) = 689.5;
Figure pct00053
실시예 23
(R)-2-(5-(2-(3-에틸우레이도)-6-플루오로-7-(테트라하이드로푸란-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-5-일)피리미딘-2-일)프로판-2-일 포스페이트 (W)의 제조.
Figure pct00054
1 L 파르 용기에 물 (200 mL), Pd/C (4 g, 10 wt% 무수 기준, 습윤, 데구사 타입(Degussa type)), (R)-디벤질 2-(5-(2-(3-에틸우레이도)-6-플루오로-7-(테트라하이드로푸란-2-일)-1H-벤조[(d]이미다졸-5-일)피리미딘-2-일)프로판-2-일 포스페이트(24) (13.89 g, 20.17 mmol), EtOH (400 mL) 및 수성 1M NaOH (40.34 mL, 40.34 mmol)를 충전시켰다. 수득한 혼합물을 파르 진탕기 장치에서 50 psi H2하에 40분 동안 수소화하였다. 반응 혼합물을 0.22 ㎛ 폴리에테르설폰(PES) 막을 통해 여과하여 검정색의 여액을 제공하였다. 물 세정을 통해 막을 가로지르는 더 검정색의 물질을 생성하였다. 수득된 여액을 셀라이트의 패드를 통과시켰고 검정색 물질은 패드가 물로 세정될 때까지 용출되지 않았다. 수득되는 어두운 용액(대략 700 mL)을 3 용적의 EtOH (2100 mL)로 희석시키고, 0.22 ㎛ PES 막 (4개의 1회용 코닝 폴리스티렌 필터 시스템즈, #431098)을 통해 여과하고 여액을 진공하에 농축시켰다. 수득되는 잔사를 물(100 mL) 및 EtOH (300 mL)에 용해시키고, 0.22 ㎛ PES 막을 통해 여과하여 투명한 황색 용액을 수득한 다음, EtOH (50 mL)로 세정하는 셀라이트 플러그(26 mm 직경 x 60 mm 높이, EtOH로 예비-습윤시킴)를 통과시키고, 여액을 이후에 농축시켰다. 수득한 잔사를 1 L 들이 환저 플라스크 속의 물(250 mL)에 용해시킨 다음, 1M 수성 HCl (40 mL)을 교반하면서 15분에 걸쳐 서서히 가하여 백색 고체의 슬러리를 수득하였다. HCl 첨가의 완료 20분 후에, 고체를 0.22 ㎛ PES 막을 통한 여과를 통해 수집하였다. 수집된 고체를 물(100 mL)로 세척한 다음, 1 L 들이 환저 플라스크로 이동(여전히 습윤)시키고 MeOH (150 mL) 속에서 30분 동안 슬러리화하였다. 수득된 미세 백색 침전물을 여과를 통해 수집한 다음 진공하에 밤새 건조시켰다. 수득되는 유리 산(9.17 g, 18.0 mmol)을 물(80 mL) 및 이어서 1.0 N 수성 NaOH (36.0 mL, 2 당량)으로 처리하였다. 수득된 용액을 동결시키고 동결건조시켜 이나트륨 [1-[5-[2-(에틸카바모일아미노)-6-플루오로-7-[(2R)-테트라하이드로푸란-2-일]-1H-벤즈이미다졸-5-일]피리미딘-2-일]-1-메틸-에틸] 포스페이트 (W) (10.206 g, 18.08 mmol, 89.66%)을 일정한 분석 데이터를 갖는 옅은 크림색 고체로서 수득하였다. ESMS (M + 1) = 509.4;
Figure pct00055
실시예 24
Boc-1-에틸-3-[6-플루오로-5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5-일]-7-[(2R)-테트라하이드로푸란-2-일]-1H-벤즈이미다졸-2-일] 우레아 (25)의 제조.
Figure pct00056
23℃에서 DMF (250 mL) 중의 1-에틸-3-[6-플루오로-5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5-일]-7-[(2R)-테트라하이드로푸란-2-일]-1H-벤즈이미다졸-2-일]우레아 (23) (10.72 g, 25.02 mmol)의 용액/현탁액에 Boc20 (6.11 g, 28.00 mmol)를 가하였다. 2시간 후에, MeOH (2 mL) 중의 2M 암모니아를 가하여 임의의 과량의 Boc20를 퀀칭(quenching)시킨다. 퀀칭된 반응 혼합물을 EtOAc와 물(각각 400 mL)로 분획하고, 유기층을 분리하고, 물(2 x 400 mL) 및 염수(400 mL)로 세척한 다음, MgSO4 위에서 건조시키고, 여과하고 농축시켜 Boc-1-에틸-3-[6-플루오로-5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5-일]-7 -[(2R)-테트라하이드로푸란-2-일]-1H-벤즈이미다졸-2-일] 우레아 (25) (12.69 g, 23.58 mmol, 94.26%)를 수득하고, 이를 추가의 정제없이 사용하였다. ESMS (M + 1) = 529.3;
Figure pct00057
실시예 25
Boc-1-에틸-3-[6-플루오로-5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5-일] -7 -[(2R)-테트라하이드로푸란-2-일]-1H-벤즈이미다졸-2-일]우레아 디벤질포스페이트 (26)의 제조.
Figure pct00058
Boc-1-에틸-3-[6-플루오로-5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5 -일] -7-[(2R)-테트라하이드로푸란-2-일]-1H-벤즈이미다졸-2-일]우레아 (25) (12.69 g, 23.58 mmol) 및 테트라졸 (3.304 g, 47.16 mmol)에 N2하에 23℃에서 DCM (240 mL)을 가한 다음 N-디벤질옥시포스파닐-N-이소프로필-프로판-2-아민 (9.775 g, 9.509 mL, 28.30 mmol)을 가하였다. 23℃에서 3시간 후에, 반응을 0℃로 냉각시킨 다음, mCPBA (6.977 g, 28.30 mmol)를 가하였다. 수득되는 용액을 0℃에서 45분 동안 교반한 후에 23℃에서 20분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM (50 mL)과 포화 수성 중탄산나트륨(400 mL)으로 분획하였다. 유기 층을 분리한 다음, 수성 아황산나트륨(350 mL 물 속의 63g) 및 포화 수성 중탄산나트륨(400 mL)으로 연속적으로 세척한 다음, 황산마그네슘 위에서 건조하고, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 잔사를 200 mL/min에서 16개의 컬럼 용적 위에서 선형 구배의 헥산 중에서 0 내지 100% EtOAc로 용출시키는 ISCO COMBIFLASH 브랜드 플래쉬 크로마토그래피 정제 시스템(330g 실리카 컬럼)을 사용하는 MPLC로 정제하였다. 생성물 함유 분획을 진공하에 증발시켜 Boc-1-에틸-3-[6-플루오로-5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5-일]-7-[(2R)-테트라하이드로푸란-2-일]-1H-벤즈이미다졸-2-일]우레아 디벤질포스페이트 (26) (11.92 g, 15.11 mmol, 64.09%)를 수득하였다. ESMS (M + 1) = 789.2;
Figure pct00059
실시예 26
(R)-디벤질 2-(5-(2-(3-에틸우레이도)-6-플루오로-7-(테트라하이드로푸란-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-5-일)피리미딘-2-일)프로판-2-일 포스페이트 (24)의 제조.
Figure pct00060
23℃에서 DCM (300 mL) 중의 Boc-1-에틸-3-[6-플루오로-5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5-일]-7-[(2R)-테트라하이드로푸란-2-일]-1H-벤즈이미다졸-2-일]우레아 디벤질 포스페이트 (26) (11.9 g, 15.09 mmol)의 용액에 물(2.325 mL, 129.1 mmol) 이후에 TFA (3.441 g, 2.325 mL, 30.18 mmol)를 가하였다. 1시간 후에, 단지 부분 전환이 tlc에 의해 관찰되어, 더 많은 TFA (3.441 g, 2.325 mL, 30.18 mmol)를 가하였다. 추가로 2.5시간 후에, MeOH (2 mL)를 가하고 혼합물을 추가로 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 1:1 염수:포화 수성 중탄산나트륨(200 mL)으로 세척하였다. 수성 층들을 DCM (150 mL)으로 재추출하고, 유기 층들을 합한 다음, 건조(황산마그네슘 위에서)시키고, 여과하고 농축시켰다. 수득되는 잔사를 EtOAc (200 mL)에 재용해시키고 물(150 mL) 및 염수(100 mL)로 세척한 다음, 건조(황산마그네슘)시키고, 여과하고 진공하에 농축시켜 (R)-디벤질 2-(5-(2-(3-에틸우레이도)-6-플루오로-7-(테트라하이드로푸란-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-5-일)피리미딘-2-일)프로판-2-일 포스페이트 (24) (10.21 g, 14.83 mmol, 98.27%)를 백색 고체로서 수득하였다. ESMS (M + 1) = 689.4;
Figure pct00061
실시예 27
(R)-2-(5-(2-(3-에틸우레이도)-6-플루오로-7-(테트라하이드로푸란-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-5-일)피리미딘-2-일)프로판-2-일 포스페이트 (W)의 제조.
Figure pct00062
1L 들이 환저 플라스크에 (R)-디벤질 2-(5-(2-(3-에틸우레이도)-6-플루오로-7-(테트라하이드로푸란-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-5-일)피리미딘-2-일)프로판-2-일 포스페이트 (24)(9.37 g, 13.61 mmol), EtOH (300 mL), 물(150 mL), Pd/C(10 중량% 무수 기준, 습윤, 데구사 유형, 3 g) 및 1M 수성 NaOH(27.22 mL, 27.22 mmol)를 충전하였다. 현탁액을 3분 동안 배출(펌핑하기 위한 침)시킨 후 수소 가스의 대기(풍선)하에 두었다. 2.5시간 동안 23℃에서 교반한 후, 반응물을 0.22μm PES 막(1회용 코닝 필터 시스템(disposable Corning filter system), 1 L, 폴리스티렌, #431098)으로 여과하여 촉매를 제거하고 EtOH(50 mL)로 세척하였다. 수득되는 용액을 농축시키고, 잔사를 물(80 mL) 속에 용해하고, MeCN(80 mL)으로 처리한 후, 동결시키고 동결건조시켜 이나트륨 (R)-2-(5-(2-(3-에틸우레이도)-6-플루오로-7-(테트라하이드로푸란-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-5-일)피리미딘-2-일)프로판-2-일 포스페이트 (W)(7.10 g, 12.81 mmol, 94.12%)를 백색 고체로서 수득하였다. ESMS (M + 1) = 509.3;
Figure pct00063
실시예 28
디Boc-1-에틸-3-[6-플루오로-5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5 -일]-7-[(2R)-테트라하이드로푸란-2-일]-1H-벤즈이미다졸-2-일]우레아(28)의 제조 .
Figure pct00064
DMF(30 mL) 중 1-에틸-3-[6-플루오로-5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5-일]-7-[(2R)-테트라하이드로푸란-2-일]-1H-벤즈이미다졸-2-일]우레아(23)(1.333 g, 3.111 mmol)의 용액/현탁액에 DMAP(38.01 mg, 0.3111 mmol)에 이어 Boc20(1.426 g, 1.501 mL, 6.533 mmol)를 가하였다. 30분 후, 반응 혼합물을 물 및 EtOAc(각각 300 mL)로 희석시키고, 유기 층을 분리하고, 물 및 염수(각각 300 mL)로 세척한 후, 황산마그네슘 위에서 건조시키고, 여과하며 농축시켰다. 잔사를 헥산 선형 구배 중 0 내지 60% EtOAc로 20개 컬럼 용적에 걸쳐 60 mL/분의 유동 속도로 용출시키는 ISCO COMBIFLASH 브랜드 섬광 크로마토그래피 정제 시스템(80 g의 실리카)을 사용하는 MPLC에 의해 정제하였다. 바람직한 생성물 분획을 합하고 증발시켜 디Boc-1-에틸-3-[6-플루오로-5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5-일]-7-[(2R)-테트라하이드로푸란-2-일]-1H-벤즈이미다졸-2-일]우레아 (28)(1.43 g, 2.275 mmol, 73.11%)를 투명한 발포체로서 수득하였다. ESMS (M + 1) = 629.3;
Figure pct00065
실시예 29
디Boc-1-에틸-3-[6-플루오로-5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5 -일]-7-[(2R)-테트라하이드로푸란-2-일]-1H-벤즈이미다졸-2-일]우레아 디벤질 포스페이트(29)의 제조.
Figure pct00066
23℃에서 N2 하에 디Boc-1-에틸-3-[6-플루오로-5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5-일]-7-[(2R)-테트라하이드로푸란-2-일]-1H-벤즈이미다졸-2-일]우레아 (28) (1.13 g, 1.797 mmol) 및 테트라졸 (251.8 mg, 3.594 mmol)에 DCM(30 mL)에 이어서 N-디벤질옥시포스파닐-N-이소프로필-프로판-2-아민(744.7 mg, 724.4 μL, 2.156 mmol)을 가하였다. 18시간 동안 교반한 후, 반응물을 0℃로 냉각시킨 후 mCPBA(531.5 mg, 2.156 mmol)로 처리하였다. 반응물을 15분 동안 0℃에서, 이후 30분 동안 23℃에서 교반하였다. 이후에, 수득되는 용액을 EtOAc와 포화된 수성 중탄산나트륨(각각 300 mL)으로 분획하고, 유기 층을 분리한 후, 10% 아황산나트륨, 포화된 수성 중탄산나트륨 및 염수(각각 300 mL)로 세척한 후, 황산마그네슘 위에서 건조시키고 여과하며 농축시킨다. 잔사를 헥산 선형 구배 중 0 내지 80% EtOAc로 20개 컬럼 용적에 걸쳐 60 mL/분의 유동 속도로 용출시키는 ISCO COMBIFLASH 브랜드 섬광 크로마토그래피 정제 시스템(80 g의 실리카 컬럼)을 사용하는 MPLC로 정제하였다. 바람직한 생성물 분획을 합하고 증발시켜 디Boc-1-에틸-3-[6-플루오로-5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5-일]-7-[(2R)-테트라하이드로푸란-2-일]-1H-벤즈이미다졸-2-일]우레아 디벤질 포스페이트 (29) (1.03 g, 1.159 mmol, 64.50%)를 선명한, 투명 오일로서 수득하였다. ESMS (M + 1) = 889.5;
Figure pct00067
실시예 30
나트륨 (R)-2-(5-(2-(3-에틸우레이도)-6-플루오로-7-(테트라하이드로푸란-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-5-일)피리미딘-2-일)프로판-2-일 포스페이트 (W)의 제조.
