BR112013017974B1 - inibidores de pirimidina girase e topoisomerase iv - Google Patents

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Anne-Laure Grillot
Paul S. Charifson
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Abstract

INIBIDORES DE PIRIMIDINA GIRASE E TOPOISOMERASE IV. A presente invenção refere-se a um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo em que X e R são como aqui definido. Os compostos de fórmula (I) são úteis como inibidores de gira-se e/ou topoisomerase IV para tratar infecções bacterianas. Os compostos de fórmula (I) ou possuem uma ampla faixa de atividade antibacteriana e propriedade toxicológicas vantajosas ou são profármacos de compostos tendo a referida atividade.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido reivindica o beneficio sob 35 U.S.C. § 119 do Pedido de Patente Provisional dos Estados Unidos número serial 61/432.965 depositado em 14 de janeiro de 2011; do Pedido de Patente Provisional dos Estados Unidos número serial 61/515.174 depositado em 04 de agosto de 2011; de Pedido de Patente Provisional dos Estados Unidos número serial 61/515,249 depositado 04 de agosto de 2011; e de Pedido de Patente Provisional dos Estados Unidos número serial 61/499.134 depositado em 20 de junho de 2011; todo o teor de cada pedido pelo presente incorporado por referência.
ANTECEDENTE DA INVENÇÃO
Resistência bacteriana a antibióticos foi há muito reconhecida, e é atualmente considerada ser um sério problema de saúde mundial. Como um resultado de resistência, algumas infecções bacterianas são ou difíceis de tratar com antibióticos ou mesmo intratáveis. Este problema tornou-se especialmente sério com o recente desenvolvimento de resistência a múltiplos fármacos em certas linhagens de bactérias, tais como Streptococcus pneumoniae (SP), Mycobacterium tuberculosis, e Enterococcus. O aparecimento de enterococos resistentes à vancomicina foi particularmente alarmante por que a vancomicina foi anteriormente o único antibiótico eficaz para o tratamento desta infecção, e foi considerada para muitas infecções ser o fármaco de "último recurso". Enquanto muitas outras bactérias resistentes a fármaco não causam doença desafiadora da vida, tais como enterococos, existe o medo de que os genes que induzem resistência possam disseminar- se para organismos mais fatais tais como Staphylococcus aureus, onde a resistência à meticilina já é prevalecente (De Clerq, e outro, Current Opinion in Anti-infective Investigational Drugs, 1999, 1, 1; Levy, "The Challenge of Antibiotic Resistance", Scientific American, March, 1998).
Outra preocupação é quão rapidamente a resistência a antibiótico pode disseminar-se. Por exemplo, até os anos 1960 SP foi universalmen- te sensível à penicilina, e em 1987 apenas 0,02% das linhagens de SP nos U.S. eram resistentes. Entretanto, durante 1995 foi reportado que a resistência do SP à penicilina foi de aproximadamente sete por cento e tão elevada quanto 30% em algumas partes dos U.S. (Lewis, FDA Consumer magazine (September, 1995); Gershman in The Medical Reporter, 1997).
Hospitais, em particular, servem como centros para a formação e transmissãode organismos resistentes ao fármaco. Infecções que ocorrem em hospitais, conhecidas como infecções nosocomiais, estão tornando-se um problema crescentemente sério. Dos dois milhões de americanos infectados em hospitais a cada ano, mais de metade destas infecções resistem a pelo menos um antibiótico. The Center for Disease Control reportou que em 1992, mais de 13.000 pacientes de hospital morreram de infecções bacteria- nas que foram resistentes ao tratamento com antibiótico (Lewis, "The Rise of Antibiotic-Resistant Infections", FDA Consumer magazine, Setembro de 1995).
Como um resultado da necessidade de combater bactérias resistentes a fármaco e a falha crescente dos fármacos disponíveis, houve um interesse ressurgente em descobrir novos antibióticos. Uma estratégia atrativa para desenvolver novos antibióticos é inibir a DNA girase e/ou topoisomerase IV, enzimas bacterianas necessárias para replicação de DNA, e, portanto,necessárias para crescimento e divisão de célula bacteriana. Atividade de Girase e/ou topoisomerase IV está também associada com eventos em transcrição, reparo e recombinação de DNA.
A Girase é uma das topoisomerases, um grupo de enzimas que catalisam a interconversão de isômeros topológicos de DNA (veja geralmente, Kornberg e Baker, DNA Replication, 2a. Ed., Capítulo12, 1992, W. H. Freeman e Co.; Drlica, Molecular Microbiology, 1992, 6, 425; Drlica e Zhao, Microbiology e Molecular Biology Reviews, 1997, 61, pp. 377-392). Girase propriamente dita controla o superenrolamento de DNA e libera o estresse topo- lógico que ocorre quando os filamentos de DNA de uma dupla parental são não flexionados durante o processo de replicação. A Girase também catalisa a conversão de DNA dúplex circular fechado, relaxado em uma forma nega- tivamente superhelicoidal que é mais favorável para recombinação. O mecanismo da reação de superenrolamento envolve o revestimento de Girase em torno de uma região do DNA, o rompimento de filamento duplo naquela região, passando uma segunda região do DNA através do rompimento, e reunindo os filamentos rompidos. Tal mecanismo de clivagem é característico de uma topoisomerase do tipo II. A região de superenrolamento é orientada pela ligação de ATP à Girase. Uma ATP é então hidrolisada durante a reação. Esta ligação de ATP e subsequente hidrólise causa mudanças confor- macionais na Girase ligada a DNA que são necessárias para sua atividade. Foi também constatado que o nível de superenrolamento de DNA (ou rela-xamento)é dependente da relação de ATP/ADP. Na ausência de ATP, Gira- se é a única capaz de relaxar DNA superenrolado. DNA Girase bacteriano é um tetrâmero de proteína de 400 kilodalton que consiste em duas subunidades A (GyrA) e duas B (GyrB). Ligação e clivagem do DNA está associada com GyrA, ao passo que ATP é ligada e hidrolisada pela proteína GyrB protein. GyrB consiste em um domínio de terminação amino que tem a atividade de ATPase, e um domínio de terminal carbóxi que interage com GyrA e DNA. Ao contrário, topoisomerases tipo II eucarióticas são homodímeros que podem relaxar superenrolamentos negativos e positivos, porém não podem introduzir superenrolamentos negativos. Idealmente, um antibiótico com base na inibição de DNA Girase bacte- riana e/ou topoisomerase IV seria seletivo para estas enzimas e seria relativamente inativo contra as topoisomerases tipo II eucarióticas.
Topoisomerase IV primeiramente resolve dímeros de cromossoma ligados na conclusão de replicação de DNA.
Os antibióticos de quinolona amplamente usados inibem a DNA Girase bacteriana (GyrA) e/ou Topoisomerase IV (ParC). Exemplos das qui- nolonas incluem os compostos primitivos, tais como ácido nalidíxico e ácido oxolínico, bem como os últimos, fluoroquinolonas mais potentes, tais como norfloxacino, ciprofloxacino, e trovafloxacino. Estes compostos ligam-se a GyrA e/ou ParC e estabilizam o complexo clivado, desse modo inibindo a função geral de Girase, levando à morte celular. As fluoroquinolonas inibem as subunidades catalíticas de Girase (GyrA) e/ou Topoisomerase IV (Par C) (veja Drlica e Zhao, Microbiology e Molecular Biology Reviews, 1997, 61, 377-392). Entretanto, resistência a fármaco também foi reconhecida como um problema para esta classe de compostos (WHO Report, "Use of Quinolones in Food Animals and Potential Impact on Human Health", 1998). Com as quinolonas, como com outras classes de antibióticos, bactérias expostas a compostos primitivos frequentemente rapidamente desenvolvem resistência cruzada a compostos mais potentes na mesma classe.
As subunidades associadas responsáveis pelo suprimento de energia necessária para renovação catalítica/redefinição das enzimas por meio de ATP hidrólise são GyrB (girase ) e ParE (topoisomerase IV), respectivamente (veja, Champoux, J.J., Annu. Rev. Biochem., 2001, 70, pp. 369413). Compostos que alvejem estes mesmos sítios de ligação de ATP nas subunidades GyrB e ParE seriam úteis para o tratamento de várias infecções bacterianas (veja, Charifson e outro, J. Med. Chem., 2008, 51, pp. 52435263).
Existem menos inibidores conhecidos que se ligam a GyrB. Exemplos incluem as cumarinas, novobiocina e cumermicina A1, ciclotialidina, cinodina, e clerocidina. As cumarinas foram mostradas ligarem-se a GyrB muito firmemente. Por exemplo, novobiocina forma uma rede de ligações de hidrogênio com a proteína e diversos contatos hidrofóbicos. Enquanto a no- vobiocina e ATP parecem ligar-se dentro do sítio de ligação de ATP, existe mínima sobreposição na orientação de ligação dos dois compostos. As porções de sobreposição são a unidade de açúcar de novobiocina e a adenina de ATP (Maxwell, Trends in Microbiology, 1997, 5, 102).
Para bactérias resistentes à cumarina, a mutação de ponto mais prevalecente está em um resíduo de arginina de superfície que se liga à carbonila do anel de cumarina (Arg136 em E. coli GyrB). Enquanto enzimas com esta mutação mostram menor superenrolamento e atividade de ATPa- se, elas são também menos sensíveis à inibição por fármacos de cumarina (Maxwell, Mol. Microbiol., 1993, 9, 681).
A despeito de serem potentes inibidores de superenrolamento de Girase, as cumarinas foram amplamente usadas como antibióticos. Eles são geralmente não adequados devido a sua baixa permeabilidade em bactérias, toxicidade eucariótica, e pobre solubilidade em água (Maxwell, Trends in Microbiology, 1997, 5, 102). Seria desejável ter um novo inibidor de GyrB e ParE eficaz, que supera estas desvantagens e, preferivelmente não contam com a ligação a Arg136 para atividade. Tal inibidor seria um candidate antibiotic atrativo, sem a história de problemas de resistência que afligem outras classes de antibióticos.
Visto que a resistência bacteriana a antibióticos tornou-se um importante problema de saúde pública, existe uma necessidade contínua de desenvolver antibióticos mais novos e mais potentes. Mais particularmente, existe uma necessidade de antibióticos que representam uma nova classe de compostos não usados anteriormente para tratar infecção bacteriana.
Compostos que alvejam os sítios de ligação de ATP em ambas as subuni- dades de GyrB (girase ) e ParE (topoisomerase IV) seriam úteis para o tra- tamento de várias infecções bacterianas. Tais compostos seriam particularmenteúteis no tratamento de infecções nosocomiais em hospitais onde a formação e transmissão de bactérias resistentes estão se tornando crescen- temente prevalecente. Além disso, existe uma necessidade de novos antibió- ticos tendo um amplo espectro de atividade com propriedades toxicológicas vantajosas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção é direcionada a compostos e sais farma- ceuticamente aceitáveis dos mesmos, úteis como inibidores de girase e/ou topoisomerase IV. Os inibidores de girase e/ou topoisomerase IV da presen- te invenção podem ser representados pela fórmula (I) ou sais dos mesmos:
Figure img0001
em que R é hidrogênio ou flúor; X é hidrogênio, -PO(OH)2, -PO(OH)O-M+, -PO(O’)2^2M+, ou -PO(O’)2^D2+; M+é um cátion monovalente farmaceuticamente aceitável; e D2+ é um cátion divalente farmaceuticamente aceitável. Os compostos de fórmula (I) ou possuem uma ampla faixa de atividade antibacteriana e propriedades toxicológicas vantajosas ou são pro- fármacos de compostos tendo a referida atividade.
A presente invenção também se refere aos compostos de fórmula (IA), ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, úteis como inibidores de girase e/ou topoisomerase IV. Os compostos de fórmula (IA) são abrangidos pela fórmula (I). Os compostos de fórmula (IA) podem ser representados como:
Figure img0002
em que R é hidrogênio ou flúor. Os compostos de fórmula (IA) possuem uma ambla faixa de atividade antibacteriana e propriedades toxicológicas vanta-josas.
A presente invenção também se refere aos compostos de fórmu-la (IB), ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, úteis como pro- fármacos para inibidores de girase e/ou topoisomerase IV. Os compostos de fórmula (IB) são abrangidos pela fórmula (I). Os compostos de fórmula (IB) podem ser representados como:
Figure img0003
em que X é -PO(OH)2, -PO(OH)O-M+, -PO(O’)2^2M+, ou -PO(O’)2^D2+; M+ é um cátion monovalente farmaceuticamente aceitável; e D2+ é um cátion diva-lente farmaceuticamente aceitável. Os compostos de fórmula (IB) são pro- fármacos de éster de fosfato do composto (R)-1-etil-3-(6-flúor-5-(2-(2- hidroxipropan-2-il)pirimidin-5-il)-7-(tetra-hidrofuran-2-il)-1H-benzo[d]imidazol- 2-il)ureia, que possui uma ampla faixa de atividade antibacteriana e proprie-dadestoxicológicas vantajosas. Além dos compostos fornecidos aqui, a pre-sente invenção também fornece uma composição farmacêutica que compre-ende um composto de fórmula (I) (que inclui outras fórmulas abrangidas pela fórmula (I) tal como as fórmulas (IA), (IB), (IC) e (ID)) ou um sal farmaceuti- camente aceitável do mesmo e um veículo farmaceuticamente aceitável.
Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, um veículo farmaceutica- mente aceitável, e um agente terapêutico adicional selecionado de um anti-biótico, um agente anti-inflamatório, um inibidor de metaloproteinase matriz, um inibidor de lipoxigenase, um antagonista de citocina, um imunossupres- sor, um agente anticâncer, um agente antiviral, uma citocina, um fator de crescimento, um imunomodulador, uma prostaglandina ou um composto de hiperproliferação antivascular.
Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um méto-do de tratamento de uma infecção bacteriana em um mamífero em necessi-dade do mesmo, compreendendo administrar ao referido mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um méto-do de tratamento de uma infecção bacteriana em um mamífero em necessi-dade do mesmo, compreendendo administrar ao referido mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um antibiótico, um agente anti- inflamatório, um inibidor de metaloproteinase matriz, um inibidor de lipoxige- nase, um antagonista de citocina, um imunossupressor, um agente anticân- cer, um agente antiviral, uma citocina, um fator de crescimento, um imuno- modulador, uma prostaglandina ou um composto de hiperproliferação anti- vascular, ou como parte de uma forma de dosagem múltipla juntamente com o referido composto ou como uma forma de dosagem separada.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
FIG. 1 é um plote elipsoide térmico de duas moléculas indepen-dentes de simetria de composto 12.
FIG. 2 é um plote elipsoide térmico de duas moléculas indepen- dendes de simetria de composto 23.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Como usado aqui, o termo "halogênio" significa F, Cl, Br, ou I.
A menos que de outro modo estabelecido, estruturas represen-tadas aqui entende-se também incluir todas as formas estereoquímicas da estrutura; isto é, as configurações R e S para cada centro assimétrico. Por-tanto, isômeros estereoquímicas simples, bem como misturas enantioméri- cas e diastereoméricas dos presentes compostos incluem-se no escopo da invenção.
Formas isotopicamente rotuladas de compostos de fórmula (I) em que um ou mais átomos são substituídos por um átomo tendo uma massa atômica ou número de massa diferentes da massa atômica ou número de massa geralmente encontrados na natureza são também incluídas aqui. E-xemplos de isótopos que podem ser incorporados em compostos da inven-ção incluem isótopos de hidrogênio, carbono, nitrogênio, oxigênio, e flúor, tais como 2H 3H 13C 14C 15N 18O e 17O Tais compostos isotopicamente ,, , , , , . rotulados estáveis e radio rotulados são úteis, por exemplo, como ferramen-tas de pesquisa ou diagnóstico ou inibidores de girase e/ou topoisomerase IV com perfil terapêutico melhorado. As estruturas também abrangem formas zuiteriônicas dos compostos ou sais, onde apropriado.
Em uma modalidade, compostos de fórmula (I) incluem compos-tos de fórmula (IC)
Figure img0004
em que R é como definido acima.
Em outra modalidade, compostos de fórmula (I) incluem com-postos de fórmulas (ID) e (IE) como mencionado abaixo:
Figure img0005
(R)-1-etil-3-(5-(2-(2-hidroxipropan-2-il)pirimidin-5-il)-7-(tetra- hidrofuran-2-il)-1H-benzo[d]imidazol-2-il)ureia, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; e
Figure img0006
(R)-1-etil-3-(6-flúor-5-(2-(2-hidroxipropan-2-il)pirimidin-5-il)-7- (tetra-hidrofuran-2-il)-1H-benzo[d]imidazol-2-il)ureia, ou um sal farmaceuti- camente aceitável do mesmo. A menos que de outro modo estabelecido, a frase "compostos de fórmula (I)" destina-se a incluir outras fórmulas mencio-nadas aqui que são abrangidas pela fórmula (I) incluindo as fórmulas (IA), (IB), (IC), (ID), e (IE). Os compostos de fórmula (IB) são profármacos de seu composto origem, 1-etil-3-[6-flúor-5-[2-(1-hidróxi-1-metil-etil)pirimidin-5-il]-7-[(2R)-tetra- hidrofuran-2-il]-1H-benzimidazol-2-il]ureia. Desse modo, a atividade exibida na administração do profármaco é principalmente devido à presença do composto origem que resulta de clivagem do profármaco.
O termo "profármaco"refere-se a compostos que são precurso- res de fármaco que, seguindo administração e absorção, liberam o fármaco in vivo por meio de algum processo metabólico. Em geral, um profármaco possui menos atividade biológica do que seu fármaco origem. Um profárma- co pode também melhorar as propriedades físicas do fármaco origem e/ou pode também melhorar eficácia de fármaco total, por exemplo, através da redução de toxicidade e efeitos indesejados de um fármaco controlando sua absorção, níveis sanguíneos, distribuição metabólica e captação celular.
O termo "composto origem" ou "fármaco origem" refere-se à en-tidade biologicamente ativa que é liberada por meio de ação enzimática de um processo metabólico ou catabólico, ou por meio de um processo químico seguindo a administração do profármaco. O composto origem pode também ser o material de partida para a preparação de seu correspondente profár- maco.
Os cátions monovalentes definidos por M+ incluem íons de amô- nio, íons de metal de álcali, tais como íons de sódio, lítio e potássio, íon de dicicloexilamina, e íon de N-metil-D-glucamina. Os cátions divalentes defini-dos por D2+ incluem íons de metal alcalino terroso tais como íons de alumí-nio,cálcio e magnésio. São também incluídos cátions de aminoácido tais como íons de arginina, lisina, ornitina, e assim em diante. Se M+ for um cá- tion monovalente, sera reconhecido que se a definição 2M+ estiver presente, cada de M+ pode ser igual ou diferente. Além disso, é similarmente reconhe-cido que se a definição 2M+ estiver presente, um cátion divalente D2+poderá em vez disso estar presente. Além disso, os grupos contendo nitrogênio bá-sicos podem ser quaternizados com tais agentes como: haletos de alquila inferior, tais como cloretos, brometos e iodetos de metila, etila, propila e buti- la; sulfatos de dialquila como sulfatos de dimetila, dietila, dibutila, diamila; haletos de cadeia longa, tais como cloretos, brometos e iodetos de decila, laurila, miristila e estearila; haketis de aralquila como brometo de benzila e outros.
Várias modalidades da invenção incluem compostos ou sais de fórmula (IB) como mencionado abaixo: (1) compostos em que X é (a) -PO(OH)O-M+; (b) -PO(O’^2M+; ou (c) -PO(O ):-D2+ (2) compostos em que M+é (a) Li+, Na+, K+, N-metil-D-glucamina, ou N(R9)4+; ou (b) Na+; (c) cada R9é independentemente hidrogênio ou um grupo C1-C4 alquila; (3) compostos em que D2+é (a) Mg2+, Ca2+, e Ba2+; ou (b) Ca2+; (4) o composto (R)-2-(5-(2-(3-etilureído)-6-flúor-7-(tetra- hidrofuran-2-il)-1H-benzo[d]imidazol-5-il)pirimidin-2-il)propan-2-ila fosfato; e (5) o composto disodium (R)-2-(5-(2-(3-etilureído)-6-flúor-7- (tetra-hidrofuran-2-il)-1H-benzo[d]imidazol-5-il)pirimidin-2-il)propan-2-ila fos-fato.
Entende-se que várias modalidades alternativas dos compostos ou sais de fórmula (IB) podem ser selecionadas requerendo uma ou mais das modalidades alternativas listadas em (1) a (3) acima. Por exemplo, ou-tras modalidades da invenção podem ser obtidas combinando (1)(a) e (2)(a); (1)(a) e (2)(b); (1)(c) e (3)(a); (1)(c) e (3)(b); (1)(b) e (2)(a); (1)(b) e (2)(b); e similares.
Os profármacos da presente invenção são caracterizados pela solubilidade aquosa inesperadamente elevada. Esta solubilidade facilita a administração de doses mais elevadas do profármaco, resultando em uma maior carga de fármaco por dosagem unitária.
Uma modalidade desta invenção refere-se a um método de tra-tamento de uma infecção bacteriana em um mamífero em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao referido mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto, que tem a fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
De acordo com outra modalidade, a invenção fornece um méto-do de diminuir ou inibir a quantidade bacteriana em uma amostra biológica. Este método compreende contatar a referida amostra biológica com um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
O termo "amostras biológicas", como aqui usado, inclui culturas ou extratos celulares das mesmas; material biopsiado obtido de um mamífe- ro ou extratos do mesmo; e sangue, saliva, urina, fezes, sêmen, lágrimas, ou outros fluidos corporais ou extratos do mesmo. O termo "amostras biológica" também inclui organismos vivos, em cujo caso "contatar um composto desta invenção com uma amostra biológica" é sinônimo do termo "administrar o referido composto ou composição compreendendo o referido composto a um mamífero".
Uma modalidade compreende contatar a referida amostra bioló-gica com um composto selecionado do grupo que consiste em (R)-1-etil-3- (5-(2-(2-hidroxipropan-2-il)pirimidin-5-il)-7-(tetra-hidrofuran-2-il)-1H- benzo[d]imidazol-2-il)ureia, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mes-mo; e (R)-1-etil-3-(6-flúor-5-(2-(2-hidroxipropan-2-il)pirimidin-5-il)-7-(tetra- hidrofuran-2-il)-1H-benzo[d]imidazol-2-il)ureia, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Composições farmacêuticas úteis para tais métodos são descritas abaixo.
Uma modalidade compreende contatar a referida amostra bioló-gica com um profármaco de éster de fosfato de (R)-1-etil-3-(6-flúor-5-(2-(2- hidroxipropan-2-il)pirimidin-5-il)-7-(tetra-hidrofuran-2-il)-1H-benzo[d]imidazol- 2-il)ureia, como definido para a fórmula (IB). Composições farmacêuticas úteis para tais métodos são descritas abaixo.
A atividade antimicrobiana dos compostos de fórmula (I) pode ser demonstrada em um ensaio de suscetibilidade antimicrobiana. Os deta-lhes das condições usadas para os ensaios de suscetibilidade antimicrobia- na são mencionados nos exemplos abaixo.
Os inibidores de girase e/ou topoisomerase IV desta invenção, ou sais farmacêuticos dos mesmos, podem ser formulados em composições farmacêuticas para administração a animais ou humanos. Estas composi-ções farmacêuticas eficazes para tratar ou prevenir uma infecção bacteriana que compreendem o inibidor de Girase e/ou topoisomerase IV em uma quantidade suficiente para mensuravelmente diminuir a quantidade bacteria- na e um veículo farmaceuticamente aceitável, são outra modalidade da presente invenção. O termo "mensuravelmente diminui a quantidade bacteria- na", como aqui usado significa uma mudança mensurável no número de bactérias entre uma amostra contendo o referido inibidor e uma amostra contendo apenas as bactérias.
Agentes que aumentam a suscetibilidade de organismos bacte- rianos a antibióticos são conhecidos. Por exemplo, Patente dos Estados U-nidos No. 5.523.288, Patente dos Estados Unidos No. 5.783.561 e Patente dos Estados Unidos No. 6.140.306 descrevem métodos de uso de proteína de aumento da permeabilidade/bactericida (BPI) para aumentar a suscetibili-dadeantibiótica de bactérias gram-positivas e gram-negativas. Agentes que aumentam a permeabilidade da membrane externa de organismos bacteria- nos foram descritos por Vaara, M. em Microbiological Reviews (1992) pp. 395-411, e a sensibilização de bactérias gram-negativas foi descrita por Tsubery, H., e outro, em J. Med. Chem. (2000) pp. 3085-3092.
Outra modalidade desta invenção refere-se a um método, como descrito acima, de prevenir, controlar, tratar ou reduzir o avanço, severidade ou efeitos de uma infecção bacteriana em um mamífero em necessidade do mesmo, porém também compreendendo a etapa de administrar ao referido mamífero um agente que aumenta a suscetibilidade de organismos bacteria- nos a antibióticos.
De acordo com outra modalidade, os métodos da presente in-venção são úteis para tratar pacientes no campo veterinário incluindo, porém não limitados a, animais de zoológico, laboratório, companhia a humanos, e fazenda incluindo primatas, roedores, répteis e pássaros. Exemplos dos referidos animais incluem, porém não estão limitados a, cobaias, hamsters, gerbis, rato, camundongos, coelhos, cães, gatos, cavalos, porcos, ovelhas, vacas, cabras, veado, macacos reso, macacos, tamarindos, macacos (apes), babuínos, gorilas, chimpanzés, orangotangos, gibões, avestruzes, galinhas, perus, patos, e gansos.
As composições farmacêuticas e métodos desta invenção serão úteis geralmente para controlar infecções bacterianas in vivo. Exemplos de organismos bacterianos que podem ser controlados pelas composições e métodos desta invenção incluem, porém não estão limitados aos seguintes organismos: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Entero coccus faecalis, Enterococcus faecium, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp. Proteus spp. Pseudomonas aeruginosa, E. coli, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Coag. Neg. Staphylococci, Haemophilus influenzae, Bacillus anthracis, Mycoplasma pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Chlamy- dophila pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Legionella pneumophila, My-cobacterium tuberculosis, Helicobacter pylori, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus epidermidis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Clostridi-um difficile, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Mycobacterium avium complex, Mycobacteriumabscessus, Mycobacterium kansasii e Myco-bacterium ulcerans.
As composições e métodos, portanto, serão úteis para controlar, tratar ou reduzir o avanço, severidade ou efeitos de infecções nosocomiais ou não-nosocomiais. Exemplos de infecções nosocomiais e não- nosocomiais incluem, porém não estão limitados a infecções respiratórias superiores, infecções respiratórias inferiores, infecções do ouvido, infecções pleuropulmonares e bronquiais, infecções complicadas do trato urinário, in-fecções descomplicadas do trato urinário, infecções intra-abdominais, infec-ções cardiovasculares, uma infecção da corrente sanguínea, sepse, bacte-remia, infecções do SNC, infecções da pele e tecido mole, infecções do GI, infecções ósseas e de articulação, infecções genitais, infecções dos olhos, ou infecções granulomatosas. Exemplos de infecções bacterianas específi-cas incluem, porém não estão limitados a infecções da pele e estrutura da pele descomplicadas (uSSSI), infecções da pele e estrutura da pele compli-cadas (cSSSI), infecções de catéter, faringite, sinusite, otite externa, otite média, bronquite, empiema, pneumonia, pneumonia bacteriana adquirida em comunidade (CABP), pneumonia adquirida em hospital (HAP), pneumonia bacteriana adquirida em hospital, pneumonia associada com ventilador (VAP), infecções do pé diabético, infecções por enterococos resistentes à vancomicina, cistite e pielonefrite, cálculos renais, prostatite, peritonite, infecções intra-abdominais complicadas (cIAI) e outras infecções inter- abdominais, peritonite associada com diálise, abscessos viscerais, endocar- dite, miocardite, pericardite, sepse associada com transfusão, meningite, encefalite, abscesso cerebral, osteomielite, artrite, úlceras genitais, uretrite, vaginite, cervicite, gengivite, conjuntivite, ceratite, endoftalmite, uma infecção em pacientes de fibrose cística ou uma infecção de pacientes neutropênicos febris.
O termo "infecções não nosocomiais"é também referido como infecções adquiridas em comunidade.
Em uma modalidade, as composições e métodos, portanto, serão úteis para controlar, tratar ou reduzir o avanço, severidade ou efeitos de pneumonia bacteriana adquirida em comunidade (CABP), pneumonia adquirida em hospital (HAP), pneumonia bacteriana adquirida em hospital, pneumonia associada com ventilador (VAP), bacteremia, infecções do pé diabético,infecções de catéter, infecções da pele e estrutura da pele descomplica- das (uSSSI), infecções da pele e estrutura da pele complicadas (cSSSI), infecções por enterococos resistentes à vancomicina ou osteomielite.
Em outra modalidade, as composições e métodos, portanto, se-rão úteis para controlar, tratar ou reduzir o avanço, severidade ou efeitos de infecções respiratórias superiores, infecções respiratórias inferiores, infec-ções do ouvido, infecções pleuropulmonares e bronquiais, infecções do trato urinário complicadas, infecções do trato urinário descomplicadas, infecções intra-abdominais, infecções cardiovasculares, uma infecção da corrente sanguínea, sepse, bacteremia, infecções do SNC, infecções da pele e tecido mole, infecções do GI, infecções ósseas e de articulação, infecções genitais, infecções dos olhos, ou infecções granulomatosas, infecções da pele e estrutura da pele descomplicadas (uSSSI), infecções da pele e estrutura da pele complicadas (cSSSI), infecções de catéter, faringite, sinusite, otite externa, otite média, bronquite, empiema, pneumonia, pneumonia bacteriana adquirida em comunidade (CABP), pneumonia adquirida em hospital (HAP), pneumonia bacteriana adquirida em hospital, pneumonia associada com ventilador (VAP), infecções do pé diabético, infecções por enterococos resistentesà vancomicina, cistite e pielonefrite, cálculos renais, prostatite, perito- nite, infecções intra-abdominais complicadas (cIAI) e outras infecções inter- abdominais, peritonite associada com diálise, abscessos viscerais, endocar- dite, miocardite, pericardite, sepse associada com transfusão, meningite, encefalite, abscesso cerebral, osteomielite, artrite, úlceras genitais, uretrite, vaginite, cervicite, gengivite, conjuntivite, ceratite, endoftalmite, uma infecção em pacientes de fibrose cística ou uma infecção de pacientes neutropênicos febris.
Em outra modalidade, uma infecção bacteriana é caracterizada pela presença de um ou mais de Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Coag. Neg. Staphlococci, Bacillus anthracis, Staphylococcus epi- dermidis, Staphylococcus saprophyticus, ou Mycobacterium tuberculosis.
Em outra modalidade, uma infecção bacteriana é caracterizada pela presença de um ou mais de Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis, ou Staphylococcus aureus.
Em outra modalidade, uma infecção bacteriana é caracterizada pela presença de um ou mais de E. coli, Moraxella catarrhalis, ou Haemophi-lus influenzae.
Em outra modalidade, uma infecção bacteriana é caracterizada pela presença de um ou mais de Clostridium difficile, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Mycobacterium avium complex, Mycobacterium abs- cessus, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium ulcerans, Chlamydophila pneumoniae e Chlamydia tracomatis.
Em outra modalidade, uma infecção bacteriana é caracterizada pela presença de um ou mais de Streptococcus pneumoniae, Staphylococ-cus epidermidis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Clostridium difficile, Moraxella catarrhalis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Mycobacterium avium complex, Mycobacterium abscessus, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium ulcerans, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes ou estrepto- cocos β -hemolíticos.
Em algumas modalidades, uma infecção bacteriana é caracteri-zada pela presença de um ou mais de Staphylococcus aureus resistente à meticilina, Staphylococcus aureus resistente à fluoroquinolona, Staphylococ cus aureus resistente ao intermediário de vancomicina, Staphylococcus au-reus resistente ao Linezolida, Streptococcus pneumoniae resistente à penici-lina,Streptococcus pneumoniae resistente a macrolídeo, Streptococcus pneumoniae resistente à fluoroquinolona, Enterococcus faecalis resistente à vancomicina, Enterococcus faecalis resistente ao Linezolida, Enterococcus faecalis resistente à fluoroquinolona, Enterococcus faecium resistente à van- comicina, Enterococcus faecium resistente ao Linezolida, Enterococcus fae- cium resistente à fluoroquinolona, Enterococcus faecium resistente à ampici- lina, Haemophilus influenzae resistente a macrolídeo, Haemophilus influenzae resistente a β-lactam, Haemophilus influenzae resistente à fluoroquino- lona, Moraxella catarrhalis resistente a β-lactam, Staphylococcus epidermidis resistente à meticilina, Staphylococcus epidermidis resistente à meticilina, Staphylococcus epidermidis resistente à vancomicina, Staphylococcus epi- dermidis resistente à fluoroquinolona, Mycoplasma pneumoniae resistente a macrolídeo, Mycobacterium tuberculosis resistente a Isoniazida, Mycobacterium tuberculosis resistente à Rifampina, Staphylococcus negativo de coagulase resistente à meticilina, Staphylococcus negativo de coagulase resistente à fluoroquinolona, Staphylococcus aureus resistente ao intermediário de gli- copeptídeo, Staphylococcus aureus resistente à vancomicina, Staphylococcus aureus Hetero resistente ao intermediário de vancomicina, Staphylococcus aureus Hetero resistente à vancomicina, Staphylococcus resistente a Macrolídeo-Lincosamida-Estreptogramina, Enterococcus faecalis resistente a β-lactam, Enterococcus faecium resistente a β-lactam, Streptococcus pneumoniae resistente a cetolídeo, Streptococcus pyogenes resistente a cetolídeo, Streptococcus pyogenes resistente a macrolídeo, Staphylococcus epidermidis resistente à vancomicina, Neisseria gonorrhoeae resistente à fluoroquinolona, Pseudomonas aeruginosa resistente a múltiplos fármacos ou Neisseria gonorrhoeae resistente à cefalosporina.
De acordo com outra modalidade, os Staphylococci resistentes à meticilina são selecionados do Staphylococcus aureus resistente à meticili- na, Staphylococcus epidermidis resistente à meticilina, ou Staphylococcus negativo de coagulase resistente à meticilina.
Em algumas modalidades, uma forma de um composto de fór-mula (I) é usado para tratar MRSA adquirida em comunidade (isto é, cMR- SA).
Em outras modalidades, uma forma de um composto de fórmula (I) é usado para tratar organismo resistente à daptomicina incluindo, porém não limitados a, Enterococcus faecium resistente à daptomicina e Staphylo-coccus aureus resistente à daptomicina.
De acordo com outra modalidade, os Staphylococci resistentes à fluoroquinolona são selecionados de Staphylococcus aureus resistente à fluoroquinolona, Staphylococcus epidermidis resistente à fluoroquinolona, ou Staphylococcus negativo de coagulase resistente à fluoroquinolona.
De acordo com outra modalidade, o Staphylococci resistente a glicopeptídeo é selecionado de Staphylococcus aureus resistente ao inter-mediário de glicopeptídeo, Staphylococcus aureus resistente à vancomicina, Staphylococcus aureus resistente ao intermediário de vancomicina, Staph-ylococcus aureus hetero resistente ao intermediário de vancomicina, ou Sta-phylococcus aureus hetero resistente à vancomicina.
De acordo com outra modalidade, o Staphylococci resistente a Macrolídeo-Lincosamida-Estreptogramina é o Staphylococcus aureusresis-tente a Macrolídeo-Lincosamida-Estreptogramina.
De acordo com outra modalidade, os Enterococci resistentes ao Linezolida sãoselecionados de Enterococcus faecalis resistente ao Linezoli- da, ou Enterococcus faecium resistente ao Linezolida.
De acordo com outra modalidade, os Enterococci resistentes a glicopeptídeo são selecionados de Enterococcus faecium resistentes à van- comicina ou Enterococcus faecalis resistentes à vancomicina.
De acordo com outra modalidade, o Enterococcus faecalisresis-tente a β-lactam o Enterococcus faecium resistente a β-lactam.
De acordo com outra modalidade, os Streptococci resistentes à penicilina são o Streptococcus pneumoniae resistente à penicilina.
De acordo com outra modalidade, os Streptococci resistentes a macrolídeo são o Streptococcus pneumonia resistente a macrolídeo.
De acordo com outra modalidade, os Streptococci resistentes a cetolídeo são selecionados de Streptococcus pneumoniae resistente a ma- crolídeo e Streptococcus pyogenes resistente a cetolídeo.
De acordo com outra modalidade, os Streptococci resistentes à fluoroquinolona são Streptococcus pneumoniae resistente à fluoroquinolona.
De acordo com outra modalidade, o Haemophilus resistente a β- lactam é o Haemophilus influenzae resistente a β-lactam.
De acordo com outra modalidade, o Haemophilus resistente à fluoroquinolona é o Haemophilus influenzae resistente à fluoroquinolona.
De acordo com outra modalidade, o Haemophilus resistente a macrolídeo é Haemophilus influenzae resistente a macrolídeo.
De acordo com outra modalidade, o Mycoplasma resistente a macrolídeo é o Mycoplasma pneumoniae resistente a macrolídeo.
De acordo com outra modalidade, o Mycobacterium resistente a Isoniazida é o Mycobacterium tuberculosis resistente à Isoniazida.
De acordo com outra modalidade, o Mycobacterium resistente à Rifampina é o Mycobacterium tuberculosis resistente à Rifampina.
De acordo com outra modalidade, o Moraxella resistente a β- lactam é o is Moraxella catarrhalis resistente a β-lactam.
De acordo com outra modalidade, uma infecção bacteriana é ca-racterizada pela presença de um ou mais dos seguintes: Staphylococcus aureus resistente à meticilina, Staphylococcus aureus resistente à fluoroqui- nolona, Staphylococcus aureus resistente ao intermediário de vancomicina, Staphylococcus aureus resistente ao Linezolida, Streptococcus pneumoniae resistente à penicilina, Streptococcus pneumoniae resistente a macrolídeo, Streptococcus pneumoniae resistente à fluoroquinolona, Enterococcus fae- calis resistente à vancomicina, Enterococcus faecalis resistente ao Linezoli- da, Enterococcus faecalis resistente à fluoroquinolona, Enterococcus faeci- um resistente à vancomicina, Enterococcus faecium resistente ao Linezolida, Enterococcus faecium resistente à fluoroquinolona Enterococcus faecium, resistente à ampicilina, Haemophilus influenzae resistente a macrolídeo, Haemophilus influenzae resistente a β-lactam, Haemophilus influenzae resis- tente à fluoroquinolona, Moraxella catarrhalis resistente a β-lactam, Staph-ylococcus epidermidis resistente à meticilina, Staphylococcus epidermidis resistente à meticilina, Staphylococcus epidermidis resistente à vancomicina, Staphylococcus epidermidis resistente à fluoroquinolona, Mycoplasma pneumoniae resistente a macrolídeo, Mycobacterium tuberculosis resistente a Isoniazida, resistente à Mycobacterium tuberculosis Rifampina, Neisseria gonorrhoeae resistente à fluoroquinolona ou Neisseria gonorrhoeaeresistenteà cefalosporina.
De acordo com outra modalidade, uma infecção bacteriana é ca-racterizada pela presença de um ou mais dos seguintes: Staphylococcus aureus resistente à meticilina, Staphylococcus epidermidis resistente à meti- cilina, Staphylococcus negativo de coagulase resistente à meticilina, Staph-ylococcus aureus resistente à fluoroquinolona, Staphylococcus epidermidis resistente à fluoroquinolona, Staphylococcus negativo de coagulaseresistenteà fluoroquinolona, Staphylococcus aureus resistente à vancomicina, Staphylococcus aureus resistente ao intermediário de glicopeptídeo, Staphylococcus aureus resistente à vancomicina, Staphylococcus aureus resistente ao intermediário de vancomicina, Staphylococcus aureus hetero resistente ao intermediário de vancomicina, Staphylococcus aureus hetero resistente à vancomicina, Enterococcus faecium resistente à vancomicina, Enterococcus faecalis resistente à vancomicina, Streptococcus pneumoniae resistente à penicilina, Streptococcus pneumoniae resistente a macrolídeo, Streptococcus pneumoniae resistente à fluoroquinolona, Streptococcus pyogenesresistente a macrolídeo, ou Haemophilus influenzae resistente a β-lactam.
De acordo com outra modalidade, uma infecção bacteriana é ca-racterizada pela presença de um ou mais dos seguintes: Staphylococcus aureus resistente à meticilina, Enterococcus faecium resistente à vancomici- na, Enterococcus faecalis resistente à vancomicina, Staphylococcus aureus resistente à vancomicina, Staphylococcus aureus resistente ao intermediário de vancomicina, Staphylococcus aureus hetero resistente ao intermediário de vancomicina, Staphylococcus aureus hetero resistente à vancomicina, Pseudomonas aeruginosa resistente a múltiplos fármacos, Mycobacterium tuberculosis resistente a Isoniazida, e Mycobacterium tuberculosis resistente à Rifampina.
Além dos compostos desta invenção, derivados farmaceutica- mente aceitáveis ou profármacos dos compostos desta invenção podem também ser empregados em composições para tratar ou prevenir os distúr-bios acima identificados.
Um "derivado ou profármaco farmaceuticamente aceitável" signi-fica qualquer sal, éster, sal de um éster ou outro derivado farmaceuticamen- te aceitável de um composto desta invenção que, em administração a um receptor, é capaz de fornecer, diretamente ou indiretamente, um composto desta invenção ou um metabólido inibitoriamente ativo ou resíduo do mes-mo. Derivados particularmente favorecido ou profármacos são aqueles que aumentam a biodisponibilidade dos compostos desta invenção quando tais compostos são administrados a um mamífero (por exemplo, permitindo um composto oralmente administrado ser mais facilmente absorvido no sangue) ou que realça a liberação do composto origem para um compartimento bio-lógico (por exemplo, o cérebro ou sistema linfático) relativo às espécies ori-gem.
Profármacos farmaceuticamente aceitáveis dos compostos desta invenção incluem, sem limitação, ésteres, ésteres de aminoácido, ésteres de fosfato, sais de metal e ésteres de sulfonato.
Sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos desta inven-ção incluem aqueles derivados de ácidos e bases inorgânicas e orgânicas farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de sais de ácido adequados inclu-em acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, benzenossulfonato, bis- sulfato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanossulfonato, formato, fumarato, glucoepta- noato, glicerofosfato, glicolato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, clori- drato, hydrobromide, hidroiodeto, 2-hidroxietanossulfonato, lactato, maleato, malonato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato, nitrato, pal- moato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, pro-pionato, salicilato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, tosilato e undeca- noato. Outros ácidos, tais como oxálico, enquanto que não em si farmaceuti- camente aceitável, podem ser empregados na preparação de sais úteis co-mo intermediários na obtenção dos compostos da invenção e seus sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis.
Sais derivados de bases apropriadas incluem sais de metal de álcali (por exemplo, sódio e potássio), metal alcalino terroso (por exemplo, magnésio), amônio e N+(C1-4 alquil)4. Esta invenção também considera a quaternização de quaisquer grupos contendo nitrogênio básicos dos com-postos descritos aqui. Produtos solúveis ou dispersíveis em água ou óleo podem ser obtidos por tal quaternização.
Composições farmacêuticas desta invenção compreendem um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um veículo farmaceuticamente aceitável. Tais composições podem opcio-nalmente compreender um agente terapêutico adicional. Tais agentes inclu-em,porém não estão limitados a, um antibiótico, um agente anti-inflamatório, um inibidor de metaloprotease matriz, um inibidor de lipoxigenase, um anta-gonista de citocina, um imunossupressor, um agente anticâncer, um agente antiviral, uma citocina, um fator de crescimento, um imunomodulador, uma prostaglandina ou um composto de hiperproliferação antivascular.
O termo "veículo farmaceuticamente aceitável"refere-se a um veículo não tóxico que pode ser administrado a um paciente, juntamente com um composto desta invenção, e que não destrói a atividade farmacoló-gica do mesmo.
Veículos farmaceuticamente aceitáveis que podem ser usados nas composições farmacêuticas desta invenção incluem, porém não estão limitados a, permutadores de íon, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas de soro, tais como albumina de soro humano, substâncias tampão tais como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas de glicerídeo parciais de ácidos graxos vegetais saturados, água, sais ou eletró- litos, tais como sulfato de protamina, fosfato de hidrogênio de dissódio, fosfato de hidrogênio de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinil pirrolidona, substâncias com base em celu- lose, polietileno glicol, carboximetilcelulose sódica, poliacrilatos, ceras, polí-meros de bloco de polietileno-polioxipropileno, lanolina e sistemas de libera-ção de fármaco de autoemulsificação (SEDDS) tais como alfa-tocoferol, poli- etilenoglicol 1000 sucinato, ou outras matrizes de liberação poliméricas simi-lares.
O termo "quantidade farmaceuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz no tratamento ou melhora de uma infecção bacteriana em um paciente. O termo "quantidade profilaticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz na prevenção ou substancialmente reduzindo uma infec-ção bacteriana em um paciente.
Dependendo da condição, ou estado de doença particular, a ser tratado ou prevenido, agentes terapêuticos adicionais, que são normalmente administrados para tratar ou prevenir aquela condição, podem ser adminis-trados juntamente com os inibidores desta invenção. Tais agentes terapêuti-cos incluem, porém não estão limitados a, um antibiótico, um agente anti- inflamatório, um inibidor de metaloprotease matriz, um inibidor de lipoxige- nase, um antagonista de citocina, um imunossupressor, um agente anticân- cer, um agente antiviral, uma citocina, um fator de crescimento, um imuno- modulador, uma prostaglandina ou um composto de hiperproliferação anti- vascular.
Os compostos desta invenção podem ser empregados de uma maneira convencional para controlar os níveis de infecções bacterianas in vivo e para tratar doenças ou reduzir o avanço ou severidade de efeitos que são mediados por bactérias. Tais métodos de tratamento, seus níveis de dosagem e requisitos podem ser selecionados por aqueles versados na téc-nica de métodos e técnicas disponíveis.
Por exemplo, um composto desta invenção pode ser combinado com um adjuvante farmaceuticamente aceitável para a administração a um paciente que está sofrendo de uma infecção ou doença bacteriana de uma maneira farmaceuticamente aceitável e em uma quantidade eficaz para re-duzir a severidade daquela infecção ou doença.
Alternativamente, os compostos desta invenção podem ser usa- dos em composições e métodos para tratar ou proteger indivíduos contra infecções ou doenças bacterianas durante períodos de tempo estendidos. Em uma modalidade, os compostos desta invenção podem ser usados em composições e métodos para tratar ou proteger indivíduos contra infecções ou doenças bacterianas durante um período de 1 a 2 semanas. Em outra modalidade, os compostos desta invenção podem ser usados em composições e métodos para tratar ou proteger indivíduos contra infecções ou doenças bacterianas durante um período de 4 a 8 semanas (por exemplo, no tratamento de pacientes com ou em risco de desenvolver endocardite ou oste- omielite). Em outra modalidade, os compostos desta invenção podem ser usados em composições e métodos para tratar ou proteger indivíduos contra infecções ou doenças bacterianas durante um período de 8 a 12 semanas. Os compostos podem ser empregados em tais composições sozinhos ou junto com outros compostos desta invenção de uma maneira consistente com a utilização convencional de inibidores de enzima em composições farmacêuticas. Por exemplo, um composto desta invenção pode ser combinado com adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis convencionalmente empregados em vacinas e administrado em quantidades profilaticamente eficazes para proteger indivíduos durante um período de tempo estendido contra infecções ou doenças bacterianas.
Em algumas modalidades, compostos de fórmula (I) podem ser usados profilaticamente para prevenir uma infecção bacteriana. Em algumas modalidades, compostos de fórmula (I) podem ser usados antes, durante ou após um procedimento dentário ou cirúrgico para prevenir infecções oportu- nísticas, tais como aquelas encontradas em endocardite bacteriana. Em outras modalidades, compostos de fórmula (I) podem ser usados profilatica- mente em procedimentos dentários, incluindo, porém não limitados a extrações, procedimentos periodontais, colocações de implante dentário e cirurgia endodôntica. Em outras modalidades, compostos de fórmula (I) podem ser usados profilaticamente em procedimentos cirúrgicos, incluindo, porém não limitados à cirurgia geral, cirurgia respiratória (tonsilectomi- a/adenoidectomia), cirurgia gastrointestinal (GI superior e cirurgia do intesti- no pequeno eletiva, escleroterapia esofágica e dilatação, resseção do intes-tino grosso, apendectomia aguda), cirurgia de trauma (cirurgia abdominal penetrante), cirurgia do trato genitourinário (prostatectomia, dilatação uretral, cistoscopia, histerectomia vaginal ou abdominal, seção de cesareana), cirur-gia de transplante (transplante de rim, fígado ou pâncreas), cirurgia de cabe-ça e pescoço (excisões da pele, dissecações de pescoço, laringectomia, ci-rurgias de câncer de cabeça e pescoço, fraturas mandibulares), cirurgia or-topédica (substituição de articulação total, fraturas abertas traumáticas), ci-rurgia vascular (procedimentos vasculares periféricos), cirurgia cardiotoráci- ca, cirurgia de desvio coronário, ressecção pulmonar e neurocirurgia.
O termo "previne uma infecção bacteriana" como aqui usado, a menos que de outro modo indicado, significa o uso profilático de um antibió-tico, tal como um inibidor de Girase e/ou topoisomerase IV da presente in-venção, para prevenir uma infecção bacteriana. Tratamento com um inibidor de Girase e/ou topoisomerase IV pode ser feito profilaticamente para preve-nir uma infecção causada por um organismo que é suscetível ao inibidor de Girase e/ou topoisomerase IV. Um grupo geral de condições, onde o trata-mentoprofilático pode ser considerado é quando um indivíduo é mais vulne-rável à infecção devido a, por exemplo, imunidade enfraquecida, cirurgia, trauma, presença de um dispositivo artificial no corpo (temporário ou perma-nente), um defeito anatômico, exposição a níveis elevados de bactérias ou possível exposição a um patógeno causador de doença. Exemplos de fato-res que podem levar à imunidade enfraquecida incluem quimioterapia, tera-pia de radiação, diabetes, idade avançada, infecção de HIV, e transplante. Um exemplo de um defeito anatômico seria um defeito na válvula do coração que aumenta o risco de endocardite bacteriana. Exemplos de dispositivos artificiais incluem articulações artificiais, pinos cirúrgicos, catéteres, etc. Outro grupo de situações onde o uso profilático de um inibidor de Girase e/ou topoisomerase IV pode ser apropriado seria para prevenir a disseminação de um patógeno entre os indivíduos (direta ou indireta). Um exemplo específico de uso profilático para prevenir a disseminação de um patógeno é o uso de um inibidor de Girase e/ou topoisomerase IV por indivíduos em uma institui- ção de cuidados com a saúde (por exemplo, um hospital ou clínica de re-pouso).
Os compostos de fórmula (I) podem também ser coadministra- dos com outros antibióticos para aumentar o efeito de terapia ou profilaxia contra várias infecções bacterianas. Quando os compostos desta invenção são administrados em terapias de combinação com outros agentes, eles po-dem ser administrados sequencialmente ou coincidentemente ao paciente. Alternativamente, composições farmacêuticas ou profiláticas, de acordo com esta invenção compreendem uma combinação de um composto de fórmula (I) e outro agente terapêutico ou profilático.
Em algumas modalidades, o agente ou agentes terapêutico(s) adicional(s) é/são um antibiótico selecionado de uma penicilina natural, uma penicilina resistente à penicilinase, uma penicilina antipseudomonal, uma aminopenicilina, uma cefalosporina de primeira geração, uma cefalosporina de segunda geração, uma cefalosporina de terceira geração, uma cefalospo- rina de quarta geração, um carbapenemo, uma cefamicina, uma quinolona, uma fluoroquinolona, um aminoglicosídeo, um macrolídeo, um cetolídeo, uma polimixina, uma tetraciclina, uma glicopeptídeo, uma estreptogramina, uma oxazolidinona, uma rifamicina, ou uma sulfonamida.
Em algumas modalidades, o agente ou agentes terapêuticos a-dicionaissão um antibiótico selecionado de uma penicilina, ima cefalospori- na, uma quinolona, um aminoglicosídeo ou uma oxazolidinona.
Em outras modalidades, os agentes terapêuticos adicionaissão selecionados de uma penicilina natural, incluindo Penicilina G de Benzatina, Penicilina G e Penicilina V, de uma penicilina resistente à penicilinase, incluindo Cloxacilina, Dicloxacilina, Nafcilina e Oxacilina, de uma penicilina antip- seudomonal, incluindo Carbenicilina, Mezlocilina, Pipercilina, Pipercili- na/tazobactam, Ticaricilina e Ticaricilina/Clavulanato, de uma aminopenicili- na incluindo Amoxicilina, Ampicilina e Ampicilina/Sulbactam, de uma cefa- losporina de primeira geração incluindo Cefazolina, Cefadroxil, Cefalexina e Cefadrina, de uma cefalosporina de segunda geração incluindo Cefaclor, Cefaclor-CD, Cefamandol, Cefonacid, Cefprozil, Loracarbef e Cefuroxima, de uma cefalosporina de terceira geração incluindo Cefdinir, Cefixima, Cefope- razona, Cefotaxima, Cefpodoxima, Ceftazidima, Ceftibuteno, Ceftizoxima e Ceftriaxona, de uma cefalosporina de quarta geração incluindo Cefepime, Ceftarolina e Ceftobiprol, de uma Cefamicina incluindo Cefotetano e Cefoxi- tina, de um carbapenemo incluindo Doripenemo, Imipenemo e Meropenemo, de um monobactam incluindo Aztreonam, de uma quinolona, incluindo Cino- xacina, ácido nalidíxico, ácido oxolínico e ácido pipemídico, de uma fluoro- quinolona incluindo Besifloxacino, Ciprofloxacino, Enoxacino, Gatifloxacino, Grepafloxacino, Levofloxacino, Lomefloxacino, Moxifloxacino, Norfloxacino, Ofloxacino e Esparfloxacino, de um aminoglicosídeo incluindo Amicacina, Gentamicina, Canamicina, Neomicina, Netilmicina, Espectinomicina, Estrep- tomicina e Tobramicina, de um macrolídeo incluindo Azitromicina, Claritromi- cina e Eritromicina, de um cetolídeo incluindo Telitromicina, de uma Tetraci- clina incluindo Clortetraciclina, Demeclociclina, Doxiciclina, Minociclina e Te- traciclina, de um glicopeptídeo incluindo Oritavancina, Dalbavancina, Tela- vancina, Teicoplanina e Vancomicina, de uma estreptogramina incluindo Dal- fopristina/quinupristina, de uma oxazolidona incluindo Linezolida, de uma Rifamicina incluindo Rifabutin e Rifampin e de outros antibióticos incluindo bactitracina, colistina, Tigacil, Daptomicina, cloranfenicol, clindamicina, isoni- azida, metronidazol, mupirocina, polimixina B, pirazinamida, trimeto- prim/sulfametoxazol e sulfisoxazol.
Em outras modalidades, os agentes terapêuticos adicionais são selecionados de uma penicilina natural incluindo Penicilina G, de uma penicilina resistente à penicilinase, incluindo Nafcilina e Oxacilina, de uma penicilina antipseudomonal incluindo Pipercilina/tazobactam, de uma aminopenicili- na incluindo Amoxicilina, de uma cefalosporina de primeira geração incluindo Cefalexina, de uma cefalosporina de segunda geração incluindo Cefaclor, Cefaclor-CD e Cefuroxima, de uma cefalosporina de terceira geração incluindo Ceftazidima e Ceftriaxona, de uma cefalosporina de quarta geração incluindo Cefepima, de um carbapenemo incluindo Imepenemo, Meropenemo, Ertapenemo, Doripenemo, Panipenemo e Biapenemo, a fluoroquinolona incluindo Ciprofloxacino, Gatifloxacino, Levofloxacino e Moxifloxacino, de um aminoglicosídeo incluindo Tobramicina, de um macrolídeo, incluindo Azitro- micina e Claritromicina, de uma Tetraciclina incluindo Doxiciclina, de um gli- copeptídeo incluindo Vancomicina, de uma Rifamicina incluindo Rifampina e de outros antibióticos, incluindo isoniazida, pirazinamida, Tigacil, Daptomici- na ou trimetoprim/sulfametoxazol.
Em algumas modalidades, uma forma sólida de um composto de fórmula (I), pode ser administrada para o tratamento de uma infecção gram positiva. Em algumas modalidades, a composição é uma composição sólida, líquida (por exemplo, uma suspensão), ou iv (por exemplo, uma forma do composto de fórmula (I) é dissolvida em um líquido e administrada iv). Em algumas modalidades, a composição incluindo um composto de fórmula (I), é administrada em combinação com um agente antibiótico adicional, por e-xemplo, uma penicilina natural, uma penicilina resistente à penicilinase, uma penicilina antipseudomonal, uma aminopenicilina, uma cefalosporina de primeirageração, uma cefalosporina de segunda geração, uma cefalosporina de terceira geração, uma cefalosporina de quarta geração, um carbapenemo, uma cefamicina, uma quinolona, uma fluoroquinolona, um aminoglicosí- deo, um macrolídeo, um cetolídeo, uma polimixina, uma tetraciclina, um gli- copeptídeo, uma estreptogramina, uma oxazolidinona, uma rifamicina, ou uma sulfonamida. Em algumas modalidades, a composição incluindo uma forma sólida de um composto de fórmula (I) é administrado oralmente, e o agente antibiótico adicional, por exemplo, uma penicilina natural, uma penicilina resistente à penicilinase, uma penicilina antipseudomonal, uma amino- penicilina, uma cefalosporina de primeira geração, uma cefalosporina de segundageração, uma cefalosporina de terceira geração, uma cefalosporina de quarta geração, um carbapenemo, uma cefamicina, uma quinolona, uma fluoroquinolona, um aminoglicosídeo, um macrolídeo, um cetolídeo, uma polimixina, uma tetraciclina, um glicopeptídeo, uma estreptogramina, uma oxazolidinona, uma rifamicina, ou uma sulfonamida é administrada iv.
Em algumas modalidades, uma forma sólida de um composto de fórmula (I), pode ser administrada para o tratamento de uma infecção gram negativa. Em algumas modalidades, a composição é uma composição sóli- da, líquida (por exemplo, uma suspensão), ou uma iv (por exemplo, uma forma de um composto de fórmula (I) é dissolvida em um líquido e adminis-trada iv). Em algumas modalidades a composição incluindo um composto de fórmula (I) é administrado em combinação com um agente antibiótico adicio-nal, selecionado de: natural penicilina, uma penicilina resistente à penicilina- se, uma penicilina antipseudomonal, uma aminopenicilina, uma cefalospori- na de primeira geração, uma cefalosporina de segunda geração, uma cefa- losporina de terceira geração, uma cefalosporina de quarta geração, um carbapenemo, uma cefamicina, um monobactam, uma quinolona, uma fluoro- quinolona, um aminoglicosídeo, um macrolídeo, um cetolídeo, uma polimixi- na, tetraciclina ou uma sulfonamida. Em algumas modalidades, a composição incluindo uma forma sólida de um composto de fórmula (I) é administrada oralmente, e o agente antibiótico adicional, por exemplo, uma penicilina natural, uma penicilina resistente à penicilinase, uma penicilina antipseudo- monal, uma aminopenicilina, uma cefalosporina de primeira geração, uma cefalosporina de segunda geração, uma cefalosporina de terceira geração, uma cefalosporina de quarta geração, um carbapenemo, uma cefamicina, um monobactam, uma quinolona, uma fluoroquinolona, um aminoglicosídeo, um macrolídeo, um cetolídeo, uma polimixina, tetraciclina ou uma sulfonami- da é administrada oralmente. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é administrado iv.
Os agentes terapêuticos adicionais descritos acima podem ser administrados separadamente, como parte de um regime de dosagem múlti-pla, da composição contendo inibidor. Alternativamente, estes agentes po-dem ser parte de uma forma de dosagem única, misturados junto com o ini-bidor em uma única composição.
As composições farmacêuticas desta invenção podem ser admi-nistradas oralmente, parenteralmente, por spray de inalação, topicamente, retalmente, nasalmente, bucalmente, vaginalmente ou por meio de um re-servatório implantado. As composições farmacêuticas desta invenção podem conter quaisquer portadores, adjuvantes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis não tóxicos convencionais. Em alguns casos, o pH da formulação pode ser ajustado com ácidos, bases ou tampões farmaceuticamente aceitá-veis, para realçar a estabilidade do composto formulado ou sua forma de liberação. O termo parenteral como aqui usado inclui injeção subcutânea, intracutânea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intrassinovial, intra- esternal, intratecal, intralesional e intracraniana ou técnicas de infusão.