Figure pct00068
23℃에서 DCM (10 mL) 중 디Boc-1-에틸-3-[6-플루오로-5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5 -일]-7-[(2R)-테트라하이드로푸란-2-일]-1H-벤즈이미다졸-2-일] 우레아 디벤질 포스페이트 (29)(121 mg, 0.1361 mmol)의 용액에 TFA(5 mL)를 가하였다. 2시간 후, 반응 혼합물을 진공하에 농축시켰다. 잔사를 MeOH (6 mL) 속에 용해하고 MeOH 중 대략 0.5 mL의 2M NH3(물질을 완전히 용해시키기 위해)으로 처리하였다. 수득되는 용액을 제조 HPLC, 역상, Sunfire prep C18 OBD 5 μM 컬럼 19 x 100 mm 상에서; 1O 내지 90% aq MeCN w/ 0.1% TFA 완충액, 선형 구배를 사용하여 15분에 걸쳐 20 mL/분의 유동 속도에서 용출시켜 6개 주입물 속에서 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 혼주시키고 동결건조시켰다. 수득되는 물질을 MeOH(3 mL) 속에 현탁시키고, 23℃에서 30분 동안 교반한 후, 침전물을 플라스틱 프릿을 통한 여과를 통해 수집하였다. 수득되는 백색 고체를 MeOH 슬러리(3 mL)에 재적용시킨 후, 여과를 통해 수집하여 건조 후 68 mg의 백색 고체를 수득하였다. 백색 고체를 0.10 M aq NaOH (2.68 mL, 2 당량의 NaOH)로 처리하여 용액을 수득하고 이를 0.45 μm PTFE 막을 지닌 Acrodisc CR 13 mm 주사기 여과기를 통과시키고, 물(2 mL)로 플러싱(flushing)하였다. 수득되는 용액을 MeCN(3 mL)으로 처리하고, 동결시키고 동결건조시켜 나트륨(R)-2-(5-(2-(3-에틸우레이도)-6-플루오로-7-(테트라하이드로푸란-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-5-일)피리미딘-2-일)프로판-2-일 포스페이트(W)를 백색 분말로서 수득하였다. ESMS (M + 1) = 509.2;
Figure pct00069
실시예 31
액상 매질에서의 감수성 시험
본 발명의 화합물을 액상 매질에서의 감수성 시험에 의해 항미생물성 활성에 대해 시험하였다. 이러한 검정은 이러한 수행을 관장하는 가장 최근의 CLSI 문건의 지침서내에서 수행할 수 있다: "M07-A8 Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically; Approved Standard-Fifth Edition (2000)". 문헌[참조: "Antibiotics in Laboratory Medicine" (Edited by V. Lorian, Publishers. Williams and Wilkins, 1996)]과 같은 기타 공보는 실험실 항생제 시험에 있어 필수적인 수행 기술을 제공한다. 사용되는 구체적인 프로토콜은 다음과 같다:
프로토콜 #1: 미량희석 브로쓰 ( broth ) 방법을 사용한 화합물의 자이라제 MIC 측정
재료:
환저 96-웰 미세역가 플레이트 (Costar 3788)
Mueller Hinton II 한천 플레이트 (MHII; BBL 프리믹스)
Mueller Hinton II 액체 브로쓰 (MHII; BBL 프리믹스)
BBL Prompt 접종 시스템 (Fisher B26306)
시험 판독 거울 (Fisher)
신선하게 제조된 단일 콜로니에 스트리크된(streaked) 세균을 갖는 한천 플레이트
멸균 DMSO
사람 혈청 (U.S. Biologicals S1010-51)
레이크화된 말 혈액 (Quad Five 270-100)
레자주린 0.01%
스프래그 도울리 랫트 혈청 (U.S. Biologicals 1011-90B 또는 Valley BioMedical AS3061SD)
혼주 마우스 혈청 (Valley BioMedical AS3054)
균주 (배지, 브로쓰 및 한천):
1. 스타필로코쿠스 아우레우스 ATCC #29213
a. MHII
b. MHII + 50% 사람 혈청
c. MHII + 50% 랫트 혈청
d. MHII + 50% 마우스 혈청
2. 스타필로코쿠스 아우레우스 ATCC #29213 GyrB T173I (MHII)
3. 스타필로코쿠스 아우레우스, JMI 수집 균주; 표 5 참조(MHII)
4. 스타필로코쿠스 에피데르미디스, JMI 수집 균주; 표 5 참조(MHII)
5. 엔테로코쿠스 파에칼리스 ATCC #29212 (MHII + 3% 레이크화된 말 혈액)
6. 엔테로코쿠스 파에시움 ATCC #49624 (MHII + 3% 레이크화된 말 혈액)
7. 엔테로코쿠스 파에칼리스, JMI 수집 균주; 표 5 참조(MHII + 3% 레이크화된 말 혈액)
8. 엔테로코쿠스 파에시움, JMI 수집 균주; 표 5 참조(MHII + 3% 레이크화된 말 혈액)
9. 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 ATCC #10015 (MHII + 3% 레이크화된 말 혈액)
10. 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, JMI 수집 균주; 표 5 참조(MHII + 3% 레이크화된 말 혈액)
11. β-용혈성 스트렙토코쿠스, 그룹 A, B, C, G) JMI 수집 균주; 표 5 참조(MHII + 3% 레이크화된 말 혈액)
12. 바실루스 세레우스 ATCC 10987 (MHII)
13. 바실루스 세레우스 ATCC 14579 (MHII)
14. 바실루스 서브틸리스 ATCC 6638 (MHII)
15. 바실루스 서브틸리스 (168) ATCC 6051 (MHII)
접종물 제조(S. 아우레우스 + 50% 혈청 이외의 모든 균주에 대해):
1. BBL Prompt 키트를 사용하여, 상기한 바와 같은 적합한 한천 배지에서 성장된 배양물로부터 5개의 큰 또는 10개의 작은, 웰-분리된 콜로니를 선발하고, 키트에 제공되어 있는 멸균 염수 1mL를 접종하였다.
2. 웰을 약 30초 동안 볼텍싱하여 약 108개 세포/mL의 현탁액을 제공하였다. 이러한 현탁액의 희석액을 플레이팅하여 실제 밀도를 확인할 수 있다.
3. 시험되는 화합물의 각각의 플레이트에 대해 0.15mL의 세포를 15mL(약 106개 세포/mL) 멸균 브로쓰(아래 참조)로 옮겨 현탁액을 1/100으로 희석시킨 다음 혼합되도록 와류(swirl)시켰다. 화합물(> 8개 화합물)의 1개 이상의 플레이트를 시험하는 경우, 용적을 이에 따라 증가시켰다.
a. E. 파에칼리스, E. 파에시움 및 S. 뉴모니아에의 경우: 14.1mL MHII + 0.9mL 레이크화된 말 혈액을 사용하였다.
4. 50㎕의 세포(약 5 x 104개 세포)를 사용하여, 브로쓰에 희석된 50㎕의 약물을 함유하는 각각의 미세적정 웰에 접종하였다(아래 참조).
약물 희석, 접종, MIC 측정:
1. 모든 약물/화합물 스톡은 통상적으로 100% DMSO에서 12.8mg/mL 농도로 제조하였다.
2. DMSO 50㎕에서 약물/화합물 스톡을 200x 목적하는 최종 농도로 되도록 희석시켰다. MIC의 출발 농도가 8㎍/mL 최종 농도인 경우, 스톡 6.25㎕ + DMSO 43.75㎕가 필요하다. 각각 200x 스톡을 새로운 96 웰 미세역가 플레이트의 열(column) 1의 별도의 행(row)에 배치하였다.
3. DMSO 25㎕를 200x 화합물 스톡을 함유하는 미세역가 플레이트의 모든 행의 열 2-12에 가하고, 25㎕를 열 1에서 열 11까지 연속 희석시키고, 각각의 열 뒤에 팁을 변경하였다. 즉, 25㎕ 화합물 + 25㎕ DMSO = 2x 희석. 대조를 위해 시리즈의 말기에 "화합물 없음" DMSO 웰을 남겨 놓았다.
4. 각각의 시험되는 균주(S. 아우레우스 + 50% 사람 혈청 제외)에 대해, Matrix 피펫터를 사용하여 50㎕의 MHII 브로쓰를 갖는 2개의 미세역가 플레이트를 제조하였다.
5. 세포 50㎕를 첨가하기 전에 0.5㎕의 각각의 희석물(w/Matrix 자동-피펫터)을 50㎕의 배지/미세역가 웰로 옮겼다. 화합물의 통상의 출발 농도는 배지 + 세포로 1/200 희석 후 8㎍/mL이었다 - 화합물 농도는 미세역가 플레이트의 행을 가로질러 2x 단계로 감소하였다. 모든 MIC는 이중으로 수행하였다.
6. 모든 웰을 50㎕의 희석된 세포 현탁액(상기 참조)으로 100㎕의 최종 용적으로 되도록 접종하였다.
7. 접종물을 가한 후, 각각의 웰을 수동 다중채널 피펫터로 철저하게 혼합하였다; 동일한 미세역가 플레이트에서 약물의 저농도에서 고농도에 이르기까지 동일한 팁을 사용하였다.
8. 플레이트를 37℃에서 적어도 18시간 동안 항온배양하였다.
9. 플레이트를 18시간 후 시험 판독 거울로 보고, MIC를 성장이 관찰되지 않는 약물의 최종 농도로서 기록하였다(웰에서의 광학 투명도).
S. 아우레우스 + 50% 사람 혈청, S. 아우레우스 + 50% 랫트 혈청 또는 S. 아우레우스 + 50% 마우스 혈청의 제조.
1. 15mL의 MHII + 15mL 사람 혈청 - 총 30mL를 배합함으로써 50% 혈청 배지를 제조하였다. 1개 이상의 화합물 플레이트를 시험하는 경우 30mL 증분으로 용적을 증가시켰다.
2. 상기한 바와 같은 S. 아우레우스 ATCC #29213의 동일한 BBL Prompt 접종물을 사용하고, 상기 제조된 50% 사람 혈청 배지 30mL에 세포 0.15mL를 옮겨 1/200로 희석시키고(약 5x105개 세포/mL), 혼합되도록 와류시켰다.
3. 목적하는 갯수의 미세역가 플레이트의 모든 시험 웰을 50% 혈청 배지 중의 세포 100㎕로 채웠다.
4. 각각의 화합물 희석액(w/Matrix 자동-피펫터) 0.5㎕를 세포/배지 100㎕로 옮겼다. 화합물의 통상의 출발 농도는 배지 + 세포로 1/200 희석 후 8㎍/mL이었다 - 화합물 농도는 미세역가 플레이트의 행을 가로질러 2x 단계로 감소하였다. 모든 MIC는 이중으로 수행하였다.
5. 각각의 웰을 수동 다중채널 피펫터로 철저하게 혼합하였다; 동일한 미세역가 플레이트에서 약물의 저농도에서 고농도에 이르기까지 동일한 팁을 사용하였다.
6. 플레이트를 37℃에서 적어도 18시간 동안 항온배양하였다. 항온배양한 후, 0.01% 레자주린 25㎕를 각각의 웰에 가하고, 37℃에서 추가로 적어도 1시간 동안 또는 레자주린 색이 변할 때까지 계속해서 항온배양하였다.
7. 플레이트를 시험 판독 거울로 보고, MIC를 기록하였다. 레자주린을 사용하는 경우, 성장이 없는 웰에서는 염료의 색이 짙은 청색에서 밝은 분홍색으로 변하였다. 염료가 분홍색으로 되돌아가는 약물의 최저 농도가 MIC이었다.
프로토콜 2: 미량희석 브로쓰 방법을 사용한 그램 음성에 대한 화합물의 자이라제 MIC 측정
재료:
환저 96-웰 미세역가 플레이트 (Costar 3788)
Mueller Hinton II 한천 플레이트 (MHII; BBL 프리믹스)
Mueller Hinton II 액체 브로쓰 (MHII; BBL 프리믹스)
BBL Prompt 접종 시스템 (Fisher b26306)
시험 판독 거울 (Fisher)
신선하게 제조된 단일 콜로니에 스트리크된 세균을 갖는 한천 플레이트
멸균 DMSO
균주 (모두에 대해 MHII 배지; 브로쓰 및 한천):
1. 에세리키아 콜리 ATCC # 25922
2. 에세리키아 콜리, JMI 수집 균주, 표 5 참조
3. 에세리키아 콜리 AG100 WT
4. 에세리키아 콜리 AG100 tolC
5. 아시네토박터 바우만니 ATCC # BAA-1710
6. 아시네토박터 바우만니 ATCC # 19606
7. 아시네토박터 바우만니, JMI 수집 균주, 표 5 참조
8. 클렙시엘라 뉴모니아에 ATCC # BAA-1705
9. 클렙시엘라 뉴모니아에 ATCC # 700603
10. 클렙시엘라 뉴모니아에, JMI 수집 균주, 표 5 참조
11. 모락셀라 카타랄리스 ATCC# 25238
12. 모락셀라 카타랄리스 ATCC# 49143
13. 모락셀라 카타랄리스, JMI 수집 균주, 표 5 참조
14. 헤모필루스 인플루엔자에 ATCC 49247
15. 헤모필루스 인플루엔자에 (Rd1 KW20) ATCC 51907
16. 헤모필루스 인플루엔자에 Rd0894 (AcrA-)
17. 헤모필루스 인플루엔자에, JMI 수집 균주, 표 5 참조
18. 수도모나스 아에루기노사 PAO1
19. 수도모나스 아에루기노사, JMI 수집 균주, 표 5 참조
20. 프로테우스 미라빌리스, JMI 수집 균주, 표 5 참조
21. 엔테로박터 클로아케, JMI 수집 균주, 표 5 참조
22. 스테노트로포모나스 말토필리아 ATCC BAA-84
23. 스테노트로포모나스 말토필리아 ATCC13637
접종물 제조:
1. BBL Prompt 키트를 사용하여, 한천 배지에서 성장된 배양물로부터 5개의 큰 또는 10개의 작은, 웰-분리된 콜로니를 선발하고, 키트에 들어있는 멸균 염수 1mL를 접종하였다.
2. 웰을 약 30초 동안 볼텍싱하여 약 108개 세포/mL의 현탁액을 제공하였다. 이러한 현탁액의 희석액을 플레이팅하여 실제 밀도를 확인할 수 있다.