As composições farmacêuticas podem ser na forma de uma pre-paração injetável estéril, por exemplo, como uma suspensão aquosa ou ole-aginosainjetável estéril. Esta suspensão pode ser formulada de acordo com técnicas conhecidas na arte usando agentes dispersasntes ou umectantes adequados (tais como, por exemplo, Tween 80) e agentes de suspensão. A preparação injetável estéril pode também ser uma solução ou suspensão injetável estéril em um diluente ou solvente parenteralmente aceitável não tóxico, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão o manitol, água, solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotônica. Além disso, óleos fixos estéreis são convencionalmente empregados como um solvente ou meio de suspensão. Para este propósito, qualquer óleo fixo suave pode ser empregado, incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos. Ácidos graxos, tais como ácido oleico e seus derivados de glicerídeo são úteis na preparação de injetáveis, visto que são óleos farmaceuticamente aceitáveis naturais, tais como óleo de oliva ou óleo de rícino, especialmente em suas versões polio- xietiladas. Estas soluções ou suspensões oleosas podem também conter um diluente ou dispersante de álcool de cadeia longa, tais como aqueles descri-tos na Pharmacopeia Helvetica, ou um álcool similar.
As composições farmacêuticas desta invenção podem ser oral-mente administradas em qualquer forma de dosagem oralmente aceitável incluindo, porém não limitadas a, cápsulas, comprimidos, e suspensões e soluções aquosas. No caso de comprimidos para uso oral, veículos que são comumente usados incluem lactose e amido de milho. Agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, são também tipicamente adicionados. Para administração oral em uma forma de cápsula, diluentes úteis incluem lactose e amido de milho seco. Quando suspensões e soluções aquosas e pro- pileno glicol são administradas oralmente, o ingrediente ativo é combinado com agentes emulsificantes e de suspensão. Se desejado, certos agentes adoçantes e/ou aromatizantes e/ou colorantes podem ser adicionados.
As composições farmacêuticas desta invenção podem também ser administradas na forma de supositórios para administração retal. Estas composições podem ser preparadas misturando um composto desta inven-ção com um excipiente não irritante adequado que é sólido em temperatura ambiente, porém líquido na temperatura retal e, portanto, derreterá no reto para liberar os componentes ativos. Tais materiais incluem, porém não estão limitados a, manteiga de cacau, cera de abelha e polietileno glicois.
A administração tópica das composições farmacêuticas desta in-venção é especialmente útil quando o tratamento desejado envolve áreas ou órgãos facilmente acessíveis por aplicação tópica. Para aplicação topica-menteà pele, a composição farmacêutica deve ser formulada com um un-guento adequado contendo os componentes ativos suspensos ou dissolvi-dos em um veículo. Veículos para administração tópica dos compostos desta invenção incluem, porém não estão limitados a, óleo mineral, petróleo líqui-do,petróleo branco, propileno glicol, polioxietileno, polioxipropileno, cera emulsificante e água. Alternativamente, a composição farmacêutica pode ser formulada com uma loção ou creme adequado, contendo o composto ativo suspenso ou dissolvido em um veículo. Veículos adequados incluem, porém não estão limitados a, óleo mineral, monoestearato de sorbitano, polissorba- to 60, cera de cetil ésteres, álcool cetearílico, 2-octildodecanol, álcool benzí- lico e água. As composições farmacêuticas desta invenção podem também ser topicamente aplicadas ao trato intestinal inferior por formulação supositó- ria retal ou em uma formulação de enema adequada. Emplastros transdér- micos topicamente administrados são também incluídos nesta invenção.
As composições farmacêuticas desta invenção podem ser admi-nistradas por a aerosol ou inalação nasal. Tais composições são preparadas de acordo com técnicas bem conhecidas na arte de Formulação farmacêuti-ca e podem ser preparadas como soluções em salina, empregando álcool benzílico ou outros preservativos adequados, promotores de absorção para realçar a biodisponibilidade, fluorocarbonetos, e/ou outros agentes solubili- zantes ou dispersantes conhecidos na técnica.
De acordo com outra modalidade, compostos de fórmula (I) po-demtambém ser liberados por implante (por exemplo, cirurgicamente), tal como com um dispositivo implantável ou de longa permanência. Um disposi-tivoimplantável ou de longa permanência pode ser designado para residir permanentemente ou temporariamente em um indivíduo. Exemplos de dis-positivosimplantáveis e de longa permanência incluem, porém não estão limitados a, lentes de contato, catéteres venosos centrais e conectores sem agulha, tubos endotraqueais, dispositivos intrauterinos, válvulas cardíacas mecânicas, marcapassos, cateteres de diálise peritoneal, articulações proté- ticas, tais como substituições de quadril e joelho, tubos de timpanostomia, cateteres urinários, próteses de voz, stents, bombas de liberação, filtros vas-culares e composições de liberação controlada implantáveis. Biopelículas podem ser prejudiciais para a saúde de pacientes com um dispositivo médi-coimplantável ou de longa permanência porque elas introduzem um substrato artificial no corpo e podem causar infecções persistentes. Desse modo, fornecendo compostos de fórmula (I) em ou sobre o dispositivo implantável ou de longa permanência, pode prevenir ou reduzir a produção de uma bio- película. Além disso, dispositivos implantáveis ou de longa permanência podem ser usados como um depósito ou reservatório de compostos de fórmula (I). Qualquer dispositivo implantável ou de longa permanência pode ser usado para liberar compostos de fórmula (I) contanto que a) o dispositivo, compostos de fórmula (I) e qualquer composição farmacêutica, incluindo compostos de fórmula (I), é biocompatível, e b) que o dispositivo pode liberar ou soltar uma quantidade eficaz de compostos de fórmula (I) para conferir um efeito terapêutico para o paciente tratado.
A liberação de agentes terapêuticos por meio de dispositivos im-plantáveisou de longa permanência é conhecida na técnica. Veja, por e-xemplo,"Recent Developments in Coated Stents" by Hofma e outro, publica-do em Current Interventional Cardiology Reports 2001, 3:28-36, todo o teor do qual, incluindo as referências aqui citadas, incorporados aqui por referên- cia. Outras descrições de dispositivos implantáveis podem ser encontradas nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.569.195 e 6.322.847; e Pedido de Patente dos Estados Unidos Números 2004/0044405, 2004/0018228, 2003/0229390, 2003/0225450, 2003/0216699 e 2003/0204168, cada das quais é incorporada aqui por referência em sua íntegra.
Em algumas modalidades, o dispositivo implantável é um stent. Em uma modalidades específico, um stent pode incluir cabos de malha en-cadeada. Cada cabo pode incluir fios de metal para suporte estrutural e fios poliméricos para liberar o agente terapêutico. O fio polimérico pode ser do-sado imergindo o polímero em uma solução do agente terapêutico. Alternati-vamente, o agente terapêutico pode ser implantado no fio polimérico durante a formação do fio de soluções precursoras poliméricas.
Em outras modalidades, dispositivos implantáveis ou de longa permanência podem ser revestidos com revestimentos poliméricos que in-cluem o agente terapêutico. O revestimento polimérico pode ser designado para controlar a taxa de liberação do agente terapêutico. A liberação contro-lada de agentes terapêuticos pode utilizar várias tecnologias. São conheci-dos dispositivos que têm uma camada ou revestimento monolítico incorpo-rando uma solução e/ou dispersão heterogênea de um agente ativo em uma substância polimérica, onde a difusão do agente é limitante da taxa, visto que o agente difunde-se através do polímero para a interface polímero-fluido e é liberado dentro do fluido circundante. Em alguns dispositivos, uma subs-tância solúvel é também dissolvida ou dispersa no material polimérico, de modo que poros ou canais adicionais são deixados após o material dissol-ver-se. Um dispositivo matriz é geralmente de difusão limitada também, po-rém com os canais ou outra geometria interna do dispositivo também de-sempenhando um papel na liberação do agente para o fluido. Os canais po-dem ser canais preexistentes ou canais deixados para trás pelo agente libe-rado ou outras substâncias solúveis.
Dispositivos desgastáveis ou degradáveis topicamente têm o agente ativo fisicamente imobilizado no polímero. O agente ativo pode ser dissolvido e/ou disperso em todo o material polimérico. O material polimérico é frequentemente hidroliticamente degradado em tempo prolongado por meio de hidrólise de ligações lábeis, permitindo o polímero desgastar-se dentro do fluido, liberando o agente ativo dentro do fluido. Polímeros hidrofí- licos têm um taxa geralmente mais rápida de erosão, com relação aos polí-meroshidrofóbicos. Polímeros hidrofóbicos são liberados para ter difusão de superfície quase pura de agente ativo, tendo erosão da interna. Polímeros hidrofílicos são acreditados permitirem água penetrar na superfície do polí-mero, permitindo hidrólise de ligações lábeis abaixo da superfície, o que po-de levar à erosão homogênea ou volumosa do polímero.
O revestimento do dispositivo implantável ou de longa perma-nência pode incluir uma mistura de polímeros, cada qual tendo uma diferente taxa de liberação do agente terapêutico. Por exemplo, o revestimento pode incluir um copolímero de ácido polilático/polietileno (PLA-PEO) e um copolí- mero de ácido polilático/policaprolactona (PLA-PCL). O copolímero de ácido polilático/óxido de polietileno (PLA-PEO) pode exibir uma maior taxa de liberação de agente terapêutico com relação ao copolímero de ácido poliláti- co/policaprolactona (PLA-PCL). As quantidades relativas e taxas de dosagem de agente terapêutico liberadas em tempo prolongado podem ser controladas controlando as quantidades relativas dos polímeros de liberação mais rápida com relação aos polímeros de liberação mais lenta. Para taxas de liberação inicial maiores a proporção de polímero de liberação mais rápida pode ser aumentada com relação ao polímero de liberação mais lenta. Se a maior parte da dosagem for desejada para ser liberada durante um longo período de tempo, a maior parte do polímero pode ser o polímero de liberação mais lenta. O dispositivo pode ser revestido vaporizando o dispositivo com uma solução ou dispersão de polímero, agente ativo, e solvente. O solvente pode ser evaporado, deixando um revestimento de polímero e agente ativo. O agente ativo pode ser dissolvido e/ou disperso no polímero. Em algumas modalidades, os copolímeros podem ser expulsos sobre o dispositivo.
Níveis de dosagem entre cerca de 0,01 e cerca de 100 mg/kg de peso corporal por dia, preferivelmente entre 0,5 e cerca de 75 mg/kg de peso corporal por dia e o mais preferivelmente entre cerca de 1 e 50 mg/kg de peso corporal por dia do composto de ingrediente ativo são úteis em uma monoterapia para a prevenção e tratamento de infecções bacterianas.
Tipicamente, as composições farmacêuticas desta invenção se-rão administradas de cerca de 1 a 5 vezes por dia ou alternativamente, como uma infusão contínua. Alternativamente, as composições da presente invenção podem ser administradas em uma formulação pulsátil. Tal administração pode ser usada como uma terapia crônica ou aguda. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com os materiais veículo para produzir uma forma de dosagem única variará, dependendo do hospedeiro tratado e o modo particular de administração. Uma preparação típica conterá de cerca de 5% a cerca de 95% de composto ativo (peso/peso). Preferivelmente, tais preparações contêm de cerca de 20% a cerca de 80% de composto ativo.
Quando as composições desta invenção compreendem uma combinação de um composto de fórmula (I) e um ou mais agentes terapêuti-cos ou profiláticos adicionais, tanto o composto quanto o agente adicional devem estar presente nos níveis de dosagem entre cerca de 10% a 80% da dosagem normalmente administada em um regime de monoterapia.
Na melhora de uma condição do paciente, uma dose de manu-tenção de um composto, composição ou combinação desta invenção pode ser administrada, se necessário. Subsequentemente, a dosagem ou fre-quência de administração, ou ambas, podem ser reduzidas, como uma fun-ção dos sintomas, em um nível no qual a condição melhorada é mantida quando os sintomas foram aliviados para o nível desejado, o tratamento de-ve cessar. Os pacientes podem, entretanto, requerer tratamento intermitente em uma base a longo prazo em qualquer recorrência ou sintomas da doen-ça.
O técnico versado apreciará que doses menores ou maiores do que aquelas citadas acima possam ser requeridas. Dosagem e regimes de tratamento específicos para qualquer paciente particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo a atividade do composto específico empre-gado, a idade, peso corporal, estado de saúde geral, sexo, dieta, tempo de administração, taxa de excreção, combinação de fármaco, a severidade e curso da doença, e a disposição do paciente para a doença e o diagnóstico do médico que está realizando o tratamento.
De acordo com outra modalidade, a invenção fornece métodos para tratar ou prevenir uma infecção bacteriana, ou estado de doença, com-preendendo a etapa de administrar a um paciente qualquer composto, com-posição farmacêutica, ou combinação descrita aqui. O termo "paciente", co-mo aqui usado, significa um animal, preferivelmente um mamífero, e o mais preferivelmente um humano.
Os compostos desta invenção são também úteis como reagentes comerciais que eficazmente ligam-se às enzimas Girase B e/ou topoiso-merase IV. Como reagentes comerciais, os compostos desta invenção, e seus derivados, podem ser usados para bloquear a atividade de Girase B e/ou topoisomerase IV em ensaios bioquímicos ou celulares para Girase B e/ou topoisomerase IV bacterianas ou seus homólogos, ou podem ser deri- vatizados para se ligarem a uma resina estável como um substrato amarrado para aplicações de cromatografia de afinidade. Estes e outros usos que ca-racterizam inibidores de Girase B e/ou topoisomerase IV comerciais serão evidentes para aqueles versados na técnica.
Os compostos desta invenção podem ser preparados de acordo com métodos gerais conhecidos por aqueles versados na técnica para com-postosanálogos, como ensinado pela Patente dos Estados Unidos No. RE40245 E; Patente dos Estados Unidos No. 7.495.014 B2; Patente dos Estados Unidos No. 7.569.591 B2; Patente dos Estados Unidos No. 7.582.641 B2; Patente dos Estados Unidos No. 7.618.974 B2; e Patente dos Estados Unidos No. 7.727.992 B2. Todas as seis das referidas patentes são incorporadas por referência como se totalmente mencionadas aqui. Os deta-lhes das condições usadas para preparar os compostos da presente inven-ção são também mencionados nos exemplos.
A fim de que esta invenção seja mais totalmente entendida, os seguintes exemplos são mencionados. Estes exemplos são para o propósito de ilustração apenas e não devem ser construídas como limitantes do esco- po da invenção de modo algum.
As seguintes definições descrevem os termos e abreviações u- sados aqui:
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Exemplo 1
Preparação de 2-(2-nitrofenil)-2,5-di-hidrofurano e 2-(2-nitrofenil)-2,3-di- hidrofurano (3a&3b).
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1-Bromo-2-nitro-benzeno misto (1) (600 g, 99 %, 2,941 mol, Alfa Aesar A11686), 1,3-bis(difenilfosfino)propano (62,50 g, 97%, 147,0 mmol, Alfa Aesar A12931), 1,4-dioxano (2,970 L, Sigma-Aldrich 360481), carbonato de potássio (812,9 g, 5,882 mol, JT-Baker 301201), e 2,3-di-hidrofurano (2) (1,041 kg, 99 %, 1,124 L, 14,70 mol, Aldrich 200018). Uma corrente de nitro-gêniofoi borbulhada através da mistura em agitação durante 4 horas, segui-da por adição de acetato de paládio (II) (16,51 g, 73,52 mmol, Strem 461780) e continuação de desoxigenação durante mais 10 minutos. A mistura de reação foi agitada ao refluxo sob nitrogênio durante a noite (RMN de uma alíquota elaborada mostrou completa consumação de arilbrometo). Ela foi deixada resfriar, diluída com hexano (1 L), filtrada através de um tampão curto de Florisil® (500 g, -200 malhas), e eluída com EtOAc. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida (2-(2-Nitrofenil)-2,3-di-hidrofurano é volátil sob vácuo elevado e pode ser um pouco instável em temperatura ambiente) fornecendo uma mistura de (3a) e (3b) como um óleo marrom escuro (654,0 g). O material bruto foi armazenado no refrigerador e levado adiante sem outra purificação.
Exemplo 2
Preparação de 2-tetra-hidrofuran-2-il-anilina (4).
Figure img0013
Colocados 5% de paládio sobre carbono (16,3 g, 50% úmidos, 3,83 mmol, Aldrich 330116) em um frasco Parr sob nitrogênio, seguidos por MeOH (100 mL, JT-Baker 909333). Adicionada a mistura bruta de 2-(2- nitrofenil)-2,5-di-hidrofurano e 2-(2-nitrofenil)-2,3-di-hidrofurano (3a&3b)) (163 g) dissolvida em MeOH (389 mL), seguida por NEt3 (237,6 mL, 1,705 mol, Sigma-Aldrich 471283). Colocado o vaso em um agitador Parr e satura-do com H2. Adicionados 2,10 kg/cm2 (30 psi) de H2 e sacudidos até a con-sumação completa (LCMS e RMN mostraram completa reação). A mistura de reação foi purgada com nitrogênio, filtrada através de Celite™ e enxaguada com EtOAc. O filtrado foi concentrado em um evaporador rotatório fornecendo um óleo marrom. Repetida a reação mais três vezes sobre a mesma escala e as bateladas foram combinadas para purificação. O produto bruto foi destilado a vácuo (aproximadamente 15 torr) coletando o destilado a 108 - 129 °C para fornecer ( 4) como um óleo amarelo tênue transparente (427,9 g, a produção média foi 84 %; 98 % de pureza de GCMS). LCMS (co-luna C18 eluindo com 10 a 90 % de gradiente de CH3CN / água durante 5 minutos com modificador de ácido fórmico) M+1: 163,95 (1,46 min). 1H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 7,15 - 7,04 (m, 2H), 6,77 - 6,62 (m, 2H), 4,85 - 4,77 (m, 1H), 4,18 (s, 2H), 4,12 - 4,02 (m, 1H), 3,94 - 3,85 (m, 1H), 2,25 - 1,95 (m, 4H) ppm.
Exemplo 2a
Preparação de (R)-2-(tetra-hidrofuran-2-il)anilina (4a).
Figure img0014
Dissolvidos 33 g de composto (4) em MeOH (265 ml) o que re-sultou em uma concentração de aproximadamente 125 mg/ml. A mistura foi filtrada através de um filtro de membrana de 0,2 mícron em seguida croma- tografada em uma coluna ChiralPak® IC (30 mm X 150 mm, temperatura de coluna 35 OC, Chiral Technologies) a 100 bar usando um sistema cromato- gráfico de fluido supercrítico multigrama Berger. A fase móvel foi (90:10) de CO2:CH3OH eluindo a 350 ml/min com monitoramento de UV a 220 nanometros. Obtidos 15,64 g de produto desejado (4a) como um óleo verde. SFC analítica ([90:10] de CO2:CH3OH, a 5 ml/min em uma coluna ChiralPak IC (4,6 X 100 mm) mantida a 35 oC e executada em pressão de 100 bar com monitoramento de UV a 220 nm) mostrou 95,5 % ee com 95% de pureza total.
Exemplo 3
Preparação de 4-bromo-2-tetra-hidrofuran-2-il-anilina (5).
Figure img0015
A uma solução agitada de 2-tetra-hidrofuran-2-il-anilina (4) (53,45 g, 327,5 mmol) em terc-butil éter de metila (MTBE, 641,4 mL) e ace- tonitrila (213,8 mL) resfriada para 2 °C foi adicio nado N-bromossuccinimida (58,88 g, 99 %, 327,5 mmol, Aldrich B81255) em 4 porções mantendo a temperatura interna abaixo de cerca de 8 °C. A mist ura de reação foi agitada ao mesmo tempo que resfriando com um banho de água gelada durante 30 minutos (RMN de uma alíquota elaborada mostrou completa consumação de material de partida). Adicionado Na2S2O3 1 N aquoso (330 mL), removido o banho frio e agitado durante 20 minutos. A mistura foi diluída com EtOAc e as camadas foram separadas. A fase orgânica foi lavada com NaHCO3 a-quoso saturado (2 x), água, salmoura, secada sobre MgSO4, filtrada através de um tampão curto de sílica, eluída com EtOAc, e concentrada sob pressão reduzida para fornecer (5) como um óleo âmbar muito escuro (82,25 g, 7794 % de pureza de HPLC). Levado adiante sem outra purificação. LCMS (coluna C18 eluindo com 10 a 90% de gradiente de CH3CN/água durante 5 minutos com modificador de ácido fórmico) M+1: 242,10 (2,89 min). 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 7,22 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 7,16 (dd, J = 8,4, 2,3 Hz, 1H), 6,54 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,79 - 4,73 (m, 1H), 4,15 (s, 2H), 4,10 - 4,01 (m, 1H), 3,93 - 3,85 (m, 1H), 2,26 - 2,13 (m, 1H), 2,12 - 1,97 (m, 3H) ppm.
Exemplo 4
Preparação de N-(4-bromo-2-nitro-6-tetra-hidrofuran-2-il-fenil)-2,2,2-trifluoro- acetamida (6).
Figure img0016
Ao anidrido trifluoroacético (455,3 mL, 3,275 mol, Sigma-Aldrich 106232) agitando a 2°C foi lentamente adicionado 4- bromo-2-tetra- hidrofuran-2-il-anilina (5) (79,29 g, 327,5 mmol) como um óleo espesso por meio de funil de adição durante 15 minutos (temperatura de reação elevada para 14 °C). O óleo restante foi enxaguado na mistu ra de reação com 2- metiltetra-hidrofurano anidroso (39,6 mL, Sigma-Aldrich 414247). O banho frio foi removido e nitrato de amônio (34,08 g, 425,8 mmol, Aldrich 467758) foi adicionado. A temperatura de reação elevada para 40 °C durante cerca de 30 minutos tempo no qual um banho de água fria foi usado para controlar o exotermo e trazer a reação para temperatura ambiente. O banho frio foi em seguida removido e a agitação continuada durante mais 40 minutos (HPLC mostrou muito pouco material não nitrado restante). A mistura de reação foi lentamente vertida na mistura em agitação de gelo esmagado (800 g). O precipitado sólido foi coletado por filtração, lavado com água, NaHCO3 aquoso saturado (para pH 8), água novamente, e hexano. O sólido úmido foi secado primeiro em um forno de convecção a 50 °C du rante diversas horas e em seguida sob pressão reduzida em um forno a 40 °C durante a noite fornecendo (6) como um sólido marrom claro (77,86 g, 62 % de produção; 98 % de pureza de HPLC). LCMS (coluna C18 eluindo com 10 a 90 % de gradiente de CH3CN / água durante 5 minutos com modificador de ácido fórmico) M+1: 383,19 (3,27 min). 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 9,81 (s, 1H), 8,08 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,73 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 4,88 (dd, J = 9,0, 6,5 Hz, 1H), 4,17 - 4,08 (m, 1H), 4,03 - 3,95 (m, 1H), 2,45 - 2,34 (m, 1H),2,17 - 2,06 (m, 2H), 1,96 - 1,83 (m, 1H) ppm.
Exemplo 5
Preparação de 4-bromo-2-nitro-6-tetra-hidrofuran-2-il-anilina (6a).
Figure img0017
N-(4-bromo-2-nitro-6-tetra-hidrofuran-2-il-fenil)-2,2,2-trifluoro- acetamida (6) dissolvido (54,00 g, 140,9 mmol) em 1,4-dioxano (162 mL) e adicionado NaOH a 6 M aquoso (70,45 mL, 422,7 mmol, JT-Baker 567202). A mistura de reação foi agitada ao refluxo durante 2 dias (HPLC mostrou completa conversão), deixada resfriar, diluída com MTBE (800 mL), lavada com água (2 x 200 mL), NH4Cl aquoso saturado, água e salmoura. A mistura foi secada sobre MgSO4, filtrada, e concentrada sob pressão reduzida para fornecer (6a) como um óleo âmbar escuro (40,96 g, 93 % de produção; total de 92% de HPLC mais pureza de RMN). LCMS (coluna C18 eluindo com 10 a 90 % de gradiente de MeOH / água de 3 a 5 minutos com modificador de ácido fórmico) M+1: 287,28 (3,44 min). 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,24 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,41 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,91 (s, 2H), 4,80 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 4,14 - 4,05 (m, 1H), 3,98 - 3,90 (m, 1H), 2,36 - 2,19 (m, 1H), 2,15 - 2,01 (m, 3H) ppm.
Exemplo 6
Preparação de 2-[5-(4-amino-3-nitro-5-tetra-hidrofuran-2-il-fenil)pirimidin-2- Il]propan-2-ol (8).
Figure img0018
Misturados 4-bromo-2-nitro-6-tetra-hidrofuran-2-il-anilina (6a) (40,40 g, 92 %, 129,5 mmol), 1,4-dioxano (260 mL, Sigma-Aldrich 360481), 2-[5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)pirimidin-2-Il]propan-2-ol (7) (41,05 g, 155,4 mmol), e Na2CO3 a 2,7 M aquoso (143,9 mL, 388,5 mmol). Uma corrente de nitrogênio foi borbulhada através da mistura em agitação durante 1 hr, seguida por adição de tetracis(trifenilfosfina)paládio (0) (7,48 g, 6,47 mmol, Strem 462150). A mistura de reação foi agitada ao refluxo duran-te 2 horas (HPLC mostrou completa reação), deixada resfriar, diluída com EtOAc, lavada com água, NH4Cl aquoso saturado, salmoura, secada sobre MgSO4, e filtrada através de um tampão curto de Florisil® eluindo com EtO- Ac. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida fornecendo um óleo mar- rom escuro. Dissolvido em CH2Cl2 e eluído através de um tampão curto de sílica-gel com CH2Cl2 e em seguida EtOAc. A fração desejada foi concentra-da em um evaporador rotatório até um precipitado formar-se fornecendo uma suspensão marrom espessa, que foi triturada com MTBE. O sólido foi coletado por filtração, lavado com MTBE, e secado sob vácuo elevado for-necendo (8) como um sólido amarelo (35,14 g, 99% de pureza de HPLC,). LCMS (coluna C18 eluindo com 10 a 90% de gradiente de CH3CN/água du-rante 5 minutos com modificador de ácido fórmico) M+1: 345,00 (2,69 min). 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,88 (s, 2H), 8,36 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,56 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,09 (s, 2H), 4,92 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 4,62 (s, 1H), 4,20 - 4,11 (m, 1H), 4,03 - 3,94 (m, 1H), 2,39 - 2,26 (m, 1H), 2,23 - 2,08 (m, 3H), 1,64 (s, 6H) ppm. O filtrado foi também concentrado e purificado por cromatografia de sílica-gel ISCO eluindo com 0 a 80 % de EtOAc / hexano fornecendo uma segunda colheita de produto (8) como um sólido âmbar (4,46 g, 88 % de produção total; 88 % de pureza de HPLC.
Exemplo 7
Preparação alternada de 2-[5-(4-amino-3-nitro-5-tetra-hidrofuran-2-ilfenil)pirimidin-2-Il]propan-2-ol (8).
Figure img0019
Misturados N-(4-bromo-2-nitro-6-tetra-hidrofuran-2-il-fenil)-2,2,2- trifluoro-acetamida (6) (19,00 g, 49,59 mmol), 2-[5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2- dioxaborolan-2-il)pirimidin-2-Il]propan-2-ol (7) (14,41 g, 54,55 mmol), carbo-nato de sódio a 2,7 M aquoso (73,48 mL, 198,4 mmol), e 1,4-dioxano (190 mL, Sigma-Aldrich 360481). Uma corrente de nitrogênio foi borbulhada atra-vés da mistura em agitação durante 40 minutos, seguida por adição de aduto de diclorometano de dicloropaládio de 1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno (2,025 g, 2,480 mmol, Strem 460450). A mistura de reação foi agitada ao refluxo sob N2 durante 7 horas, adicionados mais 50 mL de carbonato de sódio a- quoso saturado, e refluxados durante mais 16 horas. A mistura foi deixada resfriar, em seguida diluída com EtOAc (500 mL) e água (200 mL). As ca-madas foram separadas e a fase aquosa extraída com EtOAc (200 mL). A fase orgânica combinada foi lavada com água (500 mL), salmoura (500 mL), secada sobre Na2SO4, filtrada através de um tampão de Florisil®, e concen-trada em um evaporador rotatório para fornecer (8) bruto como um óleo la-ranja. O produto bruto foi purificado por cromatografia de sílica-gel ISCO elu- indo com 20 a 90% de EtOAc / hexano para fornecer (8) como um sólido laranja (15,00 g, 87 % de produção; 81-88 % de pureza). LCMS (coluna C18 eluindo com 10 a 90 % de gradiente de CH3CN / água durante 5 minutos com modificador de ácido fórmico) M+1: 345,35 (2,68 min). 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,88 (s, 2H), 8,36 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,56 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,09 (s, 2H), 4,92 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 4,62 (s, 1H), 4,20 - 4,11 (m, 1H), 4,03 - 3,94 (m, 1H), 2,39 - 2,26 (m, 1H), 2,23 - 2,08 (m, 3H), 1,64 (s, 6H) ppm.
Exemplo 8
Preparação de 2-[5-(3,4-diamino-5-tetra-hidrofuran-2-il-fenil)pirimidin-2- Il]propan-2-ol (9).
Figure img0020
A uma suspensão de 2-[5-(4-amino-3-nitro-5-tetra-hidrofuran-2-il- fenil)pirimidin-2-Il]propan-2-ol (8) (30,10 g, 87,41 mmol) e THF (90 mL) em um frasco Parr sob nitrogênio foi adicionada uma suspensão de 5% de palá-dio sobre carbono (3,01 g, 50 % úmidos, 0,707 mmol, Aldrich 330116) em MeOH (90 mL, JT-Baker 909333), seguida por NEt3 (24,37 mL, 174,8 mmol, Sigma-Aldrich 471283). Colocado o vaso em um agitador Parr e saturado com H2. Adicionados 3,16 kg/cm2 (45 psi) de H2 e sacudidos até a consuma-ção ser completa (HPLC mostrou completa conversão). A mistura de reação foi purgada com nitrogênio, filtrada através de Celite™ e enxaguada com EtOAc. O filtrado foi novamente filtrado através de um papel filtro de fibra de vidro de 0,5 mícron imprensado entre dois papéis P5, e concentrado sob pressão reduzida fornecendo (9) como uma espuma marrom clara (28,96 g, 98 % de produção; 93 % de pureza de RMN). LCMS (coluna C18 eluindo com 10 a 90% de gradiente de CH3CN / água durante 5 minutos com modifi-cador de ácido fórmico) M+1: 315,32 (1,54 min). 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,83 (s, 2H), 6,92 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 6,88 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 4,90 (dd, J = 7,9, 6,2 Hz, 1H), 4,72 (s, 1H), 4,18 (s, 2H), 4,17 - 4,08 (m, 1H), 3,99 - 3,89 (m, 1H), 3,46 (s, 2H), 2,34 - 2,19 (m, 1H), 2,17 - 2,05 (m, 3H), 1,63 (s, 6H) ppm.
Exemplo 9
Preparação de 1-etil-3-[5-[2-(1-hidróxi-1-metil-etil)pirimidin-5-Il]-7-tetra- hidrofuran-2-il-1 H-benzimidazol-2-Il]ureia (11).
Figure img0021
A uma solução agitada de 2-[5-(3,4-diamino-5-tetra-hidrofuran-2- il-fenil)pirimidin-2-Il]propan-2-ol (9) (32,10 g, 102,1 mmol) em 1,4-dioxano (160,5 mL, Sigma-Aldrich 360481) foi adicionado tampão de pH 3,5 (240,8 mL), preparado dissolvendo triidrato de NaOAc (34,5 g) em H2SO4 aquoso a 1 N (240 mL). Adicionado 1-etil-3-(N-(etilcarbamoil)-C-metilsulfanil- carbonimidoil)ureia (10) (28,46 g, 122,5 mmol, CB Research e Development) e agitado ao refluxo durante a noite (HPLC mostrou 99 % de consumação de diamina de partida). A mistura de reação foi resfriada para temperatura am-biente e vertida porção a porção (espumando) em uma solução agitada de NaHCO3 saturado aquoso (480 mL) e água (120 mL) fornecendo pH 8-9. Isto foi agitado durante 30 minutos, o sólido foi coletado por filtração, lavado co-piosamente com água para pH neutro, e em seguida com mais moderação com EtOH. O sólido foi secado sob pressão reduzida fornecendo (11) como um sólido esbranquiçado (34,48 g, 82 % de produção; 99,4 % de pureza de HPLC). LCMS (coluna C18 eluindo com 10 a 90 % de gradiente de CH3CN / água durante 5 minutos com modificador de ácido fórmico) M+1: 411,41 (1,73 min). 1H RMN (300 MHz, MeOD) δ 9,02 (s, 2H), 7,62 (s, 1H), 7,37 (s, 1H), 5,31 (s, 1H), 4,23 (dd, J = 14,5, 7,3 Hz, 1H), 4,01 (dd, J = 15,0, 7,1 Hz, 1H), 3,38 - 3,28 (m, 2H),2,58 - 2,46 (m, 1H),2,16 - 2,05 (m, 2H), 2,02 - 1,88 (m, 1H), 1,63 (s, 6H), 1,22 (t, J = 7,2 Hz, 3H) ppm.
Exemplo 10
Isolação cromatográfica quiral de 1-etil-3-[5-[2-(1-hidróxi-1-metil-etil)pirimidin- 5-Il]-7-[(2R)-tetra-hidrofuran-2-Il]-1 H-benzimidazol-2-Il]ureia (12).
Figure img0022
Uma amostra racêmica de 1-etil-3-[5-[2-(1-hidróxi-1-metil- etil)pirimidin-5-Il]-7-tetra-hidrofuran-2-il-1H-benzimidazol-2-Il]ureia (11) (24,60 g) foi resolvida em uma coluna CHIRALPAK® IC® (por Chiral Technologies) eluindo com DCM / MeOH / TEA (60 / 40 / 0,1) a 35°C fornecendo o enanti- ômero desejado (12) como um sólido branco (11,35 g, 45% de produção; 99% de pureza de HPLC, 99% ee). Tempo de retenção de HPLC quiral analítico foi de 6,2 min (coluna CHIRALPAK® IC® 4,6 x 250 mm, taxa de fluxo de 1 mL/min, 30 °C).
A estrutura e estereoquímica absoluta de 12 foram confirmadas por análise de difração de raio X de cristal simples. Dados de difração de cristal simples foram adquiridos em um difractômetro Bruker Apex II equipa-do com fonte Cu K-alpha de tubo selado (radiação Cu Kα, Y = 1,54178 A) e um detector Apex II CCD. Um cristal com dimensões de 1/2x 0,05 x 0,05 mm foi selecionado, limpo usando óleo mineral, montado em um MicroMount e centralizado em um sistema Bruker APEXII. Três bateladas de 40 quadros separados em espaço recíproco foram obtidas para fornecer uma matriz de orientação e parâmetros celulares iniciais. Parâmetros celulares finais foram obtidos e refinados após a coleção de dados ser concluída com base no conjunto de dados totais. Baseada nas ausências sistemáticas e estatísticas de intensidades a estrutura foi resolvida e refinada em grupo de espaço P21 acêntrico.
Um conjunto de dados de difração de espaço recíproco foi obtido para uma resolução de 0,9 A usando 0,5° etapas usan do 60 s de exposição para cada quadro. Os dados foram coletados a 100 (2) K. Integração de in-tensidades e refinamento de parâmetros celulares foram realizados usando software APEXII. Observação do cristal após a coleção de dados não mos-trou nenhum sinal de decomposição. Como mostrado na Fig. 1, existem du-as simetrias de moléculas independentes na estrutura e ambas as simetrias de moléculas independentes são isômeros R.
Os dados foram coletados, refinados e reduzidos usando o soft-ware Apex II. A estrutura foi resolvida usando o SHELXS97 (Sheldrick, 1990); programa(s) e a estrutura refinados usando o programa SHELXL97 (Sheldrick, 1997). O cristal mostra célula monoclínica com grupo de espaço P21. Os parâmetros de rede são a = 9,8423(4) A, b = 10,8426(3) A, c = 19,4441 (7) A, β= 102,966(3)°. Volume = 2022,09(12) A3.
Exemplo 11
Preparação do sal de ácido metanossulfônico de 1-etil-3-[5-[2-(1-hidróxi-1- metil-etil)pirimidin-5-Il]-7-[(2R)-tetra-hidrofuran-2-Il]-1 H-benzimidazol-2- iilureia (13).
Figure img0023
Uma suspensão em agitação de 1-etil-3-[5-[2-(1-hidróxi-1-metil- etil)pirimidin-5-ill-7-[(2R)-tetra-hidrofuran-2-ill-1H-benzimidazol-2-illureia (12) (9,32 g, 22,71 mmol) em etanol absoluto (93,2 mL) foi resfriada com um ba-nho de água gelada. Adicionado ácido metanossulfônico (1,548 mL, 23,85 mmol, Sigma-Aldrich 471356), removido o banho frio e agitado em tempera-tura ambiente durante 20 minutos. Ele foi concentrado em um evaporador rotatório a 35°C para uma suspensão espessa, diluíd o com EtOAc, coletado o sólido por filtração, lavado com EtOAc, e secado sob pressão reduzida fornecendo uma colheita inicial de (13) como um sólido branco (8,10 g). O filtrado foi concentrado em um rotavap fornecendo uma espuma vítrea ama-relada, que foi dissolvida em EtOH, concentrada para uma suspensão sólida, triturada com EtOAc / Et2O, e coletada por filtração. O sólido foi lavado com EtOAc / Et2O, combinado com a primeira colheita, e secado sob pressão reduzida fornecendo (13) como um sólido branco (9,89 g, 86 % de produção; 99 % de pureza de HPLC, 99% de ee). HPLC quiral analítica mostra um e- nantiômero com tempo de retenção de 6,3 min eluindo com DCM / MeOH / TEA (60 / 40 / 0,1) em uma coluna CHIRALPAK® IC® 4,6 x 250 mm com taxa de fluxo de 1 mL/min a 30 °C. LCMS (coluna C18 eluindo com 10 a 90 % de gradiente de CH3CN / água durante 5 minutos com modificador de áci-dofórmico) M+1: 411,53 (1,74 min). 1H RMN (300 MHz, MeOD) δ 9,07 (s, 2H), 7,79 (s, 1H), 7,62 (s, 1H), 5,30 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 4,24 (dd, J = 14,6, 7,3 Hz, 1H), 4,04 (dd, J = 15,0, 7,6 Hz, 1H), 3,40 - 3,30 (m, 2H),2,72 (s, 3H), 2,65 - 2,54 (m, 1H),2,20 - 2,07 (m, 2H), 2,04 - 1,90 (m, 1H), 1,64 (s, 6H), 1,23 (t, J = 7,2 Hz, 3H) ppm.
Exemplo 12
Preparação de 2-(2-flúor-6-nitro-fenil)-2,3-di-hidrofurano (15A) e 2-(2-flúor-6- nitro-fenil)-2,5-di-hidrofurano (15B).
Figure img0024
2-Bromo-1-flúor-3-nitro-benzeno (14) (200,3 g, 98%, 892,3 mmol, Bosche F6657), 1,4-dioxano (981,5 mL, Sigma-Aldrich 360481), e 2,3- di-hidrofurano (2) (341,1 mL, 99 %, 4,462 mol, Aldrich 200018) foram carre-gados em um frasco de reação, seguidos por N,N-di-isopropiletilamina (155,4 mL, 892,3 mmol, Sigma-Aldrich 550043) e dímero de bromo(tri-terc- butilfosfina)paládio(I) (6,936 g, 8,923 mmol, Johnson Matthey C4099). A mis-tura foi agitada ao refluxo durante 2 hrs (HPLC mostrou 98% de consumação de arilbrometo de partida). Ela foi deixada resfriar, o precipitado foi removido por filtração, enxaguado com EtOAc, e o filtrado concentrado em vácuo para um óleo semissólido marrom avermelhado escuro. Isto foi dissolvido em CH2Cl2, eluído através de um tampão de sílica com CH2Cl2, e concentrado em vácuo fornecendo uma mistura de 15A e 15B como um óleo âmbar escuro (291,3 g). O produto bruto foi levado adiante sem outra purificação. O produto maior foi 2-(2-flúor-6-nitro-fenil)-2,3-di-hidrofurano (15A) (96 %): LCMS (coluna C18 eluindo com 10 a 90 % de gradiente de CH3CN / água durante 5 minutos com modificador de ácido fórmico) M+1: 210,23 (3,13 min); 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 7,54 (dt, J = 8,0, 1,2 Hz, 1H), 7,43 (td, J = 8,2, 5,2 Hz, 1H), 7,32 (ddd, J = 9,7, 8,3, 1,3 Hz, 1H), 6,33 (dd, J = 4,9, 2,4 Hz, 1H), 5,80 (t, J = 10,9 Hz, 1H), 5,06 (q, J = 2,4 Hz, 1H), 3,18 - 3,07 (m, 1H), 2,94 - 2,82 (m, 1H) ppm. O produto menor foi 2-(2-flúor-6-nitro-fenil)- 2,5-di-hidrofurano (15B) (4%): GCMS (coluna Agilent HP-5MS 30 m x 250 μm x 0,25 μm aquecendo a 60 °C durante 2 min a 300° C durante 15 min com uma taxa de fluxo de 1 mL/min) M+1: 210 (11,95 min). 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 7,47 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,43 - 7,34 (m, 1H), 7,30 - 7,23 (m, 1H), 6,21 - 6,15 (m, 1H), 6,11 - 6,06 (m, 1H), 5,97 - 5,91 (m, 1H), 4,89 - 4,73 (m, 2H) ppm.
Exemplo 13
Preparação de 3-flúor-2-tetra-hidrofuran-2-il-anilina (16).
Figure img0025
Colocados 5% de paládio sobre carbono (37,3 g, 50 % úmido, 8,76 mmol, Aldrich 330116) em um frasco Parr sob nitrogênio, seguidos por MeOH (70 mL, JT-Baker 909333). Adicionada a mistura bruta de 2-(2-flúor-6- nitro-fenil)-2,3-di-hidrofurano e 2-(2-flúor-6-nitro-fenil)-2,5-di-hidrofurano (15A&15B) (186,6 g, 892,1 mmol) dissolvida em MeOH (117 mL), seguida por NEt3 (124,3 mL, 892,1 mmol, Sigma-Aldrich 471283). Colocado o vaso em um agitador Parr e saturado com H2. Após adicionar 3,16 kg/cm2 (45 psi) de H2, a mistura de reação foi agitada até a consumação do material de par-tida ser concluída (HPLC e LCMS mostraram completa reação). A mistura de reação foi purgada com nitrogênio, filtrada através de Celite™ e enxaguada com EtOAc. O filtrado foi concentrado em um evaporador rotatório fornecen-do um óleo marrom, que foi dissolvido em Et2O e lavado com água (2x). A fase de éter foi extraída com HCl a 1 N aquoso (5 x 250 mL), que foi lavado com Et2O (3x) e em seguida basificado com NaOH a 6 N aquoso para pH 12-14. A fase aquosa básica foi extraída com CH2Cl2 (4x), e o extrato orgânico combinado lavado com NH4Cl aquoso saturado, secado sobre MgSO4, e filtrado através de uma almofada de sílica eluindo com CH2Cl2 a 25 % de EtOAc / hexano. O filtrado desejado foi concentrado sob pressão reduzida fornecendo 16 como um óleo marrom claro (121,8 g, 84% de GCMS mais pureza de RMN). GCMS (coluna Agilent HP-5MS 30 m x 250 μm x 0,25 μm aquecendo a 60°C durante 2 min a 300°C durante 15 m in com uma taxa de fluxo de 1 mL/min ) M+1: 182,0 (11,44 min). LCMS (coluna C18 eluindo com 10 a 90% de gradiente de CH3CN / água durante 5 minutos com modificador de ácido fórmico) M+1: 182,10 (2,61 min). 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 6,97 (td, J = 8,1, 6,3 Hz, 1H), 6,43 - 6,35 (m, 2H), 5,21 - 5,13 (m, 1H), 4,54 (s, 2H), 4,16 - 4,07 (m, 1H), 3,90 - 3,81 (m, 1H), 2,23 - 2,00 (m, 4H) ppm. Mais colheitas foram obtidas como segue: a fase de éter combinada foi lavada com NaHCO3 aquoso saturado, salmoura, secada sobre Na2SO4, decantada, e concentrada sob pressão reduzida. O óleo foi destilado a vácuo (aproxi-madamente 15 torr) coletando o destilado a 101 - 108°C. A uma solução agi-tada do óleo destilado em EtOH (1 volume) a 2°C foi lentamente adicionado HCl a 5 M (1 eq) em iPrOH. A suspensão resultante foi trazida para tempera-tura ambiente, diluída com EtOAc (3 volumes, vol/vol), e agitada durante 2 horas. O sólido branco foi coletado por filtração, lavado com EtOAc, e secado sob pressão reduzida fornecendo uma segunda colheita de produto como o sal de HCl. O líquido mãe foi concentrado para uma suspensão, diluído com EtOAc e o sólido coletado por filtração, lavado com EtOAc, e secado em vácuo fornecendo o sal de HCl como uma terceira colheita do produto. LCMS (coluna C18 eluindo com 10 a 90 % de gradiente de CH3CN / água durante 5 minutos com modificador de ácido fórmico) M+1: 182,10 (2,58 min). 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 10,73 (br.s, 3H), 7,66 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,33 (td, J = 8,2, 5,9 Hz, 1H), 7,13 - 7,05 (m, 1H), 5,26 (dd, J = 9,0, 6,5 Hz, 1H), 4,38 - 4,28 (m, 1H), 4,00 - 3,91 (m, 1H), 2,59 - 2,46 (m, 1H), 2,30 - 1,95 (m, 3H) ppm. A produção total das três colheitas foi 76%.
Exemplo 14
Preparação de 4-bromo-3-flúor-2-tetra-hidrofuran-2-il-anilina (17).
Figure img0026
A uma solução agitada de 3-flúor-2-tetra-hidrofuran-2-il-anilina (16) (131,9 g, 92 %, 669,7 mmol) em terc-butil éter de metila (1,456 L) e ace- tonitrila (485 mL) resfriada para -20°C foi adicion ada N-bromossuccinimida (120,4 g, 99 %, 669,7 mmol, Aldrich B81255) em 3 porções mantendo a temperatura de reação abaixo de cerca de -15°C. Apó s concluir a adição a agitação foi continuada a -15 a -10 °C durante 30 m inutos. 1H RMN de uma alíquota elaborada mostrou 96% de consumação de anilina de partida então adicionou mais 4,82 g de NBS e agitou a -10°C duran te mais 30 minutos. Na2S2O3 a 1 N aquoso (670 mL) foi adicionado a uma mistura de reação. O banho frio foi removido, a mistura agitada durante 20 minutos, em seguida diluída com EtOAc. As camadas foram separadas e a fase orgânica foi lava-da com NaHCO3 aquoso saturado (2x), água, salmoura, secada sobre Na2SO4, decantada, e concentrada sob pressão reduzida fornecendo um óleo âmbar escuro. O resíduo foi diluído com hexano e eluído através de um tampão curto de sílica eluindo com 25% de EtOAc / hexano a 50 % de EtO- Ac / hexano. O filtrado desejado foi concentrado em vácuo fornecendo 17 como um óleo âmbar escuro (182,9 g, 90 % de produção; 86% de pureza de RMN). LCMS (coluna C18 eluindo com 10 a 90 % de gradiente de CH3CN/ água durante 5 minutos com modificador de ácido fórmico) M+1: 260,12 (3,20 min). 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 7,15 (dd, J = 8,6, 7,6 Hz, 1H), 6,30 (dd, J = 8,7, 1,3 Hz, 1H), 5,19 - 5,12 (m, 1H), 4,58 (s, 2H), 4,16 - 4,07 (m, 1H), 3,90 - 3,81 (m, 1H), 2,23 - 1,99 (m, 4H) ppm.
Exemplo 15
Preparação de N-(4-bromo-3-flúor-6-nitro-2-tetra-hidrofuran-2-il-fenil)-2,2,2- trifluoro-acetamida (18).
Figure img0027
Ao anidrido trifluoroacético (565,3 mL, 4,067 mol, Sigma-Aldrich 106232) agitando a 2°C foi lentamente adicionado 4-bromo-3-flúor-2-tetra- hidrofuran-2-il-anilina puro (17) (123,0 g, 86%, 406,7 mmol) como um óleo espesso por meio de funil de adição durante cerca de 20 minutos (tempera-tura de reação elevada para 13°C). O óleo restante foi enxaguado na mistura de reação com THF anidroso (35 mL). O banho frio foi removido e a reação foi aquecida para 35°C, seguida por adição porção a porção de NH4NO3 (4,88 g x 20 porções, 1,22 mol, Sigma-Aldrich A7455) durante 2,5 hrs man-tendo a temperatura de reação entre 30 e 41°C usand o um banho de água gelada somente quando necessário para controlar o exotermo. Após concluir a adição, a mistura de reação foi agitada durante mais 10 minutos (HPLC mostrou 99% de reação concluída). Ela foi lentamente vertida em gelo es-magado (1,23 kg) e agitada durante 1 hr para permitir a formação de um precipitado sólido filtrável, que foi coletado e lavado com água, moderada-mente com NaHCO3 aquoso saturado, e água novamente (para pH 7). O produto foi secado em um forno de convecção durante a noite a 40°C e em seguida sob pressão reduzida em um forno a 50°C dur ante a noite forne-cendo18 como um sólido bege (152,5 g, 90 % de produção; 96% de pureza de HPLC). LCMS (coluna C18 eluindo com 10 a 90 % de gradiente de CH3CN/ água durante 5 minutos com modificador de ácido fórmico) M+1: 401,30 (3,41 min),1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 10,56 (s, 1H), 8,19 (d, J = 6,6 Hz, 1H), 5,22 (dd, J = 10,3, 6,4 Hz, 1H), 4,22 (dd, J = 15,8, 7,2 Hz, 1H), 3,99 (dd, J = 16,1, 7,5 Hz, 1H), 2,50 - 2,38 (m, 1H), 2,22 - 2,11 (m, 2H), 1,86 - 1,71 (m, 1H) ppm.
Exemplo 16
Preparação de 4-bromo-3-flúor-6-nitro-2-tetra-hidrofuran-2-il-anilina (19).
Figure img0028
Um frasco de reação foi carregado com N-(4-bromo-3-flúor-6- nitro-2-tetra-hidrofuran-2-il-fenil)-2,2,2-trifluoro-acetamida (18) (242,3 g, 604,1 mmol), 1,4-dioxano (1,212 L), ácido sulfúrico a 2 M aquoso (362,4 mL, 724,9 mmol), e agitado ao refluxo durante 5 dias (HPLC mostrou 98% de conversão). Deixado resfriar, diluído com EtOAc, neutralizado com NaHCO3 aquoso saturado, separadas as camadas, e novamente extraída a fase a-quosa com EtOAc (2x). A fase orgânica combinada foi lavada com salmoura (2x), secada sobre MgSO4, filtrada e concentrada em vácuo fornecendo 19 como um sólido marrom esverdeado (181,7 g, 94 % de produção; 95 % de pureza de HPLC). O produto foi levado para a próxima etapa sem outra puri-ficação. LCMS (coluna C18 eluindo com 10 a 90% de gradiente de CH3CN / água durante 5 minutos com modificador de ácido fórmico) M+1: 305,20 (3,63 min). 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,35 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 7,45 (s, 2H), 5,23 - 5,16 (m, 1H), 4,23 - 4,14 (m, 1H), 3,93 - 3,84 (m, 1H), 2,31 - 1,96 (m, 4H) ppm.
Exemplo 17
Preparação de 2-[5-(4-amino-2-flúor-5-nitro-3-tetra-hidrofuran-2-il- fenil)pirimidin-2-Il]propan-2-ol (20).
Figure img0029
A uma solução agitada de 4-bromo-3-flúor-6-nitro-2-tetra- hidrofuran-2-il-anilina (19) (525,0 g, 1,721 mol, Bridge Organics Co.) em 1,4- dioxano (4,20 L, Sigma-Aldrich 360481) foi adicionada uma solução aquosa a 1,2 M de NaHCO3 (4,302 L, 5,163 mol). Uma corrente de nitrogênio foi borbulhada através da mistura em agitação durante 2 horas, seguida por adição de 2-[5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)pirimidin-2- Il]propan-2-ol (7) (545,4 g, 2,065 mol, Bridge Organics Co.) e aduto de diclo- rometano de dicloropaládio de 1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno (42,16 g, 51,63 mmol, Strem 460450). A mistura de reação foi agitada ao refluxo durante a noite, deixada resfriar, diluída com EtOAc (8,4 L), e as camadas foram separadas. A fase orgânica foi lavada com NH4Cl aquoso saturado e em seguida salmoura. A fase aquosa foi novamente extraída com EtOAc (4 L) e lavado este extrato orgânico com salmoura. A fase orgânica combinada foi secada sobre MgSO4, filtrada através de um tampão curto de Florisil®, eluída com EtOAc, e o filtrado concentrado em um evaporador rotatório fornecendo um sólido úmido marrom escuro. Isto foi dissolvido em CH2Cl2, carregado em uma almofada de sílica-gel, eluído com hexano, em seguida 25% de EtOAc / hexano, e em seguida 50 % de EtOAc / hexano. O filtrado desejado foi concentrado em um evaporador rotatório para uma suspensão espessa, e o sólido foi coletado por filtração, triturado com MTBE, e secado em vácuo fornecendo 20 como um sólido amarelo brilhante (55,8% de produção, 90-97% de pureza de HPLC). O filtrado foi concentrado e a purificação acima foi repetida fornecendo uma segunda colheita de 20 como um sólido amarelo brilhante (19,7% de produção). O filtrado foi novamente concentrado fornecendo um óleo marrom escuro e isto foi carregado em a coluna de síli-ca com tolueno e CH2Cl2 mínimo. Ele foi eluído com EtOAc / hexano (0 % a 50 %). As frações desejadas foram concentradas para uma suspensão e diluídas com MTBE / hexano. O sólido foi coletado por filtração e lavado com MTBE mínimo fornecendo a terceira colheita de 20 como um sólido amarelo brilhante (4,9 % de produção) com uma produção total de 80 % das três co-lheitas. LCMS (coluna C18 eluindo com 10 a 90 % de gradiente de CH3CN / água durante 5 minutos com modificador de ácido fórmico) M+1: 363,48 (2,95 min). 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,84 (d, J = 1,6 Hz, 2H), 8,27 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,62 (s, 2H), 5,31 - 5,24 (m, 1H), 4,63 (s, 1H), 4,27 - 4,18 (m, 1H), 3,97 - 3,87 (m, 1H), 2,33 - 2,05 (m, 4H), 1,64 (s, 6H) ppm.
Exemplo 18
Preparação de 2-[5-(4,5-diamino-2-flúor-3-tetra-hidrofuran-2-il-fenil)pirimidin- 2-Il]propan-2-ol (21).
Figure img0030
Colocados 5% de paládio sobre carbono (14,21 g, 50 % úmido, 3,339 mmol, Aldrich 330116) em um frasco Parr sob nitrogênio, seguido por MeOH (242 mL, JT-Baker 909333) e NEt3 (46,54 mL, 333,9 mmol, Sigma- Aldrich 471283). Dissolvido 2-[5-(4-amino-2-flúor-5-nitro-3-tetra-hidrofuran-2- il-fenil)pirimidin-2-Il]propan-2-ol (20) (121,0 g, 333,9 mmol) em THF quente (360 mL), deixado resfriar, adicionado a uma mistura de reação, e enxagua-do com outra porção de THF (124 mL). Colocado o vaso em um agitador Parr e saturado com H2. Adicionados 3,16 kg/cm2 (45 psi) de H2 e sacudidos até a consumação ser completa (HPLC e LCMS mostraram completa reação). A mistura de reação foi purgada com nitrogênio, filtrada através de Ce- lite™ e enxaguada com EtOAc. Ela foi novamente filtrada através de papel (microfibra de vidro) e o filtrado concentrado em vácuo. Repetida a reação mais três vezes sobre a mesma escala e as bateladas foram combinadas fornecendo 21 como um sólido marrom (447 g, 99 % de produção; 93 % de pureza de HPLC). LCMS (coluna C18 eluindo com 10 a 90 % de gradiente de CH3CN / água durante 5 minutos com modificador de ácido fórmico) M+1: 333,46 (1,79 min). 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,81 (d, J = 1,4 Hz, 2H), 6,69 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 5,27 - 5,20 (m, 1H), 4,73 (s, 1H), 4,70 (s, 2H), 4,23 - 4,14 (m, 1H), 3,94 - 3,86 (m, 1H), 3,22 (s, 2H), 2,32 - 2,22 (m, 1H), 2,18 - 1,99 (m, 3H), 1,63 (s, 6H) ppm.
Exemplo 19
Preparação de 1 -etil-3-[6-flúor-5-[2-(1-hidróxi-1 -metil-etil)pirimidin-5-Il]-7- tetra-hidrofuran-2-il-1 H-benzimidazol-2-Il]ureia (22).
Figure img0031
A uma suspensão em agitação de 2-[5-(4,5-diamino-2-flúor-3- tetra-hidrofuran-2-il-fenil)pirimidin-2-Il]propan-2-ol (21) (111,3 g, 334,9 mmol) e 1,4-dioxano (556,5 mL, Sigma-Aldrich 360481) foi adicionado 1-etil-3-(N- (etilcarbamoil)-C-metilsulfanil-carbonimidoil)ureia (10) (93,36 g, 401,9 mmol, CB Research e Development) seguido por um tampão de pH 3,5 (1,113 L), preparado dissolvendo triidrato de NaOAc (158,1 g) em H2SO4 aquoso a 1 N (1,100 L). A mistura de reação foi agitada ao refluxo durante a noite (HPLC mostrou completa conversão), resfriada para temperatura ambiente, e vertida porção a porção (espumando) em uma solução agitada de NaHCO3 saturado aquoso (2,23 L) fornecendo pH 8-9. Isto foi agitado durante 30 minutos, o sólido foi coletado por filtração, lavado copiosamente com água para pH neutro, e em seguida com mais moderação com EtOH. O sólido foi secado sob pressão reduzida fornecendo 22 como um sólido amarelado esbranqui-çado (135,2 g, 94 % de produção; 99 % de pureza de HPLC). LCMS (coluna C18 eluindo com 10 a 90% de gradiente de CH3CN / água durante 5 minutos com modificador de ácido fórmico) M+1: 429,58 (2,03 min). 1H RMN (300 MHz, MeOD) δ 8,95 (d, J = 1,6 Hz, 2H), 7,45 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 5,38 (br.s, 1H), 4,27 (dd, J = 14,9, 7,1 Hz, 1H), 4,01 (dd, J = 15,1, 7,0 Hz, 1H), 3,37 - 3,29 (m, 2H), 2,55 (br.s, 1H), 2,19 - 2,07 (m, 2H), 2,02 - 1,82 (br.s, 1H), 1,63 (s, 6H), 1,21 (t, J = 7,2 Hz, 3H) ppm.
Exemplo 20
Isolação cromatográfica quiral de 1-etil-3-[6-flúor-5-[2-(1-hidróxi-1-metil- etil)pirimidin-5-Il]-7-[(2R)-tetra-hidrofuran-2-Il]-1 H-benzimidazol-2-Il]ureia (23).
Figure img0032
Uma amostra racêmica de 1-etil-3-[6-flúor-5-[2-(1-hidróxi-1-metiletil)pirimidin-5-Il]-7-tetra-hidrofuran-2-il-1H-benzimidazol-2-Il]ureia (22) (133,60 g) foi resolvida em uma coluna CHIRALPAK® IC® (por Chiral Tech-nologies) eluindo com DCM / MeOH / TEA (60 / 40 / 0,1) a 25°C fornecendo o enantiômero desejado 23 como um sólido esbranquiçado (66,8 g, 45% de produção; 99,8% de pureza de HPLC, 99% ee). Tempo de retenção de H- PLC quiral analítico foi 7,7 min (coluna CHIRALPAK® IC® 4,6 x 250 mm, taxa de fluxo de 1 mL/min, 30°C). O sólido foi suspenso em 2:1 de EtOH / Et2O (5 volumes), agitado durante 10 minutos, coletado por filtração, lavado com 2:1 de EtOH / Et2O, e secado sob pressão reduzida fornecendo um só-lido branco (60,6 g).