3. 시험되는 화합물의 각각의 플레이트에 대해 0.15mL의 세포를 15mL(약 106개 세포/mL) 멸균 브로쓰(아래 참조)로 옮겨 현탁액을 1/100으로 희석시킨 다음 혼합되도록 와류시켰다. 화합물 12 또는 13을 포함한, 화합물(> 8개 화합물)의 1개 이상의 플레이트를 시험하고자 하는 경우, 용적을 이에 따라 증가시켰다.
4. 50㎕의 세포(약 5 x 104개 세포)를 사용하여, 브로쓰에 희석된 50㎕의 약물을 함유하는 각각의 미세적정 웰에 접종하였다(아래 참조).
약물 희석, 접종, MIC 측정:
1. 모든 약물/화합물 스톡은 통상적으로 100% DMSO에서 12.8mg/mL 농도로 제조하였다.
2. DMSO 50㎕에서 약물/화합물 스톡을 200x 목적하는 최종 농도로 되도록 희석시켰다. MIC의 출발 농도가 8㎍/mL 최종 농도인 경우, 스톡 6.25㎕ + DMSO 43.75㎕가 필요하다. 각각 200x 스톡을 새로운 96 웰 미세역가 플레이트의 열 1의 별도의 행에 배치하였다.
3. DMSO 25㎕를 200x 화합물 스톡을 함유하는 미세역가 플레이트의 모든 행의 열 2-12에 가하고, 25㎕를 열 1에서 열 11까지 연속 희석시키고, 각각의 열 뒤에 팁을 변경하였다. 즉, 25㎕ 화합물 + 25㎕ DMSO = 2x 희석. 대조를 위해 시리즈의 말기에 "화합물 없음" DMSO 웰을 남겨 놓았다.
4. 각각의 시험되는 균주에 대해, Matrix 피펫터를 사용하여 50㎕의 MHII 브로쓰를 갖는 2개의 미세역가 플레이트를 제조하였다.
5. 세포 50㎕를 첨가하기 전에 0.5㎕의 각각의 희석물(w/Matrix 자동-피펫터)을 50㎕의 배지/미세역가 웰로 옮겼다. 화합물의 통상의 출발 농도는 배지 + 세포로 1/200 희석 후 8㎍/mL이었다 - 화합물 농도는 미세역가 플레이트의 행을 가로질러 2x 단계로 감소하였다. 모든 MIC는 이중으로 수행하였다.
6. 모든 웰을 50㎕의 희석된 세포 현탁액(상기 참조)으로 100㎕의 최종 용적으로 되도록 접종하였다.
7. 접종물을 가한 후, 각각의 웰을 수동 다중채널 피펫터로 철저하게 혼합하였다; 동일한 미세역가 플레이트에서 약물의 저농도에서 고농도에 이르기까지 동일한 팁을 사용하였다.
8. 플레이트를 37℃에서 적어도 18시간 동안 항온배양하였다.
9. 플레이트를 18시간 후 시험 판독 거울로 보고, MIC를 성장이 관찰되지 않는 약물의 최종 농도로서 기록하였다(웰에서의 광학 투명도).
프로토콜 #3: 한천 희석 방법을 사용한 화합물의 자이라제 MIC 측정
재료:
페트리 플레이트 60 x 15mm (Thermo Scientific Cat. # 12567100)
원심분리 튜브, 15mL (Costar)
BBL Prompt 접종 시스템 (Fisher b26306)
신선하게 제조된 단일 콜로니에 스트리크된 세균을 갖는 한천 플레이트
멸균 DMSO
GasPakTM 항온배양 용기 (BD Cat. #260672)
GasPak TM EZ 혐기성 생물 용기 시스템 샤쉐 (BD Cat. #260678)
GasPak TM EZ C02 용기 시스템 샤쉐 (BD Cat. #260679)
GasPak TM EZ Campy 용기 시스템 샤쉐 (BD Cat. #260680)
균주:
1. 클로스트리디움 디피실레 ATCC BAA-1382;
2. 클로스트리디움 디피실레, CMI 수집 균주, 표 4 참조
3. 클로스트리디움 페르프링겐스, CMI 수집 균주, 표 4 참조
4. 박테로이드 프라길리스 및 박테로이드 종, CMI 수집 균주, 표 4 참조
5. 푸소박테리움 종, CMI 수집 균주, 표 4 참조
6. 펩토스트렙토코쿠스 종, CMI 수집 균주, 표 4 참조
7. 프레보텔라 종, CMI 수집 균주, 표 4 참조
8. N. 고노로에아에 ATCC 35541
9. N. 고노로에아에 ATCC 49226
10. 나이세리아 고노로에아에, JMI 수집 균주, 표 4 참조
11. 네이세리아 메닝기티디스, JMI 수집 균주, 표 4 참조
배지 제조 및 성장 조건:
각각의 미생물 종에 대해 권장되는 성장 배지는, 문헌[참조: "M07-A8 Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically; Approved Standard--Eighth Edition (2009)"]에 따라 배지를 제조하는 N. 고노로에아에 및 N. 메닝기티디스를 제외하고는, CLSI 공보[참조: 'M11-A7 Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria; Approved Standard - Seventh Edition (2007)']에 따라 제조하였다.
플레이트 혼주:
1. 표 1에 기재된 바와 같이 각각의 시험 화합물의 100x 약물 스톡을 제조하였다. 15mL 원심분리 튜브를 사용하고, 각각의 약물 스톡 100uL를 10mL의 용융된 한천(수욕에서 약 55℃로 냉각시킴)에 가하였다. 튜브를 2-3x 역전시켜 혼합한 다음 개별적으로 표지된 60X15mm 페트리 디쉬에 부었다.
2. 일반적인 시험 농도는 다음과 같다: 0.002ug/mL - 16ug/mL(14개 플레이트).
3. 4개의 약물 비함유 플레이트를 부었다: 양성 대조군으로서 2개, 호기성 대조군으로서 2개.
4. 플레이트를 건조시켰다. 당일에 사용하거나, 실온에서 밤새 저장하거나, 4℃에서 3일까지 저장하였다.
5. 플레이트를 약물 농도 및 균주 배치에 대해 이에 따라 표지하였다.
혐기성 환경의 유지를 필요로 하는 세포의 성장:
1. 혐기성 세균으로 수행하는 모든 작업은 가능한 한 신속하게 수행하였다; 생물안전 캐비넷(즉, 호기성 환경)에서 수행하는 작업은 혐기성 챔버로 되돌아오기 전에 30분 미만내에 완료하였다.
2. 혐기성 세균의 항온배양은 GasPakTM 챔버를 사용하여 달성하였다. 대형 박스 스타일 챔버(VWR 90003-636)는 2개의 혐기성 샤쉐(VWR 90003-642)를 필요로 하는 반면, 높은 실린더 스타일 챔버(VWR 90003-602)는 단지 1개의 샤쉐를 필요로 하였다.
플레이트 접종(생물안전 캐비넷에서 수행함):
1. 상기한 바와 같이 개별 한천 플레이트에 각각의 균주를 스트리크시켰다. 필요한 시간 및 환경 조건(즉, 혐기성, 미호기성 등)에서 항온배양하였다.
2. 직접 콜로니 현탁법(direct colony suspension method)을 사용하여, 새로 스트리크된 세포의 루프를 약 4mL 0.9% NaCl2에 현탁시키고 볼텍싱시켰다.
3. 현탁액을 O.D.600 0.05(5x10e7 cfu/mL)로 조절하였다. 혼합되도록 볼텍싱하였다.
4. 약 0.2mL의 조절되고 혼합된 배양액을 96 웰 플레이트로 옮겼다. ≤ 5개 균주를 시험하는 경우, 모든 균주를 단일 행에 함께 정렬시켰다. > 5개 균주를 시험하는 경우, 5개 이상의 균주가 단일 행에 있지 않도록 균주를 플레이트로 옮겼다. 이것은 작은 플레이트에 피팅시키는데 필요하였다.
5. 다중-채널 피펫터를 사용하고, 제조된 96개 웰 플레이트로부터의 각각의 균주 0.002mL를 각각의 MIC 시험 플레이트에 스폿팅하였다. 이것은 약 1x10e5 cfu/스폿을 야기하였다. C. 디피실레을 시험할 때, 균주는 성장하는 경우 무리를 이루지만, 다중-채널 피펫터 스폿 간의 거리는, 무리를 이루는 세포가 검정 결과를 손상시키지 않도록 하기에 충분할 정도로 멀었다.
a. 2개의 약물 비함유 플레이트를 먼저 접종하는 반면, 다른 2개의 약물 비함유 플레이트는 MIC 시험 플레이트 후에 마지막에 접종하였다. 전자 및 후자는 성장 및 접종 대조군으로서 작용하였다. 필요한 대기 조건하에서 약물-비함유 대조군의 각각의 세트로부터의 하나의 플레이트를 항온배양하고, MIC 플레이트와 하나의 플레이트는 호기성 세균으로의 오염에 대해 시험하기 위해 호기성으로 설정하였다. 호기성 배양물은 엄격한 혐기성 또는 미호기성 균주와 작용시키는 경우 성장에 대해 부정적이었다. N. 고노로에아에에서는 약간의 성장이 눈에 보였다.
6. 접종물을 건조(필요한 만큼 짧은 시간 동안)시킨 다음 적당한 수의 샤쉐 및 항온배양물을 갖는 GasPak에 거꾸로 뒤집어 배치하였다.
7. 나이세리아 종을 37℃에서 5% CO2 환경에서 24시간 동안 항온배양하였다
MIC 측정:
정확한 항온배양 시간 후 시험 플레이트를 실험하고, 양성 대조군 플레이트에서의 성장에 비해 시험 플레이트에서의 성장의 출현에 있어서 현저한 감소가 발생하는 농도에서 MIC 종점을 판독하였다.
Figure pct00070
프로토콜 #4. 마이코박테리움 종에 대한 MIC 측정 과정
재료
환저 96-웰 미세역가 플레이트 (Costar 3788) 또는 유사품
필름 플레이트 씰 (PerkinElmer, TopSeal-A #6005250 또는 유사품)
0.2% 글리세롤을 갖는 Middlebrook 7H10 브로쓰
0.2% 글리세롤을 갖는 Middlebrook 7H10 한천
Middlebrook OADC 농축물(Enrichment)
M. 투베르쿨로시스에 대한 접종물 제조:
1. -70℃에서 저장된 동결 제조된 M. 투베르쿨로시스 스톡을 사용하였다. M. 투베르쿨로시스를 7H10 브로쓰 + 10% OADC에서 성장시킨 다음 100 Klett 또는 5 x 107cfu/ml의 농도에서 동결시켰다.
2. 1ml의 동결 스톡을 제거하여 1:20 희석액을 제조하고, 이를 19ml의 7H10 브로쓰 + 10% OADC에 가하였다(최종 농도 2.5 x 106cfu/ml).
3. 이러한 희석액으로부터 2차 1:20 희석물을 제조하고, 1ml를 덜어내어, 이를 19ml의 신선한 브로쓰에 가하였다. 이것이 96-웰 플레이트에 첨가되는 최종 접종물이었다.
M. 칸사시 , M. 아비움 , M. 아브세수스 및 노카르디아 ( Nocardia ) 종에 대한 접종물 제조:
1. 10 Klett 또는 5 x 107/ml의 농도로 7H10 브로쓰에서 성장시킨 신선한 배양액 또는 배양액의 동결 제조된 스톡을 사용하였다.
2. 1.0ml의 배양물 스톡을 제거하여 1:20 희석액을 제조하고, 이를 19ml의 7H10 브로쓰에 가하였다(최종 농도 2.5 x 106cfu/ml).
3. 이러한 희석액으로부터 1:20 희석물을 제조하고, 1ml를 덜어내어, 이를 19ml의 신선한 브로쓰에 가하였다(최종 현탁액).
플레이트 제조:
1. 플레이트를 표지화하였다.
2. 50㎕의 7H10 브로쓰 + 10% OADC를 다중채널 전자 피펫터를 사용한 MIC 측정에 사용되는 모든 웰에 가하였다.
3. 시험하고자 하는 약물의 스톡 용액(예를 들면, 1mg/ml 농도)을 제조하였다.
4. 7H10 브로쓰 + 10% OADC를 사용하여 동결된 스톡 용액을 해동시키고 희석시켜 시험된 최대 농도의 4x 작업 용액을 수득하였다(예를 들면, 최종 농도 32㎍/ml, 시험된 최고 농도는 8㎍/ml이었다). 희석액은 스톡 용액으로부터 제조하였다. 1㎍/ml의 농도에서 시작하기 위해, 약물을 출발 농도가 1㎍/ml로 되도록 4㎍/ml에서 제조하였다. 25㎕의 1mg/ml 스톡을 덜어내어, 6.2ml의 브로쓰에 가하였다. 약물의 모든 희석은 브로쓰에서 수행하였다.
5. 50㎕의 4x 작업 용액을 지정된 행의 제1 웰에 가하였다. 모든 화합물을 계속해서 시험하였다. 다중채널 전자 피펫터를 사용하여, 11번째 웰을 거쳐 4X 및 연속 희석된 화합물을 혼합하였다. 남은 50㎕는 버렸다. 12번째 웰을 양성 대조군으로서 사용하였다.
6. 플레이트를 37℃에서 M. 투베르쿨로시스는 약 18일; M. 아비움 및 M. 칸사시는 약 7일; 노카르디아 및 M. 아브세수스는 약 4일 동안 항온배양하였다; 필름으로 밀봉하였다.
7. 육안으로 판독하고, 결과를 기록하였다. MIC는 성장이 관찰되지 않는 약물의 최저 농도로서 기록하였다(웰에서의 광학 투명도).
프로토콜 #5. 마이코박테리움 투베르쿨로시스 혈청 전위( Shift ) MIC 검정을 위한 프로토콜
재료 및 시약:
Costar #3904 블랙-측면, 평저 96-웰 미세역가 플레이트
0.2% 글리세롤을 갖는 Middlebrook 7H9 브로쓰 (BD271310)
Middlebrook OADC 농축물
태아 소 혈청
카탈라제(Sigma C1345)
덱스트로스
NaCl2
BBL Prompt 접종 시스템 (Fisher b26306)
단일 콜로니에 스트리크된 세균을 갖는 한천 플레이트(0.2% 글리세롤 및 OADC 농축물을 갖는 Middlebrook 7H11)
멸균 DMSO
배지 제조:
1. 혈청 전위된 MIC를 위해서는, 모두 7H9 + 0.2% 글리세롤의 베이스를 갖는 3개의 상이한 배지가 필요하였다. MIC 이전에 모든 배지 및 보충물을 멸균시키는 것이 중요하였다.
2. 모든 배지를 아래에 제조하고, 다음 부분에 기재된 바와 같이 접종하였다. 각각의 배지를 사용하여 Mtb에 대해 모든 화합물들을 시험하였다.
a. 7H9 + 0.2% 글리세롤 + 10% OADC ("표준" MIC 배지).
b. 7H9 + 0.2% 글리세롤 + 2g/L 덱스트로스 + 0.85g/L NaCl + 0.003g/L 카탈라제 (0% FBS).
c. 등용적의 태아 소 혈청(50% FBS)과 배합된, 2x 7H9 + 0.2% 글리세롤 + 2g/L 덱스트로스 + 0.85g/L NaCl + 0.003g/L 카탈라제.
접종물 제조:
1. BBL Prompt를 사용하여, 5-10개의 웰-분리된 콜로니를 선발하고, 키트에 들어있는 1ml 멸균 염수를 접종하였다. 배양물에서의 이러한 유기체의 느린 성장으로 인해, 전형적으로 플레이트는 2 내지 3주령이었다.
2. 웰을 볼텍싱한 다음 수욕에서 30초 동안 초음파처리하여, 약 108개 세포/ml의 현탁액을 제공하였다. 이러한 현탁액의 희석액을 플레이팅하여 실제 밀도를 확인할 수 있다.
3. BBL Prompt 현탁액을 1/200로 희석시킴으로써(예를 들면: 0.2ml의 세포를 40ml의 배지에 옮김) 각각 3개의 배지 제형으로 접종물을 제조하여 약 106개 세포/ml의 출발 세포 밀도를 수득하였다.
4. 100㎕ 세포(약 5 x 104개 세포)를 사용하여, DMSO 중의 1㎕의 약물을 함유하는 각각의 미세역가 웰에 접종하였다(아래 참조).
약물 희석, 접종, MIC 측정:
1. 대조 약물 스톡 이소니아지드 및 노보바이오신은 100% DMSO에서 10mM로 제조하는 반면 시프로플록사신 및 리팜핀은 각각 50% DMSO 및 100% DMSO에서 1mM로 제조하였다. 희석액을 제조하였다-스톡 용액 100㎕를 96-웰 플레이트의 제1 열에 분배하였다. 열 1로부터 50㎕를 열 2에서 DMSO 50㎕로 옮겨 각각의 화합물에 대해 행을 가로질러 11-단계, 2배 연속 희석물을 제조하였다. 혼합하고 각 열에서 팁을 변화시키면서 열 2에서 열 11을 거쳐 50㎕를 계속해서 옮겼다. 대조군으로서 단지 DMSO를 갖는 열 12를 남겨뒀다.
2. 세포 100㎕를 가하기 전에 텅빈 미세역가 웰에 각각의 희석액 1㎕를 옮겼다. 이소니아지드 및 노보바이오신의 출발 농도는 배지 + 세포로 희석시킨 후 100μM이었다; 시프로플록사신 및 리팜핀의 출발 농도는 배지 + 세포로 희석시킨 후 10μM이었다. 화합물 농도는 미세역가 플레이트의 행을 가로질러 이동하면서 2x 단계로 감소하였다. 모든 MIC는 각각 3개의 배지 조건에서 이중으로 수행하였다.
3. 화합물의 시험 세트는 전형적으로 10mM 및 50㎕ 용적이었다.
4. 다중채널 피펫터를 사용하고, 각 열의 마스터 플레이트로부터 용적 전부를 제거하고, 새로운 96-웰 미세역가 플레이트의 제1 열로 옮겼다. 새로운 96-웰 플레이트의 열 1로 옮기면서, 마스터 플레이트에서 각 열의 화합물에 대해 반복하였다.
5. 대조군 화합물에 대해 위에 기재된 바와 같이, DMSO를 희석제로서 사용하여 각각의 화합물의 2배, 11점 희석액을 생성하였다. 모든 경우에, 대조군을 위해 단지 DMSO로서 열 12를 남겨두었다. 일단 모든 희석이 완료되면, 대조군 화합물에 대해 수행한 바와 같이 세포 100㎕를 가하기 전에 다시 각각의 희석액 1㎕를 텅빈 미세역가 웰로 옮겼다.
6. 모든 웰에 100㎕의 희석된 세포 현탁액을 접종하였다(상기 참조).
7. 접종물을 가한 후, 플레이트의 측면을 부드럽게 두드려서 플레이트를 혼합하였다.
8. 플레이트를 가습된 37℃ 챔버에서 9일 동안 항온배양하였다.
9. 9일째에 25㎕ 0.01% 멸균 레자주린을 각 웰에 가하였다. 여기 492nm, 방출 595nm에서 백그라운드 형광을 측정하고, 플레이트를 또다른 24시간 동안 항온배양기로 보냈다.
24시간 후, 각 웰의 형광을 여기 492nm, 방출 595nm에서 측정하였다.
소정의 화합물에 의한 억제율(%)은 다음과 같이 계산하였다: 억제율(%) = 100-([웰 형광-평균 백그라운드 형광]/[DMSO 대조군-평균 백그라운드 형광]x100). MIC는 소정의 배지 조건에서 레자주린 감소('%-억제') 신호를 ≥70% 억제하는 최저 화합물 농도로서 모든 3개의 배지 조건에 대해 채점하였다.
표 2는 본 발명의 선택된 화합물에 대한 MIC 검정의 결과를 나타낸다.
표 2 및 후속되는 표 및 실시예에서, "화합물 12"는 1-에틸-3-[5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5-일]-7-[(2R)-테트라하이드로푸란-2-일]-1H-벤즈이미다졸-2-일]우레아에 상응하며, "화합물 13"은 화합물 12의 메실레이트 염에 관한 것이다. 유사하게, "화합물 23"은 1-에틸-3-[6-플루오로-5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5-일]-7-[(2R)-테트라하이드로푸란-2-일]-1H-벤즈이미다졸-2-일]우레아에 상응하고, "화합물 23A"는 화합물 23의 메실레이트 염에 상응한다. 상기 실시예에서 사용된 것으로서 상기 화합물 및 염을 확인하기 위해 사용된 동일한 구성원들이 존재한다.
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
Figure pct00074
표 3은 본 발명의 선택된 화합물의 MIC90 검정의 결과를 나타낸다.
Figure pct00075
Figure pct00076
표 3A는 본 발명의 선택된 화합물에 대한 MIC 검정의 결과를 나타낸다. 표 3A에서, "화합물 23A"는 1-에틸-3-[6-플루오로-5-[2-(1-하이드록시-1-메틸-에틸)피리미딘-5-일]-7-[(2R)-테트라하이드로푸란-2-일]-1H-벤즈이미다졸-2-일]우레아(23A)의 메탄설폰산 염에 상응한다. 유사하게, "화합물 W"는 (R)-2-(5-(2-(3-에틸우레이도)-6-플루오로-7-(테트라하이드로푸란-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-5-일)피리미딘-2-일)프로판-2-일 포스페이트(W)에 상응한다. 이들은 상기 합성 실시예에서 상기 화합물을 확인하는데 사용된 동일한 구성원들이다.
[표 3A]
Figure pct00077
하기 표 4에서, 용어 "CMI"는 오레곤주 윌슨빌에 위치하는 임상 미생물 기관((The Clinical Microbiology Institute)을 나타낸다.
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
하기 표 5에서, 용어 "JMI"는 아이오와주 노쓰 리버티에 소재하는 존스 미생물 기관(The Jones Microbiology Institute)을 나타낸다.
Figure pct00083
Figure pct00084
Figure pct00085
Figure pct00086
Figure pct00087
Figure pct00088
Figure pct00089
Figure pct00090
Figure pct00091
Figure pct00092
Figure pct00093
Figure pct00094
Figure pct00095
Figure pct00096
Figure pct00097
Figure pct00098
Figure pct00099
Figure pct00100
Figure pct00101
Figure pct00102
Figure pct00103
Figure pct00104
Figure pct00105
Figure pct00106
실시예 32
마우스 에스 . 아우레우스 신장 감염 모델
동물: 암컷 CD-1 마우스(8 내지 10주령; 6마리/그룹)을 챨스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories)로부터 입수하여 우리에 넣고 실험 동물의 보호 및 이용에 대한 안내서(Guide to the Care and Use of Experimental Animals)에 따라 유지시켰다.
세균 균주 및 스톡
메티실린-내성 에스. 아우레우스(MSSA) 균주 ATCC 29213를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 입수하였다. 동물 연구용 스톡을 제조하기 위해, 에스. 아우레우스를 뮐러 힌톤 아가 플레이트(Mueller Hinton Agar plate) 위에 플레이팅하고 37℃에서 밤새 항온배양하였다. 플레이트로부터 3 및 4개의 콜로니를 사용하여 300RPM에서 진탕하면서 37℃에서 8시간 동안 항온배양한 5 mL의 밀러 힌톤 브로쓰(MHB)에 접종하였다. 5 mL의 8-시간 배양물을 100 mL로 20배 희석시키고 밤새 항온배양하였다(12 내지 14 시간). 세균을 20분 동안 3000 x에서 펠렛화(pelleting)하고 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 포스페이트-완충된 염수(PBS)로 2회 세척하였다. PBS/20% 글리세롤 속에 ~1 x1010cfu를 함유하는 분취량(1mL)를 동결시키고 사용 당일까지 -80℃에서 저장하였다. 스톡 역가(stock titer)를 일련 희석으로 확인하고 밀러 힌톤 아가 플레이트 위에 플레이팅하였다.
마우스 에스 . 아우레우스 신장 감염 모델
접종 전에, 세균 스톡을 해동시키고 PBS/BSA로 1회 세척하였다. 이후에, 스톡을 PBS/BSA를 사용하여 1x 109cfu/mL의 최종 농도로 희석시켜 100μL의 용적 중 마우스당 대략 1-2 x 108cfu의 접종물을 수득하였다. 접종물은 106 내지 109개 에스 아우레우스 유기체/마우스의 챌린지 용량을 이용한 예비 실험에서 치사율없이 감염 후 26시간째에 ~106cfu/신장 부하(kidneys burden)를 확립하는데 최적인 것으로 밝혀졌다(데이터는 나타내지 않음). 당해 예비 연구에서 107cfu/마우스 미만에서 에스. 아우레우스를 사용한 챌린지는 모순되거나 만성이 아닌 감염을 유도하였지만, 109cfu/마우스의 용량은 마우스의 고 퍼센트에서 신속한 질병 및 치사율을 초래하였다. 주사는 멸균 30 게이지 침(gauge needle)을 사용하여 꼬리 정맥을 통해 정맥내 제공하였다. 마우스 감염의 완료시, 마우스를 챌린지하는데 사용된 세균 스톡을 플레이팅하고 계수하여 접종물의 농도를 확인하였다.
감염 후 제시된 시간(가장 일반적으로 2 내지 26시간)에서 세균 부하를 평가하기 위하여, 마우스를 안락사시키고 신장을 무균적으로 수거하고, 멸균 PBS/BSA (5 mL/신장의 쌍)내로 위치시켰다. 신장을 멸균 조건하에서, 손으로 유지하는 균질화기(Powergen 125; 제조원: Fisher Scientific)를 사용하여 균질화하였다. 수집 및 균질화 동안 시료 모두를 빙상에 유지시키고 균질화기를 완전히 세척하여 각각의 시료 사이에 멸균시켰다. 균질화물을 멸균 PBS/BSA 속에 일련 희석시키고 MH 아가 위에 플레이팅하여 신장의 쌍 당 세균 수를 측정하였다.
Figure pct00107
CD-1 마우스(6마리/그룹)을 2x108cfu/마우스에서 에스. 아우레우스(ATCC 29213)를 사용하여 정맥내 챌린지하였다. 2시간 후 챌린지 마우스를 경구 가비지(oral gavage)를 통해 비히클(10% VitE TPGS)을 10 ml/kg에서 또는 화합물 23A을 10, 30, 100 mg/kg에서 처리하였다. 30-분 및 6시간 치료 그룹은 1회 처리한 반면, 24-시간 그룹에게는 제1 용량 후 10시간째에 제2 처리를 제공하였다. 치료 후 시간을 증가(30분, 6시간 또는 24시간)시킨 후, 마우스를 안락사시키고 신장을 수거하여, 균질화하고 플레이팅하여 에스. 아우레우스 부하를 정량하였다. 각각의 마우스에 대한 신장의 쌍으로부터의 부하 및 마우스의 각각의 그룹에 대한 중간값을 계산하였다.
결과: 경구 투여된 화합물 23A는 실험적으로 유도된 신장 MSSA(SA 29213) 감염에 대해 생체내 효능을 나타내었다. 초기 감염 후 30분 째에 화합물- 및 비히클-처리된 마우스 사이에 신장 부하에 있어 차이가 없었다. 30분 비히클-처리된 그룹은 나중 시점에서 화합물 효과의 비교를 위한 조기 대조군으로서 제공되었다. 제1 용량 후 6시간째에, 모든 화합물 처리는 신장에서 시간-매칭된 비히클 대조군에 대해 세균 부하를 0.4 내지 0.6 log까지 감소시켰다. 또한, 30 및 100 mg/kg에서 투여된 화합물 23A는 30분 조기 대조군에 대해 0.3 내지 0.4 log 감소를 제공하였다.
24시간(10시간째에 투여된 처리의 제2 용량 포함)의 처리 기간 후, 시간-매칭된 비히클 대조군과 비교하여 세균 밀도에 있어서 감소가 모든 치료 그룹에서 관찰되었다. 30 및 100 mg/kg BID에서 투여된 화합물 23A은 2.8 내지 2.9 log 감소를 제공한 반면, 10 mg/kg의 화합물 23A BID는 보다 가변적이었으며 24시간 비히클-처리된 대조군에 대해 1.8 log 감소를 제공하였다. 또한, 30 및 100 mg/kg에서 투여된 화합물 23A은 30-분 비히클-처리된 대조군에 대해 대략 1.5 log 감소를 나타내었으며, 이는 살세균 활성의 지표이다.
요약 및 상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 30 및 100 mg/kg 화합물 23A의 BID 투여는 6시간 및 24시간 평가 시간 둘다에서 30분 대조군 그룹과 비교하여 메티실린-민감성 에스. 아우레우스(MSSA) 균주 ATCC 29213의 세균 성장을 감소시킨 반면 10 mg/kg의 화합물 23A를 사용한 처리는 6시간째에 세균 성장을 제한하였으나 24시간째에 다른 치료 그룹에 비해 덜 효과적이었다.