A estrutura e estereoquímica absoluta de 23 foram confirmadas por análise de difração de raio X de cristal simples. Dados de difração de cristal simples foram adquiridos em um difractômetro Bruker Apex II equipa-do com fonte Cu K-alpha de tubo selado (Cu Kα radiação, Y = 1,54178 A) e um detector Apex II CCD. Um cristal com dimensões de 0,15 x 0,15 x 0,10 mm foi selecionado, limpo usando óleo mineral, montado em um MicroMount e centralizado em um sistema Bruker APEXII. Três bateladas de 40 quadros separadas em espaço recíproco foram obtidas para fornecer uma matriz de orientação e parâmetros celulares iniciais. Parâmetros celulares finais foram obtidos e refinados após a coleção de dados ser concluída com base no conjunto de dados totais. Baseada nas ausências sistemáticas e estatísticas de intensidades a estrutura foi resolvida e refinada em grupo de espaço P21 acêntrico.
Um conjunto de dados de difração de espaço recíproco foi obtido para uma resolução de 0,85 A usando etapas de 0,5° usando exposições de 30 s durante cada quadro. Os dados foram coletados a 100 (2) K. Integração de intensidades e refinamento de parâmetros celulares foram realizados u-sando software APEXII. Observação do cristal após a coleção de dados não mostrou nenhum sinal de decomposição. Como mostrado na Fig. 2, existem duas simetrias de moléculas independentes na estrutura e ambas as sime-trias de moléculas independentes são isômeros R.
Os dados foram coletados, refinados e reduzidos usando o soft-ware Apex II. A estrutura foi resolvida usando o SHELXS97 (Sheldrick, 1990); programa(s) e a estrutura refinados usando o pragrama SHELXL97 (Sheldrick, 1997). O cristal mostra célula monoclínica com grupo de espaço P21. Os parâmetros de rede são a = 9,9016(2) A, b = 10,9184(2) A, c = 19,2975(4) A, β= 102,826(1)°. Volume = 2034,19(7) A3.
Exemplo 21
Preparação do sal de ácido metanossulfônico de 1-etil-3-[6-flúor-5-[2-(1- benzimidazol-2-Il]ureia (23A).
Figure img0033
A uma suspensão em agitação de 1-etil-3-[6-flúor-5-[2-(1-hidróxi- 1-metil-etil)pirimidin-5-Il]-7-[(2R)-tetra-hidrofuran-2-Il]-1H-benzimidazol-2- Il]ureia (23) (15,05 g, 35,13 mmol) em diclorometano (60 mL, J.T. Baker 931533) e etanol absoluto (15 mL, Pharmco-AAPER 111000200) foi adicio-nadoácido metanossulfônico (2,392 mL, 36,89 mmol, Sigma-Aldrich 471356). Agitado em temperatura ambiente até uma solução clara ser observada. Adicionado heptano (300 mL) lentamente durante cerca de 1 hr e coletado o precipitado sólido por filtração (usando um papel Whatman qualitativo # 3 no topo de um papel de microfibra de vidro Whatman GF/F). Secado sob pressão reduzida em um forno a vácuo (dessecado com sulfato de cálcio e hidróxido de potássio) durante a noite a 40°C fornecendo 23A como um sólido branco (13,46 g, 99% de pureza de HPLC, 99% ee). HPLC quiral analítica mostra um enantiômero com tempo de retenção de 8,6 min eluindo com CH2Cl2 / MeOH / TEA (60 / 40 / 0,1) em uma coluna CHIRALPAK® IC® 4,6 x 250 mm com taxa de fluxo de 1 mL/min a 30°C. Uma segunda colheita de produto sólido branco 23A (4,36 g, 98% de pureza de HPLC, 99% ee) foi obtida do filtrado. LCMS (coluna C18 eluindo com 10 a 90 % de gradiente de CH3CN / água durante 5 minutos com modificador de ácido fórmico) M+1: 429,58 (2,03 min). 1H RMN (300 MHz, MeOD) δ 9,00 (d, J = 1,6 Hz, 2H), 7,67 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 5,39 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 4,30 (dd, J = 14,9, 6,9 Hz, 1H), 4,03 (dd, J = 14,8, 7,7 Hz, 1H), 3,40 - 3,31 (m, 2H), 2,72 (s, 3H), 2,70 - 2,60 (m, 1H), 2,21 - 2,08 (m, 2H), 1,98 - 1,84 (m, 1H), 1,65 (s, 6H), 1,22 (t, J = 7,2 Hz, 3H) ppm. O (R)-1-etil-3-(6-flúor-5-(2-(2-hidroxipropan-2-il)pirimidin-5-il)-7- (tetra-hidrofuran-2-il)-1H-benzo[d]imidazol-2-il)ureia 23 pode em seguida ser convertido para os profármacos de fosfato ou sal de fosfato de acordo com os esquemas estabelecidos abaixo.
Figure img0034
Os reagentes e condições: (a) N,N-di-isopropilfosforamidita de dibenzila, tetrazol, 23 °C, DMF; (b) mCPBA, 0-23 °C , DMF; (c) H2, Pd/C, M+OH- ou D2+(OH-)2, EtOH, H2O; (d) aq H+; (e) aq M+OH-.
Compostos de fórmula (IB) podem ser preparados de composto 23 como mostrado no Esquema 1. Na etapa 1, composto 23 é tratado com N,N-di-isopropilfosforamidita de dibenzila e tetrazol, seguidos por ácido me- ta-cloroperoxibenzoico (mCPBA), para fornecer fosfato de dibenzila 24. Na etapa 2, hidrogenólise de 24 na presença de M+OH- ou D2+(OH-)2 fornece a forma dianiônica do composto de fórmula (IB) (X = -PO(O’)2^2M+ ou -PO(O’)2^D2+). A forma de ácido livre do composto de fórmula (IB) (X = PO(OH)2) pode ser obtido tratando a forma dianiônica com ácido aquoso. A forma monoaniônica do composto de fórmula (IB) (X = PO(OH)O-M+) pode ser obtida tratando a forma de ácido livre com um equivalente de M+OH-.
Figure img0035
Reagentes e condições:(a) Boc2O, DMF, 23 °C;(b) N,N-di- isopropilfosforamidita de dibenzila, tetrazol, 23 °C, DMF; (c) mCPBA, 0-23°C, 5 DMF; (d) TFA, H2O, MeOH, DCM, 23 °C; (e) H 2, Pd/C, M+OH- ou D2+(OH-)2, EtOH, H2O; (f) H+aq; (g) M+OH-aq.
Alternativamente, os compostos de fórmula (IB) podem ser pre- parados de composto 23 como mostrado no Esquema 2. Na etapa 1, com-posto23 é tratado com dicarbonato de di-terc-butila (Boc2O) para fornecer 10 composto de benzimidazol protegido 25. Na etapa 2, composto 25 é tratado com N,N-di-isopropilfosforamidita de dibenzila e tetrazol, seguidos por mCP- BA, para fornecer fosfato de dibenzila protegido 26. Na etapa 3, composto 26 é tratado com ácido trifluoroacético (TFA) para remover o grupo de proteção e fornecer fosfato de dibenzila 24. Na etapa 4, hidrogenólise de 24 na presença de M+OH- ou D2+(OH-)2 fornece a forma dianiônica do composto de fórmula (IB) (X = -PO(O>2M+ ou -PO(O’^D2+). A forma de ácido livre do composto de fórmula (IB) (X = PO(OH)2) pode ser obtida tratando a forma dianiônica com ácido aquoso. A forma monoaniônica do composto de fórmu la (I) (X = PO(OH)O-M+) pode ser obtida tratando a forma de ácido livre com um equivalente de M+OH-.
Figure img0036
Reagentes e condições: (a)Boc2O, DMAP, DMF, 23 °C; (b) N,N- di-isopropilfosforamidita de dibenzila, tetrazol, 23 °C, DMF; (c) mCPBA, 0-23 °C, DMF; (d) TFA, DCM; (e) aq M +OH- ou D2+(OH-)2; (f) H+aq; (g) M+OH-aq.
Os compostos de fórmula (IB) podem também ser preparados de composto 23 como mostrado no Esquema 3. Na etapa 1, composto 23 é tratado com dois equivalentes de Boc2O na presença de N,N- dimetilaminopiridina (DMAP) para fornecer composto benzimidazol bis- protegido 28. Na etapa 2, composto 28 é tratado com N,N-di- isopropilfosforamidita de dibenzila e tetrazol, seguidos por mCPBA, para for-necer fosfato de dibenzila bis-protegido 29. Na etapa 3, composto 29 é trata- do com TFA para remover os grupos de proteção. Tratamento do intermediá-rio resultante com M+OH- aquoso ou D2+(OH-)2 fornece a forma dianiônica do composto de fórmula (IB) (X = -PO(O-)2^2M+ ou -PO(O-)2^D2+). A forma de ácido livre do composto de fórmula (IB) (X = PO(OH)2) pode ser obtida tra-tando a forma dianiônica com ácido aquoso. A forma monoaniônica do com-posto de fórmula (I) (X = PO(OH)O-M+) pode ser obtida tratando a forma de ácido livre com um equivalente de M+OH-.
Exemplo 22
Preparação de fosfato de 2-(5-(2-(3-etilureído)-6-flúor-7-(tetra-hidrofuran-2- il)-1 H-benzo[ d] imidazol-5-il)pirimidin-2-il)propan-2-ila de (R )-dibenzila (24).
Figure img0037
Ao 1-etil-3-[6-flúor-5-[2-(1-hidróxi-1-metil-etil)pirimidin-5-Il]-7- [(2R)-tetra-hidrofuran-2-Il]-1H-benzimidazol-2-Il]ureia (23) (10,24 g, 23,66 mmol) em um frasco de base redonda de 1 L sob N2 a 23 °C foi adicionado DMF (200 mL) seguido por uma solução de tetrazol (105,2 mL de 0,45 M em MeCN, 47,32 mmol) seguida por N-dibenziloxifosfanil-N-isopropil-propan-2- amina (12,26 g, 11,93 mL, 35,49 mmol). Após 4,5 h mais N- dibenziloxifosfanil-N-isopropil-propan-2-amina (4 mL) foi adicionada. Após agitar mais 16 h, a reação foi resfriada para 0 °C (banho de água gelada) em seguida tratada com mCPBA (15,17 g, 61,52 mmol). A mistura foi agitada a 0 °C durante 30 min em seguida a 23 °C durante 30 min após o que a mistura de reação foi dividida entre água (400 mL) e EtOAc (700 mL). A camada orgânica foi separada, lavada com bicarbonato de sódio aquoso saturado (500 mL), 10 % de bissulfito de sódio aquoso (500 mL), bicarbonato de sódio aquoso saturado (500 mL), e salmoura (500 mL) em seguida secada (sulfato de magnésio), filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por MPLC u-sando um sistema de purificação por cromatografia flash marca registrada ISCO COMBIFLASH (330 g coluna) eluindo com 0 a 10 % de EtOH em gra-diente linear de DCM sobre 16,5 volumes de coluna em uma taxa de fluxo de 200 mL/min . Após concentração em vácuo, fosfato de 2-(5-(2-(3-etilureído)- 6-flúor-7-(tetra-hidrofuran-2-il)-1H-benzo[d]imidazol-5-il)pirimidin-2-il)propan- 2-ila de (R)-dibenzila (24) (13,89 g, 20,17 mmol, 85,27%) foi obtido como um sólido branco. ESMS (M + 1) = 689,5;1H RMN (300 MHz, CD3OD) δ 8,88 (d, J = 1,6 Hz, 2H), 7,37 (d, J = 6 Hz, 1H), 7,30 (m, 10H), 5,38 - 5,33 (m, 1H), 5,12 - 5,01 (m, 4H), 4,24 (dd, J = 6,8, 14,9 Hz, 1H), 3,98 (dd, J = 6,9, 15,1 Hz, 1H), 3,35 - 3,27 (m, 3H), 2,52 (q, J = 5,9 Hz, 1H), 2,14 - 2,05 (m, 2H), 1,91 (s, 6H) e 1,22 - 1,14 (m, 3H) ppm.
Exemplo 23
Preparação de fosfato de (R )-2-(5-(2-(3-etilureído)-6-flúor-7-(tetra-hidrofuran- 2-il)-1 H-benzo[ d] imidazol-5-il)pirimidin-2-il)propan-2-ila de dissódio (W).
Figure img0038
Um vaso Parr de 1 L foi carregado com água (200 mL), Pd/C (4 g, 10 peso% de base seca, úmidos, tipo Degussa), fosfato de 2-(5-(2-(3- etilureído)-6-flúor-7-(tetra-hidrofuran-2-il)-1H-benzo[d]imidazol-5-il)pirimidin- 2-il)propan-2-ila de (R)-dibenzila (24) (13,89 g, 20,17 mmol), EtOH (400 mL) e NaOH a 1 M aquoso (40,34 mL, 40,34 mmol). A mistura resultante foi hi- drogenada sob 3,51 kg/cm2 (50 psi) de H2 em um aparato agitador Parr du-rante 40 min. A mistura de reação foi filtrada através de uma membrana de polietersulfona de 0,22 μm (PES) fornecendo um filtrado de cor escura. Um enxague com água resultou em mais material escuro atravessando a mem-brana filtrante. O filtrado resultante foi passado através de uma almofada de celita e o material escuro não eluiu até a almofada ser enxaguada com água.
A solução escura resultante (aprox. 700 mL) foi diluída com três volumes de EtOH (2100 mL), filtrada através de uma membrana PES de 0,22 μm (usan-do 4 sistemas filtrantes de poliestireno Corning descartáveis, #431098) e o filtrado concentrado em vácuo. O resíduo resultante foi dissolvido em água (100 mL) e EtOH (300 mL), filtrado através de uma membrana PES de 0,22 μm para fornecer uma solução amarela clara, em seguida passado através de um tampão de celita (diâmetro de 26 mm x altura de 60 mm, pré-úmido com EtOH) enxaguando com EtOH (50 mL) e o filtrado em seguida concen-trado. O resíduo resultante foi dissolvido em água (250 mL) em um frasco de base redonda de 1 L, em seguida HCl aquoso a 1 M (40 mL) foi lentamente adicionado durante 15 min com agitação para fornecer uma suspensão de sólido branco. Vinte minutos após a conclusão da adição de HCl, o sólido foi coletado por meio de filtração através de uma membrana PES de 0,22 μm. O sólido coletado foi lavado com água (100 mL), em seguida transferido (ainda úmido) para um frasco de base redonda de 1 L e suspenso em MeOH (150 mL) durante 30 min. O precipitado branco fino resultante foi coletado por meio de filtração em seguida secado em vácuo durante a noite. O ácido livre resultante (9,17 g, 18,0 mmol) foi tratado com água (80 mL) em seguida NaOH aq a 1,0 N (36,0 mL, 2 equiv). A solução resultante foi congelada e liofilizada para fornecer fosfato de [1-[5-[2-(etilcarbamoilamino)-6-flúor-7- [(2R)-tetra-hidrofuran-2-Il]-1H-benzimidazol-5-Il]pirimidin-2-Il]-1-metil-etila] de dissódio (W) (10,206 g, 18,08 mmol, 89,66 %) como um sólido de cor creme pálido com dados analíticos consistentes. ESMS (M + 1) = 509,4; 1H RMN (300 MHz, D2O) δ 8,58 (s, 2H), 6,92 (d, J = 6,3 Hz, 1H), 5,13 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 3,98 - 3,81 (m, 2H), 3,04 (q, J = 7,2 Hz, 2H), 2,26 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 1,97 - 1,92 (m, 2H), 1,67 (s, 6H) e 1,01 (t, J = 7,2 Hz, 3H) ppm.
Exemplo 24
Preparação de Boc-1 -etil-3-[6-flúor-5-[2-(1-hidróxi-1 -metil-etil)pirimidin-5-Il]-7- [(2 R )-tetra-hidrofuran-2-Il]-1 H-benzimidazol-2-Il]ureia (25).
Figure img0039
A uma solução/suspensão de 1-etil-3-[6-flúor-5-[2-(1-hidróxi-1- metil-etil)pirimidin-5-Il]-7-[(2R)-tetra-hidrofuran-2-Il]-1H-benzimidazol-2- Il]ureia (23) (10,72 g, 25,02 mmol) em DMF (250 mL) a 23 °C foi adicionado Boc2O (6,11 g, 28,00 mmol). Após 2 horas, amônia a 2 M em MeOH (2 mL) foi adicionada para saciar qualquer excesso de Boc2O. A mistura reacional saciada foi dividida entre EtOAc e água (400 mL cada), a camada orgânica separada, lavada com água (2 x 400 mL) e salmoura (400 mL), em seguida secada sobre MgSO4, filtrada e concentrada para fornecer Boc-1-etil-3-[6- flúor-5-[2-(1-hidróxi-1-metil-etil)pirimidin-5-Il]-7-[(2R)-tetra-hidrofuran-2-Il]-1H- benzimidazol-2-Il]ureia (25) (12,69 g, 23,58 mmol, 94,26 %) que foi usado sem outra purificação. ESMS (M + 1) = 529,3; 1H RMN (300,0 MHz, CDCl3) δ 9,50 (s, 1H), 9,02 (t, J = 5,3 Hz, 1H), 8,91 (d, J = 1,6 Hz, 2H), 7,74 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 5,58 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 4,64 (s, 1H), 4,22 (q, J = 7,4 Hz, 1H), 4,05 (td, J = 7,8, 4,3 Hz, 1H), 3,47 (td, J = 7,2, 4,3 Hz, 2H), 2,42 - 2,35 (m, 2H), 2,28 - 2,16 (m, 2H), 1,75 (s, 9H), 1,68 (s, 6H) e 1,31 (t, J = 7,3 Hz, 3H) ppm. Exemplo 25
Preparação de fosfato de dibenzila de Boc-1-etil-3-[6-flúor-5-[2-(1-hidróxi-1- metil-etil)pirimidin-5-Il]-7-[(2R)-tetra-hidrofuran-2-Il]-1 H-benzimidazol-2- Il]ureia (26).
Figure img0040
A Boc-1-etil-3-[6-flúor-5-[2-(1-hidróxi-1-metil-etil)pirimidin-5-Il]-7- [(2R)-tetra-hidrofuran-2-Il]-1H-benzimidazol-2-Il]ureia (25) (12,69 g, 23,58 mmol) e tetrazol (3,304 g, 47,16 mmol) sob N2 a 23 °C foi adicionado DCM (240 mL) seguido por N-dibenziloxifosfanil-N-isopropil-propan-2-amina (9,775 g, 9,509 mL, 28,30 mmol). Após 3 horas a 23 °C, a reação foi resfriada para 0 °C em seguida mCPBA (6,977 g, 28,30 mmol) foi adicionado. A solução resultante foi agitada durante 45 min a 0 °C em seguida durante 20 min a 23 °C. A mistura de reação foi em seguida dividida entre DCM (50 mL) e bicarbonato de sódio aquoso saturado (400 mL). A camada orgânica foi separada, em seguida lavada sucessivamente com bissulfito de sódio aquo-so (63 g em 350 mL de água) e bicarbonato de sódio aquoso saturado (400 mL), em seguida secada sobre sulfato de magnésio, filtrada e concentrada em vácuo. O resíduo foi purificado por MPLC usando um sistema de purifi-cação por cromatografia flash marca registrada ISCO COMBIFLASH (330 g de coluna de sílica) eluindo com 0 a 100 % de EtOAc em gradiente linear de hexanos sobre 16 volumes de coluna a 200 mL/min. O produto contendo frações foi evaporado em vácuo para fornecer fosfato de dibenzila de Boc-1- etil-3-[6-flúor-5-[2-(1-hidróxi-1-metil-etil)pirimidin-5-Il]-7-[(2R)-tetra-hidrofuran- 2-Il]-1H-benzimidazol-2-Il]ureia (26) (11,92 g, 15,11 mmol, 64,09 %). ESMS (M + 1) = 789,2; 1H RMN (300,0 MHz, CDCl3) δ 9,51 (s, 1H), 9,03 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 8,91 (d, J = 1,6 Hz, 2H), 7,73 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 7,37 - 7,28 (m, 10H), 5,58 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 5,17 - 5,05 (m, 4H), 4,23 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 4,05 (td, J = 7,8, 4,3 Hz, 1H), 3,53 - 3,44 (m, 2H), 2,39 (dd, J = 7,9, 14,5 Hz, 2H), 2,28 - 2,15 (m, 2H), 1,98 (s, 6H), 1,72 (m, 9H) e 1,31 (t, J = 7,2 Hz, 3H) ppm.
Exemplo 26
Preparação de fosfato de 2-(5-(2-(3-etilureído)-6-flúor-7-(tetra-hidrofuran-2- il)-1 H-benzo[ d] imidazol-5-il)pirimidin-2-il)propan-2-ila de (R )-dibenzila (24).
Figure img0041
A uma solução de fosfato de dibenzila de Boc-1-etil-3-[6-flúor-5- [2-(1-hidróxi-1-metil-etil)pirimidin-5-Il]-7-[(2R)-tetra-hidrofuran-2-Il]-1H- benzimidazol-2-Il]ureia (26) (11,9 g, 15,09 mmol) em DCM (300 mL) a 23 °C foi adicionada água (2,325 mL, 129,1 mmol) em seguida TFA (3,441 g, 2,325 mL, 30,18 mmol). Após 1 h, somente a conversão parcial foi observada por tlc, então mais TFA (3,441 g, 2,325 mL, 30,18 mmol) foi adicionado. Após mais 2,5 h, MeOH (2 mL) foi adicionado e a mistura agitada mais 18 horas. A mistura de reação foi lavada com 1:1 de salmoura:bicarbonato de sódio a-quoso saturado (200 mL). A camada aquosa foi novamente extraída com DCM (150 mL), as camadas orgânicas combinadas, em seguida secadas (sobre sulfato de magnésio), filtradas e concentradas em vácuo. O resíduo resultante foi novamente dissolvido em EtOAc (200 mL), lavado com água (150 mL) e salmoura (100 mL), em seguida secado (sulfato de magnésio) filtrado e concentrado para fornecer fosfato de 2-(5-(2-(3-etilureído)-6-flúor-7- (tetra-hidrofuran-2-il)-1H-benzo[d]imidazol-5-il)pirimidin-2-il)propan-2-ila de (R)-dibenzila (24) (10,21 g, 14,83 mmol, 98,27 %) como um sólido branco. ESMS (M + 1) = 689,4; 1H RMN (300 MHz, CD3OD) δ 8,88 (d, J = 1,6 Hz, 2H), 7,37 (d, J = 6 Hz, 1H), 7,30 (m, 10H), 5,38 - 5,33 (m, 1H), 5,12 - 5,01 (m, 4H), 4,24 (dd, J = 6,8, 14,9 Hz, 1H), 3,98 (dd, J = 6,9, 15,1 Hz, 1H), 3,35 - 3,27 (m, 3H), 2,52 (q, J = 5,9 Hz, 1H), 2,14 - 2,05 (m, 2H), 1,91 (s, 6H) e 1,22 - 1,14 (m, 3H) ppm.
Exemplo 27
Preparação de fosfato de (R )-2-(5-(2-(3-etilureído)-6-flúor-7-(tetra-hidrofuran- 2-il)-1H-benzo[d]imidazol-5-il)pirimidin-2-il)propan-2-ila de dissódio (W).
Figure img0042
Um frasco de base redonda de 1 L foi carregado com fosfato de (R)-dibenzil 2-(5-(2-(3-etilureído)-6-flúor-7-(tetra-hidrofuran-2-il)-1H- benzo[d]imidazol-5-il)pirimidin-2-il)propan-2-ila (24) (9,37 g, 13,61 mmol), EtOH (300 mL), água (150 mL), Pd/C (10 peso% de base seca, úmidos, tipo Degussa, 3 g) e NaOH aquoso a 1 M (27,22 mL, 27,22 mmol). A suspensão foi evacuada durante 3 min (agulha para bomba) em seguida colocada sob uma atmosfera de gás de hidrogênio (balão). Após agitar 2,5 h a 23 °C, a reação foi filtrada através de uma membrana PES de 0,22 μm (sistema fil-trante Corning descartável, 1 L, polistyrene, #431098) para remover o catali-sador e lavada com EtOH (50 mL). A solução resultante foi concentrada, o resíduo dissolvido em água (80 mL), tratado com MeCN (80 mL), em seguida congelado e liofilizado para fornecer fosfato de (R)-2-(5-(2-(3-etilureído)- 6-flúor-7-(tetra-hidrofuran-2-il)-1H-benzo[d]imidazol-5-il)pirimidin-2-il)propan- 2-ila de dissódio (W) (7,10 g, 12,81 mmol, 94,12 %) como um sólido branco. ESMS (M + 1) = 509,3; 1H RMN (300 MHz, D2O) δ 8,58 (s, 2H), 6,92 (d, J = 6,3 Hz, 1H), 5,13 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 3,98 - 3,81 (m, 2H), 3,04 (q, J = 7,2 Hz, 2H), 2,26 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 1,97 - 1,92 (m, 2H), 1,67 (s, 6H) e 1,01 (t, J = 7,2 Hz, 3H) ppm.
Exemplo 28
Preparação de diBoc-1-etil-3-[6-flúor-5-[2-(1-hidróxi-1-metil-etil)pirimidin-5-Il]- 7-[(2 R )-tetra-hidrofuran-2-Il]-1 H-benzimidazol-2-Il]ureia (28).
Figure img0043
A uma solução/suspensão de 1-etil-3-[6-flúor-5-[2-(1-hidróxi-1- metil-etil)pirimidin-5-Il]-7-[(2R)-tetra-hidrofuran-2-Il]-1H-benzimidazol-2- Il]ureia (23) (1,333 g, 3,111 mmol) em DMF (30 mL) foi adicionado DMAP (38,01 mg, 0,3111 mmol) seguido por Boc2O (1,426 g, 1,501 mL, 6,533 mmol). Após 30 min, a mistura de reação foi diluída com água e EtOAc (300 mL cada), as camadas orgânicas separadas, lavadas com água e salmoura (300 mL cada), em seguida secadas sobre sulfato de magnésio, filtradas e concentradas. O resíduo foi purificado por MPLC usando umsistema de puri-ficação por cromatografia flash marca registrada ISCO COMBIFLASH (80 g de coluna de sílica) eluindo com a 0 a 60 % de EtOAc em gradiente linear de hexanos sobre 20 volumes de coluna em taxa de fluxo de 60 mL/min. As frações de produto desejadas foram combinadas e evaporadas para fornece-remdiBoc-1-etil-3-[6-flúor-5-[2-(1-hidróxi-1-metil-etil)pirimidin-5-Il]-7-[(2R)- tetra-hidrofuran-2-Il]-1H-benzimidazol-2-Il]ureia (28) (1,43 g, 2,275 mmol, 73,11%) como uma espuma clara. ESMS (M + 1) = 629,3; 1H RMN (300,0 MHz, CDCl3) δ 8,95 (d, J = 1,6 Hz, 2H), 8,31 - 8,27 (m, 1H), 8,05 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 5,80 - 5,68 (m, 1H), 4,70 (s, 1H), 4,21 - 4,09 (m, 1H), 3,98 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 3,42 - 3,37 (m, 2H), 2,45 - 2,00 (m, 4H), 1,65 (s, 6H), 1,62 (s, 9H), 1,37 (s, 9H) e 1,28 - 1,21 (m, 3H) ppm.
Exemplo 29
Preparação de fosfato de dibenzil diBoc-1-etil-3-[6-flúor-5-[2-(1-hidróxi-1- metil-etil)pirimidin-5-Il]-7-[(2R)-tetra-hidrofuran-2-Il]-1 H-benzimidazol-2- Il]ureia (29).
Figure img0044
A diBoc-1-etil-3-[6-flúor-5-[2-(1-hidróxi-1-metil-etil)pirimidin-5-Il]- 7-[(2R)-tetra-hidrofuran-2-Il]-1H-benzimidazol-2-Il]ureia (28) (1,13 g, 1,797 mmol) e tetrazol (251,8 mg, 3,594 mmol) a 23 °C sob N2 foi adicionado DCM (30 mL) seguido por N-dibenziloxifosfanil-N-isopropil-propan-2-amina (744,7 mg, 724,4 μL, 2,156 mmol). Após agitar durante 18 h, a reação foi resfriada para 0 °C em seguida tratada com mCPBA (531,5 mg, 2 ,156 mmol). A reação foi agitada durante 15 min a 0 °C, em seguida d urante 30 min a 23 °C. A solução resultante foi em seguida dividida entre EtOAc e bicarbonato de sódio aquoso saturado (300 mL cada), as camadas orgânicas separadas, em seguida lavadas com 10 % de bissulfito de sódio aquoso, bicarbonato de sódio aquoso saturado e salmoura (300 mL cada), em seguida secadas sobre sulfato de magnésio, filtradas e concentradas. O resíduo foi purificado por MPLC usando um sistema de purificação por cromatografia flash marca registrada ISCO COMBIFLASH (80 g de coluna de sílica) eluindo com 0-80 % de EtOAc em gradiente linear de hexanos sobre 20 volumes de coluna em taxa de fluxo de 60 mL/min. Frações de produto desejadas foram combinadas e evaporadas para fornecer fosfato de dibenzila de diBoc-1-etil-3-[6- flúor-5-[2-(1-hidróxi-1-metil-etil)pirimidin-5-Il]-7-[(2R)-tetra-hidrofuran-2-Il]-1H- benzimidazol-2-Il]ureia (29) (1,03 g, 1,159 mmol, 64,50 %) como um óleo vítreo claro. ESMS (M + 1) = 889,5; 1H RMN (300,0 MHz, CDCl3) δ 8,93 (d, J = 1,5 Hz, 2H), 8,31 (s, 1H), 8,04 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 7,36 - 7,26 (m, 10H), 5,83 - 5,70 (m, 1H), 5,16 - 5,05 (m, 4H), 4,24 - 4,18 (m, 1H), 4,03 - 3,97 (m, 1H), 3,42 - 3,36 (m, 2H), 2,43 - 2,05 (m, 4H), 1,98 (s, 6H), 1,64 (s, 9H), 1,40 (s, 9H) e 1,26 (t, J = 7,2 Hz, 3H) ppm.
Exemplo 30
Preparação de fosfato de (R )-2-(5-(2-(3-etilureído)-6-flúor-7-(tetra-hidrofuran- 2-il)-1H-benzo[d]imidazol-5-il)pirimidin-2-il)propan-2-ila de sódio (W).