Figure pct00108
CD-1 마우스(6/그룹)을 에스. 아우레우스(ATCC 29213)을 2x108 cfu/마우스에서 사용하여 정맥내 챌린지하였다. 2시간 후, 마우스의 단일 그룹(조기 대조군(EC))을 안락사시키고 신장을 수거하여, 균질화하고 플레이팅하여 에스. 아우레우스 부하를 정량하였다. 감염된 마우스의 추가의 그룹을 경구 가비지를 통해 비히클로 10 ml/kg(10% VitE TPGS; 말기 대조군, LC)에서, 화합물 23A를 10, 30, 60, 100 mg/kg에서 처리하였다. 24시간 후, 처리된 마우스의 그룹을 안락사하고 신장을 수거하여, 균질화하고 플레이팅하여 에스. 아우레우스 부하를 정량하였다. 각각의 마우스에 대한 신장의 쌍으로부터의 부하 및 마우스의 각각의 그룹에 대한 중간값을 요약하였다.
결과: 요약 및 상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 화합물 23A의 단일의 경구 용량은 실험적으로 유도된 신장 MSSA(SA 29213) 감염에 대해 생체내 효능을 나타내었다. 24시간 후, 모든 처리는 시간-매칭된 비히클 대조군과 비교하여 세균 밀도에 있어서 감소를 나타내었다. 화합물 23A는 10, 30, 60 또는 100 mg/kg에서 투여되는 경우 비히클 대조군에 대해 1.9, 2.3, 3.1 및 3.3 log 감소의 용량-의존성 감소를 입증하였다. 또한, 60 및 100 mg/kg의 화합물 23A의 용량은 조기 대조군에 대해 세균 부하를 1.2 내지 1.4 log까지 감소시켰으며, 이는, 화합물 23A가 살세균 활성을 가짐을 제안한다.
[표 7A]
Figure pct00109
CD-1 마우스(8마리/그룹)를 에스. 아우레우스(ATCC 29213)를 사용하여 2x108 cfu/마우스에서 정맥내 챌린지하였다. 2시간 후, 마우스의 단일 그룹(조기 대조군(EC))를 안락사하고 신장을 수거하며, 균질화하고 플레이팅하여 에스. 아우레우스 부하를 정량하였다. 감염된 마우스의 추가의 그룹을 경구 가비지를 통해 비히클로 10 ml/kg(물; 말기 대조군, LC)에서 처리하고, 화합물 W를 10, 30, 60, 100 mg/kg에서 완전한 전환시 활성 잔기 용량 등가물인, 10, 30, 60 또는 100 mg/kg의 화합물 23A를 전달할 것으로 예측되었던 16, 49, 99 또는 166 mg/kg의 공칭 용량 수준에서 투여하였다. 24시간 후, 처리된 마우스의 그룹을 안락사하고 신장을 수거하여, 균질화하고 플레이팅하여 에스. 아우레우스 부하를 정량하였다. 각각의 마우스에 대한 신장의 쌍으로부터의 부하 및 마우스의 각각의 그룹에 대한 중간값을 요약하였다.
결과: 요약 및 상기 표 8에 나타낸 바와 같이, 단일 경구 용량의 화합물 W는 실험적으로 유도된 신장 MSSA(SA 29213) 감염에 대해 생체내 효능을 나타내었다. 24시간 후, 모든 처리는 시간-매칭된 비히클 대조군과 비교하여 세균 밀도에 있어서의 감소를 나타내었다. 화합물 W는 10, 30, 60 또는 100 mg/kg의 화합물 24의 등가의 노출을 제공한 16, 49, 99 및 166 mg/kg에서 투여하는 경우 비히클 대조군에 대해 1.9, 2.3, 2.7, 2.6 및 3.0 log 감소의 용량-의존성 감소를 입증하였다. 또한, 16, 49, 99 및 166 mg/kg의 화합물 W의 용량은 조기 대조군에 대해 세균 부하를 0.7 내지 1.5 log까지 감소시켰으며, 이는, 화합물 23A가 살세균 활성을 가짐을 제안한다.
실시예 33
호중구감소성 래트 넙적다리 감염 모델
동물: 특이적인-병원체가 없는, 체중이 76 내지 100 그램인 수컷 스플라그 다울리 래트(Sprague Dawley rat)를 챨스 리버 래보러토리스, 인크.(메사츄세츠주 윌밍톤 소재)로부터 입수하여 당해 실험에서 사용하였다. 동물이 연구 시행 전 최소 7일 동안 적응하도록 하였다.
세균: 메티실린-민감성 스타필로코쿠스 아우레우스(MSSA) ATCC 균주 29213을 생체내 실험을 위해 사용하였다. 시험 분리체를 표준 미생물학적 아가 배지(5% 양 혈액이 들어있는 트립티카제 대두 아가) 위에 2회 아배양하였다. 제2의 이전을 넙적다리 감염 모델 접종물의 제조시 사용 전 24시간 미만내에 제조하였다.
호중구감소성 래트 넙적다리 감염 모델: 호중구감소증을 유도하기 위해, 래트를 면역저해제 사이클로포스파미드로 150 mg/kg에서 처리하고 1 ml로 복강내(IP) 주사에 의해 감염 전 3일째에 투여하였다. 래트를 근육내(IM) 0.2 ml 주사에 의해 뒤 넙적다리 둘다에 일반 염수 중 107 cfu/ml의 메티실린-민감성 스타필로코쿠스 아우레우스 29213 현탁액을 사용하여 감염시켰다. 시간(2 내지 26 시간)이 증가한 후, 각각의 동물의 2개의 뒤쪽 넙적다리를 수거하고, 멸균 염수로 세정하고, 칭량한 후, 50 ml의 멸균 일반 염수에 두고 젖은 빙상 위에 균질화될 때까지 두었다. 총 균질화된 시료 용적의 1/2을 거대 공극 여과기를 통과(연골 및 거대 군집화된 조직의 조각을 제거하기 위해)시키고, 염수로 희석시키고 아가 배지 플레이트(5% 양 혈액이 들어있는 트립티카제 대두 아가)에 배양하였다. 모든 배양 플레이트를 대략 37℃에서 18 내지 24시간 동안 항온배양하였다. 콜로니-형성 단위를 열거하고(cfu/ml의 균질화물) 각각의 처리 및 대조군 그룹에 대한 중간값을 계산하였다. 전형적으로 각각의 그룹은 n이 6마리이고; 각각의 넙적다리는 별개의 구성원으로 고려되었다. 그룹당 중간값 cfu/ml를 2시간째에(조기 대조군) 초기 세균 밀도와 또는 동시 수거된 시간-매칭된 비히클 대조군 그룹(말기 대조군; LC)의 초기 세균 밀도와 비교하였다.
Figure pct00110
호중구감소성 래트(3마리/그룹)을 에스. 아우레우스(ATCC 29213)를 사용한 근육내(IM) 챌린지에 의해 ~2x106 cfu/넙적다리에서 감염시켰다. 2시간 후, 래트의 단일 그룹(조기 대조군 (EC))을 안락사시키고 넙적다리를 수거하고, 균질화하며 플레이팅하여 에스. 아우레우스 부하를 정량하였다. 추가의 감염된 래트를 경구 가비지에 의해 비히클로 10 ml/kg(20% 카비트론/1% HPMCAS-MG; 말기 대조군, LC)에서 또는 화합물 23A로 10, 30, 60 mg/kg에서 처리하였다. 8-시간 치료 그룹에 단일 처리(QD)를 제공하고, 안락사시켜 넙적다리를 cfu 측정을 위해 치료(QD) 후 8시간째에 수집하는 한편, 24-시간 치료 그룹에는 12시간 떨어져서(q12h) 2개 용량을 제공하고 안락사하여 넙적다리를 처리 후 24시간째에 수집하였다. 각각의 개개 넙적다리로부터의 부하를 측정하고 3마리의 래트의 그룹으로부터 cfu/ml 및 중간값을 요약하였다.
결과: 상기 표 8에 나타낸 바와 같이, 경구 투여된 화합물 23A는 MSSA(SA 29213)에 대해 생체내 효능을 나타내었다. 제1 용량 후 8시간째에, 그룹의 모두는 시간-매칭된 대조군과 비교하여 부하에 있어서, 화합물 23A의 경우 10 mg/kg에서 ~1.3 log 감소 및 화합물 23A에 대해 30 및 60 mg/kg에서 ~2 log 감소되었다. 조기 대조군과 비교하여, 화합물 23A는 10 mg/kg에서 적어도 정체 시점까지 SA 29213의 세균 성장을 유지한 반면, 화합물 23A는 60 및 100 mg/kg에서 세균 부하를 ~0.5 내지 0.6 log까지 약간 감소시켰다.
24시간 및 12시간째에 투여된 처리의 제2 용량 후, ~2.4 내지 2.8 log의 말기 대조군과 비교하여 세균 밀도에 있어서의 감소가 모든 치료 그룹에 대해 관찰되었다. 조기 대조군과 비교하여 대략 0.8 log 감소가 화합물 23A에 대해 10 mg/kg에서 관찰된 반면, 화합물 23A는 30 및 60 mg/kg에서 ~1.1 내지 1.2 log 감소를 제공하였다.
Figure pct00111
호중구감소성 래트(3마리/그룹)을 에스. 아우레우스(ATCC 29213)를 ~2x106 cfu/넙적다리에서 사용하여 근육내(IM) 챌린지로 감염시켰다. 2시간 후 래트의 단일 그룹(조기 그룹 (EC))을 안락사시키고, 넙적다리를 수거하고, 균질화하며 플레이팅하여 에스. 아우레우스 부하를 정량하였다. 추가의 감염된 래트를 경구 가비지에 의해 비히클로 10 ml/kg (10% 비타민 E/TPGS; 말기 대조군, LC) 또는 화합물 13을 사용하여 30, 60, 100 mg/kg에서 처리하였다. 8-시간 치료 그룹에게 단일 처리(QD)를 제공하고 안락사하여 넙적다리를 처리(QD) 후 8시간째에 cfu 측정을 위해 수집하는 반면, 24 시간 치료 그룹에는 12 시간 떨어져서(q12h) 2개의 용량을 제공하고 안락사하여 넙적다리를 처리 후 24시간째에 수집하였다. 각각의 개개 넙적다리로부터의 부하를 측정하고, cfu/개개 넙적다리 및 3마리의 래트의 그룹으로부터 중간값을 각각의 그룹에 대해 요약하였다.
결과: 상기 표 9에 나타낸 바와 같이, 경구 투여된 화합물 13은 MSSA (SA 29213)에 대해 생체내 효능을 나타내었다. 항세균 활성의 정도에 있어서의 차이는 3개의 치료 그룹 사이에서 관찰되었다. 제1의 용량 후 8시간째에 그룹 모두는 시간-매칭된 대조군과 비교하여 부하에 있어서 감소되었고, 화합물 13의 경우 10 mg/kg에서 ~1.5 log 감소 및 화합물 13의 경우 60 및 100 mg/kg에서 ~1.7 및 1.8 log 감소를 가졌다. 제1 용량 후 8시간째에, 화합물 13은 10mg/kg에서 SA 29213의 세균 성장을 적어도 정지 시점까지 유지시킨 반면, 화합물 13은 60 및 100 mg/kg에서 조기 대조군에 대해 세균 부하를 각각 ~0.4 및 ~0.5 log까지 약간 감소시켰다. 24시간 및 12시간째에 투여된 처리의 제2 용량 후, 대략 1 log의 조기 대조군과 비교하여 세균 밀도에 있어서 감소는 화합물 13에 의해 60 및 100 mg/kg에서 나타났다. 대조적으로, 30 mg/kg에서 투여된 화합물 13은 조기 대조군보다 더 큰 평균 0.3 log의 가변적인 cfu 수준으로 효과적인 것으로 여겨지지 않았다. 그러나, 모든 용량 수준은 말기 대조군과 비교하여 세균 밀도가 감소하였다. ~1.1 log의 감소는 10 mg/kg의 치료 그룹의 경우 관찰된 반면, 2.85 및 ~3 log의 감소는 60 및 100 mg/kg의 용량 수준에서 관찰되었다.
요약하면, 60 및 100 mg/kg의 화합물 13의 q12h 용량은 8시간 및 24시간 평가 시간 둘다에서 초기 대조군 그룹과 비교하여 SA 29213의 세균 성장을 감소시킨 반면, 30 mg/kg을 사용한 처리는 8시간째에 세균 성장을 제한하였으나 24시간째에 다른 치료 그룹보다 덜 효과적이었다.
실시예 34
래트에서 7일째 경구( 가비지 ) 독성 및 독성역학 연구
당해 연구의 목적은 1) 가비지에 의해 7일의 연속일 동안 수컷 래트에게 경구 투여되는 경우 화합물 13 및 화합물 23A의 잠재적 독성을 평가하고 2) 제1 및 제7 용량 후 화합물 13, 및 화합물 23A의 독성역학을 평가하기 위한 것이다.
동물
종, 공급원, 병력, 및 이유
Crl:CD(SD) 래트를 뉴욕주 스톤 릿지의 챨스 리버 래보터토리즈로부터 입수하였다. 동물은 실험실에서 출생하였으며 실험적으로 처리되지 않았다[나이브(naive)]. 래트는 비임상 독성 평가를 위해 일반적으로 사용되는 종이므로 선택하였다.
수, 성별, 연령 및 체중 범위
40 마리의 래트(20마리의 캐뉼라 형성되지 않은 수컷 및 20마리의 경정맥 캐뉼라 형성된 수컷)을 주문하였다. 이들 동물로부터, 15마리의 캐뉼라 형성되지 않은 수컷과 15마리의 캐뉼라 형성된 수컷을 사용하였다. 동물은 가능한 연령을 균일하게 하였다. 래트는 투여 초기에 대략 9주령의, 사춘기 내지 젊은 성체였다. 이들의 공급업자가 계산한 생일은 연구 기록에서 보유하였다. 그룹에 대해 할당 시간에서 동물에 대한 체중 범위는 218.5 내지 306.3 g이었다.
연구 설계
래트를 하기 표 10에 나타낸 바와 같이 지정하였다. 동물에게 시험 제품 또는 비히클을 경구 가비지에 의해 7일의 연속일 동안 제공하고 투약의 완료일에 종결하였다. 투약 첫째날을 연구 1일로 지정하였다. 동물을 하기 기술된 바와 같은 임상 신호, 체중, 및 다른 파라미터에 있어서의 변화에 대해 평가하였다.
Figure pct00112
경로/용량
비히클 및 시험 제품을 경구 가비지에 의해 1일 1회 7일의 연속일 동안 그룹 A 및 그룹 B 내지 D 각각에 대해 10　mL/kg 체중의 용량 용적으로 투여하였다. 시험 제품 및 비히클을 경구 가비지에 의해 1일 2회, 대략 8시간 떨어져서, 7일의 연속일 동안 그룹 E 및 그룹 F 각각에 대해 10　mL/kg의 체중의 용량 용적에서 투여하였다. 각각의 동물에 대해 투여된 실제 용적을 계산하고, 각각의 동물의 가장 최근의 체중을 기준으로 조절하였다.
생애내 관찰 및 측정
관찰
동물을 생존능에 대해 아침에 적어도 1회 및 오후에 1회, 적어도 4시간 떨어져서, 연구 전체에서 관찰하였다. 처리 기간 동안, 매일 우리주변 관찰을 수행하고 전용량 및 후용량(단지 제1 용량 이후)을 기록하였다. 투약 후 관찰은 앞서의 연구로부터의 2개 화합물에 대한 Cmax/Tmax를 기준으로 다음 횟수에서 발생한 치료 동안 수행하였다:
그룹 A-F의 경우 투약 1시간 후
1회의 우리주변 관찰을 부검일에 수행하였다.
계획되지 않은 관찰
계획된 관찰 회수 외에 다른 횟수에서 관찰된 어떠한 발견도 계획되지 않은 관찰시 또는 프로반티스(Provantis)내에서 기록하였으나; 연구 전체에서 비정상은 관찰되지 않았다. 프로반티스는 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 전자 데이터 수집, 유지 및 보고 시스템이다.
체중
투여 시작 전에, 체중을 1일째에 무작위화를 위해 측정하였다. 치료 동안, 체중을 1일 및 7일째에 측정하였다. 또한, 절식된 체중을 기관/체중 비의 계산을 위해 부검 전 측정하였다.
사료 소모
연구 전체에 걸쳐, 사료 소모를 투약 시작 전 3일째에 시작하여 매일 측정하였다.
임상 병리학 평가
혈액학, 응고 및 혈청 화학 파라미터의 평가를 위한 혈액 시료를 레트로-오비탈 플렉서스(retro-orbital plexus)(주요 연구 동물의 경우 CO2/O2 마취하에)로부터의 모든 동물로부터 또는 부검전 경정맥 캐뉼라(독성역학적 동물의 경우)로부터 수집하였다. 독성역학적 동물에 대해 특허된 캐뉼라를 유지하기 위해 사용된 잔사 헤파린으로 인하여, 이들 래트로부터의 응고 시료는 분석할 수 없었다. 동물을 혈액 수집 전 밤새 절식시켰다. 임상 병리학 분석을 위한 혈액 수집 당일에, 동물을 혈액을 수집하여 시료가 임상 병리학 그룹에 의해 허용되는 것으로 판단된 후까지 부검하지 않았다.
혈액학
적절한 양의 혈액을 EDTA-함유 튜브 속에 수집하였다. 전혈 시료를 표 11에서 하기 나타낸 파라미터에 대해 분석하였다.
Figure pct00113
응고
적절한 양의 혈액을 시트르산나트륨을 함유하는 튜브 속에 수집한 후 원심분리하여 프로트롬빈 시간(PT) 및 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT)의 측정을 위해 혈장을 수득하였다.
혈청 화학
적절한 양의 혈액을 항응고제가 들어있지 않은 튜브 속에 수집하였다. 혈액이 응괴되도록 한 후 원심분리하여 혈청을 수득하였다. 혈청을 하기 표 12에 나타낸 파라미터에 대해 분석하였다.
Figure pct00114
독성학
투여 1일 및 7일째에, 혈액 시료(대략 0.5 mL/시료)를 경정맥 캐뉼라로부터 모든 독성역학적 동물에 대해 하기 나열된 시점에서 K3EDTA-함유 튜브내로 수집하였다. 단지 대조군 그룹(그룹 F)으로부터의 독성역학적 동물은 1시간 시점(일의 제1 용량 투여 후)에서 각각의 수집일로부터 단일 혈액 수집 시료채취하였다. 각각의 수집 전에, 혈액의 소 시료(헤파린 차단 용액)을 캐뉼라로부터 제거하고 버렸다. 새로운 주사기를 캐뉼라에 두고, 프로토콜이 요구되는 시료를 취하였다. 혈액 시료가 들어있는 주사기를 제거하고, 염수가 들어있는 새로운 주사기를 캐뉼라에 부착하였다. 혈액 용적을 동 용적의 염수로 교체한 후 차단 용액을 캐뉼라 속에 두었다. 각각의 동물을 다음 수집 시점까지 이의 우리에 다시두었다.
연구 동안 수집된 모든 시료를 표지된 용기 속에 두었다. 각각의 표지는 다음 정보를 함유하였다: 1) 연구 수, 2) 동물 수, 3) 수집 간격, 4) 그룹 및 성별, 및 5) 수집일.
혈액 시료를 역전시켜 즉시 혼합한 후, 습윤 빙상에 두고 냉 원심분리( (~1500g, ~10분, ~5℃)하여 혈장을 수득하였다. 혈장을 뚫을 수 있는 TPE 캡클러스터(capcluster) 구비된 RNase, DNase 유리된 캡이 있는 96-웰 1.4-mL의 폴리프로필렌 튜브내로 2개 분취량으로서 나누어 동결 건조시켰다(≤-70℃).
Figure pct00115
종결
연구 동안 빈사상태로 여겨지는 동물은 없었다. 모든 연구 동물을 안락사시키고 치료일의 프로토콜-처방된 일수 후 부검하였다. 모든 동물을 방혈시켜 종결하였다(깊은 CO2/O2 마취하에 복대 동맥을 보존).
부검
조직 수집과 함께 부검을 연구 동안 종결된 모든 동물에서 수행하였다. 부검은 시체 및 근육/골격 시스템의 시험; 모든 외부 표면 및 구멍; 두개강 및 뇌의 외부 표면; 관련된 기관 및 조직이 있는 목; 및 흉부, 복부, 및 이들의 관련된 기관 및 조직이 있는 골반강의 시험을 포함하였다.
모든 비정상을 기술하고 기록하였다.
기관 중량
계획된 부검시 안락사된 모든 동물에 대해, 신장, 간, 및 전립샘을 칭량하였다. 칭량 후, 간 및 신장의 대략 1 그램의 시료를 칭량하고, 프리셀리스(Precellys) 7mL CK28 조직 균질화 튜브(Tissue Homogenizing tube)(제품 번호 0904-01)로 이전시키고, 신속히 동결시키고(snap-frozen), 분석하였다.
기관/체중 비를 부검 전에 수득한 말기 절식된 체중을 사용하여 계산하였다.
조직 보존 및 골수 수집
하기 표 14에 나타낸 조직 및 기관을 모든 동물로부터 수집하고 고환, 부고환, 및 눈을 제외하고는 10% 천연-완충된 포르말린 속에 보존하였다. 고환, 부고환, 및 부착된 눈 신경이 있는 눈을 변형된 데이비드슨 용액(Modified Davidson's Solution) 속에 ~24 내지 48 시간 동안 고정시키고, 물로 세정한 후, 저장을 위해 10% 중성-완충된 포르말린으로 이전시켰다.
Figure pct00116
Figure pct00117
Figure pct00118
조직병리학
말기 부검을 위해 계획된 모든 동물에 대해, 신장, 간, 및 전립선을 파라핀 속에 봉매하고, 단면화하며 헤마톡실린 및 에오신으로 광학 현미경에 의한 추가의 시험을 위해 염색하였다. 그룹 A, D, E, 및 F의 경우에만, 상기 나열한 나머지 조직을 파라핀 속에 봉매하고, 단면화하고 광학 현미경에 의한 추가의 시험을 위해 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다.
통계적 분석
경우에 따라, 수치 동물 데이터를 통계적으로 평가하였다.
비교 통계를 위해, 그룹 A(대조군 그룹)을 그룹 B 및 C(치료 그룹, 1일 1회(QD) 투약됨) 및 그룹 F(대조군 그룹, 1일 2회(BID) 투약됨)를 그룹 E(치료 그룹, BID 투약됨)와 비교하였다. 데이터를 변이성의 동질성에 대해 레벤 시험(Levene Test) 및 정규 분포도에 대해 사피로-윌크스 시험(Shapiro-Wilks Test)을 사용하여 p≤0.05에서의 유의성으로 평가하였다. 동질성인 것으로 측정된 데이터 및 정규 분포의 데이터를 분산 분석법(ANOVA)의 분석으로 평가하였다. ANOVA가 p≤0.05에서 유의성을 확인하는 경우, 각각의 처리된 그룹과 각각의 대조군 그룹의 쌍식 비교를 파라미터 시험[둔네트 시험(Dunnett Test)]을 사용하여 수행함으로써 통계적 차이(p≤0.05)를 확인하였다. 비균질성 또는 비정규 분포인 것으로 측정된 데이터는 그룹 인자 유의성에 대해 크루스칼-왈리스 시험(Kruskal-Wallis Test)을 사용하여 평가하였다. 그룹들 사이에 유의성(p≤0.05)이 존재하는 경우, 비파라미터 시험(Wilcoxonwith Bonferroni-Holm)을 사용하여 치료 그룹을 대조군 그룹에 대해 비교하였다. 흘리는 동물로부터의 사료 소비 데이터는 적용가능한 시간 기간으로부터 배제하였다. 사료 소비 데이터의 비교 통계학은 둔네트 시험(파라미터)으로 제한되었다. 통계학은 전시험 사료 소비시(4일째 내지 1일째) 수행되지 않았다.
결과
상이한 용량 수준의 화합물 23A 및 화합물 13에 대한 노출은 용량 관련되었다. 평균 체중에 있어서 부작용 관찰 또는 효과는 화합물 13 또는 화합물 23A로 처리한 동물에서 관찰되지 않았다. 평균 사료 소비는 화합물 13(100 또는 200 mg/kg)으로 1일 1회 처리한 동물 및 화합물 23A(300 mg/kg)로 1일 2회 처리한 동물에 대한 연구의 상이한 간격 동안 감소하였다. 그러나, 감소된 사료 소비는 화합물 13 및 화합물 23A 그룹에서 체중 변화와 관련되지 않았으므로, 이들 효과는 부작용 또는 생물학적으로 유의적인 것으로 고려하지 않았다. 평균 칼슘 이온 농도(CA)는 통계적으로 더 낮았던 반면, 300 mg/kg의 화합물 23A를 1일 2회 투여한 래트의 그룹에 대한 평균 ALT 및 AST는 1일에 2회 처리한 대조군과 비교하여 통계적으로 더 높았다. 시험 제품-관련된 조직병리학적 발견은 어떠한 용량 요법에서도 화합물 13 또는 화합물 23A를 제공받은 동물에 대해 주목되지 않았다.
당해 연구의 영역내에서, 체중, 임상 병리학, 및 조직병리학에 있어서의 변화의 부재를 기준으로, 7일 동안 1일 1회 가비지를 통해 수컷 래트에게 경구 투여된 화합물 13에 대한 NOEL(관측가능하지 않은 효과 수준)은 200 mg/kg(844 ㎍*hr/ml의 7일째 AUC)인 반면, 1일 1회 투여된 화합물 23A에 대한 NOEL은 100 mg/kg(82㎍*hr/ml AUC)이었다. 7일 동안 가비지를 통해 1일 2회 수컷 래트에게 경구 투여된 화합물 23A에 대한 NOAEL(관측가능하지 않은 부작용 수준)은 300 mg/kg (291㎍*hr/ml AUC)이었다.
따라서, 화합물 13 및 23A는 각각 200 mg/kg/일 및 600 mg/kg/일까지의 용량 수준에서 연구 영역내에 부작용 독성을 입증하지 않았다.
실시예 35
수컷 시노몰구스 원숭이에서 독성 및 독성역학 연구를 결론짓는 경구 범위
당해 연구의 목적은 1) 7일의 연속일 동안 수컷 시노몰구스 원숭이에게 가비지에 의해 경구투여되는 경우 화합물 23의 잠재적 독성을 평가하고; 2) 제1 및 제7 투여 후 화합물 23의 독성역학을 평가하기 위한 것이었다.
동물
종, 공급원, 병력 및 확인
시노몰구스 원숭이[마카카 파스키쿨라리스(Macaca Fascicularis)]를 캐나다 퀘벡 핀코트 소재의 프리무스 바이오-리소시즈 인크.(Primus Bio-Resources Inc.)로부터 입수하였다. 시노몰구스 원숭이는 비임상 독성 평가를 위해 일반적으로 사용된 비-설치류 종이므로 선택하였다.
수, 성별, 연령, 및 체중 범위
8마리(2마리의 나이브 및 6마리의 비-나이브) 수컷을 본 연구에 사용하였다. 동물은 젊은 성체이며 투여 시작시 2 내지 4kg 사이로 칭량되었다.
연구 설계
동물을 하기 표 15에 나타낸 바와 같이 지정하였다. 동물에게 화합물 23 또는 비히클을 경구 가비지에 의해 7일의 연속일 동안 1일 1회 제공하고 투여 완료 다음날 종결하였다. 투약 첫째날을 연구 1일째로 설계하였다. 각각의 동물에 투여된 실제 용적을 계산하고 각각의 동물의 가장 최근 체중을 기준으로 조절하였다.
Figure pct00119
생애내 관찰 및 측정
관찰
우리-주변 임상 신호(병 건강, 행위 변화 등)을 연구 동안 적어도 1일 1회 기록하였다.
체중
체중을 그룹 지정 전 및 1일째(투여 전), 3, 및 7일째 및 부검전 말기(절식시킴)에 모든 동물에 대해 기록하였다.
심전도기록(ECG)
심전도(쌍극자 유도 I, II 및 III, 및 증강된 단극 유도 aVR, aVL 및 aVF)를 처리 전 주기 동안 1회 및 7일째에 다시(투여 후) 모든 원숭이에 대해 수득하였다.