Figure img0045
A uma solução de fosfato de dibenzila de diBoc-1-etil-3-[6-flúor- 5-[2-(1-hidróxi-1-metil-etil)pirimidin-5-Il]-7-[(2R)-tetra-hidrofuran-2-Il]-1H- benzimidazol-2-Il]ureia (29) (121 mg, 0,1361 mmol) em DCM (10 mL) a 23 °C foi adicionado TFA (5 mL). Após 2 h, a mistura d e reação foi concentrada em vácuo. O resíduo foi dissolvido em MeOH (6 mL) e tratado com aprox. 0,5 mL de NH3 a 2 M em MeOH (para dissolver totalmente o material). A solução resultante foi purificada em 6 injeções em HPLC preparativa, fase reversa, coluna de 19 x 100 mm Sunfire prep C18 OBD 5 μM; eluindo com 10 a 90 % de MeCN aq peso/ 0,1% de tampão de TFA, gradiente linear durante 15 min em taxa de fluxo de 20 mL/min. As frações contendo o produto foram agrupadas e liofilizadas. O material resultante foi suspenso em MeOH (3 mL), agitado a 23 °C durante 30 min, em seguida o p recipitado foi coletado por meio de filtração através de uma frita plástica. O sólido branco resultante foi novamente submetido a uma suspensão de MeOH (3 mL), em seguida coletado por meio de filtração para fornecer 68 mg de sólido branco após secar. O sólido branco foi tratado com NaOH aq. a 0,10 M (2,68 mL, 2 equiv de NaOH) para fornecer uma solução que foi em seguida passada através de um filtro de seringa Acrodisc CR 13 mm com membrana PTFE de 0,45 μm, inundando com água (2 mL). A solução resultante foi tratada com MeCN (3 mL), congelada e liofilizada para fornecer fosfato de (R)-2-(5-(2-(3- etilureído)-6-flúor-7-(tetra-hidrofuran-2-il)-1H-benzo[d]imidazol-5-il)pirimidin- 2-il)propan-2-ila de sódio (W) como um pó branco. ESMS (M + 1) = 509,2; 1H RMN (300 MHz, D2O) δ 8,58 (s, 2H), 6,92 (d, J = 6,3 Hz, 1H), 5,13 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 3,98 - 3,81 (m, 2H), 3,04 (q, J = 7,2 Hz, 2H), 2,26 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 1,97 - 1,92 (m, 2H), 1,67 (s, 6H) e 1,01 (t, J = 7,2 Hz, 3H) ppm.
Exemplo 31
Teste de Suscetibilidade em Meio Líquido
Os compostos desta invenção foram testados quanto à atividade antimicrobiana por teste de suscetibilidade em meio líquido. Tais ensaios foram realizados dentro das normas do mais recente documento de CLSI que regula tais práticas: "M07-A8 Methods for Diluição Antimicrobial Susceptibility Tests for Bactérias that Grow Aerobically; Approved Standard - Oitava Edição (2009)". Outras publicações, tais como "Antibiotics in Laboratory Me- dicine" (Editadas por V. Lorian, Publishers Williams e Wilkins, 1996) forne-cemtécnicas práticas essenciais em teste de antibiótico de laboratório. Os protocolos específicos usados foram como segue:
Protocolo #1: Determinação de MIC de Girase de compostos usando método de caldo de microdiluição
Materiais:
Placas de microtítulo de 96 cavidades de base redonda (Costar 3788) Placas de ágar Mueller Hinton II (MHII; premistura de BBL) Caldo líquido Mueller Hinton II (MHII; premistura de BBL) BBL Prompt Inoculation System (Fisher B26306) Espelho de Leitura de Teste (Fisher) Placas de ágar com bactérias estriadas para colônias simples, recentemente preparadas DMSO estéril Soro humano (U.S. Biologicals S1010-51) Sangue de cavalo lacustre (Quad Five 270-100) Resazurina 0,01% Soro de rato Sprague Dawley (U.S. Biologicals 1011-90B ou Valley BioMedical AS3061SD) Soro de camundongo agrupado (Valley BioMedical AS3054) Linhagens (meio, caldo e ágar): 1. Staphylococcus aureus ATCC #29213 a. MHII b. MHII + 50% de soro humano c. MHII + 50% de soro de rato d. MHII + 50% de soro de camundongo 2. Staphylococcus aureus ATCC #29213 GyrB T173I (MHI- I) 3. Staphylococcus aureus, linhagens de coleção JMI; veja a tabela 5(MHII) 4. Staphylococcus epidermidis, linhagens de coleção JMI; veja a tabela 5 (MHII) 5. Enterococcus faecalis ATCC #29212 (MHII + 3% sangue de cavalo lacustre) 6. Enterococcus faecium ATCC #49624 (MHII + 3% sangue de cavalo lacustre) 7. Enterococus faecalis, linhagens de coleção JMI; veja a tabela 5 (MHII + 3% sangue de cavalo lacustre) 8. Enterococus faecium, linhagens de coleção JMI; veja a tabela 5 (MHII + 3% sangue de cavalo lacustre) 9. Streptococcus pneumoniae ATCC #10015 (MHII + 3% sangue de cavalo lacustre) 10. Streptococcus pneumoniae, Linhagens de coleção JMI; veja a tabela 5 (MHII + 3% sangue de cavalo lacustre) 11. β-haemolytic streptococci,Grupos A, B, C, G) linhagens de coleção JMI; veja a tabela 5 (MHII + 3% sangue de cavalo lacustre) 12. Bacillus cereus ATCC 10987 (MHII) 13. Bacillus cereus ATCC 14579(MHII) 14. Bacillus subtilis ATCC 6638 (MHII) 15. Bacillus subtilis (168) ATCC 6051 (MHII)
Prep. De Inóculo (para todas as linhagens, exceto S. aureus + 50% de soros): 1. Usado o kit BBL Prompt, coletados 5 grandes ou 10 pequenas colônias bem separadas, de cultura desenvolvida sobre o meio de ágar apropriado como indicado acima e inoculado 1 mL de salina estéril fornecida no kit. 2. Vortexadas as cavidades durante ~ 30 s para fornecer uma suspensão de ~108 células/mL. A densidade real pode ser confirmada semeando diluições desta suspensão. 3. Diluída a suspensão 1/100 transferindo 0,15 mL de células em 15 mL (~106 células/mL) de caldo estéril (ou veja abaixo) para cada placa de compostos testados, em seguida turbilhonada para misturar. Se mais de 1 placa de compostos (> 8 compostos) foram testados, volumes fo- ram aumentados consequentemente. a. Para E. faecalis, E. faecium e S. pneumoniae: 14,1 mL de MHII + 0,9 mL de sangue de cavalo lacustre foram usados. 4. Usados 50 μl de células (~5 x 104 células) para inocular cada cavidade de microtítulo contendo 50 μl do fármaco diluído em caldo (veja abaixo).
Diluições de fármaco, inoculação, determinação da MIC: 1. Todos os estoques de fármaco/composto foram preparados a 12,8 mg/mL de concentração, geralmente em 100% de DMSO. 2. Estoques de fármaco/composto diluídos para 200x con-centração final desejada em 50 μL de DMSO. Se concentração de partida de MICs foi de 8 μg/mL de concentração final, em seguida requeridos 6,25 μL de estoque + 43,75 μL de DMSO. Cada 200x estoque foi colocado em uma série separada da coluna 1 de uma nova placa de microtítulo de 96 cavidades. 3. Adicionados 25 μL de DMSO às colunas 2 a 12 de todas as séries da placa de microtítulo contendo 200x estoques de composto e serialmente diluídos 25 μL de coluna 1 à coluna 11, mudadas as extremidades após cada coluna. Isto é 25 μL de composto + 25 μL de DMSO = 2x diluição. Deixado "nenhum composto" na cavidade de DMSO na extremidade da série para controle. 4. Para cada linhagem testada (exceto S. aureus + 50% de soro humano), preparadas duas placas de microtítulo com 50 μL de MHII caldo usando um pipetador Matriz. 5. Transferido 0,5 μL de cada diluição (peso/autopipetador Matriz) para 50 μL de meio/cavidade de microtítulo antes da adição de 50 μL de células. A concentração de partida usual de composto foi de 8 μg/mL após a diluição de 1/200 em meio + células - concentrações de composto diminuídas em 2x etapas através das séries da placa de microtítulo. Todas as MICs foram feitas em duplicata. 6. Todas as cavidades foram inoculadas com 50 μL de suspensão celular diluída (veja acima) para um volume final de 100 μl. 7. Após o inóculo ser adicionado, misturada cada cavidade cuidadosamente com um pipetador de múltiplos canais manual; algumas extremidades foram usadas indo da concentração baixa à elevada de fárma- co na mesma placa de microtítulo. 8. As placas foram incubadas a 37oC durante pelo menos 18 horas. 9. As placas foram observadas com um Espelho de Leitura de Teste após 18 horas e a MIC foi registrada como a menor concentração de fármaco onde nenhum crescimento foi observado (clareza ótica na cavidade).
Preparação de S. aureus+ 50% de soro humano, S. aureus+ 50% de soro de rato ou S. aureus+ 50% de soro de camundongo. 1. Preparados 50% de meio de soro combinando 15 mL de MHII + 15 mL soro humano - total 30 mL. Volume aumentado em incrementos de 30 mL quando mais de 1 placa de composto foi testada. 2. Usado o mesmo inóculo de BBL Prompt de S. aureus ATCC #29213 como descrito acima, diluído 1/200 transferindo 0,15 mL de células em 30 mL (~5x105 células/mL) do meio de soro humano a 50% preparado acima e turbilhonado para misturar. 3. Carregadas todas as cavidades de teste do número desejado de placas de microtítulo com 100 μl de células em meio de soro a 50%. 4. Transferido 0,5 μL de cada diluição de composto (pe- so/autopipetador Matriz) para 100 μL de células/media. A concentração de partida usual de composto foi de 8 μg/mL após a diluição de 1/200 em meio + células - concentrações de composto diminuídas em 2x etapas através das séries de uma placa de microtítulo. Todas as MICs foram feitas em duplicata. 5. Misturada cada cavidade cuidadosamente com um pipe- tador de múltiplos canais manual; algumas extremidades foram usadas indo da concentração baixa à elevada de fármaco na mesma placa de microtítulo. 6. As placas foram incubadas a 37oC durante pelo menos 18 horas. Após incubação, adicionados 25 μL de Resazurina a 0,01% a cada cavidade e continuados a incubar a 37oC durante pelo menos mais 1 hora ou até as mudanças de cor de Resazurina. 7. As placas foram observadas com um Espelho de Leitura de Teste e a MIC foi registrada. Quando usando Resazurina, a cor do pigmento mudou de um azul escuro para um rosa brilhante em cavidades sem nenhum crescimento. A menor concentração de fármaco que tornou o pigmento rosa foi a MIC. Protocolo 2: Determinação de MIC de Girase de compostos contra Gram negativos usando método de caldo de microdiluição
Materiais:
Placas de microtítulo de 96 cavidades de base redonda (Costar 3788) Placas de ágar Mueller Hinton II (MHII; premistura de BBL) Caldo líquido Mueller Hinton II (MHII; premistura de BBL) BBL Prompt Inoculation System (Fisher b26306) Espelho de Leitura de Teste (Fisher) Placas de ágar com bactérias estriadas para colônias simples, recentemente preparadas. DMSO estéril Linhagens (Meio de MHII para todos; caldo e ágar): 1. Escherichia coli ATCC # 25922 2. Escherichia coli, linhagens de coleção JMI, veja a tabela 5 3. Escherichia coliAG100 WT 4. Escherichia coli AG100 tolC 5. Acinetobacter baumannii ATCC # BAA-1710 6. Acinetobacter baumannii ATCC # 19606 7. Acinetobacter baumannii, linhagens de coleção JMI, veja a tabela 5 8. Klebsiella pneumoniae ATCC # BAA-1705 9. Klebsiella pneumoniae ATCC # 700603 10. Klebsiella pneumoniae, linhagens de coleção JMI, veja a tabela 5 11. Moraxella catarrhalis ATCC# 25238 12. Moraxella catarrhalis ATCC# 49143 13. Moraxella catarrhalis, linhagens de coleção JMI, veja a tabela 5 14. Haemophilus influenzae ATCC 49247 15. Haemophilus influenzae (Rd1 KW20) ATCC 51907 16. Haemophilus influenzae Rd0894 (AcrA-) 17. Haemophilus influenzae, linhagens de coleção JMI, veja a tabela 5 18. Pseudomonas aeruginosa PAO1 19. Pseudomonas aeruginosa, linhagens de coleção JMI, veja a tabela 5 20. Proteus mirabilis, linhagens de coleção JMI, veja a tabe la 5 21. Enterobacter cloacae, linhagens de coleção JMI, veja a tabela 5 22. Stenotrophomonas maltophilia ATCC BAA-84 23. Stenotrophomonas maltophilia ATCC13637
Prep. de Inóculo: 1. Usando o kit BBL Prompt, coletou 5 grandes ou 10 pequenas colônias bem separadas, de culturas cultivadas em meio de ágar e inoculado 1 mL de salina estéril que vieram com o kit. 2. Vortexadas as cavidades durante ~ 30 s para fornecer uma suspensão de ~108 células/mL. A densidade real pode ser confirmada semeando diluições desta suspensão. 3. Diluída a suspensão 1/100 transferindo 0,15 mL de células em 15 mL (~106 células/mL) caldo estéril (veja abaixo) para cada placa de compostos testados, turbilhonada para misturar. Se mais de 1 placa de compostos (> 8 compostos) tiveram de ser testadas, os volumes aumentaram consequentemente. 4. Usados 50 μl de células (~5 x 104 células) para inocular cada cavidade de microtítulo contendo 50 μl do fármaco diluído em caldo (veja abaixo).
Diluições de fármaco, inoculação, determinação de MIC: 1. Todos os estoques de fármaco/composto foram preparados a 12,8 mg/mL de concentração, geralmente em 100% de DMSO. 2. Estoques de fármaco/composto diluídos para 200x con-centração final desejada em 50 μL de DMSO. Se concentração de partida de MICs foi de 8 μg/mL de concentração final, em seguida requeridos 6,25 μL de estoque + 43,75 μL de DMSO. Cada 200x estoque foi colocado em uma série separada da coluna 1 de uma nova placa de microtítulo de 96 cavidades. 3. Adicionados 25 μL de DMSO às colunas 2 a 12 de todas as séries da placa de microtítulo contendo 200x estoques de composto e serialmente diluídos 25 μL de coluna 1 à coluna 11, mudadas as extremidades após cada coluna. Isto é 25 μL de composto + 25 μL de DMSO = 2x diluição. Deixado "nenhum composto" na cavidade de DMSO na extremidade da série para controle. 4. Para cada linhagem testada, preparadas duas placas de microtítulo com 50 μL de MHII caldo usando um pipetador Matriz. 5. Transferido 0,5 μL de cada diluição (peso/autopipetador Matriz) para 50 μL de meio/cavidade de microtítulo antes da adição de 50 μL de células. A concentração de partida usual de composto foi de 8 μg/mL após a diluição de 1/200 em meio + células - concentrações de composto diminuídas em 2x etapas através das séries de uma placa de microtítulo. Todas as MICs foram feitas em duplicata. 6. Todas as cavidades foram inoculadas com 50 μL de suspensão celular diluída (veja acima) para um volume final de 100 μl. 7. Após o inóculo ser adicionado, cada cavidade foi misturada cuidadosamente com um pipetador de múltiplos canais manual; algumas extremidades foram usadas indo da concentração baixa à elevada de fármaco na mesma placa de microtítulo. 8. As placas foram incubadas a 37oC durante pelo menos 18 horas. 9. As placas foram observadas com um Espelho de Leitura de Teste após 18 horas e a MIC foi registrada como a menor concentração de fármaco onde nenhum crescimento foi observado (clareza ótica na cavidade).
Protocolo #3: Determinação de MIC de Girase de compostos usando método de diluição de ágar
Materiais:
Placas de Petri 60 x 15 mm (Thermo Scientific Cat. # 12567100) Tubos centrífugos, 15 mL (Costar) BBL Prompt Inoculation System (Fisher b26306) Placas de ágar com bactérias estriadas para colônias simples, recentemente preparadas. DMSO estéril Recipientes de incubação GasPakTM (BD Cat. #260672) Sachês de sistema recipiente GasPak TMEZ Anaerobe (BD Cat. #260678) Sachês de sistema recipiente GasPak TMEZ C02 (BD Cat. #260679) Sachês de sistema recipiente GasPak TMEZ Campy (BD Cat. #260680) Linhagens: 1. Clostridium difficile ATCC BAA-1382; 2. Clostridium difficile, linhagens de coleção de CMI, veja a tabela 4 3. Clostridium perfringens, linhagens de coleção de CMI, veja a tabela 4 4. Bacteroides fragilis e Bacteroides spp., linhagens de coleção de CMI, veja a tabela 4 5. Fusobacterium spp., linhagens de coleção de CMI, veja a tabela 4 Peptostreptococcus, spp., Linhagens de coleções de CMI, veja a tabela 4 7. Prevotella spp., linhagens de coleção de CMI, veja a tabela 4 8. N. gonorrhoeae ATCC 35541 9. N. gonorrhoeae ATCC 49226 10. Neisseria gonorrhoeae, linhagens de coleção JMI, veja a tabela 4 11. Neisseria meningitidis, linhagens de coleção JMI, veja a tabela 4
Preparação de meio e condições de cultura:
O meio de cultura recomendado para cada espécie microbiana foi preparado de acordo com a publicação CLSI 'M11-A7 Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria; Approved Standard - Sétima Edição (2007)' com a exceção de N. gonorrhoeae e N. meningitidis para as quais o meio foi preparado de acordo com "M07-A8 Methods for Diluição Antimicrobial Susceptibility Tests for Bactérias that Grow Aerobically; Approved Standard - Oitava Edição (2009)".
Derramamento da Placa: 1. Preparados 100x estoques de fármaco de cada composto teste como descrito na Tabela 1. Usado um tubo centrífugo de 15 mL, adicionados 100 uL de cada estoque de fármaco a 10 mL de ágar derretido (resfriado para ~ 55°C em banho de água ). Misturad os invertendo o tubo 2 - 3x em seguida vertidos em placa de Petri de 60X15 mm individualmente rotuladas. 2. As concentrações de teste de rotina foram: 0,002 ug/mL - 16 ug/mL (14 placas). 3. Vertidas 4 placas livres de fármaco: 2 como controle positivo, 2 como controle aeróbico. 4. Deixadas as placas secarem. Usados no mesmo dia ou armazenados durante a noite em RT ou armazenados até 3 dias a 4°C. 5. As placas foram rotuladas consequentemente para con-centração de fármaco e colocaçãode linhagem.
Cultura de células requerendo a manutenção de um ambiente anaeróbico: 1. Todos os trabalhos realizados com bactérias anaeróbi- cas foram feitos tão rapidamente quanto possível; o trabalho realizado em gabinetes de bioproteção (isto é, ambiente aeróbico) foi completado em menos de 30 minutos antes das células serem retornadas para câmaras anae- róbicas. 2. Incubação de bactérias anaeróbicas foi obtida usando câmaras GasPakTM. As câmaras de estilo caixa grande (VWR 90003-636) requereram 2 sachês anaeróbicos (VWR 90003-642), enquanto que as câmaras de estilo cilindro alto (VWR 90003-602) apenas requereram 1 sachê. Inoculação de placa (realizada em gabinete de bioproteção): 1. Estriada cada linhagem sobre placas de ágar individuais, como descrito acima. Incubada durante o tempo requerido e condição ambiental (isto é, anaeróbica, microaerofílica, etc). 2. Usado o método de suspensão de colônia direta para suspender alças de células recentemente estriadas em ~ 4 mL 0,9% de Na- Cl2 e vortexadas. 3. Suspensão ajustada para O.D.600 0,05 (5x10e7 cfu/mL). Vortexada para misturar. 4. Transferido ~0,2 mL de culturas misturadas, ajustadas para uma placa de 96 cavidades. Quando < 5 linhagens foram testadas, todas as linhagens foram revestidas juntas em uma única série. Quando testando> 5 linhagens, transferidas as linhagens para placa com não mais do que 5 linhagens em uma única série. Isto foi necessário para ajustarem-se sobre as placas pequenas. 5. Usado pipetador de múltiplos canais, manchado 0,002 mL de cada linhagem de placas de 96 cavidades preparadas sobre cada placa de teste de MIC. Isto resultou em ~ 1x10e5 cfu/mancha. Quando testandoC. difficile, linhagens enxameadas quando cultivadas, entretando a distância entre as manchas do pipetador de múltiplos canais foi suficientemente grande, de modo que as células em enxame não prejudicassem os resultados do ensaio. 1. Inoculadas 2 placas sem fármaco primeiro, enquanto as outras 2 placas sem fármaco foram inoculadas finalmente após as placas de teste de MIC. A primeira e a última serviram como controles de cultivo e ino-culação.Incubada uma placa de cada grupo de controles sem fármaco sob as condições atmosféricas requeridas com placas de MIC e um grupo aero- bicamente para testar quanto à contaminação com bactérias aeróbicas. Cultura aerobic foi negative quanto ao crescimento quando trabalhando com linhagem anaeróbica ou microaerofílica severa. Algum crescimento foi visível com N. gonorrhoeae. 6. Deixado o inóculo secar (durante um tempo tão curto quanto necessário), em seguida colocado de cabeça para baixo em GasPak com número apropriado de sachês, e incubar. 7. Neisseria spp. foram incubados a 37°C em um ambiente de CO2 a 5% durante 24h.
Determinação de MIC: Examinadas as placas de teste após o correto tempo de incubação e lido o ponto final de MIC na concentração onde uma redução acentuada ocorreu no aparecimento de crescimento na placa de teste, quando comparado àquela de crescimento nas placas de controle positivo. Tabela 1. Diluições de composto para determinação de MIC usando o método de diluição de ágar.
Figure img0046
*1,600 ug/ml = 64 ul (10mg/ml de estoque) + 336 ul de DMSO; 400 ul de volume total para iniciar. **composto dissolvido e diluído em 100% de DMSO Protocolo 4. Procedimento de determinação de MIC para espécie Mycobac-terium
Materiais
Placas de microtítulo de 96 cavidades de base redonda (Costar 3788) ou similar Selos de placa de película (PerkinElmer, TopSeal-A #6005250 ou similar) Caldo 7H10 de Middlebrook com 0,2% de glicerol Ágar 7H10 de Middlebrook com 0,2% de glicerol Enriquecimento de OADC de Middlebrook Preparação de Inóculo para M. tuberculosis: 1. Usado estoque de M. tuberculosis congelado prep. ar- 15 mazenado a -700C. M. tuberculosis foi cultivado em caldo 7H10 + 10% de OADC, em seguida congelado em uma concentração de 100 Klett ou 5 x 107cfu/ml, 2. Preparada uma diluição de 1:20 por remoção de 1 mL do estoque congelado e adicionando-o a 19 mL de caldo 7H10 + 10% de OADC (concentração final 2,5 x 106cfu/ml). 3. A partir desta diluição preparada uma segunda diluição de 1:20, removido 1 ml e adicionando-o a 19 mL de caldo fresco. Este foi o inóculo final para adição às placas de 96 cavidades.
Preparação de inóculo para M. kansasii, M. avium, M. abscessus e Nocardia spc.: 1. Usado estoque congelado preparado de cultura ou uma cultura fresca desenvolvida em caldo 7H10 em uma concentração de 10 Klett ou 5 x 107/ml. 2. Preparada uma diluição de 1:20 removendo 1,0 mL do estoque de cultura e adicionando-o a 19 mL de caldo 7H10 (concentração final 2.5 x 106cfu/ml). 3. A partir desta diluição preparada a 1:20 diluição, removi-do 1 ml e adicionando-o a 19 mL de fresh caldo (suspensão final). Preparação de Placa: 1. Placas rotuladas. 2. Adicionados 50 μL de caldo 7H10 + 10% de OADC a to-das as cavidades que estão sendo utilizadas para determinação de MIC u-sando um pipetador eletrônico de múltiplos canais. 3. Preparadas soluções de fármacos de estoque (por e-xemplo, 1 mg/mL de concentração) a serem testadas. 4. Descongeladas e diluídas soluções de estoque congela-das usando caldo 7H10 + 10% de OADC para obter uma solução de trabalho 4x a concentração máxima testada (por exemplo, concentração final 32 μg/ml, a concentração mais elevada testada foi de 8 μg/ml). Diluições foram feitas da solução de estoque. Para iniciar em uma concentração de 1 μg/ml, os fármacos foram preparados a 4 μg/ml, então a concentração de partida foi de 1 μg/ml. Removidos 25 μL do estoque de 1mg/ml e adicionados a 6,2 mL de caldo. Todas as diluições de fármaco foram feitas em caldo. 5. Adicionados 50 μL da solução de trabalho de 4x à pri-meira cavidade da série designada. Continuado para todos os compostos a serem testados. Usando um pipetador eletrônico de múltiplos canais, mistu-rado 4X e compostos diluídos seriais através da 11a. cavidade. Descartados os 50 μl restantes. Usada a 12a. cavidade como o controle positivo. 6. Incubadas as placas a 37°C de M. tuberculosis durante ~18 dias; M. avium e M. kansasii durante ~7 dias; Nocardia e M. abcessus durante ~4 dias; com selos de película. 7. Lidos visualmente e registrados os resultados. Uma MIC foi registrada como a menor concentração de fármaco onde nenhum cresci-mento foi observado (clareza ótica na cavidade).
Protocolo 5. Protocolo para Ensaio de MIC de Mudança de Soro de Myco-bacterium tuberculosis.
Materiais e reagentes:
Placas de microtítulo de 96 cavidades de base placa, lados pre-tos Costar #3904 Caldo 7H9 de Middlebrook (BD271310) com 0,2% de glicerol Enriquecimento de OADC de Middlebrook Soro Bovino Fetal Catalase (Sigma C1345) Dextrose NaCl2 BBL Prompt Inoculation System (Fisher b26306) Placas de ágar (Middlebrook 7H11 com 0,2% de glicerol e enri-quecimento de OADC) com bactérias estriadas para colônias simples DMSO estéril Prep. de meio: 1. Para MICs mudadas de soro, três meios diferentes foram requeridos que tiveram todos uma base de 7H9 + 0,2% de glicerol. Foi importante que todos os meios e suplementos foram esterilizados antes das MICs. Preparados todos os meios abaixo e inoculados como descrito na próxima seção. Testados todos os compostos em comparação com Mtb usando cada meio. a. 7H9 + 0,2% de glicerol + 10% de OADC (meio de MIC "padrão"). b. 7H9 + 0,2% de glicerol + 2 g/L de dextrose + 0,85 g/L de NaCl + 0,003 g/L de catalase (0% FBS). c. 2x 7H9 + 0,2% de glicerol + 2 g/L de dextrose + 0,85 g/L de NaCl + 0,003 g/L de catalase combinado com volume igual de Soro Bovi-no Fetal (50% de FBS).
Prep. de Inóculo: 1. Usando BBL Prompt, coletadas 5 a 10 colônias bem se-paradas e inoculado 1 mL de salina estéril que veio no kit. Tipicamente pla-cas tinham duas a três semanas de idade quando usadas para este ensaio, devido ao lento crescimento deste organismo em cultura. 2. A cavidade vortexada, em seguida tratada com ondas sonoras em banho de água durante 30 segundos, fornecendo uma suspen-são de ~108 células/ml. A densidade real pode ser confirmada semeando diluições desta suspensão. 3. Preparado inóculo em cada das três formulações de meio diluindo a suspensão de BBL Prompt 1/200 (por exemplo: transferido 0,2 mL de células para 40 mL de meio) para obter uma densidade celular de partida de ~106 células/ml. 4. Usados 100 μl de células (~5 x 104 células) para inocular cada cavidade de microtítulo contendo 1 μL de fármaco em DMSO (veja a-baixo).
Diluições de fármaco, inoculação, determinação de MIC: 1. Estoques de fármaco de controle de Isoniazida e Novo- biocina foram preparados a 10 mM em 100% de DMSO enquanto que Cipro- floxacino e Rifampina foram preparados a 1 mM em 50% de DMSO e 100% de DMSO, respectivamente. Preparadas diluições - dispensados 100 μL da solução de estoque na primeira coluna de uma placa de 96 cavidades. Pre-paradas 11 etapas, diluições seriais de 2 vezes através da série para cada composto, transferindo 50 μl da coluna 1 para dentro de 50 μL de DMSO na coluna 2. Continuado a transferir 50 μL da coluna 2 até a coluna 11, enquanto misturando e mudando as extremidades em cada coluna. Deixada a coluna 12 com DMSO apenas como um controle. 2. Transferido 1 μL de cada diluição para dentro de uma cavidade de microtítulo vazia, antes da adição de 100 μL de células. A con-centração de partida de Isoniazida e Novobiocina foi de 100 μM após a dilui-ção em meio + células; a concentração de partida de Ciprofloxacino e Ri- fampina foi de 10 μM após a diluição em meio + células. Concentrações de composto diminuídas em 2x etapas movendo-se através das séries da placa de microtítulo. Todas as MICs foram feitas em duplicata em cada das três condições de meio. 3. Grupos de teste de compostos foram tipicamente a 10 mM e 50 μL de volume. 4. Usado um pipetador de múltiplos canais, removido todo o volume de cada coluna da placa mestre e transferido para dentro da pri-meira coluna de uma nova placa de microtítulo de 96 cavidades. Repetido para cada coluna de compostos na placa mestre, transferindo para dentro da coluna 1 de uma nova placa de 96 cavidades. 5. Como descrito acima para compostos de controle, gera-dos 2 vezes, diluições de 11 pontos de cada composto usando DMSO como diluente. Em todos os casos, deixado a coluna 12 como DMSO apenas para um controle. Assim que todas as diluições foram concluídas, novamente foi transferido 1 μL de cada diluição para dentro de uma cavidade de microtítulo vazia, antes da adição de 100 μL de células como feito para os compostos de controle. 6. Todas as cavidades foram inoculadas com 100 μL de suspensão celular diluída (veja acima). 7. Após adição de inóculo, as places misturadas batendo suavemente nos lados da placa. 8. As placas foram incubadas em uma câmara a 37oC umi- dificada durante 9 dias. 9. Em 9 dias foram adicionados 25 μl de Resazurina estéril a 0,01% a cada cavidade. A fluorescência de base foi medida em 492 nm de excitação, 595 nm de Emissão e retornada a placa para o incubador durante mais 24 horas.
Após 24 horas a fluorescência de cada cavidade foi medida em 492 nm de Excitação, 595 nm de Emissão.
O percentual de inibição por um determinado composto foi calculado como segue: Percentual de inibição = 100-([fluorescência da cavidade- fluorescência debase média]/[controle de DMSO-fluorescência de base média] x100). As MICs foram classificadas para todas as três condições de meio como a menor concentração de composto que inibiu o sinal de redução de Resazurina ('% de inibição') >70% em uma determinada condição de meio.