추적을 심장의 전기적 기능장애의 총 변화 지표에 대해 평가하였다. 심박수(유도 II), 부비동 및 방실 리듬 또는 전도율을 포함하는 비정상의 잠재적인 존재를 측정하였다. 심박수, PR 간격, QRS 기간, QT 및 QTc 간격 값을 측정하였다.
독성역학
일련의 7개의 혈액 시료(대략 각각 0.5 mL)를 각각의 원숭이로부터 다음 시점에서 1일 및 7일째에 수집하였다: 투약 전, 투약 후 30분 및 2, 3, 6, 12 및 24 시간째. 당해 목적을 위해, 각각의 원숭이를 정맥 천자로 방혈시키고, 시료를 항응고제, K2EDTA를 함유하는 튜브내로 수집하였다. 튜브를 가공이 준비될 때까지 습윤 빙상에 두었다.
임상 병리학
실험실 조사(혈액학, 응고, 임상 화학 및 소변 검사)를 처리 개시 전 및 8일째 종결 전에 모든 동물에서 수행하였다.
혈액 시료를 적어도 12시간 그러나 20시간을 초과하지 않는 것으로 이루어진 사료 박탈의 밤새 기간 후 정맥천자로 수집하였다. 뇨를 사료 및 물이 밤새(적어도 12시간 그러나 20 시간 초과는 아님) 박탈된 동물로부터 수집하였다.
혈액학
다음 파라미터를 EDTA 항응고제내로 수집된 혈액 시료에서 측정하였다: 적혈구 세포 수, 평균 미립자 헤모글로빈(계산됨), 헤마토크릿(hematocrit)(계산됨), 평균 혈구 용적, 헤모글로빈, 세포의 형태학, 백혈구 세포 수, 혈소판 수, 백혈구 세포 차이(절대치), 망상 적혈구(절대치 및 퍼센트) 및 평균 혈구 헤모글로빈 농도(계산됨).
응고
활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 및 프로트롬빈 시간을 시트레이트 항응고제내로 수집된 혈액 시료에서 측정하였다.
임상 화학
다음 파라미터를 응괴(clotting) 활성인자: a/g 비(계산됨), 크리아티닌, 알라닌 아미노트랜스퍼라제, 글로불린(계산됨), 알부민, 글루코즈, 알칼린 포스파타제, 인(무기), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제, 칼륨, 빌리루빈(전체), 나트륨, 칼슘, 총 단백질, 클로라이드, 트리글리세라이드, 콜레스테롤(전체), 우레아, 감마 글루타밀트랜스퍼라제 및 소르비톨 데하이드로게나제를 함유하는 튜브내로 수집한 혈액에서 측정하였다.
소변검사
다음 파라미터를 뇨 시료에서 측정하였다: 빌리루빈, 단백질, 혈액, 침사 현미경검사(sediment microscopy), 색상 및 외형, 비중, 글루코즈, 우로빌리노겐, 케톤, 용적 및 pH.
종결
모든 동물을 8일째에 처리 기간의 완료시 사료없이 밤새 기간 후 안락사시켰다. 원숭이를 케타민으로 예비-안락사시킨 후 나트륨 펜토바르비탈의 정맥내 과용량에 이어 주요 혈관의 절단에 의한 방혈로 안락사시켰다.
부검
조직 수집과 함께 부검을 연구 동안 종결된 모든 동물에서 수행하였다. 부검은 시체 및 근육/골격계; 모든 외부 표면 및 구멍; 두개강 및 뇌의 외부 표면; 관련 기관 및 조직을 지닌 목; 및 흉부, 복부, 및 이의 관련 기관 및 조직을 지닌 골반강의 시험을 포함하였다. 모든 비정상을 기술하고 기록하였다.
조직 보존
전체적인 실험 및 선택된 기관 칭량의 완료시, 조직 및 기관을 표 16에서 하기 주목한 바와 같이 유지시켰다. 중성의 완충된 10% 포르말린을 달리 나타내지 않는 한 고정 및 보존을 위해 사용하였다.
Figure pct00120
Figure pct00121
조직병리학
모든 동물에 대해, 상기 나타낸 모든 조직을 파라핀 속에 봉매하고, 단면화하고 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하고 광학 현미경으로 시험하였다.
결과
상이한 용량 수준의 화합물 23에 대한 노출은 용량 관련되었다.
200mg/kg/일까지의 용량에서 화합물 23의 투여에 대해 기여할 수 있는 체중, 심전도 검사 파라미터, 임상 병리학 파라미터, 또는 기관 중량에 있어서의 변화, 또는 임상 신호는 없었다. 유사하게, 200mg/kg/일까지의 용량에서 화합물 23의 투여에 명백하게 기여할 수 있는 육안적 또는 현미경적 발견은 없었다. 수컷 시노몰구스 원숭이에서 화합물 23에 대해 관찰되지 않은 효과 수준(NOEL)은 200mg/kg/일로 측정되었다.
실시예 36
약동학적 연구
본 발명의 선택된 화합물의 약동학적 파라미터를 하기 기술된 시험에서 측정하였다. 일반적인 분석 과정 및 구체적인 시험 프로토콜을 다음과 같이 사용하였다:
일반적인 분석 과정
다음의 일반적인 분석 과정을 다음에 기술된 약동학적 시험에서 사용하였다:
시료 분석. 혈장중 화합물 23 및 화합물 W의 농도를 고성능 액체 크로마토그래피/직렬 질량 분광법(HPLC/MS/MS)을 사용하여 측정하였다. 추출 전에, 혈장 시료를 경우에 따라, 용량 수준 또는 제형에 따라 블랭크 혈장 2-, 4-, 5-, 또는 10-배를 사용하여 희석시켰다. 화합물 23 및 화합물 W를 내부 표준물(IS)과 함께 (희석된) 혈장 각각 100μL로부터 아세토니트릴(혈장/아세토니트릴의 1:4 비)로 직접적인 단백질 침전에 의해 추출하였다. 원심분리 후, 상층액 추출물(10μL)를 LC/MS/MS 시스템 위에 주입하였다. HPLC 시스템은 물 또는 아세토니트릴 중 0.1% 포름산으로 이루어진 구배 이동 상으로 용출된 Waters Xterra MS C18 컬럼, 5 마이크론, 2.1 mm 직경 x 50 mm 길이를 포함하였다.
분석물을 다중 반응 모니터링(MRM)의 유형으로 대기압 화학 이온화(APCI)를 사용하여 MS/MS로 검출하였다. 정량(quantitation)의 하한(LLOQ)은 시료 희석 인자에 따라, 1, 2, 4, 5, 10, 또는 20　ng/mL이었다. 검정의 선형 범위는 1 내지 5000 ng/mL이었다. 하루내(intra-day) 및 하루간(inter-day) 검정 정확도는 정상치의 2% 내이었다. 하루내 및 하루간 검정 가변성은 <10% 이었다.
화합물 W의 용량 현탁액 제형의 시료를 DMSO:아세토니트릴:물(33:33:33)을 사용한 10-배 내지 500-배 또는 1000-배의 희석 후 HPLC/UV 방법으로 검정하였다. 화합물 W의 용량 용액의 시료를 용량 수준 또는 제형에 따라 DMSO:물(50:50)로 10-, 50-, 100- 또는 500-배 희석 후 HPLC/UV 방법으로 검정하였다.
약동학적 데이터 분석. 화합물 23 및 화합물 W의 혈장 농도-시간 프로파일을 WinNonlin® 전문 편집 소프트웨어(Professional Edition software), 버젼 5.1.1 (제조원: 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 Pharsight Corporation)을 사용하여 비구획 약동학적 방법으로 분석하였다.
AUCall, AUCextrap, Cmax, tmax, Cl_obs, Vss_obs 및 t1/2를 포함하는 주요 약동학적 파라미터를 측정하였다.
통계적 데이터 분석. 혈장 농도 및 약동학적 파라미터 추정치의 기술적인 통계적 데이터를 계산하였으며, 이는 평균, 표준 편차(SD), 및 윈논린 소프트웨어(WinNonlin software), 버젼 5.1.1 또는 마이크로소프트 엑셀 2000을 사용한 변동 계수(%CV)를 포함한다.
원숭이 경구 연구
수컷 시노몰구스 원숭이(용량 그룹 당 n=3)에게 3, 30 및 300　mg/kg의 화합물 W의 단일의 공칭 PO 용량을 가비지(gavage)로 투여하였다. 화합물 W를 0.5% MC(미세결정성 셀룰로즈) 속에서 제형화하였다. 동물이 투여 전 및 후에 사료 및 물에 자유로이 접근하도록 하였다.
혈액 시료(대략 각각 0.25 mL)를 투여 전 및 투여 후 0(전 용량), 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 24, 48 시간째에 경동맥 카테터를 통해 수집하였다. 각각의 혈액 시료를 습윤 빙상에 유지시킨 튜브내로 수집하였으며 항응고제로서 칼륨 EDTA를 함유하였다. 혈장을 분리하고 분석할 때까지 대략 -70℃에서 저장하였다.
혈장 시료를 액체 크로마토그래피/직렬 질량 분광법(LC/MS/MS)을 사용하여 분석함으로써 시료 희석 인자에 따라 1 내지 20ng/mL의 정량의 하한(LLOQ)으로 화합물 23 및 화합물 W의 농도를 측정하였다. 혈장 농도 대 시간 데이터를 비구획 약동학(PK) 분석에 적용시켰다. 당해 분석의 결과를 표 17에 제공한다.
Figure pct00122
원숭이 IV 연구
수컷 시노몰구스 원숭이(투약 그룹당 n=3)에게 1　mg/kg의 화합물 W의 단일의 공칭 IV 볼내 용량을 경정맥 캐뉼라를 통해 투여하였다. 화합물 W를 D5W(물 용액 중 5% 덱스트로즈) 속에서 제형화하였다. 동물을 투여 전 및 후에 사료 및 물에 자유로이 접근하도록 하였다.
혈액 시료(대략 각각 0.25 mL)를 투여 전 및 투여 후 0(예비투여), 5분, 10분, 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 24, 48 시간째에 수집하였다. 각각의 혈액 시료를 습윤 빙상에 둔 튜브내로 수집하였으며 항응고제로서 칼륨 EDTA를 함유하였다. 혈장을 분리하고 대략 -70℃에서 분석할 때까지 저장하였다.
혈장 시료를 액체 크로마토그래피/직렬 질량 분광법(LC/MS/MS) 방법을 사용하여 분석함으로써 샘플 희석 인자에 따라 1 내지 20 ng/mL의 정량의 하한(LLOQ)로, 화합물 23 및 화합물 W의 농도를 측정하였다. 혈장 농도 대 시간 데이터를 비구획 약동학적(PK) 분석에 적용시켰다. 당해 분석의 결과를 표 18에 제공한다.
Figure pct00123
래트 경구 연구
수컷 스플라그 다울리 래트(용량 그룹 당 n=3)의 그룹에게 3, 10, 30, 300　mg/kg의 화합물 W의 단일 공칭 경구 용량을 투여하였다. 화합물 W를 0.5% MC(미세결정성 셀룰로즈), 20% 캅티솔, 1% HPMC-AS(하이드록시프로필 메틸셀룰로즈 아세틸 석시네이트), 1% PVP(폴리비닐피롤리돈) 속에서 제형화하였다. 동물을 투여 전 및 후에 사료 및 물에 자유로이 접근하도록 하였다. 혈액 시료(대략 각각 0.25 mL)를 투여 전 및 투여 후 0(전 용량), 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 12, 24 시간째에 경동맥 카테터를 통해 수집하였다. 각각의 혈액 시료를 습윤 빙상에 유지시킨 튜브내로 수집하였으며 항응고제로서 칼륨 EDTA를 함유하였다. 혈장을 분리하고 분석할 때까지 대략 -70℃에서 저장하였다.
혈장 시료를 액체 크로마토그래피/직렬 질량 분광법(LC/MS/MS)을 사용하여 분석함으로써 시료 희석 인자에 따라 1 내지 20ng/mL의 정량의 하한(LLOQ)으로 화합물 23 및 화합물 W의 농도를 측정하였다. 혈장 농도 대 시간 데이터를 비구획 약동학(PK) 분석에 적용시켰다. 당해 분석의 결과를 표 19에 제공한다.
Figure pct00124
래트 IV 연구
수컷 스플라그 다울리 래트(용량 그룹 당 n=3)의 그룹에게 1 및 5　mg/kg의 화합물 W의 단일 공칭 IV 볼내 경정맥 캐뉼라를 통해 투여하였다. 화합물 W를 D5W 속에서 제형화하였다. 동물을 투여 전 및 후에 사료 및 물에 자유로이 접근하도록 하였다. 혈액 시료(대략 각각 0.25 mL)를 투여 전 및 투여 후 0(전 용량), 5분, 10분, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 12, 24 시간째에 경동맥 카테터를 통해 수집하였다. 각각의 혈액 시료를 습윤 빙상에 유지시킨 튜브내로 수집하였으며 항응고제로서 칼륨 EDTA를 함유하였다. 혈장을 분리하고 분석할 때까지 대략 -70℃에서 저장하였다.
혈장 시료를 액체 크로마토그래피/직렬 질량 분광법(LC/MS/MS) 방법을 사용하여 분석함으로써 시료 희석 인자에 따라 1 내지 20ng/mL의 정량의 하한(LLOQ)으로 화합물 23 및 화합물 W의 농도를 측정하였다. 혈장 농도 대 시간 데이터를 비구획 약동학(PK) 분석에 적용시켰다. 당해 분석의 결과를 표 20에 제공한다.
Figure pct00125
마우스 경구 연구
암컷 CD-1 마우스(용량 그룹 당 n=3)의 그룹에게 10, 30, 100　mg/kg의 화합물 W의 단일 공칭 경구 용량을 투여하였다. 화합물 W를 0.5% MC 속에서 제형화하였다. 동물을 투여 전 및 후에 사료 및 물에 자유로이 접근하도록 하였다. 혈액 시료(대략 각각 0.025 mL)를 투여 전 및 투여 후 0(전 용량), 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 12, 24 시간째에 하악골 하부 정맥으로부터 수집하였다. 각각의 혈액 시료를 습윤 빙상에 유지시킨 튜브내로 수집하였으며 항응고제로서 칼륨 EDTA를 함유하였다. 혈장을 분리하고 분석할 때까지 대략 -70℃에서 저장하였다.
혈장 시료를 시료 희석 인자에 따라 1 내지 20ng/mL의 정량의 하한(LLOQ)으로 액체 크로마토그래피/직렬 질량 분광법(LC/MS/MS) 방법을 사용하여 분석하였다. 혈장 농도 대 시간 데이터를 비구획 약동학(PK) 분석에 적용시켰다. 당해 분석의 결과를 표 21에 제공한다.