A tabela 2 mostra os resultados do ensaio de MIC para os com-postos selecionados desta invenção. Na tabela 2 e nas subsequentes tabelas e exemplos, o "Com-posto 12" corresponde a 1-etil-3-[5-[2-(1-hidróxi-1-metil-etil)pirimidin-5-il]-7- [(2R)-tetra-hidrofuran-2-il]-1H-benzimidazol-2-il]ureia e o "Composto 13" refe-re-se ao sal de mesilato de composto 12. Similarmente, o "Composto 23" corresponde a 1-etil-3-[6-flúor-5-[2-(1-hidróxi-1-metil-etil)pirimidin-5-il]-7- [(2R)-tetra-hidrofuran-2-il]-1H-benzimidazol-2-il]ureia e o "Composto 23A" refere-se ao sal de mesilato de composto 23. Estes são os mesmos números usados para identificar os referidos compostos e sais como usados nos e-xemplos abaixo. Tabela 2 - Valores de MIC dos Compostos Selecionados
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A tabela 3 mostra os resultados do ensaio de MIC90 para os compostos selecionados desta invenção. Tabela 3 - Valores de MIC90 de Compostos Selecionados com Painéis de Patógenos Gram Positivos, Gram Negativos e Anaeróbicos
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A Tabela 3A também mostra os resultados dos ensaios de MIC para os compostos selecionados desta invenção. Na Tabela 3A, "Composto 23A" corresponde ao sal de ácido metanossulfônico de 1-etil-3-[6-flúor-5-[2- (1-hidróxi-1-metil-etil)pirimidin-5-il]-7-[(2R)-tetra-hidrofuran-2-il]-1H- benzimidazol-2-il]ureia (23A). Similarmente, o "Composto W" corresponde a fosfato de (R)-2-(5-(2-(3-etilureído)-6-flúor-7-(tetra-hidrofuran-2-il)-1H- benzo[d]imidazol-5-il)pirimidin-2-il)propan-2-ila de dissódio (W). Estes são os mesmos números usados para identificar os referidos compostos nos exem-plossintéticos acima. 10 Tabela 3A. Valores de MIC de Compostos Selecionados
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1Coleção de Cultura Tipo Americano 2Construído por Vertex 3Centro de Estoque Genético de Coli 4Todas as construções tolCsão tolC::Tn10 derivada de CAG12184 (Centro 5 de Estoque Genético de Coli) Na Tabela 4 abaixo, o termo "CMI" significa The Clinical Microbi- ology Institute localizado em Wilsonville, Oregon. Tabela 4. Painéis de Organismo Anaeróbico Usado para Gerar Dados de MIC90
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Na Tabela 5 abaixo, o termo "JMI" significa The Jones Microbio- logy Institute localizado em North Liberty, Iowa. Tabela 5: Panéis de Organismo Gram Positivo e Gram Negativo Usados para Gerar Dados de MIC90.
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Exemplo 32
Modelo de Infecção dos Rins por S. aureusde Camundongo Animais: camundongos CD-1 fêmea (8 a 10 semanas de idade; 6/grupo), foram obtidos de Charles River Laboratories e foram alojados e 5 mantidos de acordo com o Guide to the Care and Use of Experimental Animals.
Linhagem Bacteriana e Estoques
Linhagem S. aureus sensível à meticilina (MSSA) ATCC 29213 foi obtida da American Type Culture Collection. Para preparar estoques para 10 estudos animais S. aureus foram colocados sobre placas de ágar Mueller Hinton e incubados a 37oC durante a noite. 3-4 colônias da placa foram usadas para inocular 5 mL de caldo Mueller Hinton (MHB) que foi incubado durante 8 horas a 37oC com agitação a 300 RPM. Os 5 mL de cultura de 8 horas foram diluídos 20 vezes em 100 mL e incubados durante a noite (12 a 14 15 horas). As bactérias foram peletadas durante 20 minutos a 3000 x e lavadas duas vezes com Salina Tamponada por Fosfato (PBS) contendo Albumina de Soro Bovino a 0,5% (BSA). Alíquotas (1mL) contendo ~1 x1010cfu em PBS/20% de glycerol foram congeladas e armazenadas a -800C até o dia do uso. Títulos de estoque foram confirmados por diluição serial e semeadura sobre placas de ágar Mueller Hinton.
Modelo de infecção dos rins por S. aureusde camundongo
Antes da inoculação, estoques bacterianos foram descongelados e lavados uma vez com PBS/BSA. Os estoques foram em seguida diluídos com PBS/BSA para uma concentração final de 1x 109cfu/mL para fornecer um inóculo de aproximadamente 1-2 x 108cfu por camundongo em um volume de 100 uL. Este inóculo foi constatado ser ideal em experimentos preliminaries que utilizaram doses de desafio de 106-109 organismos de S. au- reus/camundongo para estabelecer uma carga de ~106cfu/rins em 26 horas após a infecção sem mortalidade (dados não mostrados). Nestes estudos preliminaries, desafio com S. aureus em menos do que 107cfu/camundongo induziu infecções inconsistentes ou não crônicas, ao passo que uma dose de 109cfu/camundongo resultou em rápida enfermidade e mortalidade em uma alta percentagem dos camundongos. Injeções foram administradas intravenosamente por meio da veia do rabo, usando uma agula de 30 gauges estéril. Na conclusão das infecções de camundongo, os estoques bacterianos usados para desafiar os camundongos foram semeados e contados para verificar a concentração dos inóculos.
Para estimar o desafio bacteriano nos tempos indicados após a infecção (mais comumente 2 a 26 horas), os camundongos foram eutaniza- dos e os rins foram assepticamente colhidos, e colocados em PBS/BSA es-téril (5 mL/par de rins). Os rins foram homogeneizados sob condições esté-reis, usando um homogeneizador manual (Powergen 125; Fisher Scientific). Durante a coleção e homogeneização, todas as amostras foram mantidas sobre gelo e o homogeneizador foi lavado cuidadosamente e esterilizado entre cada amostra. Os homogeinados foram serialmente diluídos em PBS/BSA estéril e semeados sobre MH ágar para determinar as contagens bacterianas por par de rins.
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Camundongos CD-1 (6/grupo) foram desafiados IV com S. au-reus (ATCC 29213) a 2x108cfu/camundongo. Duas horas após desafio os camundongos foram tratados por meio de gavagem oral com Veículo (10% de VitE TPGS) a 10 ml/kg de Composto 23A a 10, 30, 100 mg/kg. Os grupos de tratamento de 30 minutos 6 horas foram tratados uma vez, enquanto que o grupo de 24 horas recebeu um segundo tratamento de 10 horas após a primeira dose. Após quantidades crescentes de tempo após o tratamento (30 minutos, 6 horas ou 24 horas), os camundongos foram eutanizados e os rins coletados, homogeneizados e semeados para quantificar as cargas de S. aureus. As cargas de pares de rins para cada camundongo e a média para cada grupo de camundongos foram calculadas.
Resultados:
O Composto 23A oralmente administrado exibiu eficácias in vivo contra infecção de MSSA dos rins experimentalmente induzida (SA 29213). Em 30 minutos após o tratamento incial, não houve nenhuma diferença em carga dos rins entre os camundongos tratados com o composto e com o veí-culo. O grupo tratado com o Veículo 30 minutos serviu como controle preco-ce para comparação dos efeitos do composto em pontos do tempo posterio-res. Em 6horas, após a primeira dose, todos os tratamentos com o composto reduziram as cargas bacterianas nos rins por 0,4-0,6 logs versus controle de veículo comparado pelo tempo. Adicionalmente, o Composto 23A adminis-trado a 30 e 100 mg/kg forneceu redução de 0,3-0,4 log versus o controle precoce de 30 minutos.
Após o período de tratamento de 24 horas (que incluiu uma se-gunda dose de tratamento administrada em 10 horas), um decréscimo em densidade bacteriana comparada ao Controle de Veículo comparado pelo tempo foi observado para todos os grupos de tratamento. O composto 23A administrado a 30 e 100 mg/kg de BID forneceu redução de 2,8-2,9 log, ao passo que 10 mg/kg de composto 23A BID foi mais variável e forneceu uma redução de 1,8 log versus o controle tratado com veículo de 24 horas. Além disso, o composto 23A administrado a 30 e 100 mg/kg mostrou aproxima-damentereduções de 1,5 log versus o controle tratado com o veículo 30 mi-nutos, indicativo de atividade bactericida.
Em resumo e como mostrados acima na Tabela 6, dosagem BID de 30 e 100 mg/kg de Composto 23A diminuiu o crescimento bacteriano de S. aureussensível à meticilina (MSSA) linhagem ATCC 29213 quando com-parado ao grupo de controle de 30 minutos em ambos os tempos de avalia-ção de 6 horas e 24 horas, enquanto que o tratamento com 10 mg/kg de Composto 23A limitou o crescimento bacteriano em 6 horas, porém foi me-nos eficaz do que outros grupos de tratamento em 24horas.
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Camundongos CD-1 (6/grupo) foram desafiados IV com S. aureus (ATCC 29213) a 2x108 cfu/camundongo. Após 2 horas um único grupo de camundongos (Controle Precoce (EC)) foi eutanizado e os rins coletados, homogeneizados e semeados para quantificar as cargas de S. aureus. Os grupos adicionais de camundongos infectados foram tratados por meio de gavagem oral com Veículo a 10 ml/kg (10% de VitE TPGS; Controle Tardio, LC), Composto 23A a 10, 30, 60, 100 mg/kg. Após 24 horas os grupos de camundongos tratados foram eutanizados e os rins coletados, homogenei-zados e semeados para quantificar as cargas de S. aureus. As cargas de pares de rins para cada camundongo e a média para cada grupo de camun-dongos foram sumariadas.
Resultados:
Em resumo e como mostrados acima na Tabela 7, uma única dose oral de composto 23A exibiu eficácia in vivo contra uma infecção de MSSA dos rins experimentalmente induzida (SA 29213). Após 24 horas to-dos os tratamentos mostraram decréscimos em densidade bacteriana em comparação ao controle de veículo comparado pelo tempo. O composto 23A demonstrou reduções dependente da dose de 1,9, 2,3, 3,1 e 3,3 Logs de Redução versus Controle de Veículo, quando administrado a 10, 30, 60 ou 100 mg/kg. Além disso, doses de 60 e 100 mg/kg de composto 23A reduziram as cargas bacterianas versus o controle precoce em 1,2-1,4 logs, suge- rindo que o composto 23A tem atividade bactericida.
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Camundongos CD-1 (8/grupo) foram desafiados IV com S. aureus (ATCC 29213) a 2x108 cfu/camundongo. Após 2 horas um único grupo de camundongos (Controle Precoce (EC)) foi eutanizado e os rins coletados, homogeneizados e semeados para quantificar cargas de S. aureus. Os gru-pos adicionais de camundongos infectados foram tratados por meio de ga- vagem oral com Veículo a 10 ml/kg (Água; Controle Tardio, LC), O composto W foi administrado a 16, 49, 99 ou 166 mg/kg de níveis de dose nominais que foram supostos liberar 10, 30, 60 ou 100 mg/kg de composto 23A, os equivalentes de dose de porção ativa em completa conversão a 10, 30, 60, 100 mg/kg. Após 24 horas os grupos de camundongos tratados foram euta- nizados e os rins coletados, homogeneizados e semeados para quantificar cargas de S. aureus. Cargas de pares de rins para cada camundongo e a média para cada grupo de camundongos foram sumariadas.
Resultados:
Em resumo e como mostrado acima na Tabela 8, uma dose oral única de composto W exibiu eficácia in vivo contra uma infecção de MSSA dos rins experimentalmente induzida (SA29213). Após 24 horas todos os tratamentos mostraram decréscimos em densidade bacteriana comparados com o Controle de Veículo comparado pelo tempo. Composto W demonstrou reduções dependentes da dose de 1,9, 2,3, 2,7, 2,6 e 3,0 Logs de Redução versus Controle de Veículo quando administrado a 16, 49, 99 e 166 mg/kg que forneceu exposições equivalentes de 10, 30, 60 ou 100 mg/kg de com-posto 24. Além disso, doses de 16, 49, 99 e 166 mg/kg de Composto W re-duziram cargas bacterianas versus o Controle Precoce em 0,7-1,5 logs su-gerindo que o Composto 23A tem atividade bactericida.
Exemplo 33
Modelo de Infecção da Coxa de Rato Neutropênico
Animais:
Ratos Sprague Dawley machos, livres de patógeno específico pesando entre 76 a 100 gramas, foram obtidos de Charles River Laboratori-es, Inc. (Wilmington, MA) e utilizados neste experimento. Os animais foram deixados aclimatar durante um mínimo de sete (7) dias antes do início do estudo.
Bactérias:
A linhagem 29213 de ATCC de Staphylococcus aureus (MSSA) sensível à meticilina foi utilizada para experimentaão in vivo. O isolado de teste foi subcultivado duas vezes sobre meio de ágar microbiológico padrão (ágar de soja de tripticase com 5% de sangue de ovelha). A segunda trans-ferência foi feita menos do que 24horas antes do uso na preparação do inó- culo de modelo de infecção da coxa.
Modelo de infecção da Coxa de Rato Neutropênico:
Para induzir neutropenia, os ratos foram tratados com o imunos- supressor ciclofosfamida a 150 mg/kg, administrado em 1 ml por injeção in-traperitoneal (IP), três dias antes da infecção. Os ratos foram infectados por uma injeção de 0,2 ml intramuscular (IM) em ambas as coxas traseiras com uma suspensão de a 107 cfu/ml de Staphylococcus aureus 29213 sensível à meticilina, em salina normal. Após quantidades crescentes de tempo (2 a 26 horas) as duas coxas traseiras de cada animal foram coletadas, enxaguadas com salina estéril, pesadas, em seguida colocadas em 50 ml de salina nor-mal estéril e colocadas sobre gelo úmico até homogeneização. Aproxima-damente metade do volume de amostra homogeneizada total foi passada através de um filtro de poro grande (para remover cartilagem e grumos grandes de pedaços de tecido), diluído em salina e cultivado sobre placas de meio de ágar (ágar de soja de tripticase com 5% de sangue de ovelha). Todas as placas de cultura foram incubadas a aproximadamente 37°C durante 18 a 24 horas. Unidades formadoras de colônia foram enumeradas (em cfu/mL de homogeneizado) e o meio para cada grupo de tratamento e controle foi calculado. Tipicamente cada grupo teve um n = 6; cada coxa foi considerada um número discreto. A media cfu/ml por grupo foi comparada com a densidade bacteriana inicial em 2 horas (Controle Precoce) ou aquela do grupo de controle de veículo comparada pelo tempo (Controle Tardio; LC) coletado simultaneamente.
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Resultados:
Como mostrado acima na Tabela 8, o composto 23a oralmente administrado exibiu eficácia in vivo contra o MSSA (SA 29213). Em 8 horas após a primeira dose todos os grupos tiveram reduções em cargas, em 5 comparação com o controle comparado pelo tempo, ~1,3 de redução log para o composto 23A a 10 mg/kg e ~2 de redução log para o composto 23A a 30 e 60 mg/kg. Em comparação ao controle precoce, o composto 23A a 10 mg/kg manteve o crescimento bacteriano de SA 29213 para pelo menos o ponto de estase, ao passo que o composto 23A a 60 e 100 mg/kg reduziu 10 ligeiramente a carga bacteriana em ~0,5-0,6 logs.
Após 24 horas e uma segunda dose de tratamento administrado em 12horas, um decréscimo em densidade bacteriana comparado ao controle tardio de ~2,4-2,8 logs foi observado para todos os grupos de tratamento. Comparado ao controle precoce um redução log de aproximadamente 0,8 foi 15 observada para o composto 23A a 10 mg/kg, enquanto que o composto 23A a 30 e 60 mg/kg forneceu reduções log de ~ 1,1 -1,2.
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Ratos neutropênicos (3/grupo) foram infectados por desafio intramuscular (IM) com S. aureus (ATCC 29213) a ~2x106 cfu/coxa. Após 2 horas um único grupo de ratos (Controle Precoce (EC)) foi eutanisado e as coxas coletadas, homogeneizadas e semeadas para quantificar cargas de S. aureus. Os ratos infectados adicionais foram tratados por gavagem oral com veículo a 10 ml/kg (10% de Vitamina E/TPGS; Controle Tardio, LC) ou Com-posto 13 a 30, 60, 100 mg/kg. Os grupos de tratamento de 8 horas receberam um único tratamento (QD) e foram eutanisados e coxas coletadas para determinação de cfu 8 horas após o tratamento (QD), enquanto que os gru-pos de tratamento de 24 horas receberam 2 doses com espaço de 12 horas (q12h) e foram eutanisados e coxas coletadas 24 horas após o tratamento. Cargas de cada coxa individual foram determinadas e o cfu/coxa individual e a média do grupo de 3 ratos foi sumariada para cada grupo.
Resultados:
Como mostrado acima na tabela 9, o composto 13, oralmente administrado, exibiu eficácia in vivo contra o MSSA (SA 29213). Diferenças na extensão de atividade antibacteriana foram observadas entre os três gru-pos de tratamento. Em 8 horas após a primeira dose, todos os grupos tiveram reduções em cargas, em comparação com o controle comparado pelo tempo, redução log de ~1,5 para o composto 13 a 10 mg/kg e reduções log de ~1,7 e 1,8 para o composto 13 a 60 e 100 mg/kg. Em 8 horas após a primeira dose, o composto 13 a 10 mg/kg manteve o crescimento bacteriano de SA 29213 para pelo menos o ponto de estase, ao passo que o composto 13 a 60 e 100 mg/kg diminuiu ligeiramente a carga bacteriana versus o Controle Precoce em ~0,4 e ~0,5 logs respectivamente. Após 24 horas e a segunda dose de tratamento administrada em 12 horas, um decréscimo em densidade bacteriana comparado ao controle precoce de aproximadamente 1 log foi exibido pelo composto 13 a 60 e 100 mg/kg. Ao contrário, o composto 13 administrado a 30 mg/kg não pareceu eficaz com níveis de cfu variáveis va-riando 0,3 log maiores do que o controle precoce. Entretanto, todos os níveis de dose diminuíram a densidade bacteriana, em comparação com o controle tardio. Uma redução de ~1,1 log foi observada para o grupo de tratamento de 10 mg/kg, ao passo que uma redução de 2,85 e ~3 logs foi observada para os níveis de dose de 60 e 100 mg/kg.
Em resumo, as doses de q12h de 60 e 100 mg/kg de composto 13 diminuiu o crescimento bacteriano de SA 29213 quando comparado ao grupo de controle inicial em ambos os tempos de avaliação de 8 horas e 24 horas, ao mesmo tempo em que o tratamento com 30 mg/kg limitou o cres-cimento bacteriano em 8 horas, porém foi menos eficaz do que outros gru-pos de tratamento em 24 horas.
Exemplo 34
Estudos de Sete Dias de Toxicidade e Toxicocinéticos Orais em Ratos
Os objetivos deste estudo foram: 1) avaliar a toxicidade potencial do composto 13 e composto 23A quando administrados oralmente por gava- gem a ratos machos durante 7 dias consecutivos e 2) para avaliar os toxico- cinéticos de composto 13, e composto 23A após a primeira e sétima doses. Animais
Espécies, Fonte, História, e Justificativa Ratos Crl:CD(SD) foram obtidos de Charles River Laboratories of Stone Ridge, NY. Os animais foram criados em laboratório e experimen-talmente não submetidos a fármaco. Os ratos foram escolhidos por que eles são uma espécie que é comumente usada para avaliações de toxicidade não clínica. Número, Sexo, Idade, e Faixa de Peso Corporal
Quarenta ratos (20 machos não canulados e 20 machos com cânulas de veia jugular) foram ordenados. Destes animais, 15 machos não canulados e 15 machos canulados foram usados. Os animais foram tão uni-formes em idade quanto possível. Os ratos foram pré-púberes a adultos jo-vens, aproximadamente 9 semanas de idade no início da dosagem. Sua da-ta de nascimento calculada pelo fornecedor foi mantida nos registros do es-tudo. A faixa de peso para os animais no momento da alocação para os gru-pos foi de 218,5 a 306,3 g.
Projeto de Estudo
Os ratos foram designados como mostrados na Tabela 10 abai-xo. Os animais receberam o artigo ou veículo de teste por gavagem oral du- rante 7 dias consecutivos e foram terminados no dia seguinte à conclusão da dosagem. O primeiro dia de dosagem foi designado como o Dia 1 do estudo. Os animais foram avaliados quanto às mudanças em sinais clínicos, peso corporal, e outros parâmetros como descrito abaixo.
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Rotina/Dose
O veículo e artigo de teste foram administrados por gavagem oral uma vez ao dia durante 7 dias consecutivos em um volume de dose de 10 mL/kg de peso corporal para o Grupo A e Grupos B-D, respectivamente. O artigo de teste e veículo foram administrados por gavagem oral duas vezes ao dia, aproximadamente 8 horas de espaço, durante 7 dias consecutivos em um volume de dose de 10 mL/kg de peso corporal para o Grupo E e Grupo F, respectivamente. O volume real administrado a cada animal foi cal-culado e ajustado com base no peso corporal mais recente de cada animal. Observações e Medições Em Vida
Observações
Os animais foram observados quanto à viabilidade pelo menos uma vez pela manhã e uma vez à tarde, pelo menos 4 horas de espaço, du-rante todo o estudo. Durante o period de tratamento, observações cageside diárias foram feitas e registradas pré-dose e pós-dose (após a primeira dose apenas). As observações pós-dose feitas durante o tratamento ocorreram nos seguintes tempos, com base em Cmax/Tmax para os dois compostos de estudos anteriores: 1 hora pós-dose para os Grupos A-F. Uma observação cageside foi feita no dia da necropsia.
Observações não Planejadas
Quaisquer descobertas observadas em tempos que não os tem-pos de observação planejados tiveram que ser registrados em uma observa-ção não planejada ou em Provantis; entretanto, nenhuma anormalidade foi observada em todo o estudo. Provantis é um sistema eletrônico de coleção de dados, controle e relato que é comumente usado na técnica. Pesos Corporais
Antes do início da dosagem, pesos corporais foram medidos pa-ra aleatorização no Dia 1. Durante o tratamento, os pesos corporais foram medidos no Dia 1 e Dia 7. Além disso, pesos corporais jejuados foram medi-dos antes da necropsia para cálculo das relações órgão/peso corporal. Consumo de Alimento
Em todo o estudo, o consumo de alimento foi medido diariamen-te iniciando 3 dias antes do início de dosagem.
Avaliação de Patologia Clínica
Amostras de sangue para avaliação de hematologia, coagula-ção, e parâmetros de química de soro foram coletadas de todos os animais a partir do plexo retro-orbital (sob anestesia de CO2/O2, para os animais do estudo principal) ou cânula da veia jugular (para os animais toxicocinéticos) antes da necropsia. Devido à heparina residual usada para manter as cânu-las evidentes para os animais toxicocinéticos, amostras de coagulação des-tes ratos, não foram capazes de ser analisadas. Os animais foram jejuados durante a noite antes da coleção de sangue. No dia de coleção de sangue para análises de patologia clínica, os animais não foram necropsiados até após o sangue ser coletado e as amostas avaliadas serem aceitáveis pelo grupo de patologia clínica.
Hematologia
Uma quantidade apropriada de sangue foi coletada em tubos contendo EDTA. As amostras de sangue foram analisadas quanto aos parâmetros indicados abaixo na tabela 11. Tabela 11 - Parâmetros de Sangue Total
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Coagulação
Uma quantidade apropriada de sangue foi coletada em tubos contendo citrato de sódio e em seguida centrifugada para obter plasma para a determinação de tempo de protrombina (PT) e tempo de troboplastina par-cial ativada (APTT).
Química de Soro
Uma quantidade apropridada de sangue foi coletada em tubos sem anticoagulante. A amostra foi deixada coagular e em seguida foi centri-fugada para obter soro. O soro foi analisado quanto aos parâmetros indica-dos abaixo na tabela 12. Tabela 12 - Parâmetros de Soro
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Toxicocinéticas
No 1o e 7o dias de dosagem, amostras sanguíneas (aproxima-damente 0,5 mL/amostra) foram coletadas a partir da cânula da veia jugular para todos os animais toxicocinéticos nos pontos do tempo listados abaixo em tubos contendo K3EDTA. Animais toxicocinéticos do grupo de controle (Grupo F) tiveram apenas uma única amostragem de coleta de sangue de cada dia de coleta no ponto do tempo de 1 hora (seguindo a primeira admi-nistração de dose do dia). Antes de cada coleta, uma pequena amostra de sangue (com solução de bloqueio de heparina) foi removida da cânula e descartada. Uma nova seringa foi colocada na cânula, e a amostra requerida no protocolo foi tirada. A seringa com a amostra de sangue foi removida, e uma nova seringa com salina ligada à cânula. O volume de sangue foi subs-tituído por um volume igual de salina e em seguida solução de bloqueio co-locada na cânula. Cada animal foi retornado para sua gaiola até o próximo momento de coleta.
Todas as amostras coletadas durante este estudo foram coloca-das em recipientes rotulados. Cada rótulo continha a seguinte informação: 1) Número de estudo, 2) Número de animal, 3) Intervalo de coleta, 4) Grupo e Sexo, e 5) Dados de coleta.
As amostras de sangue foram misturadas imediatamente inver-tendo-as, em seguida colocadas sobre gelo úmido e centrifugadas frias (~1500g, ~10 minutos, ~ 5 °C) para obter plasma. O plasma foi dividido em tubos de polipropileno de 1,4 mL de 96 cavidades com tampas sem DNase, RNase, certificadas capcluster de TPE perfurável como 2 alíquotas e arma-zenados congelados ( < -70 °C).
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1 Todas as amostras foram coletadas dentro da janela de coleta. 2 Após o dia 1 dosagem apenas. 3 Obtido de Grupos E e F antes da administração de dose PM . 4 Após o dia 7 dosagem apenas.
Terminação
Nenhum animal foi julgado moribundo durante o estudo. Todos os animais de estudo foram eutanizados e submetidos a uma necropsia se-guindo o número de dias de tratamento prescrito pelo protocolo. Todos os animais foram terminados por exsanguinação (cortando a aorta abdominal ao mesmo tempo em que sob anestesia profunda por CO2/O2).
Necropsia
Uma necropsia com coleta de tecidos foi conduzida em todos os animais terminados durante o estudo. A necropsia incluiu exame de : carcaça e sistema muscular/esqueletal; todas as superfícies ex-ternas e orifícios; cavidade craniana e superfície externa do cérebro; pescoço com órgãos e tecidos associados; e cavidades toráxica, abdominal, e pélvica com seus órgãos e te-cidos associados. Todas as anormalidades foram descritas e registradas.
Pesos do Órgão
Para todos os animais eutanizados em necropsias planejadas, os rins, fígado, e glândula da prostate foram pesados. Após a pesagem, uma amostra de aproximadamente 1 grama de fígado e rins foi pesada, transferi-da para tubos de homogeneização de tecido CK28 de 7 mL Precellys (Cat. No. 0904-01), congelada instantaneamente, e analisada.
As relações de órgão/corpo foram calculadas usando o peso corporal jejuado terminal obtido antes da necropsia.
Preservação de Tecido e Coleta de Medula Óssea
Os tecidos e órgãos indicados abaixo na tabela 14 foram coleta-dos de todos os animais, e foram preservados em formalina tamponada neu-tra a 10% com a exceção dos testículos, epidídimos, e olhos. Testículos, epidídimos, e olhos com nervo ótico ligado foram fixados em Solução de Da-vidson Modificada durante ~24 a 48 horas, enxaguados com água, e em se-guida transferidos para formalina tamponada neutra a 10% para armazena- gem.
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aTireoide pesada com paratireoides ligadas.
Histopatologia
Para todos os animais planejados para a necropsia terminal, os rins, fígado, e prostate foram inseridos em parafina, seccionados e mancha- dos com hematoxilina e eosina para outro exame por microscopia leve. Para os Grupos A, D, E, e F apenas, os tecidos restantes listados acima foram inseridos em parafina, seccionados e manchados com hematoxilina e eosina para outro exame por microscopia leve.
Análise Estatística
Onde apropriado, dados animais numéricos foram avaliados es tatisticamente.
Para estatísticas comparativas, Grupo A (grupo de controle) foi comparado aos Grupos B e C (grupos tratados, QD dosado) e Grupo F (grupo de controle, BID dosado) foi comparado ao Grupo E (grupo tratado, BID 15 dosado). Os dados foram avaliados usando o Teste Levene quanto à homogeneidade de variações e o teste Shapiro-Wilks quanto à normalidade de distribuições, com significância em p < 0,05. Os dados determinados serem homogeneous e de distribuição normal foram avaliados por análise de variação (ANOVA). Se a significância verificada por ANOVA em p<0,05, comparações par a par de cada grupo testado com o respectivo grupo de controle foram feitas usando um teste paramétrico (Teste Dunnett) para identificar as diferenças estatísticas (p<0,05). Os dados determinados serem não homogêneos ou de distribuição anormal foram avaliados usando um Teste Kruskal-Wallis quanto à significância de fator de grupo. Se a significância (p <0,05) existiu entre os grupos, um teste não paramétrico (Wilcoxonwith Bon- ferroni-Holm), foi usado para comparar os grupos de tratamento ao grupo de controle. Os dados de consumo de alimento de animais onde derramamento ocorreu foram excluídos do período de tempo aplicável. Estatísticas comparativas de dados de consume de alimento foram limitados ao Teste Dunnett (paramétrico). Estatísticas não foram realizadas sobre o consumo de alimento pré-teste (Dia 4 ao Dia 1).
Resultados
As exposições para diferentes níveis de dosagem de composto 23A e Composto 13 foram relacionadas com a dose. Nenhuma observação ou efeito adverso sobre o peso corporal médio foi observado em animais tratados com o Composto 13 ou Composto 23A. O consumo médio de ali-mento foi reduzido durante os diferentes intervalos do estudo para animais tratados uma vez ao dia com o Composto 13 (100 ou 200 mg/kg) e duas ve-zes aodia com o Composto 23A (300 mg/kg). Entretanto, como o consumo diminuído de alimento não foi correlacionado com as mudanças de peso corporal nos grupos de Composto 13 e Composto 23A, estes efeitos não foram considerados serem adversos ou biologicamente significantes. A con-centração de íon de cálcio media (CA) foi estatisticamente menor, enquanto que a ALT media e a AST para o grupo de ratos administrados 300 mg/kg de Composto 23A duas vezes ao dia foiram estatisticamente maiores quando compaadas aos controles tratados duas vezes ao dia. Nenhuma descogerta histopatológica relacionada com o artigo de teste foi observada para animais recebendo ou o Composto 13 ou Composto 23A em qualquer regime de do- se.