Figure pct00126
위에서 기술된 연구는, 화합물 W가 적어도 래트, 개 및 원숭이에서 화합물 23으로 생체내에서 전환됨을 입증한다.
실시예 37
효소학 연구
본 발명의 선택된 화합물의 효소 억제 활성을 하기 기술된 시험에서 측정하였다:
DNA 자이라제 ATPase 검정
에스. 아우레우스 DNA 자이라제의 ATP 가수분해 활성을 피루베이트 키나제/락테이트 데하이드로게나제를 통한 ADP의 생산을 NADH의 산화에 커플링시켜 측정하였다. 당해 방법은 이미 기술되어 왔다(참조: Tamura and Gellert, 1990, J. Biol. Chem., 265, 21342).
ATPase 검정을 100 mM TRIS pH 7.6, 1.5 mM MgCl2, 150 mM KCl을 함유하는 완충 용액 속에서 30℃에서 수행하였다. 커플링 시스템은 2.5 mM 포스포에놀 피루베이트, 200μM 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NADH), 1 mM DTT, 30 ㎍/ml 피루베이트 키나제, 및 10 ㎍/ml 락테이트 데하이드로게나제의 최종 농도를 함유한다. 효소(90 nM의 최종 농도) 및 선택된 화합물의 DMSO 용액(3%의 최종 농도)를 가하였다. 반응 혼합물을 10분 동안 30℃에서 가온되도록 하였다. 반응을 ATP를 0.9mM의 최종 농도로 첨가하여 개시하고, NADH 사라짐 비율(rate)을 340 나노미터에서 10분에 걸쳐 모니터링하였다. Ki 및 IC50 값을 속도 대 농도 프로파일로부터 측정하였다.
본 발명의 선택된 화합물은 에스. 아우레우스 DNA 자이라제를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 표 22는 에스. 아루에우스 DNA 자이라제 억제 검정에서 당해 화합물의 억제 활성을 나타낸다.
Figure pct00127
DNA Topo IV ATPase 검정
에스. 아우레우스 TopoIV 효소에 의한 ATP의 ADP로의 전환을 NADH의 NAD+로의 전환에 커플링시키고, 반응의 진행을 340nm에서의 흡광도에 있어서 변화로 측정하였다. TopoIV (64 nM)를 완충액 중 선택된 화합물(3% DMSO 최종)을 사용하여 10분 동안 30℃에서 항온배양하였다. 완충액은 100 mM 트리스 7.5, 1.5 mM MgCl2, 200 mM K·글루타메이트, 2.5 mM 포스포에놀 피루베이트, 0.2 mM NADH, 1 mM DTT, 5㎍/mL의 선형화된 DNA, 50㎍/mL의 BSA, 30㎍/mL의 피루베이트 키나제, 및 10㎍/mL의 락테이트 데하이드로게나제(LDH)로 이루어진다. 반응을 ATP로 개시하고, 속도를 20분 동안 30℃에서 Molecular Devices SpectraMAX 플레이트 판독기 위에서 모니터링하였다. 억제 상수, Ki, 및 IC50을 완전한 결합 억제제에 대한 모리슨 방정식(Morrison Equation)에 대해 적합한 선택된 화합물의 속도 대 농도의 플롯으로부터 측정하였다.
Figure pct00128
실시예 38
수용해도 연구
화합물 23 및 화합물 W의 수용해도를 다음 과정에 따라 측정하였다.
시료의 제조. 각각의 화합물의 수성 시료를 다음과 같이 제조하였다. 화합물을 4ml의 투명한 바이알 속에서 물(0.5mL)을 가하고 자기 교반기로 교반하기 전에 칭량(20 내지 30mg 화합물)하였다. 1.0N HCl을 현탁액에 가하여 pH를 바람직한 범위로 조절하였다. 실온에서 96시간 동안 교반한 후, 현탁액을 0.22 마이크론 여과기(Millipore, Ultrafree centrifugal filters, Durapore PVDF 0.22μm, 제품 번호 UFC30GVNB)를 통해 여과하였다. 여액을 수집하고 pH를 pH 계측기로 측정하였다. 화합물 W를 함유하는 여액을 10배 희석시켜 HPLC 분석에 적합한 농도를 제공하였다. 화합물 23을 함유하는 여액은 희석을 필요로 하지 않았다.
표준 용액의 제조. 각각의 화합물의 표준 용액을 다음 과정에 따라 제조하였다. 1 내지 2 mg의 각각의 화합물을 10mL 용적 플라스크내로 정밀하게 칭량하고 물(화합물 W의 경우) 또는 1:1 메탄올:0.1N HCl(화합물 23의 경우)을 가하여 화합물을 완전히 용해하였다. 초음파 처리를 화합물 23에 대해 수행하여 1:1의 메탄올:0.1N HCl 속에서의 용해를 보조하였다. 모든 고체가 용해되면, 추가의 용매를 가하여 각각의 용액의 용적을 10ml로 조절하였다. 수득되는 용액을 완전히 혼합하여 각각의 화합물의 표준 용액을 수득하였다. 이후에, 각각의 표준 용액을 용매로 2배, 10배, 및 100배 희석하였다.
용해도 분석. 각각의 시료 및 각각의 표준 용액의 분취량을 HPLC 분석(Agilent 1100, 주입 용적 10μL, 파장 271nm, 컬럼 XTerra® 페닐 5μm, 4.6x50mm, 부분 번호 186001144, 이동 상: A:수 중 0.1% TFA AcN 중 0.1% TFA)으로 분석하였다. 각각의 표준 용액을 3회 주입하고, 각각의 시료를 2회 주입하였다. 표준 곡선을 표준 용액의 농도에 대한 HPLC로부터의 피크 영역의 평균을 플로팅하여 수득하였다(원소 분석에 의해 측정한 것으로서 고체의 총 물 함량을 기초로 한 표준물의 중량의 적절한 교정과 함께). 각각의 시료의 농도를 HPLC 결과, 표준 곡선의 기울기 및 절편으로부터의 수성 시료의 피크 영역으로부터 계산하였다. 하기 표 24에 나열된 용해도 값을 시료의 농도와 시료의 희석 인자의 곱으로부터 유도하였다.
Figure pct00129
실시예 39
간 및 간 S9 세포의 생체내 대사작용 연구
화합물 W에서 화합물 23으로의 전환을 래트, 개, 원숭이 및 사람으로부터의 간 및 장 S9 분획에서 연구하였다. 화합물 W를 간 S9 분획 속에서 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 20, 40, 100, 200, 300μM 및 장 S9 분획 속에서 1, 3, 10, 20, 100, 300, 500, 1000μM에서 항온배양하였다. 항온배양은 0, 5, 10, 15, 30, 45 또는 60분 동안 수행하였다. 화합물 23의 형성을 LC/MS-MS로 정량화하고 데이터를 미하엘리스 멘텐 방정식(Michaelis Menten equation)에 맞추었다. 하기 표 25의 데이터는, 화합물 W가 이들 간 및 장 S9 분획 속에서 화합물 23으로 신속하게 전환함을 나타낸다.
Figure pct00130

Claims (21)

  1. 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    [화학식 I]
    Figure pct00131

    상기 화학식 I에서,
    R은 수소 또는 불소이고;
    X는 수소, -PO(OH)2, -PO(OH)O-M+, -PO(O-)2·2M+, 또는 -PO(O-)2·D2 +이며;
    M+는 약제학적으로 허용되는 1가 양이온이고;
    D2 +는 약제학적으로 허용되는 2가 양이온이다.
  2. 제1항에 있어서, 화학식 IA의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    [화학식 IA]
    Figure pct00132

    상기 화학식 IA에서,
    R은 수소 또는 불소이다.
  3. 제1항에 있어서, 화학식 IB의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    [화학식 IB]
    Figure pct00133

    상기 화학식 IB에서,
    X는 -PO(OH)2, -PO(OH)O-M+, -PO(O-)2·2M+, 또는 -PO(O-)2·D2 +이며;
    M+는 약제학적으로 허용되는 1가 양이온이고;
    D2 +는 약제학적으로 허용되는 2가 양이온이다.
  4. 제1항에 있어서, 화학식 IC의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    [화학식 IC]
    Figure pct00134

    상기 화학식 IC에서,
    R은 수소 또는 불소이다.
  5. 제4항에 있어서, 상기 화합물이 (R)-1-에틸-3-(5-(2-(2-하이드록시프로판-2-일)피리미딘-5-일)-7-(테트라하이드로푸란-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)우레아, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 화합물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 화합물이 (R)-1-에틸-3-(6-플루오로-5-(2-(2-하이드록시프로판-2-일)피리미딘-5-일)-7-(테트라하이드로푸란-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)우레아, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 화합물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 염이 (R)-1-에틸-3-5-(2-(2-하이드록시프로판-2-일)피리미딘-5-일)-7-(테트라하이드로푸란-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)우레아의 메탄설폰산염인, 염.
  8. 제4항에 있어서, 상기 염이 (R)-1-에틸-3-(6-플루오로-5-(2-(2-하이드록시프로판-2-일)피리미딘-5-일)-7-(테트라하이드로푸란-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)우레아의 메탄설폰산염인, 염.
  9. 제3항에 있어서, 상기 X가 -PO(OH)O-M+, -PO(O-)2·2M+, 또는 -PO(O-)2·D2 +이고; M+가 Li+, Na+, K+, N-메틸-D-글루카민 및 N(R9)4 +로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 여기서, 각각의 R9가 독립적으로 수소 또는 C1-C4 알킬 그룹이며; D2 +가 Mg2+, Ca2 +, 및 Ba2 +로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 화합물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 X가 -PO(OH)O-M+ 또는 -PO(O-)2·2M+이고; M+가 Li+, Na+, K+, N-메틸-D-글루카민 및 N(R9)4 +로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 여기서, 각각의 R9가 독립적으로 수소 또는 C1-C4 알킬 그룹인, 화합물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 X가 -PO(O-)2·2M+이고; M+가 Li+, Na+, K+, N-메틸-D-글루카민 및 N(R9)4 +로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 여기서, 각각의 R9가 독립적으로 수소 또는 C1-C4 알킬 그룹인, 화합물.
  12. 제9항에 있어서, 상기 M+가 Na+인, 화합물.
  13. 제3항에 있어서, 상기 화합물이 이나트륨 (R)-2-(5-(2-(3-에틸우레이도)-6-플루오로-7-(테트라하이드로푸란-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-5-일)피리미딘-2-일)프로판-2-일 포스페이트인, 화합물.
  14. 제1항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 또는 비히클을 포함하는, 약제학적 조성물.
  15. 제2항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 또는 비히클을 포함하는, 약제학적 조성물.
  16. 제3항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 또는 비히클을 포함하는, 약제학적 조성물.
  17. 생물학적 시료를 제1항에 따른 화합물과 접촉시킴을 포함하는, 생물학적 시료 내의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 스타필로코쿠스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis), 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis), 나이세리아 고노르호에아에(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 마이코박테리움 아비움 복합체(Mycobacterium avium complex), 마이코박테리움아브세수스(Mycobacteriumabscessus), 마이코박테리움 칸사시이(Mycobacterium kansasii), 마이코박테리움 울세란스(Mycobacterium ulcerans), 클라미도필라 뉴모니아에(Chlamydophila pneumoniae), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydophila trachomatis), 해모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 또는 β-용혈성 스트렙토코쿠스 세균의 양을 감소시키거나 억제하는 방법.
  18. 제1항에 따른 화합물을 환자에게 투여함을 포함하는, 환자에서 병원내 또는 비-병원내 세균 감염의 진전, 중증도 또는 효과를 억제하거나, 치료하거나 감소시키는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 세균 감염이 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 스타필로코쿠스 에피데르미디스, 엔테로코쿠스 파에칼리스, 스타필로코쿠스 아우레우스, 클로스트리디움 디피실레, 모락셀라 카타르할리스, 나이세리아 고노르호에아에, 나이세리아 메닌기티디스, 마이코박테리움 아비움 복합체, 마이코박테리움 아브세수스, 마이코박테리움 칸사시이, 마이코박테리움 울세란스, 클라미도필라 뉴모니아에, 클라미디아 트라코마티스, 해모필루스 인플루엔자에, 스트렙토코쿠스 피오게네스 또는 β-용혈성 스트렙토코쿠스 중 하나 이상의 존재를 특징으로 하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 세균 감염이 상기도 감염, 하기도 감염, 귀 감염, 흉막폐 및 기관지 감염, 합병 요로 감염, 비합병 요로 감염, 복강내 감염, 심혈관 감염, 혈류 감염, 패혈증, 균혈증, CNS 감염, 피부 및 연조직 감염, GI 감염, 골 및 관절 감염, 생식기 감염, 눈 감염 또는 육아종 감염, 비합병 피부 및 피부 구조 감염(uSSSI), 합병 피부 및 피부 구조 감염(cSSSI), 카테터 감염, 인두염, 부비동염, 외이염, 중이염, 기관지염, 농흉, 폐렴, 지역사회-획득 세균성 폐렴(CABP), 병원-획득성 폐렴(HAP), 병원-획득성 세균성 폐렴, 인공호흡기-관련 폐렴(VAP), 당뇨병성 발 감염, 반코마이신 내성 장구균 감염, 방광염 및 신우신염, 신장 결석, 전립샘염, 복막염, 합병 복강내 감염(cIAI) 및 기타 복강간 감염(inter-abdominal infection), 투석-관련 복막염, 내장 농양, 심장내막염, 심근염, 심장막염, 수혈-관련 패혈증, 수막염, 뇌염, 뇌 농양, 골수염, 관절염, 생식기 궤양, 요도염, 질염, 자궁경부염, 치은염, 결막염, 각막염, 안구내염, 낭성 섬유증 환자에서의 감염 또는 발열성 중성구 감소증 환자의 감염 중 하나 이상으로부터 선택되는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 세균 감염이 지역사회-획득 세균성 폐렴(CABP), 병원-획득성 폐렴(HAP), 병원-획득성 세균성 폐렴, 인공호흡기-관련 폐렴(VAP), 당뇨병성 발 감염, 카테터 감염, 비합병 피부 및 피부 구조 감염(uSSSI), 합병 피부 및 피부 구조 감염(cSSSI), 반코마이신 내성 장구균 감염 또는 골수염 중 하나 이상으로부터 선택되는, 방법.
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