Dentro do escopo deste estudo e com base na ausência de mu-danças em peso corporal, patologia clínica, e histopatologia, o NOEL (Nível de Efeito Não Observável) para o Composto 13 administrado a ratos machos uma vez ao dia durante 7 dias oralmente por meio de gavagem foi de 200 mg/kg (844 μg*hr/ml Dia 7 AUC), enquanto que o NOEL para o Composto 23A administrado uma vez ao dia foi de 100 mg/kg (82 μg*hr/ml de AUC). O NOAEL (Nível de Efeito Adverso Não Observável) para o Composto 23A administrado a ratos machos duas vezes ao dia durante 7 dias oralmente por meio de gavagem foi de 300 mg/kg (291 μg*hr/ml AUC).
Portanto, os compostos 13 e 23A não demonstraram toxicidade adversa dentro do escopo do estudo em níveis de dose até 200 mg/kg/dia e 600 mg/kg/dia, respectivamente.
Exemplo 35
Um Estudo de Toxicidade e Toxicocinética Encontrada na Faixa Oral em Camundongos Cinomolgos Machos
Os objetivos deste estudo foram 1) avaliar a toxicidade potencial de composto 23 quando administrados oralmente por gavagem a macacos Cinomolgos machos durante 7 dias consecutivos; e 2) avaliar as toxicociné- ticas do composto 23 após a primeira e sétima doses.
Animais
Espécies, Fonte, História, e Justificativa Macacos cinomolgos (Macaca Fascicularis) foram obtidos de Primus Bio-ReFontes Inc. of PinCourt, Quebec, Canadá. Os macacos cino- molgos foram escolhidos por que eles são uma espécie não roedora que é comumente usada para avaliações de toxicidade não clínica. Número, Sexo, Idade, e Faixa de Peso Corporal Oito (2 não submetidos a tratamento e 6 submetidos a tratamen-to) machos foram usados no estudo. Os animais eram adultos jovens e pe-sados entre 2 a 4 kg no início de dosagem.
Projeto de Estudo
Os animais foram designados como mostrado na Tabela 15 a- baixo. Os animais receberam o Composto 23 ou veículo por gavagem oram uma vez por dia durante 7 dias consecutivos e foram terminados no dia seguinte ao término da dosagem. O primeiro dia de dosagem foi designado como o Dia 1 do estudo. O volume real administrado a cada animal foi calculado e ajustado com base no peso corporal mais recente de cada animal. Tabela 15 - Designação do Grupo e Níveis de Dose
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* Os animais de controle receberam o controle /veículo (20% de captisol / 1% de HPMCAS / 1% de PVP em tampão a 0,01M de KCl/HCL) apenas. Observações e Medições Em Vida
Observações
Sinais clínicos cage-side (enfermidade, mudanças comporta- mentais etc.) foram registrados pelo menos uma vez ao dia durante o estudo.
Pesos Corporais
Os pesos corporais foram registrados para todos os animais an-tes da designação do grupo e nos dias 1 (antes da dosagem), 3 e 7 assim como terminalmente antes da necropsia (jejuado).
Electrocardiografia (ECG)
Electrocardiogramas (derivações de membro bipolares I, II e III, e derivações unipolares aumentadas aVR, aVL e aVF) foram obtidos para todos os macacos uma vez durante o período de pretratamento e novamente no Dia 7 (após a dosagem).
Os traços foram avaliados quanto às mudanças maciças indica-tivas de disfunção elétrica cardíaca. A presença potencial de anormalidades envolvendo ritmo cardíaco (derivação II), ritmo do seio e atrioventricular ou condutividade foi determinada. Ritmo cardíaco, intervalo de PR, duração de QRS, valores de intervalos QT e QTc foram medidos.
Toxicocinéticas
Uma série de 7 amostras de sangue (aproximadamente 0,5 mL de cada) foi coletada de cada macaco nos dias 1 e 7 nos seguintes pontos do tempo: predose, 30 minutos e 2, 3, 6, 12 e 24 horas após a dose. Para este propósito, cada macaco foi sangrado por venipunção e as amostras foram coletadas em tubos contendo o anticoagulante, K2EDTA. Os tubos foram colocados sobre gelo úmido até estarem prontos para processamento. Patologia Clínica
Investigações de laboratório (hematologia, coagulação, química clínica e urinálise) foram realizadas em todos os animais antes do início do tratamento e antes do término no Dia 8.
Amostras de sangue foram coletadas por venipunção seguindo um período durante a noite de privação de alimento consistindo em pelo me-nos 12 horas, porém não mais do que 20 horas. Urina foi coletada de ani-mais privados de alimento e água, durante a noite (pelo menos 12 horas, porém não mais do que 20 horas). Hematologia
Os seguintes parâmetros foram medidos sobre amostras de sangue coletadas em anticoagulante EDTA: contagem de célula vermelha do sangue, média de hemoglobina corpuscular (calculada), Hematócrito (calculado), volume corpuscular médio, hemoglobina, morfologia de células, contagem de célula branca do sangue, contagem de plaqueta, diferencial de célula branca do sangue (absoluto), reticulócito (absoluto e percentagem) e concentração de hemoglobina corpuscular média (calculada).
Coagulação
Tempo de tromboplastina parcial ativada e tempo de protrombi- na, foram medidos nas amostras de sangue coletadas em anticoagulante de citrato.
Química Clínica
Os seguintes parâmetros foram medidos em amostras de sangue coletadas em tubos contendo ativador de coagulação: relação a/g (cal-culada), creatinina, alanina aminotransferase, globulina (calculada), albumi- na, glicose, fosfatase alcalina, fósforo (inorgânico), aspartato aminotransfe-rase, potássio, bilirubina (total), sódio, cálcio, proteína total, cloreto, triglicerí- deos, colesterol (total), ureia, gama glutamiltransferase e sorbitol desidroge- nase.
Urinálise
Os seguintes parâmetros foram medidos em amostras de urina: bilirubina, proteína, sangue, microscopia de sedimento, cor e aparência, gra-vidade específica, glicose, urobilinogênio, cetonas, volume e pH.
Terminação
Todos os animais foram eutanizados no término do period de tratamento no Dia 8, seguindo um período durante a noite sem alimento. Os macacos foram pré-anestesiados com Cetamina e em seguida eutanizados por uma dose excessiva intravenosa de pentobarbital de sódio, seguido por exsanguinação por transecção de vasos sanguíneos maiores.
Necropsia
Uma necropsia com coleta de tecidos foi conduzida em todos os animais terminados durante o estudo. A necropsia incluiu exame de: carcassa e sistema muscular/esqueletal; todas as superfícies e orifícios externos; cavidade craniana e superfície externa do cérebro; pescoço com órgãos e tecidos associados; e cavidades torácica, abdominal, e pélvica com seus órgãos e te-cidos associados.
Todass as anormalidades foram descritas e registradas. Preservação de Tecido
Na conclusão do exame total e pesagem de órgão selecionado, os tecidos e órgãos foram mantidos como mencionado abaixo na Tabela 16. Formalina a 10% tamponada neutral foi usada para fixação e preservação, a menos que de outro modo indicado.
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Histopatologia
Para todos os animais, todos os tecidos indicados acima foram inseridos em parafina, seccionados e manchados com hematoxilina e eosina e examinados por microscopia de luz.
Resultados
As exposições para diferentes níveis de dosagem de composto 23 foram relacionadas com a dose.
Não houve nenhum sinal clínico, ou mudanças em pesos corpo-rais, parâmetros de electrocardiografia, parâmetros de patologia clínica, ou pesos de órgão que podem ser atribuídos à administração de composto 23 em doses até 200 mg/kg/dia. Similarmente, não houve nenhuma descoberta macroscopic ou microscopic que pudesse claramente ser atribuída à admi-nistração de composto 23 em doses até 200 mg/kg/dia. O nível de efeito não observado (NOEL) para o composto 23 em macacos Cinomolgos foi deter-minado ser de 200 mg/kg/dia.
Exemplo 36 ESTUDOS FARMACOCINÉTICOS
Os parâmetros farmacocinéticos de compostos selecionados desta invenção foram determinados nos experimentos descritos abaixo. Pro-cedimentos analíticos gerais e protocolos experimentais específicos foram empregados como segue:
Procedimentos Analíticos Gerais
Os seguintes procedimentos analíticos gerais foram empregados nos experimentos farmacocinéticos descritos abaixo:
Análise de Amostra.
Concentrações de composto 23 e Composto W em plasma foram determinadas usando um método de cromatografia líquida de alto de-sempenho / espectrometria de massa tandem (HPLC/MS/MS). Antes da ex-tração, amostras de plasma foram diluídas usando plasma absoluto 2-, 4-, 5, ou 10-vezes, como necessário, dependendo do nível de dose ou formula-ção. O Composto 23 e Composto W juntamente com o padrão interno (IS) foram extraídos de (diluídos), 100 μL cada, por precipitação de proteína direta com acetonitrila (relação de 1:4 de plasma/acetonitrila). Após centrifuga- ção, o extrato de sobrenadante (10 μL) foi injetado sobre o sistema de LC/MS/MS. O sistema de HPLC incluiu uma coluna C18 Waters Xterra MS, 5 mícrons, 2,1 mm de diâmetro x 50 mm de comprimento, eluída com uma fase móvel gradiente, consistindo em 0,1% de ácido fórmico em água ou em acetonitrila.
Os analisados foram detectados por MS/MS com Ionização Química de Pressão Atmosférica (APCI) no modo de múltipla monitoração de reação (MRM). O menor limite de quantificação (LLOQ) foi de 1, 2, 4, 5, 10, ou 20 ng/mL, dependendo do fator de diluição de amostra. A faixa linear do ensaio foi de 1 a 5000 ng/mL. A precisão do ensaio intra-dia e inter-dia foi dentro de 2% dos valores nominais. A variabilidade do ensaio intra- e inter- dia foi de <10%.
Amostras da formulação de suspensão da dose de composto W foram ensaiadas com um método HPLC/UV após 10 vezes a 500 ou 1000 vezes de diluição com DMSO:acetonitrila:água (33:33:33) dependendo do nível de dose ou formulação. Amostras da Formulação de solução de dose de composto W foram ensaiadas com um método HPLC/UV após 10, 50, 100 ou 500 vezes de diluição com DMSO:água (50:50) dependendo do nível de dose ou formulação.
Análise de Dados Farmacocinéticos.
Perfis de tempo-concentração plasmática de composto 23 e composto W foram analisados por métodos farmacocinéticos não comparti-mentais usando o software WinNonlin® Edição Professional, Versão 5.1.1 (Pharsight Corporation, Mountain View, CA).
Parâmetros farmacocinéticos essenciais incluindo AUCall, AUCex- trap, Cmax, tmax, Cl_obs, Vss_obs e t1/2 foram determinados.
Análise de Dados Estatísticos.
Dados estatísticos descritivos de concentrações plasmáticas e estimativas de parâmetros farmacocinéticos foram calculados, incluindo a média, desvio padrão (SD), e coeficiente de variação (%CV) usando o soft-ware WinNonlin, Versão 5.1.1 ou Microsoft Excel 2000.
Estudo Oral de Camundongo
Macacos cinomolgos machos (n=3 por grupo de dose) foram administrados doses PO nominais únicas de 3, 30 e 300 mg/kg de composto W por gavagem. O Composto W foi formulado em 0,5% MC (celulose micro- cristalina). Os animais tiveram livre acesso a alimento e água antes e após a dosagem.
Amostras de sangue (aproximadamente 0,25 mL cada) foram coletadas por meio de um catéter de artéria carótida antes da dosagem e em 0 (predose), 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 24, 48 horas pós dose. Cada a-mostra de sangue foi coletada em um tubo que foi mantido sobre gelo úmido e continha EDTA de potássio como o anticoagulante. Plasma foi separado e armazenado em aproximadamente -70°C até a análise.
Amostras de plasma foram analisadas usando um método de cromatografia líquida / espectrometria de massa tandem (LC/MS/MS) para determinar as concentrações de composto 23 e Composto W com um limite inferior de quantificação (LLOQ) de 1 a 20 ng/mL, dependendo do fator de diluição de amostra. Concentração de plasma vs. dados de tempo foi sub-metidaà análise farmacocinética não compartimental (PK). Os resultados desta análise são fornecidos na tabela 17.
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Estudo IV de Macaco
Macacos cinomolgos machos (n=3 por grupo de dose) foram administrados uma dose de bolo IV nominal única de 1 mg/kg de composto W por meio de uma cânula de veia jugular. O composto W foi formulado em D5W (5% de dextrose em solução de água). Os animais tiveram livre acesso a alimento e água antes e após a dosagem.
Amostras de sangue (aproximadamente 0,25 mL cada) foram coletadas por meio de um catéter de artéria carótida antes da dosagem e a 0 (predose), 5 min, 10 min, 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 24, 48 horas após a dose. Cada amostra de sangue foi coletada em um tubo que foi mantido so-bre gelo úmido e continha EDTA de potássio como o anticoagulante. Plasma foi separado e armazenado a aproximadamente -70°C até a análise.
Amostras de plasma foram analisadas usando um método de cromatografia líquida / espectrometria de massa tandem para determinar as concentrações de composto 23 e Composto W, com um limite inferior de quantificação (LLOQ) de 1 a 20 ng/mL, dependendo do fator de diluição da amostra. Concentração plasmática versus dados de tempo foi submetida à análise farmacocinética não compartimental (PK). Os resultados desta análi-sesão fornecidos na tabela 18. Tabela 18. Dados Farmacocinéticos de Estudo IV de Macaco
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Estudo Oral de Rato
Grupos de ratos Sprague Dawley machos (n=3 por grupo de do- se) foram administrados doses orais nominais únicas de 3, 10, 30, 300 mg/kg de composto W por gavagem. O composto W foi formulado em ou 0,5% MC (celulose microcristalina) ou 20% de Captisol, 1% HPMC-AS (hidroxipropyl metilcellulose acetyl succinate), 1% PVP (polyvinylpyrrolidone). Os animais tiveram livre acesso a alimento e água antes e após a dosagem. Amostras de sangue (aproximadamente 0,25 mL cada) foram coletadas por meio de um catéter de artéria carótida antes da dosagem e a 0 (pre dose), 0,25, 0,5, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 12, 24 horas após a dose. Cada amostra de sangue foi coletada em um tubo que foi mantido sobre gelo úmido e con-tinha EDTA de potássio como o anticoagulante. O plasma foi separado e armazenado a aproximadamente -70°C até a análise.
Amostras de plasma foram analisadas usando um método de cromatografia líquida / espectrometria de massa tandem para determinar as concentrações de composto 23 e Composto W com um limite inferior de quantificação (LLOQ) de 1 a 20 ng/mL, dependendo do fator de diluição da amostra. Concentração plasmática versus dados de tempo foi submetida à análise farmacocinética não compartimental (PK). Os resultados desta análi-sesão fornecidos na tabela 19. Tabela 19. Dados Farmacocinéticos de Estudo Oral de Rato
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Estudo IV de Rato
Grupos de ratos Sprague Dawley machos (n=3 por grupo de do- se) foram administrados doses de bolo IV nominais únicas de 1 e 5 mg/kg de composto W por meio de uma cânula de veia jugular. Composto W foi formulado em D5W. Os animais tiveram livre acesso a alimento e água antes e após a dosagem. Amostras de sangue (aproximadamente 0,25 mL cada) foram coletadas por meio de um catéter de artéria carótida antes da dosagem e a 0 (predose), 5 min, 10 min, 0,25, 0,5, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 12, 24horas após a dose. Cada amostra de sangue foi coletada em um tubo que foi mantido sobre gelo úmido e continha EDTA de potássio como o anticoagulante. Plasma foi separado e armazenado a aproximadamente -70°C até a análise.
As amostras de plasma foram analisadas usando um método de cromatografia líquida / espectrometria de massa tandem para determinar as concentrações de composto 23 e Composto W com um limite inferior de quantificação (LLOQ) de 1 a 20 ng/mL, dependendo do fator de diluição da amostra. Concentração plasmática versus dados de tempo foi submetida à análise farmacocinética não compartimental (PK). Os resultados desta análi-sesão fornecidos na tabela 20. Tabela 20. Dados Farmacocinéticos de Rat IV Study
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Estudo Oral de Camundongo
Grupos camundongos CD-1 fêmeas (n=3 por grupo de dose) fo-ram administrados doses orais nominais únicas de 10, 30, 100 mg/kg de composto W por gavagem. Composto W foi formulado em 0.5% MC. Os a-nimais tiveram livre acesso a alimento e água antes e após a dosagem. A-mostras de sangue (aproximadamente 0,025 mL cada) foram coletadas da veia submandibular antes da dosagem e a 0 (predose), 0,25, 0,5, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 12, 24 horas após a dose. Cada amostra de sangue foi coletada em um tubo que foi mantido sobre gelo úmido e continha EDTA de potássio como o anticoagulante. Plasma foi separado e armazenado a aproximadamente -70°C até a análise. Amostras de plasma foram analisadas usando um método de cromatografia líquida / espectrometria de massa tandem com um limite infe-rior de quantificação (LLOQ) de 1 a 20 ng/mL, dependendo do fator de dilui-ção da amostra. Concentração plasmática versus dados de tempo foi sub-metidaà análise farmacocinética não compartimental (PK). Os resultados desta análise são fornecidos na tabela 21. Tabela 21. Dados Farmacocinéticos de Estudo Oral de Camundongo
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Os estudos descritos acima demonstram que o composto W é convertido in vivo no composto 23, em pelo menos ratos, cães e macacos. Exemplo 37
ESTUDOS DE ENZIMOLOGIA
As atividades de inibição de enzima de compostos selecionados desta invenção foram determinadas nos experimentos descritos abaixo: Ensaio de DNA Girase ATPase
A atividade de hidrólise de ATP de S. aureus DNA Girase foi medida por acoplamento da produção de ADP através de piruvato cina- se/lactato desidrogenase à oxidação de NADH. Este método foi descrito an-teriormente (Tamura e Gellert, 1990, J. Biol. Chem., 265, 21342).
Ensaios de ATPase foram realizados a 30oC em soluções tam- ponadas contendo TRIS a 100 mM, pH 7,6, MgCl2 a 1,5 mM, KCl a 150 mM. O sistema de acoplamento contém concentrações finais de piruvato de fos- foenol a 2,5 mM, dinucleotídeo de adenina de nicotinamida a 200 μM (NA- DH), 1 mM DTT, 30 ug/ml de cinase de piruvato, e 10 ug/ml de lactato desi- drogenase. A enzima (concentração final a 90 nM) e uma solução de DMSO (3 % de concentração final) do composto selecionado foram adicionadas. A mistura de reaçãofoi deixada incubar durante 10 minutos a 30oC. A reação foi iniciada pela adição de ATP a uma concentração final de 0,9 mM, e a ta-xa de desaparecimento de NADH foi monitorada a 340 nanômetros durante o curso de 10 minutos. Os valores Ki e IC50 foram determinados dos perfis da taxa versus a concentração.
Os compostos selecionados da presente invenção foram consta-tados inibirem a S. aureus DNA girase. A tabela 22 mostra a atividade inibi-tóriadestes compostos no ensaio de inibição de S. aureus DNA Girase. Tabela 22. Inibição de S. aureusDNA Girase
Figure img0091
Ensaio de DNA Topo IV ATPase
A conversão de ATP em ADP pela enzima S. aureus TopoIV foi acoplada a uma conversão de NADH em NAD+, e o progresso da reação foi medido pela mudança em absorvência a 340 nm. TopoIV (64 nM) foi incuba-da com o composto selecionado (3% de DMSO final) em tampão durante 10 minutos a 30 °C. O tampão consistiu em Tris 7,5 a 1 00 mM, MgCl2 a 1,5 mM, 200 mM de K^Glutamato, piruvato de fosfoenol a 2,5 mM, NADH a 0,2 mM, DTT a 1 mM, 5 μg/mL de DNA linearizado, 50 μg/mL de BSA, 30 μg/mL de piruvato cinase, e 10 μg/mL de lactato desidrogenase (LDH). A reação foi iniciada com ATP, e as taxas foram monitoradas continuamente durante 20 minutos a 30°C em uma leitora de placa Molecular De vices SpectraMAX. A constante de inibição, Ki, e o IC50 foram determinados de plotes de taxa ver-sus a concentração de composto selecionado ajustado à Equação de Morri-son para inibidores de ligação firme.
Compostos selecionados da presente invenção foram constata-dos inibirem S. aureus DNA Topo IV. A tabela 23 mostra a atividade inibitória destes compostos no ensaio de inibição de S. aureus DNA Girase. Tabela 23. Inibição de S. aureusDNA Topo IV
Figure img0092
Exemplo 38 ESTUDO DE SOLUBILIDADE AQUOSA
As solubilidades aquosas de composto 23 e composto W foram determinadas de acordo com o seguinte procedimento.
Preparação de Amostras.
Amostras aquosas de cada composto foram preparadas como segue. Compostos foram pesados (20 a 30 mg de composto) em frascone- tes transparentes de 4 ml antes da adição de água (0,5 mL) e agitação por agitador magnético. HCl a 1,0 N foi adicionado à suspensão para ajustar o pH à faixa desejada. Após agitar durante 96 horas em temperatura ambiente, a suspensão foi filtrada através de um filtro de 0,22 mícron (Millipore, filtros centrífugos Ultrafree, Durapore PVDF 0,22μm, Cat# UFC30GVNB). O filtrado foi coletado e o pH medido com um medidor de pH. O filtrado contendo o composto W foi diluído 10 vezes paa fornecer uma concentração apropriada para análise de HPLC. O filtrado contendo o composto 23 não requereu diluição.
Preparação de Soluções Padrão.
Soluções padrão de cada composto foram preparadas de acordo com o seguinte procedimento. 1 a 2 mg de cada composto foram precisa-mente pesados em um frasco volumétrico de 10 mL e ou água (para o com-postoW) ou 1:1 metanol : HCl a 0,1N (para o composto 23) foi adicionado para completamente dissolver o composto. Tratamento com som foi realizado para o composto 23 para auxiliar com a dissolução em 1:1 metanol : HCl a 0,1N. Quando todos os sólidos dissolvidos, solvente adicional foi adicionado para ajustar o volume de cada solução a 10 ml. As soluções resultantes foram cuidadosamente misturadas para fornecer as soluções padrão de ca-da composto. Cada solução padrão foi em seguida diluída com solvente em 2 vezes, 10 vezes, e 100 vezes.
Análise de Solubilidade.
Alíquotas de cada amostra e cada solução padrão foram anali-sadas por análise de HPLC (Agilent 1100, volume de injeção 10 μL, compri-mento de onda 271nm, coluna XTerra® Fenil 5μm, 4,6 x 50 mm, Parte No. 186001144, fase móvel: A: 0,1% de TFA em água, 0,1% de TFA em AcN). Cada solução padrão foi injetada três vezes, e cada das amostras foi injetada duas vezes. As curvas padrão foram obtidas por plotagem da media da area de pico da HPLC versus as concentrações das soluções padrão (com correções apropriadas dos pesos dos padrão sobre o teor de água total do sólido como determinado por análise elementar). A concentração de cada amostra foi calculada a partir da área de pico da amostra aquosa dos resul-tados da HPLC e a inclinação e interceptação das curvas padrão. Os valores de solubilidade listados na tabela 24 abaixo foram derivados do produto da concentração da amostra e o fator de diluição da amostra. Tabela 24. Solubilidade Aquosa de Compostos 23 e W
Figure img0093
Exemplo 39 ESTUDO DE METABOLISMO IN VIVO EM CÉLULAS S9 HEPÁTICAS E DO FÍGADO
A conversão de composto W em composto 23 foi estudada em frações de S9 do fígado e intestinais de ratos, cães, macacos e humanos. O composto W foi incubado a 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 20, 40, 100, 200, 300 μM em frações de S9 do fígado e em 1, 3, 10, 20, 100, 300, 500, 1000 μM em frações de S9 intestinais. As incubações foram feitas durante 0, 5, 10, 15, 30, 45 ou 60 minutos. A formação de composto 23 foi quantificada por LC/MS- MS e os dados foram ajustados à equação Michaelis Menten. Os dados na tabela 25 abaixo indicam que o composto W rapidamente converte-se no composto 23 nestas frações S9 hepáticas e intestinais. Tabela 25. Velocidade de formação (VMAX) de composto 23 a partir do composto W em S9 de Fígado e Intestinal.
Figure img0094
*ND: Parâmetros não determinados, taxa de formação não saturada.

Claims (16)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula
Figure img0095
em que R é hidrogênio ou flúor; X é hidrogênio, -PO(OH)2, - PO(OH)O-M+, -PO(O-)2‘2M+, ou -PO(O>D2+; M+é um cátion monovalente farmaceuticamente aceitável; e D2+é um cátion divalente farmaceuticamente aceitável; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula
Figure img0096
em que R é hidrogênio ou flúor; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
3. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tem a fórmula
Figure img0097
em que X é -PO(OH)2, -PO(OH)O-M+, -PO(O>2M+, ou -PO(O- )2^D2+; M+é um cátion monovalente farmaceuticamente aceitável; e D2+é um cátion divalente farmaceuticamente aceitável; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
4. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tem a fórmula
Figure img0098
em que R é hidrogênio ou flúor; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
5. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o composto é (R)-1-etil-3-(5-(2-(2-hidroxipropan-2-il)pirimidin-5-il)-7- (tetra-hidrofuran-2-il)-1H-benzo[d]imidazol-2-il)ureia, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou em que o composto é (R)-1-etil-3-(6- flúor-5-(2-(2-hidroxipropan-2-il)pirimidin-5-il)-7-(tetra-hidrofuran-2-il)-1H- benzo[d]imidazol-2-il)ureia, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
6. Sal de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o sal é um sal de ácido metanossulfônico de (R)-1-etil-3-(5-(2-(2- hidroxipropan-2-il)pirimidin-5-il)-7-(tetra-hidrofuran-2-il)-1H-benzo[d]imidazol- 2-il)ureia ou em que o sal é um sal de ácido metanossulfônico de (R)-1-etil-3- (6-flúor-5-(2-(2-hidroxipropan-2-il)pirimidin-5-il)-7-(tetra-hidrofuran-2-il)-1H- benzo[d]imidazol-2-il)ureia.
7. Composto de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que X é -PO(OH)O-M+, -PO(O-)2‘2M+, ou -PO(O>D2+; M+ é selecionado de um grupo que consiste em Li+, Na+, K+, N-metil-D-glucamina, e N(R9)4+, em que cada R9 é independentemente hidrogênio ou um grupo C1C4alquila; D2+ é selecionado de um grupo que consiste em Mg2+, Ca2+, e Ba2+.
8. Composto de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que X é -PO(OH)O-M+ ou -PO(O-)2^2M+; M+ é selecionado de um grupo que consiste em Li+, Na+, K+, N-metil-D-glucamina, e N(R9)4+, em que cada R9 é independentemente hidrogênio ou um grupo C1-C4 alquila.
9. Composto de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que X é -PO(O-)2^2M+; M+ é selecionado de um grupo que consiste em Li+, Na+, K+, N-metil-D-glucamina, e N(R9)4+, em que cada R9 é independentemente hidrogênio ou um grupo C1-C4 alquila.
10. Composto de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o composto é fosfato de (R)-2-(5-(2-(3-etilureído)-6-flúor-7-(tetra- hidrofuran-2-il)-1H-benzo[d]imidazol-5-il) pirimidin-2-il)propan-2-ila de dissódio.
11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que que compreende um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um portador, adjuvante, ou veículo farmaceuticamente aceitável.
12. Método de diminuir ou inibir a quantidade de bacteriana de Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Clostridium difficile, Moraxella catarrhalis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Mycobacterium avium complex, Mycobacteriumabscessus, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium ulcerans, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenesou estreptococos β-hemoliticos em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende contatar a referida amostra biológica com um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
13. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que é para uso no controle, tratamento ou redução no avanço, severidade ou efeitos de uma infecção bacteriana nosocomial ou uma não nosocomial.
14. Composto, como definido na reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que uma infecção bacteriana é caracterizada pela presença de um ou mais de Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Clostridium difficile, Moraxella catarrhalis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Mycobacterium avium complex, Mycobacterium abscessus, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium ulcerans, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes ou estreptococos β-hemoliticos.
15. Composto de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato que uma infecção bacteriana é selecionada de um ou mais dos seguintes: infecções respiratórias superiores, infecções respiratórias inferiores, infecções do ouvido, infecções pleuropulmonares e bronquiais, infecções do trato urinário complicadas, infecções do trato urinário descomplicadas, infecções intra-abdominais, infecções cardiovasculares, uma infecção da corrente sanguínea, sepse, bacteremia, infecções do SNC, infecções da pele e tecido mole, infecções do GI, infecções ósseas e de articulação, infecções genitais, infecções dos olhos, ou infecções granulomatosas, infecções da pele e estrutura da pele descomplicadas (uSSSI), infecções da pele e estrutura da pele complicadas (cSSSI), infecções de catéter, faringite, sinusite, otite externa, otite média, bronquite, empiema, pneumonia, pneumonia bacteriana adquirida em comunidade (CABP), pneumonia adquirida em hospital (HAP), pneumonia bacteriana adquirida em hospital, pneumonia associada com ventilador (VAP), infecções do pé diabético, infecções por enterococos resistentes à vancomicina, cistite e pielonefrite, cálculos renais, prostatite, peritonite, infecções intra-abdominais complicadas (cIAI) e outras infecções inter-abdominais, peritonite associada com diálise, abscessos viscerais, endocardite, miocardite, pericardite, sepse associada com transfusão, meningite, encefalite, abscesso cerebral, osteomielite, artrite, úlceras genitais, uretrite, vaginite, cervicite, gengivite, conjuntivite, ceratite, endoftalmite, uma infecção em pacientes de fibrose cística ou uma infecção de pacientes neutropênicos febris.
16. Composto de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que uma infecção bacteriana é selecionada de um ou mais dos seguintes: pneumonia bacteriana adquirida em comunidade (CABP), pneumonia adquirida em hospital (HAP), pneumonia bacteriana adquirida em hospital, pneumonia associada com ventilador (VAP), bacteremia, infecções do pé diabético, infecções de catéter, infecções da pele e estrutura da pele descomplicadas (uSSSI), infecções da pele e estrutura da pele complicadas (cSSSI), infecções por enterococos resistentes à vancomicina ou osteomielite.
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